OBTENÇÃO E COLORAÇÃO

DE CORTES HISTOLÓGICOS

Autores: Gisele Costa1, Tássia Cristina dos Santos1, Veronica Angyalossy1, Laurinda de
Fátima P. Caly2, Mara Maria L. Santana Pinheiro2, Eliana M. B. Dessen2 e Paulo A. Otto2
1
Departamento de Botânica, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo, Rua do Matão
277, 05508-090 São Paulo SP
2
Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, Universidade de São
Paulo, Rua do Matão 277, 05508-090 São Paulo SP

Diagramação: Regina de Siqueira Bueno

Tema central: Biologia celular, células vegetais

Público alvo: estudantes de ensino médio
Financiamento: Fapesp

1
 O B J E T IV O DA AT IV IDADE

A atividade tem como objetivo principal introduzir noções básicas de preparação de fragmentos
de tecidos vegetais para o estudo de anatomia interna de plantas (caule, raiz e folhas).

F UN Ç Ã O PEDAGÓGICA

A compreensão da anatomia interna de órgãos vegetais não é simples, pois envolve estruturas
invisíveis a olho nu e que não fazem parte das experiências do dia-a-dia dos estudantes. A manipulação
de fragmentos de vegetais e sua preparação para análise histológica fornece a contextualização
necessária para desenvolver habilidades procedimentais nos estudantes retirando-o de sua condição
de espectador passivo e motivando-o para o aprendizado ativo de anatomia vegetal.

C O N T EÚ DO DO K IT

O kit contém material suficiente para uma turma de 25 alunos dividida em 5 grupos de 5
estudantes. Cada grupo de estudantes terá à sua disposição:

· Conjunto de protocolos plastificado para os estudantes

· 1 micrótomo manual
· 1 navalha com lâmina de barbear
· 1 frasco de esmalte (de unhas) de boa qualidade (vedação de preparações temporárias)
· 1 frasco conta-gotas contendo glicerina 50% (meio de montagem semi-permanente)
· 1 frasco conta-gotas com água destilada
· 1 frasco conta-gotas com hipoclorito de sódio (água sanitária comercial) a 50%
· 1 frasco conta-gotas com etanol 70%
· 1 frasco conta-gotas com etanol 50%
· 1 frasco conta-gotas com fucsina básica (0,5%)
· 1 frasco conta-gotas com verde firme (0,5%)
· 1 frasco contendo lâminas de vidro para microscopia
· 1 placa de Petri contendo lamínulas
· 5 vidros de relógio
· 2 pinceis finos
· 2 pinças
· 5 pipetas de plástico
· etiquetas auto adesivas
· Observação: o(a) professor(a) deverá providenciar uma cenoura para ser usada como
suporte para cortar órgãos vegetais.
· O kit contém ainda material opcional, para uso exclusivo do professor em situações
emergenciais (por exemplo, na ocorrência de quantidade insuficiente de corantes ou na
contingência de não se obterem cortes adequados por algum motivo). O material está
descrito na próxima página.

2
 Conteúdos biológicos: conservação e manuseio

1. Cortes de caules, raízes, pecíolos e folhas das plantas utilizadas na presente prática
(beijo, piper, vedélia, aipo e pimentão), conservados em álcool 70%, que funciona como
fixador e conservante. Antes de serem submetidos a coloração, os tecidos cortados
devem ser hidratados em água destilada. Com o auxílio de uma pinça, basta transferir os
tecidos para um vidro de relógio com água destilada por cerca de 1 minuto e, em seguida,
utilizar o protocolo de coloração (página 7). Caso o professor deseje confeccionar lâminas
permanentes, como descrito nas Notas para o Professor, itens II e III (páginas 9 e 10),
também é necessário hidratar o material antes da coloração.

2. Fragmentos de caules, raízes, pecíolos e folhas das mesmas plantas descritas no item
anterior, conservados em álcool 70%. Os cortes obtidos desses fragmentos devem ser
hidratados antes de serem corados.

3
3. Um conjunto de preparações histológicas permanentes, confeccionadas com as técnicas
descritas nas Notas para o Professor (itens II e III). As preparações podem ser usadas pelo
professor para identificação microscópica das estruturas vegetais e/ou para comparação
com as preparações obtidas pelos alunos.

4
 P R E P A R A NDO A AT IV IDADE

Recomenda-se que o professor aproprie-se do material que tem em mãos. Assim é

fundamental ler o conteúdo do item “Notas para o professor” que contém a descrição detalhada de
todos os procedimentos práticos, as imagens microscópicas obtidas com os referidos procedimentos
e a identificação das diferentes estruturas dos diferentes tecidos. Depois de conhecer o material que
tem em mãos o professor pode planejar a estratégia didática que usará.
O professor deve também escolher o material biológico a ser utilizado em aula. Aconselhamos
que seja um material facilmente encontrado e com estruturas que possam ser facilmente manipuladas
para o procedimento de corte e coloração, como por exemplo, caule de Impatiens, vulgarmente
conhecida com beijo de frade. Outras possibilidades estão apresentadas na Tabela abaixo.

Estrutura a ser
Sugestões de Materiais
analisada

Sphagneticola trilobata “vedélia”, Asteraceae

CAULE Piper sp, “piper”, Piperaceae
Impatiens balsamina, “beijo”, Balsaminaceae

RAIZ Monstera deliciosa, “costela-de-Adão”, Araceae

Coffea arabica, “café”, Rubiaceae

FOLHA Phormium tenax, “linho-da-Nova-Zelândia”, Hemerocallidaceae
Capsicum annuum, “pimentão”, Solanaceae

PECÍOLO Apium graveolens, “aipo”, Apiaceae

O professor pode optar por preparar com antecedência algumas lâminas dos materiais mais
difíceis de serem obtidos em sala de aula e deixar para os estudantes exercitarem o procedimento
de obtenção de preparações citológicas de tecidos vegetais de caule, por exemplo, um material que
apresenta consistência que facilita seu manuseio, corte e coloração.
Em aulas anteriores à prática recomenda-se que os estudantes tenham uma ideia geral dos
procedimentos que serão realizados no laboratório, ou seja a preparação de lâminas para o estudo
da estrutura interna de órgãos de vegetal. Além disso, os estudantes devem ter tido pelo menos
uma aula prática de manuseio de microscópio. O grupo que será levado ao laboratório deve ser
responsável e previamente instruído do cuidado a ser tomado no manuseio da navalha de corte.
Recomenda-se ainda ao professor que as navalhas sejam distribuídas apenas no momento dos
cortes propriamente ditos e em seguida, imediatamente recolhidas.

5
 A P L IC A N D O A AT IV IDADE EM SALA DE AU LA

O professor deve escolher a estratégia didática que achar mais adequada. A seguir estão
descritos apenas os aspectos procedimentais.
Após dividir a turma em grupos, distribuir os materiais do kit para cada um dos grupos (exceto
a navalha, que será distribuída apenas no momento de realizar os cortes). Para cada grupo há um
conjunto de PROTOCOLOS ilustrados como o passo a passo dos procedimentos. Eles apresentam
instruções sobre:
· o “Micrótomo manual” (em anexo)
· a “Obtenção de suporte para cortar os órgãos vegetais (em anexo)
· a “Obtenção de cotes finos de caules e raízes” (em anexo)
· a “Coloração dos tecidos vegetais cortados” (em anexo)

Para a análise microscópica das preparações citológicas obtidas serão usados os microscópios
acompanhados dos protocolos de microscopia (Ver kit de microscopia - https://genoma.ib.usp.br/files/
upload/44/genoma-protocolo-microscopia-mar20111.pdf)

ObservaçãO da estrutura
Organização: Paulo Alberto Otto
Eliana Maria Beluzzo Dessen
interna dOs vegetais Obtenção de suporte
Colaboração: Verônica Angyalossy
Diagramação: Regina de Siqueira Bueno
para cortar os órgãos vegetais

O Micrótomo manual
1 Cortar uma fatia de cenoura 2 Pressionar o
com 1 cm de espessura. tubo cortador do
micrótomo sobre
a parte mais
central da fatia

P R O C E D IM E N T O
de cenoura.
Cabo, por onde o
instrumento é seguro Manter o tubo
cortador na
posição vertical.

1 cm

PA R A O S
borboleta
usada para girar
o parafuso que
empurra o cilindro
de alumínio com
o material a ser
seccionado no poço. 3 Usar o tubo 4 Cortar ao meio o cilindro de cenoura
extrator com o auxílio da faca.

E STU D A N T E S
Cada 1/10 de volta
produz cortes com para retirar
cerca 50 a 100 µm. o cilindro
Poço de cenoura
em que é de dentro
colocado do tubo
o material cortador.
a ser
seccionado
tubo cortador tubo extrator Platina,
onde é apoiado o
instrumento de corte

5 Usar a faca para fazer um sulco 6 Repetir os passos 1 a 4 para obter um

Conteúdo do Kit longitudinal nos lados internos segundo cilindro de cenoura cortado ao meio.
dos pedaços de cenoura NÃO fazer o sulco interno (passo 5) neste
Micrótomo obtidos no item anterior. cilindro de cenoura.
Esta peça será usada para obter
Esta peça será usada para
cortes de caules e raízes.
obter cortes de estruturas
navalha planas, como folhas.
tubo
cortador

tubo
vidro de relógio extrator

1 2

Obtenção de cortes finos Coloração dos Coloração dos

de caules e raízes tecidos vegetais cortados tecidos vegetais cortados
continuação

1 Colocar o pedaço de folha que deseja estudar
numa das metades do cilindro de cenoura.
2 Colocar a outra metade do cilindro sobre o
tecido a ser estudado como em um sanduiche
1 Lavar os cortes obtidos para a retirada do 2 Desidratar os tecidos cortados acrescentando 7 Acrescentar sobre os cortes, com a pipeta 8 Transferir os cortes para
hipoclorito de sódio. sobre os tecidos, no vidro de relógio, de plástico, 1mL de etanol 50%. Escorrer uma lâmina de vidro, com
A lavagem é feita escorrendo-se a solução 20 gotas de etanol 70%. o etanol contendo o excesso de corante o auxilio do pincel. Cobrir
de hipoclorito do vidro de relógio e Aguardar 3 minutos. e acrescentar mais 1 mL de etanol 50%. os tecidos cortados e
acrescentando-se água destilada. Repetir o procedimento até que não corados com 1 gota de
Repetir o procedimento até não sentir 3 haja restos de corante no etanol. glicerina 50%.
minutos
mais o cheiro de hipoclorito de sódio.

3 Colocar o cilindro de cenoura contendo o 4 Usar a navalha de mão para cortar 3 Escorrer o etanol 70% 4 Colocar sobre os cortes 5 gotas do corante 9 Cobrir a preparação 10 Vedar as bordas
tecido a ser estudado no orifício do micrótomo uma fina fatia de cenoura + tecido. do vidro de relógio. verde firme (fast green) 0,5%. com uma lamínula. da lamínula com
de mão. Regular a profundidade do orifício Manter a navalha na posição Usar o pincel para Aguardar 1 minuto. esmalte incolor.
movendo o parafuso central pela borboleta horizontal, paralela à manter os cortes Esta é uma
para que o cilindro de cenoura se encaixe platina do micrótomo. no vidro de relógio. 1 preparação
3
perfeitamente. Desprezar esta Acrescentar 20 minuto semipermanente
minutos
primeira fatia. gotas de etanol que pode durar
Girar muito pouco a 50%. Aguardar vários meses.
borboleta no sentido 3 minutos.
horário (cerca de Escorrer o
de volta). etanol 50%.
Usar a navalha para
fazer mais um corte.

5 Colocar cuidadosamente a fatia do tecido 6 Selecionar, com o auxílio de uma lupa de mão, 5 Acrescentar sobre os cortes, com a pipeta de 6 Colocar sobre os cortes 5 gotas do corante 11 Observar ao microscópio nos O corante verde firme cora de verde a
obtida (sem a cenoura), com o auxílio as fatias mais finas obtidas. Transferir com o plástico, 1ml de etanol 50%. Escorrer o etanol fucsina 0,5%. Aguardar 30 segundos. aumentos de 40 e de 100 vezes. parede primária das células (celulósica)
de pincel sobre um vidro de relógio auxílio do pincel os cortes desejados para outro contendo o excesso de corante e acrescentar Desenhar as estruturas observadas. e o corante fucsina
contendo 20 gotas de água. Repetir o vidro de relógio contendo 10 gotas de água + mais 1 ml de etanol 50%. 30 cora em rosa
procedimento para obter outras fatias. 10 gotas de hipoclorito de sódio. segundos escuro a parede
Aguardar 5 minutos. secundária
das células
(lignificadas).
Água destilada

40x
5
minutos 100x
Hipoclorito
de sódio

3 4 5

6
 N O T AS P A RA O PROFESSOR

Para se observar a estrutura interna de um órgão biológico é preciso prepara-lo para uma
análise microscópica. Alguns requisitos são necessários para uma visualização microscópica
adequada. Um deles é garantir que a luz transmitida pelo microscópio atravesse o material. Como na
grande maioria das vezes o material não é fino o suficiente para que isso possa ocorrer é necessário
fatiá-lo em cortes muito finas, ou seja, confeccionar preparações histológicos, geralmente com muito
menos de 1mm (0,1 a 0,01mm) de espessura. Os tecidos vegetais são muito mais fáceis de serem
fatiados do que os animais e por isto são muito utilizados em aulas de técnicas microscópicas básicas.
Outro requisito a ser garantido para uma visualização eficiente em microscopia óptica é que
haja suficiente contraste no material a ser observado. O contraste natural ocorre quando algumas
partes do tecido absorvem mais luz que outras. Quando não há contraste natural utilizam-se corantes
para criar um contraste artificial. Os corantes biológicos têm afinidade por constituintes celulares
específicos e absorvem, cada um deles, diferentes comprimentos de onda da luz visível.
Não é trivial para os estudantes entender os planos de cortes dos diferentes tecidos, uma vez
que cada tecido ou órgão possui uma complexa organização tridimensional. Por isso, o aspecto do
mesmo tecido ou órgão cortado em diferentes planos (transversal, longitudinal ou diagonal) fornece
imagens muito diferentes. O estudante pode começar a ter desafios de reconstrução tridimensional
de um objeto e poderá ser ajudado a compreender, por exemplo, imagens originadas por cortes em
diferentes planos de um ovo cozido (parte de seu cotidiano) ou de um órgão tubular, em ilustrações
que deverão ser preparadas e apresentadas pelo professor.
Apoio teórico conceitual sobre a anatomia interna dos vegetais pode ser encontrado em livros
básicos de botânica usados nos últimos anos do ensino médio ou nos primeiros anos de cursos
universitários da área biológica ou em material de boa qualidade disponibilizado gratuitamente
na WWW (Internet), como (1) Santos DYAC, Chow F, Furlan CM. Ensino de Botânica - Curso de
atualização de professores de Educação Básica: A Botânica no cotidiano. Capitulo 8. Melo-de-Pinna
GFA, Ceccantini GCT, Menezes NL. Morfologia e anatomia dos órgãos vegetativos. Disponível em
http://botanicaonline.com.br/geral/arquivos/bmaterial2.pdf, p.37-43 e (2) http://portal.virtual.ufpb.br/
biologia/novo_site/Biblioteca/Livro_4/7-Anatomia_Vegetal.pdf

7
 Procedimentos gerais de confecção dos cortes

Os cortes são obtidos como descrito nas publicações de Otto (2011) e Otto e Dessen (s/data),
com a navalha na posição indicada em detalhe na figura abaixo.

Figura 1 - Maneira correta de usar a navalha munida de uma lâmina de barbear. Conforme mostrado, a lâmina deve correr
o mais deitada possível em relação à platina do micrótomo manual.

Quando executado pelos alunos, o fatiamento do material deve ser sempre supervisionado
pelo professor, a fim de se evitarem acidentes com a navalha (como pequenos cortes acidentais dos
dedos sempre têm uma certa chance de ocorrerem, é necessário que a escola disponha, no local,
de um kit básico de primeiros socorros que contenha mertiolate ou mercúrio cromo, tesoura, gaze e
curativos adesivos tipo “band-aid”.
Deve-se trabalhar sempre com vários cortes, pois durante o procedimento é comum que
alguns não tenham espessura ou qualidade adequada, se rompam ou sejam perdidos.
Apesar de os cortes com menor espessura serem os mais adequados para a preservação
adequada das estruturas tissulares da peça, eles são difíceis de manusear por estarem sujeitos a
dobras e outras alterações estruturais, as quais somente são evitadas nesses casos em espécimes
obtidos com a aplicação de técnicas profissionais, que correspondem ao uso de micrótomos de
precisão na técnica que usa inclusão em parafina nas peças e aplicação de técnicas apropriadas de
fixação do corte nas lâminas previamente à desparafinização e coloração do preparado.

8
I) Procedimento descrito com mais detalhes em Otto e Dessen, s/data (Observação da estrutura
interna dos vegetais – Protocolo dos estudantes, Anexos)
No processo de lavagem, os cortes devem ser mantidos, com o auxílio de um pincel ou de
uma pinça, afastados da beirada do vidro de relógio, para facilitar o descarte da água ou etanol de
lavagem. O material de descarte deve ser acumulado em um recipiente de vidro à parte, conforme
for sendo realizada a lavagem dos cortes. Para diafanizar (ou clarificar) os cortes, acrescentar no
próprio vidro de relógio um pouco de hipoclorito de sódio a 50% (água sanitária), aguardando até que
os preparados fiquem bem transparentes e lavando-os bem em seguida até retirar todo o hipoclorito
de sódio (quando os preparados estiverem bem lavados não deverá mais ser sentido o odor do
hipoclorito de sódio na água de lavagem). (4) O material é desidratado em seguida com álcool até
que a água seja praticamente toda substituída por álcool etílico a 50%. Na coloração que usa verde
firme (fast green) e fucsina básica, corar com o primeiro corante por 1 minuto, lavar com etanol a
50% até retirar todo o excesso de corante; corar em seguida com a solução do segundo corante
durante meio minuto, lavando em seguida com etanol 50% para retirar o corante em excesso. Os
cortes já estão prontos para serem transferidos, para as lâminas de microscopia. As lâminas podem
ser preparadas para receber um ou vários cortes. Para montar o corte em meio semipermanente
(glicerina a 50%), ele deverá ser reidratado (até água destilada pura) e transferido em seguida por
meio de uma pinça delicada ou um pincel fino para a lâmina; pingar em seguida sobre o corte uma
ou duas gotas de glicerina a 50%, colocar uma lamínula por cima, pressionando cuidadosamente
para evitar ou eliminar bolhas e vedar com esmalte para unhas. Lâminas semipermanentes como
essa que acabou de ser preparada mantêm-se adequadas para observação por vários anos se o
procedimento todo for efetuado com cuidados mínimos.

II) Técnica (opcional) para o preparo de lâminas permanentes, modificando algumas das etapas
descritas no procedimento anterior
Para confeccionar uma preparação permanente (em bálsamo do Canadá, não fornecido no
kit) espalhar na lâmina de microscopia uma camada fina (uma ou duas gotas, diluídas ou não em
igual volume de água) de albumina glicerinada de Mayer com a ajuda de uma segunda lâmina ou
de um palito e acrescentar imediatamente o preparado já corado antes que a película seque; para
garantir a adesão do corte à lâmina, aquecê-la rapidamente (usando a lâmpada de álcool ou um bico
de Bunsen, se disponível); em seguida, contrariamente ao procedimento precedente, o corte, já na
lâmina, deverá ser desidratado, passando primeiro por uma série progressiva de concentrações de
etanol até álcool a 100%; em seguida o álcool deverá ser substituído pelo xilol, o que é conseguido
passando o corte por uma série sucessiva de concentrações de xilol-etanol até xilol puro; pingar
então sobre o preparado, ainda embebido ligeiramente em xilol puro, uma ou duas gotas de bálsamo
do Canadá e, finalmente, colocar uma lamínula por cima, pressionando-a cuidadosamente para
evitar ou eliminar bolhas. Lâminas permanentes como essa que acabou de ser preparada mantêm-
se adequadas para observação indefinidamente se o procedimento todo for efetuado com cuidados
mínimos. As lâminas assim preparadas devem ser mantidas em posição perfeitamente horizontal
durante alguns dias para garantir a imobilização das lamínulas. O processo pode ser acelerado
mediante o uso de estufa a 30-35°C.

9
III) Técnica alternativa (opcional) para o preparo de lâminas permanentes, dispensando o uso
da albumina glicerinada de Meyer
A técnica não é apropriada para ser usada em cortes muito finos, mas fornece resultados
muito bons com cortes algo mais espessos. Sem a necessidade do uso do agente diafanizante água
sanitária, os cortes são submetidos à sequência de coloração diferencial descrita na técnica descrita
no item I. Em seguida as peças são desidratadas mediante imersão em soluções de álcool a 50%,
70% e 100% (1-2 minutos em cada solução); em seguida procede-se à substituição do álcool pelo xilol,
o que é obtido por imersão em álcool-xilol (1:1) e por dois banhos em xilol puro (1-2 minutos em cada
líquido). Depois disso o material é transferido para uma solução de bálsamo do Canadá em xilol na
proporção de 1 parte de bálsamo para 10 a 20 partes de xilol puro, onde poderá permanecer durante
várias horas ou mesmo alguns dias (mas podendo ser utilizado depois de 1 a 2 minutos, tempo que
deve ser empregado principalmente no caso de cortes mais finos, susceptíveis de sofrerem alterações
de dobramento e encolhimento). O tratamento com o xilol puro das últimas fases do processo tem
função de diafanizar o material, além de permitir a sua perfeita inclusão em bálsamo do Canadá entre
lâmina e lamínula. São válidas as observações constantes no último parágrafo do item II.

Figura 2 - Esquema mostrando o procedimento de preparo dos cortes detalhado no item III acima (método simplificado de
obtenção de preparados histológicos permanentes.

Mostramos a seguir fotografias de alguns preparados histológicos conseguidos usando-se a

técnica III descrita acima. As imagens foram obtidas de lupas Leica guarnecidas com digitalizadores,
ligadas a programas computacionais que permitem o controle da iluminação, contraste, focalização
e o arquivamento das imagens em formato jpg. Aproveitamos a oportunidade para agradecer
aos Drs. André L. P. Perondini e Denise S. Scheeepmaker (Departamento de Genética IB USP)
a disponibilização do seu equipamento foto-microscópico e a sua disposição e paciência em nos
familiarizar com o uso desse material, que empregamos para obter todas as imagens mostradas

10
a seguir. Também agradecemos ao Dr. José R. Pirani (Departamento de Botânica IB USP) pela
cuidadosa revisão das imagens e por suas correções e sugestões, a maioria das quais foi incorporada
ao presente texto de maneira virtualmente literal.
O professor deverá estar preparado para explicar aos alunos detalhes dos cortes e o significado
e a função das estruturas tissulares identificadas em cada uma das fotografias.
É importante notar, em praticamente todas as figuras dos preparados histológicos, que as
estruturas identificadas como «lignificadas» também possuem celulose, com a peculiaridade de terem
recebido um depósito de lignina sobre sua parede celulósica. Também é importante lembrar que nas
raízes em geral os tecidos vasculares não se organizam em feixes (como é a regra nos caules e
outros órgãos aéreos), mas sim formam uma massa central mais ou menos compacta de tecidos
vasculares. Ainda em todas as figuras a estrutura identificada como «cutícula/epiderme» deve ser
entendida como epiderme com cutícula, uma vez que a cutícula é uma camada inerte depositada
sobre as paredes externas das células epidérmicas.

Figura 3 - Preparado histológico de um corte de pecíolo de Apium graveolens (aipo). O aipo é uma planta cultivada
cujos pecíolos são hipertrofiados, constituindo a sua parte comestível. As estruturas lignificadas (cutícula; feixe vascular
correspondente a xilema e esclerênquima; colênquima) coram-se em vermelho (fucsina) e as partes celulósicas (parede
das células do parênquima) coram-se em verde (verde firme ou fast green).

11
Figura 4 - Preparado histológico de um corte de folha de Capsicum annuum (pimentão), uma variedade botânica cultivada
como a anterior cujo fruto (também conhecido como pimentão) é muito apreciado gastronomicamente. As estruturas
lignificadas (epiderme e colênquima; feixe vascular correspondente a xilema) coram-se em vermelho (fucsina) e as partes
celulósicas (parede das células do parênquima) coram-se em verde (verde firme ou fast green).

Figura 5 - Preparado histológico de um corte de caule de Impatiens balsamina (beijo ou beijo de frade), uma planta com flores
que possui uma ampla distribuição geográfica. As estruturas lignificadas (cutícula, epiderme e colênquima; esclerênquima
e feixe vascular correspondente a xilema) coram-se em vermelho (fucsina) e as partes celulósicas (parede das células do
parênquima) coram-se em verde (verde firme ou fast green).

12
Figura 6 - Preparado histológico de um corte de raiz de Monstera deliciosa (costela de Adão), uma planta nativa da América
tropical com folhas muito bonitas e frutos comestíveis e amplamente cultivada por seu valor ornamental. Como nas demais
ilustrações, as partes lignificadas (cutícula e massa central de tecidos vasculares) coram-se preferencialmente em vermelho
(fucsina) e as estruturas celulósicas (paredes das células do parênquima) em verde (fast green).

13
Figura 7 - Preparado histológico de um corte de caule de Piper sp. (piper), uma planta florífera que possui uma ampla
distribuição na região tropical. As estruturas lignificadas (cutícula, epiderme e colênquima; esclerênquima e feixe vascular
correspondente a xilema) coram-se em vermelho (fucsina) e as partes celulósicas (parede das células do parênquima)
coram-se em verde (verde firme ou fast green).

Figura 8 - Preparado histológico de um corte de caule de Sphagneticola trilobata (vedélia), uma planta florífera originária
da América Central com ampla distribuição na região neotropical. Como nos casos anteriores, as estruturas lignificadas da
planta (cutícula, epiderme e colênquima; esclerênquima e feixe vascular correspondente a xilema) coram-se em vermelho
(fucsina) e as partes celulósicas (parede das células do parênquima) coram-se em verde (verde firme ou fast green).

14
 P R O T O C O L O DE PREPARAÇ ÃO DAS
S O LU Ç Õ E S D E C ORANT ES E OU T RAS
S UB S T ÂN C IA S , REAGENT ES E DROGAS

As soluções devem ser preparadas exclusivamente por pessoas com treinamento em técnicas
básicas de laboratório químico, o qual deve ser minimamente equipado com aparelhagem adequada,
incluindo balança de precisão e capela para manuseio de substâncias nocivas e tóxicas. A filtragem
das soluções deve ser realizada preferencialmente em lã de vidro ou no mínimo usando-se papel de
filtro analítico. A estocagem das soluções deve ser feita em frascos de vidro neutro âmbar, mantidos
ao abrigo da iluminação direta.

1) Azul de astra
O corante azul de astra cora em azul a parede primária (celulósica) das células vegetais.
Para o preparo da solução alcoólica a 1%, dissolver 2g do corante azul de astra em 200ml (volume
final) de álcool etílico a 50% e agitar durante 5 minutos. Filtrar e estocar. O kit contém esta solução
do corante já preparada, em pequenas quantidades, para uso apenas do professor, caso ele
deseje mostrar aos alunos cortes corados com este corante.

2) Fucsina básica
O corante fucsina básica cora em vermelho ou rosa escuro a parede secundária (lignificada)
das células vegetais. Dissolver 1g do corante fucsina básica em 200 ml (volume final) de álcool
etílico a 50% e agitar durante 5 minutos. Filtrar e estocar. A partir dessa solução (concentrada) a
0,5% podem ser preparadas um soluções mais diluídas (também em álcool etílico a 50%) a 0,1% e
a 0,01%, que são mais fáceis de usar quando em associação com os corantes contrastantes azul de
astra ou verde firme. O kit contém a solução mais concentrada do corante e a solução a 0,1%
para uso eventual do professor.

3) Verde firme (fast green)

O corante verde firme cora em verde a parede primária (celulósica) das células vegetais. Para
o preparo da solução de trabalho concentrada, dissolver completamente 1g do corante verde firme
em uma mistura de 200ml (volume final) de álcool etílico a 50% (ou mais adequadamente, em uma
mistura de 200 ml de álcool etílico absoluto e metilcelosolve na proporção de 1:1), filtrar e estocar em
frasco âmbar. Esta solução concentrada (solução mãe) pode ser usada diretamente, mas soluções
bem mais diluídas são mais fáceis de controlar quando combinadas com o corante contrastante
fucsina básica. Para obter uma dessas soluções, num frasco separado misturar em proporções iguais
etanol puro (100%) e xilol. Na hora de usar o corante, acrescentar 0,5ml da solução-mãe concentrada
a um volume total de 100ml da solução álcool-xilol (solução diluída de uso). O kit contém a solução
mais concentrada do corante já preparada. Como o caso da fucsina, a solução mais diluída do
corante poderá ser eventualmente usada, a critério do professor.

15
 4) Solução de lugol
A reação com lugol localiza os depósitos intracelulares de amido, que tomam uma coloração
azulada ou marrom muito intensa. Para o preparo da solução de uso, dissolver 2g de iodeto de
potássio em água destilada e acrescentar 2g de iodo ressublimado de tal modo que o volume
final seja de 200ml. A mistura com iodo deve ser realizada dentro da capela do laboratório, com a
finalidade de se evitarem os vapores da fração de iodo sólido que se sublima naturalmente. Agitar
muito bem, deixando em repouso (algumas horas a uma semana), filtrar e guardar em frasco âmbar.
Para aplicar o lugol (verificação da “reação com lugol”) basta colocar os cortes, sem diafanizá-los, em
cima da lâmina, adicionar algumas gotas do reagente e montar com o próprio reagente a lâmina semi-
permanente. A coloração típica da reação se perde de maneira relativamente rápida com o passar
do tempo. Esta solução de lugol já preparada está incluída no kit. Trata-se de uma atividade
separada, que será usada pelo professor para detecção de amido nas preparações histológicas.

5) Outras soluções de corantes

A escola poderá adquirir outros corantes normalmente usados em preparações histológicas
vegetais, como a safranina, o cristal violeta (violeta de genciana) e o azul de metileno. Detalhes
sobre seu uso e suas propriedades tintoriais, bem como sobre o preparo de suas soluções, podem ser
encontrados em textos acessíveis como os de Beçak & Paulette (s/data) e Kraus & Arduin (1997), que
consultamos para o preparo deste texto e cuja leitura indicamos para os mais interessados. Pequenas
quantidades desses corantes foram preparadas para uso eventual pelo professor e também fazem
parte do kit.

Referências
Beçak W, Paulette-Vanrell J. Técnicas de citologia e histologia. Livraria Nobel, São Paulo, s/data.
Kraus J.E.; Arduin M. Manual básico de métodos em morfologia vegetal. Editora Universidade Rural,
Seropédica, 1997
Otto P.A. Construção e uso de um micrótomo de mão, empregado para obtenção de cortes finos de tecidos
vegetais e animais. Genética na Escola v. 6, n.1, p. 27-33, 2011 (http://www.geneticanaescola.com.br/
Ano6vol1.html).
Otto, P.A, Dessen E.M.B. Observação da estrutura interna dos vegetais. Guia de uso de micrótomo manual
https://genoma.ib.usp.br/files/upload/44/corte-e-coloracao.pdf
https://genoma.ib.usp.br/files/upload/44/manual-2.pdf
https://genoma.ib.usp.br/files/upload/44/protocolo-microtomo-final.pdf

16
 ObservaçãO da estrutura
Organização: Paulo Alberto Otto
Eliana Maria Beluzzo Dessen
Colaboração: Verônica Angyalossy
interna dOs vegetais
Diagramação: Regina de Siqueira Bueno

O Micrótomo manual

Cabo, por onde o

instrumento é seguro

borboleta
usada para girar
o parafuso que
empurra o cilindro
de alumínio com
o material a ser
seccionado no poço.
Cada 1/10 de volta
produz cortes com
cerca 50 a 100 µm.
Poço
em que é
colocado
o material
a ser
seccionado
tubo cortador tubo extrator Platina,
onde é apoiado o
instrumento de corte

Conteúdo do Kit
Micrótomo

navalha

tubo
cortador

tubo
vidro de relógio extrator

1
17
 Obtenção de suporte
para cortar os órgãos vegetais

1 Cortar uma fatia de cenoura 2 Pressionar o

com 1 cm de espessura. tubo cortador do
micrótomo sobre
a parte mais
central da fatia
de cenoura.
Manter o tubo
cortador na
posição vertical.

1 cm

3 Usar o tubo 4 Cortar ao meio o cilindro de cenoura

extrator com o auxílio da faca.
para retirar
o cilindro
de cenoura
de dentro
do tubo
cortador.

5 Usar a faca para fazer um sulco 6 Repetir os passos 1 a 4 para obter um

longitudinal nos lados internos
dos pedaços de cenoura
obtidos no item anterior.
Esta peça será usada para obter
cortes de caules e raízes.
segundo cilindro de cenoura cortado ao meio.
NÃO fazer o sulco interno (passo 5) neste
cilindro de cenoura.
Esta peça será usada para
obter cortes de estruturas
planas, como folhas.

2
18
 Obtenção de cortes finos
de caules e raízes

1 Colocar o pedaço de folha que deseja estudar 2 Colocar a outra metade do cilindro sobre o
numa das metades do cilindro de cenoura. tecido a ser estudado como em um sanduiche

3 Colocar o cilindro de cenoura contendo o 4 Usar a navalha de mão para cortar

tecido a ser estudado no orifício do micrótomo uma fina fatia de cenoura + tecido.
de mão. Regular a profundidade do orifício Manter a navalha na posição
movendo o parafuso central pela borboleta horizontal, paralela à
para que o cilindro de cenoura se encaixe platina do micrótomo.
perfeitamente. Desprezar esta
primeira fatia.
Girar muito pouco a
borboleta no sentido
horário (cerca de
de volta).
Usar a navalha para
fazer mais um corte.

5 Colocar cuidadosamente a fatia do tecido
obtida (sem a cenoura), com o auxílio
de pincel sobre um vidro de relógio
contendo 20 gotas de água. Repetir o
procedimento para obter outras fatias.
Água destilada
6 Selecionar, com o auxílio de uma lupa de mão,
as fatias mais finas obtidas. Transferir com o
auxílio do pincel os cortes desejados para outro
vidro de relógio contendo 10 gotas de água +
10 gotas de hipoclorito de sódio.
Aguardar 5 minutos.

5
minutos
Hipoclorito
de sódio

3
19
 Coloração dos
tecidos vegetais cortados

1 Lavar os cortes obtidos para a retirada do 2 Desidratar os tecidos cortados acrescentando

hipoclorito de sódio. sobre os tecidos, no vidro de relógio,
A lavagem é feita escorrendo-se a solução 20 gotas de etanol 70%.
de hipoclorito do vidro de relógio e Aguardar 3 minutos.
acrescentando-se água destilada.
Repetir o procedimento até não sentir 3
minutos
mais o cheiro de hipoclorito de sódio.

3 Escorrer o etanol 70% 4 Colocar sobre os cortes 5 gotas do corante

do vidro de relógio. verde firme (fast green) 0,5%.
Usar o pincel para Aguardar 1 minuto.
manter os cortes
no vidro de relógio. 1
3
Acrescentar 20 minuto
minutos
gotas de etanol
50%. Aguardar
3 minutos.
Escorrer o
etanol 50%.

5 Acrescentar sobre os cortes, com a pipeta de 6 Colocar sobre os cortes 5 gotas do corante
plástico, 1ml de etanol 50%. Escorrer o etanol fucsina 0,5%. Aguardar 30 segundos.
contendo o excesso de corante e acrescentar
mais 1 ml de etanol 50%. 30
segundos

4
20
 Coloração dos
tecidos vegetais cortados
continuação

7 Acrescentar sobre os cortes, com a pipeta 8 Transferir os cortes para

de plástico, 1mL de etanol 50%. Escorrer uma lâmina de vidro, com
o etanol contendo o excesso de corante o auxilio do pincel. Cobrir
e acrescentar mais 1 mL de etanol 50%. os tecidos cortados e
Repetir o procedimento até que não corados com 1 gota de
haja restos de corante no etanol. glicerina 50%.

9 Cobrir a preparação 10 Vedar as bordas

com uma lamínula. da lamínula com
esmalte incolor.
Esta é uma
preparação
semipermanente
que pode durar
vários meses.

11 Observar ao microscópio nos O corante verde firme cora de verde a

aumentos de 40 e de 100 vezes. parede primária das células (celulósica)
Desenhar as estruturas observadas. e o corante fucsina
cora em rosa
escuro a parede
secundária
das células
(lignificadas).
40x
100x

5
21