Geração in vitro de anticorpos monoclonais

de coelho anti-Listeria monocytogenes

utilizando sistemas de expressão sem
células com base em RT-PCR de célula única”

cTeruyo Ojima-Kato a,b, ⁎, Dai Hashimura b , Takaaki Kojima b , Shiori

Minabe b , Hideo Nakano b, ⁎⁎

MARIANA FERREIRA E TATIANA ALVES

 Introdução

OBJETIVO MOTIVO MÉTODO

Obtenção de mAbs ( Anticorpos Os anticorpos monoclonais

de coelho têm vantagens
SICREX
monoclonais de coelho)
Sistema “Single-Cell Reverse
anti-L. monocytogenes pelo sobre os de rato devido
Transcription-PCR
método SICREX à sua maior afinidade
linked in vitro- Expression
Expressão de mAbs como forma
sscFv no citoplasma de
E. coli para utilizações práticas. Rápida geração e avaliação de mAbs derivados
Porque não se usa sempre de células B individuais específicas de
anticorpos de coelho?
antigénios no sangue periférico de animais
imunizados sem cultivo de células de mamíferos.

 Introdução
O QUE SÃO MABS?
Os anticorpos monoclonais (mAbs) são instrumentos essenciais nos domínios da
investigação terapêutica, de diagnóstico e biológica.

QUAL O MÉTODO MAIS COMUM?

O método do hibridoma de ratinho é uma abordagem tradicional e mais amplamente utilizada

para obter mAbs de ratinho.

EM QUE SE BASEIA? QUAL O PROBLEMA?

Baseia-se na fusão celular de Apesar de haver várias técnicas
células do baço com linhas que permitem uma melhor afinidade,
celulares de mieloma imortal estas são complicadas e demoradas
 DESTA FORMA SURGE O
SICREX

RESUMO DA TÉCNICA

O QUE PERMITE?
A avaliação da afinidade de
mAbs derivados de células B
individuais específicas
de antigénio no sangue
periférico de animais
imunizados em poucos dias.
Isolamento das células individuais
ANTIGÉNIO
UTILIZADO
1º PARTE 2º PARTE
Imunização Expressão de scFV in vivo
Isolamento das células B
Purificação de scFVs
Triagem das células B específicas do antigénio
com micromanipulador
RT-PCR e amplificação de anticorpos
Contrução de fragmentos de DNA para expressão livre das células
CFPS- Síntese protéica sem células dos genes do anticorpo

Listeria monocytogenes
ELISA
 MÉTODO
1 IMUNIZAÇÃO

Imunização com 5x10^8 células

de L-monocytogenes em PBS
( +2,5 ml de FREUND completo)
por injeção hipodérmica.

Reforço nos seguintes períodos:

+2 semanas
+10 dias
+2 dias

AMOSTRA RECOLHIDA
 MÉTODO
2 ISOLAMENTO DAS CÉLULAS B

Centrifugação AMOSTRA RECOLHIDA

em gradiente
1ml suspensão de linfócitos ( 10^6 células)
+
ç ão 5 ul de DynaBeads M-280
Fração de Linfócitos u ga a
r if tid
nt pe Recolhidos Contados Incubação
e
C re
t(m)_2m
TºC- Ambiente
Camada Linfócitos +
Superior Células B

Células não Células B específicas

específicas do antigénio
ELISA

Descartadas Recolhidas
 MÉTODO
2 ISOLAMENTO DAS CÉLULAS B

Recolhidas
Com esferas magnéticas Parte-se as pontas Células B
revestidas de antigénio para tubos de PCR
isoladas
Incubação

Coletadas sobre a forma As pontas dos capilares

de complexo pérola-célula contêm células B
Preparação de pontas de vidro de
Com células B
microcapilares através de moldagem
preparadas
ISOLAMENTO de tubos de vidro com extrator
Incubação
Complexos de grânulos Células B são libertadas por
t(h)- 1h
L-monocytogenes e células B sucção da ponta de um
foram coletadas capilar pelo fenómeno capilar
 MÉTODO
3 RT-PCR E AMPLIFICAÇÃO DE GENES DE ANTICORPOS

Células B
isoladas

RT-PCR
COMO FOI FEITA COMO SE OBTEM QUAL O USO?
A LIGAÇÃO? T7P E T7T?

0,5 ul

Reação de ligação com Amplificação apartir de Síntese de Fab usando a

PCR de sobreposição pRSEb com um primer expressão livre de células
1º Etapa 2º Etapa

Obtêm-se fragmentos
Ligam-se mais 2 fragmentos Obtêm-se dsDNA
de DNA de anticorpo
de DNA contendo T7P e T7T de HC e Lc ( genes)
 MÉTODO
3 RT-PCR E AMPLIFICAÇÃO DE GENES DE ANTICORPOS

Obtêm-se dsDNA E COMO CONSTRUÍMOS O FRAGMENTO scFv?

de HC e Lc ( genes)

As regiões VL e VH são conectadas com uma sequência

ligante ao fragmento de DNA do anticorpo
QUAL O USO?

VL e VH são
Síntese de Fab usando a
amplificados
expressão livre de células

Os produtos do PCR purificados são Fragmentos T7P e T7T

colocados com o PCR sobreposto para foram ligados pelo
construir o VL-linked-VH-fragmento mesmo procedimento
 MÉTODO
4 CFPS- SÍNTESE PROTEICA SEM CÉLULAS DOS GENES DOS ANTICORPOS

Fragmentos T7P e T7T

COMO CONSIGO FAZER SÍNTESE PROTEICA CFPS
foram ligados pelo
SEM CÉLULAS DOS GENES DO ANTICORPO?
mesmo procedimento

Usamos Extrato S30 do BL21 Star

porque a produção do Fab do
COMO DETETAR A PROTÉINA?
camandungo 6D9 foi melhor.

Incorporar 1/100 do volume de

Várias incubações e posterior
reação de Lys tRNA fluorescente
análise por SDS-Page
na mistura de reação.
 MÉTODO
5 ELISA

Antigénio- L-monocytogenes preparados na imunização

Anticorpo primário- Produto livre de células ou lisado celular - 1 Ab

Anticorpo secundário- Anti-coelho I ( G +M), conjugado com HRP produzido em cabra

QUAL O TIPO DE
Indireta
ELISA PRESENTE?
 MÉTODO
5 ELISA

Cada poço de 96 poços Maxisorp Incubação Os poços são preenchidos

foi revestido com 50 ul de TºC- 4ºC com 4 w/ v % Block Ace
suspensão celular de OD t- O/N
Adição do lisado
de células

Para que? Incubação

TºC- T/A
Bloquear a placa para t (h)- 1.5h
impedir que o Adição de 50 ul de anti-coelho I ( G + M)
anticorpo se ligue. conjugado com HRP produzido em cabra

Para que? Incubação Incubação

Adição de 50 ul

TºC- T/A TºC- T/A
de 1 M H 2 SO4
Parar a reação t (m)- 10m t (h)- 1.5h

Adição de 50 ul de solução contendo 2 mg/mL

de ( OPD, Wako) com 0,009% de H2O2
 MÉTODO
6 2º PARTE- EXPRESSÃO SCFV IN VIVO

Plasmídeo de expressão para scFV

Vizualização da scFV nas
em E.Coli é construido usando
proteínas é feita por SDS-PAGE
a técnica de Gibson

Em que consiste Como verificamos?

a técnica?

Análise- Estudos de ligação
Trasnformar a E.Coli de scFVs purificados
foram realizados com
base na Bio-Layer
Interfenometry
 Resultados
COLETA DE CÉLULAS B ESPECÍFICAS DE
L-MONOCYTOGENES COM MICROMANIPULADOR

Os resultados da ELISA mostraram que o antissoro de coelho imunizado tinham atividade de

ligação 5x superior para L-monocytogenes do que antissoro de coelho antes da imunização.
 Resultados
AMPLIFICAÇÃO DE GENES DE ANTICORPOS
DE CÉLULAS B ÚNICAS

O clone 4 e 9 foram expressos por CFPS para originar Fab no entanto não mostraram a
afinidade desejada para o antigénio em ELISA.
 Resultados
AMPLIFICAÇÃO DE GENES DE ANTICORPOS
DE CÉLULAS B ÚNICAS

O clone 4 e 9 foram expressos por CFPS para originar Fab no entanto não mostraram a
afinidade desejada para o antigénio em ELISA.

PORQUE?
Houve uma menor formação de
ligações dissulfito entre os genes Lc e Hc
para a L-monocytogenes no caso da
forma Fab nos clones 4 e 9. No caso da
forma scFv sintetizada por CFPS,
mostraram afinidade de ligação.
 Resultados
EXPRESSÃO IN VIVO SELECIONADO

Os scFvs foram expressos com sucesso no citoplasma da E.Coli.

Os ScFVs nº4 e 9 foram

Os scFVs produzidos na E.coli
predominantemente expressos
foram purificados como uma
como banda proteica que foram
única banda como mostra a figura
detetados por SDS-PAGE

Resumindo os scFVs mostraram As bandas inferiores detetadas

alta afinidade para anticorpos em todas as faixas podem
de L-monocytogenes ser produtos degradados.
 DISCUSSÃO

MÉTODO EXPRESSÃO DE
SICREX SCFVS IN VIVO
 Conclusão
Os anticorpos cmonoclonais de coelho para a L.monocytogenes foram gerados com
sucesso apartir de células B únicas no sangue periférico de coelho mélo método SICREX.

Esses anticorpos monocloanis foram produzidos com sucesso na forma ativa no

citoplasma da cepa E.Coli Shuffle T7 Express.

Inicialmente 13 células B foram coletadas

e 6 pares de genes mABS foram amplificados.
3 pares produzidos em E.Coli tiveram
afinidade suficiente ao antigénio.
OBRIGADO!
MARIANA FERREIRA
TATIANA ALVES