Cultivo in vitro de Raphanus sativus

com adição de hormônios vegetais

Trabalho de finalização do Curso Médio Técnico de Biotecnologia

Davi Wöhlcke Thiengo e Ester Zylbersztejn

Professora orientadora: Dra. Maria Antonia Malajovich

Instituto de Tecnologia ORT

Objetivos
Comparar o crescimento de plantas de rabanete semeadas in vitro em diferentes condições
hormonais: sem hormônio, com ácido giberélico (GA3) e com benzilaminopurina (BAP).

Materiais
18 frascos de 300 mL; 18 tampas para estes frascos; Beckers; Pipetas; pinça; água destilada;
panela de pressão; corantes (verde e amarelo); repolho de metal; micro-ondas; bastão de
vidro; sementes de rabanete; fluxo laminar;; luvas de látex.

Reagentes
Àgar Bacteriológico; Sacarose; Solução 0,1% de Plant Preservative Mixture (PPM); Solução de
ácido giberélico (0,2 mg/ mL); solução de benzilaminopurina (0,2 mg/mL); meio Murashige &
Skoog; hipoclorito de sódio, álcool 70°; formol aldeído

Procedimentos

Parte I: Preparação dos meios

 Preparação de meio Murashige & Skoog (1 L de meio)

 Composição do meio (Anexo 1)

- Pesar 2,7 gramas de meio Murashige & Skoog (MS) na balança e dissolver em 970 mL de água
destilada

- Acrescentar 25 gramas de açúcar cristal

- Acrescentar 7 gramas de ágar bacteriológico e levar ao micro-ondas para que derreta e

adicionar 0,1 % de solução de PPM (1 mL)

- Dividir o meio em três beckers colocando 300 mL de meio em cada Becker

- Adicionar em cada Becker 30 mL da solução de hormônio correspondente e adicionar uma

gota de corante em cada uma delas seguindo a seguinte ordem (Meio 1 – Meio Murashige &
Skoog sem adição de hormônio e sem adição de corantes; Meio 2 – Meio com adição de ácido
giberélico (GA3) e corante amarelo; Meio 3 – Meio com adição de benzilaminopurina (BAP) e
corante verde).

- Distribuir 50 ml do meio 1 em 6 frascos. Repetir o procedimento com os outros dois meios.-

Esterilizar os meios na panela de pressão por 40 minutos.
  Desinfecção das sementes

- Esterilizar três potes com água destilada.

- Mergulhar duas pinças de em hipoclorito sódio (água sanitária 50%) por vinte
minutos.
- Mergulhar as sementes por 20 minutos em hipoclorito sódio (água sanitária 50%) e
lavar três vezes, com a água destilada previamente esterilizada.

 Semeadura

- Limpar o fluxo laminar com álcool 70° e formaldeído, utilizando luvas em todo o
procedimento.
- Ligar a luz UV do fluxo por quinze minutos.
- Organizar a distribuição dos materiais (frascos, sementes desinfetadas e pinças)
dentro do fluxo.
- Colocar 3 sementes de rabanete em cada pote.

Resultados do experimento

Análise dos resultados

Semana 1 (29/04/2015)

Potes com meio controle: foram os potes nos quais o rabanete se desenvolveu menos de
modo geral, tendo um crescimento normal.

I – 3 sementes germinaram, não houve crescimento e desenvolvimento da planta.

II - 2 sementes germinaram, houve o crescimento do caule e da raiz. Houve presença de pelos

na raiz.

IV – 2 sementes germinaram. Em uma delas o cotilédone foi liberado.

V – 3 sementes germinaram. A planta proveniente de duas sementes teve um pequeno

crescimento.

VI – 3 sementes germinaram, houve o crescimento da raiz (que possui pelos), do caule e das
folhas das plantas provenientes de duas dessas sementes. A outra semente apenas teve um
início de crescimento. Esse foi o pote entre os controles que apresentou melhor
desenvolvimento da planta.
Potes com meio + GA3: As plantas apresentaram um desenvolvimento desigual entre si, mas
em sua maioria foi um desenvolvimento melhor do que nos potes controle.

I – 3 sementes germinaram. Duas sementes originaram plantas que tiveram raiz (com pelos) e
caule desenvolvidos.

II – 3 sementes germinaram. Apenas houve a liberação do cotilédone de uma das sementes.

III – 2 sementes germinaram. Houve pequeno crescimento da raiz e do caule das plantas
provenientes de ambas sementes.

IV – 3 sementes germinaram. Ocorreu o início do crescimento do caule e da raiz nas plantas

provenientes de duas dessas sementes. A planta proveniente da outra semente cresceu mais.

V – 3 sementes germinaram. E o crescimento do caule e da raiz iniciou-se de maneira

semelhante.

VI – 3 sementes germinaram. As plantas provenientes de duas dessas sementes tiveram

crescimento do caule e raiz (com pelos).

Potes com meio + BAP: as plantas desse meio tiveram um crescimento e um desenvolvimento
mais acelerado em comparação ao meio + GA3 e ao meio controle.

I – 2 sementes germinaram.

II – 3 sementes germinaram. Houve o crescimento da raiz e do caule das plantas provenientes

das 3 sementes, porém 2 dessas plantas tiveram um melhor desenvolvimento. Do experimento
inteiro, foi o pote que apresentou melhor crescimento e desenvolvimento do rabanete.

III – 3 sementes germinaram. A planta proveniente de uma dessas sementes cresceu um

pouco, caule, raiz e folhas começaram a crescer.

IV – duas sementes germinaram, e as plantas provenientes dessas cresceram (caule, raiz e

folhas). Uma das plantas cresceu um pouco mais que a outra.

VI – 3 sementes germinaram. Uma das plantas apresentou um início de crescimento da raiz,

em outra houve o início do crescimento do caule e a raiz cresceu, e a última cresceu mais,
apresentando caule, raiz e folhas.
GA3 + BAP – 2 sementes germinaram. Houve o início do crescimento da raiz de uma das
plantas e a outra apresentou crescimento da raiz e do caule. Obs: a planta está tombada no
meio.

Semana 2 (08/05/2015)

Potes com meio controle:

I – 3 sementes germinaram e houve a liberação dos cotilédones de cada uma.

II – houve o desenvolvimento do caule e da raiz e o aparecimento de novas folhas, a planta se

desenvolveu e cresceu em altura. Foi a planta mais alta.

IV – das 2 sementes germinadas, 1 delas teve o crescimento de folhas e do caule.

V – das 3 sementes, 2 tiveram o crescimento em altura, e desenvolvimento da raiz e do caule.

Na outra sementes, os cotilédones. cresceram um pouco.

VI – Houve o desenvolvimento das plantas (caule e raiz) e aparecimento de novas folhas

(algumas amarelas). Ocorreu crescimento em altura, foi a planta do meio controle que melhor
se desenvolveu.

Potes com meio + GA3

I – Houve crescimento da planta em altura e desenvolvimento das estruturas secundárias

(caule, raiz, novas folhas).

II – Houve o crescimento dos cotilédones em uma das sementes, e a liberação dos cotilédones
nas outras duas sementes.

III – Houve o desenvolvimento das folhas e da raiz das duas sementes que haviam germinado.

IV – Das três sementes que germinaram, a planta proveniente de uma dessas sementes
cresceu em altura e se desenvolveu. Na outra as folhas e o caule cresceram um pouco, na
última houve início do crescimento do caule e das folhas.

VI – Houve o crescimento e o desenvolvimento de uma das plantas. Na outra planta, houve o

início do desenvolvimento (caule, raiz e folhas).
Potes com meio + BAP

I – Houve o crescimento dos cotilédones e o início do crescimento do caule.

II – As plantas cresceram em altura e se desenvolveram. Algumas folhas ficaram amarelas.

III – Houve o crescimento da raiz da planta de uma das sementes, houve o crescimento dos
cotilédones de outra semente, e a liberação dos cotilédones da última semente.

IV- Houve o crescimento em altura e desenvolvimento das plantas provenientes das duas
sementes. (há duas folhas amarelas, que provavelmente são os cotilédones).

V – Houve o crescimento e desenvolvimento das plantas provenientes das duas sementes,

uma se desenvolveu mais que a outra, e há a presença de folhas amarelas em ambas. Outra
semente germinou, houve a liberação dos cotilédones e o início do desenvolvimento do caule.

VI – houve o crescimento (em altura) e o desenvolvimento das plantas provenientes das três
sementes.

Pote meio + GA3 + BAP – As duas plantas cresceram em altura e houve o aparecimento de
novas folhas.

Semana 3 (13/05)

Potes com meio + BAP

I – Houve crescimento do caule e da raiz.

II – As plantas cresceram em altura e as estruturas secundárias se desenvolveram

(ramificações do caule e novas folhas).

III – crescimento da raiz, crescimento em altura e aparecimento de novas folhas da planta

proveniente de uma das sementes. Houve o crescimento dos cotilédones das outras duas
sementes.

IV - As plantas cresceram em altura e as estruturas secundárias se desenvolveram

(ramificações do caule e novas folhas).

V – Houve o crescimento (em altura) e desenvolvimento da planta, das estruturas secundárias

(ramificações do caule e novas folhas). Obs: Há folhas relativamente grandes e amareladas,
provavelmente porque o pote ficou num local que não havia luz o suficiente. Houve o
crescimento do caule, raiz e folhas da planta proveniente da outra semente que havia
germinado.

VI - A planta cresceu em altura e as estruturas secundárias se desenvolveram (ramificações do

caule e novas folhas). Há uma folha frágil e velha, prestes a cair.

Pote GA3 + BAP - A planta cresceu em altura e as estruturas secundárias se desenvolveram

(novas folhas).

Potes com meio controle:

I – crescimento dos cotilédones e da raiz de cada uma das sementes.

II – crescimento em altura e da raiz, desenvolvimento das estruturas secundárias (ramificações

do caule, novas folhas). Houve o crescimento do cotilédone e da raiz de outra semente do
frasco.

IV – houve o início do crescimento dos cotilédones e do caule das duas plantas.

V - A planta cresceu em altura e as estruturas secundárias se desenvolveram (ramificações do

caule e novas folhas). Houve o início do crescimento do cotilédone e do caule da outra planta
do frasco.

VI – Houve crescimento em altura e desenvolvimento das estruturas secundárias da planta,

porém há algumas folhas amareladas.

Potes com meio + GA3:

I – A planta cresceu muito em altura e as estruturas secundárias se desenvolveram (caule e

novas folhas). Porém, há folhas amareladas. Há um cotilédone no meio crescendo,
proveniente de outra semente. Há raízes aéreas, que saíram do meio.

II – Houve crescimento das folhas, caule e raiz das plantas provenientes das três sementes.

III – Houve o crescimento dos cotilédones e das raízes da planta.

IV – Houve o crescimento em altura e o desenvolvimento das estruturas secundárias da planta

proveniente de uma das sementes. Das outras duas sementes, houve o crescimento dos
cotilédones e início do crescimento do caule e da raiz. Há algumas folhas amareladas.
V - Houve o crescimento em altura e o desenvolvimento das estruturas secundárias, porém há
algumas folhas amareladas e frágeis. Houve o crescimento dos cotilédones e início do
crescimento da raiz e do caule da planta proveniente da outra semente do frasco.

VI - Houve o crescimento em altura e o desenvolvimento das estruturas secundárias de duas

plantas. Da outra houve o crescimento dos cotilédones, do caule e da raiz.

Conclusão:

A partir do cultivo de sementes de rabanete em um meio com diferentes quantidades de

hormônios, podemos inferir que a concentração destes altera e otimiza o desenvolvimento da
planta. A adição de BAP auxiliou no desenvolvimento das estruturas secundárias da planta,
enquanto a adição de GA3 faz com que a planta tenha o seu crescimento melhorado na
questão de altura. Podemos observar essa diferença quando compararmos com as plantas
cultivadas no meio controle, que não teve crescimento menor do que a com BAP e não teve
tanto desenvolvimento das estruturas secundárias. Com o passar do tempo, os nutrientes do
meio se esgotaram o que ocasionou a morte precoce da planta por não ter mais como se
desenvolver. Algumas plantas apresentaram possível desenvolvimento de raízes aéreas e
tropismos invertidos o que pode ser consequência da ação dos hormônios vegetais.

Tabela Semana 1
Controle Benzilaminopurina Ácido giberélico GA3 + BAP

1 3 sementes 2 sementes 3 sementes 2 sementes

germinaram, não germinaram. germinaram. Duas germinaram. Houve
houve crescimento e sementes o início do
desenvolvimento da originaram plantas crescimento da raiz
planta. que tiveram raiz de uma das plantas e
(com pelos) e caule a outra apresentou
desenvolvidos crescimento da raiz e
do caule. Obs: a
planta está tombada
no meio.

2 2 sementes 3 sementes 3 sementes -

germinaram, houve o germinaram. Houve germinaram.
crescimento do caule o crescimento da raiz Apenas houve a
e da raiz. Houve e do caule das liberação do
presença de pelos na plantas provenientes cotilédone de uma
raiz. das 3 sementes, das sementes.
porém 2 dessas
 plantas tiveram um
melhor
desenvolvimento. Do
experimento inteiro,
foi o pote que
apresentou melhor
crescimento e
desenvolvimento do
rabanete.

3 - 3 sementes 2 sementes -
germinaram. A germinaram.
planta proveniente Houve pequeno
de uma dessas crescimento da raiz
sementes cresceu e do caule das
um pouco, caule, raiz plantas
e folhas começaram provenientes de
a crescer. ambas sementes.

4 2 sementes duas sementes 3 sementes -

germinaram. Em uma germinaram, e as germinaram.
delas o cotilédone foi plantas provenientes Ocorreu o início do
liberado. dessas cresceram crescimento do
(caule, raiz e folhas). caule e da raiz nas
Uma das plantas plantas
cresceu um pouco provenientes de
mais que a outra. duas dessas
sementes. A planta
proveniente da
outra semente
cresceu mais.

5 3 sementes Uma das plantas 3 sementes -

germinaram. A planta cresceu um pouco germinaram. E o
proveniente de duas em altura. crescimento do
sementes teve um caule e da raiz
pequeno crescimento. iniciou-se de
maneira
semelhante.
6 3 sementes 3 sementes 3 sementes -
germinaram, houve o germinaram. Uma germinaram. As
crescimento da raiz das plantas plantas
(que possui pelos), do apresentou um início provenientes de
caule e das folhas das de crescimento da duas dessas
plantas provenientes raiz, em outra houve sementes tiveram
de duas dessas o início do crescimento do
sementes. A outra crescimento do caule caule e raiz (com
semente apenas teve e a raiz cresceu, e a pelos).
um início de última cresceu mais,
crescimento. Esse foi o apresentando caule,
pote entre os raiz e folhas.
controles que
apresentou melhor
desenvolvimento da
planta.

Tabela Semana 2
 Controle Benzilaminopurina Ácido giberélico GA3 + BAP

1 3 sementes Houve o crescimento Houve crescimento As duas plantas

germinaram e dos cotilédones e o da planta em altura e cresceram em altura
houve a liberação início do crescimento desenvolvimento das e houve o
dos cotilédones de do caule. estruturas aparecimento de
cada uma. secundárias (caule, novas folhas.
raiz, novas folhas).

2 houve o As plantas cresceram Houve o crescimento

desenvolvimento do em altura e se dos cotilédones em
caule e da raiz e o desenvolveram. uma das sementes, e
aparecimento de Algumas folhas ficaram a liberação dos
novas folhas, a amarelas. cotilédones nas
planta se outras duas
desenvolveu e sementes.
cresceu em altura.
Foi a planta mais
alta.

3 ---- Houve o crescimento Houve o

da raiz da planta de desenvolvimento das
uma das sementes, folhas e da raiz das
houve o crescimento duas sementes que
dos cotilédones de haviam germinado.
outra semente, e a
liberação dos
cotilédones da última
semente.

4 das 2 sementes Houve o crescimento Das três sementes

germinadas, 1 delas em altura e que germinaram, a
teve o crescimento desenvolvimento das planta proveniente de
de folhas e do caule. plantas provenientes uma dessas sementes
das duas sementes. (há cresceu em altura e
duas folhas amarelas, se desenvolveu. Na
que provavelmente são outra as folhas e o
os cotilédones). caule cresceram um
pouco, na última
houve início do
crescimento do caule
 e das folhas.

5 das 3 sementes, 2 Houve o crescimento e As plantas

tiveram o desenvolvimento das provenientes das 3
crescimento em plantas provenientes sementes cresceram
altura, e das duas sementes, em altura. Há raízes
desenvolvimento da uma se desenvolveu aéreas (fora do meio),
raiz e do caule. Na mais que a outra, e há que possuem pelos.
outra sementes, os a presença de folhas
cotilédones. amarelas em ambas.
cresceram um Outra semente
pouco. germinou, houve a
liberação dos
cotilédones e o início
do desenvolvimento do
caule.

6 Houve o houve o crescimento Houve o crescimento

desenvolvimento (em altura) e o e o desenvolvimento
das plantas (caule e desenvolvimento das de uma das plantas.
raiz) e aparecimento plantas provenientes Na outra planta,
de novas folhas das três sementes. houve o início do
(algumas amarelas). desenvolvimento
Ocorreu (caule, raiz e folhas).
crescimento em
altura, foi a planta
do meio controle
que melhor se
desenvolveu.

Tabela Semana 3
 Controle Benzilaminopurina Ácido Giberélico GA3 + BAP

1 crescimento dos Houve crescimento do A planta cresceu muito A planta cresceu em

cotilédones e da caule e da raiz. em altura e as altura e as estruturas
raiz de cada uma estruturas secundárias secundárias se
das sementes. se desenvolveram desenvolveram
(caule e novas folhas). (novas folhas).
Porém, há folhas
amareladas. Há um
cotilédone no meio
crescendo, proveniente
de outra semente. Há
raízes aéreas, que
saíram do meio.

2 crescimento em As plantas cresceram Houve crescimento das

altura e da raiz, em altura e as folhas, caule e raiz das
desenvolvimento estruturas secundárias plantas provenientes
das estruturas se desenvolveram das três sementes.
secundárias (ramificações do caule e
(ramificações do novas folhas).
caule, novas
folhas). Houve o
crescimento do
cotilédone e da
raiz de outra
semente do
frasco.

3 Crescimento da raiz, Houve o crescimento

crescimento em altura e dos cotilédones e das
aparecimento de novas raízes da planta.
folhas da planta
proveniente de uma das
sementes. Houve o
crescimento dos
cotilédones das outras
duas sementes.

4 houve o início do As plantas cresceram Houve o crescimento

crescimento dos em altura e as em altura e o
cotilédones e do estruturas secundárias desenvolvimento das
caule das duas se desenvolveram estruturas secundárias
plantas. (ramificações do caule e da planta proveniente
novas folhas). de uma das sementes.
Das outras duas
 sementes, houve o
crescimento dos
cotilédones e início do
crescimento do caule e
da raiz. Há algumas
folhas amareladas.

5 A planta cresceu Houve o crescimento Houve o crescimento

em altura e as (em altura) e em altura e o
estruturas desenvolvimento da desenvolvimento das
secundárias se planta, das estruturas estruturas secundárias,
desenvolveram secundárias porém há algumas
(ramificações do (ramificações do caule e folhas amareladas e
caule e novas novas folhas). Obs: Há frágeis. Houve o
folhas). Houve o folhas relativamente crescimento dos
início do grandes e amareladas, cotilédones e início do
crescimento do provavelmente porque crescimento da raiz e do
cotilédone e do o pote ficou num local caule da planta
caule da outra que não havia luz o proveniente da outra
planta do frasco. suficiente. Houve o semente do frasco.
crescimento do caule,
raiz e folhas da planta
proveniente da outra
semente que havia
germinado.

6 Houve A planta cresceu em Houve o crescimento

crescimento em altura e as estruturas em altura e o
altura e secundárias se desenvolvimento das
desenvolvimento desenvolveram estruturas secundárias
das estruturas (ramificações do caule e de duas plantas. Da
secundárias da novas folhas). Há uma outra houve o
planta, porém há folha frágil e velha, crescimento dos
algumas folhas prestes a cair. cotilédones, do caule e
amareladas da raiz.
Anexos
Anexo 1: Composição do meio de Murashige & Skoog

- 2,7 gramas de meio Murashige & Skoog

- 25 gramas de açúcar cristal

- 7 gramas de ágar bacteriológico