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Senado Federal |ANVISA |Banco Central |Sec. do Tesouro Nacional |IBAMA |Palácio do Planalto
Situação: Vigente
Ementa: Aprova os Métodos Analíticos para Controle de Alimentos para uso Animal.
Histórico:
Os textos legais disponíveis no site são meramente informativos e destinados a consulta / pesquisa,
sendo imprópria sua utilização em ações judiciais.
ANTONIO CABRERA
http://extranet.agricultura.gov.br/sislegis-consulta/consultarLegislacao.do?operacao=visualizar&id=3077 1/1
SECRETARIA NACIONAL DE DEFESA AGROPECUÁRIA
DEPARTAMENTO NACIONAL DE DEFESA ANIMAL.
DIVISÃO DE LABORATÓRIO ANIMAL
IMPORTANTE
Nunca retirar a amostra de um único ponto, pois a mesma é casual e não
permite conclusões quanto a qualidade do produto.
7. Para acondicionamentos a granel utilizar uma sonda de profundidade com
cruzeta móvel (fig. 3), nas medidas aproximadas de 1,60m de comprimento e 0,05 m
de diâmetro, introduzindo-a por impulsão forçada. Adotar um mínimo de oito pontos
localizados, aplicados a cargas menores e 16 pontos para quantidades maiores
(carretas e vagões), sempre intercalando as posições vertical e inclinada da sonda
(FIG. 5).
IMPORTANTE
O instrumento de colheita deverá necessariamente abranger as partes superior,
média e inferior do material em todos os pontos escolhidos.
Quebra de página
SONDA DE PROFUNDIDADE
(Granel)
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Aparelho vibrador para peneiras
- Balança técnica (Precisão +/- 0,1 g)
- Conjunto padrão de peneiràs metálicas - diâmetro de 203 mm
- Bolas de borracha maciça com 2 a 3 cm de diâmetro.
PROCEDIMENTO:
1. Colocar 2 Bolas de borracha em cada peneira e montar o conjunto.
2. Pesar 100g de amostra e transferir para a peneira superior do conjunto. Tampar e
fixar no vibrador.
3. Ligar e deixar por um período de 10 minutos em reostato Nº 10.
4. Pesar as frações retidas em cada peneira.
CÁLCULO:
OBSERVAÇAO:
O número de peneiras e o tamanho das malhas deverão ser estabelecidos conforme o
tipo de produto.
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Balança analítica (Precisão +/- 0,0001 g)
- Estufa de secagem
- Pesa filtro ou cápsula de alumínio, com tampa
- Dessecador com cloreto de cálcio ou silica-gel anidros
PROCEDIMENTO:
1. Pesar a cápsula ou pesa filtro, limpo e previamente seco em estufa a 105ºC. por
uma hora, resfriado em dessecador até temperatura ambiente.
2. Pesar de 3 a 5g da amostra, dependendo da capacidade do recipiente.
3. Colocar em estufa pré-aquecida a 105ºC (.+,/- 1ºC) até peso constante (4 a 6
horas).
4. Retirar da estufa e deixar em dessecador até temperatura ambiente.
5. Pesar
CÁLCULO:
Umidade % (A - B) = x 100
C
ONDE:
A = Peso do recipiente + amostra
B = Peso do recipiente + amostra após secagem
C = Peso da amostra
OBSERVAÇAO:
Ao utilizar estufa sem renovação de ar recomenda-se não processar grande número de
amostras simultaneamente.
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Balança semi analítica. (precisão +/- 0,01 g).
- Manta ou chapa elétrica com controle de temperatura.
- Condensador Liebig com junta esmerilhada.
- Balo de fundo redondo ou chato, capacidade 500 ml com junta esmerilhada.
- Sistema receptor graduado de "Dean and Stark" ou "Bidwell Stirling" com capacidade
10 ou 20 ml, divisão 1/10 com juntas superior e inferior esmerilhadas.
REAGENTE:
- Toluol P.A.
PROCEDIMENTOS:
1. Pesar 20 a 30 g da amostra "in natura" (ou conforme a quantidade de água
estimada), diretamente no balão.
2. Adicionar +/- 200 ml de toluol P.A., conectar ao sistema e este ao condensador.
3. Aquecer a mistura lentamente, controlando a temperatura para manter o líquido em
constante ebulição.
4. Destilar até volume constante da fase aquosa no tubo graduado.
5. Desligar e proceder a leitura do volume final à temperatura ambiente.
CÁLCULO:
V x.100
Umidade % = P
ONDE:
V = Volume da fase aquosa no tubo graduado
P = Peso da amostra em grama
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Balança analítica (precisão +/-0,0001 g).
- Conjunto Kjeldahl para digestão e destilação macro.
- Bureta de 50 ml. div. 1/10.
- Frasco Kjeldahl 500 ou 800 Mi ou tubo de digestão macro.
- Erlenmeyer de 300 ou 500 ml.
- Pérolas de vidro 4 a 6 mm.
- Provetas de 100 ml.
REAGENTES:
- ÁcIdo sulfúrico P.A. (d = 1.84 g/l).
- Hidróxido de sódio P.A.
- Sul fato de cobre pentahidratado P. A.
- Sulfato de sódio anidro P.A. ou sulfato de potássio anidro P.A.
- Vermelho de metiIa P. A.
- Zinco metálico granulado P.A.
- Biftalato de potássio P.A.
- Ácldo bórico P.A.
- Verde de bromocresol P.A.
- Ácido clorídrico P.A.
- Carbonato de sódio P.A.
PROCEDIMENTOS:
1. Pesar 1,0 g da amostra e transferir para frasco Kjeldhal ou tubo de digestão.
2. Adicionar aproximadamente 15 g de mistura catalítica, 5 a 7 pérolas de vidro e 20
ml de ácido sulfúrico P.A. pela parede do frasco.
3. Iniciar a digestão.com temperatura baixa. Prosseguir, elevando até o máximo de
38º C, evitando deixar pontos aderidos a parede do frasco.
Continuar por mais 30 minutos após clareamento completo da mistura.
4. Esfriar, juntar de 250 a 350 ml de água destilada- (dependendo da capacidade do
frasco). Agitar até dissolução e esfriar.
5. Levar ao destilador, adicionar cinco grânulos de zinco para controlar a ebulição e
cuidadosamente, 50 ml de hidróxido de sódio 50%. Arrolhar rapidamente, agitar e
proceder a destilação.
6. Recolher cerca de 200 ml de destilado em erlenmeyer de 300 ou 500 ml contendo
50 ou 100 ml de água destilada mais um volume de ácido sulfúrico 0,2 N a ser
determinado de acordo com o percentual de proteína bruta estimada e 2 gotas de
indicador vermelho de metila 0,1%.
OBSERVAÇÃO: Alternativamente poderá ser empregado 50 ml de ácido do bórico 4%
com 8 a 10 gotas do Indicador misto para receber a destilado.
7. Retirar e titular o excesso de ácido com solução de hidróxido de sódio até a viragem
do vermelho para amarelo.
OBSERVAÇAO: Ao utilizar o ácido bórico 4% empregar como titulante ácido clorídrico
até viragem do ind'1cador (verde para rosa).
8. Proceder uma prova em branco, testando a qualidade dos reagentes.
CÁLCULOS:
Proteína = (Va - Vb) x F1 - (Vs x F2) x N x 6,25 x 0.014 x 100
Bruta % P
ONDE:
Va = Volume de H2S04 0.2 N utilizado
Vb = Volume de H2S04 0.2 N consumido pela prova em branco
F1 = Fator de correção do H2S04 0.2 N
Vs = Volume de NaOH 0.2 N gasto na titulação
F2 = Fator de correção do NaOH 0.2 N
N = Normalidade
6,25 = Fator de transformação do nitrogênio em proteína, considerando'
16% nitrogênio (100/16=6,25)
0,014 = Miliequivalente grama do nitrogênio
P = 'Peso da amostra em g
ONDE:
Va = Volume de HCl 0,1 N gasto na titulação
Vb = Volume de HCl 0,1 N gasto na prova em branco
F = Fator de correção do HCl 0,1 N
N = Normalidade
6,25 = Fator de transformação do nitrogênio em proteína, considerando
16% nitrogênio (100/16=6,25).
0,014 = Miliequivalente grama do nitrogênio
P = Peso da amostra em g
OBSERVAÇÕES:
1. Destilar de modo que o condensado seja obtido a temperatura ambiente.
2. O terminal do condensador deve ficar mergulhado na solução durante a fase de
destilação.
3. Quando houver viragem da cor vermelha para amarela durante a fase de destilação,
desconsidera a análise em processo.
4. Orientação para volumes de H2S04 0.2 N a ser utilizado, de acordo com o
percentual de proteína bruta esperado.
%. PB ml H2S04
até 10 % 10
20 % 15
30 % 25
40 % 30
60 % 50
80 % 60
PADRONIZAÇÃO:
Pesar exatamente 0,4 g de carbonato de sódio (Na2C03) P.A. previamente seco em
mufla a 270ºC por uma hora. Dissolver em erlenmeyer, adicionando aproximadamente
30 ml de H2S04 0,2 N medidos e bureta de 4 gotas de vermelho de metila. Prosseguir
a titulação gotejando a solução de H2S04 0.2 N até leve coloração rósea. Aquecer até
ebulição e resfriar. Havendo permanência da coloração rósea, considerar terminada a
titulação. Caso contrário, prosseguir, repetindo a operação até coloração permanente.
CÁLCULO DO FATOR:
P NR
NR = VxE F= NE
ONDE:
P = Peso do Na2C03 em miligrama
NR ~ Normalidade real da solução
V = Volume gasto na titulação em ml
E = Equivalente grama de Na2C03
NE = Normalidade esperada
CÁLCULO DO FATOR:
P NR
NR = VxE F= NE
ONDE:
E = Equivalente grama do biftalato de potássio
P = Peso do Biftalato em miligrama
V = Volume de NaOH 0.2 N consumido.
NR = Normalidade real .
NE = Normalidade esperada
f. Mistura catalítica
Peneirar separadamente o sulfato de sódio ou potássio anidros e o sulfato de cobre
pentahidratado em peneira com malha de 1 mm. Juntar 10 partes de Na2S04 ou
K2S04 e uma parte de CuS04. 5H20. Homogeneizar e guardar em frasco com tampa.
P NR
NR = VxE F= NE
ONDE:
P = Peso em mg do Na2C03 na alíquota
V = Volume gasto de HCl 0,1N
E = Equivalente grama do Na2C03
NR = Normalidade real
NE = Normalidade esperada
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Balança analítica (precisão +/- 0,0001g).
- Bloco digestor e destilador por arraste de vapor.
- Bureta de 25 ml (1/20).
- Frasco Kjeldahl de 300 mI ou tubo de digestão (semi micro).
- Erlenmeyer de 125 ml
- Proveta de 25 ml
REAGENTES:
- Ácido sulfúrico P.A. (d = 1,84 g/l)
- Hidróxido de sódio P.A.
- Sulfato de cobre pentahidratado P.A.
- Sulfato de sódio anidro P.A. ou sulfato de potássio anidro P.A.
- Vermelho de metila P.A.
- Zinco metálico granulado.
- Biftalato de potássio P.A.
- Ácido bórico P.A.
- Verde bromocresol P.A.
- Ácido clorídrico P.A.
- Carborloto dé sódio P.A.
PROCEDIMENTOS:
1. Pesar de 300 a 500 mg da amostra e 'transferir para frasco Kjeldahl ou tubo.
2. Adicionar aproximadamente, 2g de mistura catalítica e 5 a 10ml de ácido sulfúrico
P.A. pela parede do frasco.
3. Proceder a digestão até que a solução fique límpida, cuidando para não deixar
pontos pretos aderidos a parede do frasco. Continuar por mais 30 minutos após o
clareamento. Esfriar e dissolver com aproximadamente 10 a 20ml de água destilada.
4. Colocar em um erlenmeyer aproximadamente 50ml de água destilada, volume de
H2S04; 0,2 N de acordo com a porcentagem de proteína estImada e 2 gotas de
vermelho de metila 0,1%.
OBSERVAÇÃO: Alternativamente poderá ser empregado de 20 a 50ml de ácido bórico
4% para receber o destilado, com 8 a 10 gotas de indicador misto.
5. Transferir quantitativamente a amostra digerida para o destilador, lavando o frasco
três vezes com aproximadamente 10ml de água destilada.
OBSERVAÇÃO: No caso de destiladores automáticos, conectar o tubo no Suporte e
bocal apropriados.
6. Adicionar aproximadamente 20ml de NaOH 50%. Destilar por arraste mantendo o
terminal do condensador mergulhado na solução receptora até que toda amônia seja
liberada.
7. Retirar o erlenmeyer, lavar o terminal do condensador e titular o excesso de ácido,
com solução de NaOH 0,2 até viragem do indicador (vermelho para amarelo).
OBSERVAÇAO: Ao utilizar ácido bórico 4% empregar como titulante HCl 0,1N até
viragem do indicador misto (verde para rosa).
8. Proceder paralelamente prova em banco dos reagentes utilizados.
CÁLCULOS:
Proteína = (Va - Vb) x F1 - (Vs x F2) x N x 6,25 x 0.014 x 100
Bruta % P
ONDE:
VA = Volume de H2S04 0,2 N utilizado
V8 = Volume de H2S04 0,2 N consumido na prova em branco
F1 = Fator de correção do H2S04 0,2 N
VS = Volume de NaOH 0,2 N Gasto na titulação
F2 = Fator de correção do NaOH 0,2 N
N = Normalidade
6,25 = Fator de transformação do nitrogênio em proteína, considerando
16% de nitroganio (100/16=, 6,25)
0;014 = Miliequivalente grama do nitrogênio
P = Peso da amostra em grama
ONDE:
Va = Volume de HCl 0,1 N gasto na titulação
Vb = Volume de HCl 0,1 N gasto na prova em branco
F = Fator do HCI 0,1 N
N = Normalidade
6,25 = Fator de transformação do nitrogênio em proteína, considerando
16% de Nitrogênio (100/16 = 6,25)
0,014=, Miliequivalente grama do nitrogênio
P = Peso da amostra em grama
OBSERVAÇOES:
1. Destilar de modo que o condensado seja obtido a temperatura ambiente.
2. O terminal do condensador deve ficar mergulhado na solução durante a fase de
destilação.
3. Quando houver viragem da cor vermelha para amarela durante a fase de destilação,
desconsiderar a análise em processo.
4. Orientação para volumes de H2S04 0,2N a ser utilizado, de acordo com o percentual
de proteína bruta esperado.
% PB ml H2S04
até 10% 10
20% 15
30% 25
40% 30
60% 50
80% 60
5. Proceder sempre uma prova de recuperação utilizando caserna P.A., sulfato de
amônio anidro P.A. ou cloreto de amônio P.A.
6. Em amostras com alto teor de gordura ou que apresentem formação de espuma
durante a fase de digestão ou destilação, utilizar algumas gotas de solução
antiespumante.
CÁLCULO DO FATOR:
P NR
NR = VxE F= NE
ONDE:
P = Peso do Na2C03 em miligrama
NR = Normalidade real da solução
V = Volume gasto na titulação em ml.
E = Equivalente grama do Na2C03
NE = Normalidade esperada
PADRONIZAÇÃO:
Pesar, com exatidão, cerca de 1,a g de biftalato de potássio P.A., previamente seco em
estufa a 120ºC por duas horas. Dissolver em erlenmeyer com aproximadamente 75ml
de água destilada. Adicionar 4 gotas de solução alcoólica de fenolftaleína 1% e titular
gotejando a solução de NaOH 0,2N até coloração levemente rósea.
CÁLCULO DO FATOR:
P NR
NR = VxE F= NE
ONDE:
E = Equivalente grama do biftalato de potássio
P = Peso do biftalato em miligrama
V = Volume de NaOH 0, N consumido
NR = Normalidade real
INE = Normalidade esperada
f. Mistura catalítica
Peneirar separadamente o sulfato de sódio ou potássio anidros e o sulfato de cobre
pentahidratado em peneira com malha de 1mm. Juntar 10 partes de Na2S04 ou K2S04 e
uma parte de CuS04. 5H20. Homogeneizar e guardar em frasco com tampa.
PADRONIZAÇÃO:
Pesar exatamente 5,299g de carbonato de sódio (Na2C03) P.A. previamente seco a
270ºC por uma hora. Dissolver em água destilada, transferir para balão volumétrico de
1.000ml e completar o volume.
Pipetar 20 ml da solução de Na2C03 e transferir para erlenmeyer de 250ml. Adicionar 3
gotas de solução de vermelho de metila 0,1%. Titular até viragem para coloração
rósea. Aquecer a ebulição, para eliminar o gás carbônico. Esfriar e prosseguir a
titulação. Repetir esta operação até coloração rósea permanente.
CÁLCULO 00 FATOR:
P NR
NR = VxE F= NE
ONDE:
P = Peso em mg do Na2C03 na alíquota
V = Volume gasto de HCl
E = Equivalente grama do Na2C03
NR = Normalidade real
NE = Normalidade esperada.
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Balança analítica (Precisão +1- 0,0001g)
- Estufa bacteriológica
- Estufa de secagem
- Agitador tipo Wagner (Modelo AOAC para 15 RPM) ou similar
- Cadinho de vidro sinterizado NQ 01 ou funil de Buchner
- Papel de filtro quantitativo filtração média.
- Proveta de 250 ml.
- Frascos com tampa ou erlenmeyer capacidade 500 ml
REAGENTES:
1. Ácido clorídrico P.A. (d = 1,19g/ml)
2. Pepsina c/ atividade 1:10.000
3. Acetona P.A.
PROCEDIMENTOS:
1. Pesar 1g da amostra, desengordurar e transferir quantitativamente para frasco com
tampa ou erlenmeyer com rolha esmerilhada.
2. Adicionar 150ml de solução de pepsina 0.2% em HCl 0,075 N, previamente
aquecida a 45ºC. Fixar no agitador e incubar por 16h a 45ºC com agitação constante.
3. Filtrar sob sucção em cadinho de vidro sinterizado ou papel filtro previamente
tarados. Usando-se a segunda opção, ajustar o papel ao funil Buchner. Lavar o resíduo
com 2 a 3 porções de água a 45 – 50ºC e após, com 2 porções de acetona P.A.
4. Colocar o cadinho ou papel de filtro com o resíduo em estufa a 105ºC por 1 hora.
Retirar e esfriar em dessecador até temperatura ambiente. Pesar.
CÁLCULOS:
A-B
Digestibilidade % = 100 - (______) x 100
P
ONDE:
A = Peso do cadinho ou papel de filtro + resíduo
B = Peso do cadinho ou papel de filtro
C = Peso da amostra em grama
OBSERVAÇOES:
1. A solução de pepsina 0,2% em HCl 0,075N deverá ser preparada momentos antes
de sua utilização.
2. Em substituição ao agitador tipo Wagner, poderá ser utilizado banho maria com
agitação (tipo Kline) ou similar. A velocidade de agitação deverá ser ajustada de
maneira que o resultado obtido seja semelhante aquele do método indicado.
PADRONIZAÇÃO:
Pesar exatamente 0,12g de Na2C03 P.A. previamente seco em mufla e 270ºC por 1
hora. Dissolver em erlenemeyer,. adicionando aproximadamente 20ml de HCl 0,75N,
medidos em bureta e adicionar 4 gotas de vermelho de metila 0,1%. Prosseguir a
titulação, gotejando a solução de HCl 0,075N até leve coloração rósea. Aquecer até
ebulição e esperar. Havendo permanência de coloração rósea, considerar terminada a
titulação.
Caso contrário, prosseguir até coloração rósea constante.
CÁLCULO DA NORMALIDADE:
P
NR = ______
VXE
ONDE:
P = Peso de Na2C03 em miligrama
V = Volume gasto de HCI 0,075N na titulação
E = Equivalente grama do Na2C03
NR = Normalidade real
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Balança analítica (Precisão +/- 0,0001g)
- Estufa bacteriológica
- Estufa de secagem
- Agitador tipo Wagner (Modelo AOAC para 15 RPM) ou similar
- Funil de Buchner
- Papel de filtro quantitativo, filtração média
- Proveta de 250ml
- Frascos ou erlenmeyer capacidade 500 ml com tampa
- Material e equipamento usados para determinação de proteína bruta (macro ou semi-
micro)
REAGENTES:
- Ácido clorídrico P.A. (d = 1,19g/ml)
- Pepsina com atividade 1:10.000
- Acetona P.A.
- Reagentes utilizados na determinação de proteína bruta (macro ou semi-micro)
PROCEDIMENTO:
1. Pesar 19 da amostra, desengordurar e transferir quantitativamente para frasco ou
erlenmeyer com tampa.
2. Adicionar 150ml de solução de pepsina 0,2% em HCI 0,075 N, previamente
aqueclda a 45ºC. Flxar no agitador e incubar por 16 horas a 45ºC com agitação
constante.
3. Filtrar com sucção sobre papel de filtro ajustado a um funil de Buchner lavar o
resíduo com 2 a 3 porções de água a 45 – 50ºC e após, com 2 porções de acetona.
4. Transferir o papel com o resíduo para balão Kjeldahl ou tubo de digestão. Proceder
conforme descrito nos métodos para determinação de Proteína Bruta (macro ou semi-
micro).
CALCULO:
PADRONIZAÇÃO:
Pesar 0,12 gramas de Na2C03 P.A. previamente seco em mufla a 270ºC por 1 hora.
Dissolver em erlenmeyer, adicionando aproximadamente 20ml de HCI 0,075N,
medidos em bureta, e adicionar 4 gotas de vermelho de metila 0,1%. Prosseguir a
titulação, gotejando a solução de HCl 0,075N até leve coloração rósea. Aquecer até
ebulição e esperar. Havendo permanência de coloração rósea, considerar terminada a
titulação. Caso contrário, prosseguir até coloração rósea constante.
CALCULO DA NORMALIDADE:
P
NR = ______
VXE
ONDE:
P = Peso de Na2C03 em mg
V = Volume gasto de HCl 0,075N na titulação
E = Equivalente grama do Na2C03
NR = Normalidade real
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Balança analítica (precisão +/- 0,0001g)
- Agitador magnético ou tIpo Kline, com controle de rotação.
- Centrífuga
- Erlenmeyer de 250ml ou 300ml
- Material e equipamento usados para determinação da proteína bruta (macro ou semi-
micro).
REAGENTES:
- Hidróxido de potássio P.A. (Min. 85% KOH)
- Soluções reagentes usadas na determinação de proteína bruta (macro ou semi-
micro).
PROCEOIMENTO:
1. Pesar 2,0g da amostra. Transferir para erlenmeyer de 250 ou 300ml e adicionar
volumétricamente 100 ml de solução de KOH 0,2% (0,036N).
2. Agitar brandamente por 20 minutos, usando agitador magnético ou tipo Kline.
3. Centrifugar o sobrenadante por 5 a 10 minutos a 1.500 rpm.
4. Pipetar volumétricamente 25ml do centrifugado e transferir para frasco Kjeldahl ou
10ml para tubo de digestão.
5. Proceder conforme descrito nos métodos para determinação de proteína bruta
(macro ou semi-micro).
6. Proceder paralelamente prova em branco .dos reagentes utilizados.
CÁLCULO:
Proteína do sobrenadante x 100
Proteína solúvel % =
Proteína Bruta
i
Utilizar peso da amostra para cálculo, de acordo com alíquota empregada.
OBSERVAÇOES:
1. A agitação da mistura deve ser branda mas suficiente para provocar revolução
completa do material.
2. Devido a alta sensibilidade do método, trabalhar com solução de KOH exatamente
0,036N.
SOLUÇOES REAGENTES E VOLUMÉTRICAS:
1. Solução volumétrica padronizada de hidróxido de potássio 0,2% (0,036N).
Pesar 2,376 g de KOH P.A., solubilizar em água destilada. Transferir quantitativamente
para balão volumétrico de 1000ml, completar o volume e homogeneizar.
PADRONIZAÇAO
Pesar com exatidão 0,2g de Biftalato de Potássio P.A., previamente seco em estufa a
120ºC por 2 horas. Dissolver em erlenmeyer com aproximadamente 7.5ml de água
destilada. Adicionar 4 gotas de solução alcóolica de fenolftaleína a 1% e titular
gotejando a solução de KOH 0,036N até coloração levemente rósea.
CALCULO DA NORMALIDADE:
P
N = YxE
ONDE:
E = Equivalente grama do biftalato de potássio
P = Peso do biftalato de potássio em miligrama
Y = volume KOH 0,036N consumido.
NR = Normalidade real
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Balança analítica (precisão +/- 0,0001g)
- Conjunto Kjeldahl para destilação macro
- Frasco Kjeldahl capac. 500 ou 800ml
- Erlenmeyer 300 ou 500ml
- Bureta capacidade 50ml div. 1/10
- Provetas 10 e 100ml
- Pérolas ,de vidro 4 a 6mm diâmetro
REAGENTES:
- Uréia P.A.
- Urease P.A.
- Cloreto de cálcio P.A. .
- Óxido de magnésio P.A.
- Solução antiespumante
- Reagentes utilizados na determinação de proteína bruta - fase de destilação {macro
ou semi-micro).
PROCEDIMENTO:
1. Pesar de 0,2 a 2g da amostra, conforme o teor esperado e transferir para frasco
Kjeldahl de 500 ou 800 ml.
2. Adicionar aproximadamente 300ml de água destilada e 10ml de solução neutra de
urease 1%. tampar hermeticamente e deixar a temperatura ambiente por 1 hora ou 20
minutos a 40ºC.
3. Adicionar 2g de óxido de magnésio, 5ml de solução de cloreto de cálcio 25%, 3ml
de solução antiespumante e 7-8 pérolas de vidro.
4. Levar ao destilador, arrolhando rapidamente o frasco. Agitar e proceder a
destilação.
5. Recolher cerca de 150-200ml do destilado em erlenmeyer de 300 ou 500ml,
contendo 20 e 50ml de solução de ácido bórico 4% ou volume de ácido sulfúrico 0,2N
a ser determinado, de acordo com o percentual de uréia esperado (Neste caso, utilizar
indicador vermelho de metila 0,1%).
6. Retirar e titular utilizando ácido clorídrico 0,1N ou hidróxido de sódio 0,2N,
procedendo a titulação conforme descrito na metodologia ,para determinação de
proteína bruta.
7. Proceder paralelamente prova em branco dos reagentes utilizados.
CÁLCULOS:
(VA - VB) x F1 - (Vs x F2) x N x 2,143 x.0,014 x 100
Uréia % = P
ONDE:
VA = Volume H2S04 0,2N utilizado
VB = Volume H2S04 0,2N consumido pela prove branco
F1= Fator de correção do H2S04 0,2N
Vs = Volume de NaOH 0,2N gasto na titulação
F2 = Fator de correção do NaOH 0,2N
N = Normalidade
2,143 = Fator de transformação do nitrogênio em uréia
0,014 = Miliequivalente grama do nitrogênio
P = Peso da amostra em grama ou no caso de utilização de Ácido Bórico 4%
ONDE:
VA = Volume HCl 0,1N gasto na titulação
VB = Volume HCl 0,1N consumido na prova branco.
F1 = Fator de correção do HCl 0,1N
N = Normalidade
2,143 = Fator de transformação do nitrogênio em uréia
0,014 = Miliequivalente grama do nitrogênio
P = Peso da amostra em grama
OBSERVAÇÕES:
1. Volume de H2S04 0,2N a ser utilizado, de acordo com o percentual de uréia
esperado.
% Volume
1 5
2 10
5 25
2. Proceder prova de recuperação utilizando uréia P.A. (100 a 200 mg).
3. O terminal do condensador deve ficar mergulhado na solução durante a fase de
destilação.
4. Quando houver viragem da coloração vermelha para amarela durante a fase de
destilação, desconsiderar a análise em processo (no caso de usar H2S04 0,2 N)
5. Destilar de modo que o condensado seja obtido a temperatura ambiente.
6. Em substituição a solução neutra de urease 1%, pode-se utilizar (Jackbean Meal)
em excesso (500 a 600mg). Conservar em geladeira.
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Balança analítica (precisão +/- 0,0001g).
- Estufa de secagem.
- Dessecador com cIoreto de cálcio ou silica gel anidros.
- Balão de fundo chato ou copo Goldfisch
- Apatelho extrator tipó Soxhlet ou Goldfisch
- Papel de filtro qualitativo ou cartucho extrator de cerâmica ou celulose
- Algodão hidrófilo desengordurado.
REAGENTES:
- Éter de petróleo P.A.
PROCEDIMENTO:
1. Pesar de 2 a 5g da amostra, transferir para cartucho extrator ou cartucho preparado
com papel filtro.
2. Secar a 105ºC + / - 1ºC durante 2 horas.
3. Secar o balão ou copo em estufa a 105ºC por uma hora, esfriar em dessecador até
a temperatura ambiente e pesar.
4. Introduzir o cartucho no extrator.
5. Adicionar quantidade suficiente de solvente ao balão ou copo, conectando-o ao
extrator, Ajustar o conjunto ao condensador.
6. Extrair por um período de, no mínimo, 6 horas a velocidade de condensação de 2 a
4 gotas por segundo.
7. Recuperar o solvente e completar a secagem do balão ou copo em estufa a 105ºC
por 30 minutos.
8. Esfriar em dessecador até temperatura ambiente e pesar.
9. Repetir a operação de secagem até que a diferença entre duas pesagens sucessivas
não seja superior a 0,1% do peso da amostra.
CÁLCULO:
(A – B)
Extrato Etéreo % = C x 100
ONDE:
A = peso do balão ou copo + resíduo
B = peso do balão ou copo
C = peso da amostra em grama
OBSERVAÇÃO:
Conduzir sempre uma prova em branco, testando a qualidade do solvente utilizado.
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Balança analítica (precisão +/- 0,0001g)
- Estufa de secagem.
- Forno mufla.
- Conjunto para determinação de fibra bruta.
- Sistema de vácuo.
- Dessecador com cloreto de cálcio ou silica gel anidros.
- Copo Berzelius de 600mI ou erlenmeyer de 500ml com junta esmerilhada.
- Frasco kitassato
- Funil de Buchner +/- 10cm de diâmetro.
- Cadinho de Gooch capacidade de 40/50mI ou cadinho de vidro sinterizado porosidade
1 (90 a 150 micras).
- Fibras de óxido de alumínio ou amianto purificado.
- Tela de nailon ou poliester ou aço inox (200 mesh) ou papel de filtro qualitativo.
REAGENTES:
- Ácido sulfúrico P.A. (d = 1,84 g/ml)
- Hidróxido de sódio P.A.
- Álcool etílico ou acetona P.A.
- Solução anti-espumante
PROCEDIMENTO:
1. Pesar de 1 a 3g da amostra, conforme o teor de fibra bruta estimado.
Desengordurar.e secar em estufa a 105ºC por uma hora.
2. Transferir o resíduo para bequer, erlenmeyer ou cadinho de vidro sinterizado
(sistema automático). Adicionar 200ml de H2S04 1,25% (0,225N) em ebulição (sistema
automático - injetar 150ml), e algumas gotas de solução anti-espumante. Digerir com
refluxo por exatamente 30 minutos.
3. Filtrar quantitativamente a quente, sob vácuo em funil de Buchner provido de tela
de nailon, aço inox ou cadinho de vidro sinterizado (sistema automático). Proceder
lavagens sucessivas do resíduo com água fervente até completa neutralização.
4. Retornar o resíduo ao bequer ou erlenmeyer, lavando a tela com 200ml de NaOH
1,25% (0,313N) em ebulição (sistema automático -, injetar 150ml de NaOH 1,25% -
0,313N). Adicionar algumas gotas de solução anti-espumante. Digerir com refluxo por
exatamente 30 minutos.
5. Filtrar quantitativamente a quente sob vácuo em funil Buchner provido de tela de
nailon ou poliester, aço inox ou diretamente em cadinho de vidro sinterizado.
6.. Transferir quantitativamente o resíduo com auxílio de água quente para cadinho de
vidro sinterizado ou cadinho de Gooch contendo camada densa de fibras de óxido de
alumínio ou amianto purificado. Lavar com aproximadamente 20ml de álcool etílico
P.A. ou acetona P.A. e 20ml de acetona P.A. ou éter etílico ou petróleo P..A.o
7. Colocar em estufa a 105 C até peso constante (4 a 6 horas). Retirar, deixar em
dessecador até temperatura ambiente e pesar.
8. Incinerar em mufla a 550ºC por 2 horas ou a 600°C por 1 hora. Retirar a
temperatura de 250ºC / 300ºC. Resfriar em dessecador até temperatura ambiente e
pesar.
CÁLCULO:
(A – B)
Extrato Etéreo % = C x 100
ONDE:
A = Peso do cadinho + resíduo
B = Peso do cadinho + cinzas
C = Peso da amostra
OBSERVAÇÕES:
1. Em substituição a tela de nailon ou aço inox, poderá ser utilizado um tecido de linho
com textura equivalente.
2. Poderão ser eregados como anti-espumantes:
a. álcool n-amílico
b. solução de silicone (1g de silicone + 50ml de éter etílico + 50ml de éter de petróleo)
estocar em refrigerador.
3. A camada de fibras de óxido de alumínio ou amianto no cadinho de Gooch deverá
ter, após boa compactação, espessura suficiente para não permitir a passagem de
partículas de resíduo.
4. Ao Utilizar cadinho de vidro sinterizado, adotar temperatura máxima de 500ºC e
tempo mínimo de 3 horas.
5. O amianto deverá ser previamente calcinado, tratado com solução ácida e alcalina,
conforme o ensaio e lavado cuidadosamente de maneira a eliminar todo o resíduo.
Calcinar novamente.
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Balança analítica (precisão +/- 0,0001g)
- Forno mufla
- Dessecador com cloreto de cálcio ou silica gel anidros
- Cadinho ou cápsula de porcelana
PROCEDIMENTO:
1. Pesar o cadinho ou cápsula de porcelana, limpo e previamente calcinado em mufla a
550ºC/600ºC por 30 minutos, e resfriado em dessecador até temperatura ambiente.
2. Pesar de 2 a 3g da amostra no cadinho ou cápsula.
3. Levar à mufla e gradualmente aumenta temperatura (550/600ºC) até obtenção de
cinzas claras (3 horas no mínimo).
4. Retirar a 250/300ºC, resfriar em dessecador até temperatura ambiente e pesar.
CÁLCULO:
A-B
Cinzas ou Matéria Mineral % = (___________) x 100
C
ONDE:
A = Peso do cadinho ou cápsula + resíduo
B = Peso dó cadinho ou cápsula
C = Peso da amostra em grama
OBSERVAÇOES:
1. Nem sempre o resíduo obtido representa toda a substância inorgânica presente na
amostra, pois alguns sais podem sofrer redução ou volatilização nessa faixa de
temperatura.
2. Não se obtendo cinzas claras após decorrido o período mínimo de calcinação,
recomenda-se a adição de 2 a 3 gotas de HN03 concentrado ou água oxigenada 30
volumes, e retorno a mufla entre 550/600ºC por mais uma hora. Essa adição facilitará
a oxidação do carbono.
3. Opcionalmente ao item 3 (procedimento), poderá ser efetuada uma pré-queima em
placa aquecedora e/ou bico de Buzen, transferindo em seguida para mufla
(55Q/600ºC).
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Balança analítica (precisão +/:. 0,0001g)
- Forno mufla
- Dessecador com cloreto de cálcio ou silica gel anidros
- Cadinho ou cápsula de porcelana
- Papel filtro quantitativo, filtração média
- Bequer de 250ml
REAGENTES:
- Ácido clorídrico P.A.
PROCEDIMENTO:
1. Pesar o cadinho ou cápsula de porcelana, limpo e previamente calcinado em mufla a
550/600ºC por 30 minutos, e resfriado em dessecador até temperatura ambiente.
2. Pesar de 2 a 3g da amostra no cadinho ou cápsula.
3. levar à mufla e gradualmente aumentar a temperatura até (550/600ºC) até
obtenção de cinzas claras (3 horas no mínimo).
4. Retirar a 250/300ºC, resfriar até a temperatura ambiente.
5. Transferir quantitativamente as cinzas contidas no cadinho para bequer de 250ml,
lavando com três porções de aproximadamente 20ml de solução de ácido clorídrico
1:1. Ferver por 5 minutos.
6. Filtrar quantitativamente sobre papel de filtro, lavando o resíduo com H20 destilada
quente até eliminação de todo o ácido.
7. Transferir o papel de filtro com resíduo para cápsula ou cadinho de porcelana,
previamente tarado. levar à mufla e gradualmente aumentar a temperatura. Manter
por duas horas. (no mínimo) à temperatura de 550/600ºC.
8. Retirar a 250/300ºC. Resfriar em dessecador até temperatura ambiente e pesar.
CÁLCULO:
A-B
Resíduo insolúvel % = (__________) x 100
C
ONDE:
A = Peso da cápsula ou cadinho + resíduo
B = Peso de cápsula ou cadinho
C = Peso original da amostra em grama
OBSERVAÇÃO:
Opcionalmente aos itens 3 e 7, poderá ser efetuada uma pré-queima em placa
aquecedora, transferindo em seguida para a mufla (500/600ºC).
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Placa aquecedora. ou banho maria
- Bequer de 250 ou 300ºC
- Funil analítico
- Cadinho de Gooch
- Fibras de Óxido de Alumínio ou Amianto
- Vidro de relógio
- Pipetas volumétricas
- Pipetas graduadas (ou repipetador automático)
- Proveta de 50ml
- Balões volumétricos
- Papel de filtro qualitativo
- Bastão de vidro
- Bureta ambar de 50ml (1/20)
REAGENTES:
- Ácido clorídrico P.A. .
- Ácido sulfúrico P.A.
- Oxalato de amônio P.A. '"
- Hidróxido de amônio P.A.. .
- Permanganato de potássio P.A.
- Vermelho de metila P.A.
PROCEDIMENTO:
1. Com o auxílio de bastão de vidro, transferir quantitativamente para béquer as cinzas
obtidas na determinação de matéria mineral. Lavar o cadinho com pequenas porções
de solução de HCl 1/1 totalizando 40 ml, e em seguida com água destilada. Cobrir com
vidro de relógio e levar a placa aquecedora até que haja redução de 1/3 do volume.
Esfriar.
2. Filtrar sobre papel de filtro qualitativo para balão volumétrico adequado. Completar
o volume com água destilada e homogeneizar (solução estoque). Reservar esta
solução também para a determinação de fósforo.
3. Pipetar volumétricamente uma alíquota adequada para bequer de 250 ou 300ml.
Adicionar 2 a 3 gotas de vermelho de metila 0,1% e diluir com água destilada até
aproximadamente 50 ml.
4. Aquecer brandamente em placa aquecedora ou banho maria, (70/80ºC) e
acrescentar sob agitação constante 25ml de oxalato de amônio 4,2% quente. Adicionar
NH40 1/1, gota a gota sob agitação constante, até que a coloração mude do vermelho
para rosa. Se houver mudança da coloração para amarelo, gotejar HCI 1:3 até retorno
para rosa. Deixar em repouso no mínimo 1 hora e máximo de 3 horas.
5. Filtrar sob vácuo em cadinho de Gooch com camada de fibra de óxido de alumínio
ou amianto. Lavar o bequer e o precipitado 3 vezes com NH40H 1/50 ou até que
algumas gotas do filtrado não reajam com solução de nitrato de prata acidulada com
ácido nítrico.
6. Transferir o cadinho de Gooch com o precipitado para o bequer original. Adicionar
água destilada até cobrir o cadinho e 5ml de H2S04 P.A.
7. Aquecer até completa dissolução do precipitado (próximo a ebulição), e titular com
KMn04 0,05 N sob constante agitação- até coloração rósea clara persistente por 30
segundos. Cuidar para que durante a titulação a temperatura não fique abaixo de
60ºC.
CÁLCULO:
V x N x F x 0,02004 x S x 100
Cálcio % = PxA
ONDE:
V = Volume de KMn04 0,05 N gasto na titulação.
N = Normalidade.
F = Fator de correção da solução de KMn04 0,05 N.
S = Volume da solução estoque.
P = Peso da amostra em grama.
A = Volume da alíquota utilizado
0,02034 = miliequivalente grama do cálcio.
OBSERVAÇOES:
1. Não é necessário calcinar amostras isentas de matéria orgânica.
2. O Manganês é reduzido pelo oxalato em meio ácido, de + 7.para + 2, tornando a
solução de permanganato incolor. A primeira gota que não for reduzida, dará a
mesma, uma tonalidade rosa.
3. Orientação para volumes estoques e alíquotas de acordo com o percentual de cálcio
esperado.
cálcio esperado % volume estoque alíquota
0-1% 200ml 100 ml
1-4% 200ml 50ml
4 - 10 % 250ml 20ml
10 - 20 % 250ml 10ml
20 - 40 % 500ml 10ml
SOLUÇÕES REAGENTES E VOLUMÉTRICAS:
PADRONIZACÃO:
Pesar exatamente 3,35g de oxalato de sódio Na2C204 P.A. previamente seco em
estufa a 105ºC por duas horas. Dissolver em bequer com aproximadamente 100ml de
água destilada, transferir para balão volumétrico de 1000ml e completar o volume.
Pipetar 20ml da solução de Na2C204 para erlenmeyer de 250ml, adicionar 10ml de
H2S04 1:1. Aquecer a 70/80ºC e titular nessa temperatura gotejando a solução de
KMn04 0,05N numa velocidade de 2 a 3 gotas/segundo, até coloração levemente rósea
persistente por 30 segundos.
CALCULO DO FATOR
P NR
N= VxE NE
ONDE:
E = Equivalente grama do oxalato de sódio
P = Peso do oxalato de sódio em miligrama na alíquota
V = Volume de KMn04 gasto na titulação
NR = Normalidade real
NE = Normalidade esperada
MATERIAL E EQUIPAMENTo
- Balão vólumétrico de 100 ou 250ml
- Pipeta volumétrica de 10 ml e 25ml
- Erlenmeyer de 250 e 500ml
- Placa aquecedora
- Papel de filtro
- Pipeta graduada
- Buretas de 25ml
- Pérolas de vidro
REAGENTES:
- Ácido ClorIdrico P.A.
- Molibdato de amônia P.Á.
- Hidróxido de sódio P. A.
- Trietanolamina P.A.
- Cianeto de potássio P.A.
- Calcelna P.A.
- Timolftaleína P.A.
- Nitrato de potássio P.A.
- EDTA P.A.
PROCEOIMENTO:
1. Com o auxílio de bastão de vidro, transferir quantitativamente as cinzas obtidas na
determinação de matéria mineral para bequer, lavar o cadinho, com pequenas porções
de solução de HCI 1:1, totalizando 40ml e em seguida, com água destilada, cobrir com
vidro de relógio e levar à placa aquecedora ate que haja redução de 1/3 do volume.
Esfriar.
2. Filtrar sobre papel de filtro qualitativo para balão volumétrico adequado. Completar
o volume com água destilada (solução estoque).
3. Pipetar volumetricamente uma alíquota adequada da solução estoque e transferir
para bequer de 250 m,i.
4, Adicionar 25ml de solução de molibdato de amônio 5%, 2,5ml de ácido clorídrico e
levar à placa aquecedora a 70ºC durante uma hora.
5. Deixar esfriar.
6. Filtrar em papel de filtro, recolhendo o filtrado em erlenmeyer de 500ml. Fazer
lavagens sucessivas com água destilada até extração completa.
7: Adicionar 20mI de hidróxido de sódio 4N, água destilada, 5ml de cianeto de
potássio 0,1N e 5ml de trietanolamina 20% (realizar esta operação em capela de
exaustão).
8. Elevar o volume a 300ml com água destilada e adicionar pequena quantidade de
calceina mista, sob agitação.
9. Titular com EDTA 0,02M. O ponto final da titulação a coloração passa de uma
fluorescência verde amarelada para uma não fluorescência violácea.
CÁLCULO;
V x M x F x 40,08 x 100
Cálcio % = P x 1000
ONDE:
V = Volume gasto de EDTA
M = Molaridade da solução de EDTA
F = Fator de correção dá solução de EDTA
40,08= Peso molecular do cálcio
a. Calceina mista
Misturar 0,2g de calceína., 0,12g de timolftaleina e 20g de nitrato de potássio. Manter
em frasco ambar.
PADRONIZAÇÃO:
Pesar, em erlenmeyer de 250ml 0,5055g de carbonato de cálcio P.A. previamente seco
em estufa a 105ºC por três horas. Adicionar quantidade de HCI 10% suficiente para
dissolver o sal e transferir quantitativamente para balão volumétrico de 250ml com
água destilada, completando o volume. Depois de bem homogeneizado, pipetar
alíquota de 25ml e proceder de maneira idêntica a determinação de cálcio.
25 ml
FC = V
ONDE:
V = volume gasto de EDTA
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Colorímetro fotoelétrlco
- Pipetas volumétricas
- Balões volumétricos de 100ml
- Pipeta graduada
REAGENTES:
- Metavanadato de amônio P.A.
- Ácido nítrico P.A.
- Molibdato de amônio P.A.
- Fosfato de potássio monobásico P.A.
- Ácido sulfúrico P.A.
PROCEDIMENTO:
1. Pipetar volumetricamente para balão de 100ml, alIquota da solução estoque de
maneira que a leitura esteja em uma faixa de 15% a 50% transmitância ou 0,824 a
0,222 de absorbância.
2. Adicionar 4ml de H2S04 10N e 20ml do reagente misto. Completar o volume com
água destilada, homogeneizar e aguardar no mínimo por 10 minutos antes de fazer a
leitura.
3. Paralelamente, preparar um branco contendo os mesmos volumes de H2S04 10N,
reagente misto e água destilada.
4. Determinar a absorbâncla ou transmitância em fotocolorImetro a 420nm, zerando
anteriormente com o branco.
5. Comparar a absorbância ou transmitância com a curva padrão previamente
elaborada, ou usar equação de regressão.
CÁLCULO:
L x S x D x 100
Fósforo % = PXA
ONDE:
L = Leitura do gráfico em mg
D = Fator de diluição
S = Volume da solução estoque
P = Peso da,amostra em ,miligrama
A = Volume da alíquota utilizado
OBSERVAÇOES:
A coloração amarela do complexo formado possui estabilidade limitada, devendo ser
determinada de acordo com a qualidade dos reagentes empregados na solução mista.
SOLUÇOES REAGENTES E VOLUMÉTRICAS:
e. Reagente misto
Juntar 1 parte da solução de metavanadato com 1 parte da solução de molibdato de
amônio e homogeneizar. Preparar momentos antes da utilização.
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Colorímetro fotoelétrico
- Pipetas volumétricas
- Pipetas graduadas,
- Balões voiumétricos capacidade 200, 100 e 50ml
REAGENTES:
- Molibdato de amônio P.A.
- Ácido sulfúrico P.A.
- Fosfato de potássio monobásico P.A.
- Bissulfito de sódio P.A.
- Sulfito de s6dio P.A.
- Ácido - 1 amino- 2 naftol-4 sulfônico ou sulfato de p-aminofenol P.A.
PROCEDIMENTO:
1. Pipetar volumetricamente para balão de 50ml, alíquota da "solução estoque" de
maneira que a leitura a ser obtida esteja em uma faixa de 15 a 60% de transmitância
ou 0,824 a 0,222 de absorbância.
2. Adicionar cerca de 25ml de água destilada e 5ml de molibdato de amônio. Misturar
girando o balão.
3. Adicionar 2ml de ácido 1-2-4 aminonaftolsulfônico ou sulfato de p-aminofenol e
marcar o tempo. Completar o volume, tampar e agitar.
4. Paralelamente preparar um branco contendo os mesmos volume de molibdato de
amônio, ácido 1,2,4 aminonaftolsulfônico ou sulfato de p.aminofenol e água destilada.
5. Após 20 minutos exatamente, fazer a leitura a 720 nm, zerando anteriormente com
o branco.
6. Comparar a absorbância ,ou transmitância com a curva padrão previamente
preparada, ou usar a equação de regressão:
CALCULO:
L x :S x D x 100
Fósforo % =
PxA
ONDE:
L= Leitura do gráfico em miligrama
D= Fator de diluição
S= Volume da solução estoque
P= Peso da amostra em miligrama
A= Volume da alíquota utilizado
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Bequer 300 ou 400ml
- Proveta graduada
- Funil analítico
- Pipetas volumétricas
- Placa aquecedora ou banho-maria com controle de temperatura
- Pipetas graduadas,
- Buretas de 50ml (1/10)
- Papel de filtro quantitativo filtração lenta
- Bastão de vidro
REAGENTES:
- Ácido clorídrico P.A.
- Âcido nítrico P.A.
- Hidróxido de amônio P.A.
- Hidroxido de sódio P.A.
- Nitrato de potássio P.A.
- Nitrato de amônio P.A.
- Fenolftaleina P.A.
- Molibdato de amônio P.A.
PROCEDIMENTO:
1. Pipetar volumetricamente uma aliquota adequada da solução estoque, e transferir
para bequer.
2. Utilizando uma tira de papel tornassol, alcalinizar com NH40H 1/1 e adicionar
aproximadamente 10g de NH4NO3 P.A., agitando até dissoluçao.
3. Acldular com HNO3 1/1. elevar a 100ml com água destilada e adicionar 2 gotas de
HN03 1/1 em excesso.
4. Levar à placa aquecedora ou banho-maria a 40/50ºC. Gotejar com agitação
constante, volume adequado de solução de molibdato de amônio até completa
precipitação. Manter nessa faixa de temperatura por uma hora com agitaçao ocasional.
Esfriar.
5. Filtrar quantitativamente sobre papel de filtro, lavando o bequer 2 vezes com HN03
2% e 4 vezes com KN03 1% com o auxílio de bastao de vidro de ponta de latex.
Transferir o papel contendo o precipitado para o bequer original.
6. Adicionar NaOH 0,2N até completa dissoluçao do precipitado e registrar o volume
gasto utilizando 3 a 5 gotas de fenolftale!na 1%, titular com HCI 0,2N até viragem do
indicadbr (violeta para incolor).
CÁLCULO:
(VS x F1 - VA x F2) x N x S x 0,0269)
P% = PxA
ONDE:
VS = Volume de NaOH 0,2 N
VA = Volume de HCI 0,2 N gasto na tltulaçao
F1 = Fatór de correção do NaOH 0,2 N
F2 = Fator de correçao de HCI 0,2 N
N = Normalidade
S = Volume da soluçao estoque
P = Peso original da amostra em grama
A = Volume da slíquota utilizado
0,0269 = Fator de conversao de P205 em P
PADRONIzAÇÃO:
Pesar com exatidão 1,5g de biftalato de potássio P.A. previamente seco em estufa
105ºC por duas horas. Dissolver em erlenmeyer com aproximadamente 75ml de água
destilada. Adicionar 4 gotas de solução alcóolica de fenolftaleína 1% e titular gotejando
a solução de NaOH O,2N até coloração levemente rósea.
CALCULO DO FATOR:
P NR
NR = VxE NE
ONDE:
E = Equivalente grame de biftalàto de potássio,
P = Peso do biftaLato de potassio em miligrama
V = Volume de NaOH 0,2N consumidq
NR = NormalIdade real
NE = Normalidade esperada
PADRONIZAÇÃO:
Pesar com exatidão 0,26g de Na2CO3 P..A. previamente seco, em mufla 270ºC por 1
hora. Dissolver em erlenmeyer, adicionando aproximadamente 20ml de HCl 0,2N
medidos em bureta, e 4 gotas de alaranjado de metila 0,2%.Prosseguir a titulação
gotejando a solução de HCl 0,2N até leve coloração rósea. Aquecer até ebulição e
esfriar. Havendo permanência da coloração rósea, considerar terminada a titulação.
Caso contrário, prosseguir até rósea constante.
CALCULO DO FATOR:
P NR
NR = VxE NE
ONDE:
E = Equivalente grama de Na2C03
P = Peso de Na2C03 em miligrama
V = Volume gasto na titulação em ml
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Colorímetro fotoelétrico
- Pipetas volumétricas
- Pipetas graduadas
- Balões volumétricos ou garrafas Stohlman .
- Agitador tipo Wagher ou similar ou agitador magnético
- Papel de filtro quantitativo, filtração média.
REAGENTES:
- Ácido cítrico P.A, '
- Reagentes usados na determinação de fósforo colorimétrico(molibdato vanadato)
PROCEDIMENTO:
1..Pesar1,0g de amostra e transferlr para um balão volumétrico de 250ml ou garrafa
stohlman.
2.Adicionar 100ml de solução de ácido cítrico 2%.
3. Agitar durante 30 minutos a velocidade de 30-40 RPM (agitador tipo Wagner).
Empregando-se outro sistema, a velocldade deve ser branda mas suficiente para
provocar revolução completa do material.
4. Completar o volume homógeneizar e filtrar em papel filtro.
5. Transferir para balão volumetrico de 100ml, uma alíquota da amostra conforme o
teor esperado.
6. Adicionar 20ml de água destilada, 4ml de H2S04 10N e 20ml.de solução
vanadomolíbdica. Agitar, completar e homogeneizar.
7. Paralelamente preparar um branco.
8. Esperar 10 minutos e determinar absorbância ou transmitância a 420nm. Comparar
com uma curva padrão previamente preparada ou usar equação de regressão.
CÁLCULO: .
L x S x 100
Fósforo solúvel % = PxA
ONDE:
L = Leitura do gráfico em miligrama
S = Volume da solução
P = Peso da amostra em rniligiama
A = Volume da alíquota utilizado
Ps
Solubilidade Cítrica % =_____________x 1.00
Pt
ONDE:
Ps = Fósforo solúvel
Pt = Fósforo total
OBSERVAÇOES:
1. A amostra deve apresentar granulometria correspondente a no máximo 0,425mm
(ABNT).
2. A alíquota a ser pipetada da solução estoque deverá adequar-se de tal forma que a
leitura encontrada no aparelho esteja sempre na faixa entre 15 a 60% de
transmitância ou 0,624 a 0,222 de absorbância.
3. A coloração amarela do complexo formado possui estabilidade limitada, devendo ser
determinada de acordo com a qualidade dos reagentes empregados na solução mista.
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Balança analítica (precisão +/- 0,0001g)
- Tubos de ensaio 25 x 150mm com tampa
- Pipetas volumétricas
- Banho termostático sorológlco
- Bequer de 10ml
- Potenciômetro (sensibilidade 0,01 de pH)
REAGENTES:
- Fosfato monobásico de potássio P.A.
- Fosfato dibásico de potássio P.A.
- Uréia P.A;
- Ácido fosfórico P.A.
- Hidróxido de potássio P.A.
PREPARO DA AMOSTRA:
Moer a amostra, evitando: aquecimento, de tal forma que pelo menos 60% passe em
peneira de 0,425 mm.
PROCEDIMENTO:
1. Pesar exatamente duas porções de 0,2g de amostra e transferir quantitativamente
para dois tubos de ensaio.
2. Adicionar volumetricamente 10ml de solução tampão de fósforo pH 7,0 ao tubo A.
Agitar sem invertê-Io. Tampar, colocar em banho termostático a 30 +/- 0,5ºC
anotando o tempo. Esta será a prova em branco.
3. Adicionar volumetricamente 10ml de solução tamponada de uréia pH 7,0 ao tubo B.
Proceder conforme o item anterior.
4. Para facilidade operacional, manter entre os mesmos um intervalo de 5 minutos.
5. Retirar os tubos do banho, após transcorridos exatamente 30 minutos.
6. Transferir o líquido sobrenadante para bequer de 10ml e em seguida medir o pH de
A e B.
CÁLCULO:
Atividade ureática = pH amostra B - pH amostra A
OBSERVAÇOES:
1. A não estabilização do potenciômetro pode ser atribuida a obstrução do elétrodo de
calomelano por uma película da fração solúvel de proteina de soja. Deve-se proceder
uma limpeza apropriada, empregando-se uma solução de pepsina 1%, onde o eletrodo
deverá ficar imerso por tempo suficiente.
c. Observações,
1) Eliminar a solução tampão de fosfato após 30 dias do seu preparo.
2) Preparar a solução tamponada de uréia imediatamente antes do uso.
3) Soluções de ácido fosfórico e hidróxido de potássio poderão ser usadas na
concentração 0,2N.
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Balança semi-analítica (precisão +/- 0,01g)
- Erlenmeyer ou bequer de 250ml
- Funil analítico
- Papel de filtro Qualitativo
- Bureta de 25ml div. 1/10
- Proveta
- Erlenmeyer de 300ml
- Bastão de vidro
REAGENTES:
- Álcool, etílico P.A.
- Hidróxido de sódio P.A.
- Fenolftaleína P.A.
PROCEDIMENTO:
1. Pesar 5g de amostra e transferir para erlenmeyer ou bequer de 250ml.
2. Adicionar 150ml de álcool etílico previamente neutralizado, deixar em repouso por
30 minutos, fazendo agitações ocasionais (5 em 5 minutos).
3. Filtrar o sobrenadante sobre papel de filtro para erlenmeyer de 300ml.
4. Adicionar ao resíduo 100ml de álcool etílico previamente neutralizado e deixar em
repouso por 15 minutos com agitações ocasionais.
5. Fllfrar sobre o mesmo papel de filtro, juntando ao filtrado obtido no item 3.
6. Titular com solução de NaOH 0,1N, utilizando 4 a 5 gotas de fenolftaleína 1%, até
atingir coloração rósea persistente por 30 segundos.
CÁLCULOS:
Índice Acidez em meq. V x N x f x 100
NaOH 0,1N/100g de amostra = P
Índice Acidez em mg V x N x f x 40
NaOH/g. de amostra = P
ONDE:
V = Volume gasto de NaOH 0,1N na titulação.
N = Normalidade da solução de NaOH.
f = Fator de correção do NaOH 0,1N.
P = Peso da amostra em grama
OBSERVAÇOES:
1. Utilizar ácool etílico neutralizado, preparado imediatamento antes do uso.
2. Recomenda-se conduzir prova em branco dos reagentes.
3. Manter o frasco de álcool etílico fechado, para evitar formação de ácido carbônico.
PADRONIZAÇÃO:
Pesar com exatidão, cerca de 0,40 g de biftalato de potássio P.A. previamente seco em
estufa a 120ºC por 2 horas. Dissolver em erlenmeyer com aproximadamente 75ml de
água destilada. Adicionar 4 gotas de solução alcóolica de fenolftaleíria 1% e titular
gotejando a solução de NaOH 0,1N até coloração levemente rósea
CÁLCULO DO FATOR:
NR = P F= NR
VxE NE
ONDE:
E = Equivalente grama de biftalato de potássio
P = Peso do biftalato de potássio em miligrama
V = Volume gasto na titulação em ml
NR = Normalidade real
NE = Normalidade esperada
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Balança semi-analítica (precisão +/ - 0,01g)
- Erlenmeyer de 250ml
- Bureta de 25ml (1/10)
- Proveta
REAGENTES:
- Éter etílico P.A.
- Álcool etílico P.A.
- Hidróxido de Sódio P.A.
- Fenolftaleína P.A
PROCEDIMENTO:
1. Pesar 5g da amostra em erlenmeyer.
2. Adicionar 100ml da mistura éter-álcool (2/1) previamente neutralizada e agitar até
completa.dissolução.
3. Titular com solução de NaOH 0,1N, utilizando 4 a 5 gotas de fenolftaleína 1%, até
atingir coloração rósea persistente por 30 segundos.
CÁLCULO:
OBSERVAÇOES:
1. Amostras de difícil dissolução, levar após pesagem ao Banho-maria e aquecer até
dissolver completamente. O excesso de aquecimento pode provocar elevação do valor
de ácidos graxos livres.
2. Utilizar mistura éter.álcool neutralizada, preparada imediatamente antes do uso.
3. Recomenda-se conduzir prova em branco dos reagentes.
4. Manter o frasco da mistura éter-álcool fechado para evitar formação de ácido
carbônico.
PADRONIZAÇÃO:
Pesar com exatidão, cerca de 0,40 gramas de Biftalato de potássio P.A. previamente
seco em estufa a 120ºC por 2 horas. Dissolver em erlenmeyer com aproximadamente
75ml de água destilada. Adicionar 4 gotas de solução alcóolica de fenolftaleína 1% e
titular gotejando a solução de NaOH 0,1N até coloração levemente rósea.
CÁLCULO DO FATOR:
NR = P F= NR
VxE NE
ONDE:
E – Equivalente grama de biftalato de potássio
P - Peso do biftalato de potássio em miligrama.
V = Volume gasto na titulação em ml
NR = Normalidade real
NE = Normalidade esperada
REAGENTES:
- Álcool etílito P.A.
- Hidróxido de sodio P.A.
- Fenolftaleína P.A.
PROCEDIMENTO:
1. Pesar 2g da amostra em erlenmeyer ou bequer de 250ml.
2. Adicionar 100 a 150ml mistura água-álcool (1/1) previamente neutralizada e
agitatar até completa dissolução.
3.. Titular com solução de NaOH 0,1N utilizando, 4 a 5 gotas de fenolftaleína 1% até
atingir a coloração rósea persistente por 30 segundos.
CÁLCULO:
Índice de acidez em V x f x N x 0,06 x 100
Acido Acético % = P
ONDE:
V -= Volume gasto de NaOH 0,1 N na titulação
f = Fator de correção do NaOH 0,1N.
N = Normalidade
N = Peso da amostra em grama
0,06 = Miliequivalente grama do ácido acético
OBSERVAÇOES:
1. Utilizar água-álcool neutralizada preparada imediatamente ante do uso.
2. Recomenda-se conduzir prova em branco dos reagentes.
3. Manter o frasco da mistura água-álcool tampado para evitar formação de ácido
carbonico.
PADRONIZAÇÃO:
Pesar, com exatidão, cerca de 0,40g de Biftalato de potássio P.A. previamente seco em
estufa a 120ºC por 2 horas. Dissolver em erlenmeyer com aproximadamente 75ml de
água destilada. Adicionar 4 gotas de solução alcoolica de fenolftaleína 1% e titular
gotejando a soluçao de NaOH 0,1N até coloração levemente rósea
CÁLCULO DO FATOR:
NR = P F= NR
VxE NE
ONDE:
E = Equivalente grama de biftalato de potássio
P = Peso do biftalato de potássio em miligrama
V = Volume de NaOH 0,1N gasto na titulação em ml
NR = Normalidade real
NE = Normalidade esperada
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Balança analítica (precisão +/- 0,0001g)
- Bureta 25 ml divisão 1/10
- Erlenmeyer de 250ml
- Forno mufla
- Funil analítico
- Papel de filtro qualitativo
- Pipeta graduada 10 ml
- Cadinho ou cápsula de porcelana
REAGENTES:
- Ácido nítrico P.A.
- Difenilcarbazona P.A.
- Nitrato mercúrico P.A.
PROCEDIMENTO:
1. Pesar 5 g da amostra em cápsula de porcelana ou cadinho e levar à mufla a 500ºC
por 2 horas. Retirar e esfriar até a temperatura ambiente.
2. Transferlr quantitativamente o resíduo para erlenmeyer de 250ml atraves de papel
filtro qualitativo lavando várias vezes com água destilada quente.
3. Utilizando solução de ácido nítrico 1:4, ajustar o pH do filtrado entre 2,3 e 2,8 e
adicionar 3 a 4 gotas de solução alcóolica de difenilcarbazona 0,5%.
4. Titular com nitrato mercúrico 0,1N até viragem de incolor para azul violáceo.
CÁLCULOS:
ONDE:
V = Volume de nitrato de mercúrio 0,1N gasto na titulação
F = Fator de correção de nitrato de mercúrio 0,1N
N = Normalidade do nitrato mercúrico
P = Peso amostra em grama
OBSERVAÇÕES:
1. O cálcuio do NaCI % considera que todo o cloreto seja proveniente do
NaCI.
2. O método é aplicável somente para cloretos solúveis em água.
-,
3. Amostras com_alto teor de cloretos (sais e mist~ras minerais),
proceder diluições adequadas.
PADRONIZAÇÃO:
Pesar com exatidão, cerca de 0,117g de NaCl P.A. previamente seco em mufla a 300ºC
por uma hora. Transferir para erlenmeyer 125ml e dissolver com aproximadamente
20ml de água destilada. Acidular com HN03 1:4 até pH 2,3 - 2,8. Titular, gotejando a
solução de Nitrato Mercúrico 0,1N até viragem para cor azul violácea.
CÁLCULO DO FATOR:
NR = P F= NR
VxE NE
ONDE:
P = Pesodo cloreto de sodio
E = Equivalente grama do cloreto de sódio
V = Volume gasto na titulação
NR = Normalidade real
NE = Normalidade esperada
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Balança analítica (precisão +/- 0,0001g)
- Forno mufla
- Chapa aquecedora
- Erlenmeyer de 250 ou 300ml
- Papel de filtro quafltativo
- Balão volumétrico de 100ml
- Pipeta vo.lumétrica de 50ml
- Bureta de 25ml divisão 1/10
- Cadinho ou cápsula de porcelana
REAGENTES:
- Nitrato de prata P.A.
- Cromato de potássio P.A.
- Ácido nítrico P.A.
- Carbonato de cálcio P.A.
- Cloresto de sódio P.A.
PROCEDIMENTO.
1. Pesar 5g da amostra em cápsula de porcelana ou cadinho e levar à mufla a 500ºC
por 2 horas. Retirar e esfriar a temperatura ambiente.
2. Solubilizar o resíduo com HN03 2% quente. Transferir quantitatlvamente para balão
volumétrlco a de 100ml através de papel de filtro qualitativo, lavando 2 a 3 vezes com
HN03 2% quente. Completar o volume com água destilada e homogeneIzar.
3. Retirar alíquota de 50ml para erlenmeyr de 250 ou 300ml e neutralIzar com
carbonato de cálcio P.A. utilizando papel, tornassol como indicador. AdIcionar um
excesso de +/- 0,5g de carbonato de cálcio.
4. Aquecer em chapa aquecedora até ebulição, mantendo por 2 ou 3 minutos até
desprendimento de todo C02 formado. Esfriar.
5. Adjcionar 2 a 3 gotas de cromato de potássio 5% e titular com ni'trato de prata 0,05
N até vlragem para cor vermelho tijolo clara.
CALCULOS:
OBSERVAÇOES:
1. Para produtos de origem mineral, adotar o seguinte procedimento:
a. Pesar 5g da alllostra, pre,vIamente triturada e homogeneizada em gral. Transferir
para erlenmeyer de 500ml adicionar 100 a 150 ml água destilada e levar a fervura por
5 min. Esfriar.
b. Filtrar sobre papel de filtro em balão volumétrico de 500ml, lavando o erlenmeyer e
o papel com sucessivas porções de água destilada.
Completar o volume e homogeneizar.
c. Retirar alíquota conforme tabela, para erlenmeyer de 250 ou 300ml e continuar a
partir do ítem 4 do procedimento:
PADRONIZAÇAo:
Pesar com exatidão, cerca de 0,07g de NaCl P.A. previamente seco em mufla a 300ºC
por .1 hora. Transferir para erlenmeyer de 125ml e adicionar cerca de 30 a 40ml de
água destilada. Dissolver, acrescentar 1ml de K2CrO4 5% e titular com AgN03 0,05N
até aparecimento da cor vermelho tijolo clara.
CÁLCULO DO FATOR:
F = ___________P___________
0,00585 x N x V
ONDE:
F = Fator de correção do nitrato de prata 0,05N
P = Peso em grama do cloreto de sódio
N = Normalidade
V = Volume de AgNO3 gasto na titulação
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
REAGENTES:
- Ácido nítrico P.A.
- Nitrato de prata P.A.
- Persulfato de potássio P.A.
- Difenilcarbazida P.A.
- Álcool etílico P.A.
PROCEDIMENTO:
1. Pesar cerca de 2g P.A. amostra em cadinho ou cápsula de porcelana.
2. Incinerar a 600ºC por 20 minutos. Retirar a 250/300ºC e resfriar.
3. Adicionar 5ml de HN03 P.A. e aquecer até iniciar ebulição. Esfriar.
4. Aplicar na placa de tock:
1 gota da qmostra digerida
1 gota de persulfato de potássio saturado
1 gota de nitrato de prata 1 N '
Esperar 3 minutos e aplicar 1 gota de solução dedifebilcarbazida 1%
5. O aparecimento de coloração violeta no momento da aplicação da solução de
difenilcarbazida, indica presença de cromo na amostra.
OBSERVAÇOES:
1. A presença de cromo na amostra pode ser um indicativo de adição de raspas de
couro.
2: Testar os reagentes com uma solução 5 ppm de cromo (dicromato de potássio,
óxido crômico, etc.) antes da análise.
3. A estocagem das soluções de persulfato de potássio e difenilcarbazida por longo
perIodo, podem comprometer a sensibilidade do método.
SOLUÇÕES REAGENTES:
a. Solução reagente de persulfato de potássio
Pesar 3g de K2S208 em bequer e dissolver em 100ml de água destilada. Estocar em
geladeira.
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Frasco de destilação com 3 bocas ou Claysen ou Barret, capacidade 500 ou 1000ml
- Condensador de Allihn ou Liebig
- Termômetro - escála até 150ºC
- Juntas e conexões
- Duas fontes de aquecimento
- Frasco gerador de vapor capac. 1000 ou 2000ml
- Balança analítica - precisão +/- 0,0001g
- Pérolas de vidro
- Agitador magnético e barra
- Funil de separação - capac. 50 ou 100ml
- Balões volumétricos 100, 250 e 500ml
- Pipetas volumétricas 50ml
- Micro bureta capac. 2 ou 5ml divisão 1/100
- Cadinho de níquel
REAGENTES:
- Fluoreto de sódio P.A.
- Alizarina sulfonato de sódio P.A.
- Hidróxido de sódio P.A.
- Permanganato de potário P.A.
- Ácido perclórico ou sulfúrico P.A.
- Nitrato de tório P.A.
- Ácido clorídrico P.A.
- Ácido monocloroacético P.A.
- Fenoftaleína P.A.
PROCEDIMENTO:
1. Triturar e homogeneizar uma porção da amostra em gral. Pesar de 0,5
a 5,0g dependendo do teor de flúor esperado e transferir quantitativamente para
frasco de destilação.
ATENÇÃO: Produtos contendo matéria orgânica deverão ser previamente submetidos a
fusão, antes da transferência para o frasco de destilação.
Quando se trabalha com ácido perclórico, a presença de matéria orgânica pode
provocar explosão violenta. (vide observações).
2. Adicionar certa de 30ml de água destilada, 5 gotas de solução saturada de
permanganato de potássio e 6 a 8 pérolas de vidro ou lã de vidro.
3. Fechar o frasco de destilação com rolhas de borracha, através das quais passam:
a. Um tubo de vidro concectado ao frasco gerador de vapor, cuja extremidade deve
estar mergulhada no líquido.
b. Um funil de separação e um termômetro (mergulhado no líquido).
c. Um tubo de vidro conectado ao condensador.
4. Aquecer a ebulição o frasco gerador de vapor (usar água destilada), deixando a
saída de segurança aberta e a saída de vapor para o frasco de destilação fechadas;
5. Colocar 35ml de ácido perclórico ou sulfúrico no funil de separação. Abrir
cuidadosamente a torneira e deixar o ácido escorrer lenta e totalmente fechando-a em
seguida.
6. Iniciar o aquecimento do frasco de destilação. Quando a temperatura atIngir 135ºC,
abrIr a saída do gerador de vapor para o frasco, fechando a saída de segurança em
seguida.
7. Regular o aquecimento dos frascos, de maneira a manter constante o volume da
solução e a temperatura entre 132 e 135ºC.
8. Prosseguir com a destilação (mínimo de 30 minutos), até que cerca de 200ml do
destilado tenha sido recolhido em balão volumétrico de 250ml ou 500ml, contendo
30ml de NaOH 1N com algumas gotas de fenolftaleína.
9. Abrir a saída de segurança do gerador de vapor e desligar as fontes de
aquecimento.
10. Completar o volume do balão volumétrico com água destilada e homogeneizar.
Pipetar volumétricamente, uma aliquota.de 100ml para erlenmeyer de 250ml e
adicionar de 8 a 10 gotas de solução indicadora de alizarina sulfonato de sódio 0,05%.
11. Adicionar HCl 0,5% até pH 3 - 3,5 ou coloração amarela. Adicionar 1ml de solução
tampão.
12. Titular lentamente com solução de nitrato de tório 0,05N até coloração levemente
rósea (mesma coloração considerada na fatoração do nitrato de tório).
CÁLCULO:
ONDE:
V = Volume de nitrato de tório gasto na titulação
N = Normalidade
F = Fator de correção do nitrato de tório
P = Peso inicial da amostra em grama
S = Volume da solução estoque
A = Volume da alíquota utilizado.
0,019 = Miliequivalente grama de Fluor
0BSERVAÇOES:
1. O destilado deverá ser obtido a temperatura ambiente. Caso contrário,
desconsiderar a prova e reavaliar o sistema de condensação.
2. Proceder prova de recuperação em fluoretos de cálcio e de sódio, utilizando água
destilada deionizada,
3. Em substituição ao ácido perclórico, poderá ser utilizado ácido sulfúrico P.A. (mínimo
30ml) e máximo de 60ml para 5g de amostra)
4. Quando for necessário a fusão da amostra, usar cadinho de níquel e
aproximadamente 2,5g do fundente (hidróxido de sódio, carbonato de cálcio ou óxido
de cálcio). A fusão deve ser efetuada em capela, usando bico de Bunsen, até formação
de uma pasta homogênea. Tomar os cuidados necessários, para evitar a projeção da
amostra, esfriar à temperatura ambiente e transferir a amostra fundida para balão de
destilação.
5. A fusão da amostra da ração poderá ser substituída por calcinação a 600ºC, em
mistura com oxido de cálcio.
6. Na destilação com ácido perclórico, a temperatura não deve ultrapassar 135ºC.
7. Durante a titulação é recomendável a permanência de um eletrodo na solução,
objetivando assegurar a não variação do pH, que é crítico nessa prova.
PADRONIZAÇÃO:
Dissolver exatamente 0,525g de NaF.P.A. previamente seco em estufa a 105ºC
durante 2 horas, em água destilada e transferir quantitativamente para balão
volumétrico de 250ml. Completar o volume e homogeneizar. Pipetar volumétricamente
uma alíquota de 10ml para erlenmeyer de 250ml, adicionar 50ml de água destilada e 3
gotas de solução indicadora de alizarina sulfonato de sódio 0,05%. Continuar como
descrito nos itens 11 e 12 do procedimento.
Concentração dessa solução = 0,95mg de flúor/ml ou 2,1mg de NaF/ml.
CÁLCULO DO FATOR:
P NR
N = VxE F = NE
ONDE:
E = Equivalente grama de fluoreto de sódio
P = Peso de fluoreto de sódio em miligrama na alíquota
V = Volume de Th (N03)4 gasto na titulação emml
NR = Normalidade real
NE = Normalidade esperada
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Potenciômetro com escala em milivolts
- Agitador magnético
- Eletrodo ion específico para Flúor
- Eletrodo de referência
- Balança analítica precisão +/- 0,0001g
- Cadinho de platina ou níquel
- Bico de Bunsen
- Bequer de 150 e 600ml
- Balões volumétricos de 100, 250, 500 e 1000ml
- Funis analíticos
- Pipetas volumétricas
- Placa aquecedora
REAGENTES:
- Fluoreto de sódio P.A.
- Cloreto de sódio P.A.
- Ácido acético P.A.
- CDTA (Ácido 1,2 - ciclohexylenediamino tetra acético) P.A.
- Hidróxido de sódio P.A.
- Verde de bromocresol P:A.
- Álcool etílico P.A.
PROCEDIMENTO:
1. Triturar e homogeneizar uma porção da amostra em gral. Pesar em Cadinho de
platina ou níquel de 0,25 a 0,5g da amostra dependendo do teor de fluor esperado.
2. Adicionar aproximadamente 215g de NaOH. Fundir a amostra (brandamente no
início) em capela usando bico de Bunsen, até formação de uma pasta homogênea.
Tomar os cuidados necessários para evitar a projeção da amostra. Esfriar a
temperatura ambiente.
3. Transferir o cadinho (com a amostra fundida para bequer de 600ml, adicionar água
destilada e deionizada de modo a cobri-lo e, aproximadamente 20ml de HCl 1:1.
Deixar em repouso até completa solubilização do resíduo.
4. Transferir quantitativamente para balão de 250 ou 500ml, sem filtrar. Acertar o pH
no próprio balão, com NaOH 6N e/ou HCI 10%, utili'zandor verde de bromocresol como
indicador, de maneira que o pH esteja entre 5,3 e 5,4. Completar com água destilada e
deionizada.
5. Pipetar volumetricamente, alíquota de 50ml para balão volumétrico de 100ml.
Adicionar 10ml de solução tisab IV. Completar o volume com água destilada e
deionizada: O pH desta solução (sol de leitura) deve estar entre 5,3 e 5,4.
6. Transferir a solução para bequer de 150ml e proceder a determinação
potenciométrica em escala mV., com agitação constante e, após estabilização (mínima
3 minutos), fazer a leitura.
CÁLCULO:
Ppm x 5
Fluor % = P x As X 100
ONDE:
ppm = ppm de fluor obtido na curva de mV x conc.
S = volume da solução estoque (250 ou 500ml)
P = peso original da amostra
As = volume da aliquota utilizado da solução estoque
OBSERVAÇOES:
1. As condições de leitura protenciométrica da amostra (tempo de estabilização,
temperatura da solução de leitura; agitação constante) deverão ser as mesmas
aplicadas na preparação da curva padrão.
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Potenciômetro com escala em milivolts
- Eletrodo ion especifico para flúor
- Eletrodo de referência
- Agitador magnético.
- Balança analítica precisão +/- 0,0001g
- Bequer de 50 e 30ml.
- Balões de .1000, 500 e 250ml
- Funis analiticos
- Pipetas volumétricas de 20, 25 e 50ml
- PIaca aquecedora
REAGENTES:
- Fluoreto de sódio P.A.
- Hidróxido de amônio P.A.
- Ácido cítrico P.A.
- Tampão citrato neutro de amônio pH 7,0
- Azul de bromotimol P.A.
- Ácido clorídrico P.A.
PROCEDIMENTO:
1. Pesar 0,5000g de amostra, transferir para bequer de 300ml.
2. Adicionar 5ml de HCI concentrado, aquecer brandamente e adicionar água destilada
até 100ml.
3. Adicionar solução de hidróxido de amônio 1:1 para precipitação dos metais (até a
turvação da solução).
4. Adicionar algumas gotas de azul de bromotimol e ácido cítrico 7% para complexação
dos metais, até a viragem de azul para amarelo.
5. Transferir quantitativamente para balão 250ml sem filtrar. Avolumar e agitar.
6. Pipetar volumétricamente uma alíquota de 20ml para bequer de 50ml e adicionar
20ml de citrato neutro de amônio pH 7,0.
7. Proceder a determinação potenciométrica em milivolts com agitação constante, e
após estabilização (mínimo 3 minutos), fazer a leitura.
CÁLCULO:
As leituras são realizadas em milivolts e transformadas em ppm.
Através de um gráfico ou de uma equação de regressão.
OBSERVAÇOES:
1. As condições de leitura potenciométrica da amostra (tempo de estabilização,
temperatura da solução, agitação) deverão ser as mesmas aplicadas na preparação da
curva padrão.
2. No cálculo da concentração de fluoreto contido na amostra, o volume da alíquota
utilizada não é considerado, como também não é considerado na realização da curva.
O gráfico fornece diretamente, o teor de flúor no balão de diluição.
e. Acldo cítrico 7%
Pesar 7,0g de ácido cítrico P.A., solubilizar em água destilada.
Transferir para o balão 100ml. Completar o volume com água destilada deionizada.
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Cromatoplacas silicagel 60 para TLC-0,2mm espessura, tamanho 20 x 20cm sem
indicador de flúorescência
- Microseringa graduada de 25 microlitros
- Balões volumétricos de 25, 50 e 100ml
- Agitador magnético
- Funil de Buchner de 12cm de diâmetro
- Funil de separação de 125ml
- Pipetas volumétricas
- Erlenmeyer
- Papel de filtro
- Cromato visor munido de lâmpada com emissão a 3650 A e 15 watts
- Cadinho de vidro com placa filtrante
- Tubo cromatográfico (22 x 300mm).
- Silicagel,60 (0,063 - 0,2mm) ativada para cromatografia em coluna
- LS de vidro
- Câmara cromatográfica com tampa (22 x 23 x 10cm)
REAGENTES:
- Éter etílico anidro P.A.
- Clorofórmio P.A.
- Acetona P.A.
- Alcool metílico P.A.
- Hexano P.A.
- Sulfato de sódio anidro P.A.
- Carbonato básico de cobre II P.A.
- Padrões de aflatoxinas B1 - B2 - G1 - G2
PROCEDIMENTO:
a. PREPARAÇÃO DAS SOLUÇOES PADRÕES:
Diluir os padrões de aflatoxinas B1 - B2 - G1 - G2 na forma cristalina, com solução de
benzeno + acetonitrila (98 + 2) de modo a se obter concentrações de 8 a
10ug/ml.Manter sob refrigeração constante a 0ºC e em frasco ambar herméticamente
fechado.
Diluir novamente obtendo-se soluções padrões de trabalho com concentração 0,1 a
0,5ug/ml e manter sob as mesmas condições de estocagem. Observar se não está
havendo perda de solvente por evaporação, pois neste caso ocorrerá alteração na
concentração da solução padrão.
b. EXTRAÇÃO:
Pesar 50g de amostra moída em erlenmeyer de 500ml. Umedecer completamente a
amostra e adicionar 250ml de cloroformio. Tampar a boca do frasco com papel
alumínio e deixar sob agitação magnética por 30 minutos.
Filtrar em papel de filtro. Se a filtração for muito lenta, usar vácuo fraco.
c. PURIFICAÇÃO DO EXTRATO:
Preparar tubo cromatográfico (22 x 300mm) colocando bolas de lã de vidro no fundo,
seguindo-se 5g de Na2SO4 anidro (base para a silica gel). A seguir juntar 10g de
silicagel 60 (0,063 - 0,2mm) ativada por secagem durante uma hora em estufa.
Adicionar 5g de sulfato de sódio anidro, e lavar a coluna com 30ml de clorofórmio.
Transferir 50ml de extrato da amostra para a coluna e diluir em fluxo máximo com
100ml de hexano seguido por 100ml de éter etílico P.A. e descartar.
Diluir aflatoxinas com 150ml de metanol + clorofórmio (5 + 145) coletando totalmente
esta fração desde o seu início até o final.
Adicionar pérolas de vidro e evaporar até próximo de 5ml em banho-maria.
Acrescentar 4g de sulfato de sódio anidro e 2g de carbonato básico de cobre II. Agitar
vigorosamente e filtrar através de cadinho de vidro com placa filtrante para bequer de
50ml e evaporar até a secura.
Diluir o extrato purificado com cloroformio a volume: apropriado e aplicar em CCD.
e. INTERPRETAÇÃO DO CROMATOGRAMA:
Comparar as alturas de Rf entre a amostra e o padrão spots fluorescentes na amostra
atribuidos a aflatoxinas deverão ter valor idêntico de Rf e ser similar na coloração.
NOTA: Desde que spots da amostra e padrão são comparados diretamente na mesma
placa, o valor do Rf não é importante, pois este pode variar de placa para placa.
Para quantificar a toxina deverão ser considerados os spots do padrão daamostra
contendo a mesma intensidade de fluorescência.
CÁLCULO:
S. Y. V
ug/kg = X. W
ONDE:
S = ul aplicado do padrão
Y = Concentração do padrão em ug/ml
V = ul final do extrato da amostra
X = Volume aplicado da amostra em ul
W = Peso da amostra no extrato em gramas
CONFIRMAÇAO QUÍMICA DA IDENTIDADE DAS AFLATOXINAS:
Desde que a detecção de aflatoxinas por CCD não é evidência conclusiva da sua
identidade, uma confirmação mais eficiente deve ser feita. Desta forma, testes
confirmativos envolvendo a formação de derivados químicos tem sido desenvolvidos.
Estes métodos confirmativos envolvem o isolamento da aflatoxina por coluna e CCD,
são morosos e difíceis para alguns analistas. Um método simples e rápido para
confirmação da aflatoxina B1 foi desenvolvido por Przbylski no qual a aflatoxina B1
extraída da amostra é convertida em aflatoxina B2a diretamente na placa de CCD. O
teste é baseado na ação catalítica do ácido trifluoracético com a adição de água
através da dupla ligação do anel terminal de furano da aflatoxina B1. Aflatoxina G1 é
convertida da mesma maneira em G2a; B2 e G2 não são afetadas. Essa reação tem
sido utilizada como base em vários artigos publicados como método de confirmação de
aflatoxina B1 e G1.
DETERMINAÇÃO:
Dividir a placa de silica gel em duas metades idênticas. Cobrir uma delas com um vidro
limpo. Na outra colocar duas alíquotas (spots) de 1-10ul da amostra contendo 0,5 -
5,0ng de aflatoxina. Colocar também dois spots de padrão com a mesma concentração
das amostras.
Colocar 1ul de ácido trifluoracético em cada um dos três spots, e deixar a reação
ocorrer por 5 minutos. Manter corrente de vapor sobre a placa por 10 minutos.
Na outra metade coberta da placa aplicar alíquotas idênticas eliminando o tratamento
com ácido trifluoracético.
Desenvolver a placa em clorofórmio + acetona (85 + a15) ou acetado de etila saturado
com água. Colocar 200 ml do solvente diretamente na cuba de eluição.
Após desenvolvimento examinar a placa de CCD sob luz UV de comprimento de onda
longo. Aflatoxinas sem tratamento com ácido trifluoracético devem aparecer próximas
ao topo da placa. Derivados fluorescentes azuis (B2a e G2a) deverão aparecer a Rf
aproximadamente 1/4 aos da Bl e G1.
Borrifar a placa com solução de H2SO4 (1 + 3) para mudar a fluorescência da
aflatoxina de azul ou azul-esverdeado para amarelo como uma confirmação adicional
de aflatoxinas. Usar este teste somente para confirmar a ausência de aflatoxinas, isto
é, spots os quais não se tornaram amarelos são positivamente ausentes de aflatoxinas,
visto que muitos outros materiais, além da aflatoxina, podem dar reação com H2S04
desenvolvendo coloraçó amarela.
OBSERVAÇOES:
A seguir são notificadas algumas precauções que servem como advertência,
envolvendo o uso de compostos tóxicos e inflamáveis.
a. Destilações, extrações e evaporações com líquidos inflamáveis. Executar estas
operações atraves de equipamentos apropriados como banno-maria, vapor ou manta
aquecedora. Utilizar sistema eficaz de eliminação de gases para remover vapores
inflamáveis que possam ser produzidos. Deixar abertura ampla no frasco e adicionar
pérolas de ebulição antes de iniciar o aquecimento.
b. Acetonitrila. Tóxico. Evitar contato com a pele e os olhos. Usar sistema eficaz para
eliminação de vapores. HCN é liberado quando em contato com ácido.
f. Éter Etílico. Armazenar sob proteção da luz. Inflamável. Utilizar sistema eficaz para
eliminação de vapores. Evitar eletricidade estática. Peróxidos instáveis podem se
formar após armazenamento prolongado ou exposição dos frascos a luz solar.
g. Alcool Metílico. Inflamável. Tóxico. Evitar contatos com a pele, olhos e inalação.
Utilizar sistema eficaz para eliminação dos vapores.
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Balança semi-analítica
- Banho-maria
- Agitador magnético ou liquidificador
- Câmara escura com lâmpada ultra-vloleta
- Secador
- Pipetas
- Provetas de 50ml, 100ml
- Funil de vidro 100mm
- Bequer de 100ml, 250ml
- Balões volumétricos 5ml, 10ml
- Funil de separação de 500ml tipo pera
- Cápsulas de porcelana capacidade de 200ml
- Micro seringas 10ul, 50ul
- Cuba de vidro com tampa esmerilhada - 20 x 20 x 10
- Erlenmeyer com tampa esmerilhada de 250ml, 500ml
- Cromatoplacas silicagel 60/0,2mm de espessura 20 x 20cm
- Micropipetas
REAGENTES:
- Clorofórmio P.A.
- Metanol P.A.
- Cloreto de sódioP.A:
- Hexano P.A.
- Benzeno P.A.
- Acetato de etila P.A.
- Etanol P.A.
- Ácido fórmico P.A.
- Acetona P.A.
- Padrões de aflatoxinas B1, B2, G1 e G2
- Ácido sulfúrico P.A.
PROCEDIMENTO:
1. Pesar 25g de amostra previamente moída e homogeneizada (desengordurar se
necessário) em um erlenmeyer de 500ml.
2. Adicionar água destilada quente (40 a 60ml), suficiente para formar uma pasta;
esfriar.
3. Adicionar 100ml de clorofórmio, tampar e agitar vigorosamente por 30 segundos.
Retirar a tampa cuidadosamente.
4. Tampar e deixar em agitação branda e constante por 30 minutos.
5. Filtrar o extrato em papel de filtro 24cm (80g), recebendo em erlenmeyer ou balão
de fundo chato com junta 24/40, ou compatível ao condensador.
6. Evaporar no soxhlet, em banho-maria.
7. Dissolver o resíduo em 50ml de metanol e transferir para o funil de separação de
500ml.
8. Adicionar 50ml de solução de NaCl 4% e agitar cautelosamente, eliminando a
pressão pela torneira.
9. Adicionar mais 50ml de hexano, agitar vigorosamente eliminando a pressão.
10. Deixar em repouso até a separação das fases.
OBSERVAÇÃO: Se a fase hexano não estiver límpida, fazer uma nova lavagem com
hexano.
11. Recolher a parte inferior em um funil de separação contendo 50ml de hexano,
agitar.
12. Receber a camada inferior em outro funil de separação, contendo 50ml de
clorofórmio, agitar, deixar em repouso até a separação das fases.
13. Recolher a parte inferior em um frasco evaporado e reservar.
14. Fazer mais uma extração com 50ml de clorofórmio, recolhendo o extrato no
mesmo frasco evaporador.
15. Evaporar em banho-maria até quase secura. Completar a evaporação usando
corrente de nitrogênio.
16. Dissolver o extrato com clorofórmio de acordo com os teores esperados (1ml a
10ml).
17. Na cromatofolha, marca linha de origem 1,5cm da margem.
Marcar linha de chegada 8,5cm da linha de origem.
Dividir a linha de origem de 2 em 2cm.
Fazer as aplicações com auxílio de micro seringas na linha de origem.
18. Saturar a cuba com uma das misturas abaixo:
Benzeno + acetato dé etila + etanol(60 + 38 + 2) ou,
Cloroformio + acetona (90 + 10) ou,
Tolueno + acetato de etila + acido fórmico (60 +30 + 10) ou,
Tolueno + acetato de etila + ácido fórmico (60 + 40 + 0,5).
19. Aplicar 2 ou 3 pontos de padrões para 3 pontos de amostra.
20. Colocar a placa cuidadosamente na cuba já saturada e aguardar até que a fase
móvel atinja a marca de 8,5cm.
21: Retirar a placa da cuba e secar ao ambiente ou com auxílio de secador.
22. Fazer a leitura da placa, em câmara escura, sob luz ultravioleta, comparando a
intensidade da fluorescência da amostra com os padrões.
Se a intensidade de fluorescência da mancha de amostra for maior que a intensidade
de fluorescência da mancha de maior concentração do padrão, a amostra deverá ser
diluída e recromatografada.
OBSERVAÇAO: Para confirmação, adicionar uma gota de H2S04 50%, sobre a mancha
que se supõe ser Aflatoxina B1 e/ou B2. Se a mancha permanecer com fluorescência
azul, indica que não se trata de aflatoxina. Se a mancha mudar para amarelo; pode
indicar aflatoxina; mas o teste não é conclusivo. Neste caso, proceder ao teste com
ácido trifluoracético.
CÁLCULO:
5 x V x V = ug Aflatoxina/kg = ppb
WxZ
ONDE:
S = ul de aflatoxina do padrão com igual intensidade de fluorescência da amostra.
Y = Concentração aflatoxina do padrão em ug/ml.
V = ul do solvente requerido para diluir o extrato final.
W = Peso da amostra em grama.
Z = ul de aflatoxina da amostra com igual intensidade de fluorescência do padrão.
SOLUÇÕES REAGENTES:
1. Soluções de saturação:
a. Homogeneizar 60 partes de benzeno; 38 partes de acetato de etila e 2 partes de
etanol.
b. Homogeneizar 90 partes de clorofórmio e 10 partes de acetona.
c. Homogeneizar 60 partes de tolueno, 30 partes de acetato de etila e 10 partes de
ácido fórmico.
d. Homogeneizar 60 partes de tolueno, 40 partes de acetato de etila e 0,5 parte de
ácido fórmico.
REAGENTES:
- Clorofórmio P.A.
- Acetato de etila P.A.
- Acetona P.A.
- Ácido fórmico 90% P.A.
- Hidróxido de sódio P.A.
- Carbonato básico de cobre P.A.
- Cloreto férrico anidro P.A.
- Cloreto de potássio P.A.
- Hidróxido de potássio P.A.
- Ácido sulfúrico P.A.
- Hyflo super-cel ou equivalente
- Florisil (100-200 mesh)
- Padrões de aflatoxina B1, B2, G1 e G2
- Benzeno P.A.
- Acetonitrila P.A.
- Tolueno P.A.
- Silica gel 60 (0,063 - 0,2mm)
- Alumina neutra P.A.
- Sulfato de sódio anidro P.A.
- Sulfato de cálcio anidro P.A.
PROCEDIMENTO:
a. EXTRAÇAO:
1. Pesar 50g da amostra previamente homogeneizada (deve passar em peneira malha
0,85mm).
2. Transferir a amostra para um liquidificador (copo de vidro) ou erlenmeyer de 500ml.
3. Adicionar 250ml de acetona + água (85+15) e agitar em alta velocidade por 3
minutos ou agitar em erlenmeyer de 500ml por 30minutos a 1 hora.
4. Filtrar em papel de filtro qualitativo pregueado, usando um funil de 15cm de
diâmetro. Tampar com vidro de relógio
5. Recolher em proveta de 250ml os primeiros 150ml.
b. PURIFICAÇAO:
1. Transferir os 150ml do filtrado para um bequer de 400ml.
2. Adicionar 3g de carbonato básico de cobre e homogeneizar.
3. Adicionar 170ml de NAOH 0,2N (8g/l H20) e 30ml de cloreto férrico gel (20g +
300ml H20) em bequer de 600ml. Homogeneizar.
4. Adicionar (2.) em (3). Homogeneizar.
5. Medir 150ml de Hyflo Super-Cel e adicionar ao bequer de 600ml. Homogeneizar
6. Filtrar, usando papel de filtro qualitativo pregueado e funil analítico de 15cm de
diâmetro. Tampar com vidro de relógio.
7. Recolher os primeiros 150ml em proveta de 250ml.
c. PARTlÇÃO:
1. Transferir os 150ml obtidos na purificação para um funil de separação de 500ml.
2. Adicionar 150ml de H2SO4 0,03% (0,3ml H2SO4/l H2O) e 10ml de clorofórmio.
3. Agitar vigorosamente por 2 minutos e deixar separar as camadas.
4. Transferir a camada inferior para um funil de separação de 125ml (+/- 13 - 14ml).
5. Adicionar 100ml da solução de KOH-KCI (1,12g + 10g + 11). Agitar suavemente por
30 segundos e deixar separar as fases.
6. Se formar emulsão, drenar a emulsão para proveta com tampa de 50, 25
ou 10ml e adicionar 1g de sulfato de sódio anidro. Agitar fortemente.
7. Rotular: extrato (1). Retirar 2ml para a pesquisa na coluna.
8. Se a pesquisa da coluna der positiva seguir o seguinte esquema:
a. Adicionar 10ml de clorofórmio ao funil de separação de 500ml do item C-1.
Desprezar qualquer resíduo de clorofórmio presente nos funis.
d. AVALIAÇÃO:
1. Transferir.4ml do extrato (1) e 4ml do extrato (2) para um funil de separação de
125ml.
2. Adicionar 50ml de ácido sulfúrico 0,03% e agitar suavemente por 30 segundos.
3. Coletar 6ml da camada inferior de clorofórmio (medir em proveta de 15ml).
4. Concentrar em banho-maria sob atmosfera de nitrogênio.
5. Diluir para volume conhecido em benzeno acetonitrila (98+2) e realizar a
cromatografia em camada delgada usando a seguinte fase móvel:
tolueno: acetato de etila: cloroformio: ácido fórmico 90% (50 : 70 : 50 : 20).
6. PESQUISA POR CROMATOGRAFIA EM COLUNA:
a) Preparo da Coluna:
I. A minicoluna deverá ter 6mm de diâmetro interno e comprimento de 190mm. No
final e afilada para 2mm de diâmetro. Todo material deve ser secado a 110ºC por 1-2
horas.
II. Colocar lã de vidro na parte final da coluna.
III. Adicionar 8-10mm de Drierite (CaSO4 anidro). Bater suavemente após cada adição
para facilitar o assentamento.
IV. Adicionar 8-10mm de Florisil 100-200 mesh.
V. Adicionar 16-20mm de silica gel.
VI. AdicIonar 8-10mm de alumina neutra.
VII. Adicionar 8-10mm de Drierite.
VIII. Colocar lã de vidro no topo da coluna.
b) Cromatografia:
Transferir 2ml para coluna (drenar por gravidade 15-30min). Quando o solvente atingir
o topo do adsorvente adicionar 3ml do eluente clorofórmio + acetona (9+1). Drenar
por gravidade.
c) Detecção qualitativa:
Será positivo quando aparecer banda azul fluorescente no topo da camada de fiorisil,
formando um anel bem nítido.
7. QUANTIFICAÇÃO:
Caso o resultado for positivo, fazer quantificação:
a) Diluir o extrato para 500 ou 1000ul com benzeno acetonitrila (98:2).
b) Aplicar alíquota da amostra é dos padrões em placa de sílica gel 60.
c) Correr usando a fase móvel tolueno : acetato de etila : clorofórmio : ácido fórmico
90%(70 : 50 : 50 : 20).
d) Calcular a concentração de aflatoxina usando a seguinte fórmula:
A.C.V
Aflatoxina em ug/ml = P.S.
ONDE:
A = Volulme em ul da alíquota de aflatoxina padrão com fluorescência igual a da
amostra.
C = Concentração em ug/ml da aflatoxina padrão.
V = Volume do solvente em ul requeridos para diluir o extrato final.
P = Quantidade da amostra em g contida no extrato final (3,9g).
S = Volume em ul da alíquota do extrato da amostra com fluorescência igual a
Amostra.
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Liquidificador ou homogeneizador equivalente,
- Leitora de placas - manual ou automática (espectrofotômetro 490nm)
- Lavadora de placas - Manual ou automática
- Micropipeta monocanal - 25 ul
- Micropipeta multicanal (8) - 50 a 200ul (volume variável)
- Ponteiras para micropipetas (TIPS)
- Pipeta graduada - 10ml
- Papel filtro qualitativo ou lã de vidro
- Erlenmeyer - 250ml
- Balança analítica
REAGENTES:
- Metanol P.A. (MEOH)
- N, N-dimetilformamida P.A. (DMF)
- Ácido clorídrico P.A. concentrado d = 1,19 g/l
- Hipoclorito de sódio 5%
- Acetona P.A.
- Kit para detecção aflatoxina:
Placas sensibilizadas com anticorpos Anti~B1
B1 conjugado com peroxidase
5 padrões de aflatoxina em diferentes concentrações
diluente de amostra
tabletes de OPD (O - fenilenediamina-2)
diluente de OPD.
PROCEDIMENTO:
a. AMOSTRAGEM:
Colher a amostra segundo instruções e moer de maneira que passe integralmente por
uma peneira de 0,85mm. Fazer uma segunda homogenização e armazenar para o
procedimento analítico.
b. EXTRACÃO:
1. Pesar 50g da amostra
2. Adicionar 250ml de solvente de extração (70% MEOH 29% H2O destilada e 1%
DMF).
3. Homogeneizar em liquidificador a velocidade média por 3 minutos (alta- velocidade
1 a 2 minutos), ou em um agitador mecânico por 45 minutos a alta velocidade.
4. Deixar sedimentar.
5. Filtrar o sobrenadante através de papel de filtro ou lã de vidro.
6. Diluir o extrato filtrado 1:20 com diluente da amostra (incluso no kit) - 25ul do
extrato em 475ul de diluente de amostra.
c. TÉCNICA:
Os melhores resultados são obtidos sob rígida observação destas instruções. A
precisão e a exatidão serão mantidas se a pipetagem e a lavagem forem cuidadosas.
As instruções a seguir são de caráter técnico e permitem a manutenção da precisão do
ensaio:
1. Utilizar a técnica de pipetagem reversa para agilizar a adição do reagente (isto é,
aspire mais líquido que o necessário e liberar quantidade exata).
2. Adotar uma organização na adição do reagente sempre obedecendo
a mesma sequência que a da adição do reagente anterior.
3. Calcular o tempo de incubação após a adição de reagentes a primeira fileira de
poços. A cronometragem do ensaio é muito sensível.
Padronizar os tempos em todos os passos do ensaio, tanto na adição dos reagentes
como na determinação dos tempos de incubação.
4. Depositar os reagentes diretamente no fundo da cavidade, tomando preocuções
para que não permaneçam resíduos nas bordas do poço de titulação ou bolhas de ar
no fundo. Após a adição da amostra às cavidades, fazer uma checagem rápida para se
certificar que não existem bolhas de ar antes da adição do conjugado.
5. Para que o tempo de incubação seja preciso, recomenda-se que não se faça o
ensaio de mais de quatro tiras ao mesmo tempo. Para outras amostras, iniciar um
novo ensaio com novos padrões e marque novamente o tempo de incubação.
6. Lavar completamente uma fileira de poços antes de passar a seguinte. Aspirar o
conteúdo líquido da tira. Completar com solução de lavagem até o eminente
transbordamento. Aspirar o líquido da tira, repetir a lavagem mais três/quatro vezes,
então, proceder a lavagem da tira seguinte.
7. Para maior precisão dos resultados quantitativos, recomenda-se que cada amostra
seja corrida em duplicata, a variação da densidade óptica deve ser avaliada. É natural
que exista uma variação da +/- 10% na densidade óptica. Variações maiores podem
ser indicativas de erros técnicos.
d. ENSAIO:
1. Permitir que os reagentes do kit atinjam um equilíbrio com a temperatura ambiente.
2. Completar a identificação poço/amostra na tabela de cálculos.
3. Adicionar 50ul de Padrão A, não diluído, aos poços A1 e A2; os Padrões de B a E em
duplicata, aos poços de A3 a A10.
4. Adicionar 50ul das amostras diluídas a poços em duplicata.
5. Adicionar imediatamente 50ul de conjugado a cada poço.
6. Incubar 30 minutos para teste quantitativo, 10 minutos para avaliaçao qualitativa
de presença ou não de aflatoxina na amostra.
7. Preparar o substrato (OPD) -10ml diluente para 1 tablete de OPD.
8. Ao final da incubação, lavar cada fileira de poços 3 a 5 vezes (água destilada e
deionizada).
9. Adicionar 100ul do substrato a cada poço.
10. Incubar por 10 minutos.
11. Adicionar 100ul de HCl 1N a cada poço (para paralisar a reação).
12. Zerar a leitura com ar utilizando uma absorbância de 490nm.
13. Proceder a leitura da placa e registrar as absorbâncias, a 490nm, na tabela de
cálculos coluna A.
e. RESULTADOS:
A concentração das amostras pode ser determinada graficamente (Curva Padrão) ou
por regressão do logit vs concentração.
CÁLCULOS:
1. Cálculo das médias de absorbância de cada Padrão (A a E) e amostras
desconhecidas, coluna B.
2. Cálculo da razão B/B0 para cada Padrão e amostra (coluna C).
3. Cálculo do logit B/B0:
CURVA PADRÃO:
1. A curva padrão deve ser uma ligeira curva que une os valores dos padrões. A
execução cuidadosa do ensaio observando-se a técnica discutida em "Procedimentos
irá produzir uma curva precisa assim como irá possibilitar uma quantificação precisa
das amostras.
2. A área mais sensível da curva padrão para quantificação é a área mais inclinada da
curva, ou de cerca de 3 a 40ppb.
3. Portanto quando uma amostra équantificada acima de 50ppb, a amostra não estará
na porção mais sensível da curva. Se houver necessidade de quantificação de uma
amostra em exatamente 0,1ppb, utiliza-se maiores diluições desta amostra para que
possa ser enquadrada na porção mais sensível da curva.
OBSERVAÇÕES:
a. As micotoxinas devem ser manipuladas como substâncias tóxicas.
b. Limpar os resíduos com hipoclorito de sódio 1% e deixar em repouso. Adicionar
solução de acetona a 5%.
c. Os recipientes de vidro devem ser descontaminados com alvejante e acetona antes
do descarte.
SOLUÇÕES E REAGENTES:
a. Solução de Extração:
Homogeneizar 70 partes de metanol P.A. 29 partes de água destilada e 1 parte de N, N
dimetilformamida P.A.
TABELA DE CÁLCULOS
Identificação da A B C D E F G
Amostra Padrão Média B /B0 -1B/B0 B/B0 Logit. B/B0 Resultados
Poço Amostra Conc. A (490) 1-B/B0 N 1-B/B0 ppb
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Balança analítica (precisão +/- 0,0001g)
- Erlenmeyer de 250ml
- Bureta de 25mI ou 50ml
- Pipetas volumétricas de 5ml
- Pipeta graduada de 1ml
- Bico de Bunsen ou placa aquecedora
- Banho-maria
- Papel de tornassol
- Papel de filtro qualitativo
REAGENTES:
- Tartarato duplo de sódio e potássio P.A.
- Sulfato de cobre pentahidratado P.A.
- Hidróxido de sódio P.A.
- Glicose P.A.
- Ferrocianeto de potássio P.A.
- Acetato ou sulfato de zinco P.A.
- Ácido clorídrico P.A.
- Azul de metileno P.A.
a. Preparo da amostra:
Pesar em balança analítica 5g de amostra em bequer de 150ml e dissolver com cerca
de 50ml de H2O. Transferir para balão volumétrico de 250ml, lavando bem o bequer.
Adicionar 5ml da solução de ferro-cianeto de potássio 15% e 5ml de acetato ou sulfato
de zinco 30%.
Agitar e completar o volume com água destilada e deixar sedimentar por 15 minutos.
Filtrar em papel de filtro seco e receber o filtrado em erlenmeyer seco.
b. Titulação:
Em erlenmeyer de 500ml, pipetar volumétricamente 10ml das soluções de Fehling A e
B e adicionar 40ml de H2O destilada e aquecer a ebulição.
Colocar a solução de amostra na bureta e gotejar no erlenmeyer sem agitação, até o
desaparecimento da coloração azul. Mantendo a ebulição, adicionar de 1 a 2 gotas de
azul de metileno 0,5% e continuar a titulação até que a coloração azul desapareça. A
titulação não deve ultrapassar a três minutos.
CÁLCULO:
ONDE:
T = Título da solução de Fehling em açúcar redutor.
V = Volume da amostra gasto na titulação em ml
P = Peso da amostra em grama
100 = Porcentagem
250 = Volume da solução
b. Titulação:
Proceder como para glicídeos redutores em glicose.
CÁLCULO:
Glicídeos totais em 100 x 500 x T
glicose % = (açúcar invertido) VxP
b. Titulação:
Proceder como para glicídeos redutores em glicose.
CÁLCULOS:
100 x 500 x T
% açúcares totais = VxP
a. Quando a amostra só contiver amido, multiplicar o resultado por 0,90, que é o fator
de transformação da glicose em amido.
% amido = % açúcares totais X 0,90
OBSERVAÇOES:
1. A hidrólise ácida pode ser feita em autoclave a 120ºC por 20 minutos para obter
glicídios redutores em lactose, faz-se o procedimento como em glicídios redutores em
glicose e multiplica-se o resultado pela constante da lactose 1,39.
100 x 250 x T
Glicídios redutores em lactose % = VxP x 1,39
SOLUÇOES:
a. SOLUÇÃO DE FEHLING A:
Dissolver exatamente 34,639G de sulfato de cobre pentahidratado em água destilada.
Transferir quantitativamente para balão volumétrico de 1000ml. Completar o volume e
homogeneizar.
b. SOLUCÃO DE FEHLING B:
Dissolver exatamente 173g de tartarato duplo de sódio e potássio (sal de Rochelle) e
125g de hidróxido de sódio em água destilada.
Transferir quantitativamente para balão volumétrico de 1000ml. Completar o volume e
homogeneizar.
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Espectrofotômetro de absorção atômica
- Forno mufla
- Balança analítica
- Cadinho de porcelana
- Chapa aquecedora
- Balões volumétricos
- Pipetas graduadas
- Pipetas volumétricas
- Proveta
- Funis de vidro
- Papel de filtro qualitativo
REAGENTES E SOLUÇÕES:
a. Ácido clorídrico P:A, (d= 1,19 g/l)
b. Solução de ácido clorídrico (1 + 1)
c. Solução de lantânio 5%:
h. Branco.
Transferir 10ml da solução de lantânio para balão volumétrico de 100ml e completar o
volume com água deionizada.
PROCEDIMENTO:
1. Pesar a amostra em cadinho de porcelana previamente seco e calcinar por 4 horas a
560ºC. A quantidade deverá ser proporcional ao teor de cálcio esperado para o
produto:
Farinha de carne, peixe ossos: 1,0g de amostra.
Rações e concentrados: 2.0g de amostra.
Matérias-primas com baixos teores de cálcio: 5,0g de amostra.
CÁLCULO:
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Espectrofotômetro de absorção atômica
- Forno mufla
- Balança analítica
- Cadinho de porcelana
- Chapa aquecedora
- Balões volumétricos
- Pipetas graduaqas
- Pipetas volumétricas
- Proveta
- Funis de vidro
- Papel de filtro qualitativo
REAGENTES E SOLUÇÕES:
a. Ácido clorídrico P.A. (d = 1,19 g/l)
b. Solução de ácido clorídrico (1 + 1)
h. Branco.
Transferir 10ml, da solução de lantânio para balão volumétrico de 100ml e completar o
volume com água deionizada.
PROCEDIMENTO:
1. PARA INGREDIENTES MINERAIS:
Pesar 0,1 a 1,0g de amostra em bequer de 100ml.
Adicionar 20ml de ácido clorídrico concentrado e levar a chapa aquecedora.
Seguir conforme o item 3.
CÁLCULO:
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Espectrofotômetro de absorção atômica
- Forno mufla
- Balança analítica
- Cadinho de porcelana
- Chapa aquecedora
- Balões volumétricos
- Pipetas graduadas
- Pipetas volumétricas
- Proveta
- Funil de vidro
- Papel de filtro qualitativo
REAGENTES E SOLUÇÕES:
a. Ácido clorídrico P.A. (d = 1,19g/l)
b. Solução de ácido clorídrico (1 + 1)
c. Solução padrão estoque de cobalto 1000ug/ml:
Dissolver 1g de cobalto (ampola) em balão volumétrico de 1000ml e completar o
volume com água deionizada.
g. Branco.
Diluir em balão volumétrico de 100ml, a mesma quantidade de ácido clorídrico
utilizada na solução amostra. Completar o volume com água delonizada.
PROCEDIMENTO:
1. PARA INGREDIENTES MINERAIS:
Pesar 0,1 a 1,0g de amostra em bequer de 100ml.
Adicionar 20ml de ácido clorídrico concentrado e levar a chapa aquecedora.
Seguir conforme o item 3.
CÁLCULO:
Cobalto (ug/g ou ppm) = (C) x (V) x FD
P
ONDE:
C = Concentração do elemento na solução da amostra (ug/ml)
V = Volume inicial da solução da amostra em ml
FD = Fator de diluição
P = Peso da amostra em grama
FD = volume inicial da solução da amostra diluida (ml)
volume da alíquota tomada (ml)
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Espectrofotômetro de absorção atômica
- Forno mufla
- Balança analítica
- Cadinho de porcelana
- Chapa aquecedora
- Balões volumétricos
- Pipetas graduadas
- Pipetas volumétricas
- Proveta
- Funis de vidro
- Papel de filtro qualitativo
REAGENTES E SOLUÇÕES:
a. Ácido clorídrico P.A. (d = 1,19 g/l)
b. Sblução de ácido clorídrico (1 + 1)
g. Branco.
Diluir em balão volumétrico de 100ml, a mesma quantidade de acido clorídrico
utilizada na solução amostra. Completar o volume com água deionizada.
PROCEDIMENTO:
1. PARA INGREDIENTES MINERAIS:
Pesar 0,1 a 1,0g de amostra em bequer de 100ml.
Adicionar 20ml de ácido clorídrico concentrado e levar a chapa aquecedora.
Seguir conforme o item 3.
CÁLCULO:
Cobre (ug/g ou ppm) = (C) x (V) x FD
P
ONDE:
C = Concentração do elemento na solução da amostra (ug/ml)
V = Volume inicial da solução da amostra em ml
FD = Fator de diluição
P = Peso da amostra em gramas
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Espectrofotômetro de absorção atômica
- Forno mufla
- Balança analítica
- Cadinho de porcelana
- Chapa aquecedora
- Balões volumétricos
- Pipetas graduadas
- Pipetas volumétricas
- Proveta
- Funil de vidro
- Papel de filtro qualitativo
REAGENTES E SOLUtOES:
a. Ácido clorídrico P.A. (d = 1,19g/l)
b. Solução de ácido clorídrico (1 + 1)
g. Branco.
Diluir em balão volumétrico de 100ml, a mesma quantidade de ácido clorídrico
utilizada na solução amostra. Completar o volume com água deionizada.
PROCEDIMENTO:
1. PARA INGREDIENTES MINERAIS:
Pesar 0,1 a 1,9g de amostra em bequer de 100 ml.
Adicionar 20ml de ácido cloridrico concentrado e levar a chapa aquecedora.
Seguir conforme o item 3.
CÁLCULO:
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Espectrofotômetro de absorção atômica
- Forno mufla
- Balança analítica
- Cadinho de porcelana
- Chapa aquecedora
- Balões volumétricos
- Pipetas graduadas
- Pipetas volumétricas
- Proveta
- Funil de vidro
- Papel de filtro qualitativo
REAGENTES E SOLUÇÕES:
a. Ácido clorídricoP.A. (d = 1,19g/l)
b. Solução de ácido clor!drico (1 + 1)
PROCEDIMENTO:
1. PARA INGREDIENTES MINERAIS:
Pesar 0,1 a 1,0g de amostra em bequer de 100 ml.
Adicionar 20ml de ácido clorídrico concentrado e levar a chapa aquecedora.
Seguir conforme o item 3.
CÁLCULO:
ONDE:
C = Concentração do elemento na solução da amostra (ug/ml)
V = Volume inicial da solução da amostra em ml
FD = Fator de diluição .
P = Peso da amostra em grama
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Espectrofotômetro de absorção atômica
- Forno mufla
- Balança analítica
- Cadinho de porcelana
- Chapa aquecedora
- Balões volumétricos
- Pipetas graduadas
- Pipetas volumétricas
- Proveta
- Funil de vidro
- Papel de filtro qualitativo
REAGENTES E SOLUCÕES:
a. Ácido clorídrico P.A. (d = 1,19g/l)
b. Solução de ácido clorídrico (1 + 1)
c. Solução padrão estoque de manganês 1000ug/ml:
Dissolver 1g de manganês (ampola) em balão volumétrico de 1000ml e completar o
volume com água deionizada.
g. Branco.
Diluir em balão volumétrico de 100ml, a mesma quantidade de ácido clorídrico
utilizada na solução amostra. Completar o volume com água deionizada.
PROCEDIMENTO:
1. PARA INGREDIENTES MINERAIS:
Pesar 0,1 a 1,0g de amostra em bequer de 100ml.
Adicionar 20ml de ácido clorídrico concentrado e levar a chapa aquecedora.
Seguir conforme o item 3.
CÁLCULO:
Ferro (ug/g ou ppm) = (C) x (V) x FD
P
ONDE:
C = Concentração do elemento na solução da amostra (ug/ml)
V = Volume inicial da solução da amostra em ml
FD = Fator de diluição
P = Peso da amostra em grama
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Fotocolorímetro com capacidade de 530nm
- Chapa aquecedora
- Bureta 25 ml divisão 1/10
- Pipeta volumétrica de 5ml
- Balões volumétricos 100ml e 500ml
- Bequer 100ml, 250ml e 600ml
- Papel filtro qualitativo
- Almofariz com pistilo
REAGENTES:
- Ácido clorídrico P.A. (d = 1,19g/l)
- Ácido nítrico P.A. (d = 1,42g/l)
- Metaperiodato de Potássjo P.A.
- Ácido fosfórico P.A.
- Sulfato de manganês monohidratado P.A.
PROCEDIMENTO:
a. Curva padrão:
1) Pipetar volumetricamente alíquotas de 0,5/0,1/2,0/ 3,0ml de MnSO4. H2O (solução
padrão 1ml = 1mg Mn).
2) Adicionar em cada alíquota:
- 100ml água destilada
- 10ml HNO3 P.A.
- 10ml H3PO4 P.A.
- 0,5g KIO4 P.A.
3) Ferver por 10 minutos até que a solução adquira coloração semelhante a do
permanganato.
4) Esfriar e completar a 200ml em balão volumétrico.
5) Efetuar leitura em absorbância ou transmitância (530nm) usando como branco os
reagentes mencionados no item 2, elevando a 200ml com água destilada.
b. Preparaçào da amostra:
1) Homogeneizar a amostra em almofariz
2) Pesar 0,5g em bequer de 250ml
3) Adicionar 8ml HCl P.A. aquecer em chapa aquecedora. Evaporar até quase secura.
4) Dissolver em água destilada e transferir quantitativamente para balão volumétrico
de 500ml completando o volume. Filtrar desprezando os 10 primeiros ml.
5) Retirar do filtrado uma alíquota de 5ml, transferir para bequer de 600ml. Prosseguir
como descrito nos itens a-2, a-3 e a-4.
6) Determinar a absorbância ou transmitância, comparando a leitura obtida com a de
um padrão mais próximo a mesma.
CÁLCULOS:
OBSERVAÇÃO:
A alíquota a ser tomada da solução estoque, deverá adequar-se de tal forma que a
leitura esteja sempre na faixa entre 15 a 60% T ou 0,824 a 0,222 de absorbância.
SOLUÇÃO:
a. Solução - Padrão de Manganês 1,0 mg/ml
Dissolver 0,3076g MnSO4. H2O em balão volumétrico de 100ml. Completar o volume e
homogeneizar.
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Chapa aquecedora
- Erlenmeyer de 500ml
- Bureta ambar capacidade 50ml divisão 1/10
REAGENTES:
- Ácido clorídrico P.A. (d =1,19g/l)
- Cloreto estanoso P.A.
- Cloreto mercuroso P.A.
- Sulfato de manganês P.A.
- Ácido fosfórico P.A. (d = 1,7g/l)
- Permanganato de Potássio P.A.
- Oxalato de sódio P.A.
- Ácido sulfúrico P.A. (d = 1,84g/l)
PROCEDIMENTO:
1. Homogeneizar a amostra em almofariz.
2. Pesar 0,3g e transferir para erlenemeyer de 500ml. Adicionar 50ml de HCl 20% e
digerir até quase secura.
3. Gotejar solução de cloreto estanoso quente até tornar-se incolor.
4. Esfriar em água corrente.
5. Adicionar 10ml de solução cloreto mercuroso, 100ml de água destilada e 25ml de
solução Zimmermann-Reinhart.
6. Deixar em repouso por 5 minutos. Adicionar 25ml de água destilada.
7. Titular com KMnO4 0,1N até a coloração levemente rósea persistente.
CÁLCULO:
Fe % = V x F x 0,5585
P
ONDE:
V = Volume gasto de KMnO4 0,1N
F = Fator de correção do KMnO4 0,1N
P = Peso da amostra em grama
SOLUÇOES:
a. Solução de ácido clorídrico 1 + 2
Diluir uma parte de ácido clorídrico P.A. em duas partes de água destilada.
d. Solução de Zimmermann-Reinhardt
Dissolver 70g de MnSO4. H2O P.A. em 500ml de água destilada. Adicionar 125ml de
H2SO4 P.A. e 125ml de H3PO4. Agitar e completar o volume para 1000ml com água
destilada.
PADRONIZAÇÃO:
Pesar exatamente 3,35g de oxalato de sódio (Na2C2O4) P.A. previamente seco em
estufa de 105ºC por 2 horas. Dissolver em bequer contendo aproximadamente 100ml
de água destilada. Transferir para balão volumétrico de 1000ml e completar o volume.
Transferir 10ml de solução Na2C2O4 para erlenmeyer de 250ml e adicionar 10ml
H2SO4 1 + 1. Aquecer a 70/80ºC e titular até coloração levemente rósea persistente
por 30 segundos.
CÁLCULO DO FATOR:
P NR
N = VxE F = NE
ONDE:
E = Equivalente grama de oxalato de sódio
P = Peso do oxalato de sódio em mg na alíquota
V = Volume de KMnO4 gasto na titulação
NR = Normalidade real
NE = Normalidade esperada
F = Fator de correção
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Forno mufla
- Balança analítica
- Chapa aquecedora
- Cápsula .ou cadinho de porcelana
- Erlenmeyer de 500ml
- Bureta capacidade 50ml divisão 1/10
- Almofariz com pistilo
REAGENTES:
- Ácido sulfúrico P.A. (d = 1,84g/l)
- Hidróxido de sódio P.A.
- Cloreto de amônio P.A.
- Vermelho de metila P.A.
PROCEOIMENTO:
1. Homogeneizar a amostra em almofariz.
2. Pesar 1,5g da amostra em cadinho ou cápsula de porcelana.
3. Levar à mufla e aumentar gradualmente a temperatura até 550/600ºC. Manter
durante 2 horas.
4. Retirar a 250ºC e resfriar em dessecador até temperatura ambiente.
5. Transferir quantitativamente com o auxílio de bastão de vidro e água destilada, para
erlenmeyer de 500ml, contendo 2,5g de cloreto de amônia.
6. Adicionar 50ml de H2SO4 1N. Aquecer até dissolução.
7. Adicionar 5 a 10 gotas de vermelho de metila a 0,1 % e titular com NaOH 1N, até
viragem de vermelho para amarelo.
CÁLCULO:
CÁLCULO DO FATOR:
P NR
N = VxE F = NE
ONDE:
P = Peso do Na2CO3 em mg
NR = Normalidade real da solução
V = Volume gasto na titulação em ml
E = Equivalente grama de Na2CO3
NE = Normalidade esperada
PADRONIZAÇÃO:
Pesar com exatidão 1,5g de Biftalato de Potássio previamente seco em estufa por duas
horas. Dissolver em erlenmeyer com aproximadamente 75ml de água destilada.
Adicionar 4 gotas de solução alcoólica de fenolftaleína 1%; titular com a solução de
NaOH até coloração rósea.
CÁLCULO DO FATOR:
P NR
N = VxE F = NE
ONDE:
P = Peso do biftalato de potássio em mg
NR = Normalidade real da solução
V = Volume gasto na titulação em ml
E = Equivalente grama de biftalato de potássio
NE = Normalidade esperada
PRINCÍPIO: Os sais cúpricos, quando tratados çom Iodeto de Potássio liberam iodo. O
iodo cuproso formado é insolúvel em ácido acético e solúvel em excesso de Iodeto de
Potássio. O iodo liberado pela ação do Acetato Cúprico sobre o Iodeto de Potássio é
determinado por titulação com Tiossulfato de Sódio 0,1N.
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Balança analítica
- Erlenmeyer de 250 ml com tampa esmerilhada
- Provetas graduadas de 50 e 100ml
- Bureta ambar 50ml çom divisão 1/10
- Almofariz com pistilo
- Chapa aquecedora
REAGENTES:
- Ácido nítrico P.A. (d = 1,42g/l)
- Hidróxido de amônio P.A.
- Ácido acético glacial P.A.
- Amido P.A.
- Tiossulfato de sódio P.A.
- Bicromato de potássIo P.A.
- Iodeto de potássio P.A.
PROCEDIMENTO:
1. Homogeneizar a amostra em almofariz.
2. Pesar de 0,1 a 0,3g da amostra, dependendo do teor de cobre esperado. Transferir
para erlenmeyer de 250ml.
3. Adicionar 12,5ml de HNO3 1 + 3 e dissolver.
4. Adicionar 12,5ml de água destilada e NHOH 1 + 1 gota a gota, até coloração azul
escuro, formando um precipitado de CU(OH)2.
5. Ferver em chapa aquecedora por 3 minutos.
6. Acrescentar 3 a 4ml de ácido acético glacial, para dissolver o precipitado. Esfriar.
7. Adicionar 1,0g de Iodeto de Potássio e titular com solução padronizada de Na2S2O3
0,1N, até que a cor mude de marrom para amarelo.
OBSERVAÇÃO: Titular rapidamente para que não ocorra perda por oxidação.
8. Adicionar 1ml de solução de amido 1% e prosseguir a titulação cautelosamente até
que a cor azul desapareça.
CÁLCULO:
Cobre % = 0,636 x V x F
P
ONDE:
V = Volume de Na2S203 0,1N gasto na titulação
F = Fator de correção do Na2S2O3 0,1N
P = Peso da amostra em grama
b. Hidróxido de Amônio 1 + 1
Transferir 500ml de hidróxido de amônio P.A. para balão volumétrico de 1000ml e
completar o volume com água destilada.
c. Solução de Amido 1%
Pesar 1 grama de amido em bequer de 100ml. Adicionar gotas de água destilada fria
até formar uma pasta lisa e fina. Acrescentar 80ml de água fervente, agitando
constantemente com um bastão de vidro. Ferver por um minuto. Esfriar e transferir
para balão volumétrico de 100ml completando o volume.
OBSERVAÇÃO: Preparar esta solução momentos antes do uso.
PADRONIZAÇAO:
Pesar 0,20g de K2Cr2O7 seco a 100ºC / 2 horas em erlenmeyer de 250ml, com tampa
esmerilhada.
Dissolver com 80ml de água destilada contendo 2 gramas de iodeto de potássio.
Adicionar 20ml de HCI 1N e guardar imediatamente no escuro por exatamente
10minutos.
Titular imediatamente com Na2S2O3.5H2 0,1N até viragem de cor marrom para
amarelo.
Adicionar 1 ml de solução de amido 1% e prosseguir a titulação até o desaparecimento
da coloração azul.
CÁLCULO DO FATOR:
P NR
N = VxE F = NE
ONDE:
NR = Normalidade real da solução
P = Peso de K2Cr2O7 em miligrama
V = Volume gasto na titulação em ml
E = Equivalente grama de K2Cr2O7
NE = Normalidade esperada
F = Fator de Correção
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Balança analítica
- Balão volumétrico 500ml
- Bequer 400ml
- Pipeta volumétrica 25ml
- Bureta50 ml divisão 1/10
REAGENTES:
- EDTA P.A. sal sódico
- Hidróxido de amônio P.A.
- Acetato de amônio P.A.
- Murexida P.A.
PROCEDIMENTO:
1. Pesar 5,0g da amostra e dissolver em água destilada com leve aquecimento. Esfriar
e filtrar se necessário com papel de filtro qualitativo, recolhendo em balão volumétrica
de 500mI. Completar o volume com água destilada.
2. Transferir uma alíquota de 25ml para bequer de 400ml. Adicionar 5,0g de acetato
de amônio e ajustar o pH com hidróxido de amônia para um valor próximo de 12.
3. Adicionar uma pitada de murexida e titular com EDTA 0,1M padronizado, até
viragem de amarelo para lilás, passando pela coloração vinho intermediária.
CÁLCULO:
Cobaldo % = V x F x 0,5893
P
ONDE:
V = Volume de EDTA 0,1M gasto na titulação
F = Fator de correção de EDTA 0,1M
P = Peso da amostra em grama
OBSERVAÇAO:
Se alguma amostra for insolúvel em água, recomeçar a análise, procedendo a uma
digestão com +/- 30ml de HCI 1 + 1. Ferver em bequer de 250ml, provido de vidro de
relógio, até perto da secura.
PADRONIZAÇÃO:
Pesar 2,5275g de Carbonato de cálcio P.A. previamente seco e transferir para
erlenmeyer de 250ml. Adicionar ácido clorídrico 10% em quantidade suficiente para
dissolver o sal. Transferir quantitativamente para balão volumétrico de 250ml com
água destilada, completando o volume. Pipetar uma alíquota de 25ml e adicionar 5ml
de trietanolamina 20% e 3 ml NaOH4N. Adicionar uma pitada de calcon e titular com
EDTA 0 1M.
CALCULO DOFATOR:
P NR
N = VxE F = NE
ONDE:
P = Peso do CaCO3 em miligramas
NR = Normalidade real da solução
V = Volume gasto na titulação em ml
E = Equivalente grama de CaCO3
N~ = Normalidade esperada
PRINCÍPIO: Os sais iodatados, quando tratados com Iodeto de potássio em meio ácido,
liberam o iodo. O iodo liberado pela ação do iodeto de potássio e ácido sulfúrico é
determinado por titulação com tiossulfato de sódio 0,1N.
MATERIAL E EQUIPAMENTO:
- Erlenmeyer 300 ml com tampa esmerilhada
- Proveta 100ml
- pipeta de 10ml
- Bureta ambar de 50ml, divisão 1/10
REAGENTES:
- Iodeto de potássio P.A.
- Acido sulfúrico P.A. (d = 1,84g/l)
- Tiossulfato de sódio P.A..
- Amido P.A.
- Bicromato de potássio P.A.
PROCEDIMENTO:
1. Pesar de 0,1g da amostra em erlenmeyer de 300ml com tampa esmerilhada.
2. Adicionar 100ml de KI 10%.
3. Adicionar 10ml H2SO4 10%.
4. Agitar até dissolução e deixar em repouso por 10 minutos ao abrigo da luz.
5. Titular com Na2S203 0,1 N até cDIDral;ãD amarelo pálido.
6. Adicionar 1ml de solução de amido e titular até descoloração total do azuI.
CÁLCULO:
Iodo = V x F x 0,2116
P
ONDE:
V = Volume de Na2S2O3 0,1N gasto
F = Fator de correção do Na252O3 0,1N
P = Peso da amostra em grama
PADRONIZAÇÃO:
Pesar 0,2g de K2Cr2O7 seco em erlenmeyer de boca esmerilhada. Dissolver com 80ml
de água destilada. Adicionar 2g de KI P.A. e 20ml de HCl 1N. Tampar e guardar no
escuro por 10 minutos. Efetuar uma pré-titulação com solução de Tiossulfato de Sódio
0,1N até coloração amarela. Adicionar 1ml de solução de amido 1% e prosseguir a
titulação até a descoloração total do azul.
CÁLCULO DO FATOR:
P NR
N = VxE F = NE
ONDE:
NR = Normalidade real da solução
P = Peso de K2Cr2O7 em miligrama
V = Volume gasto na titulação
E = Equivalente grama de K2Cr2O7
NE = Normalidade esperada
F = Fator de Correção
MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
MEIOS DE CULTURA:
- Agar oxitetraciclina glicose extrato de levedura
- Água peptonada a 1%, tamponada.
PROCEDIMENTO:
1. Pesar assepticamente 25g da amostra homogeneizada, adicionar 225ml de água
peptonada a 1%, tamponada. Homogeneizar. Preparar as diluições necessárias.
2. Transferir, de cada diluição 1ml para placas de Petri, em duplicata.
3. Adicionar em cada placa 15ml de agar oxitetraciclina glicose extrato de levedura,
previamente fundida e mantida a 45ºC. Homogeneizar e deixar solidificar.
4. Incubar a 22/25ºC por 5 a 7 dias.
5. Selecionar placas com 10 - 100 colônias.
6. Contar as colônias e expressar o resultados como número de bolores e leveduras
viáveis por grama do produto.
PREPARO DO MEIO DE CULTURA
A. Agar Oxitetraciclina Glicose Extrato de Levedura
Extrato de Levedura 5,0g
D (+) glicose 10,0g
Ágar 15,0g
Suspender os componentes em um litro de água destilada ou deionizada, ferver até a
completa dissolução. Distribuir em frascos e esterilizara 121ºC por 15 minutos. Antes
da utilização adicionar 0,1g de oxitetraciclina por 1 litro do meio. Preparar solução
aquosa do antibiótico.
pH final: 6,5 +/-0,2
MEIOS DE CULTURA:
- Água peptonada a 1%, tamponada.
- Ágar cristal violeta vermelho neutro bile
- Caldo triptona
- Caldo VM - VP
- Ágar citrato de Simmons
- Ágar nutritivo
PROCEDIMENTO:
1. Pesar assepticamente 25g da amostra homogeneizada e adicionar 225ml de água
peptonada a 1%. Homogeneizar. Manter à temperatura ambiente P9r 2 horas para
revitalizar as células debilitadas. Preparar as diluições necessárias.
2. Pipetar alíquotas de 1ml de cada diluição e transferir para placas de Petri, em
duplicata, acrescentar 15ml de agar cristal violeta vermelho neutro bile, previamente
fundido e mantido a 45ºC. Homogeneizar e deixar solidificar. Acrescentar uma segunda
camada do mesmo agar (aproximadamente 10ml) e deixar solidificar.
3. Incubar a 44ºC por 24 horas.
4. Selecionar placas que apresentem entre 15 - 150 colônias de cor roxo avermelhada
(fucsia) rodeadas por um halo de precipitação da mesma cor.
5. Contar as colônias típicas. Confirmar realizando as provas de vermelho de metila,
Voges-Proskauer, indol e citrato.
6. Repicar em agar nutritivo inclinado, 5 colônias ou um numero igual à raiz quadrada
das colônias contadas na placa. Incubar a 35ºC por 24 horas.
7. Transferir a cultura do agar inclinado para os seguintes meios: caldo triptona, caldo
VM-VP e agar citrato de SIMMONS.
8. Incubação: Caldo Triptona e Caldo VM-VP - 48 horas a 35ºC.
Agar Citrato de SIMMONS - 96 horas a 35ºC.
9. Considerar como E. coli as culturas que apresentarem o resultado do IMVIC como:
+ + - - ou - + - -
CÁLCULOS:
Calcular o número de E.coli por grama do produto, utilizando a seguinte fórmula:
R=Cxcxd
r
ONDE:
R = resultado
C = Colônias contadas
c = Colônias confirmadas
r = Colônias repicadas
d = diluição da amostra
d. Caldo VM-VP
Prciteose-peptona 7,0g
Glicose 5,0g
Fosfato dipotássico 5,0g
Dissolver os compohentes em um litro de água destilada ou deionizada, distribuir 10ml
por tubos e esterilizar a 121ºC por 15 minutos.
pH final: 7,5 +/- 0,1
MEIOS DE CULTURA:
- Água peptonada a 1%, tamponada.
- Agar cristal violeta vermelho neutro bile
- Caldo lauril triptose-MUG (4 - metilumbelliferil Beta - D - glicuronídeo)
PROCEDIMENTO:
1. Pesar assepticamente 25g da amostra, adicionar 225ml de água peptonada a 1%.
Homogeneizar. Manter à temperatura ambiente por 2 horas, para revitalizar as células
debilitadas. Preparar as diluições necessárias.
2. Transferir de cada diluição 1ml para placas de Petri, em duplicata.
3. Adicionar em cada placa 15ml de agar cristal violeta vermelho neutro bile,
previamente fundido e mantido a 45ºC. Homogeneizar e deixar solidificar. Acrescentar
uma segunda camada menos espessa de aproximadamente 10 ml.
4. Incubar a 44ºC por 24 horas.
5. Características das colônias típicas: cor roxo - avermelhada (fucsia) e 0,5 a 2mm de
diâmetro.
6. Selecionar as placas com 15 - 150 colônias típicas, efetuar a contagem e anotar.
CONFIRMAÇÃO:
1. Repicar 3 a 5 colônias típicas em caldo lauril triptose - MUG.
2. Incubar a 35ºC por 20 horas.
3. Fazer a leitura em câmara com lâmpada ultravioleta a 336nm. A Beta-Glicuronidase
da E.Coli hidrolisa o MUG, incolor, liberando o composto 4-metilumbelliferona
fortemente fosforescente.
CÁLCULOS:
O número de E.coli é calculado aplicando a seguinte fórmula:
R=Cxcxd
r
ONDE:
R = resultado
C = Colônias contadas
c = colônias confirmadas
r = colônias repicadas
d = diluição da amostra
MEIOS DE CULTURA:
- Caldo Lactosado ou Água Peptona a 1%, tamponada
- Caldo Rappaport Modificado
- Caldo Selenito Cistina
- Ágar Verde Brilhante Vermelho de Fenol Lactose Sacarose
- Ágar para Enterobactérias (Hektoen)
- Ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD)
- Ágar Tríplice Açúcar Ferro (TSI)
- Ágar Lisina Ferro (LIA)
- Ágar Citrato de Simmons
- Ágar Nutritivo
- Meio SIM
- Caldo Uréia
- Caldo KCN
PROCEDIMENTO:
1. Pré-Enriqueclmento
Pesar assepticamente 25g da amostra homogeneizada, adicionar 225m de caldo
lactosado ou água peptonada a 1% tamponada.
Incubar a 35 C por 18 - 24 horas.
2. Enriquecimento Seletivo
Pipetar duas porções de 1ml da cultura pré-enriquecida, uma para tubo contendo 10
ml de caldo Rappaport modificado e outra para tubo contendo 10ml de caldo selenito
cistina.
Incubar a 42 – 43ºC por 24 - 36 horas.
3. Isolamento e Seleção
A partir dos caldos de enriquecimento seletivo semear em placas de ágar verde
brilhante ou ágar Hektoen e ágar XLD.
Incubar a 35 - 37oC por 24 horas.
As colônias típicas de SALMONELLA em ágar verde brilhante apresentam-se incolores
ou de coloração rosa avermelhada, entre translúcidas ou ligeiramente opacas. Algumas
colônias poderão apresentar coloração verde amarelada, quando estiverem rodeadas
do microorganismos fermentadores de lactose.
Em ágar Hektoen apresentam-se azuladas com ou sem centro escuro.
Em ágar XLD, apresentam-se transparentes da mesma cor do meio, às vezes com
centro escuro.
De cada placa repicar 3 a 5 colônias típicas em tubos com caldo uréia. Incubar a 37ºC
por 24 horas.
Repicar em ágar TSI, LIA, agar citrato SIMMONS os tubos que apresentarem
resultados negativos na prova da uréia.
lncubar a 35 – 37ºC por 24 - 48 horas o TSI e LIA e até 96 horas o ágar citrato.
Para leitura e interpretação verificar os quadro a seguir:
1 Ágar TSI.
2. Agar LIA
MEIO SIM
Teste sorológico
Teste de aglutinação: em uma lâmina fazer uma suspensão espessa de colônias
suspeitas em solução salina a 0,85%. Adicionar 1 - 2 gotas do anti-soro.
Homogeneizar imprimindo movimento de rotação.
OBSERVAÇÕES:
- A aglutinação na suspensão de bactérias em solução salina a 0,85% significa uma
reação inespecífica, portanto, negativa para salmonela.
- Deve-se realizar o teste com anti-soros polivalentes somáticos "O" e flagelares "H".
- Se o teste de aglutinação com anti-soros for positivo, proceder a tipificação final.
a. Caldo Lactosado
Extrato de levedura 3,0g
Peptona 5,0g
Lactose 5,0g
Dissolver os componentes em um litro de água destilada ou deionizada, dlstribuir em
frascos com 225ml e esterllizar a 121ºC por 15 minutos.
pH final: 6,9 +/- 0,1
- Solução de Iodo-lodeto
Iodo 5g
Iodeto de potássio 8g
Água destilada 40ml
d. Caldo Selenito-cistina
Triptona 7,0g
L .(-) cistina 0,01g
Lactose 4,0g
Fosfato dissódico dihidratado 10,0g
Bi-selenito de sódio 4,0g
Dissolver os componentes em um litro de água destilada ou deionizada. Se necessário,
pode-se aquecer em banho-maria fervente por 10 minutos. Distribuir em frascos
estereis.
pH final: 7,0 +/- 0,2
Usar o meio no mesmo dia da preparação.
h. Caldo Uréia
Extrato de levedura 0,1g
Dihldrogenofosfato de potássio 9,1g
Hidrogenofosfato dissódico 9,5g
Uréia 20,0g
Vermelho fenol 0,01g
Dissolver os componentes em 1 litro de água destilada e esterilizar por filtração,
distribuindo em tubo (cerca de 3 ml/tubo) Não esterelizar em autoclave.
pH final: 6,8 +/- 0,1
l. Meio Sim
Peptona de caseína 25,0g
Peptona de carne 6,6g
Citrato amônio e ferro III 0,2g
Tiossulfato de sódio 0,2g
Ágar agar 3,0g
Dissolver os componentes em 1 litro de água destilada e distribuir em tubos até cerca
de 4cm de altura e esterilizar a 121ºC por 15 minutos.
pH final: 7,3 +/- 0,1
m. Caldo KCN
Proteose-peptona 25,0g
Dihidrogenosfosfato de potássio 0,225g
Hidrogenofosfato dissódico 5,64g
Cloreto de sódio 5,0g
Aditivo-cianeto de potássio 0,075g
Dissolver em 1 litro de água destilada e deionizada e esterilizar em autoclave por 15
minutos. Deixar atingir a temperatura ambiente, adicionar 15 ml/l de uma solução
estéril a 0,5% de cianeto de potássio e distribuir em tubos com tampa de rosca (4ml
por tubo). Não aquecer.
pH final: 7,6 +/- 0,1
n. Ágar Nutritivo
Extrato de levedura2,0g
Extrato de carne1,0g
Peptona5,0g
Ágar ágar15,0g
Cloreto de sódio5,0g
Suspender os componentes em 1 litro de água destilada e/ou deionizada. Deixar em
repouso por 15 minutos. Ferver até dissolução completa.
Distribuir em tubos e esterilizar a 121ºC, por 15 minutos.
pH final: 7,0 +/- 0,2
MEIO DE CULTURA:
- Água peptonada a 1%, tamponada.
- Ágar cristal violeta vermelho neutro bile glicose.
PROCEDIMENTO:
1. Pesar assepticamente 25 gramas da amostra homogeneizada, adicionar 225ml de
água peptonada a 1%. Homogeneizar. Manter a temperatura ambiente por 2 horas,
para revitalizar as células debilitadas. Preparar as diluições necessárias.
2. Transferir alíquotas de 1ml de cada diluição e transferir para placas de Petri em
duplicata.
3. Acrescentar em cada placa +/- 15ml de ágar cristal violeta vermelho neutro glicose,
mantido a 45ºC. Homogeneizar e deixar solidificar. Cobrir com uma segunda camada
do msâmo ágar (aproximadamente 10ml) deixar solidificar. Incubar a 35 - 3.7ºC por
24 horas.
4. Selecionar placas que apresentem entre 20 - 20 colônias roxo-avermelhada (fucsia)
rodeadas por halo de precipitação da mesma cor. Contar as colônias.
5. Confirmar efetuando o teste de oxidase em 5 colônias ou em número igual a raiz
quadrada das colônias contadas na placa. As enterobactérias são oxidase negativa.
CÁLCULO:
Calcular o número de enterobactérias totais viáveis por grama do produto aplicando a
seguinte fórmula:
R=Cxc xd
r
ONDE:
R = Resultado
C = Colônias contadas
c = Colônias confirmadas
d = Diluiçgo da amostra na placa
r = Colônias repicadas
(Of. nº 168/91)