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TERAPIA CELULAR E GÊNICAPERCEPÇÕES

PERCEPÇÃO INOVADORA

Aplicação prática da avaliação e

comparação do desempenho do
método de contagem de células
derivadas dos Padrões ISO de
Contagem de Células Parte 1 e 2
Yongyang Huang, Jordan Bell, Dmitry Kuksin, Sumona Sarkar,
Laura T Pierce, David Newton, Jean Qiu e Leo Li-Ying Chan

O aumento da utilização de células na biofabricação e como produtos terapêuticos na última década

levou ao desenvolvimento e publicação de dois padrões ISO de contagem de células, ISO 20391 – 1:2018 e
ISO 20391 – 2:2019 para fornecer orientação sobre os princípios gerais relacionados à célula contagem e
estabelecer uma abordagem para avaliar a qualidade dos métodos de contagem de células. Neste
trabalho, demonstramos a implementação prática do protocolo experimental descrito na ISO Cell
Counting Standard Parte 2 e uma análise comparativa de Bland-Altman para avaliar o desempenho e
comparação dos métodos de contagem de células. Comparamos dois tipos de células, dois instrumentos
de citometria de imagem e duas manchas fluorescentes, calculando a precisão, coeficiente de
determinação (R2) e um índice de proporcionalidade (PI) para avaliar o desempenho do método de
contagem de células. Além disso, os resultados da contagem de células são comparados diretamente
para avaliar o viés entre dois métodos de contagem de células. O protocolo é adequado para avaliar e
comparar o desempenho de vários métodos de contagem de células para selecionar ensaios a jusante.

Informações sobre terapia celular e genética2021; 7(9), 937–960

DOI: 10.18609/cgti.2021.126

www.insights.bio
937
TERAPIA CELULAR E GÊNICAPERCEPÇÕES

INTRODUÇÃO e melhorar a qualidade das medições de

contagem de células:
Na última década, as terapias celulares e genéticas
1.Determinar o uso pretendido do resultado da contagem de
melhoraram drasticamente sua eficácia e se
células (por exemplo, contagem de células para
tornaram peças essenciais no tratamento do
normalização de bioensaios, dosagem de terapia
câncer.[1,2]. Com a aprovação de duas terapias de
celular, digestão pós-tumoral para análise de
células T do receptor de antígeno quimérico (CAR)
transcriptoma baseada em célula única, processamento
pela Food and Drug Administration (FDA) dos EUA
de tecido de camundongo para ensaios de
em 2017, o número de estudos clínicos e testes em
citotoxicidade ou isolamento de PBMCs humanos para
novos e inovadores produtos de terapia celular
análise de imunofenotipagem, etc)
também aumentou.[3–5]. Normalmente, as terapias
celulares requerem modificação genética das 2.Investigue para entender a composição da amostra
células imunes (ou seja, células T, células NK) celular (por exemplo, vários tipos de células, restos
coletadas de pacientes, expansão da cultura e de partículas, impurezas químicas e meio de
reintrodução dos produtos finais nos pacientes. suspensão), bem como as aparências morfológicas
Portanto, é fundamental fornecer contagem das células sob microscopia
celular precisa para a administração de dosagens
3.Entenda os princípios do ensaio e selecione o ensaio de
adequadas, o que pode levar à ineficácia ou induzir
contagem de células apropriado, como contagem de
respostas autoimunes indesejadas em pacientes
células totais, vivas e mortas, viabilidade ou análise de
submetidos a tratamentos terapêuticos.[6–8].
população celular

No 21st Century Cures Act, o Congresso dos 4.Investigue os recursos e selecione os sistemas de

Estados Unidos também reconheceu a importância da contagem de células apropriados, onde o sistema

padronização para simplificar o desenvolvimento, consiste em reagentes, consumíveis, instrumentos

garantia de qualidade e facilitar a aprovação e algoritmos de software, bem como critérios de

regulatória de produtos de terapia genética e celular[ desempenho do ensaio (ou seja, precisão, faixa,

9]. No workshop “Synergizing Efforts in Standards linearidade, etc.)

Development for Cellular Therapies and Regenerative

5.Trate cada método de contagem de células como um
Medicine Products” realizado pela FDA em 31 de
processo completo, incluindo amostragem, diluição e
março de 2014, a contagem de células e a garantia de
coloração, que são essenciais para a preparação
medição de viabilidade foram identificadas como
adequada da amostra
oportunidades para o desenvolvimento de padrões[
6.Forneça treinamento contínuo ao operador, a fim de
10,11]. Desde então, a ISO publicou dois padrões de
garantir resultados consistentes de contagem de
contagem de células, “ISO 20391-1:2018
células
Biotechnology – Cell Counting
– Parte 1: Orientação geral sobre métodos de Percebe-se também que as necessidades de

contagem de células” e “ISO 20391-2:2019 contagem de células para terapias celulares e gênicas

Biotecnologia – Contagem de células – Parte 2: Projeto são amplas devido a uma ampla gama de tipos de

experimental e análise estatística para quantificar o amostras biológicas com várias formulações e etapas

desempenho do método de contagem”, que podem de bioprocessamento, que são complexas, dinâmicas

servir de orientação para pesquisadores que e heterogêneas. Como atualmente não há materiais

trabalham na área de imunoterapia e terapia celular de referência para células vivas de mamíferos que

adotiva, onde ambas exigem medições de contagem sejam certificados para concentração celular, o

de células robustas e de alta qualidade para produtos parâmetro de precisão descrito na Diretriz Tripartida

biológicos e celulares[12,13]. Harmonizada ICH – Validação de Procedimentos

Derivado dos conceitos gerais descritos na Parte 1 Analíticos: Texto e Metodologia Q2 (R1) não pode ser

do Padrão de Contagem de Células ISO, propomos 6 prontamente aplicado, aumentando assim o desafio e

fatores-chave que podem fornecer orientação sobre a dificuldade de validar a precisão da contagem de

seleção de métodos de contagem de células células[14–16].

938 DOI: 10.18609/cgti.2021.126


Portanto, os padrões de contagem de células ISO podem
servir como uma ferramenta valiosa para avaliar e
selecionar métodos de contagem de células adequados
para o propósito, a fim de aumentar a confiança nos
resultados da contagem de células.
DESENVOLVIMENTO DO
PROTOCOLO
Empregamos a orientação da ISO 20391 –
2:2019 Biotecnologia – Contagem de
células – Parte 2 e utilizamos informações
do ICH Q2 (R1) para desenvolver um
protocolo apropriado para avaliar o
desempenho de métodos de contagem de
células selecionados. O documento de
orientação ICH Q2 (R1) apresenta vários
parâmetros para a validação de métodos
analíticos, como robustez, linearidade,
faixa de detecção, limites de detecção
(LOD), limites de quantificação (LOQ),
precisão (repetibilidade, precisão
intermediária, reprodutibilidade) , e
precisão. É importante observar que, como
não há material de referência para
fornecer um valor de referência para a
concentração celular, a avaliação do
parâmetro de precisão precisa ser avaliada
indiretamente por métodos comparativos
ortogonais.2) e proporcionalidade.
Utilizando o documento ISO Cell Counting
Standard Parte 2, identificamos vários parâmetros-
chave que podem avaliar rápida e suficientemente o
desempenho dos métodos de contagem de células[
17,18]. Neste trabalho, vamos nos concentrar em um
protocolo experimental derivado do Padrão ISO de
Contagem de Células Parte 2, que avalia o coeficiente
de determinação (R2
valor), precisão (repetibilidade – coeficiente de variação
[CV]) e índice de proporcionalidade (PI) de um método de
contagem de células. O índice de proporcionalidade é uma
métrica introduzida na Parte 2 do Padrão de Contagem de
Células ISO que quantifica o grau em que um método de
contagem de células está em conformidade com o
princípio da proporcionalidade, onde se espera que as
contagens de células aumentem proporcionalmente com
a diluição. O princípio da proporcionalidade é
fundamental
Informações sobre Terapia Celular e Genética - ISSN: 2059-7800
PERCEPÇÃO INOVADORA
propriedade de qualquer método de contagem de
células, e qualquer desvio da proporcionalidade
indicaria um erro sistemático ou não sistemático,
resultando em perda de precisão da medição. Para
avaliar mais diretamente o desvio sistemático da
proporcionalidade, que é um indicador de perda de
precisão, oPIé calculado ajustando um modelo
proporcional aos dados da série de diluição e, em
seguida, resumindo os resíduos com base nos dados
suavizados, reduzindo assim a influência da variação
aleatória na avaliação da proporcionalidade[17].
Existem várias abordagens para calcularPI, onde
algunsPIas métricas podem ser mais relevantes com
base na necessidade de adequação ao propósito do
método de contagem de células. Algumas métricas
penalizam mais os valores discrepantes, enquanto
outras pesam os erros uniformemente nas diluições
ou permitem mais contribuições por concentrações de
células mais altas. Neste trabalho, utilizamos oPI
modelo publicado anteriormente do Instituto Nacional
de Padrões e Tecnologia (NIST)[17]. Deve-se notar que
as fontes de erro sistemático que são proporcionais à
diluição da amostra não serão detectadas com esta
abordagem. Por exemplo, se os detritos forem
misturados com a suspensão de células e falsamente
identificados como células, a concentração de células
e detritos seria reduzida proporcionalmente com a
diluição, e as falsas contagens não afetariam a
proporcionalidade. A fim de demonstrar o uso
adequado dos experimentos propostos, esses
protocolos foram testados usando vários sistemas de
citometria de imagem da Nexcelom Bioscience LLC.
(Lawrence, MA).
MÉTODO DE ANÁLISE COMPARATIVA
DE BLAND-ALTMAN
Métodos de análise comparativa podem ser
empregados para comparar o desempenho de
diferentes métodos de contagem de células.
Embora a falta de material de referência impeça
a medição direta da precisão da contagem de
células, a comparação de métodos ortogonais
pode servir como uma alternativa viável. Muitas
vezes também é desejável determinar o quanto
os resultados de um método irão concordar
com outro, como quando um instrumento é
939
TERAPIA CELULAR E GÊNICAPERCEPÇÕES
atualizado depois de muitos anos no
laboratório. Um método útil é a construção de
um gráfico de diferenças médias de Tukey,
também conhecido como gráfico de Bland-
Altman.[20–22]. A análise de Bland-Altman
resulta no cálculo de um viés (com intervalo de
confiança correspondente) entre dois métodos,
indicando qual método conta mais alto ou mais
baixo em média e quanto. A análise também
fornece uma estimativa de quão bem os dois
métodos devem concordar para uma única
amostra. Aqui, modificamos o projeto
experimental da série de diluição descrito no
documento ISO Cell Counting Standard Parte 2
para coletar dados apropriados para uma
análise de Bland-Altman, ao mesmo tempo em
que atendemos aos requisitos de padrões para
calcular CV, R2, ePI.
Normalmente, os gráficos de Bland-Altman
consistem em diferenças absolutas entre duas
medições plotadas contra sua média. No caso da
contagem de células, a variância não é constante para
diferentes concentrações, mas geralmente é
proporcional ao número de células contadas[17]. Para
que a análise de Bland-Altman seja útil em tal
aplicação, os dados podem ser transformados para
atingir uma variância aproximadamente constante em
uma faixa de concentrações. Neste protocolo, usamos
diferenças percentuais em vez de diferenças absolutas
para obter uma variância mais uniforme.
O método de análise de Bland-Altman produz
três métricas de comparação:
1.O viés entre dois métodos, que é a média
das diferenças.
2.Os limites de concordância (LoA), que são
um múltiplo do desvio padrão das
diferenças.
3.O intervalo de confiança (CI) do viés, que é
um múltiplo do erro padrão da média das
diferenças.
O viés descreve a diferença média entre os
resultados de medição obtidos por meio dos
dois métodos. Devido à variação biológica nas
amostras e à variabilidade no processo de
medição para ambos os métodos, é impossível
prever exatamente o quanto a medição de
qualquer amostra individual será diferente
940 DOI: 10.18609/cgti.2021.126
entre os dois métodos. No entanto, quando as
medições de muitas amostras são calculadas,
um viés – mesmo que leve – pode se tornar
claro. O viés pode ser interpretado como um
método medindo maior ou menor do que outro
em média, embora a diferença entre os
métodos ao medir uma única amostra possa
variar amplamente.
Os limites de concordância descrevem
quão amplamente essas diferenças podem
variar. Quando adicionado e subtraído do
viés, o LoA define um intervalo dentro do
qual se espera encontrar a diferença entre as
medições de dois métodos de uma única
amostra. Neste protocolo, usamos os limites
de concordância que se aproximam de um
intervalo de confiança de 95% (1,96 × desvios
padrão) para uma distribuição normal. Esta é
uma aproximação suficiente para nossos
propósitos e tamanho de amostra de 72
medições. Se menos medições forem
adquiridas, intervalos de confiança
calculados a partir da distribuição t
apropriada (em vez da distribuição Normal)
são recomendados. Se as diferenças
percentuais entre os resultados dos dois
métodos seguirem uma distribuição normal,
podemos esperar que 95% das diferenças
caiam dentro de um LoA do valor do viés. Na
realidade,[23]. Se for necessário mais rigor
estatístico, podem ser aplicados testes de
normalidade e os intervalos de confiança
podem ser calculados com mais precisão[24].
Dependendo da variação observada entre
amostras em relação à variação entre
medições replicadas de cada amostra, pode
ser útil incluir termos de efeitos aleatórios
normalmente incluídos na análise de
experimentos hierárquicos. Neste trabalho,
não nos preocupamos com a variação
amostra a amostra nos experimentos
propostos.
O intervalo de confiança do viés fornece a
incerteza aproximada para o valor do viés
calculado e sugere uma faixa dentro da qual o
verdadeiro valor do viés entre os dois métodos
de contagem de células provavelmente será
encontrado. Ao contrário do LoA, esse intervalo
de confiança se estreita com um aumento
 PERCEPÇÃO INOVADORA

número de amostras medidas. Se o intervalo de APLICAÇÕES DO MÉTODO

confiança de 95% for maior do que o valor absoluto do
Os protocolos de comparação e avaliação de desempenho
viés (ou seja, o IC coloca o valor 0 entre os colchetes),
do método de contagem de células podem ser aplicados
a comparação do método não demonstrou um viés
em pesquisas, desenvolvimento de métodos analíticos,
estatisticamente significativo entre os dois métodos
desenvolvimento de processos e ensaios pré-clínicos ou
(em nível de significância α = 0,05). Com amostras
clínicos. Além disso, o método pode ser aplicado a uma
suficientes, mesmo um viés muito leve pode ser
infinidade de campos de pesquisa que requerem o uso de
medido com confiança. Um leve viés geralmente é
células, como terapia celular e gênica, imuno-oncologia e
insignificante em comparação com a variação da
imunoterapia, desenvolvimento de linha celular e
amostra. Os pesquisadores devem considerar como
produção de produtos biológicos, virologia e doenças
uma contagem de células está sendo usada para
infecciosas, medicina regenerativa, toxicologia, alimentos
determinar os níveis aceitáveis de viés em seu caso.
ciência e até energia renovável. A qualidade dos

resultados da contagem de células é crítica para uma

Antes de prosseguir com a análise comparativa de
ampla gama de tipos de células usadas nos campos de
Bland-Altman para contagem de células, os
pesquisa mencionados acima. Esses tipos de células
pesquisadores devem:
podem incluir células primárias, como sangue total
1.Determine a faixa de valores de concentração
humano ou de camundongo, sangue do cordão umbilical,
celular para a qual a comparação entre os dois
aspirado de medula óssea, tecido adiposo, hepatócitos,
métodos é desejada;
PBMCs, amostra de leucaférese, plaquetas, Digestões de

2.Determine quais valores do viés e LoA são tumor ou tecido são tipicamente usadas. Além disso, as

aceitáveis para sua aplicação, células de bactérias e leveduras são frequentemente

usadas para gerar produtos biológicos ou para a

3.Selecione amostras de células que sejam
produção de bebidas.
representativas da população para a qual a
comparação é desejada e o intervalo
determinado na etapa 1; e
DESIGN EXPERIMENTAL
4.Meça cada amostra usando os diferentes
métodos de contagem de células, tomando A avaliação de desempenho do método de contagem
cuidado para que a amostra não mude entre de células aqui proposta consiste em um experimento
as medições (atraso mínimo entre as de diluição em série e análise comparativa para
medições, mistura adequada, etc.)[25]. múltiplos métodos. O projeto experimental é

Um número maior de medições pareadas demonstrado usando linhas de células CHO-S e Jurkat

pode reduzir as incertezas do viés e do LoA, fluorescentemente coradas com laranja de acridina e

por exemplo, o intervalo de confiança do viés um corante nuclear verde. Dois sistemas de contagem

diminui com mais medições. Os de células são comparados: o Cellaca MX High-

pesquisadores devem determinar a precisão Throughput Cell Counter (Cellaca MX) e o Celigo Image

necessária e aumentar o número de Cytometer (Celigo). É importante observar que a

medições pareadas de acordo – sugerimos Contagem de células ISO Parte 2 exige que os

um mínimo de 20 medições pareadas como usuários avaliem as contribuições dos erros de

ponto de partida. Finalmente, é possível que pipetagem para a integridade da diluição para

o viés ou a variação variem com a estabelecer a confiança na diluição e na amostragem.

concentração celular. Nesse caso, o viés e o Aqui, realizamos uma pré-avaliação de erro de

LoA obtidos para todo o grupo de dados pipetagem, que não será descrita neste protocolo.

podem não ser representativos de como os Também é importante investigar a estabilidade da

dois métodos se comparam em uma faixa amostra de células-alvo antes de conduzir o

mais estreita de concentrações. Pode ser útil experimento, a fim de evitar desvios na concentração

realizar análises de Bland-Altman em e viabilidade durante o período de tempo do ensaio. A

subconjuntos menores de dados. estabilidade de

Informações sobre Terapia Celular e Genética - ISSN: 2059-7800

941
TERAPIA CELULAR E GÊNICAPERCEPÇÕES
as células Jurkat e CHO utilizadas neste trabalho
foram previamente testadas e não apresentaram
tendências perceptíveis(Figura Complementar 1).
O experimento de diluição consiste em uma
série de concentração de 6 pontos dos tipos de
células-alvo, onde cada concentração é produzida
independentemente a partir do estoque original
(em vez das outras diluições) para reduzir a
propagação do erro de diluição que pode afetar a
proporcionalidade. A série de diluição deve
abranger o intervalo de concentração típico das
amostras de células-alvo para avaliar o
desempenho do método de contagem de células
no intervalo especificado.
Três amostras replicadas são geradas por
concentração e cada amostra replicada é
medida 4 vezes por método de contagem de
células para que cada método forneça um total
de 12 medições por concentração e um total de
72 medições em uma série de concentração de
6 pontos. As medições são usadas para calcular
o coeficiente de determinação (R2), precisão
(repetibilidade – Coeficiente de Variação, CV) e
índice de proporcionalidade (PI) para cada
método de contagem de células. É importante
notar que as células Jurkat e CHO testadas
foram coradas com laranja de acridina e corante
Verde Nuclear para medir apenas a
concentração celular total neste trabalho.
Para comparação de desempenho entre dois
métodos de contagem de células, o método de Bland-
Altman é aplicado. Como a medição de
proporcionalidade, os resultados da comparação são
válidos apenas para o uso pretendido dos métodos
específicos (tipo de célula, tipo de ensaio,
instrumentos exatos, etc.) e apenas para a faixa de
concentrações de células incluídas no teste. Portanto,
é vital definir primeiro os métodos exatos, as
condições de teste e a faixa de concentrações de
células sobre as quais a comparação é desejada. Para
obter resultados mais precisos, a análise de Bland-
Altman deve incluir o maior número possível de
medições, abrangendo as fontes de variação
esperadas para a operação normal do método de
contagem de células, como operadores múltiplos,
lotes de reagentes e frascos de cultura de células.
Cada ponto no gráfico de Bland-Altman é obtido
usando ambos os métodos de contagem de células
para medir uma única amostra. A amostra deve ser
942 DOI: 10.18609/cgti.2021.126
cuidadosamente misturados para garantir a
homogeneidade antes que as porções sejam tomadas
para medição com cada método de contagem de
células. As medições devem ser feitas com o mínimo
de atraso entre elas, simultaneamente, se possível. Se
o experimento descrito acima for realizado com os
mesmos tubos de células usando ambos os métodos
ao mesmo tempo, a análise de Bland-Altman pode ser
realizada com os dados resultantes. Se desejado,
intervalos de confiança mais estreitos no viés
calculado ou menos incerteza nos limites de
concordância podem ser obtidos complementando os
dados com mais amostras. As concentrações que
abrangem o intervalo de concentração selecionado
devem ser representadas aproximadamente
igualmente nas amostras usadas.
EXPERIÊNCIA NECESSÁRIA PARA
IMPLEMENTAR O PROTOCOLO
Em geral, a experiência necessária para implementar a
avaliação de desempenho do método de contagem de
células é o treinamento adequado por um usuário
experiente na operação dos sistemas de contagem de
células. Além disso, os usuários devem ser treinados na
preparação de amostras para garantir um desempenho
consistente das etapas de diluição, amostragem e
coloração do processo de contagem de células.
LIMITAÇÕES
A precisão é um dos parâmetros mais críticos para
a validação de um método analítico, no entanto,
não pode ser aplicada diretamente à maioria dos
métodos de contagem de células. Uma vez que
existem padrões de referência de células vivas
limitados, é um desafio avaliar a precisão de um
método de contagem de células. Portanto, a
proporcionalidade é um parâmetro alternativo
para avaliar a precisão em relação à fração de
diluição, que serve como controle interno, além de
utilizar métodos ortogonais para comparação.
Deve-se reconhecer que R2os valores calculados
em uma faixa de concentrações são fortemente
dependentes da faixa escolhida. Uma gama maior
de dados lineares resulta em um R2
valor mais próximo de 1. Se a comparação entre R2

valores devem ser tentados, é importante que o
intervalo para os dois cálculos seja o mesmo. Além
disso, deve-se notar que o índice de
proporcionalidade aqui definido não é normalizado
para o número de frações de diluição e o número
de réplicas biológicas por fração de diluição. É
necessário que o mesmo desenho experimental
seja usado sePIdeve ser significativamente
comparado entre os métodos.
MATERIAIS
Materiais de documentação
f ISO 20391-1:2018 Biotecnologia - Contagem de
Células - Parte 1: Orientação Geral sobre Métodos
de Contagem de Células
f ISO 20391-2:2019 Biotecnologia - Contagem de
Células - Parte 2: Projeto Experimental e Análise
Estatística para Quantificar o Desempenho do
Método de Contagem
Materiais biológicos
f Linha celular de ovário de hamster chinês (CHO-
S) (Gibco, nº 11619012)
f Jurkat, linha celular Clone E6-1 (ATCC,
TIB-152™)
Meio de crescimento e suplementos
f Meio CD CHO (1X) (Gibco, nº 10743011)
f GlutaMAX-1 (100X) (Gibco, nº 35050061)
f Suplemento HT (100X) (Gibco, nº 11067030)
f RPMI Medium 1640 (1X) (Gibco,
# 11875093)
f Soro Fetal Bovino (FBS) (Acesso,
# A19023)
f Solução Antibiótica Antimicótica (100X)
(Sigma-Aldrich, #A5955-100ML)
Reagentes de coloração fluorescente
Informações sobre Terapia Celular e Genética - ISSN: 2059-7800
PERCEPÇÃO INOVADORA
f Solução de coloração ViaStain™ AOPI (AOPI,
Nexcelom Bioscience, CS2-0106-5mL)
f Solução de coloração ViaStain™ AO (AO,
Nexcelom Bioscience, CS2-0108-5mL)
f ViaStain™ Total Cell Nuclear Green
(Nuclear Green, Nexcelom Bioscience,
CS1-V0008-1)
Outros reagentes e produtos químicos
f Pó de solução salina tamponada com fosfato
(PBS) (Sigma-Aldrich, nº P38135)
f Água HyClone™, grau de cultura celular (livre de
endotoxina) (GE Health, nº SH3052903)
Equipamento
f Capa de cultura de tecidos (Forma Scientific,
ClassII A/B3 BSC)
f Incubadora de cultura celular (Thermo, Forma 370)
f Balanceiro de placa (Boekel, RockerII 260350)
f Pipetador automático (Fisherbrand™ Pipet
Controller, #FB14955202)
f Pipetadores manuais (P10, P100, P1000)
(VWR, 1-10UL, 10-100UL, 100-1000UL)
f Centrífuga (Eppendorf, 2702)
f Espectro do celômetro e computador
portátil operacional (Spectrum, Nexcelom
Bioscience)
f Cellaca MX Contador de células automatizado
de alto rendimento e laptop operacional, faixa
de concentração de 1 x 105- 1 x 107células/mL
(Nexcelom Bioscience)
f Celigo Image Cytometer e computador de
mesa operacional (Nexcelom Bioscience)
Instrumentos descartáveis
f T-75 cm2frasco (USA Scientific, CC7682-48)
f Tubo de centrífuga de 15 mL (Greiner Bio,
188271)
943
TERAPIA CELULAR E GÊNICAPERCEPÇÕES
f Pipetas sorológicas 5 mL, 10 mL, 25 mL (USA
Scientific, nº 1075-0110, nº 1071-0810,
nº 1072-5410)
f Pontas de pipeta (P10 e P1000) (VWR,
7320561, 83007-380)
f Pontas de pipeta (P200) (USA Scientific,
11111210)
f Microtubos 1,5 mL (VWR, 89000028)
f Microtubos 0,5 mL (CellTreat, 229440)
f Lâminas de contagem de células (Nexcelom
Bioscience, CHT4-SD100-002)
f Cellaca MX Placas de contador de células
automatizadas de alto rendimento (placas Cellaca
MX, Nexcelom Bioscience, CHM24-A100-001)
CONFIGURAÇÃO DO REAGENTE
Solução salina tamponada com
fosfato (PBS)
Prepare a solução de PBS misturando 5 L de
H2O com 1 pacote de PBS em pó para gerar
uma solução de 0,01 M PBS a pH 7,4 com
NaCl a 0,138 M e KCl a 0,0027 M.
Meio de cultura de células CHO-S
Prepare o meio CHO-S (500 mL) com o
meio CD CHO (1X) e complemente com
5 mL do GlutaMAX-1 (100X) e 5 mL do
Suplemento HT (100X).
Meio de cultura de células Jurkat
Prepare o meio Jurkat (500 mL) com o
meio RPMI 1640 (1X) e complemente
com 10% FBS (50 mL) e 5 mL da solução
antibiótica antimicótica (100X).
Solução de coloração ViaStain™ AOPI
A solução de coloração de laranja de acridina
(AO) e iodeto de propídio (PI) já está preparada
944 DOI: 10.18609/cgti.2021.126
para a concentração correta antes da coloração em 1:1
com as células.
Solução de coloração ViaStain™ AO
A solução de coloração de laranja de acridina (AO)
já está preparada para a concentração correta
antes da coloração 1:1 com as células.
Solução de coloração ViaStain™ Total Cell
Nuclear Green
Prepare uma solução de coloração 2X (10 µM)
misturando PBS e a solução estoque Nuclear
Green a 5 mM. Pipete 10 mL de PBS em um
tubo de centrífuga de 15 mL e adicione 20 µL da
solução estoque Total Cell Nuclear Green. Feche
o tubo de centrífuga de 15 mL e inverta 10X
para misturar a solução de coloração antes de
usar.
CONFIGURAÇÃO DO EQUIPAMENTO
Espectro do celômetro
Conecte o Cellometer Spectrum ao laptop em
operação por meio do cabo USB e conecte o
cabo de alimentação. Ligue o instrumento na
parte de trás e, em seguida, abra o software
de análise Cellometer Spectrum. No software
Cellometer Spectrum, selecione o tipo de
ensaio padrão “AOPI Viability Assay_S5” para
contagem de células.
Contador de células automatizado de
alto rendimento Cellaca™ MX
Conecte o Cellaca MX ao computador laptop
operacional por meio do cabo USB e conecte
o cabo de alimentação. Ligue o instrumento
na parte de trás e abra o software de análise
Cellaca MX. No software Cellaca MX (v1.2),
selecione o tipo de ensaio padrão
“MX04.0_AOPI_LiveDead” para contagem de
células.

celigo®Imagem Citômetro
Ligue o Celigo na parte frontal e abra o software
de análise Celigo. Navegue para o canto
superior direito e clique em 'Administration' e,
em seguida, selecione 'Manage Plate Profiles'.
Depois que a janela “Plate Profile Management”
for aberta, clique no botão 'Import' e selecione
o perfil da placa para a placa Cellaca 12 × 2.
Retorne à tela inicial para aquisição e análise de
imagens.
PROCEDIMENTO
Manutenção de células CHO-S
Tempo: 20 – 30 min para passar as
células e medir sua concentração e
viabilidade.
1.Passe as células CHO-S quando estiverem entre 2
a 4 × 106células/mL. Permitir que as células
cresçam acima dessa concentração pode
diminuir a divisão celular, bem como diminuir a
viabilidade devido a nutrientes insuficientes no
meio.
2.Aqueça o meio de cultura de células CHO-S a
37 ° C por 15 min na incubadora ou em
banho-maria a 37 ° C por 5 min antes da
passagem.
3.Sob o gabinete de biossegurança, use uma pipeta de 10
mL, pipete para cima e para baixo pelo menos 10 vezes
para quebrar os aglomerados de células e criar uma
suspensão homogênea de células no frasco T-75.
4.Remova 200 µ l de células do frasco T-75 e transfira
para um microtubo de 1,5 mL antes que as células
tenham a chance de se estabelecer.
5.Obtenha uma lâmina de contagem de células CHT4-
SD100 e retire o filme plástico protetor na parte
superior e inferior e coloque a lâmina em um Kim-
Wipe.
6.Misture 20 µl de amostra de células CHO-S e 20 µl de
AOPI em um microtubo de 0,5 mL.
7.Pipete 20 µ l de amostra de células coradas em
uma câmara no slide de contagem de células.
Informações sobre Terapia Celular e Genética - ISSN: 2059-7800
PERCEPÇÃO INOVADORA
8.Insira a lâmina de contagem de células no
Spectrum e selecione “AOPI Viability
Assay_S5”.
9.Medir a concentração celular e
viabilidade.
10.Com base na concentração medida,
calcule a proporção de células para novos
meios necessários para atingir uma
concentração de 2 × 105células/mL.
11.Remova o volume celular calculado do frasco e
substitua por uma quantidade apropriada de
meio de cultura de células CHO-S aquecido.
12.Coloque o balão passado de volta no agitador de
placa dentro da incubadora de 8% de
2
CO a 37°C.
13.Monitore o crescimento das células diariamente e continue
a passagem conforme necessário (geralmente 3 vezes
por semana).
Manutenção de células Jurkat
Tempo: 20–30 min para passagem das células e
medição de sua concentração e viabilidade.
14.Passe pelas células Jurkat quando estiverem entre 1
a 2 × 106células/mL. Permitir que as células
cresçam acima dessa concentração pode diminuir
a divisão celular, bem como diminuir a viabilidade
devido a nutrientes insuficientes no meio.
15.Aqueça o meio de cultura de células Jurkat a
37 ° C por 15 min na incubadora ou em
banho-maria a 37 ° C por 5 min antes da
passagem.
16.Sob o gabinete de biossegurança, use uma pipeta de 10
mL, pipete para cima e para baixo pelo menos 10 vezes
para quebrar os aglomerados de células e criar uma
suspensão homogênea de células no frasco T-75.
17.Remova 200 µ l de células do frasco T-75 e transfira
para um microtubo de 1,5 mL antes que as células
tenham a chance de se estabelecer.
18.Obtenha uma lâmina de contagem de células CHT4-
SD100, retire o filme plástico protetor na
945
TERAPIA CELULAR E GÊNICAPERCEPÇÕES
superior e inferior e coloque o slide em um
Kim-Wipe.
19.Misture 20 µl de amostra de células Jurkat e 20 µl
de AOPI em um microtubo de 0,5 mL.
20.Pipete 20 µ l de amostra de células coradas em
uma câmara no slide de contagem de células.
21.Insira a lâmina de contagem de células no
Spectrum e selecione “AOPI Viability
Assay_S5”.
22.Medir a concentração celular e
viabilidade.
23.Com base na concentração medida,
calcule a proporção de células para novos
meios necessários para atingir uma
concentração de 2 × 105células/mL.
24.Remova o volume celular calculado do frasco e
substitua por uma quantidade apropriada de
meio de cultura de células Jurkat aquecido.
25.Coloque o balão passado de volta dentro da
incubadora
2
de 5% CO a 37 ° C.
26.Monitore o crescimento das células diariamente e continue
a passagem conforme necessário (geralmente 3 vezes
por semana).
Preparação de amostras de estoque de células a partir de
cultura de células
Tempo: 15 min para coletar as células dos frascos de
cultura de células, 5 min para contagem de células e
análise de viabilidade e 10 min para ajustar a
concentração da amostra de células, se necessário.
27.Colete um estoque de amostra de células CHO-S e
Jurkat separadamente em um tubo de 15 mL de
cultura de células seguindo técnicas assépticas.
28.Obtenha uma lâmina de contagem de células CHT4-
SD100, retire o filme plástico protetor na parte
superior e inferior e coloque a lâmina em um Kim-
Wipe.
29.Pipete 20 µ l da amostra de células usando um
pipetador P100 em um microtubo de 0,5 mL.
30.Pipetar 20 µL de AOPI e adicionar ao
microtubo de 0,5 mL.
946 DOI: 10.18609/cgti.2021.126
31.Aspire a mistura de células e AOPI para cima e
para baixo pelo menos 5 vezes.
32.Pipete 20 µ l das células coradas em uma
câmara no slide de contagem de células.
33.Insira a lâmina de contagem de células no
Spectrum e conte as células coradas para gerar
contagem de células e viabilidade.
34.Ajuste a concentração da amostra da célula de
estoque para ~ 5 × 106células/mL para células
CHO-S e Jurkat.
a.Diminua a concentração por diluição em
meio celular.
b.Aumente a concentração por
centrifugação e ressuspenda em
meio celular.
35.Repita as etapas 28–33 para garantir que a
concentração seja ajustada para ~5 × 106células/
mL.
Preparação de amostra e preparação de
contagem de células para avaliação e
comparação de desempenho de métodos de
contagem de células
Tempo: 15–30 min com uma única pipeta manual
para preparação da amostra. 15–20 min para
incubação de amostras de células misturadas com
Nuclear Green(Figura 1). ~10 min por placa Cellaca
MX com uma única pipeta manual para preparação
de contagem de células.
CRÍTICO:Sob a orientação da ISO Cell Counting
Parte 2, é necessário um experimento inicial de
validação da precisão do volume de pipetagem
usando os pipetadores experimentais para
aumentar a confiança na amostragem. Essa
validação pode ser realizada com uma balança de
laboratório sensível e bem calibrada e um fluido de
densidade conhecida, mas o procedimento não
será descrito neste protocolo. Dilua diretamente as
células para gerar amostras de diluição
independentes em vez de diluição em série para
reduzir a propagação de erros de pipetagem que
podem afetar a proporcionalidade.
36.Obtenha as amostras preparadas de
células CHO-S e células Jurkat no mais alto
 PERCEPÇÃO INOVADORA

fFIGURA 1
Preparação de amostras de células e diagrama do processo de medição.

Sequência do procedimento da esquerda para a direita:(1)Colete sua amostra de células-alvo e prepare diferentes concentrações com frações de diluição específicas
usando mídia celular.(2)Repita este processo para gerar 3 réplicas para cada fração de diluição.(3)Rotule cada tubo em ordem aleatória de 1 a 18.(4)Prepare e meça
cada tubo 4 vezes com cada método de contagem de células selecionado.(5)Analise as imagens com cada método de contagem de células para gerar resultados de
contagem de células.(6)Utilize os resultados da contagem de células para gerar o índice de proporcionalidade (PI), coeficiente de variação (CV) e coeficiente de
determinação (R2).

concentração para o uso pretendido e 41.Pipete 60 µl de amostra de célula estoque

faixa (~ 5 × 106células/mL).
37.Prepare outras amostras do estoque de amostras
de células CHO-S e Jurkat em 0,1, 0,3, 0,5, 0,7,
0,9 e 1,0 frações de diluição (DFs)
independentemente(Tabela 1).
a.Prepare amostras replicadas com PBS ou meio
de cultura celular.
38.Pipete 120 µl de amostra de células stock CHO-
S ou Jurkat para o 1º microtubo para a
CHO-S ou Jurkat no 4º microtubo e adicione
60 µl de PBS para a amostra de 0,5 DF.
42.Pipete 36 µl de amostra de célula estoque CHO-S
ou Jurkat no 5º microtubo e adicione 84 µl de
PBS para a amostra 0,3 DF.
43.Pipete 12 µl de amostra de célula estoque
CHO-S ou Jurkat no 6º microtubo e adicione
108 µl de PBS para a amostra 0,1 DF.
44.Repita as etapas 38–43 mais duas vezes para gerar

amostra 1.0 DF. um total de 3 amostras replicadas em cada DF,

onde um total de 18 tubos de amostras de
39.Pipete 108 µl de amostra de célula estoque CHO- células são gerados.
S ou Jurkat no segundo microtubo e adicione 12
45.Pipete 120 µl de solução de coloração AO no 1º
µl de PBS para a amostra 0,9 DF.
microtubo de cada amostra DF para fazer uma

40.Pipete 84 µl de amostra de células CHO-S ou amostra mista 1:1. Após esta etapa,

Jurkat no terceiro microtubo e adicione 36 µl de um total de 240 µL de amostra de células é

PBS para a amostra de 0,7 DF. preparado no 1º microtubo em cada DF.

fTABELA 1 46.Inverta o microtubo 0,1 DF 10 vezes para

garantir uma mistura uniforme.

Frações de diluição e preparação dos volumes
correspondentes para amostra de células e PBS. 47.Transfira 50 µl do microtubo misto de 0,1 DF

DF Volume celular (µL) Volume de PBS (µL)

para o poço de carregamento A1 na 1ª placa

1,0 120 0 Cellaca MX. Repita a transferência mais 3

0,9 108 12 vezes para os poços de carga A2 – A4 da 1ª
0,7 84 36 placa Cellaca MX.
0,5 60 60
48.Repita a Etapa 46–47 para os primeiros
0,3 36 84
microtubos dos DFs restantes (0,3, 0,5, 0,7, 0,9 e
0,1 12 108

Informações sobre Terapia Celular e Genética - ISSN: 2059-7800

947
TERAPIA CELULAR E GÊNICAPERCEPÇÕES

fMESA 2
Mapa da placa Cellaca para amostras de células em diferentes DFs.

Placa 1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0,1 0,1 0,1 0,1 0,3 0,3 0,3 0,3 0,5 0,5 0,5 0,5
B 0,7 0,7 0,7 0,7 0,9 0,9 0,9 0,9 1,0 1,0 1,0 1,0
Placa 2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0,1 0,1 0,1 0,1 0,3 0,3 0,3 0,3 0,5 0,5 0,5 0,5
B 0,7 0,7 0,7 0,7 0,9 0,9 0,9 0,9 1,0 1,0 1,0 1,0
Placa 3

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0,1 0,1 0,1 0,1 0,3 0,3 0,3 0,3 0,5 0,5 0,5 0,5
B 0,7 0,7 0,7 0,7 0,9 0,9 0,9 0,9 1,0 1,0 1,0 1,0

1.0) nos poços de carregamento restantes na
1ª placa Cellaca MX, seguindo o mapa da
placa mostrado abaixo. Após esta etapa, a 1ª
placa Cellaca MX é preparada(Mesa 2).
a.Randomize as Etapas 46–48, se aplicável. Isso é
Aquisição e análise de imagens para cada
método de contagem de células
Tempo: O escaneamento e a análise são de 6 minutos
por placa para o Cellaca MX e de 5 a 10 minutos por
placa para o Celigo.

sugerido pelo padrão ISO de contagem de 51.Carregue a 1ª placa Cellaca MX no

células, parte 2, a fim de minimizar os efeitos Cellaca MX após a preparação.

sistemáticos de dependência do tempo no 52.Selecione o tipo de ensaio padrão

índice de proporcionalidade e outras métricas “MX04.0_AOPI_LiveDead” para contagem de células no
da qualidade do processo de medição de software Cellaca MX para amostras de células coradas
contagem de células. com solução de coloração AO. Para amostras de

49.Repita os passos 45–48 para a 2ª e 3ª células coradas com Nuclear Green, aumente o tempo

amostras replicadas em diferentes DFs para de exposição FL1 em 50–100%. Verifique a

preparar as 2ª e 3ª placas Cellaca MX. intensidade fluorescente das células manchadas de

verde nuclear nas imagens de visualização antes da

a.Prepare cada placa Cellaca MX imediatamente
aquisição da imagem.
antes da aquisição da imagem, em vez de
preparar todas as placas Cellaca MX no início, 53.Use os parâmetros de análise padrão para

para minimizar o intervalo de tempo entre a contar células no campo claro Cellaca MX

preparação da amostra e a aquisição da capturado e imagens fluorescentes FL1.

imagem. Exporte os dados de concentração.

50.Repita as etapas 36–49 e tinga com 120 µL de 54.Transfira a 1ª placa Cellaca MX para o Celigo.

Nuclear Green. Selecione o perfil da placa para as placas Cellaca

MX. Use a configuração de experimento padrão

a.Incube as amostras de células coradas com verde
para aquisição e análise de imagens. Exporte as
nuclear por 15 a 20 minutos em temperatura
contagens totais de células das imagens de
ambiente. O tempo de incubação pode ser
fluorescência capturadas.
reduzido a 37 °C.
55.Repita 51–54 para a 2ª e 3ª placas Cellaca
MX.

948 DOI: 10.18609/cgti.2021.126

 PERCEPÇÃO INOVADORA

Avaliação de desempenho do método de 63.Repita 57–62 para calcular a concentração

contagem de células médiaM,o desvio Bk

padrão combinado da
concentração σ e o CV combinado
Bk
adquirido
Tempo: ~ 30 min para calcular e analisar os com o método B (Celigo) paraDF.
parâmetros para avaliação de desempenho para k

uma linha celular e uma mancha.

64.Use concentrações médias (M,M)deaitodasBi as
56.Calcule a concentração de células usando as amostras em 6 DFs diferentes para gerar uma série
contagens totais de células dos dados de concentração para Cellaca MX e Celigo. Realize
exportados da Celigo e multiplique por um um ajuste proporcional com a série de concentração
fator de 1383,979, que é a taxa de conversão para cada método usando o modelo de mínimos
baseada no volume contado e no fator de quadrados reponderados iterativamente (IRLS).
diluição da coloração com AO e Nuclear Green. Defina os pesos dos mínimos quadrados

57.Calcular a concentração médiaM adquirida proporcionais ao recíproco das variações, que

ai

com o método A (Cellaca MX) de um número podem ser estimadas por concentrações médias

total denreplicar medições para a amostra i sob a suposição de uma distribuição quase-Poisson
ai

usandoEquação 1. de que as variações das concentrações celulares são

proporcionais às suas respectivas concentrações

médias (var= φM),onde φ é um escalar estimado a

[1] , ondeMé Ar
o
partir dos dados experimentais que se anula
ai
concentração adquirida com o método A para
quando
ai
usado na ponderação de cada termo dos
amostraeudurante a medição replicadar.
mínimos quadrados[17]. Execute novamente o

58.Calcular a concentração médiaM adquirido ajuste do modelo atualizando os pesos usando

Ak

com o método A (Cellaca MX) para a fração de valores previstos das concentrações médias até que

diluição k (DF)usandoEquação 2. o ajuste proporcional seja otimizado. Gere uma lista

k
de valores previstos de concentrações médias (
[2]

59.Calcular a variância da concentraçãovar ai

) do IRLS
adquirida com o método A (Cellaca MX) de um
modelo.
número total denreplicar
ai
medições para a
amostra i usandoEquação 3. 65.Determine o coeficiente de determinação (R2
value) do modelo IRLS para o método A
[3] (Cellaca MX) usandoEquação 7[26,27]. Use o
mesmo método para determinar o R2
60.Calcular a variância combinada de
valor para o método B (Celigo).
concentraçãovaradquirida
AK
com o método A
(Cellaca MX) paraDFusandoEquação 4.
k [7]

[4]

61.Calcule o desvio padrão combinado da

concentração σ adquirida
Ak
com o método A
(Cellaca MX) paraDFusandoEquação
k
5.
66.Realize um ajuste com a série de concentração

para cada método (Cellaca MX, Celigo) usando

[5]
um modelo polinomial de ordem superior como
62.Calcular o CV agrupado,cvadquirida
Ak
com o um modelo flexível. Defina a ordem do
método A (Cellaca MX) paraDFusando
k
a polinômio como o número de DFs menos 1. Gere
equaçãoEquação 6. uma lista de valores previstos de concentrações

médias
[6]

Informações sobre Terapia Celular e Genética - ISSN: 2059-7800

949
TERAPIA CELULAR E GÊNICAPERCEPÇÕES

replicar r da amostra i usando o

( ) de
Equação 10.
modelo polinomial.

67.Determine o índice de proporcionalidade (PI) [10] , onde X éir o

com base na soma suavizada de resíduos média amostral dada por
escalonados absolutos
A
(PISAbsSRA, PISAbsSR) para
Cellaca MX e Celigo usandoEquação 8 após
71.Calcule o viés do método A para o método B (Viés
publicação anterior[17,18],
)calculando a média
AB
Yvalores usandoEquação
eu
11

[8] ou calculando a médiaY valores usandoEquação

ir

12

[11] , onde N é o
68.Aplique o método de Bland-Altman para número de amostras (para amostras pareadas,
comparar o desempenho entre dois métodos réplicas não pareadas, ou seja, para cada
de contagem de células. amostra, diferentes réplicas são medidas com

cada método).
69.Utilizamos um aplicativo de software
desenvolvido internamente derivado do
[12] , onde N é o
padrão de contagem de células ISO Parte 2 e
número total de medições repetidas (para amostras
método comparativo de Bland-Altman para
emparelhadas com réplicas emparelhadas, ou seja,
calcular automaticamente o coeficiente de
para cada amostra, as mesmas réplicas são medidas
determinação, precisão, parâmetros do índice
usando ambos os métodos).
de proporcionalidade, bem como os
parâmetros de análise de Bland-Altman (bias, 72.Calcule o LoA multiplicando 1,96 pela média das
LoA, o IC do viés). diferenças percentuais determinadas na etapa
70 usandoEquação 13ou 14.LoA é definido como
o intervalo de confiança unilateral de 95% para
Método comparativo de Bland-Altman: uma única amostra.
cálculo de dados
[13]
Tempo: ~ 30 min para analisar e plotar os dados de
comparação Bland-Altman para uma linha celular e
uma mancha.

70.Calcule a diferença percentualY entre a onde N é o número de amostras (amostras

eu

mediçãoMadquirido com o método Aea pareadas, réplicas não pareadas).

ai

mediçãoM adquirido com o método B Bi

para cada amostra i usando oEquação 9, [14]

somente se as amostras forem pareadas
entre os métodos A e B.

[9] , ondexé a
eu
amostra onde N é o número total de medições
média dada por replicadas (amostras pareadas, replicações
não pareadas).
a.Se as mediçõesMeMda
Ar
replicação
Bir
r
são pareados, calcule a diferença 73.Calcule o IC do viés usandoEquação 15.
percentualYentre a medição
ir
M
adquirido com oaimétodo
r
Aea
mediçãoM adquirida com o [15] , onde N é o número
Bir

método B para cada de amostras (para amostras pareadas sem

réplicas pareadas) ou o número total de

950 DOI: 10.18609/cgti.2021.126


medições replicadas (se ambas as amostras
e réplicas forem pareadas).
Método comparativo de Bland-
Altman: representação gráfica
74.Plote um único ponto no diagrama de Bland-
Altman para cada amostra, comx(média
eu
amostral) no eixo horizontal eY(diferença
eu
percentual) no eixo vertical.
75.Trace uma linha horizontal que cruza o eixo
vertical no valor deViéscalculado AB
na etapa 71.
76.Trace duas linhas horizontais adicionais que
cruzam o eixo vertical nos valores de
ViésAB + LOAeViés–LOA , onde o
AB
LoA é calculado conforme descrito na etapa 72.
Essas linhas definem uma faixa de valores para a
diferença percentual esperada entre os dois
métodos para uma única amostra.
77.Plote duas linhas horizontais adicionais nos
valoresViés+
AB
IC Viés
eViés–ICAB
.Esse
O intervalo fornece uma noção da incerteza
no próprio valor de viés.
78.Examine o gráfico e observe qualquer
dependência de concentração no viés ou na
variação.
SOLUÇÃO DE PROBLEMAS
Siga a solução de problemasTabela 3para
otimizar os experimentos e resultados.
TEMPO
1.Etapa 1–26, manutenção de células CHO-S e Jurkat:
20–30 min para passagem das células e medição
de sua concentração e viabilidade por linha
celular.
2.Etapas 27–35, preparação de amostras de estoque de células a
partir da cultura de células: 15 min para coletar as células
dos frascos de cultura de células, 5 min para contagem de
células e análise de viabilidade e 10 min
Informações sobre Terapia Celular e Genética - ISSN: 2059-7800
PERCEPÇÃO INOVADORA
para ajustar a concentração da amostra de células, se
necessário.
3.Etapas 36–50, preparação de amostra e preparação de
contagem de células para avaliação e comparação de
desempenho de métodos de contagem de células:
15–30 min com uma única pipeta manual para
preparação de amostra, 15–20 min para incubação
de amostras de células misturadas com Nuclear
Green e ~ 10 min por placa Cellaca MX para
preparação de contagem de células.
4.Etapa 51–55, aquisição e análise de imagens: 6
min por placa para o Cellaca MX e 5–10 min
por placa para o Celigo.
5.Etapa 56–78, avaliação de desempenho e análise de
comparação Bland-Altman: 1 h por linha celular
por solução de coloração.
RESULTADOS ANTECIPADOS &
DISCUSSÃO
Viés Duas linhagens de células (CHO-S, Jurkat), dois
corantes (AO, Nuclear Green) e 2 métodos de
contagem de células foram avaliados para demonstrar
a aplicação da avaliação de desempenho do método
de contagem de células e análise comparativa de
Bland-Altman.Figura 2mostra o CV médio e agrupado,
respectivamente, da série de concentração de 6
pontos de células Jurkat coradas com AO usando
ambos os sistemas de contagem de células.Tabela 4
mostra os resultados numéricos para o CV médio e
agrupado. A faixa de concentração medida no
experimento foi ~ 5 × 105
para ~6 × 106células/mL. Tanto o Cellaca MX quanto o
Celigo têm CVs agrupados variando de 1,8 a 7,6% para
todas as réplicas por concentração. Com base nas
medições emTabela 4, o coeficiente de
determinação e o índice de proporcionalidade podem
ser calculados via análise de regressão.Figura 3mostra
os ajustes proporcionais da série de concentração de 6
pontos em função das frações de diluição para Cellaca
MX e Celigo. Os resultados para cada parâmetro são
mostrados emFigura 4eTabela 5. Tanto o Cellaca MX
como o Celigo apresentam valores comparáveis de
coeficiente de determinação (R2valores)
951
TERAPIA CELULAR E GÊNICAPERCEPÇÕES

fTABELA 3
Tabela de solução de problemas.

Etapa Problema Razao possivel Solução

62, 63 CV é muito grande em Amostragem ou pipetagem fMisture e pipete adequadamente as amostras seguindo a célula ISO
um ou alguns DFs erro padrão de contagem
Erros de contagem devido a f Ajuste os parâmetros de contagem
aglomerados
f Remova os outliers se forem observados erros graves de contagem
67 Baixa Proporcionalidade Propagação de erro de f Diluir diretamente para gerar amostras de diluição independentes
pipetagem em vez de diluição em série para eliminar a propagação do erro de
pipetagem
68, Um grande viés Variação da amostra (ou seja, f Use o mesmo estoque de amostras de células para ambos os métodos de contagem de
70–78 entre duas células diferentes estoques de amostras) células
métodos de contagem
f Se possível, use a mesma amostra de células no mesmo consumível
para conduzir a comparação de contagem de células

fTeste a estabilidade da amostra de células para concentração

Alteração da condição da amostra (por
exemplo, fotobranqueamento,
secagem da amostra)
e viabilidade durante o ensaio. Se uma tendência for
observada, os resultados podem ser inválidos
fPraticar avaliação de desempenho de contagem de células e
experimentos de comparação
f Use predefinições no software

f Conclua as aquisições de imagens em um curto período de tempo

Análise de contagem de células fAjuste os parâmetros de imagem e contagem no

variação ysis (ex. software para garantir que as células sejam contadas corretamente
desagregação)
Comparação de instrumentos f Certifique-se de que os instrumentos exatos sejam comparados em
experimentos repetidos

Calibração do instrumento fCertifique-se de que ambos os instrumentos estejam bem calibrados e os dados
os parâmetros de aquisição e análise são otimizados antes do
uso.

e índices de proporcionalidade (PIs) dos ajustes inferior ao Cellaca MX nesta comparação do

proporcionais nesta avaliação do método de
contagem de células. Não são observadas
diferenças significativas entre Cellaca MX e
Celigo para ambos R2ePIvalores.
Em seguida, o método de Bland-Altman é
aplicado para comparar o desempenho entre os
métodos de contagem de células Cellaca MX e
Celigo.Figura 5mostra um gráfico Bland-Altman
representativo entre Cellaca MX e Celigo. Neste
gráfico, uma porcentagem positiva indica uma
concentração mais alta para medições de Celigo.
Cada ponto no gráfico representa um par de
medições determinadas por ambos os métodos
método de contagem de células. Como o valor
de 0 está fora do intervalo de confiança do viés,
conclui-se que a diferença de concentração
observada entre esses dois métodos de
contagem de células é significativa (p < 0,05),
apesar de relativamente pequena. O viés exibe
uma ligeira dependência da concentração de
células neste caso. Espera-se que uma medição
pareada adicional feita usando dois métodos
nas mesmas condições caia dentro do intervalo
definido pelos LoA em aproximadamente 95%
dos casos.
Um resumo da avaliação do desempenho de contagem

de contagem de células. Os resultados do viés de células e resultados de comparação entre Cellaca MX e

de concentração, intervalo de confiança de 95% Celigo usando diferentes combinações de linhagens de

e desvio padrão do viés entre Cellaca MX e células alvo e soluções de coloração é mostrado emTabela

Celigo são mostrados emTabela 6. Um viés de ~ 7. Os vieses de concentração são -2–6% para os métodos

-1,5% (n = 72 medições replicadas) indica que a de contagem de células pareadas nessas quatro contagens

concentração medida pelo Celigo é de ~1,5% de células

952 DOI: 10.18609/cgti.2021.126

 PERCEPÇÃO INOVADORA

fFIGURA 2
Resultados da contagem de células para (a) concentrações médias e (b) CV agrupado de séries de concentração de 6 pontos de células Jurkat coradas com AO.

As concentrações médias e os valores de CV medidos por Cellaca MX e Celigo foram altamente comparáveis em cada fração de diluição. É claro que, à medida que a concentração
diminui, o CV combinado aumenta, provavelmente devido ao ruído de Poisson (erro aleatório) em concentrações mais baixas.

métodos. Como cada combinação de mancha
de célula foi tratada independentemente, os
resultados não foram combinados e a taxa de
descoberta falsa (FDR) ou a taxa de erro familiar
(FWER) não foram calculadas. No geral,
realizamos vários experimentos práticos
seguindo o Padrão ISO de Contagem de Células
Parte 2 com Celigo e Cellaca MX, e os resultados
apresentados aqui estão na faixa esperada da
qualidade da medição de contagem de células.
O Padrão de Contagem de Células ISO Parte 2
permite que pesquisadores de terapia genética e
celular conduzam experimentos para avaliar e
comparar a qualidade dos processos de medição
de contagem de células. Nesta aplicação prática da
norma, demonstramos a avaliação

fTABELA 4
Concentração média calculada e CV agrupado para cada fração de diluição usando o Padrão de
Contagem de Células ISO Parte 2.

Contagem de células DF n Média (células/mL) CV agrupado (%)

método
Cellaca MX 0,1 12 5.37E+05 7.5
0,3 12 1.78E+06 4.2
0,5 12 2.88E+06 3.3
0,7 12 3.93E+06 2.2
0,9 12 5.05E+06 3.8
1,0 12 5.74E+06 2.3
celigo 0,1 12 5.21E+05 7.6
0,3 12 1.71E+06 3.9
0,5 12 2.80E+06 3.6
0,7 12 3.91E+06 2.7
0,9 12 5.06E+06 3.6
1,0 12 5.80E+06 1.8

Informações sobre Terapia Celular e Genética - ISSN: 2059-7800

953
TERAPIA CELULAR E GÊNICAPERCEPÇÕES

fFIGURA 3
Ajuste de regressão linear da série de concentração de 6 pontos em função das frações de diluição
(DFs), que mostra a distribuição das medições de concentração para Cellaca MX e Celigo em cada
fração de diluição.

da Cellaca MX e Celigo usando células
Jurkat e CHO adaptadas às comunidades
de bioprocessamento e terapia celular.
Os usuários do Padrão ISO de Contagem
de Células Parte 2 podem utilizar o
protocolo para avaliar um ou mais
métodos de contagem de células. Para a
avaliação de um método, pode-se
realizar experimentos para estabelecer
uma linha de base para cada um dos
parâmetros de qualidade, onde esta
linha de base pode ser monitorada
posteriormente com diferentes
operadores, instrumentos, processos,
etc. Para comparação de métodos de
contagem de células, os parâmetros de
qualidade podem ser comparados por
meio de análise bootstrap ou estudos
replicados, e a diferença ou viés entre os
métodos pode ser determinada usando a
análise comparativa de Bland-Altman.
também devem ser avaliados para estender os
resultados do estudo a processos de medição
semelhantes.
PERGUNTAS FREQUENTES
1. Podemos reduzir o número de
amostras e medições replicadas?
a.Sim, até certo ponto; o desenho
experimental mínimo recomendado
consiste em pelo menos 4 frações de
diluição alvo, 3 amostras replicadas e
3 medições replicadas.
b.Indicadores de qualidade de projetos
experimentais que não atendem a esses
recomendações devem ser interpretadas
com cautela e podem exigir
estudos adicionais para avaliar adequadamente a
proporcionalidade e precisão.

954 DOI: 10.18609/cgti.2021.126

 PERCEPÇÃO INOVADORA

fFIGURA 4
Comparação do R2ePIvalores entre Cellaca MX e Celigo. o R2ePIos valores são altamente
comparáveis.

c.Por exemplo, se um projeto experimental a.Deve ser adequado para a faixa típica de
tiver apenas 2 medições replicadas, a concentrações de células que você
avaliação do CV diretamente desse projeto pretende avaliar para o seu tipo de célula.
experimental e a análise estatística podem
3.Devemos verificar os pipetadores?
não ser apropriadas,
no entanto, a avaliação da proporcionalidade a.Sempre use pipetas calibradas

ainda pode ser realizada. profissionalmente

eu.Nesse caso, um segundo experimento b.Realizar uma verificação nos pipetadores

com medições mais replicadas de menos aumentará a confiança nos resultados

amostras e/ou menos frações de diluição c.A ISO 20391-2 também sugere uma
pode ser conduzido para abordar mais abordagem para gerar diluição medida
diretamente a precisão do método. frações, onde a massa de solução pipetada
durante a geração das frações é usada para

2.Qual é a faixa de concentração celular que calcular um valor de fração de diluição

devemos usar? medido mais preciso para uso na análise de

R2ePI. Nesse caso, pequenos erros na
fTABELA 5 pipetagem podem ser contabilizados no
R-quadrado calculado ePIvalores para avaliação de
ajuste do modelo proporcional.
desempenho.

R-Quadrado PI 4.O que os resultados podem nos dizer?

Cellaca MX 0,997 0,44
celigo 0,997 0,42 a.Os indicadores de qualidade fornecem um meio

Significado Não Não para quantificar e comparar a qualidade

Informações sobre Terapia Celular e Genética - ISSN: 2059-7800

955
TERAPIA CELULAR E GÊNICAPERCEPÇÕES

fFIGURA 5
Gráfico de Bland-Altman entre os métodos de contagem de células Cellaca MX e Celigo.

As diferenças percentuais calculadas mostram uma tendência crescente à medida que a concentração aumenta.

fTABELA 6
Resultados da análise comparativa de Bland-Altman entre Cellaca MX e Celigo.

Viés Limite de acordo CI de viés

- 1,5% - 6,9% a 3,9% - 2,1% a -0,8%

fTABELA 7
Tabela de resumo da avaliação de desempenho de contagem de células e resultados de comparação.

Célula Coloração Cellaca MX celigo Viés LOA 95% signif-

linha solução R2 agrupados PI R2 agrupados PI IC de ICÂNCIA

cv cv viés de preconceito

faixa faixa
(%) (%)
Jurkat Nuclear 0,998 3,8% para 0,30 0,997 3,7% para 0,37 3,4% - 6,0% 2,3% Y
verde 6,1% 7,4% para para
12,8% 4,5%
Jurkat AO 0,997 2,2% para 0,44 0,997 1,8% para 0,42 - 1,5% - 6,9% - 2,1% Y
7,5% 7,6% para 3,9% para
- 0,8%
CHO Nuclear 0,998 3,4% para 0,40 0,999 2,7% para 0,35 5,6% - 3,4% 4,5% Y
verde 5,8% 6,8% para para
14,6% 6,7%
CHO AO 0,998 2,7% para 0,44 0,996 2,7% para 0,35 5,1% - 2,4% 4,2% Y
7,0% 6,4% para para
12,5% 5,9%

956 DOI: 10.18609/cgti.2021.126

 PERCEPÇÃO INOVADORA

de métodos de contagem de células baseados c.A análise comparativa de Bland-Altman

em princípios fundamentais para a contagem: indicará a diferença percentual entre
precisão e proporcionalidade os 2 métodos.

b.A análise da Parte 2 do Padrão de Contagem d.Essas abordagens não indicam ou

ISO não faz suposições sobre a verdadeira comparam a precisão dos métodos de
contagem de células e pode tirar conclusões contagem de células.
sobre a qualidade do método na ausência de
e.A seleção do método de contagem de células
um material de referência ou método de
deve ser feita com base na qualidade do
referência.
método e no que é adequado para suas
necessidades de medição.

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958
AFILIAÇÕES Divisão, Laboratório de Medição de
Materiais, Instituto Nacional de
Yongyang Huang
Padrões e Tecnologia, Gaithersburg,
Departamento de Pesquisa e Desenvolvimento
MD, EUA
de Tecnologia Avançada, Nexcelom Bioscience
LLC, Lawrence, MA, EUA David Newton
Divisão de Engenharia Estatística,
Jordan Bell
Laboratório de Tecnologia da
Departamento de Pesquisa e Desenvolvimento
Informação, Instituto Nacional de
de Tecnologia Avançada, Nexcelom Bioscience
Padrões e Tecnologia, Boulder, CO, EUA
LLC, Lawrence, MA, EUA
Jean Qiu
Dmitry Kuksin
Departamento de Pesquisa e Desenvolvimento
Departamento de Pesquisa e Desenvolvimento
de Tecnologia Avançada, Nexcelom Bioscience
de Tecnologia Avançada, Nexcelom Bioscience
LLC, Lawrence, MA, EUA
LLC, Lawrence, MA, EUA
Leo Li-Ying Chan
Sumona Sarkar
Autor para correspondência: Departamento de
Divisão de Biossistemas e
Pesquisa e Desenvolvimento de Tecnologia
Biomateriais, Laboratório de Medição
Avançada, Nexcelom Bioscience LLC, Lawrence,
de Materiais, Instituto Nacional de
MA, EUA
Padrões e Tecnologia, Gaithersburg,
lchan@nexcelom.com
MD, EUA
Laura T Pierce
Biossistemas e Biomateriais
DOI: 10.18609/cgti.2021.126
 PERCEPÇÃO INOVADORA

AUTORIA E CONFLITO DE INTERESSES

Contribuições:Leo Li-Ying Chan e Jean Qiu conceberam o estudo e o projeto experimental. Dmitry Kuksin realizou a cultura celular e forneceu as
células Jurkat e CHO-S para a experimentação. Jordan Bell e Yongyang Huang desenvolveram um aplicativo de software para os parâmetros da Parte
II dos Padrões de Contagem de Células ISO e o método de análise Bland-Altman. Yongyang Huang conduziu experimentos de comparação e avaliação
de desempenho do método de contagem de células. Sumona Sarkar e Laura T Pierce contribuíram para o desenvolvimento da padronização da
contagem de células, da qual este protocolo foi derivado. David Newton contribuiu para o desenvolvimento e descrição da análise estatística. Leo Li-
Ying Chan, Yongyang Huang, Jordan Bell, Sumona Sarkar e Laura T Pierce escreveram o manuscrito.

Reconhecimentos:Os autores gostariam de agradecer a Pauline N. Mitchell por fornecer a obra de arte do diagrama do processo de medição e
preparação de amostras Cell.

Divulgação e potenciais conflitos de interesse:Yongyang Huang, Jordan Bell, Dmitry Kuksin, Jean Qiu e Leo Li-Ying Chan declaram interesses
conflitantes. A aplicação da avaliação e comparação do desempenho do método de contagem de células empregou sistemas de contagem de células
e reagentes da Nexcelom Bioscience LLC.

Isenção de responsabilidade de direitos autorais do NIST:Contribuição oficial do Instituto Nacional de Normalização e Tecnologia; não está sujeito a direitos autorais nos

Estados Unidos.

Isenção de responsabilidade do produto comercial do NIST:Certos equipamentos, instrumentos ou materiais comerciais são identificados neste
trabalho para especificar o procedimento experimental adequadamente. Tal identificação não pretende implicar recomendação ou endosso pelo
Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia, nem pretende implicar que os materiais ou equipamentos identificados sejam necessariamente os
melhores disponíveis para o efeito.

Declaração de financiamento:Os autores não receberam nenhum apoio financeiro para a pesquisa, autoria e/ou publicação deste artigo.

ARTIGO E INFORMAÇÕES DE DIREITOS AUTORAIS

Direito autoral:Publicado por Cell and Gene Therapy Insights sob Creative Commons License Deed CC BY NC ND 4.0, que permite a qualquer pessoa
copiar, distribuir e transmitir o artigo, desde que devidamente atribuído da maneira especificada abaixo. Sem uso comercial sem permissão.

Atribuição:Copyright © 2021 Nexcelom Bioscience. Publicado por Cell and Gene Therapy Insights sob Creative Commons License Deed CC
BY NC ND 4.0.

Fonte do artigo:Convidamos; revisado externamente por pares.

Enviado para revisão por pares:2 de julho de 2021;Manuscrito revisado recebido:19 de agosto de 2021;Data de publicação:15 de setembro de 2021.

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