Imunocitoquimica:

A técnica de imunocitoquímica é utilizada para localizar proteínas numa célula ou

população de células (se for num tecido denomina-se imunohistoquímica), e tem como
fundamento a utilização de anticorpos específicos (geralmente IgGs, mas também
IgMs) contra a proteína que se pretende identificar e localizar numa dada célula. A
proteína em questão funciona assim como antigénio. Há inúmeros anticorpos
disponíveis comercialmente. Para sintetizar novos anticorpos é necessário imunizar
animais contra a proteína/antigénio, injectandoa na corrente sanguínea (uma
estratégia idêntica à vacinação). Posteriormente recolhe-se o sangue dos animais
imunizados e purificam-se os anticorpos. Os coelhos são os principais produtores de
anticorpos utilizando esta estratégia. A questão é que, neste caso, se purificam todos
os anticorpos produzidos para o antigénio que circulam no sangue, isto é, anticorpos
que ligam diferentes regiões da proteína. Cada tipo de anticorpo é produzido por um
só tipo de linfócito B, mas os anticorpos produzidos por vários linfócitos vão juntar-se
na corrente sanguínea. Como temos anticorpos diferentes para uma mesma proteína,
estes anticorpos designam-se anticorpos policlonais.
Os três métodos mais usados para marcar os anticorpos são:
– Conjugação com composto fluorescente. Torna possível a identificação
do anticorpo marcado e, portanto, do antigénio a que ele se liga, pelo emprego
do microscópio de fluorescência.
– Conjugação com uma enzima. O anticorpo é localizado por meio
de técnicas histoquímicas, geralmente, usadas em enzimas. A enzima mais usada é
a peroxidase, que pode ser localizada pelo método DAB (3-3’diaminobenzidina) e
visualizada tanto no microscópio ótico como no eletrónico.
– Conjugação com uma substância que não se deixa atravessar pela luz e que dispersa
eletrões. Um dos marcadores mais frequentemente usados é o ouro, cujas partículas
podem ser visíveis nos microscópios ótico e eletrónico.
Técnica direta
Imagine-se que, de um determinado órgão de rato (ou de outro animal), se
possa extrair e purificar uma proteína, que será denominada
de proteína Y (ou antigénio). Pretende-se saber em que célula ou tecido do órgão ela
se localiza. Injetando-se a proteína Y num outro animal, por exemplo num coelho, este
formará um anticorpo com a capacidade de se combinar de uma forma específica com
a proteína alvo, mas não com outras. Do sangue do coelho extrai-se e purifica-se
o anticorpo contra a proteína Y, podendo-se ligar quimicamente este anticorpo a
um composto fluorescente ou a um outro marcador. Assim, procedendo desta forma,
obtém-se um anticorpo que se liga à proteína de interesse (neste caso, proteína Y), e
que consegue ser identificado ao microscópio. De seguida, mergulha-se um corte do
mesmo órgão do qual se obteve a proteína Y numa solução que contenha
o anticorpo marcado, haverá uma combinação dos dois e as estruturas que contiverem
a proteína Y serão visíveis.
Técnica indireta
Esta técnica é realizada da seguinte forma: faz-se a imersão do corte histológico em
solução com anticorpo não marcado, obtido do sangue de um animal no qual
foi injetado o antigénio cuja localização se pretende determinar. O anticorpo liga-se
ao antigénio, mas não pode ser observado ao microscópio, um vez que não está
marcado. Seguidamente, imerge-se o preparado
em solução com antigamaglobulina marcada. Esta fixa-se à gamaglobulina que já está
ligada ao antigénio, revelando a sua localização. A antigamaglobulina é obtida
pela injeção da fração gamaglobulina no plasma sanguíneo do animal que
recebeu injeções do antigénio numa outra espécie diferente.
Os métodos imunocitoquímicos vêm sofrendo aperfeiçoamentos para que se obtenha
uma maior especificidade e uma localização cada vez mais precisa
das macromoléculas pesquisadas. Uma dessas melhorias é o método do ouro-proteína
A que tem sido muito usado e tem contribuído significativamente na investigação
da Biologia Celular e na evolução de algumas técnicas de diagnóstico médico.