Avaliação da fracção fenólica de águas ruças e bagaços de

azeitona por métodos químicos, cromatográficos e

espectroscópicos - Identificação da actividade antifúngica em
extractos obtidos com acetato de etilo

Relatório de Estágio
Licenciatura em Bioquímica

Ricardo Micael de Oliveira Cardoso

Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro

Vila Real, 2014

Orientador de Estágio

_____________________________________________________

José Manuel Marques Martins de Almeida

Departamento de Física (DF), UTAD

Co-Orientador de Estágio

_____________________________________________________

Carla Maria Alves Quintelas do Amaral Marinho

Departamento de Biologia e Ambiente (DeBA), UTAD

Director de Curso

_____________________________________________________

Carla Maria Alves Quintelas do Amaral Marinho

Departamento de Biologia e Ambiente (DeBA), UTAD

“O sucesso é ir de fracasso em fracasso
sem perder o entusiasmo”

Winston Churchill
Agradecimentos
O espaço limitado desta secção de agradecimentos não me permite agradecer, como
devia, a todas as pessoas que, ao longo deste semestre me ajudaram directa ou indirectamente,
a cumprir os meus objectivos e que contribuíram para a realização deste estágio. Desta forma,
deixo apenas algumas palavras, poucas, mas com um sentido e profundo sentimento de
agradecimento, porque sem eles nada teria sido possível.

Ao Professor Doutor José Manuel Almeida, orientador deste estágio, agradeço toda a
disponibilidade e empenho que sempre revelou para comigo, pela amabilidade e boa
disposição, pelos ensinamentos que me proporcionou e que me permitiram evoluir
cientificamente. Obrigado pela paciência e apoio demonstrados ao longo desta caminhada.

À Professora Doutora Carla Amaral, co-orientadora deste estágio e directora de curso,

agradeço-lhe por tudo. Sem a sua ajuda nada disto seria possível. Obrigado pela boa
disposição que sempre demonstrou, pelo tempo que despendeu ao longo do trabalho, por me
ter animado quando mais era preciso e principalmente, por todos os conhecimentos que
partilhou e que me fizeram acreditar, em certa medida, que estou no curso certo. Ficar-lhe-ei
eternamente grata por esta oportunidade. E não queria acabar sem lhe pedir desculpa pelas
imensas e repetitivas perguntas chatas que lhe estou sempre a fazer.

À minha querida amiga Patrícia, colega de laboratório, quero agradecer,

profundamente, por todos estes meses que passámos juntos no laboratório e pela tua amizade,
boa disposição e apoio que me fizeram continuar todos os dias, após muitas horas, dias, noites
e fins-de-semana de trabalho. Sem ti, não era de todo possível. Muito obrigado por tudo!

À Dona Cesaltina, agradeço, essencialmente, pela paciência que teve para me aturar
durante estes meses e pela boa disposição constante demonstrada. Sem a tua ajuda, as tuas
dicas, este trabalho seria muito mais difícil de realizar. Muito obrigado!

Ao Sr. Luís Fernando, agradeço-lhe, acima de tudo, a tua boa disposição, e pela tua
importante ajuda neste trabalho.

Aos meus amigos, Rafa, Carina, Daniela, Vera, que me acompanharam mais de perto
neste trabalho, agradeço por me encorajarem e me apoiarem sempre. A vossa amizade e os
vossos conselhos foram uma mais-valia para que esta etapa tivesse corrido da melhor
maneira.

i
 A todos os amigos que conheci, em Vila Real, e aos que já eram antes de vir cá, um
muito obrigado pela vossa amizade. Os meus dias são muito melhores, por saber que posso
contar com pessoas como vós. Muito do que sou hoje, deve-se a vós. Muito obrigado!

À minha família, Pai, Mãe, irmãos, primos, tios e avós, muito obrigado por sempre
acreditarem em mim. Sei que nem sempre mostrei a minha gratidão para convosco, mas quero
que saibam que vos estou eternamente grato e que agradeço do fundo do coração por me
terem permitido continuar estudar, mesmo depois de as coisas não me terem corrido bem nos
primeiros anos. Sois a minha vida!

ii
Índice de Figuras
Figura 1 - Compostos fenólicos: A-Oleuropeína; B-Hidroxitirosol; C-Tirosol. ....................... 8
Figura 2 - Gráfico de observações da análise em componentes principais (PCA) para os
parâmetros químicos analisados nas diferentes réplicas dos locais de amostragem. ............... 20
Figura 3 - Gráfico de observações da análise discriminante linear (LDA) para aos parâmetros
químicos analisados nas diferentes réplicas dos locais de amostragem ................................... 22
Figura 4 – Dendrograma aplicado aos parâmetros químicos. ................................................. 23
Figura 5 – Espectros obtidos por FTIR de cada réplica (média das repetições) dos diferentes
locais de amostragem. .............................................................................................................. 24
Figura 6 - Gráfico de observações da análise em componentes principais (PCA) para os
dados obtidos por FTIR nas diferentes réplicas dos locais de amostragem.Erro! Marcador
não definido.
Figura 7 - Gráfico: Comunalidade versus Números de Onda (cm-1) ...................................... 27
Figura 8 - Gráfico com os valores previstos pelo método PLS-R e os valores medidos para
polifenóis totais. ....................................................................................................................... 28
Figura 9 - Perfis cromatográficos dos extractos fenólicos de águas ruças a 280 nm de duas
réplicas: 1-Hidroxitirosol; 2-Tirosol; 3-Ácido Ferúlico; 4-Ácido m-cumárico e 5-Oleuropeína
para Tabuaço 2; 6-Hidroxitirosol; 7-Tirosol; 8-Ácido Tânico e 9-Oleuropeína para Mirabaga
2. ............................................................................................................................................... 29
Figura 10 - Gráfico de observações da análise em componentes principais (PCA) para os
dados de HPLC nas diferentes réplicas dos locais de amostragem. ......................................... 33
Figura 11 – Relação entre os picos de HPLC e a sua variabilidade. ....................................... 34
Figura 12 - Caixas de Petri com culturas puras de Candida albicans, Candida parapsilosis e
Candida oleophila, respectivamente, usadas no teste de difusão em disco. ............................ 36

iii
Índice de Tabelas
Tabela 1 - Valores para produção, consumo e exportação de azeite em Portugal entre 2002 a
2012 (1 000 toneladas) (Fonte: http://www.internationaloliveoil.org/estaticos/view/131-
world-olive-oil-figures) .............................................................................................................. 2
Tabela 2 – Padrões interpretativos do diâmetro de inibição versus MIC (Concentração
Mínima de Inibição) correspondentes para Candidas pp. ao Fluconazole 25 µg/disco ........... 16
Tabela 3 - Resultado dos parâmetros químicos das amostras analisadas. ............................... 18
Tabela 4 – Matriz de coeficientes de correlação de Pearson para os parâmetros químicos. ... 20
Tabela 5 – Matriz de confusão para as amostras de calibração e para validação cruzada com
base nos parâmetros químicos. Classificações observadas nas linhas, e classificações previstas
nas colunas. .............................................................................................................................. 22
Tabela 6 – Desempenho de qualidade do modelo PLS-R para polifenóis totais. ................... 28
Tabela 7 – Percentagem (%) de área relativa de cada pico para todas as réplicas. ................. 31
Tabela 8 – Contribuições das variáveis (%) de F1 e F2 para cada pico. ................................. 34

iv
Lista de abreviaturas
AHC – do inglês Agglomerative Hierarchical Chusters, clusters hierárquicos aglomerativos;
CQO – Carência Química de Oxigénio;
FTIR – do inglês Fourier Transform Infrared spectroscopy, Espectroscopia de Infravermelhos
com Transformada de Fourier;
FTIR-ATR – do inglês Fourier Transform Infrared spectroscopy –Attenuated Total
Reflectance, Espectroscopia de Infravermelhos com Transformada de Fourier e com reflecção
total atenuada;
HPLC – do inglês High-Permormance Liquid Chromatography, Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência;
HPLC-MS-MS – do inglês High-Permormance Liquid Chromatography with tandem Mass
Spectrometry, Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Espectroscopia de Massa;
KMO – do inglês Kaiser-Meyer-Olkin measure, valor de Kaiser-Meyer-Olkin;
LDA – do inglês Linear Discriminant Analysis, Análise Discriminante Linear;
LDL – do inglês Low Density Lipoprotein, lipoproteína de baixa densidade;
LOOCV – do inglês Leave-One-Out Cross Validation, Validação cruzada leave-one-out;
MIC – do inglês Minimal Inhibitory Concentrtion, Concentração Mínima Inibitória;
OMWW – do inglês Olive Mil Wastewaters, águas ruças;
PCA – do inglês Principal Components Analisys, Análise em Componentes Principais;
PLS-R – do inglês Partial Least Squares Regression, Regressão por Mínimos Quadrados
Parciais;
R2 – Coeficiente de regressão;
RMSEC – do inglês Root Mean Square Error of Calibration, Erro Médio Quadrático de
Calibração;
RMSECV – do inglês Root Mean Square Error of Cross-Validation, Erro Médio Quadrático
de Validação Cruzada.
RP-HPLC – do inglês Reverse-Phase - High Performance Liquid Chromatography,
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência de Fase Reversa.

v
Resumo
Nas últimas décadas, a indústria olivícola tem sofrido um desenvolvimento
considerável, devido ao aumento da produção e do consumo de azeite. Esta gordura vegetal,
típica da dieta mediterrânica, está associada à diminuição do risco de incidência de doenças
cardiovasculares e de cancro. Estes efeitos têm sido atribuídos aos elevados teores em
compostos fenólicos existentes na azeitona. Durante o processo de extracção do azeite, apenas
1 a 2% desses compostos ficam retidos no azeite, ficando os restantes 98 a 99% retidos nos
subprodutos. Os subprodutos, como as águas ruças e os bagaços, poderão ser uma fonte
valiosa para a extracção de compostos bioactivos com potencial utilização nas indústrias
farmacêuticas, cosmética ou para aditivos alimentares.

Neste trabalho, recolheram-se amostras representativas de lagares de extracção de

azeite de duas e três fases localizados na região transmontana. Os lagares de três fases estão
localizados em Tabuaço e Lamego (Alvelos), e os de duas fases estão localizados na zona
quente transmontana, nomeadamente em Murça (CAOM), Mirandela (Mirabaga) e Valpaços
(Aucama). A partir dos seus efluentes fez-se uma extracção líquido/líquido com acetato de
etilo a fim de obter as fracções fenólicas que foram avaliadas relativamente a parâmetros
químicos como polifenóis totais, orto-difenóis e flavonóides, espectrofotometria de IR e
composição em ácidos fenólicos por HPLC-RP.

A quimiometria aliada à espectroscopia de infravermelho, nomeadamente o uso da

técnica de espectroscopia de infravermelhos com transformada de Fourier (FTIR) permitiu
distinguir os efluentes que resultaram de processos de centrifugação de duas ou três fases. A
caracterização química demonstrou que o teor em polifenóis totais e orto-difenóis são os que
melhor distinguem a origem das amostras.

O uso da cromatografia líquida de alta eficiência permitiu identificar compostos

bioactivos presentes nas águas ruças. Neste trabalho, o hidroxitirosol, o tirosol e a oleuropeína
foram os compostos fenólicos mais encontrados nos extractos obtidos através de acetato de
etilo. Foi também possível distinguir os extractos provenientes de lagares de duas e três fases,
recorrendo à análise em componentes principais.

Os mesmos extractos fenólicos não apresentaram qualquer actividade antifúngica para

Candida albicans, Candida parapsilosis e Candida oleophila.

vi
 Este trabalho permitiu concluir que os métodos seleccionados caracterizam de forma
fidedigna as amostras analisadas. O FTIR é uma metodologia expedita de caracterização das
fracções fenólicas com potencial bioactivo, quando associada a avaliações quimiométricas. A
utilização da metodologia de extracção líquido/líquido, e a escolha do solvente acetato de
etilo revelou-se de eficácia elevada e baixa complexidade, pelo que a sua utilização é
recomendada para a obtenção destes extractos

vii
Abstract
In recent decades, the olive industry has experienced considerable development due to
increased production and consumption of olive oil. This vegetable fat, typical of the
Mediterranean diet is associated with decreased risk of cardiovascular disease and cancer.
These effects have been attributed to high levels of phenolic compounds found in olives.
During the extraction process of olive oil, only 1 to 2% of these compounds are retained in the
olive oil and 98 to 99% remain in by-products. The by-products such as pomace and olive
mill wastewaters may therefore be a valuable source for the extraction of bioactive
compounds with potential use in the pharmaceutical, cosmetic or food additives industries.

In this study representative samples of olive oil extraction by-products were collected
in two-and three phase olive mills located in Trás-os-Montes and Alto Douro region. The
three phase mills are located in Tabuaço and Lamego (Alvelos), and the two phase are located
in “Terra Quente Transmontana”, particularly in Murça (CAOM), Mirandela (Mirabaga) and
Valpaços (Aucama). From their efflents a liquid-liquid extraction with ethyl acetate was done
to obtain phenolic fractions that were evaluated relative to chemical parameters, such as total
polyphenols, flavonoids and ortho-diphenols, IR spectrophotometry and phenolic acids
composition by RP-HPLC.

Combining multivariate analysis with Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR)

allowed distinguishing the effluent resulting from centrifugation processes of two or three
phases. The chemical characterization showed that the content of total plyphenols and ortho-
diphenols are those that best distinguish the origin of the samples.

The use of high performance liquid chromatography allowed the identification of

bioactive compounds present in olive mill wastewaters. In this study hydroxytyrosol, tyrosol
and oleuropein were the phenolic compounds mostly found in the extracts obtained by ethyl
acetate. It was also possible to distinguish the mill extracts from two-and three-phase, using
principal component analysis.

The same phenolic extracts showed no antifungal activity for Candida albicans,
Candida parapsilosis and Candida oleophila species.

This work showed that the selected methods can reliably characterize the samples
analyzed. The FTIR combined with chemometric analisys is an expeditious method for
characterization of potential bioactive phenolic fractions. The use of the method liquid/liquid
extraction and the choice of ethyl acetate as solvent proved to be of low complexity and high
efficiency, so that its use is recommended for obtaining these extracts.

viii
Índice Geral

Agradecimentos ...................................................................................................................................... i
Índice de Figuras .................................................................................................................................. iii
Índice de Tabelas .................................................................................................................................. iv
Lista de abreviaturas............................................................................................................................. v
Resumo .................................................................................................................................................. vi
Abstract ................................................................................................................................................ viii
Índice Geral .......................................................................................................................................... ix
Objectivos do trabalho ......................................................................................................................... xi
1. Introdução .......................................................................................................................................... 1
1.1. Produção de azeite em Portugal e no Mundo .......................................................................... 1
1.1.1. Extracção do azeite ................................................................................................................ 3
1.1.2. Subprodutos ........................................................................................................................... 5
1.1.3. Impactos ambientais .............................................................................................................. 6
1.2. Caracterização de bioactivos ..................................................................................................... 8
1.3. Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) ........................... 9
1.3.1. Aplicações ........................................................................................................................... 10
1.4. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) .............................................................. 11
1.4.1. Aplicações ........................................................................................................................... 11
1.5. Quimiometria ............................................................................................................................ 11
1.5.1 Análise em Componentes Principais (PCA)......................................................................... 12
1.5.2. Análise Discriminante Linear (LDA) .................................................................................. 12
1.5.3. Regressão por Mínimos Quadrados Parciais (PLS-R) ........................................................ 12
2. Material e Métodos.......................................................................................................................... 13
2.1. Amostragem .............................................................................................................................. 13
2.2. Extracção da fracção fenólica ................................................................................................. 13
2.3. Caracterização química ........................................................................................................... 14
2.3.1. Polifenóis totais ................................................................................................................... 14
2.3.2. Orto-difenóis ....................................................................................................................... 14
2.3.3. Flavonóides ......................................................................................................................... 14
2.4. Bioactividade: Antimicrobiana ............................................................................................... 15
2.5. Medição de espectros no infravermelho médio...................................................................... 16
2.5.1. Preparação de amostras e recolha de dados ......................................................................... 16

ix
 2.6. Obtenção dos cromatogramas por RP-HPLC ....................................................................... 16
2.6.1. Preparação de amostras e recolha de dados ......................................................................... 16
2.7. Análise Estatística..................................................................................................................... 17
3. Resultados e Discussão .................................................................................................................... 18
3.1. Caracterização química ........................................................................................................... 18
3.2. Análise Quimiométrica para os parâmetros químicos .......................................................... 19
3.2.1. Análise em Componentes Principais (PCA)........................................................................ 19
3.2.2. Análise Discriminante Linear (LDA) .................................................................................. 21
3.2.3. Clusters hierárquicos Aglomerativos (AHC) ...................................................................... 23
3.3. Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier ...................................... 24
3.3.1. Análise dos resultados experimentais .................................................................................. 24
3.3.2. Análise em Componentes Principais (PCA) dos espectros de IV ....................................... 25
3.3.3. Regressão por Mínimos Quadrados Parciais (PLS-R) aplicada aos dados espectroscópicos
....................................................................................................................................................... 27
3.4. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) .............................................................. 29
3.4.1. Identificação de compostos fenólicos .................................................................................. 29
3. 4. 2. Análise em Componentes Principais (PCA) para HPLC................................................... 32
3.5. Bioactividade: Antimicrobiana ............................................................................................... 35
4. Conclusões e perspectivas futuras.................................................................................................. 37
5. Bibliografia ...................................................................................................................................... 39

x
Objectivos do trabalho
Com este trabalho pretende-se:

 Extrair a fracção fenólica de águas ruças da região de Trás-os-Montes e Alto Douro,

utilizando um solvente polar, nomeadamente, o acetato de etilo;
 Caracterizar quimicamente as águas ruças em polifenóis totais, orto-difenóis e
flavonóides;
 Medir o espectro de absorção na zona do infravermelho médio das fracções fenólicas
das amostras;
 Utilizar a técnica de FTIR para identificação de grupos funcionais da fracção fenólica;
 Utilizar a técnica de HPLC para identificar compostos bioactivos na fracção fenólica;
 Avaliar a actividade antifúngica dos extractos fenólicos;
 Recorrer à quimiometria para distinguir e correlacionar as amostras de águas ruças
quanto à sua composição química e origem.

xi
1. Introdução
1.1. Produção de azeite em Portugal e no Mundo
A oliveira é uma das mais antigas árvores cultivadas, estando a sua origem como
colheita datada de 4000-3000 AC, na região da Palestina (Rapoport, 2008). A sua propagação
está associada à expansão das civilizações mediterrânicas, que durante séculos dominaram a
humanidade, deixando a sua marca na cultura ocidental (IOC, 2014). Actualmente, cerca de
95% da área plantada, a nível mundial, encontra-se na zona mediterrânica (Rapoport, 2008).

Cientificamente, a oliveira é conhecida como Olea europaea L.. Pertence à família das
Oleacea e é a única espécie desta família com fruto comestível. É uma árvore de porte médio,
apresentando entre 4 a 8 metros de altura, dependendo da variedade. Consegue sobreviver e
ser produtiva durante centenas de anos. A sua copa é arredondada e o seu tronco é grosso,
apresentando uma casca de cor cinza/verde acinzentada. As folhas da oliveira são perenes e,
em regra, sobrevivem 2/3 anos. O fruto, a azeitona, é pequeno e apresenta forma elipsoidal e
globosa. Mede 1 a 4 cm de comprimento e tem um diâmetro compreendido entre 0,6 a 2 cm.
Quando atinge a maturação final, a azeitona fica preta, preta-púrpura ou avermelhada, porém,
em muitos casos, é colhida mais cedo, no seu estado verde (Rapoport, 2008).

O azeite é um dos óleos comestíveis mais consumidos, com volumes que têm vindo a
crescer constantemente desde 2005. A olivicultura e a indústria do azeite têm uma enorme
repercussão a nível económico e social, especialmente, para os países Mediterrânicos
(Dermeche et al., 2013). De acordo com estatísticas recentes (IOC, 2014), os maiores
produtores mundiais de azeite (dados referentes à colheita do ano 2011/2012) estão na UE
(72,1%), sendo a Espanha a líder desta classificação com 48,6%, seguindo-se a Itália com
12,0%, a Grécia com 9,9% e Portugal com 2,3%. Fora da UE, mas ainda dentro da zona
Mediterrânica, podemos encontrar alguns produtores com valores relevantes, como sejam:
Marrocos (3,6%), Síria (6,0%), Tunísia (5,5%) e a Turquia (5,75%). Relativamente, aos
maiores consumidores de azeite, os países que mais contribuem, estatisticamente, são os da
área Mediterrânica, principalmente Itália (19,8%) e Espanha (18,6%). Portugal apresenta,
similarmente aos valores produzidos, um consumo com valores interessantes (2,5%). É de
realçar que, os Estados Unidos da América são o terceiro país que mais consome azeite, a
nível mundial, com 9,7 %.

1
 O azeite possui excelentes propriedades nutricionais e o seu consumo, que outrora era
exclusivo da área Mediterrânica, está a aumentar à escala global. Países como a Argentina,
Austrália, EUA e África do Sul estão a surgir no cultivo da oliveira de forma intensa. Na
última década, a produção de azeite aumentou, aproximadamente 40% em todo o mundo. Este
fenómeno pode ser explicado pelo sucesso da dieta mediterrânica, à qual está associado uma
menor incidência de aterosclerose, determinados cancros e doenças cardiovasculares e
neurodegenerativas (Owen et al., 2000; López, et al., 2004; Perona et al., 2006). Estes
aparentes benefícios para a saúde foram, em parte, atribuídos ao consumo de azeite virgem
pelas populações da área mediterrânica. Os compostos fenólicos, senso lato, e o ácido oleico
presentes no azeite são os responsáveis pela crescente popularidade deste óleo pois podem
afectar a razão lípidos/lipoproteínas plasmáticas (Perona et al., 2006) e actuar como
antioxidantes naturais para prevenir doenças humanas (Owen, 2000). Além da actividade
antioxidante, os compostos fenólicos têm, também, propriedades anti-inflamatórias, anti-
proliferativas e propriedades anti-aterogénicas (Hajimahmoodi et al., 2008; Atmani et al.,
2009; Cicerale, 2010; Ilias et al., 2011; Loizzo et al., 2011).

A oliveira tornou-se uma espécie característica constante da agricultura portuguesa

muito graças à sua resistência a grandes períodos de seca e a sua adaptabilidade ao solo
rochoso. Economicamente, já no século XIII, o azeite tinha um papel importante no comércio
externo de Portugal, mantendo esta posição ao longo dos tempos. Durante a Idade Média, o
azeite era um produto abundante e nos séculos que se seguiram, desempenhou um papel
significativo na revitalização da agricultura. Contemporaneamente pode ver-se na Tabela 1, a
evolução que ocorreu ao nível da produção, consumo e exportação em terras lusas.

Tabela 1 - Valores para produção, consumo e exportação de azeite em Portugal entre 2002 a 2012 (1
000 toneladas) (Fonte: http://www.internationaloliveoil.org/estaticos/view/131-world-olive-oil-figures)

2002/ 2003/ 2004/ 2005/ 2006/ 2007/ 2008/ 2009/ 2010/ 2011/
2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012
Produção 28,9 31,2 41,2 29,1 47,5 36,3 53,4 62,5 62,9 76,2
Consumo 64,9 67 74,5 71,6 76,8 75,8 87,5 87,8 82 78
Exportação 13,1 15,9 16,6 16,7 23,2 29 30,7 35,8 42,7 51,5

Relativamente à distribuição a nível nacional, há cinco principais regiões de cultivo:

Trás-os-Montes, Beira Litoral, Beira Interior, Ribatejo e Oeste e Alentejo. Em 2010, o
Alentejo produziu 51% de azeite seguindo-se a região de Trás-os-Montes com 27%, Beira

2
Interior com 10%, Ribatejo e Oeste com 7% e Beira Litoral com, apenas, 5%. Sendo o
Alentejo a maior região produtora de Portugal, é de salientar que esta está dividida em três
áreas: Norte Alentejano, Alentejo Interior e Moura. De entre as variedades conhecidas,
Portugal cultiva principalmente Carrasquenha, Cobrançosa, Cordovil de Castelo Branco,
Cordovil de Serpa, Galega Vulgar, Maçanilha Algarvia, Redondal (IOC, 2014).

1.1.1. Extracção do azeite

O azeite encontra-se na forma de pequenas gotas no interior dos vacúolos das células
do mesocarpo da azeitona. Pode encontrar-se disperso, em menor quantidade, no sistema
coloidal do citoplasma da célula e ainda, no epicárdio e no endosperma. Para se obter um
rendimento de 1 kg de azeite são necessários, aproximadamente, 5 kg de azeitonas
(Kapellakis et al., 2008). As principais etapas de processamento na obtenção do azeite
seguem a ordem seguinte: colheita, remoção das folhas e lavagem, trituração/esmagamento,
mistura, separação e centrifugação do azeite.

Na primeira etapa, após a colheita nos olivais, as azeitonas são colocadas num
reservatório que está anexo a uma correia em movimento. A remoção das folhas e a lavagem
são importantes pois têm como finalidade remover todo o material estranho que possa ser
prejudicial para a maquinaria ou, mesmo, contaminar o produto final, como é o caso das
folhas que conferem um sabor amargo ao azeite.

De seguida, faz-se a trituração/esmagamento, sendo este o primeiro passo essencial. O

objectivo da trituração/esmagamento é romper as paredes celulares para facilitar a libertação
do azeite contido nos vacúolos. Isso é conseguido através da rotação de duas ou três rodas
pesadas a velocidades elevadas.

Depois deste passo, a pasta resultante é misturada e malaxada lenta e constantemente

durante cerca de 30 minutos, para aumentar a percentagem de azeite disponível e ajudar a que
pequenas gotas se aglutinem e aglomerem, facilitando, assim, a separação de fases, ou seja, a
separação do azeite e da água (Dermeche et al., 2013). As moendas podem ser verticais ou
horizontais, embora as primeiras sejam menos utilizadas. Ambas consistem em tanques
cilíndricos com lâminas rotativas e paredes duplas, e possuem uma hélice rotativa com várias
asas que misturam a pasta, a velocidades normalmente baixas (19-20 rpm). Para a
optimização do processo, as paredes duplas dos malaxadores têm água aquecida em
circulação constante. No entanto, a água não deve ter temperaturas superiores a 30oC para

3
que, assim, se evite a destruição dos componentes voláteis, haja mudança da cor do azeite
para tons avermelhados ou ocorra o aumento da acidez (Kapellakis et al., 2008).

Os principais constituintes da pasta da azeitona, antes do processo de extracção, são: o

azeite, pedaços dos caroços, água e resíduos celulares das azeitonas esmagadas. Nesta fase de
separação, podem ser usados dois diferentes processos de extracção do azeite: através de
processos descontínuos, baseados na pressão e através de processos contínuos, baseados na
centrifugação.

O processo de pressão descontínuo é o método mais antigo e mais difundido no

processamento da azeitona para obter azeite. Nos moinhos tradicionais, após a trituração, a
pasta da azeitona é espalhada sobre capachos, que são discos de fibra (outrora feitos em linho
ou coco), que são empilhados em cima uns dos outros e colocados numa prensa hidráulica.
Quando é exercida pressão, as fases líquidas (azeite e água) atravessam a fracção sólida
chamada de bagaço de azeitona (bolo de azeitona) que conta com a polpa da azeitona, pele,
caroço e água. Durante este procedimento é adicionada uma pequena quantidade de água para
facilitar a separação do azeite das outras fases. Este método oferece vantagens como sejam a
simplicidade da técnica, o uso de equipamentos baratos e a utilização de pequenas
quantidades de água, que produz um pequeno volume de água ruças (40 a 60 L/100 kg de
azeitona) (Dermeche et al., 2013). A descontinuidade do processo e os elevados custos de
mão-de-obra são as principais desvantagens. Além disso, as águas ruças (OMWW)
produzidas apresentam um valor mais elevado de carga orgânica expresso em valores
superiores de Carência Química de Oxigénio (CQO) em comparação com águas ruças geradas
por outros processos (Di Giovacchino et al., 2002).

O processo de pressão descontínuo tradicional deu lugar a um processo contínuo que

utiliza um sistema de três fases e que evoluiu posteriormente para sistemas de duas fases. O
processo de extracção do azeite em contínuo usa um decantador industrial para separar todas
as fases por centrifugação. Este método é baseado nas diferenças da densidade dos
componentes da pasta da azeitona (azeite, água e sólidos insolúveis). Os decantadores podem
funcionar quer como sistemas trifásicos quer como bifásicos.

No processo contínuo, o decantador trifásico adiciona água morna na etapa da

centrifugação (1,25 a 1,75 vezes mais em comparação com a extracção por prensa) o que leva
à produção de uma maior quantidade de águas ruças (80-120 L/ 100 Kg de azeitonas)
(Dermeche et al., 2013). O sistema de três fases, tal como o nome indica, gera três fracções:

4
um resíduo sólido conhecido como bagaço (bolo de azeitonas) e duas fases líquidas (azeite e
agua ruça). Este sistema tem como vantagens a automatização completa, uma melhor
qualidade do azeite e uma menor área necessária para a maquinaria. Porém, também,
apresenta desvantagens como sejam um maior consumo de água e energia, uma descarga de
águas ruças superior e uma instalação mais cara (Roig et al., 2006). Apesar do elevado
consumo de água, o sistema de três fases é o método mais amplamente empregado para a
produção de azeite virgem, especialmente nos países do Mediterrâneo menos desenvolvidos,
como a Turquia, Tunísia, Síria e Marrocos (Kapellakis et al., 2008).

Para minimizar o volume de águas ruças, o processo de duas fases foi desenvolvido na
década de 90. Com esta tecnologia, a pasta de azeitonas é separada em duas fases: azeite e
bagaço húmido. O bagaço húmido é um semi-sólido, ou seja, é uma combinação de casca e
polpa de azeitona e águas ruças. Este subproduto pode ser reprocessado para extrair óleo de
bagaço usando hexano e aumentar, assim, o rendimento. Os sistemas de duas fases têm sido
apelidados de decantadores “ecológicos” devido à redução no consumo de água (10 L/100 Kg
de águas ruças) comparativamente com os lagares de três fases (Roig et al., 2006; Kapellakis
et al., 2008). No entanto, o bagaço resultante é difícil de gerir devido à sua carga poluente ser
mais concentrada (McNamara et al., 2008).

Independentemente do processo aplicado para a separação do azeite dos seus

derivados, é necessária uma centrífuga vertical. A centrífuga vertical opera a velocidades mais
baixas do que a centrifuga horizontal, permitindo a separação final do azeite da água e de
outras substâncias.

1.1.2. Subprodutos
Durante o processamento da azeitona são produzidos três produtos residuais
principais: o bagaço ou bagaço húmido (subproduto resultante de um decantador de três fases
e de um decantador de duas fases, respectivamente), os resíduos vegetais como pequenos
galhos e as algumas folhas, e a água ruça.

O bagaço é o material resultante após a remoção da maior parte do azeite da pasta de

azeitonas. O bagaço húmido, obtido em sistemas de duas fases, apresenta um teor de
humidade à volta de 65-75 %, em comparação com 22-25% do “bolo de azeitonas” resultante
do método de prensa tradicional e 40-45% do bagaço dos sistemas trifásicos (Alburquerque et
al., 2004). Os galhos e as folhas não têm qualquer valor comercial, no entanto são
aproveitados para a alimentação de animais ruminantes ou são depositados em aterro.

5
 As águas ruças são um subproduto caracterizado, principalmente, por uma elevada
carga orgânica. De entre as diferentes substâncias orgânicas encontradas neste efluente
incluem-se os açúcares, taninos, compostos fenólicos, os ácidos orgânicos e lípidos (Zbakh e
El-Abbassi, 2012). Este líquido, que contem água na sua constituição (83-92%), caracteriza-
se por uma cor vermelha escura, ligeiramente ácido (pH à volta de 5) e com alta
condutividade.

O conteúdo fenólico das águas ruças é elevado e apresenta inúmeros compostos

interessantes. Muitos estudos têm vindo a ser realizados com o objectivo de recuperar os
polifenóis das águas ruças usando a adsorção em matrizes vegetais (Ena et al., 2011),
extracção da fase sólida (Bertin et al., 2011; Ferri et al., 2011) e processos de membrana (El-
Abbassi et al., 2009, 2011; Garcia-Castello et al., 2010), entre outros. No entanto, os extractos
aquosos de águas ruças podem ser utilizados para a preparação de produtos de elevado valor
acrescentado (Galanakis et al., 2010). As águas ruças têm sido referidas por possuir fibras
dietéticas solúveis e, especialmente, material de pectina com excelente capacidade de
gelificação (Galanakis et al., 2010).

Em termos inorgânicos, as águas ruças são compostas, maioritariamente, por metais

(Zbakh e El-Abbassi, 2012). Os metais são importantes ao nível nutricional e ao nível
toxicológico. Alguns metais, nomeadamente o ferro, cobre e o zinco, são substâncias
essenciais para o corpo humano e a sua deficiência pode acarretar problemas de saúde. No
entanto, esses mesmos elementos podem ter efeitos tóxicos, dependendo da dose, via de
assimilação, entre outros factores (Leung et al., 2010).

As águas ruças possuem, também, metais importantes, nomeadamente o magnésio e

cálcio, que estão directamente relacionados com uma diminuição do risco de doenças
cardíacas (Anne, 2011). A composição das águas ruças depende de vários parâmetros, tais
como a variedade da azeitona, da época da colheita, condições climáticas, do processo de
extracção do azeite, entre outros (Zbakh et al., 2012).

1.1.3. Impactos ambientais

As águas ruças são um subproduto das azeitonas e pode então presumir-se que são
totalmente biodegradáveis. No entanto, isso não acontece porque os fenóis e lípidos se
decompõem muito mais lentamente do que os açúcares, e ainda porque muitos dos compostos
fenólicos característicos destes efluentes apresentam elevada toxicidade para números
microrganismos, vulgarmente utilizados em processos de tratamento biológico (Sassi et al.,

6
2008; Amaral et al., 2012). Este entrave à biodegradação e a elevada carga orgânica das águas
ruças faz com que estes resíduos sejam responsáveis pelos vários problemas ambientais, em
particular, na zona mediterrânica.

Os principais impactos ambientais deste subproduto são o perigo adjacente para a vida
aquática, visto que as águas ruças são mais concentradas em compostos orgânicos do que os
efluentes municipais e logo que há uma descarga para a água doce, a disponibilidade de
oxigénio reduz substancialmente, causado um desequilíbrio em todo o ecossistema
(Kapellakis et al., 2008). Para além disso, o aumento da concentração de nutrientes
(eutrofização) provenientes das águas ruças promove o desenvolvimento de algas; os odores
provocados por fenómenos de fermentação nos tanques ao ar livre ou pela descarga directa no
solo ou, mesmo, em efluentes naturais. Isto leva a que o metano e outros gases, como o
sulfureto de hidrogénio, sejam emitidos; os lípidos das águas ruças formam uma película
impenetrável sobre a superfície da água, bloqueando a “entrada” de luz solar e oxigénio para
os microrganismos da água, levando à redução do crescimento das plantas e o aumento da
erosão; a coloração das águas naturais é causada pela oxidação e posterior polimerização dos
taninos que produzem polifenóis de cor escura, e que são difíceis de remover dos efluentes; a
toxicidade provocada pelas águas ruças, devido à presença de vários ácidos voláteis
fitotóxicos e compostos fenólicos, que são tóxicos, na sua constituição. Os fenóis em conjunto
com os álcoois, aldeídos e ácidos fenólicos provocam a redução do pH, pelo que as águas
ruças devem ser tratadas removendo a fracção fenólica (Adhoum e Monser, 2004).

No que diz respeito às águas ruças, o quadro jurídico existente destaca alguns
problemas significativos. Um deles está relacionado com a falta de uma política comum e
específica entre os membros da UE, visto haver diferentes normas para o tratamento de
efluentes agro-industriais que têm vindo a ser implementados em toda região mediterrânica.
Por exemplo, há muito tempo que foram adoptadas directrizes para aplicação de águas ruças
no solo em Itália (Bettazzi et al., 2006) e Espanha (Cabrera et al., 1996), mas na Grécia, além
de ser proibido, cada uma das regiões tem a sua própria política, chegando até a ser
contraditórias (Kapellakis et al., 2006).

7
 1.2. Caracterização de bioactivos
Existem inúmeros compostos fenólicos diferentes que foram identificados em águas
ruças (Obied et al., 2005; Garcia-Castello et al., 2010). No entanto, os principais compostos
fenólicos encontrados são a oleuropeína, o hidroxitirosol e o tirosol (Figura 1).

Figura 1 - Compostos fenólicos: A-Oleuropeína; B-Hidroxitirosol; C-Tirosol.

Estes compostos possuem um elevado espectro de actividades biológicas, incluindo

actividade antioxidante (Carrasco-Pancorbo et al., 2005; Deiana et al., 2010; Zhu et al.,
2010), anti-inflamatória (Petroni et al., 1997; Miles et al., 2005;Marrugat et al., 2010), anti-
bacteriana e, mesmo funções antivirais (Bisignano et al., 1999, 2001; Brenes et al., 2011).

Vários estudos têm sugerido que os danos oxidativos são um factor importante
etiológico da aterosclerose. O hidroxitirosol e a oleuropeína foram mencionados para impedir
a oxidação das LDL (Low Density Lipoproteins) e para retardar o desenvolvimento de placas
ateroscleróticas em modelos animais (González-Santiago et al., 2006; Omar, 2010),
propondo, assim, a eficácia deste compostos no tratamento e prevenção de aterosclerose.

As águas ruças possuem actividade protectora contra o ácido hipocloroso (HOCl) que
induz a danificação da catalase, que é de importância biológica significativa, nomeadamente
na degradação do peróxido de hidrogénio (H2O2) (Visioli et al., 1999; Czerwinska et al.,
2011).

Recentemente, alguns estudos têm relatado actividades citoprotectoras de extractos de

águas ruças, ricas em hidroxitirosol, em células cerebrais dissociadas in vitro e ex vivo
(Schaffer et al., 2007, 2010), que podem reduzir o risco de doenças neurodegenerativas com o
avançar da idade, como a doença de Alzheimer (Scarmeas et al., 2009).

8
 Noutros estudos, o hidroxitirosol e a oleuropeína são responsáveis por terem efeitos
importantes na formação e manutenção dos ossos e podem ser usados como fármacos eficazes
no tratamento de sintomas da osteoporose (Hagiwara et al., 2011).

Obied e colaboradores (2007) referiram que a fracção fenólica das águas ruças
demonstrou actividade anti-bacteriana contra várias espécies de bactérias, como a
Staphylococus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa. Além
disso, em outros estudos, foi demonstrado que as actividades bactericidas e fungicidas
significativas das águas ruças estão, directamente, relacionadas com o conteúdo fenólico em
hidroxitirosol e tirosol (Yangui et al., 2009, 2010)

Para a utilização de agentes bioactivos, a valorização dos compostos fenólicos implica

o fraccionamento e purificação dos mesmos e, acima de tudo, o controlo da sua concentração,
para que se evitem efeitos adversos no seu consumo.

1.3. Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR)

Os métodos espectroscópicos são baseados no estudo da interacção da radiação
electromagnética com as amostras. O espectro electromagnético prolonga-se desde
frequências pequenas utilizadas para comunicações rádio até frequências mais elevadas como
é o caso das radiações gama. A região do infravermelho (10-14000 cm-1) do espectro
electromagnético é dividida em três regiões: o infravermelho próximo, médio e longínquo
(Davis e Mauer,2010).

O infravermelho médio (400-4000 cm-1) é a região que mais vezes é usada para a
análise de compostos orgânicos porque estes possuem frequências de absorção características
das vibrações das ligações nesta região. Quando a radiação IV atravessa uma amostra são
absorvidos comprimentos de onda específicos fazendo com que as ligações químicas
presentes na amostra sofram vibrações de stretching, contracting e bending. Os grupos
funcionais presentes numa molécula tendem a absorver a radiação IV no mesmo intervalo de
comprimentos de onda, independentemente de outras estruturas na molécula. Há, portanto,
uma correlação entre as posições das bandas de absorção IV e as estruturas químicas na
molécula. Para além de fornecer informação qualitativa sobre os grupos funcionais, os
espectros de IV podem fornecer informação quantitativa, tal como acontece na avaliação da
concentração de bactérias num meio de crescimento (Schawe et al., 2011).

9
 Resumidamente, um espectroscópio de infravermelhos com Transformada de Fourier
funciona da seguinte maneira: a fonte de IV emite radiação que atravessa um interferómetro,
geralmente um interferómetro de Michelson, que possui um divisor de feixe, um espelho fixo
e um espelho móvel. O interferómetro utiliza padrões de interferência para fazer medições
precisas do comprimento de onda da luz. Quando a radiação de IV passa através da amostra,
parte da radiação é absorvida e o resto é transmitido para o detector. Este mede todos os
interferogramas gerados para todos os comprimentos de onda infravermelhos. Uma função
matemática denominada de Transformada de Fourier, transforma o interferograma num
espectro IV. Graficamente aparecem, no eixo dos Y, os valores das absorvâncias ou
transmitâncias e no eixo dos X, aparecem os números de onda.

Na espectroscopia de FTIR, a reflexão total atenuada (ATR) é uma das técnicas mais
usadas para a obtenção dos espectros em que é utilizada a reflexão interna total. Este método
pode ser utilizado na análise de amostras quer de sólidos quer de líquidos pouco ou muito
viscosos. Os cristais utilizados nas células ATR são feitos a partir de materiais que possuem
baixa solubilidade em água e apresentam um índice de refracção muito elevado. Esses
materiais podem ser seleneto de zinco (ZnSe), germânio (Ge) e bromo-iodeto de tálio (KRS-
5) (Stuart, 2004).

Os dados da espectroscopia de infravermelho são muito complexos, pelo que

raramente são utilizados na sua forma original. Após a sua obtenção é necessário recorrer à
quimiometria, por forma a extrair a maior quantidade de informação possível (Rohman e Che
Man, 2011).

Esta técnica apresenta algumas vantagens que a distinguem. É simples de usar e

rápida, é um método muito sensível pois apenas precisa de pequenas quantidades de amostra,
não é destrutiva e fornece informação quantitativa em amostras que podem ser liquidas,
gasosas e sólidas. No entanto, tem, também, desvantagens: as condições ambientais em redor
do aparelho causam variação dos espectros, sendo necessário fazer-se a medição do espectro
sem amostra em medições sucessivas, e em amostras complexas pode originar espectros com
sobreposição de bandas (Davis e Mauer, 2010).

1.3.1. Aplicações
Actualmente, a espectroscopia de infravermelhos é uma das técnicas analíticas mais
interessantes, porque permite estudar, praticamente, qualquer tipo de amostra sendo elas,
orgânicas, inorgânicas ou biológicas. Esta técnica tem especial utilidade, por exemplo, na

10
indústria farmacêutica (Sherazi et al., 2010), na microbiologia (Beeke et al., 2007), em
análises forenses (Panayioyou e Kokot, 1999), na indústria alimentar (Cerna et al., 2003),
entre outras.

1.4. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC)

A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência é uma forma específica de cromatografia
em coluna, que é, vulgarmente, usada em bioquímica para separar, identificar e quantificar
compostos bioactivos, como por exemplo, no café (Rodrigues e Bragagnolo, 2013).

O HPLC utiliza uma coluna que contém uma fase estacionária, uma bomba que
movimenta a fase móvel através da coluna e um detector que mostra os tempos de retenção
das moléculas. O tempo de retenção varia com as interacções que são feitas entre a fase
estacionária, as moléculas a analisar e o solvente utilizado. O tempo de retenção é assim
chamado, pois refere-se ao tempo que um analito demora a sair da coluna.

As amostras são introduzidas em pequenas quantidades para o fluxo da fase móvel e

dão-se interacções físicas e químicas com a fase estacionária. Cada componente da amostra
interage de maneira diferente com a coluna, o que leva à separação dos componentes. Os
solventes mais usados incluem combinações miscíveis de água com líquidos orgânicos, como
são o caso do metanol e o acetonitrilo (Ogawa e Yoshimura, 2012).

1.4.1. Aplicações
O HPLC é uma ferramenta que é usada nas mais diversas áreas. É usada para fins
médicos, na detecção dos níveis da vitamina D no soro sanguíneo (Lukaszkiewicz et al.,
1989), forenses, na detecção de drogas no plasma sanguíneo (Fernández et al., 2006), de
investigação, na detecção de compostos fenólicos (Chirinos et al, 2008), e farmacêuticos, no
controlo de qualidade de produtos farmacêuticos (Gravel et al., 2005).

1.5. Quimiometria
A quimiometria é a aplicação de métodos estatísticos ou matemáticos a dados
experimentais de forma a extrair o máximo de informação possível. De entre todas as
ferramentas destacam-se as seguintes:

 Análise em componentes principais (PCA)

 Regressão multivariada
 Regressão linear múltipla (MLR)
 Regressão de Ridge (RR)

11
  Regressão de componentes principais (PCR)
 Regressão por mínimos quadrados parciais (PLS-R)
 Análise factorial de correspondência (CFA)
 Análise discriminante linear (LDA)
 Análise canónica de correlação
 Métodos de selecção de variáveis.

Os métodos de análise multivariada podem também ser divididos em dois tipos:

métodos de análise supervisionada e métodos de análise não supervisionada. Os primeiros
requerem um conhecimento prévio de informações acerca das amostras em estudo, enquanto
que, os segundos não precisam de ter qualquer informação prévia sobre as amostras. O PCA é
um exemplo de um método não supervisionado e a DA é uma análise supervisionada.

1.5.1 Análise em Componentes Principais (PCA)

É um procedimento estatístico que é usado para reduzir a multidimensionalidade do
conjunto de variáveis e produzir um pequeno número de outras variáveis, que contém a maior
parte da informação do conjunto de variáveis iniciais. Essas novas variáveis denominam-se de
componentes principais (PC). Esta transformação é definida da seguinte maneira: o primeiro
componente principal é o responsável máximo da variabilidade de dados e cada componente
que se sucede representará por sua vez, uma menor variabilidade de dados.

1.5.2. Análise Discriminante Linear (LDA)

A análise discriminante linear é um método linear e paramétrico com características de
discriminação. Tanto a LDA como o PCA estão intimamente relacionados, pois ambos
procuram fazer combinações lineares de variáveis para explicar melhor os dados. No entanto,
a LDA tenta criar um modelo que diferencie as classes de dados, enquanto que o PCA não
tem em conta qualquer diferença entre classes.

1.5.3. Regressão por Mínimos Quadrados Parciais (PLS-R)

É usado para construir modelos preditivos. Este método estatístico extrai o máximo de
quantidade de informação a partir dos dados obtidos com base em variáveis latentes que são
usadas na previsão de variáveis físico-químicas. Para se construir um modelo PLS-R é
necessário um conjunto de dados de calibração, um conjunto de dados de validação e um para
o teste de predição.

12
2. Material e Métodos
2.1. Amostragem
As amostras foram recolhidas na região de Trás-os-Montes e Alto Douro, durante o
mês de Fevereiro de 2014. Para tal foram recolhidas três réplicas em cada um dos locais de
amostragem. A escolha dos cinco locais para se proceder à recolha das amostras, teve por
base o tipo de processo de extracção de azeite e o tipo de subprodutos gerados.

Das cinco estações, Tabuaço e Alvelos, eram lagares que usavam um método de
extracção trifásico. Na Cooperativa Agrícola de Tabuaço, as amostras foram retiradas de um
reservatório de águas ruças, apelidado de inferno. Em Alvelos (Lamego), as amostras foram
recolhidas directamente do decantador, pelo que estas amostras resultaram de processos de
lavagem do azeite.

Quanto às outras amostras, na Cooperativa Agrícola dos Olivicultores de Murça

(CAOM), o subproduto recolhido resultou de um método de extracção de duas fases, que
estavam depositados num reservatório ao ar livre, junto à cooperativa. Em Latadas,
Mirandela, foram recolhidas amostras de uma empresa de refinaria (Mirabaga) que extrai
óleos de bagaço húmido dos vários lagares de azeite da região. São, portanto, amostras que
resultam de um método de extracção de duas fases, que estavam depositadas no solo, antes de
serem processadas. Em Valpaços, as amostras apanhadas pertencem, também, a uma empresa
de refinaria de óleos (Aucama). No entanto, estas amostras passaram por um segundo
processo de extracção de azeite e foram retiradas, directamente, do decantador de duas fases.

Todas as amostras foram mantidas em gelo até à chegada ao laboratório onde foram
mantidas no frio até serem processadas. Por razões de comodidade, as amostras são chamadas
de Tabuaço (1,2 e 3), Alvelos (1,2,3), CAOM (1,2 e 3), Mirabaga (1,2 e 3) e Aucama (1,2 e
3).

2.2. Extracção da fracção fenólica

As amostras foram centrifugadas durante 20 minutos à velocidade de 4000g, numa
centrífuga SIGMA 3K30. Depois de centrifugadas, foram filtradas num funil de Büchner com
1 mm de poro. O objectivo deste processo é retirar os resíduos sólidos existentes nas
amostras, ficando, apenas, com uma amostra líquida.

Na segunda etapa, a partir das amostras obtidas na etapa anterior, a fracção fenólica foi
extraída, com n-hexano, duas vezes, na proporção 2:3 (v/v) (águas ruças:n-hexano). Neste

13
procedimento, as amostras foram agitadas vigorosamente, e deixadas em repouso overnight
para total separação de fases. Após o tempo de espera, foi eliminada a fase com o hexano.

Na terceira etapa, as amostras decantadas na etapa anterior, foram extraídas com

acetato de etilo, duas vezes, na proporção de 1:1 (v/v). Foram repetidos os passos da etapa
prévia.

Na quarta etapa, as amostras obtidas, na etapa anterior, foram evaporadas num

evaporador rotativo sob vácuo, à temperatura de 80oC (De Marco et al., 2007).

2.3. Caracterização química

2.3.1. Polifenóis totais

Os polifenóis totais foram determinados colorimetricamente, de acordo com o método
de Folin-Ciaocalteau modificado (Ergül et al. 2009). De acordo com este método, foram
adicionados 500 µL de reagente Folin-Ciaocalteau (4x diluído) a 100 µL de amostra (não
diluída). Após 5 minutos, foram adicionados 500 µL de uma solução de carbonato de sódio
(Na2CO3) a 20%. Após 30 minutos à temperatura ambiente e às escuras, a absorvância foi
medida, num espectrofotómetro JASCO V530, a 725 nm. Foi usado ácido cafeico (C9H8O4)
para fazer a recta padrão com procedimento idêntico ao utilizado para as amostras.

2.3.2. Orto-difenóis
Os Orto-difenóis foram determinados colorimetricamente, usando molibdato de sódio
(Na2MoO4). A solução de molibdato de sódio foi preparada dissolvendo 1 g de molibdato de
sódio em 10 mL de uma solução com metanol (CH3OH) e água (H2O) na proporção 1:1 (v/v).
Neste método, foram adicionados 200 µL de amostra a 50 µL da solução de molibdato de
sódio e a 2250 µL de H2O. Após 15 minutos, a absorvância foi medida, num
espectrofotómetro JASCO V530, a 370 nm. Foi usado ácido gálico (C7H6O5) para fazer os
padrões com procedimento idêntico ao utilizado para as amostras.

2.3.3. Flavonóides
Os flavonóides foram determinados colorimetricamente, de acordo com o seguinte
método. A 500 µL de amostra foram adicionados 150 µL de uma solução de nitrito de sódio
(NaNO2) a 5%. Após 5 minutos, foram adicionados 150 µL de cloreto de alumínio (AlCl3) a
10%. Após mais 6 minutos, foi adicionado 1 mL de solução de hidróxido de sódio (NaOH) a
1M. Foi, então, medida a absorvância, num espectrofotómetro JASCO V530, a 510 nm. Foi

14
usado catequina (C15H14O6) para fazer os padrões com procedimento idêntico ao utilizado
para as amostras.

2.4. Bioactividade: Antimicrobiana

O teste de difusão em disco foi realizado de acordo com o protocolo M44-A do
NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards).

a) Preparação do inóculo

Isolados em cultura pura de Candida albicans (espécie patogénica), Candida

parapsilosis (espécie oportunista) e Candida oleophila (espécie não patogénica) foram sub-
cultivados em Sabouraud Dextrose Agar, e incubados overnight a 35⁰C. Após o período de
incubação, as colónias foram suspensas em solução salina (0,85% NaCl) estéril. A suspensão
de leveduras foi ajustada para conter 1 a células/mL (corresponde à escala 0,5 de Mc
Farland) e, em seguida, com auxílio de uma zaragatoa estéril, a suspensão foi inoculada na
superfície de uma placa de Petri com meio Mueller-Hinton com glicose a 2% sem azul de
metileno com espessura de quatro milímetros, fazendo estrias uniformemente em toda a
superfície da placa, em 4 direcções. Para o meio de Mueller-Hinton, foram suspensos 36,0 g
de pó em 1L de água destilada. Foi aquecido até ferver e misturado até dissolver
completamente. De seguida, foi esterilizado na autoclave a 121⁰C durante 15 minutos, e
posteriormente, o meio foi distribuído em placas de Petri.

b) Preparação dos extractos para aplicação nos discos

Os extractos obtidos em 2.2., foram ressuspensos em DMSO, dimetilsulfóxido

(C2H6OS). Neste procedimento, foram dissolvidos 10 mg de extracto de cada uma das
réplicas dos cinco locais de amostragem referidos, em 1 mL de DMSO.

c) Aplicação dos discos de difusão

Depois do inóculo estar seco, discos de 5 mm de diâmetro, previamente esterilizados,

foram colocados na superfície da placa, garantindo um contacto total do disco com a
superfície do inóculo. A sua distribuição foi uniforme, de modo a que houvesse um
afastamento mínimo entre discos de 24 mm de centro a centro.

25 µL de extractos de cada amostra foram colocados sobre os discos de papel em cada

placa com meio de Mueller-Hilton. Depois de absorvidos os extractos, as placas foram
incubadas a 35⁰C entre 24 a 48 horas. Após esse período de incubação, os resultados dos

15
halos de inibição de crescimento foram interpretados de acordo com as tabelas pré-
estabelecidas para classificar os isolados em resistentes ou susceptíveis.

Tabela 2 – Padrões interpretativos do diâmetro de inibição versus MIC (Concentração Mínima de

Inibição) correspondentes para Candidas pp. ao Fluconazole 25 µg/disco

Diâmetro MIC Breakpoints Categoria

≤ 14 mm ≥ 64 µg/mL Resistente
≥ 19 mm ≤ 8 µg/mL Susceptível
15-18 mm 16-32 µg/mL Susceptível Dose-Dependente

2.5. Medição de espectros no infravermelho médio

2.5.1. Preparação de amostras e recolha de dados

As amostras usadas foram preparadas, previamente, como está descrito na secção 2.2..
A medição de espectros no infravermelho foi efectuada num espectrómetro de infravermelhos
com transformada de Fourier (Mattson, Unicam Research Series), equipado com um acessório
de reflexão total atenuada (ATR) (Golden Gate, U.K.) sendo o equipamento controlado pelo
software WinFirst, versão 3.2., que é usado também para, posterior, interpretação de
resultados.

As amostras foram colocadas directamente sobre o cristal, com auxílio de uma

espátula pequena. A temperatura do cristal foi mantida a 35⁰C. Para se efectuar as medições
foi escolhida a região entre 4000 e 500 cm-1, uma resolução de 4 cm-1 e 64 varrimentos
(scans); cada medição teve a duração de cerca de 4 minutos. Foram medidas três repetições de
cada réplica, e entre medições consecutivas, o cristal foi cuidadosamente limpo com etanol a
95%, deixado secar alguns segundos. Antes de cada medição foi efectuado um background.
Antes de guardar cada espectro foi efectuada uma correcção automática da linha de base.

2.6. Obtenção dos cromatogramas por RP-HPLC

2.6.1. Preparação de amostras e recolha de dados

As amostras obtidas em 2.2 foram redissolvidas em solução metanólica em água
destilada na proporção de 1:1 (v/v) e injectadas num cromatógrafo modelo Dionex Ultimate
3000 (Dionex Corp., Sunnyvale, USA) equipado com um detector de fotodiodo da Dionex e
com uma coluna de fase reversa C18 ACE 5C18 (250 mm x 4,6 mm).

16
 Este procedimento decorreu a 35⁰C usando um volume de injecção de 25 µL. A
detecção foi efectuada a 280 e a 325 nm, usando um perfil de eluição em gradiente com
solvente A, 5% de ácido fórmico (v/v), e o solvente B, 100% de metanol. A eluição foi
efectuada do seguinte modo: 0 aos 2 minutos, 5% de eluente B e 95% de eluente A; 2 aos 65
minutos, gradiente automático começado com 5% do eluente B e foi aumentando até 65 % do
eluente B; 65 aos 66, gradiente automático começado com 65% do eluente B e foi diminuindo
até 5% do eluente B; 67 aos 75 minutos, final da corrida com 5% do eluente B e 95% do
eluente A. Os compostos fenólicos foram, então, identificados comparando os seus espectros
UV e tempos de retenção respectivos com padrões externos injectados nas mesmas condições.

2.7. Análise Estatística

A análise multivariada (PCA, LDA, AHC e PLS-R) foi realizada usando o programa
“XLSTAT” V2003.06 (Addinsoft, Inc, New York, USA).

Para as variáveis químicas, polifenóis totais, orto-difenóis e flavonóides, foi usada a

análise em componentes principais (PCA), a análise discriminante linear (LDA) e técnica de
clusters hierárquicos aglomerados (AHC) foi construído um dendrograma, de modo a obter
diferenças ou semelhanças entre a variabilidade de dados existente.

Para os dados espectais obtidos por FTIR foi usada a análise em componentes
principais, entre os 592,04 cm-1 e 1799,27 cm-1. Foi ainda usada a regressão por mínimos
quadrados parciais (PLS-R) para relacionar os parâmetros químicos com as variáveis
espectroscópicas.

Para analisar os compostos fenólicos identificados por HPLC, foi usada, também, a
análise em componentes principais (PCA).

17
3. Resultados e Discussão
O acetato de etilo foi escolhido como solvente de extracção dos biofenóis de águas
ruças por ser um método frequentemente seleccionado e já testado por outros autores (De
Marco et al., 2007; El-Abbassi et al., 2012; Kalogerakis et al., 2013; Rubio-Senent et al.,
2013). Allouche e colaboradores (2004) demonstraram que o acetato de etilo exibe um maior
poder de extracção relativamente a outros solventes, tais como o 4-metil-2-pentanona, butan-
2-ona e etoxietano, mais conhecido como éter etílico.

3.1. Caracterização química

Na tabela 3 estão os valores determinados colorimetricamente para os parâmetros
químicos analisados (Polifenóis Totais, Orto-difenóis e Flavonóides).

Tabela 3 - Resultado dos parâmetros químicos das amostras analisadas.

Polifenóis Totais Orto-difenóis Flavonóides

Amostra
Eq (mg/L) Ác. Caféico Eq (mg/L) Ác. Gálico Eq (mg/L) Catequina
Tabuaço 1 93,833 1163,333 137,037
Tabuaço 2 85,148 1347,778 160,802
Tabuaço 3 98,889 1597,778 105,951

Aucama 1 132,037 4798,889 223,852

Aucama 2 141,519 4666,667 223,852
Aucama 3 127,444 4426,667 230,864

Mirabaga 1 130,926 3660,000 136,642

Mirabaga 2 106,000 3513,333 136,642
Mirabaga 3 131,500 3501,111 *

CAOM 1 134,648 5043,333 121,370

CAOM 2 146,722 5035,556 99,383
CAOM 3 145,352 4803,333 86,494

Alvelos 1 27,686 280,000 *

Alvelos 2 10,630 716,667 *
Alvelos 3 77,407 673,333 *
*-não foi possível fazer a medição

A análise dos resultados permite-nos dizer que, para os polifenóis totais e orto-
difenóis, os pontos de amostragem Aucama, Mirabaga e CAOM apresentam valores de
concentrações superiores aos obtidos para as estações de Tabuaço e Alvelos. O primeiro
grupo de resultados refere-se a amostras que resultam de processos de centrifugação de duas
fases e o segundo grupo, refere-se a amostras que resultaram de processo de centrifugação de

18
três fases. É, portanto, possível vislumbrar uma diferença dos resultados para os dois tipos de
extracção de azeite.

Relativamente aos flavonóides, Aucama é o local de amostragem que apresenta maior

concentração, sendo que estas amostras se referem a processos de centrifugação de duas fases.
Quanto aos resultados obtidos dos pontos de amostragem, não é possível observar uma
distinção clara entre as concentrações obtidas, embora haja réplicas em que não há resultados,
pelo que não se deve fazer qualquer tipo de analogia, como foi feito para os dois primeiros
parâmetros analisados.

Comparando os resultados por nós obtidos com estudos já publicados (Ergül et al.,
2009; Amaral et al., 2012), os valores medidos para polifenóis totais são inferiores. Tais
resultados podem estar relacionados com o estado de maturação das azeitonas, sendo que para
um estado de maturação maior, a quantidade de polifenóis totais é, também, superior (Amaral
et al., 2008). Azaizeh e colaboradores (2012) obtiveram, por sua vez, resultados concordantes
com os obtidos neste estudo, para o parâmetro polifenóis totais.

As réplicas de Alvelos são as que apresentam um menor conteúdo em polifenóis totais

e orto-difenóis, relativamente a todos os outros locais de amostragem, visto esta amostra ser
proveniente de processos de lavagem.

3.2. Análise Quimiométrica para os parâmetros químicos

3.2.1. Análise em Componentes Principais (PCA)

A análise em componentes principais permite identificar os parâmetros que mais
contribuem para a variabilidade encontrada entre amostras. Nesta análise, o valor de KMO
(Kaiser-Meyer-Olkin), que é teste estatístico que varia entre zero e um e compara as
correlações simples com as correlações parciais observadas entre as variáveis, foi de ~0,5 o
que sugere que a correlação entre os dados é considerada “aceitável”.

Pela observação dos coeficientes de correlação de Pearson (Tabela 4) calculados entre

parâmetros químicos, a classificação feita pelo KMO é corroborada, uma vez que, ainda que
haja uma tendência para que os valores de polifenóis totais estarem correlacionados com os
valores de orto-difenóis, esta correlação não é estatisticamente significativa. Os mesmos
coeficientes de correlação mostram que os flavonóides com os polifenóis totais e os
flavonóides com os orto-difenóis não apresentam correlação estatisticamente significativa
entre si.

19
Tabela 4 – Matriz de coeficientes de correlação de Pearson para os parâmetros químicos.

Variáveis Polifenóis totais Orto-difenóis Flavonóides

Polifenóis totais 1 0,884 0,023
Orto-difenóis 0,884 1 0,123
Flavonóides 0,023 0,123 1

Estas análises estatísticas dependem muito dos resultados e, neste trabalho, houve
algumas amostras para as quais não se obtiveram medições, nomeadamente as réplicas de
Mirabaga 3, Alvelos1, Alvelos 2 e Alvelos 3, por não existir amostra suficiente, o que explica,
parcialmente, a ausência de correlações entre as amostras.

No gráfico das observações (Figura 2) resultante da aplicação da análise em

componentes principais, o primeiro componente principal (F1) explica 63,18% da variância e
o segundo componente principal (F2) explica 33,12% da variância. Isto demonstra que, em
apenas dois componentes principais, é explicada 96,30% da variância.

Observações (eixos F1 e F2: 96,30 %)

2
Aucama 3
Aucama 1
1,5 Aucama 2

0,5 Alvelos 2
F2 (33,12 %)

Alvelos 1 Tabuaço 2
Alvelos 3
0
Mirabaga 3
Tabuaço 1
Mirabaga 2
-0,5 Mirabaga 1

Caom 1
-1 Tabuaço 3

Caom 2
-1,5
Caom 3

-2
-3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2
F1 (63,18 %)

Figura 2 - Gráfico de observações da análise em componentes principais (PCA) para os parâmetros químicos
analisados nas diferentes réplicas dos locais de amostragem.

20
 O gráfico de observações (Figura 2) mostra que é possível distinguir as amostras
provenientes dos diferentes locais de amostragem e, ainda, agrupar as amostras consoante a
origem de processos de centrifugação de duas ou três fases.

A componente F1 estabelece a diferenciação entre os lagares de duas ou de três fases.

No lado negativo da componente F1, aparecem os de três fases e no lado positivo da
componente F1, aparecem os de duas fases. Os parâmetros químicos que mais contribuem
nesta diferenciação são os polifenóis totais e os orto-difenóis.

A componente F2 não explica a variabilidade encontrada para as amostras

provenientes de processos de centrifugação de três fases, pois as amostras de Alvelos e
Tabuaço estão distribuídas mais ao menos aleatoriamente entre os quadrantes separados por
F2. No entanto, para as amostras provenientes de processos de centrifugação de duas fases,
esta componente (F2) separa claramente as réplicas de Aucama, situadas no lado positivo, das
amostras de CAOM e de Mirabaga que estão situadas na parte negativa. Para a formação da
componente principal F2 o parâmetro mais importante é a variável flavonóides.

Portanto podemos concluir que medindo apenas os parâmetros de polifenóis e orto-

difenóis e recorrendo a uma equação que relacione estes dois parâmetros, é possível distinguir
amostras oriundas dos dois tipos de processo de extracção de azeite.

3.2.2. Análise Discriminante Linear (LDA)

Na tentativa de obter um modelo quantitativo para melhor diferenciar as diferentes
amostras, e ainda corroborar a análise de PCA foi aplicada a análise discriminante linear
(LDA) aos parâmetros químicos determinados colorimetricamente.

A análise utilizada (Figura 3) revelou que o primeiro factor discriminante (F1) explica
92,99% da variância e o segundo factor discriminante (F2) explica 6,55% da variância. Isto
significa que em apenas dois factores discriminantes, é explicada 99,54% da variância.

O gráfico das observações representado na figura 3 mostra uma evidente diferenciação

entre os dois tipos de processos de centrifugação. À esquerda de F1, no lado negativo,
aparecem as amostras relativas a processos de centrifugação de três fases e à direita de F1, no
lado positivo, aparecem as amostras relativas a processos de centrifugação de duas fases.

21
 Observações (eixos F1 e F2: 99,54 %)
15

10

Aucama 3
5 Aucama 2
Aucama 1
ALV
F2 (6,55 %)

Alvelos 1 Alvelos 3
Tabuaço 2
Alvelos 2 0 AUC
Tabuaço 1 Mirabaga 3
-20 -15 -10 -5 0 Mirabaga
5 1 10 15 20 CAO
Mirabaga 2
Tabuaço 3 Caom 1 MIR
Caom 2
-5 Caom 3 TAB

-10

-15
F1 (92,99 %)

Figura 3 - Gráfico de observações da análise discriminante linear (LDA) para aos parâmetros químicos analisados nas
diferentes réplicas dos locais de amostragem

De forma semelhante à análise de PCA, a LDA revela que, no caso dos lagares de
Alvelos e Tabuaço, o factorial F2 não os discrimina tão claramente como no caso dos lagares
de duas fases. Há uma maior proximidade entre as amostras de lagares de três fases entre si do
que entre as amostras de lagares de duas fases, em que Aucama é claramente diferente da
CAOM e Mirabaga, sendo que estas já apresentam uma maior proximidade entre si.

Conforme ilustrado na tabela 5, a análise discriminante permitiu classificar

corretamente 100% das amostras quando se utiliza o conjunto de amostras de calibração mas
apenas de 93,33% de classificações correctas quando se efectua a validação cruzada (Cross-
validation).

Tabela 5 – Matriz de confusão para as amostras de calibração e para validação cruzada com base nos
parâmetros químicos. Classificações observadas nas linhas, e classificações previstas nas colunas.

Calibração Validação (Cross-validation)

ALV AUC CAO MIR TAB % ALV AUC CAO MIR TAB %
correcta correcta
ALV 3 0 0 0 0 100 2 0 0 0 1 66,67
AUC 0 3 0 0 0 100 0 3 0 0 0 100
CAO 0 0 3 0 0 100 0 0 3 0 0 100
MIR 0 0 0 3 0 100 0 0 0 3 0 100
TAB 0 0 0 0 3 100 0 0 0 0 3 100

22
 3.2.3. Clusters hierárquicos Aglomerativos (AHC)
A aplicação da análise de clusters hierárquicos aglomerativos permite agrupar ou
dividir elementos mediante as semelhanças ou diferenças entre si. Na figura 4, está
representado o dendrograma que mostra a dissimilaridade entre réplicas e locais de
amostragem. Dendrograma

Caom 3
Caom 2
Caom 1
Mirabaga 3
Mirabaga 1
Mirabaga 2
Aucama 2
Aucama 1
Aucama 3
Alvelos 3
Tabuaço 2
Tabuaço 1
Tabuaço 3
Alvelos 2
Alvelos 1

0 5 10 15 20 25
Dissimilaridade

Figura 4 – Dendrograma aplicado aos parâmetros químicos.

Há uma dissimilaridade entre os resultados obtidos, o que permite distinguir os dois

tipos de centrifugação. Todas as réplicas de CAOM são muito semelhantes entre si e o mesmo
acontece para Mirabaga, Aucama e Tabuaço. A réplica, Alvelos 3, é muito semelhante às
réplicas de Tabuaço, sendo Alvelos 1 e Alvelos 2 muito semelhantes entre si. CAOM e
Mirabaga apresentam uma dissimilaridade. Há, então, uma dissimilaridade entre os locais de
amostragem de processos de centrifugação de duas fases. Relativamente a processos de
centrifugação de três fases, há uma pequena dissimilaridade. De um modo geral, ainda que se
possa afirmar que todas as amostras, para os diferentes parâmetros químicos, apresentam um
elevado grau de semelhança, é possível obter uma separação das réplicas e pontos de
amostragem com significância estatística.

23
 3.3. Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier

3.3.1. Análise dos resultados experimentais

Os extractos de acetato de etilo foram analisados através de FTIR-ATR. Na figura 5
estão representados todos os espectros, resultantes da média das três repetições feitas para
cada réplica, obtidos pela técnica de FTIR, entre os 600 cm-1 e 1800 cm-1.
0,3

0,25

0,2

Absorvância
0,15

0,1

0,05

0
1800 1600 1400 1200 1000 800 600
Números de onda (cm-1)
Tabuaço 1 Tabuaço 2 Tabuaço 3 Aucama 1
Aucama 2 Aucama 3 Mirabaga 1 Mirabaga 2
Mirabaga 3 Caom 1 Caom 2 Caom 3
Alvelos 1 Alvelos 2 Alvelos 3

Figura 5 – Espectros obtidos por FTIR de cada réplica (média das repetições) dos diferentes locais de amostragem.

Da análise da figura 5, pode-se dizer que para os extractos obtidos das amostras de
Tabuaço, Aucama, Mirabaga e CAOM os espectros são todos muito semelhantes entre si,
havendo pouca variação dos números de onda para cada pico específico. Com Alvelos, os
espectros obtidos apresentam diferenças, ao nível da absorvância e ao nível do número de
onda, relativamente às outras amostras. Isto pode ser explicado devido à quantidade
insuficiente de amostra obtida por extracção da fracção fenólica para apresentar resultados
estatisticamente coerentes, pelo que na análise da PCA, esta amostra não será considerada
para análise.

As bandas mais relevantes encontram-se na região, denominada fingerprint (790 cm-1-

1900 cm-1, pois estas zonas apresentam características próprias de cada substância,
funcionando como uma impressão digital (Tapp et al., 2003). As bandas a 1728 cm-1e 1712
cm-1 estão relacionados com o grupo funcional carbonilo (C=O) de cetonas, ésteres e ácidos

24
carboxílicos. A banda a 1240 cm-1 está relacionado com as ligações C-O de ésteres, éteres
(normalmente, éteres aromáticos), álcoois e grupos fenol. A banda a 1043 cm-1 está
relacionada com ligações C-O de álcoois primários e secundários, ésteres insaturados e
aromáticos, e éteres aromáticos (Silverstein et al., 2005).

3.3.2. Análise em Componentes Principais (PCA) dos espectros de IV

Nesta análise, o valor de KMO foi de ~0,7 o que sugere que a correlação entre os
dados é considerada “razoável”. Como foi referido anteriormente, não serão apresentados
resultados para Alvelos, pelo que foi feito PCA apenas para quatro pontos de amostragem.

A PCA reduziu o número de variáveis (números de onda) de 600 para 14 componentes

principais que são capazes de explicar 98,8% da variância das amostras. Estas 14
componentes principais possuem Eigenvalues iguais ou superiores a 1, o que nos permite
seleccioná-los para análise.

No gráfico das observações ilustrado na figura 6, o primeiro componente principal

(F1) explica 58,50% da variância, e o segundo componente principal (F2) explica 19,29% da
variância. Isto demonstra que usando apenas dois componentes principais é explicada 77,80%
da variância, ainda que, comparativamente com outras análises, este valor seja inferior.

Observações (eixos F1 e F2: 77,80 %)

20

2 fases

10
Tabuaço

Aucama
F2 (19,29 %)

0 Mirabaga

CAOM

-10

3 fases

-20
-30 -20 -10 0 10 20 30 40 50
F1 (58,50 %)
Figura 6 - Gráfico de observações da análise em componentes principais (PCA) para os dados
obtidos por FTIR nas diferentes réplicas dos locais de amostragem.

25
A partir do gráfico das observações (figura 6), podemos concluir que os espectros, obtidos
pela técnica de FTIR, permitem distinguir as amostras provenientes de pontos de amostragem
diferentes e ainda permite agrupa-las consoante o método usado para extrair azeite.
Nitidamente, no lado negativo da componente F1 aparecem as amostras relativas a processos
de centrifugação de duas fases e no lado positivo da componente F1 aparece a amostra
relativa ao processo de centrifugação de três fases.

Com o objectivo de perceber quais os grupos funcionais que estão associados à

variabilidade entre as amostras, procedeu-se ao cálculo da comunalidade.

Estatisticamente, a comunalidade é definida como a soma dos quadrados das cargas

factoriais correspondentes a todos os componentes principais, para cada variável original.
Desta maneira, as variáveis originais mais importantes são aquelas para as quais a
comunalidade é maior do que 0,6.

No gráfico da figura 7, os números de onda nos intervalos: 1760,7 cm-1 a 1708,63 cm-
1
; 1527,35 cm-1 a 1509,99 cm-1; 1465,64 cm-1 a 1457,93 cm-1; 1375 cm-1 a 1369,22 cm-1;
1282,43 cm-1 a 1274,72 cm-1; 1270 cm-1 a 1236,15 cm-1; 1066,44 cm-1 a 998,95 cm-1; 983,52
cm-1 a 962,31 cm-1 possuem comunalidade superior a 0,6 e, portanto, foram seleccionados
como potenciais números de onda associados à variabilidade entre as amostras.

A banda 1760,7 cm-1 a 1708 cm-1 está associada ao grupo funcional carbonilo (C=O)
de cetonas, ésteres e ácidos carboxílicos. A banda 1527,35 cm-1 a 1509,99 cm-1 poderá estar
associada a ligações C=C aromáticas. As bandas 1465,64 cm-1 a 1457,93 cm-1; 1375 cm-1 a
1369,22 cm-1 e 983,52 cm-1 a 962,31 cm-1 estão associadas a diferentes vibrações do grupo
funcional C-H. As bandas 1282,43 cm-1 a 1274,72 cm-1 e 1270,86 cm-1 a 1236,15 cm-1 estão
associadas a ligações C-O de ésteres, éteres álcoois e grupos fenol. E, finalmente, a banda
1066,44 cm-1 a 998,95 cm-1 poderá estar associada ao grupo funcional C-O de álcoois
primários e secundários, ésteres aromáticos e éteres aromáticos, por exemplo (Silverstein et
al., 2005).

É, então, possível concluir-se que os grupos funcionais indicados acima permitem

explicar as semelhanças químicas existentes entre as amostras.

26
 1,2

0,8

Comunalidade
0,6

0,4

0,2

0
1800,00 1600,00 1400,00 1200,00 1000,00 800,00 600,00
Números de onda (cm-1)
Figura 7 - Gráfico: Comunalidade versus Números de Onda (cm-1)

3.3.3. Regressão por Mínimos Quadrados Parciais (PLS-R) aplicada aos

dados espectroscópicos
O PLS-R foi calculado apenas para o parâmetro polifenóis totais com o objectivo de
avaliar se é possível predizer a concentração de polifenóis totais (Y, variáveis resposta) a
partir das absorvâncias das amostras feitas por FTIR (X, variáveis preditivas). A regressão foi
efectuada nas mesmas regiões de números de onda para as quais a comunalidade foi superior
a 0,6.

A qualidade do ajuste foi determinada pelo erro quadrático médio de calibração

(RMSEC), o coeficiente de determinação múltipla ou coeficiente de regressão (R2, onde R é o
factor de correlação) e pelo erro quadrático médio de validação cruzada (RMSECV).

Para validar os modelos de PLS-R desenvolvidos foi usado o método de validação

cruzada leave-one-out (LOOCV). Neste método, uma amostra é excluída de forma aleatória.
O valor da variável resposta da amostra excluída para polifenóis totais foi calculado com um
modelo construído com as restantes amostras, as variáveis preditivas. Este procedimento foi
repetido até que cada amostra tivesse sido excluída uma vez.

Um valor elevado de R2 e valores baixos de RMSEC e RMSECV significam um bom

desempenho preditivo e uma boa precisão de modelos PLS-R.

Para esta análise, não foi usada a amostra de Alvelos pelas razões supracitadas. A
tabela 6 mostra o desempenho de qualidade do modelo PLS-R para o coeficiente de regressão

27
(R2) e para os erros quadráticos médios de calibração e de validação. Pode-se afirmar que o
modelo PLS-R aqui aplicado apresenta um bom desempenho, devido R2 ser relativamente
elevado e o RMSE ser baixo. A figura 8 mostra a precisão e o desempenho do modelo que
correlaciona os valores medidos experimentalmente com os valores previstos pelo modelo a
partir dos dados de FTIR.

Tabela 6 – Desempenho de qualidade do modelo PLS-R para polifenóis totais.

R² RMSE
Parâmetro
químico
Calibração Validação Calibração Validação

Polifenóis totais 0,931 0,857 33,5 42,7

250 Polifenóis totais y = 1,1548x + 2,1232

previstos R² = 0,9314
Polifenóis totais previstos (Eq (mg/L) Ác. Caféico

200 Polifenóis totais y = 1,3366x + 1,6449

previstos LOOCV R² = 0,8571

150

100

50

0
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Polifenóis totais medidos (Eq (mg/L) Ác. Cafeico)

Figura 8 - Gráfico com os valores previstos pelo método PLS-R e os valores medidos para
polifenóis totais.

28
 3.4. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC)

3.4.1. Identificação de compostos fenólicos

Com o objectivo de identificar compostos fenólicos nas diferentes amostras, utilizou-
se a técnica de HPLC. Na figura 9, a título exemplificativo, estão representados dois dos
cromatogramas obtidos.

Figura 9 - Perfis cromatográficos dos extractos fenólicos de águas ruças a 280 nm de duas réplicas: 1-
Hidroxitirosol; 2-Tirosol; 3-Ácido Ferúlico; 4-Ácido m-cumárico e 5-Oleuropeína para Tabuaço 2; 6-Hidroxitirosol;
7-Tirosol; 8-Ácido Tânico e 9-Oleuropeína para Mirabaga 2.

As águas ruças são um subproduto que contêm um elevado número de substâncias

orgânicas (Zbakh and El-Abbassi, 2012), incluindo os compostos fenólicos que se pretendem
identificar por HPLC. Na análise dos cromatogramas, foi possível verificar que as águas ruças
têm, na sua composição, diversos compostos fenólicos.

29
 Cada cromatograma apresentou em, muitos casos, mais de 50 picos, sendo que cada
pico representará uma substância diferente. Para cada réplica, foram seleccionados no
máximo 16 picos, que apresentavam maior percentagem de área relativa e maiores mAU
(Unidades Arbitrárias). Os tempos de retenção e os espectros UV (ultravioleta) de padrões
externos puros injectados previamente foram comparados com os picos seleccionados dos
cromatogramas com o objectivo de identificar o máximo de compostos fenólicos possíveis.

Recorrendo, então, aos espectros UV de padrões externos puros e respectivos tempos

de retenção, foram identificados sete compostos: Hidroxitirosol, Tirosol, Ácido m-Cumárico,
Ácido Tânico, Ácido Ferúlico, Ácido 3,4,5-trimetoxibenzóico e Oleuropeína. Os dois
primeiros, foram os compostos que mais vezes foram identificados e que apresentaram maior
percentagem de área relativa. Houve muitos outros picos, com percentagens de área relativa
relevante, cuja identificação não foi possível devido à inexistência de padrões para
comparação (Tabela 7).

O hidroxitirosol foi identificado em todas as amostras, excepto Alvelos. Isto pode ser
explicado, em parte, devido à quantidade de amostra disponível usada para a análise, que foi
muito inferior a todas as outras, pelo que a quantidade de amostra usada poderia, porventura,
ter prejudicado a identificação do hidroxitirosol. De realçar que, o hidroxitirosol foi o
composto identificado com maior percentagem de área relativa. Em outros estudos este
composto foi, também, identificado, usando um método de extracção da fracção fenólica com
acetato de etilo (De Marco et al., 2007; Rubio-Senent et al., 2013). O hidroxitirosol está, por
exemplo, associado à diminuição de doenças degenerativas, nomeadamente, à doença de
Alzheimer (Scarmeas et al., 2009). Está, também, associado à formação e manutenção dos
ossos (Hagiwara et al., 2011).

O tirosol foi identificado em todas as amostras, sem excepção. Foi o segundo

composto identificado com maior percentagem de área relativa. Obied e colaboradores (2005)
identificaram tirosol usando diferentes solventes e condições para extrair a fracção fenólica,
entre os quais metanol e hexano, à temperatura ambiente. O tirosol pode actuar como
antioxidante contra a peroxidação lipídica em células do intestino (Deiana et al., 2010).

30
Tabela 7 – Percentagem (%) de área relativa de cada pico para todas as réplicas (ALV-Alvelos; AUC-Aucama; Mira-Mirabaga; TAB-Tabuaço).

Nome Picos TAB 1 TAB 2 TAB 3 AUC 1 AUC 2 AUC 3 MIRA 1 MIRA 2 MIRA 3 CAOM 1 CAOM 2 CAOM 3 ALV 1 ALV 2 ALV3

Hidroxitirosol p1 17,23 21,43 21,83 45,26 44,03 46,82 27,87 24,76 27,78 43,97 52,72 48,41
Tirosol p2 10,39 10,63 5,17 12,58 12,57 14,73 13,67 13,73 14,13 12,30 13,67 14,82 11,26 13,80 14,83
Ácido m-cumárico p3 13,76 2,21 1,01 1,12
Ácido Tânico p4 2,96 1,58 1,41 1,94 1,89 2,01 1,66
Ácido Ferúlico p5 3,62 4,11 12,92 1,18 1,12
Ácido 3,4,5-trimetoxibenzóico p6 0,99
Oleuropeína p7 1,14 3,22 0,23 2,29 2,56 2,68 1,83 1,88
p8 3,09 289,00 4,08 5,42 8,57 9,41 9,52 4,11 4,61 5,04 4,92 2,64
p9 5,04 5,69 3,25
p10 2,63
p11 6,72 6,21 2,45
p12 13,76 13,10 11,61 5,65 5,84 4,81 6,36 8,71 9,24 5,76 4,10 4,74 4,73 4,23 4,05
p13 1,94 1,89 2,01 1,66 1,29 1,39
p14 5,57 6,18
p15 1,43 1,43 3,66 2,77 2,55
p16 10,02 5,57 23,27 1,59
p17 2,96 2,69 1,96 4,92 4,10 3,84 2,70 0,84 1,26
p18 6,41 5,97 6,63 3,01 2,00 2,00 1,25 2,37 2,76
p19 2,11 2,05 1,01 1,12
p20 1,68 2,35 1,70
Desconhecido p21 1,18 1,12
p22 0,64
p23 2,88 2,73 3,85 2,87 4,36 3,33
p24 1,18 1,41 1,04 1,49 1,37 0,26
p25 0,81 1,24 1,23 2,60 2,27 2,24
p26 0,85 1,87 2,79 2,73 1,78 1,62 1,46 1,53 2,27 1,00
p27 1,29 3,71 4,79 5,15 3,99 2,06 3,26 3,38 5,09
p28 7,69 8,27 9,06 6,25 5,73 3,45 5,72 7,03 7,51 5,98 4,97 5,53
p29 7,28 6,82 6,33 6,59 7,47 7,32 1,75 2,61 1,88
p30 66,61 70,43 64,53
p31 3,56 3,77 1,47
p32 6,50 6,02 4,09 2,83 0,59 6,81 8,39 7,23 2,96 0,50 0,99
p33 1,30 4,28 2,28 2,36
p34 1,69 2,57 4,02 4,28

31
 A oleuropeína foi, também um composto fenólico identificado, embora,
maioritariamente, em Aucama, Mirabaga e CAOM, ou seja, proveniente de amostras relativas
a processos de extracção de azeite de duas fases. No entanto, a percentagem de área relativa
destes compostos, é na ordem dos 1 a 3%, ou seja, muito inferior as percentagens obtidas com
o hidroxitirosol e tirosol. A oleuropeína é um dos compostos bioactivos mais importantes, que
actua, por exemplo, contra a hipertensão em paciente em fase 1 (Susalit et al., 2011) ou até
actuar como um cardioprotector (Omar, 2010).

Relativamente às diferenças obtidas entre os tipos de extracção de azeite, o ácido

tânico foi apenas identificado em amostras relativas a processos de centrifugação de duas
fases. O ácido 3,4,5-trimetoxibenzóico foi apenas identificado numa das réplicas de CAOM.
Como foi referido, anteriormente, a oleuropeína foi identificada, na maioria das réplicas de
amostra provenientes de métodos de extracção de azeite de duas fases, sendo só por uma vez
identificado numa das réplicas de Tabuaço. Quanto ao ácido m-cumárico e ao ácido ferúlico,
não foi possível estabelecer qualquer relação com o método usado para extrair azeite.

A fracção fenólica das águas ruças é caracterizada por uma complexidade

significativa, o que também se verificou pelas amostras que analisámos neste estudo. Bianco e
colaboradores identificaram 20 compostos fenólicos, usando HPLC-MS-MS. No entanto, a
composição fenólica varia fortemente entre estudos. Lesage-Meessen e colaboradores (2001)
demonstraram que o conteúdo em hidroxitirosol era superior para sistemas de duas fases.
Visioli e colaboradores (2002) identificaram a oleuropeína como composto maioritário das
águas ruças nas suas investigações. Mas, por outro lado, Allouche e colaboradores (2004)
falharam na identificação desse composto. Estas publicações explicam parcialmente as
diferenças encontradas entre as amostras analisadas neste estudo. Acresce ainda o facto de
que durante o processo de extracção de azeite, a maior parte dos compostos fenólicos se
encontram na polpa da azeitona. Como o processo de obtenção dos extractos pressupôs a
centrifugação da polpa para obtenção do líquido, a composição original pode ter variado. Isto
no que diz respeito às amostras dos lagares de duas fases.

3. 4. 2. Análise em Componentes Principais (PCA) para HPLC

A análise de componentes principais (PCA) permite identificar quais os parâmetros
que mais contribuem para a variabilidade encontrada entre as amostras. Nesta análise, o valor
de KMO (Kaiser-Meyer-Olkin), que correlaciona todas as variáveis entre si, foi de ~0,65 o
que sugere que a correlação entre os dados é considerada “razoável”. Com seis componentes

32
principais, o PCA consegue explicar 92,3% da variância das amostras. Todos os seis
componentes principais possuem Eigenvalues superiores a 1.

No gráfico das observações (Figura 10), resultante da aplicação de PCA, a primeira

componente principal (F1) explica 35,1% da variância e a segunda componente principal (F2)
explica 21,9% da variância. Isto significa que dois componentes principais explicam 57.0%
da variância. Comparativamente com os resultados obtidos análise PCA relativas aos
parâmetros químicos, estes valores podem ser considerados baixos, pois para explicar pelo
menos 95% da variabilidade das amostras seriam necessários mais do que três componentes
principais. No entanto, o gráfico mostra que é possível distinguir as amostras provenientes
dos diferentes locais de amostragem e, ainda, agrupá-las consoante o tipo de processo de
extracção de azeite de duas ou três fases.

Observações (eixos F1 e F2: 56,94 %)

4

Tabuaço 3 3 fases
Tabuaço 1
Mirabaga 2
Tabuaço 2 Mirabaga 1
2 Mirabaga 3
F2 (21,89 %)

0 Aucama 1

CAOM 3 CAOM 1
Aucama 3
Aucama 2
CAOM 2

-2
2 fases
Alvelos 1
Alvelos 2
Alvelos 3

-4
-6 -4 -2 0 2 4 6
F1 (35,05 %)

Figura 10 - Gráfico de observações da análise em componentes principais (PCA) para os dados de HPLC
nas diferentes réplicas dos locais de amostragem.

A componente F1 permite diferenciar as amostras oriundas de processos de

centrifugação de duas ou de três fases. No lado negativo da componente F1, aparecem os de
três fases e no lado positivo da componente F1 aparecem os de duas fases. Os picos que mais
contribuem para esta diferenciação são o tirosol, os ácidos tânico e ferúlico e a oleuropeína.

33
Ainda para este factorial contribuem picos desconhecidos que não foi possível identificar,
devido à inexistência de espectros UV de padrões puros.

A componente F2 separa, claramente, Tabuaço e Alvelos, sendo que Tabuaço aparece

no lado positivo da componente F2 e Alvelos aparece no lado negativo da componente F2. A
componente principal F2 consegue também separar as réplicas de Mirabaga das réplicas de
Aucama e CAOM. Não foi possível identificar os picos que mais contribuíram para essa
diferenciação por não se dispor de padrões externos.

Na análise da figura 11, podemos ver os picos que mais se relacionam entre si. Essa
relação existe entre os picos 3 (Ácido m-cumárico), 5 (Ácido Ferúlico), 12, 16 e 18; entre os
picos 28 e 32; entre os picos 1 (Hidroxitirosol), 4 (Ácido Tânico), 7 (Oleuropeína), 13, 15, 17,
26, 27, 29 e 33; e entre os picos 2 (Tirosol), 6 (Ácido 3,4,5-trimetoxibenzóico), 8, 23, 24. Na
tabela 8, podemos verificar a percentagem com que essas variáveis contribuem para a
distinção e separação das amostras.

Tabela 8 – Contribuições das variáveis (%) de F1 e F2 para cada pico.

Contribuições das variáveis (%)

F1 F2
p1 4,039 0,608
p2 6,004 4,176
Variáveis eixos F1 e F2: 56,94 %)
p3 2,345 2,666 1
p4 8,093 1,244 p12
p28

p5 5,913 5,149 0,75 p32

p18
p6 0,124 0,196 p16
0,5 p5 p33
p7 4,016 0,821 p15
p3 p17
p8 1,090 0,001 0,25
p13
p4
F2 (21,89 %)

p7
p12 2,630 13,753 p1
p29p27
p13 5,512 2,065 0 p8 p26

p15 6,063 4,240 p6

p16 6,197 5,721 -0,25

p24
p23
p17 9,966 2,386 p2
-0,5
p18 4,054 8,615
p23 2,177 1,913 -0,75
p25
p24 2,138 1,609
p25 0,593 13,065 -1
-1 -0,75 -0,5 -0,25 0 0,25 0,5 0,75 1
p26 8,467 0,006
F1 (35,05 %)
p27 7,711 0,126
p28 0,043 16,128 Figura 11 – Relação entre os picos de HPLC e a sua variabilidade.
p29 6,137 0,216
p32 1,782 10,820
p33 4,907 4,478

34
 A análise de PCA dos dados de HPLC contribuem, significativamente, para
diferenciar as amostras estudadas provenientes de lagares de duas ou três fases.
Efectivamente, a identificação dos picos referidos acima, em particular tirosol, os ácidos
tânico e ferúlico e a oleuropeína permitem inferir se a amostra tem origem num lagar de duas
ou de três fases.

3.5. Bioactividade: Antimicrobiana

O teste de difusão em disco foi realizado com o objectivo de avaliar alguma
bioactividade dos extractos fenólicos obtidos das amostras dos lagares de duas e de três fases,
em particular, aferir a sua actividade antifúngica. Este teste, efectuado pela medição da
inibição dos halos de crescimento de microrganismos para além de dar informação fidedigna,
é de execução fácil e rápida. Neste teste avaliou-se a possível actividade antifúngica de
extractos de amostras de efluentes dos lagares de duas e três fases obtidos por acetato de etilo
usando espécies de Candidaceae. Candida albicans patogénica para o homem, Candida
parapsilosis, espécie oportunista e Candida oleophila, não patogénica, isolado selvagem
obtido a partir de amostras de águas ruças.

Diversos estudos realizados como o de Obied e colaboradores (2007), demonstraram

que a fracção fenólica das águas ruças apresenta actividade anti-bacteriana contra
Staphylococus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa. Capasso
e colaboradores (1995) demonstraram que os polifenóis de águas ruças têm actividade
antimicrobiana contra bactérias patogénicas.

Na figura 12 estão representados 3 exemplos de resultados obtidos para o teste de

difusão em disco para cada uma das espécies. Foram analisadas as três réplicas de cada uma
das amostras para os três tipos de leveduras.

Na observação das placas, constatou-se que não houve formação de halos de inibição
para nenhuma das espécies testadas. Estes resultados não eram os esperados para as espécies
Candida albicans e Candida parapsilosis, pois são espécies patogénicas e oportunistas,
respectivamente, e como tal deveriam apresentar halos de inibição devido às propriedades
antifúngicas de fenóis identificados em águas ruças (Brenes et al., 2011).

35
 Figura 12 - Caixas de Petri com culturas puras de Candida albicans, Candida parapsilosis e Candida oleophila,
respectivamente, usadas no teste de difusão em disco.

Para a levedura Candida oleophila, os resultados observados eram expectáveis, visto

que esta levedura resulta de um isolado obtido a partir de águas ruças, e portanto, não era
esperado que houvesse formação de halos de inibição. Amaral e colaboradores (2012)
demonstraram que houve uma redução de 83% do conteúdo fenólico usando C.oleophila no
tratamento de águas ruças. Portanto, se os fenóis foram “consumidos” por esta levedura, não é
esperado que os compostos fenólicos extraídos com aceto de etilo para as cinco amostras
apresentassem actividade antifúngica.

Ainda que não se tenha obtido inibição do crescimento para estas espécies de
microrganismos, isso não significa que os extractos obtidos com acetato de etilo neste
trabalho, não apresentem actividade antibacteriana (Obied et al., 2007), investigação que
deverá ser efectuada no futuro.

Por outro lado, Endo e colaboradores (2010) testaram a actividade antifúngica de

extractos obtidos a partir da romã contra Candida albicans e C. parapsilosis.

Neste estudo, estes investigadores não obtiveram inibição usando extractos de per si,
mas quando combinado com fluconazole, o composto maioritário dos extractos, punicalagina,
potenciou a formação de halos de inibição para a levedura Candida albicans. Será, portanto,
interessante testar a combinação do fluconazole com os extractos fenólicos por nós obtidos,
para se saber se esta combinação apresenta, ou não, o mesmo tipo de resultados.

36
4. Conclusões e perspectivas futuras
Com este trabalho pretendeu-se analisar amostras de águas ruças provenientes de dois
tipos de processos de centrifugação diferentes de cinco locais de amostragem na região de
Trás-os-Montes e Alto Douro.

Conclui-se que utilização da metodologia de extracção líquido/líquido e a escolha do

solvente acetato de etilo revelou-se de eficácia elevada e baixa complexidade, pelo que a sua
utilização é recomendada para a obtenção extractos de águas ruças.

Na caracterização química das amostras, concluiu-se que foi possível distinguir as

diferentes amostras provenientes de lagares de três fases e de duas fases recorrendo à análise
em componentes principais (PCA), à análise discriminante linear e aos clusters hierárquicos
aglomerativos. Os resultados mostraram, ainda, que todas as amostras são diferentes entre
elas. Aucama foi o ponto de amostragem que apresentou maiores diferenças relativamente a
todas as outras. Concluiu-se, também, que os parâmetros químicos, polifenóis e os orto-
difenóis, são os responsáveis pela diferenciação entre amostras.

Concluiu-se, que os espectros de FTIR tratados estatisticamente por PCA, também

permitem distinguir amostras entre si, além da clara distinção das amostras oriundas de
lagares de duas ou de três fases, mostrando que, embora os espectros IV apresentem bandas
que são muito idênticas entre as diferentes réplicas de cada amostra, todas elas são
significativamente diferentes entre si. Portanto, o FTIR é uma metodologia expedita de
caracterização das fracções fenólicas com potencial bioactivo, quando associada a avaliações
quimiométricas.

Concluiu-se, também, que os compostos fenólicos identificados por HPLC são

diferentes entre amostras que são provenientes de processos de centrifugação de duas e de três
fases. Concluiu-se que quem contribui maioritariamente para diferenciar as amostras são os
picos desconhecidos, embora o tirosol, os ácidos tânico e ferúlico e a oleuropeína tenham uma
grande contribuição para essa diferenciação. Portanto, seria interessante saber, em estudos
futuros, quais os compostos, dos que não foi possível identificar, que mais contribuíram para
esta distinção de processos de centrifugação de duas e de três fases.

A avaliação da actividade antifúngica realizada permitiu concluir que as leveduras

usadas não foram susceptíveis aos extractos fenólicos obtidos com acetato de etilo, pelo que
não apresentaram actividade antifúngica contrariamente ao esperado. No entanto, no futuro,

37
seria interessante saber que condições podem ser alteradas para potenciar o aparecimento de
resultados positivos.

Este trabalho permitiu concluir que os métodos seleccionados caracterizam de forma

fidedigna as amostras analisadas e que com uso da quimiometria permitiu fazer uma análise
mais cuidadosa dos resultados e uma interpretação mais completa dos resultados.

38
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