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J Forensic Sci, maio de 2014, Vol. 59, nº 3

doi: 10.1111/1556-4029.12391
NOTA TÉCNICA Disponível online em: onlinelibrary.wiley.com

PATOLOGIA/BIOLOGIA

María C. Tranchida,1 Ph.D.; Nestor D. Centeno, 2 Ph.D.; e Marta N. Cabello,1,3 Ph.D.

Fungos do solo: seu uso potencial como forense

Ferramenta*

RESUMO: Sendo uma sepultura um ambiente anômalo e diferente de seu entorno, os investigadores criminais empregam diferentes técnicas
para localizar, recuperar e analisar sepulturas clandestinas. Neste estudo foram identificados os fungos encontrados no solo sob cadáveres em decomposição com o objetivo de
relacionar a copresença de restos humanos e diferentes espécies fúngicas. Foram isolados os fungos de três maneiras: lavagem do solo,
diluições em série e crescimento em câmara úmida. Dichotomomyces cejpii, Talaromyces trachyspermus, Talaromyces flavus e Talaromyces sp. nós estamos
as espécies representativas encontradas – com aquelas pertencentes ao grupo da amônia, cujos fungos são os primeiros na sucessão de decomposição de cadáveres diretamente no
solo. A micobiota encontrada na presente área de estudo difere claramente da micobiota identificada na amostra controle e da
espécies previamente descritas para outras áreas da Província de Buenos Aires, Argentina. São necessários mais exemplos forenses deste tipo para desenvolver
plenamente o uso detalhado da micologia como ferramenta forense.

PALAVRAS-CHAVE: ciência forense, micologia forense, Ascomycota forense, fungos do solo, tafonomia forense, decomposição de cadáveres, fungos
sucessão

Micologia forense é um termo relativamente novo usado para a descrição
das espécies de fungos presentes nas proximidades de cadáveres humanos,
bem como aqueles grupos de fungos potencialmente úteis em
estabelecendo um tempo de morte (1,2). A tafonomia é a subdisciplina da
paleontologia que estuda os restos orgânicos e fossilizados post mortem nos
registros de diferentes períodos geológicos.
A tafonomia forense visa entender as condições que influenciam o processo
de decomposição para estimar o postmortem
intervalo e determinar a causa e a forma da morte. este
ramo da ciência forense - incorporando muitas técnicas de uma ampla
gama de disciplinas como arqueologia (3), entomologia (4),
microbiologia (5) e botânica (6) - tem sido usada para localizar,
descobrir e analisar sepulturas clandestinas.
Nas últimas décadas, poucos estudos de caso envolvendo
A micologia e a tafonomia baseadas em fungos têm sido utilizadas como
base para micologia forense nos Estados Unidos (1,2,7), Japão
(8,9) e Brasil (10) e mais recentemente na Argentina. este
nova subdisciplina das ciências forenses está aumentando em todo o mundo,
pois certos grupos de fungos geraram uma
corpo de dados sobre a decomposição de cadáveres e sua
ambiente relacionado. Esta informação demonstrou que diferentes grupos
fúngicos - referidos como amônia ou pós-putrefação
1
Instituto de Botânica Carlos Spegazzini, Universidad Nacional de La
Plata, 53# 477, Cp 1900, La Plata, Buenos Aires, Argentina.
2
Universidade Nacional de Quilmes, Departamento de Ciência e Tecnologia,
Laboratório de Entomología Aplicada e Forense, Sáenz Peña 352, Cp
1876, Bernal, Buenos Aires, Argentina.
3
Comissão de Investigações Científicas da Província de Buenos Aires
(CICPBA), 526 10 e 11, Cp 1900, La Plata, Buenos Aires, Argentina.
*Apoiado por doações do Projeto UNLP (11/N651), CICPBA e PICT
017.
Recebido em 22 de novembro de 2012; e em formulário revisado em 14 de março de 2013; aceitaram
24 de março de 2013.
fungos - podem servir como indicadores acima do solo da presença de
sepulturas em ecossistemas florestais (2).
O enterro de cadáveres humanos em condições naturais ou semi-naturais
às vezes é realizado na tentativa de ocultar a evidência de um crime. A
capacidade de localizar sepulturas clandestinas por
meio de fungos pode assim constituir uma ferramenta útil no processo
investigativo. Embora a entomologia forense – envolvendo a detecção dos
insetos presentes em cadáveres humanos – seja a mais
ciência frequentemente aplicada em investigações criminais e tem
permitiu a resolução de casos criminais complexos, técnicas
empregar fungos também pode constituir ferramentas relevantes para tal
fins forenses.
O objetivo deste trabalho foi isolar e identificar fungos em associação com
cadáveres humanos em estado avançado de decomposição.
Materiais e métodos
Restos humanos foram encontrados em dezembro de 2009 em um campo próximo
Cidade de Pergamino, Província de Buenos Aires (34° 21ÿ 41.6874ÿS;
60° 5ÿ 22.9914ÿW), Argentina. O site continha temporários
poças de uma chuva anterior. A vegetação predominante era
herbácea com sorgo como a planta mais comum. Dados lógicos climatológicos
obtidos de uma estação meteorológica governamental localizada em
uma distância de 60 km do local mostrou que a média
temperatura desde o momento do desaparecimento (14 de novembro de
2009) até a descoberta dos restos mortais (8 de dezembro de 2009)
variou entre 15,3 e 24,1°C, enquanto a precipitação média
variou entre 0 e 41 mm. O cadáver foi encontrado
24 dias após a morte com o crânio já reduzido a um esqueleto
e com os braços e pernas em estado de decomposição avançada
(Fig. 1A).
Amostras de solo em contato com os restos (Fig. 1B) e
15 m de distância do corpo (amostra de controle) foram tomadas com um estéril

© 2014 Academia Americana de Ciências Forenses 785

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786 REVISTA DE CIÊNCIAS FORENSES

FIGO. 1––Fotografia tirada no momento da descoberta dos restos humanos. (A) Restos humanos em estágio avançado de decomposição. (B) Local onde o solo
amostra foi retirada para este estudo. Na foto pode-se observar a vegetação luxuriante do local.

FIGO. 2––(A) Ascósporos de Dichotomomyces cejpii mostrando a ornamentação da parede sob microscopia eletrônica de varredura (25009). (B) Globose asco com
ascósporos (75009).

colher no momento da descoberta, transportada para o laboratório em sacos
plásticos hermeticamente fechados e processada de acordo com os seguintes
métodos: (i) Foi realizada uma lavagem conforme descrito por Parkinson e
Williams (11). As partículas de solo foram lavadas pelo menos 10 vezes com
água estéril, sendo a água completamente drenada após cada lavagem. As
partículas de solo foram então secas por 24 h em papel de filtro. Em seguida,
50 partículas foram semeadas em ágar batata dextrose (PDA) e ágar extrato
de levedura de malte (MYA) contendo estreptomicina (100 lg/mL) e cloranfenicol
(50 lg/mL) para inibir o crescimento bacteriano. A frequência relativa é o
número de partículas portadoras de um fungo específico/número total de
partículas para cada meio de cultura (12); (ii) Diluições seriadas foram feitas
conforme descrito por Warcup (13). De cada diluição, 100 lL foram semeados
em triplicata em cada um dos seguintes meios de cultura: PDA, MYA e ágar-
água. As unidades formadoras de colônias médias (UFCs) e os desvios padrão
foram registrados; (iii) Cinquenta partículas de solo foram incubadas em 10
placas de Petri de 90 mm contendo papel de filtro umedecido (para manter a
umidade) em cinco partículas por placa a 25°C. Após Elíades et al. (14),
vamos nos referir a esta abordagem como o método da câmara úmida. Com
esta técnica, cada partícula individual do solo foi considerada uma unidade
amostral distinta, e a frequência de ocorrência foi calculada como: o
número de partículas portadoras de um fungo específico/número total de
partículas analisadas (50).
As estruturas morfológicas dos fungos foram observadas por microscopia
óptica, por meio da coloração com algodão azul. A ultraestrutura do isolado
fúngico foi observada em microscópio eletrônico de varredura Jeol JSM-6360
(JSM-6390LV, Jeol, Akishima, Tóquio, Japão) no Serviço de Microscopia
Eletrônica do Museu de Ciências Naturais de La Plata. Artigos taxonômicos
originais e trabalhos específicos como Sotolk et al. (15) e Domsch et al. (16)
foram utilizados para identificar fungos esporulantes.
Resultados
Através da técnica de câmara úmida, identificamos Dichot omomyces cejpii
(Milko) Scott (Ascomycota, Eurotiomycetes; Fig. 2) nas amostras de partículas
de solo com uma frequência relativa de 0,94, enquanto Talaromyces
trachyspermus (Shear) Sotolk & Samson (Fig. 3) ) e Talaromyces sp. foram
observadas em uma frequência relativa de apenas 0,04 e 0,02, respectivamente.
Na amostra controle foram identificados Mucor hiemalis (Hagem) Schipper e
Mortierella sp. (Zygomycota), e estágios anamórficos de Ascomycota como
Penicillium frequentans (Wehmer) Westling,
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TRANQUIDA E AL. . FUNGOS DO SOLO COMO FERRAMENTA FORENSE 787

00 0 0 0,04 0,08 0,02 0,04 0,02

Relativo 50)
(N
=
frequência

Câmara
úmida

WA NF NF NF NF

NF NF NF NF 104
104
2,6
3,3
104
1,5
1,5
NF
99
9
PDA

(N
3)
=
controle
Ao Método

(média
SD)
1.3 104
1,5
104
0,6
0,4
104
0,5
0,6
104
0,6
0,3
0,6
1,6
NF
999
9919 0,25
104
1,3
0,51
0,08
104
1,6
0,4
104
1,3
10499

FIGO. 3––Ascósporos de Talaromyces trachyspermu mostrando a ornamentação

da parede com verrugas aglomeradas sob microscopia eletrônica de varredura (55009). Diluição
série
104)
em
(1
9

NF NF 104
1,5
NF
9 104
4,3
104
1,5
0,6
99
MYA

Aspergillus sp., e Penicillium sp. Penicillium sp. foi o mais

espécies freqüentes encontradas na amostra de controle analisada por este 1.3 2.3

técnica (frequência relativa 0,14) (Tabela 1).

Pelo método de lavagem do solo, as espécies mais comuns
0 0 0,08
2,6 0,06
1

encontrado foi D. cejpii, ensaiando em maior frequência relativa

no meio de cultura MYA do que no meio de cultura PDA. Talaromyces
Relativo 50)
(N
=

sp., T. trachyspermus, Talaromyces flavus (Klocker) Sotolk &

Lavagem
solo
do frequência

MYA
PDA
0 0 00,02
0 0,06
0 0,04
0,02
0,3

Sansão (Fig. 4), P. frequentans, Penicillium strictum Gilman

& Abbott, e Penicillium purpurescens (Sopp) Raper &
Thom também foram observados por este método, mas em um baixo
frequência (Tabela 1). Por outro lado, os zigomicetos 0,94 0,04 0,02
0 0 NF 0
Mortierela sp. e M. hiemalis (Tabela 1), e Absidia sp. Relativo
frequência
50)
(N
=

(frequência relativa 0,02) foram registrados na amostra de controle. Câmara

úmida

A frequência relativa de estágios anamórficos de Ascomycota

fungos P. frequentans, Penicillum sp., Aspergillus sp e Cla dosporium
cladosporioides (Fries.) de Vries são mostrados em
Tabela 1. Outros estágios anamórficos de Ascomycota como Purpu reocillium WA
104
4,1
9 104
1,5
9
NF NF NF NF NF NF
104
0,5
9

lilacinum (Thom) Luannsa-ard, Houbraken; Hywel Jones & Samson,

Trichoderma koningii Oudem, Fusarium 2.3

oxysporum Schlecht, Clonostachys reosea Fries também foram

observado.
A quantificação fúngica pelo método de diluição em série deu a
seguintes valores de abundância: 2,5 0,6 9 106 e 1,9 106 UFC 0,6 9 NF
104
1.6
NF
9
NF NF NF

para D. cejpii em meio MYA e PDA, respectivamente 0,8 9 105 UFC para
Método
(N
3)
=

(média
SD)

1,1 mus e 20 8 UFC para TalaromycesT. trachyspertivamente,

sp., ambos em PDA em oposição a 10,6
104
0,6
8,3
9 104
8,0
20
9 5.6

Diluição
série
104)
em
(1
9

médio (Tabela 1). Na amostra controle foram registradas as UFCs amostras

controle.
controle,
comuns
amostra
tratado
fungos
cultura
entre
meios
todos
de
os
e solo
para
de
os
e

de estágios anamórficos de Ascomycota: Aspergillus sp., Penicil lium sp e coletadas

Amostras
humano
repouso
solo
em
de

P. frequentans (Tabela 1). UFCs de T. koningii, NF NF NF NF

104
NF
19

F. oxysporum e Aspergillus terreus Thom também foram

observado. Penicillium frequentans foi o mais frequentemente quantificado
Espécies de ascomicetos (4.3 1,5 9 104 ) em PDA (Tabela 1).
Mucor hiemalis foi o único zigomiceto encontrado através deste
técnica (Tabela 1). 15,6
54,9
MYA
104
59,8
0,33
9192
PDA
104
253
9 1,24
2104
19 0,02
104
1,5
4,3
9 0 0,02 0,33
3,1 0
Dichotomomyces cejpii, T. trachyspermus, T. flavus e
Talaromyces sp., a espécie mais representativa deste trabalho, Relativo
Lavagem
solo
do frequência
50)
(N
=

0,52 0,04 0,02 0,02

0 0
foram depositados na coleção do Instituto Botânico C. Spe gazzini,
Universidade Nacional de La Plata, sob a adesão
números LPSC 1160, 1161, 1162 e 1163, respectivamente.

Discussão
encontrado.
dextrose;
levedura
extrato
batata
água;
malte;
ágar-
PDA,
WA,
ágar
não
MYA,
NF,
ágar
de
de
decomposição
empregadas
encontradas
encontradas
(controle).
espécies
técnicas
distância
comuns
coletadas
humanos
usando
apenas
amostras
mostra
Espécies
tabela
TABELA
fungos
restos
sob
emem
15
m
1––
de
dea
eAtrês
as
as
solo
dee
cladosporioides traquispermo cejpii
frequentadores
Dichotomomyces
Espécies
fungos
MYA
PDA
de Mortierela
sp.
hiemalis
Mucor Penicillium
Penicillium
sp. Cladosporium
Talaromyces
sp. Talaromyces

Nas últimas décadas, uma série de experimentos de campo e casos

Aspergilus
sp.

estudos em micologia forneceram dados úteis para detectar sítios

Machine Translated by Google
788 REVISTA DE CIÊNCIAS FORENSES
FIGO. 4––Ascósporos de Talaromyces flavus mostrando sua parede de spinulose
sob microscopia eletrônica de varredura (40009).
onde ocorreu a decomposição do cadáver. Esses dados demonstraram que
certos grupos quimioecológicos de fungos podem atuar como marcadores de
sepultura acima do solo (1,2,17,18). De acordo com Carter e Tibbett (2),
variedades de fungos que potencialmente podem atuar como marcadores de
sepulturas de destino do clã são conhecidas como fungos de amônia e pós-
putrefação e podem servir como uma ferramenta para a estimativa do intervalo
pós-sepultamento.
A micobiota encontrada na presente área de estudo difere claramente da
micobiota identificada na amostra controle. Os fungos zygo mycota como M.
hiemalis, Absidia sp. e Mortierella sp são geralmente encontrados no solo,
esterco, matéria orgânica em decomposição e grãos armazenados, e algumas
espécies são conhecidas como fungos do açúcar pela falta de enzimas para
degradar carboidratos complexos (19,20). Os autores observam a ausência
dessas espécies na amostra de solo coletada sob o corpo humano em
decomposição. Crater e Tibbet (2) referem-se aos zigomicetos como fungos
pós-putrefação, mas em nosso estudo estavam presentes apenas na amostra
de solo controle, fazendo parte da biota fúngica dos solos da Província de
Buenos Aires, conforme mencionado por Cabello et al. (21) e Eliades et al.
(12,14,22). Essa diferença pode estar relacionada aos compostos contendo
nitrogênio que entram no solo a partir da decomposição dos restos humanos
presentes. No caso particular aqui apresentado, a descoberta de Eurotiomycetes
geofúngicos seria consistente com um tempo de morte em cerca de 25 dias
antes da descoberta do corpo (2).
Os fungos de amônia em solo de floresta experimental tratado com uréia,
amônio ou outros compostos nitrogenados que liberam amônia após a
decomposição podem formar estruturas de frutificação (ou seja, cogumelos)
mais rapidamente do que ocorreria naturalmente (ou seja, em locais que não
sofreram tratamento químico experimental (2)). Os fungos de amônia e pós-
putrefação fazem parte da mesma sucessão da biota que ocorre durante o
processo natural de decomposição, sendo as estruturas dos fungos de amônia
as primeiras identificáveis nesta sucessão. Esses fungos iniciais podem
apresentar corpos de frutificação de 1 a 10 meses após a fertilização do solo
com compostos nitrogenados e consistem nos ascomicetos (anamorfos e
teleomorfos) juntamente com os basidiomicetos saprotróficos (23,24). De
acordo com Sagara (23) e Fukiharu e Hongo (24) – embora seus trabalhos
tratassem de solos florestais – D. cejpii, T. trachyspermus, T. flavus e
Talaromyces sp., do filo Ascomycota, corresponderiam a fungos de fase inicial:
assim, no nosso caso, essas estruturas foram encontradas 25 dias após a
morte do indivíduo. A contribuição de compostos de nitrogênio, incluindo
aminoácidos das proteínas dos restos em decomposição, poderia ter
uma influência significativa na ocorrência dessas espécies fúngicas sob o
cadáver.
Muitos exemplos de fungos associados a restos de animais foram
documentados, mas apenas alguns envolvendo decomposição post mortem
humana (1,2). O presente estudo é o primeiro registro, para a Argentina e para
a América do Sul, de fungos de solo ocorrendo no local de um corpo humano
em decomposição em condições naturais.
Dichotomomyces cejpii foi a espécie dominante nas amostras de solo. Este
fungo foi mencionado por Godeas (25) em Buenos Aires, Argentina, em
associação com serapilheira, mas os presentes achados constituem o primeiro
registro do envolvimento de D. cejpii no processo de decomposição de um
cadáver enterrado em solo de pastagem. Nas amostras de solo cultivadas in
vitro em laboratório, observamos tanto o teleomorfo D. cejpii quanto seu
anamorfo Polypaecilum spp. T. trachyspermus foi descrito por El ÿades et al.
(22) como presente em solos da Província de Buenos Aires.
Um levantamento sistemático de estruturas de frutificação fúngica em solo
de pastagem poderia ser usado para designar potenciais locais de sepultura,
reduzindo assim a quantidade de tempo necessária para rastrear uma grande área.
Tais levantamentos seriam apropriados onde houver suspeita de enterro ao
longo de meses ou anos, pois a frutificação relacionada ao cadáver não
ocorreria imediatamente após o enterro.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Dr. Donald F. Haggerty, investigador de carreira
aposentado e falante nativo de inglês, por editar a versão final do manuscrito.
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Informações adicionais e solicitações de
reimpressão: Mar ÿa C. Tranchida, Ph.D.
Instituto de Botânica C. Spegazzini
FCNyM Universidad Nacional de La Plata Calle
53 N 477, Cp 1900 La Plata Buenos Aires
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