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Todos os direitos desta edição são reservados à Sociedade Brasileira de Genética.

Comissão Editorial Sociedade Brasileira De Genética

Editor
Élgion Lúcio Silva Loreto
Universidade Federal de Santa Maria

Comissão Editorial
Carlos Frederico Martins Menck
Universidade de São Paulo

Louis Bernard Klaczko

Universidade Estadual de Campinas

Marcio de Castro Silva-Filho

Universidade de São Paulo

Maria Cátira Bortolini

Universidade Federal do Rio Grande do Sul

Marcelo dos Santos Guerra Filho

Universidade Federal de Pernambuco

Pedro Manoel Galetti Junior

Universidade Federal de São Carlos

Introdução ao mundo dos microRNAs / Tiago Campos Pereira

(Organizador). – Ribeirão Preto: Sociedade Brasileira de Genética,
2015.
342 p. : il.

ISBN 978-85-89265-21-8

1. miRNA, RISC, Dicer, Drosha, silenciamento gênico, RNAi, genética.

Rua Cap. Adelmio Norberto da Silva, 736

14025-670 - Ribeirão Preto - SP
16 3621-8540 | 16 3621-3552
Uma introdução ao
mundo dos microRNAs

No século passado observamos grandes avanços ligados à biologia molecular. Da

descoberta da estrutura do DNA aos finos mecanismos de regulação gênica, muitos foram
os achados. Os microRNAs foram inicialmente descritos na década de 90 e desde 2000 se
fala em seus papéis como reguladores biológicos. Pesquisas têm demonstrado a participação
destas moléculas em doenças diversas - dentre elas, o câncer.
A progressão das pesquisas científicas e clínicas está diretamente ligada ao avanço
tecnológico. Por isso é tão importante a busca por soluções inovadoras, que possam diminuir
o tempo e os custos na obtenção dos dados. Nós, da GeneSeq, sabemos que cientistas bem
amparados podem ir mais longe! Por isso, temos auxiliado diversos pesquisadores em
projetos envolvendo sequenciamento em larga escala e bioinformática, com soluções em
genômica, transcriptoma e regulação epigenética. Também atuamos nas áreas de Oncologia
e Reprodução Humana, com testes e painéis abrangentes, que atendem às demandas dos
profissionais de saúde.
E para oferecer serviços com excelência, procuramos por parceiros que fossem
referência no assunto. Assim nos tornamos representantes da BGI International. Com bases
espalhadas ao redor do mundo, esse grande centro tem história e fez parte do Projeto de
Sequenciamento do Genoma Humano. A expertise acumulada ao longo dos anos se reflete
na estrutura única da BGI: além de instalações modernas e bem equipadas, esse centro tem
um corpo científico de peso e importantes certificações internacionais. Isso significa que
todos os procedimentos passam por controles de qualidade bem estabelecidos. Por isso, os
ensaios são exatos e precisos, o que garante a confiabilidade dos dados. E nós, da GeneSeq,
ficamos felizes por oferecer essa opção segura aos profissionais brasileiros.
Queremos, assim, participar desse novo e empolgante momento da biologia molecular,
facilitando a vida dos pesquisadores e trazendo soluções a um custo acessível. É por acreditar
na ciência que decidimos nos lançar nesta empreitada. Pela mesma razão, apoiamos este livro,
que traz informações relevantes aos pesquisadores da área, de uma forma descomplicada
e clara. Esperamos contribuir também com as suas pesquisas. Desejamos a todos uma boa
leitura!

Saiba mais. Visite nosso site:

www.geneseq.com.br
Você também pode nos contatar via email:
Dando sequência à vida.
contato@geneseq.com.br
Lista de abreviaturas,
acrônimos, siglas e símbolos

µg: micrograma (10-6 grama).

3’ UTR (3’ Untranslated Region): região 3’ não traduzida.
5’ RACE (Rapid Amplification of cDNA End): amplificação rápida do DNA
complementar (referente à) extremidade 5’ (do RNA mensageiro).
5’ UTR (5’ Untranslated Region): região 5’ não traduzida.
aa: aminoácido.
AGO: argonauta.
AM: aprendizagem de máquina.
AMFE (Adjusted Minimum Free Energy): menor energia mínima livre ajustada.
amiR (artificial microRNA): microRNA artificial.
CAP: 7 metilguanosina trifosfato.
ceRNA (competing endogenous RNA): RNA endógeno competidor.
circRNA (circular RNA): RNA circular.
CLASH (Cross-linking, Ligation and Sequencing of Hybrids): ligação cruzada
(mediada por luz ultravioleta seguida por) ligação (convencional) e sequenciamento de
híbridos.
cmiRNA (canonical miRNA): microRNA canônico.
CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats): repetições
palindrômicas pequenas regularmente espaçadas e agrupadas.
D-bodies (Dicing bodies): corpúsculos (nucleares) de processamento.
DCL (dicer-like): semelhante à enzima dicer.
DIG: digoxigenina.
diRNA (double-strand break interacting RNA): RNA de interação com DNA
apresentando quebra de dupla fita.
dsRBD (double-stranded RNA Binding Domain): domínio de ligação a RNA de
dupla fita.
dsRBP (double-stranded RNA Binding Protein): proteína de ligação a RNA de dupla
fita.
dsRNA (double-stranded RNA): RNA de dupla fita.
e.g. (do Latin, exempli gratia): por exemplo.
g: aceleração da gravidade (9,8 metros por segundo ao quadrado)
g: grama
GMUCT (Genome-wide Mapping of Uncapped and Cleaved Transcripts): mapeamento
em escala genômica de transcritos clivados e sem CAP.
 h: hora(s)
HITS-CLIP (High-Throughput Sequencing of RNA isolated by Cross-linking
Immunoprecipitation): sequenciamento em larga escala de RNAs isolados por ligação
cruzada (mediada por luz ultravioleta) e imunoprecipitação (da proteína argonauta).
i.e.: (do Latin, id est): isto é.
iCLIP (individual-nucleotide resolution Cross-Linking Immunoprecipitation):
resolução em nível nucleotídico (obtida após) ligação cruzada (mediada por luz ultravioleta)
e imunoprecipitação (da proteína argonauta).
isomiRs: isômeros de microRNAs.
KO (Knock Out): nocaute.
lmiRNA (long miRNA): microRNA longo (~24 nucleotídeos).
LNA (Locked Nucleic Acid): ácido nucleico “fechado”.
lncRNA (long noncoding RNA): RNA longo e não codificador (de proteínas).
M: molar
MBS (MicroRNA Binding Site): sítio de ligação ao miRNA.
MFE (Minimum Free Energy): energia livre mínima.
MFEI (Minimum Free Energy Index): índice de energia livre mínima.
miPEP (microRNA-encoded peptide): peptídeo codificado por (um transcrito primário
de) microRNA.
miR BS (microRNA Binding Site): o mesmo que MBS.
miRISC (microRNA-Induced Silencing Complex): complexo de silenciamento
induzido pelo miRNA maduro.
miRNA*: microRNA estrela.
miRtron: fusão dos termos miRNA e íntron.
mm: milímetro(s)
moRNAs (miRNA offsets): miRNAs “deslocados”.
MRE (MicroRNA Response Element; MicroRNA Recognition Element): o mesmo
que MBS.
ncRNA (non-coding RNA): RNA não codificador (de proteínas).
NGS (Next Generation Sequencing): sequenciamento de última geração.
nt: nucleotídeo(s).
oligo-dT: oligômero de desoxitimidina monofostato.
oncomiR: fusão dos termos oncology e miRNA.
ORF (Open Reading Frame): fase aberta de leitura.
PAR-CLIP (Photoactivatable-Ribonucleoside-enhanced Cross-linking Immuno
precipitation): ligação cruzada (mediada por luz ultravioleta) aprimorada pelo uso de
ribonucleosídeos fotoativáveis (seguida por) imunoprecipitação (da proteína argonauta).
PARE (Parallel Analysis of RNA Ends): análise em paralelo de extremidades de RNA.
pb: par(es) de bases
P-bodies (Processing Bodies): corpos (citoplasmáticos) de processamento.
 pg: picograma (10-12 grama)
piRNA (PIWI-interacting RNA): RNA de interação com a proteína PIWI.
Poli-A: polímero de adenosina monofosfato.
pre-miRNA (precursor microRNA): microRNA precursor.
pri-miRNA (primary microRNA): microRNA primário.
qiRNA (QDE-2 interacting RNA): RNA de interação com a proteína QDE-2.
qPCR (quantitative Polymerase Chain Reaction): reação em cadeia e quantitativa
da (DNA) polimerase.
RdRP (RNA-dependent RNA Polymerase): RNA polimerase dependente de RNA.
RIP-Chip (Ribonucleoprotein Immunoprecipitation-microarray): imunoprecipitação
de ribonucleoproteínas (contendo a proteína argonauta, seguida de análise por) microarranjos.
RISC (RNA-Induced Silencing Complex): complexo de silenciamento induzido por
RNA.
RITS (RNA-Induced Transcriptional Silencing complex): complexo de silenciamento
transcricional induzido por RNA.
RLC (RISC-Loading Complex): complexo de carregamento do RISC.
RT (Reverse Transcription): transcrição reversa.
RT-PCR (Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction): transcrição reversa
seguida pela reação em cadeia da (DNA) polimerase.
RT-qPCR (Reverse Transcription – quantitative Polymerase Chain Reaction):
transcrição reversa seguida pela reação em cadeia da (DNA) polimerase, de natureza
quantitativa.
scanRNA (scanning RNA): RNA de varredura.
siRISC (small interfering RNA-Induced Silencing Complex): complexo de
silenciamento induzido pelo pequeno RNA de interferência.
siRNA (small interfering RNA): pequeno RNA de interferência.
smRNA (small RNA): pequeno RNA.
SNP (Single Nucleotide Polymorphism): polimorfismo de um único nucleotídeo.
stRNA (small temporal RNA): pequeno RNA (de controle) temporal.
SVM (Suport Vector Machine): máquina de vetores de suporte.
TAP-Tar (Tandem Affinity Purification of miRNA Target mRNAs): purificação por
afinidade, e em tandem, de mRNAs alvos de miRNAs.
tasiRNA (trans-acting small interfering RNA): pequeno RNA de interferência de
ação em trans.
TE (Transposable Element): elemento transponível.
TGS (Transcriptional Gene Silencing): silenciamento gênico transcricional.
tRFs (transfer RNA-derived Fragments): fragmentos derivados de RNA transportador.
tRNA (transfer RNA): RNA transportador.
(Delta Delta Cycle threshold): diferença da diferença do ciclo de limiar.
Sumário

Prefácio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

Capítulo 1. Histórico dos microRNAs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

Dr.a Ernna Herida Domingues de Oliveira, Dr.a Daniela Zimbardi,

Tiago Jorge Alves de Souza, Gustavo Borges, Gabriel José de Carli e
Prof. Dr. Tiago Campos Pereira

1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

1.1 C. elegans – um modelo de pesquisa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

1.2 O controle do desenvolvimento larval de C. elegans. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

2. lin-4: o primeiro microRNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

3. O primeiro breakthrough: lin-4 é caracterizado

como um pequeno RNA regulatório . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

3.1 lin-4 controla outros alvos: lin-28 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

3.2 Mecanismo de ação de lin-4. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

4. O segundo breakthrough: outro miRNA é identificado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

5. O terceiro breakthrough: miRNAs são evolutivamente conservados . . . . . . . . . . . . 28

6. O quarto breakthrough: microRNAs são abundantes na natureza . . . . . . . . . . . . . . 30

7. O trio de artigos seminais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

7.1 Artigo 1: Abundância de miRNAs em C. elegans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

7.2 Artigos 2 e 3: miRNAs em diversas espécies e seus padrões de expressão. 31

Capítulo 2. Origem e Evolução de MicroRNAs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

Prof. Dr. Danillo Pinhal, Pedro Gabriel Nachtigall, Arthur Casulli de

Oliveira, Luiz Augusto Bovolenta, Marcos Edgar Herkenhoff

1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
2. Origem e expansão do repertório de miRNAs nos organismos. . . . . . . . . . . . . . . . . 34
3. Organização genômica de miRNAs em animais e plantas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
3.1 MiRNAs intergênicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
3.2 MiRNAs intrônicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
3.3 MiRNAs exônicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
3.4 Clusters de miRNAs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
3.5 A importância da organização genômica em análises filogenéticas. . . . . . 43
4. O genoma como substrato para a gênese de novos miRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
4.1 Duplicação gênica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
4.2 Duplicação genômica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
4.3 De novo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
4.4 Íntrons. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
4.5 Pseudogenes, snoRNAs e tRNAs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
4.6 Elementos transponíveis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
4.7 Transcritos antissenso de miRNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
5. Mecanismos de diversificação dos transcritos de miRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
5.1 Alteração da região seed e isomiRs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
5.2 Edição de miRNA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
5.3 Alteração de braço de leitura de miRNAs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
5.4 Mudança de hairpin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
6. Considerações finais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

Capítulo 3. Regulação da abundância de miRNAs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

Ighor L.G. Arantes, Prof.a Dr.a Maité F.S. Vaslin,

Carolina Alves Pereira Corrêa, Prof. Dr. Tiago Campos Pereira e
Prof. Dr. Régis L. Corrêa

1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
2. Seção A – Biogênese e sua regulação. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
 2.1 A transcrição de microRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
2.1.1 Regulação da transcrição . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
2.2 Processamento do pri-miRNA em pre-miRNA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
2.2.1 Regulação do processamento por DROSHA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
2.3 Exportação para o citoplasma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
2.4 Processamento do pre-miRNA no citoplasma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
2.4.1 Regulação do processamento por DICER . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
2.5 Processamento de miRNAs em plantas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
2.6 Modificações pós-transcricionais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
2.6.1 Regulação através da cauda. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
2.6.2 Edição de RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
2.6.3 Metilação. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
2.7 Formação do complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). . . . . . 76
2.7.1 Regulação das proteínas AGO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
2.7.2 Regras para a seleção da fita guia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
2.8 Vias não canônicas de biogênese. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
3. Seção B – Degradação e sua regulação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
3.1 Degradação de miRNAs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
4. Considerações finais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81

Capítulo 4. Nomenclatura de microRNAs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

Prof. Dr. Francis de Morais Franco Nunes

1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
2. A biogênese dos miRNAs e sua relação com a nomenclatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
3. A nomenclatura e os bancos de dados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
4. Convenções. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
5. Submissão de sequências para os bancos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
6. Conceitos de “família de microRNAs”. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
Capítulo 5. Mecanismos de ação de microRNAs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95

Prof. Dr. Tiago Campos Pereira, Cristiane de Santis Alves,

Geraldo Felipe Ferreira e Silva, Fausto Andrés Ortiz-Morea e
Prof. Dr. Fábio Tebaldi Silveira Nogueira

1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
2. A maquinaria de silenciamento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
3. Mecanismos de ação de microRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
3.1 Visão geral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
3.2 Processos de inibição da tradução. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .97
3.2.1 Competição pelo 5’ CAP. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
3.2.2 Inibição da montagem dos ribossomos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98
3.2.3 Deadenilação seguida pelo bloqueio da iniciação da tradução. . . 98
3.2.4 Dissociação prematura de ribossomos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
3.2.5 Redução da velocidade de elongação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
3.2.6 Proteólise durante a fase de elongação. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
3.3 Desestabilização do RNA-alvo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
3.3.1 Clivagem do transcrito-alvo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
3.3.2 Deadenilação seguida de remoção do 5’ CAP. . . . . . . . . . . . . . . . . 100
3.4 Silenciamento transcricional. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
3.4.1 Metilação do DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
3.4.2 Modificações da cromatina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .101
3.5 Promoção da transcrição . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
3.6 Aumento da eficiência de tradução. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
4. Concentração espacial da maquinaria de silenciamento gênico. . . . . . . . . . . . . . . 103
4.1 Corpúsculos de processamento de RNA (P-bodies) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
4.2 Retículo endoplasmático. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
5. Conclusões . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
Capítulo 6. MicroRNAs virais e miRNAs celulares contra vírus. . . . . . . . . . 107

Prof. Dr. Ivan de Godoy Maia, Dr. Douglas Silva Domingues,

Dr.a Helena Sanches Marcon

1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
2. MicroRNAs codificados pelos vírus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
3. O papel dos miRNAs modulando a interação vírus-hospedeiro . . . . . . . . . . . . . . . 111
3.1 A influência na longevidade das células infectadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112
3.2 A modulação da resposta imune do hospedeiro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
3.3 A regulação da expressão viral e do hospedeiro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
4. MicroRNAs celulares em resposta a vírus em animais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
5. MicroRNAs celulares em resposta a vírus em vegetais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .115
6. Conclusões e perspectivas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116

Capítulo 7. MicroRNAs e desenvolvimento vegetal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119

Eder Marques da Silva, Edna Gicela Ortiz Morea,

Carlos Hernán Barrera Rojas, Prof. Dr. Fábio Tebaldi Silveira Nogueira

1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
2. MicroRNAs e a transição de fase juvenil para fase adulta em vegetais . . . . . . . . . 122
3. MicroRNAs e desenvolvimento foliar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123
4. Papel dos microRNAs na iniciação e desenvolvimento de órgãos reprodutivos. . 128
4.1 MiR172 atuando na regulação de genes de identidade floral . . . . . . . . . . 129
4.2 A via miR159/GAMYB-like é funcional ao longo do desenvolvimento das
anteras e também atua no tempo de florescimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130
4.3 Interação entre vias reguladas por microRNAs durante o desenvolvimento
floral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
5. MicroRNAs e desenvolvimento de frutos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
6. MicroRNAs e seus efeitos na formação e desenvolvimento do sistema radicular.133
6.1 MicroRNAs e seus efeitos na formação da raiz principal. . . . . . . . . . . . . . 134
6.2 MicroRNAs e seus efeitos funcionais na formação e desenvolvimento de
raízes laterais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
6.3 Correlação dos microRNAs com fatores ambientais no desenvolvimento do
sistema radicular. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
7. Outros aspectos relacionados ao desenvolvimento vegetal. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138
8. Desafios e perspectivas das pesquisas
relacionadas aos microRNAs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139
Capítulo 8. MicroRNAs em insetos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147

Felipe Martelli, Natália Helena Hernandes, Dr.a Camilla Valente Pires1,

Prof.a Dr.a Zilá Luz Paulino Simões, Prof. Dr. Francis Morais Franco Nunes

1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148

2. Ativação do genoma zigótico e embriogênese. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151

3. Regulação do desenvolvimento e da metamorfose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152

4. Regulação do crescimento celular e corporal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153

5. Regulação de apoptose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153

6. Manutenção e diferenciação de células da linhagem germinativa. . . . . . . . . . . . . 154

7. Regulação do desenvolvimento do sistema nervoso. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155

8. Regulação do tempo de vida e envelhecimento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155

9. Regulação do sistema imune . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156

10. Regulação da relação inseto vetor-parasita. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157

11. Efeito sobre variações fenotípicas populacionais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157

12. Regulação do dimorfismo sexual e comportamento reprodutivo. . . . . . . . . . . . . . 158

13. Regulação do comportamento social. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .158

14. MicroRNAs na alimentação larval e na determinação de castas. . . . . . . . . . . . . . . 159

15. Considerações finais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 160

Capítulo 9. miRNAs na fisiologia humana. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165

Dr. Cesar Seigi Fuziwara, Prof.a Dr.a Carolina Beltrame Del Debbio e
Prof.a Dr.a Edna Teruko Kimura

1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166

2. MiRNAs na fisiologia humana – visão geral. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167

3. Tecido Muscular Cardíaco e Esquelético . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169

3.1 Coração. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169

3.1.1 Remodelamento cardíaco. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 170

3.2 Músculo esquelético . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 170

4. Cérebro: Desenvolvimento e plasticidade sináptica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .171

5. Conclusões . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173
Capítulo 10. Implicações patológicas da desregulação de microRNAs. . . 177

Dr.a Danyella B. Dogini, Dr. André S. Vieira, Simoni H. Avansini,

Alexandre H. Berenguer de Matos, Prof.a Dr.a Iscia Lopes-Cendes.......... 177

1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178
2. MicroRNAs nas doenças neurológicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 179
2.1 As epilepsias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 179
2.2 A doença de Alzheimer. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 180
2.3 A doença de Huntington. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181
3. MicroRNAs e os transtornos psiquiátricos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 182
3.1 A Esquizofrenia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 182
3.2 O Transtorno Afetivo Bipolar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183
3.3 O Autismo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183
4. MicroRNAs nas doenças cardiovasculares. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 184
5. MicroRNAs e as doenças autoimunes ou inflamatórias crônicas . . . . . . . . . . . . . . 185
5.1 O Lúpus Eritematoso Sistêmico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185
5.2 A Artrite Reumatoide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 186
5.3 As doenças inflamatórias intestinais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 186
6. Considerações finais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 186

Capítulo 11. Uso de miRNAs no diagnóstico, prognóstico e terapêutica. 191

Dr. Júlio Cesar Cetrulo Lorenzi e Dr.a Dalila Lucíola Zanette

1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192
2. Diagnóstico e prognóstico baseados em miRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192
2.1 Neoplasias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192
2.2 Neoplasias hematológicas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193
2.2.1 Leucemia Linfocítica Crônica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193
2.2.2 Mieloma Múltiplo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 194
2.2.3 Leucemias pediátricas agudas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 194
2.2.4 Linfomas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 195
2.3 Tumores sólidos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 195
2.3.1 Câncer de próstata. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 195
2.3.2 Câncer colorretal. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196
 2.3.3 Câncer de pulmão . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197
2.3.4 Câncer de mama . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 198
2.3.5 Câncer gástrico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 198
2.3.6 Câncer cervical. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199
2.4 miRNAs como biomarcadores em outras doenças . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200
2.4.1 Diabetes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200
2.4.2 Doenças neurológicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200
2.4.3 Epilepsia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200
2.4.4 Esclerose Múltipla . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200
2.4.5 Doença de Alzheimer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201
3. Aplicações terapêuticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201
3.1 Terapêutica baseada na inibição miRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201
3.2 Terapêutica baseada na reposição de miRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202
3.3 Perspectivas para o uso terapêutico dos miRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203

Capítulo 12. Análise molecular de microRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211

Dr.a Ana Paula Körbes e Dr.a Flávia Cristina de Paula Freitas

1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212
2. Técnicas para clonagem de miRNAs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212
2.1 Métodos de isolamento e purificação de pequenos RNAs . . . . . . . . . . . . . 213
2.2 Métodos de quantificação. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 216
2.3 Estratégias de clonagem de miRNAs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 216
3. Técnicas para análise de expressão gênica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 220
3.1 Northern blot. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 220
3.2 Hibridização in situ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222
3.3 RT-qPCR. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222
3.4 Normalização e análise dos dados.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 225
3.5 Microarranjos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 226
3.6 Normalização e análise dos dados. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 228
3.7 Sequenciamento em larga escala. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 228
3.8 Análise dos dados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 230
3.9 Quantificação das moléculas primárias e precursoras dos miRNAs. . . . . 231
4. Bancos de dados para análises de identificação dos miRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . 231
Capítulo 13. Abordagens computacionais e moleculares para identificação
de alvos de microRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 237

Prof. Dr. Régis Lopes Corrêa, Kelly Costa de Almeida, Thiago Sardou
Charret, Dr. Júlio Cesar Cetrulo Lorenzi, Prof. Dr. Tiago Campos Pereira
e Prof. Dr. Vinícius D’Avila Bitencourt Pascoal

1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 238
2. Métodos in silico para predição de alvos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 238
3. Métodos moleculares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 241
3.1 Baseados na superexpressão de miRNAs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 241
3.1.1 Seguida por análise via northern blot. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 241
3.1.2 Acompanhada por ensaios de bioluminescência. . . . . . . . . . . . . .241
3.1.2.1 Controles negativos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 243
3.1.2.2 Controle de normalização. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 243
3.1.2.3 Limitações. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 243
3.1.3 Seguida por análise com microarranjos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 244
3.1.4 Seguida por sequenciamento em larga escala e proteômica . . . . 244
3.2 Baseados na inibição da atividade de miRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 245
3.3 Detecção do sítio de clivagem por 5’ RACE. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 245
3.4 Detecção experimental de alvos de miRNAs em escala genômica . . . . . . 247
3.4.1 PARE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 247
3.4.2 GMUCT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 249
3.5 Imunoprecipitação de proteínas Argonauta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 249
3.5.1 RIP-Chip . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 250
3.5.2 TAP-Tar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 250
3.5.3 HITS-CLIP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 251
3.5.4 PAR-CLIP. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 251
3.5.5 iCLIP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 251
3.5.6 CLASH. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 252
4. Considerações finais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 252
Capítulo 14. Estratégias para depleção de miRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 255

Prof.a Dr.a Cláudia Vianna Maurer-Morelli e

Prof. Dr. Vinícius D’Ávila Bitencourt Pascoal

1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 256
2. Oligonucleotídeos antissenso - antimiRs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 256
2.1 Vantagens e limitações dos antimiRs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 258
3. Esponjas artificiais de miRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 258
3.1 Vantagens e limitações das esponjas artificiais de miRNAs. . . . . . . . . . . . 260
4. Modificações em genes de microRNAs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 260
4.1 Knockouts gerados por métodos tradicionais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 262
4.2 Knockouts condicionais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 262
4.3 Vantagens e limitações dos knockouts gerados por métodos
tradicionais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 263
4.4 Knockouts gerados por CRISPR/Cas9. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 263
4.5 Exemplos de aplicação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 264
4.6 Vantagens e limitações do CRISPR/Cas9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 265
5. Conclusões . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 266

Capítulo 15. MiRNAs artificiais, miméticos e superexpressão de miRNAs

endógenos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 269

Dr.a Franceli Rodrigues Kulcheski, Dr.a Daniela Zimbardi e

Prof. Dr. Tiago Campos Pereira

1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 270
2. Superexpressão de microRNAs endógenos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 270
3. MicroRNAs artificiais (amiRNAs). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .270
3.1 Vantagens sobre outras técnicas de silenciamento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 271
3.2 Parâmetros para projetar amiRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 273
3.3 Construção de amiRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 276
3.4 Aplicações no estudo de função gênica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 276
3.5 Uso no melhoramento genético de plantas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 278
4. miRNAs miméticos (miRNA mimics; mimetic miRNAs). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 280
 4.1 Aspectos gerais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 280
4.2 Aplicações. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 281
4.3 miRNAs miméticos funcionais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 281
5. Conclusões . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 282

Capítulo 16. Predição computacional de microRNAs em genomas . . . . . . . 287

Fábio Ribeiro Cerqueira, Yuri Bento Marques, Thales Francisco Mota

Carvalho, José Cleydson Ferreira da Silva, Marcos Fernando Basso,
Guilherme Loss de Morais e Joseane Biso de Carvalho

1. Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 288
2. Bancos de dados de microRNAs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 289
3. Métodos para predição computacional de miRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 293
3.1 Métodos comparativos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 293
3.2 Métodos não comparativos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 297
3.3 Métodos baseados em dados de sequenciamento de nova geração . . . . . 305
4. Considerações finais e perspectivas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 315

Capítulo 17. Novas fronteiras em miRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 321

Dr.a Amanda Freire de Assis, Beatriz Alves Guerra, Emilio Tarcitano,

Dr.a Ernna Hérida Domingues de Oliveira, Prof. Dr. Marcelo A. Mori,
Silas Pinto da Silva e Prof. Dr. Tiago Campos Pereira

1. Seção 1 - RNAs endógenos competidores: esponjas naturais de miRNAs

Dr.a Amanda Freire de Assis e Dr.a Ernna Hérida Domingues de Oliveira

1.1 Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 322

1.2 Considerações moleculares para as interações entre ceRNAs. . . . . . . . . . 323
1.3 Identificação de ceRNAs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 323
1.4 RNAs circulares: uma nova e curiosa classe de ceRNAs. . . . . . . . . . . . . . . 324
2. Seção 2 - miRNAs circulantes

Prof. Dr. Marcelo A. Mori, Emilio Tarcitano, Silas Pinto da Silva e Beatriz
Alves Guerra

2.1 Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 326

2.2 miRNAs circulantes em humanos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 326
2.3 Transporte intertecidual de miRNAs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 327
2.4 Presença de miRNAs em fluidos corporais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 329
2.5 Papel biológico de miRNAs circulantes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 331
2.6 Perspectivas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 332

3. Seção 3 - miPEPs: peptídeos codificados por pri-miRNAs

Prof. Dr. Tiago Campos Pereira

3.1 miPEPs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 333

3.2 Perspectivas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 334

Índice remissivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 339

Prefácio

Tiago Campos Pereira

É
impressionante pensar que, até alguns anos atrás, pequenos RNAs eram vistos
simplesmente como resultado da degradação de outros transcritos celulares, isto
é, lixo molecular. Na passagem do milênio, uma reviravolta tomou o mundo da
ciência: os microRNAs são, na verdade, como ouro em pó no solo – uma abundante riqueza
ignorada pelo tamanho reduzido, antes confundida com sujeira na vastidão do citoplasma.
Ninguém poderia imaginar que moléculas tão pequenas pudessem ser capazes de tão grandes
façanhas dentro da célula: ligar e desligar milhares de genes de forma orquestrada, regulando
virtualmente todos os processos da vida.
A história dos microRNAs se confunde muito com a dos siRNAs. Inicialmente, essas
duas classes de moléculas eram facilmente distinguíveis. Mas, em pouco tempo, notou-se
que um mesmo conjunto de enzimas e de proteínas estava envolvido com a biogênese e
com a ação delas (Dicer, Dicer-like, Drosha, RISC, entre outras), sugerindo que miRNAs e
siRNAs eram muito próximos.
Com o passar dos anos, o acúmulo de dados na literatura evidenciou algo ainda mais
dramático: existe um continuum de pequenos RNAs (qiRNA, diRNA, siRNA, piRNA, miRNA,
tasiRNA etc.) que interagem com um continuum de proteínas relativamente semelhantes
(membros da família Argonauta, PIWI e outros), gerando um continuum de efeitos: silenciamento
gênico transcricional, inibição da tradução, clivagem do RNA-alvo, ativação da transcrição,
intensificação da tradução, deleção de sequências genômicas, entre outros. Vinte e dois anos
após os primeiros papers descrevendo miRNAs, encontramo-nos ainda desvendando a real
contribuição desses pequenos RNAs para a célula.
Este livro foi planejado objetivando apresentar o vasto tema dos miRNAs de maneira
clara, didática, abrangente e atualizada, para que fosse acessível a graduandos e a docentes.
Os primeiros cinco capítulos abordam aspectos elementares: o histórico das descobertas
dos miRNAs, a evolução dos genes de miRNAs, a biogênese e degradação, as regras de
nomenclatura e os mecanismos moleculares de ação.
Os quatro capítulos seguintes (6 a 9) discorrem sobre miRNAs na regulação de uma
imensa variedade de processos biológicos em vírus, plantas, animais e seres humanos. Os dois
capítulos posteriores (10 e 11) discutem sobre os efeitos patológicos da desregulação desses
miRNAs, assim como o potencial uso dessas moléculas no diagnóstico, prognóstico e terapia.
Os outros cinco capítulos (12 a 16) abordam um imensa gama de técnicas e de
ferramentas moleculares e computacionais que permitem o estudo dos miRNAs e de seus
genes-alvo. Por fim, o último capítulo (17) apresenta recentes descobertas no mundo dos
pequenos RNAs.
Esta obra é o segundo volume de uma série chamada “Introdução a ...”, por mim
organizada, que objetiva apresentar de maneira clara as técnicas e os tópicos recentes da
genética e da biologia molecular aos alunos e aos pesquisadores brasileiros. O primeiro
volume – Introdução à técnica de Interferência por RNA - RNAi (de 2013, com 170 páginas) –

Prefácio 21
 tem sido um grande sucesso, com disponibilidade na livraria virtual da Sociedade Brasileira
de Genética.
Visando produzir uma obra ainda melhor, um grande esforço foi aplicado neste segundo
volume ao longo de dois anos, para que ele fosse ainda mais abrangente (17 capítulos), mais
didático (57 figuras), com diferentes pontos de vista (59 colaboradores), buscando proporcionar
ao leitor um texto estruturalmente organizado, simples, moderno e de fácil leitura.
Registro aqui meus agradecimentos a todos que auxiliaram direta e indiretamente na
produção desta obra (autores, colaboradores, revisores e editores) e às agências de fomento
CNPq, CAPES, FAPESP e Fundações de Amparo à Pesquisa dos Estados de todos os autores,
por fornecerem todo o arcabouço necessário para a elaboração deste livro.
Em especial, agradeço a Deus por me conceder a vida, por me dar a chance de estudar
a vida, por me fazer feliz nesta vida e por me conceder a vida eterna. “Fazendo Ele soar a
sua voz, logo há rumor de águas no céu, e faz subir os vapores das extremidades da terra; faz
os relâmpagos para a chuva, e dos seus tesouros faz sair o vento” (Jeremias 10:13).

22 Introdução ao mundo dos microRNAs

Histórico dos microRNAs Capítulo
1
Dr.a Ernna Herida Domingues de Oliveira1, Dr.a Daniela Zimbardi2,
Tiago Jorge Alves de Souza1,3, Gustavo Borges4, Gabriel José de Carli3 e
Prof. Dr. Tiago Campos Pereira3
1
Depto. de Genética, FMRP – USP, Ribeirão Preto – SP
2
Depto. de Genética, IBB – UNESP, Botucatu – SP
3
Depto. de Biologia, FFCLRP – USP, Ribeirão Preto – SP
4
Hemocentro, FMRP – USP, Ribeirão Preto – SP

Estruturação do capítulo
1. Introdução
1.1 C. elegans – um modelo de pesquisa
1.2 O controle do desenvolvimento larval de C. elegans
2. lin-4: o primeiro microRNA
3. O primeiro breakthrough: lin-4 é caracterizado como um pequeno RNA regulatório
3.1 lin-4 controla outros alvos: lin-28
3.2 Mecanismo de ação de lin-4
4. O segundo breakthrough: outro miRNA é identificado
5. O terceiro breakthrough: miRNAs são evolutivamente conservados
6. O quarto breakthrough: microRNAs são abundantes na natureza
7. O trio de artigos seminais
7.1 Artigo 1: Abundância de miRNAs em C. elegans
7.2 Artigos 2 e 3: miRNAs em diversas espécies e seus padrões de expressão

Histórico dos microRNAs 23

 1. Introdução

1.1 C. elegans – um modelo de pesquisa

A pesquisa científica se utiliza de diversas espécies como modelos biológicos, tais
como: Mus musculus (camundongo), Rattus norvegicus (rato), Escherichia coli (bactéria), S.
cerevisae (levedura), Arabidopsis thaliana (planta), Drosophila melanogaster (mosca), Danio
rerio (peixe paulistinha – zebrafish), Xenopus laevis (sapo), entre muitas outras.
Uma espécie bem menos conhecida no Brasil mas intensamente utilizada no mundo
inteiro é o Caenorhabditis elegans – um nematódeo hermafrodita de vida livre (i.e., não
parasita), de aproximadamente 1 mm de comprimento que vive no solo. Curiosamente,
indivíduos adultos possuem exatamente 959 células, 302 das quais são neurônios (Wormbook,
2006 e 2010). Essa espécie atraía pouco interesse científico até 1960, quando o pesquisador
Sidney Brenner percebeu seu enorme potencial para a biologia celular e do desenvolvimento,
introduzindo-a como uma nova espécie-modelo. C. elegans possui um ciclo de vida curto (~72
horas de ovo até a fase adulta, passando por quatro estágios larvais – L1 a L4), seu cultivo em
laboratório é simples e de baixo custo, tornando-o um modelo muito interessante (figura 1).
Estudos sobre a regulação genética do desenvolvimento e sobre a morte celular
programada nessa espécie renderam o prêmio Nobel a Sidney Brenner (junto a outros
pesquisadores), em 2002. Outros dois prêmios Nobel tiveram C. elegans como modelo:
2006 (Interferência por RNA) e 2008 (estudos com a proteína GFP). Nessa mesma espécie,
os microRNAs foram originalmente descobertos durante estudos focados na biologia do
desenvolvimento (Lee et al., 1993; Wightman et al., 1993).

1.2 O controle do desenvolvimento larval de C. elegans

O desenvolvimento larval nesse nematódeo é regulado por uma via que envolve genes
heterocrônicos essenciais no controle temporal de uma sequência de eventos celulares que
ocorrem no período pós-embrionário, acarretando na formação de seus quatro estágios
larvais (Ambros e Horvitz, 1984; Ambros e Horvitz, 1987; Ambros, 1989).
Mutações nos genes heterocrônicos podem causar um desenvolvimento precoce, em
que programas de desenvolvimento tardio são expressos no início do estágio larval; ou
atraso no desenvolvimento, em que programas de desenvolvimento precoce são reiterados
em estágios tardios (figura 2) (Chalfie et al., 1981; Ambros e Horvitz, 1984).

2. lin-4: o primeiro microRNA

Indivíduos adultos com mutações no gene heterocrônico lin-4 não apresentam algumas
das estruturas típicas dessa fase do desenvolvimento (como cutícula adulta e vulva), além de não
conseguirem ovipor (Chalfie et al., 1981; Ambros e Horvitz, 1987). Adicionalmente, diferentes
experimentos sugeriam que lin-4 regulava negativamente outro gene heterocrônico, o lin-14.
A proteína LIN-14 é normalmente abundante durante o estágio larval jovem e escassa
no estágio larval tardio (Ruvkun e Giusto, 1989). Curiosamente, o aumento temporal da
atividade do gene lin-4 refletia na redução dos níveis da proteína LIN-14, evidenciando que

24 Introdução ao mundo dos microRNAs

o programa genético de transição entre fases larvais dependia criticamente de lin-4, que
atuaria reduzindo a atividade de lin-14 (figura 3) (Feinbaum e Ambros, 1999).
Uma vez que os níveis dos transcritos de lin-14 mantinham-se constantes durante
todo o desenvolvimento, a queda nos níveis da proteína LIN-14 possivelmente seria devida
a um controle pós-transcricional (Wightman et al., 1993). Adicionalmente, o mapeamento
da região 3’ UTR do mRNA de mutantes lin-14 com ganho de função (Wightman et al., 1991)
e experimentos de fusão gênica (Wightman et al., 1993) definiram que essa região era um
elemento necessário para que ocorresse a regulação negativa.

Figura 1. O ciclo de vida de Caenorhabditis elegans. Tempo médio de desenvolvimento da espécie a 22 °C. L1-L4:
estágios larvais de 1 a 4.

Figura 2. Genes heterocrônicos. Mutações em genes heterocrônicos podem causar um desenvolvimento precoce (e.g.,
larva de idade referente a L2 mas com aspecto de L3) ou atraso no desenvolvimento (e.g., larva de idade referente a
L2 com aspecto de L1).

Nota: Por convenção, os genes (e os alelos mutantes) foram indicados em letras minúsculas e em itálico (lin-14). A proteína
correspondente, em letras maiúsculas (LIN-14); o transcrito, em letras minúsculas (lin-14).

Histórico dos microRNAs 25

 3. O primeiro breakthrough: lin-4 é caracterizado
como um pequeno RNA regulatório
Baseado nessas evidências, dois grupos de pesquisa investigaram os mecanismos
moleculares precisos pelos quais lin-4 regulava os níveis de expressão da proteína LIN-
14 (Wightman et al., 1993; Lee et al., 1993). Os dados experimentais revelaram que lin-4
localizava-se dentro de um íntron de um gene com função desconhecida. Homólogos desse
gene foram encontrados em outras três espécies de Caenorhabditis: C. briggsae, C. remanei e C.
vulgaris, indicando que eles poderiam codificar produtos gênicos funcionalmente semelhantes.
Além disso, análises de northern blot revelaram a existência de dois transcritos de lin-4 de
aproximadamente 22 e 61 nucleotídeos (nt).
Outros experimentos envolvendo mutações sítio-dirigidas em possíveis quadros abertos
de leitura (Open Reading Frames – ORFs) de lin-4 demonstraram que a atividade do gene
não foi afetada, sugerindo fortemente que ele não codificava uma proteína. Adicionalmente,
comparações das sequências nucleotídicas revelaram que os transcritos de lin-4 eram
complementares a um determinado sítio repetido sete vezes na 3’ UTR de lin-14 (figura 4).
A importância dessa complementaridade para a função de lin-4 foi reforçada por
diversas observações. Primeiro, a região 3’ UTR de lin-14 que era complementar a lin-4
encontrava-se conservada entre espécies de C. elegans e C. briggsae, sugerindo que a função de
lin-4 também seria conservada entre essas espécies. Adicionalmente, mutações na sequência
de lin-4 que é complementar a lin-14 alteravam ou desestabilizavam a hibridação entre esses
RNAs. Por fim, regiões complementares a lin-4 eram justamente as regiões deletadas no
mutante lin-14 com ganho de função, o que acarretou um desenvolvimento larval atrasado
em C. elegans (Wightman et al., 1991). Essas evidências apoiaram fortemente a hipótese
de que o pequeno RNA lin-4 inibia temporariamente a tradução de lin-14 entre os estágios
larvais L1 e L2, através da interação antissenso com determinadas sequências da região 3’
UTR de lin-14.
Até então se tinha conhecimento de alguns exemplos de mecanismos naturais de
regulação antissenso que afetavam a estabilidade do RNA (Kimelman e Kirschner, 1989;
Hildebrandt e Nellen, 1992; revisto em Simons, 1988; revisto em Eguchi et al., 1991). Porém,

Figura 3. Lin-4 regula negativamente lin-14. O aumento dos níveis do RNA lin-4 está associado à redução dos níveis da
proteína LIN-14. Uma vez que a abundância do RNA lin-14 não se altera, postulava-se que lin-4 modularia negativamente
LIN-14 no nível pós-transcricional.

26 Introdução ao mundo dos microRNAs

as evidências indicavam que lin-4 provavelmente não controlava a estabilidade do mRNA de
lin-14, uma vez que os níveis do transcrito de lin-14 continuavam relativamente constantes
durante todo o desenvolvimento do verme e não eram consideravelmente alterados em
mutantes de lin-4. Dessa forma, foi sugerido que lin-4 poderia se ligar ao mRNA de lin-14
no citoplasma e inibir a tradução pela interação direta com componentes da maquinaria
de tradução.
Dados prévios já haviam evidenciado mecanismos naturais afetando a tradução através
da interação de um RNA antissenso com a região 5’ UTR de mRNAs, aparentemente interferindo
na ligação de ribossomos (Liao et al., 1987; Simons, 1988; Kittle et al., 1989). Por outro lado, os
autores consideraram o fato de que se lin-4 não inibisse a tradução diretamente, sua interação
com a região 3’ UTR de lin-14 representaria um novo tipo de mecanismo de controle da tradução.
Por fim, os autores sugeriram que o RNA de lin-4 poderia agir em conjunto com proteínas,
uma vez que as sequências de lin-4 e lin-14 não eram totalmente complementares, havendo a
formação de bolhas fora das regiões de hibridação, que poderiam ser sítios de ligação dessas
proteínas.
Publicados na mesma edição de dezembro de 1993 da revista Cell, esses dois artigos
tiveram uma grande importância histórica, uma vez que demonstraram pela primeira vez
um processo de regulação pós-transcricional mediado por um pequeno RNA antissenso
através da hibridação com a região 3’ UTR do gene-alvo.

3.1 lin-4 controla outros alvos: lin-28

Outro gene heterocrônico crítico para o desenvolvimento normal de C. elegans é
o lin-28, que controla a sucessão de L2 para L3. A caracterização molecular desse gene
demonstrou que ele codifica uma proteína citoplasmática com domínios de ligação a RNA e
apresenta uma alta identidade de sequência com genes de duas outras espécies, C. remanei
e C. vulgaris. Adicionalmente, a expressão desse gene se distribui por várias populações
celulares e apresenta níveis proteicos elevados no estágio embrionário final e L1, sendo
gradualmente reduzidos nos estágios larvais subsequentes. Esse fato sugeria a existência

Figura 4. Interação entre lin-4 e lin-14. A. O pequeno RNA de lin-4 (21 nt) possui complementaridade parcial com sete
sítios na 3’ UTR do mRNA de lin-14. Essas interações senso-antissenso seriam a base do mecanismo molecular pelo qual
lin-4 regularia negativamente lin-14. B. Complementaridade parcial entre o RNA lin-4 e os sítios em lin-14.

Histórico dos microRNAs 27

 de uma regulação pós-transcricional uma vez que, assim como o lin-14, o mRNA de lin-28
foi detectado em todos os estágios do desenvolvimento larval.
Nesse contexto, uma descoberta importante foi reportada em 1997, com identificação
de uma sequência de 15 nt na região 3’ UTR de lin-28 que também é complementar ao RNA
de lin-4, sugerindo que a expressão do lin-28­seria regulada por esse RNA (Moss et al., 1997).
Esse dado foi corroborado pela observação de que mutantes com ausência da atividade de
lin-4 apresentam expressão proteica elevada de lin-28 nos estágios larvais finais e nos vermes
adultos. Somando-se a isso, vermes contendo uma versão mutante de lin-28 (com deleção
da sequência de 15 nt) apresentaram um fenótipo retardado dominante característico de
L2 e atraso ou inibição do desenvolvimento para os estágios subsequentes.

3.2 Mecanismo de ação de lin-4

Em seguida, Olsen e Ambros (1999) procuraram detalhar ainda mais a associação
entre lin-4 e lin-14 ao avaliar o comprimento da cauda poli-A do mRNA de lin-14 entre os
estágios L1/L2. Eles verificaram que a associação do lin-4 com a extremidade 3’ UTR desse
gene não promovia a desestabilização do mRNA por deadenilação.
A avaliação do perfil polissomal por ensaio de sedimentação pelo gradiente de
sacarose não identificou alteração no recrutamento do mRNA de lin-14 ou na montagem
da maquinaria de tradução funcional ou, ainda, no deslocamento do mRNA para regiões
subcelulares ausentes dessa maquinaria entre os estágios larvais L1 e L2. Da mesma forma,
a presença do RNA de lin-4 foi identificada na fração ativa composta de polirribossomos
somente em L2. Em conjunto, esses dados sugeriram que outro mecanismo traducional
posterior à etapa de iniciação estaria envolvido na repressão de LIN-14 por lin-4.
A repressão traducional promovida por pequenos RNAs regulatórios poderia ocorrer
pós-iniciação, pela atuação nos mecanismos envolvidos na elongação, terminação ou mesmo
na liberação da proteína funcional. Mais do que uma ação isolada, os resultados obtidos
nesse estudo sugeriam que uma combinação de efeitos inibitórios pela atuação em mais
de uma etapa da tradução ou, ainda, por um aumento na taxa de degradação da proteína
recém-sintetizada poderiam ser os responsáveis pela repressão exercida por lin-4.

4. O segundo breakthrough: outro miRNA é identificado

Sete anos após a descoberta do primeiro pequeno RNA antissenso regulador lin-4, um
grupo liderado por Gary Ruvkun da Universidade Harvard publicava na Nature a existência
de um segundo RNA regulador em C. elegans: o let-7 (Reinhart et al., 2000). Inicialmente,
esse trabalho descreveu a base molecular do padrão temporal de atividade do gene lin-41,
que possuía sítios complementares na porção 3’ UTR ao RNA de let-7, demostrando que
essa região era responsável pela diminuição da expressão da proteína LIN-41 durante a
passagem do estágio L4 para adulto.

5. O terceiro breakthrough: miRNAs são evolutivamente

conservados
A descoberta desse segundo pequeno RNA regulador sugeria que talvez esses RNAs
fizessem parte de um fenômeno evolutivamente antigo e importante no processo de regulação

28 Introdução ao mundo dos microRNAs

da expressão gênica. Assim, o mesmo grupo de Harvard buscou identificar homólogos
desses genes, os quais eles denominaram stRNAs (small temporal RNAs), encontrando-os
em vertebrados, hemicordados, ascídias, artrópodes, anelídeos, moluscos e no homem
(Pasquinelli et al., 2000).
Inicialmente, essa busca foi possível através da comparação de sequências do RNA
let-7 entre C. elegans, D. melanogaster e o homem. Os resultados revelaram que havia um
alinhamento perfeito de sequências entre C. elegans e D. melanogaster, e parcial com diversas
regiões no genoma humano.
Adicionalmente, a estrutura secundária do tipo stem-loop (semelhantes a um grampo
de cabelo) predita para o precursor do transcrito de let-7 em C. elegans (Lee et al., 1993)
também era conservada para os precursores de D. melanogaster e humanos (figura 5). De
acordo com os autores, esses precursores seriam eficientemente processados (por uma enzima,
até então desconhecida) nos pequenos RNAs maduros detectados nessas espécies. Diversos
outros aspectos da natureza dessas moléculas eram preservados: (i) o perfil de expressão
temporal, (ii) os sítios complementares na porção 3’ UTR e (iii) o tamanho do RNA (21 nt).
Por fim, os autores notaram similaridades entre os stRNAs e os siRNAs (small interfering
RNAs) (Hamilton e Baulcombe, 1999), tais como o tamanho (21-25 nt) e o fato de ambos
estarem envolvidos em fenômenos de regulação gênica pós-transcricional, sugerindo um
laço evolutivo mais profundo entre os dois.
Todas essas novas descobertas reluziam como um novo mundo à frente, mediado
por pequenos RNAs regulatórios até então elusivos para a ciência.

Figura 5. Conservação da estrutura secundária dos stRNAs (e miRNAs). O transcrito precursor do let-7 (com 70 nt)
apresenta uma estrutura secundária no formato de um grampo de cabelo (hairpin, também denominada stem-loop ou
foldback). Essa estrutura também foi predita para homólogos desse stRNA em outras espécies. Era proposto que esses
precursores seriam processados por uma enzima então desconhecida (dicer) nos pequenos RNA maduros (21 nt).

Histórico dos microRNAs 29

 6. O quarto breakthrough: microRNAs são abundantes na
natureza
Até o ano 2000, a comunidade científica tinha conhecimento da existência de apenas
dois stRNAs (lin-4 e let-7) controlando os padrões temporais de desenvolvimento dos diferentes
estágios em C. elegans (Lee et al., 1993; Wightman et al. 1993; Moss et al., 1997; Reinhart
et al., 2000).
Em outubro de 2001, um trio de artigos seminais, sequencialmente publicados na
mesma edição da Science, abalaria a comunidade científica. Eles reportavam que os stRNAs
faziam parte de uma classe muito maior de moléculas, agora denominadas microRNAs, bem
mais abundantes do que se imaginava anteriormente (Lau et al., 2001; Lee e Ambros, 2001;
Lagos-Quintana et al., 2001).

7. O trio de artigos seminais

7.1 Artigo 1: Abundância de miRNAs em C. elegans

A partir dos conhecimentos acerca da estrutura e função de lin-4 e let-7, Lau e
colaboradores (2001) desenvolveram um trabalho a procura de RNAs, em C. elegans, que
se assemelhassem com stRNAs/siRNAs e que, adicionalmente, pudessem desempenhar um
papel mais abrangente na regulação gênica desse organismo modelo. Naquele mesmo ano
três outros trabalhos haviam evidenciado que a biogênese dessas duas classes de pequenos
RNAs demandava a atividade de uma endoribonuclease chamada dicer (Bernstein et al., 2001).
Dessa forma, foram isolados os RNAs endógenos de C. elegans que apresentavam características
semelhantes aos produtos resultantes da clivagem pela dicer, por meio de três critérios:
(i) comprimento de 22 nucleotídeos; (ii) nucleotídeo monofosfato na extremidade 5’; (iii)
grupo hidroxila na extremidade 3’.
Os 330 fragmentos que obedeceram a esses critérios foram identificados e clonados.
Desses, 300 possuíam o potencial de se combinar com sequências genômicas formando
estruturas em grampos (stem-loop) semelhantes às que provavelmente eram necessárias
para o processamento dos stRNAs. Esses 300 clones correspondiam a 54 sequências únicas
(lin-4, let-7 e outros RNAs).
O grupo de Lau verificou que, apesar de os microRNAs lin-4 e let-7 estarem localizados
no braço 5’ da estrutura em forma de alça, apenas um quarto dos miRNAs analisados estavam
localizados nesse braço. Isso implicou que os produtos estáveis resultantes do processamento
por dicer poderiam residir em ambos os braços do precursor.
Os autores estudaram também a função dos microRNAs encontrados, para verificar
se algum deles atuava como um stRNA. Dentre os microRNAs que apresentaram padrão
diferencial durante o desenvolvimento, destacou-se o miR-84, pois possuía sequência 77%
idêntica ao let-7, sendo considerado como indistinguível desse stRNA. Dessa forma, eles
especularam que o miR-84 provavelmente seria um stRNA que trabalhava em conjunto com
o microRNA let-7 no controle da transição larva/adulto. Tal ideia foi fundamentada pela
identificação de sítios plausíveis de ligação para o miR-84 na região 3’ UTR de determinados
genes heterocrônicos.

30 Introdução ao mundo dos microRNAs

 Com os dados obtidos, verificou-se grande semelhança entre os microRNAs de C. elegans
analisados nesse trabalho e os microRNAs da espécie C. briggsae, sendo que mais de 40%
dos microRNAs dessas espécies aparentemente eram idênticos. Os microRNAs de C. elegans
também demonstraram possuir homologias discerníveis em organismos evolutivamente
distantes. O let-7, por exemplo, possui homólogos discerníveis em espécies como drosófila
e humanos. Ao menos sete outros genes de microRNAs (mir-1, mir-2, mir-34, mir-60, mir-72,
mir-79 e mir-84) aparentavam ser conservados em drosófila, sendo que a maioria desses
também em humanos.
Portanto, os dados indicaram que em culturas de C. elegans saudáveis e em crescimento,
a regulação por microRNAs executava um papel biológico natural e que genes de RNAs
pequenos como lin-4 e let-7 eram mais abundantes nessa espécie modelo do que se pensava
previamente.
Em face aos dados obtidos, os autores levantaram a hipótese de que os novos microRNAs
descritos, juntamente com os RNAs lin-4 e let-7, constituíam uma importante e abundante classe
de riboreguladores. A diversidade dos padrões de expressão dos genes desses microRNAs
demonstrou que eles provavelmente agiriam em uma variedade de vias regulatórias muito
além do controle do desenvolvimento.

7.2 Artigos 2 e 3: miRNAs em diversas espécies e seus padrões de

expressão
Com o mesmo intuito de identificar novos microRNAs em organismos invertebrados
e vertebrados, Lagos-Quintana e colaboradores (2001) desenvolveram um trabalho para
isolamento e identificação de microRNAs em D. melanogaster e células humanas HeLa. O
grupo foi capaz de identificar 21 microRNAs humanos, assim como observar que o perfil de
expressão de microRNAs da mosca-das-frutas era variado: alguns com expressão constitutiva,
outros com padrões período-ou tecido-específicos.
Nesse contexto, experimentos adicionais de northern blot comparando a presença
de microRNAs em células HeLa, rins de ratos, zebrafish adultos, ovário de Xenopus laevis
e células S2 de drosófila evidenciaram uma variedade de combinações entre as amostras
e os miRNAs.
Nessa mesma edição da revista Science, Rosalind Lee e Victor Ambros (2001) relatavam
ter encontrado diversos novos miRNAs em C. elegans, alguns deles com homólogos no
camundongo, em drosófila e no homem.
A partir dessa data a comunidade científica percebia claramente que os miRNAs
não eram uma peculiaridade de C. elegans, mas sim um elemento genético evolutivamente
conservado, presente em várias espécies e potencialmente capaz de regular diversos processos
biológicos. A justificativa para a total ignorância, por parte dos cientistas, a respeito dessa
classe de pequenos RNAs até o ano 2000 pode ser atribuída a dois aspectos principais: (i)
algoritmos computacionais utilizados na época, que identificavam genes através de ORFs
(ausentes em genes de microRNAs) e (ii) a frequente exclusão de RNAs de pequeno peso
molecular (< 200 nt) nas análises de transcriptomas dessa época.
Em 20 de dezembro de 2002 a revista Science estampava em sua capa o Breakthrough
of the Year: “New roles for RNAs”, contemplando as então recentes descobertas referentes aos
papéis regulatórios dos pequenos RNAs. Essa molécula, de nome singelo e que soa literalmente
pequeno, promoveria uma verdadeira revolução na Biologia do início do século 21.

Histórico dos microRNAs 31

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Origem e Evolução Capítulo
de MicroRNAs 2

Prof. Dr. Danillo Pinhal1, Pedro Gabriel Nachtigall1, Arthur Casulli de Oliveira1,
Luiz Augusto Bovolenta2, Marcos Edgar Herkenhoff1
1
Depto. de Genética, Instituto de Biociências de Botucatu, UNESP - SP
2
Depto. de Física e Biofísica, Instituto de Biociências de Botucatu, UNESP - SP

Estruturação do capítulo
1. Introdução
2. Origem e expansão do repertório de miRNAs nos organismos
3. Organização genômica de miRNAs em animais e plantas
3.1 MiRNAs intergênicos
3.2 MiRNAs intrônicos
3.3 MiRNAs exônicos
3.4 Clusters de miRNAs
3.5 A importância da organização genômica em análises filogenéticas
4. O genoma como substrato para a gênese de novos miRNAs
4.1 Duplicação gênica
4.2 Duplicação genômica
4.3 De novo
4.4 Íntrons
4.5 Pseudogenes, snoRNAs e tRNAs
4.6 Elementos transponíveis
4.7 Transcritos antissenso de miRNAs
5. Mecanismos de diversificação dos transcritos de miRNAs
5.1 Alteração da região seed e isomiRs
5.2 Edição de miRNAs
5.3 Alteração de braço de leitura de miRNAs
5.4 Mudança de hairpin
6. Considerações finais

Origem e Evolução de MicroRNAs 33

 1. Introdução
Embora descobertos em 1993, somente em 2001 os miRNAs foram reconhecidos
como uma ampla classe de pequenos RNAs regulatórios, composta por algumas dezenas
de representantes – atualmente centenas a milhares foram identificados – em espécies de
plantas e animais (Bartel, 2004). Dotados da capacidade de regular a expressão de poucos
a centenas de genes, os miRNAs parecem trabalhar de forma orquestrada em amplas redes
regulatórias integradas para controlar uma via ou função biológica comum. Uma vez que
os miRNAs interagem amplamente com muitos transcritos, a evolução desse sistema é algo
intrigante. Com que frequência os genes de miRNAs surgem e o quão rápido estes genes
evoluem após emergirem nas mais diferentes espécies constituem-se em questões centrais
relativas à evolução dos miRNAs.

2. Origem e expansão do repertório de miRNAs nos organismos

Pesquisas realizadas na última década trouxeram evidências de que os miRNAs possuem
origem bastante antiga e que já estariam presentes no genoma de formas de vida unicelular,
ainda metabolicamente bastante simples (Molnár et al., 2007). Nesses organismos, os miRNAs
teriam surgido como uma nova classe de reguladores e moduladores da expressão gênica.
Atualmente diversos estudos argumentam que tanto o aparecimento quanto a expansão
dos miRNAs estão diretamente associados à multicelularidade e à evolução da complexidade
nos organismos (Heimberg et al., 2008, 2010; Berezikov, 2011). Paralelamente, uma marcante
expansão no repertório de miRNAs e, consequentemente, dos genes-alvo por eles regulados,
teria impactado a própria filogenia animal ao proporcionar inovações no plano corpóreo dos
organismos, e, assim, contribuído para a geração de variabilidade fenotípica entre espécies
relacionadas.
Um fato interessante é que, apesar de o surgimento dos miRNAs nos animais
provavelmente ter acompanhado a emergência da multicelularidade, nas plantas a evolução
desses pequenos RNAs regulatórios ocorreu anteriormente ao surgimento dos organismos
multicelulares, pois foram encontrados miRNAs ortólogos aos das plantas na alga unicelular
Chlamydomonas reinhardtii (Molnár et al., 2007). Esse fato, aliado à ausência de miRNAs
no genoma de fungos e às diferenças na estrutura e biogênese entre animais e plantas,
sugere que a origem dos miRNAs tenha ocorrido de maneira independente nestes dois reinos
(Jones-Rhoades et al., 2006). Por outro lado, acredita-se que a maquinaria de silenciamento
gênico, responsável pela geração de miRNAs, já estava presente no organismo ancestral de
todos os eucariotos (Buchon e Vaury, 2006; Cerutti e Casas-Mollano, 2006). Há estudos que
reportaram a existência de miRNAs idênticos no genoma de plantas e animais (Arteaga-
Vázquez et al., 2006), e há ainda um estudo surpreendente que demonstrou que miRNAs
presentes no arroz (Oryza sativa), quando ingeridos na alimentação, alteram a expressão
de genes alvo em células humanas (Zhang et al., 2012a), resultado este, porém, ainda sob
debate (Tosar et al., 2014).
Embora os dados disponíveis ainda não permitam provar que os miRNAs foram
condicionantes da complexidade da vida multicelular animal e vegetal, eles certamente
mostram que os miRNAs devem ter sido elementos facilitadores desse processo. Isso porque
esses pequenos RNAs forneceram um mecanismo adicional de regulação gênica, aumentando

34 Introdução ao mundo dos microRNAs

assim, as chances de células funcionalmente simples evoluírem em algo notadamente mais
complexo.
Estudos voltados à análise da distribuição filogenética de miRNAs que examinaram
os níveis de conservação e de diversidade dessas moléculas sugerem que elas exercem papel
evolutivo fundamental ao cooperarem para promover variação fenotípica durante todo
o desenvolvimento dos organismos (Niwa e Slack, 2007). Além disso, análises genômicas
comparativas têm revelado que invertebrados e vertebrados apresentaram um acréscimo no
inventário de tipos celulares ao longo do tempo geológico de forma extraordinariamente análoga
à aquisição de seu respectivo conjunto de miRNAs (Sempere et al., 2006; Chen et al., 2012).
Tais observações suportam a hipótese de que a origem da complexidade metabólica dos
organismos metazoários superiores, tais como os vertebrados, decorre, mais provavelmente,
de considerável expansão do inventário de RNAs regulatórios não codificadores – incluindo-
se o aumento do número absoluto de miRNAs – do que de um aumento no número de genes
codificadores de proteínas (Mattick, 2004). De fato, o ganho de complexidade metabólica
pelo estabelecimento e ampliação de redes gênicas é inegável ao examinar-se a filogenia
animal, e é provavelmente o resultado da regulação de um número crescente de genes por
novos miRNAs, evento este que pode ter influenciado diretamente a própria evolução animal.
Mas quando e como surgiram os primeiros genes de miRNAs?
A habilidade notória dos miRNAs em modular a expressão gênica provavelmente evoluiu
de algum mecanismo primitivo de defesa contra vírus, bactérias e elementos genéticos móveis
(transposons), os quais detêm a capacidade de gerar mutações no DNA do organismo hospedeiro.
Nesse contexto teriam surgido diferentes classes de pequenos RNAs como um mecanismo de
defesa da integridade do genoma, sendo que os miRNAs teriam evoluído de modo a atuar em
vias envolvidas na regulação da expressão de genes endógenos (Carthew e Sontheimer, 2009).
No entanto, miRNAs também podem regular transposons e outros RNAs não codificantes longos
(Creasey et al., 2014; Fei et al., 2013).
Diversas pesquisas têm reportado a presença de miRNAs em Bilateria – um amplo
grupo de animais cuja origem remete há cerca de 500 milhões de anos. Esses organismos
caracterizam-se pelo padrão corpóreo com simetria bilateral e perfazem um grande conjunto
de organismos, incluindo os seres humanos e a maioria dos demais filos animais, excetuando-
se esponjas (poríferos), e águas-vivas e anêmonas marinhas (cnidários). Tanto as esponjas
– os metazoários mais antigos viventes – quanto as águas-vivas apresentam simetria radial
(Radiata), ou seja, morfologicamente possuem extremidades superior e inferior, porém não
exibem padrão corpóreo anteroposterior definido. Estes organismos de simetria radial são
considerados evolutivamente anteriores aos de simetria bilateral. Disso poder-se-ia concluir
que os miRNAs teriam origem na base dos Bilateria, o que explicaria sua ausência no genoma
ancestral dos Radiata. De fato, até pouco tempo, nenhum miRNA havia sido encontrado em
esponjas ou águas-vivas, e havia apenas alusões à sua provável existência em anêmonas.
Entretanto pesquisas recentes direcionadas à análise bioinformática em larga escala de
bibliotecas de pequenos RNAs revelaram o contrário, ao reportar a presença de miRNAs
nesses grupos e em outros metazoários basais cujos genomas atualmente encontram-se
sequenciados e anotados (Hertel et al., 2006; Peterson et al., 2009; Christodoulou et al., 2010).
Em cnidários essas investigações resultaram na descrição de 158 genes de miRNAs,
sendo 141 miRNAs no genoma da anêmona marinha Nematostella vectensis e 17 miRNAs
no genoma da água-viva Hydra magnipapillata (miRbase v21.). Cabe destacar que ambas as
espécies de cnidários produzem proteínas (Pasha e Argonautas, que sabidamente interagem

Origem e Evolução de MicroRNAs 35

 com miRNAs) bastante similares às proteínas encontradas em humanos (Grimson et al., 2008).
Dentre os miRNAs identificados chama a atenção um exemplo de miRNA altamente conservado,
o mir-100, que é o único presente no genoma de todos os Bilateria e também no da anêmona
N. vectensis.
Em poríferos, 8 genes de miRNAs foram descritos no genoma da esponja Amphimedon
queenslandica, os quais também mostraram-se altamente conservados em outras linhagens de
poríferos (Wheeler et al., 2009). É interessante notar que nenhum dos miRNAs identificados
nesses organismos apresentou homologia aos miRNAs de Eumetazoa (Grimson et al 2008;
Wheeler et al., 2009) – clado que congrega todos os animais, exceto esponjas e Placozoa.
Este resultado, quando somado ao fato pouco usual de que os precursores de miRNAs de
poríferos apresentam longas estruturas secundárias, trouxe à tona a possibilidade que os
miRNAs de poríferos tenham surgido independentemente daqueles atualmente encontrados
em Eumetazoa (Heimberg et al., 2008; Peterson et al., 2009). Por outro lado, a presença das
proteínas Drosha e Pasha em esponjas, essenciais ao processamento de miRNAs, sugere
uma origem única da maquinaria de biogênese de miRNAs nos animais e, por inferência,
a presença de substratos comuns em um antigo ancestral animal (Grimson et al., 2008).
A possível perda de miRNAs antigos de Metazoa nos poríferos e a evolução de miRNAs
específicos deste clado são suportados pela aparente ausência de miRNAs no Placozoa Trichoplax
adhaerens. Nesta espécie de metazoário basal não foram encontrados quaisquer genes de
miRNAs, embora o tenham sido em ancestrais desses organismos, metabolicamente mais
complexos, e também em ancestrais comuns de cnidários e Bilateria. Juntos, estes dados
sugerem que em Placozoa houve perda secundária de miRNAs preexistentes. Além disso, a
proteína Pasha - exclusivamente envolvida na via de biogênese de miRNAs - não foi identificada
no genoma de T. adhaerens, sugerindo que todos os miRNAs tenham sido perdidos nessa
linhagem (Grimson et al., 2008). Do mesmo modo, tanto os miRNAs quanto as proteínas
da maquinaria de miRNAs e RNAi não foram identificadas em Monosiga brevicollis, um
organismo unicelular pertencente aos choanoflagelados, grupo vivente filogeneticamente
mais próximo de Metazoa (Christodoulou et al., 2010).
Portanto, embora os miRNAs tenham surgido como uma classe de reguladores
gênicos bastante cedo na evolução de Metazoa, o exato momento desse evento permanece
desconhecido. Na prática estes achados nos permitem presumir que a origem dos miRNAs
tenha sido anterior ao surgimento desses organismos, o que remete a uma provável origem
no genoma do ancestral metazoário hipotético comum, o Urmetazoa, que teria vivido entre
600 e 800 milhões de anos atrás (Technau, 2008).
Diversas investigações têm buscado compreender com que frequência os genes e
famílias multigênicas de miRNAs emergem e de que forma distribuem-se nos grandes grupos
de organismos (Figura 1).
Considerando-se o amplo número de miRNAs atualmente identificado em Bilateria
e a descoberta de que apenas um único miRNA é compartilhado por cnidários e Bilateria,
deduz-se que um grande acúmulo de novos miRNAs tenha ocorrido na base de Bilateria
(Hertel et al., 2006; Peterson et al., 2009). Análises recentes dos genes de miRNAs no genoma
dos dois principais superfilos de Bilateria - os protostômios e os deuterostômios - revelaram
que 34 famílias de miRNAs são comuns a ambos os grupos (Christodoulou et al., 2010),
corroborando observações prévias de que um número substancial de miRNAs são conservados
nesses grupos (Hertel et al., 2006; Prochnik et al., 2007).

36 Introdução ao mundo dos microRNAs

 Posteriormente, uma nova expansão do repertório de miRNAs fora detectada na base
dos vertebrados (Heimberg et al., 2008, 2010), cuja origem remonta há cerca de 525 milhões
de anos (Shu et al., 1999). Finalmente, no clado que congrega os vertebrados, houve um novo
acúmulo de genes de miRNAs restrito à linhagem ancestral dos mamíferos placentários
(Eutérios) (Hertel et al., 2006; Heimberg et al., 2008; Berezikov, 2011). Tal fato é verificado
ao examinar-se o genoma do rato Rattus norvegicus, espécie para a qual foram descritos
aproximadamente o dobro do total de miRNAs reportados no genoma do peixe paulistinha
(zebrafish, Danio rerio). A quantificação dos genes de miRNAs descritos para diferentes clados
foi obtida pela análise da versão 21 do miRBase (atualizada em junho de 2014) (Kozomara e
Griffiths-Jones, 2011) e como tal, representa um cenário transitório do conhecimento atual
sobre miRNAs em diferentes filos.
Atualmente nos registros do miRBase – principal repositório de dados de miRNAs –
estão representadas 115 espécies de metazoários para as quais foram descritos mais de

Figura 1. Distribuição dos genes de miRNAs detectados no genoma de diversas espécies do reino animal (dados obtidos
do miRBase versão 21 em junho de 2015).

Origem e Evolução de MicroRNAs 37

 28.000 miRNAs. Desse total, mais da metade foi reportada a partir da análise do genoma de
espécies de vertebrados (Ambros et al., 2003; Kozomara e Griffiths-Jones, 2014). Embora estes
números já sejam expressivos, certamente o real número de miRNAs é bastante superior ao
conhecido, haja vista que diversos grupos permanecem pouco estudados.
Ainda que restrito, o atual conhecimento da diversidade de miRNAs demonstra
que estes representam (numericamente) de 1 a 5% de todo o conjunto de genes, o que os
torna a classe de reguladores mais abundante no genoma (Zhao e Srivastava, 2007; Olena
e Patton, 2010). Entre os vertebrados, diversos exemplos de conservação da composição
nucleotídica dos genes de miRNA e de funções dos transcritos gerados foram detectadas entre
zebrafish, ratos e humanos, para os quais são conhecidos cerca de 350, 1200 e 1900 miRNAs,
respectivamente (miRBase v.21). Ainda, análises genômicas em zebrafish identificaram e
agruparam os miRNAs em 44 famílias (Thatcher et al., 2008), das quais 41 são compartilhadas
por todos os vertebrados (Heimberg et al., 2008). A existência de muitos genes de miRNAs
conservados compartilhados por diversos grupos de vertebrados sugere sua participação em
processos celulares e ontogenéticos vitais comuns a esses organismos (Heimberg et al., 2010).
Em contrapartida, diversos miRNAs não conservados (i.e., “linhagem-específicos”) foram
também detectados em vertebrados. Acredita-se que esses miRNAs evolutivamente divergentes
poderiam desempenhar um papel específico no estabelecimento e manutenção da diversidade
fenotípica entre os diferentes grupos de organismos (Plasterk, 2006; Sempere et al., 2006).
Por exemplo, na análise de miRNAs em cérebro humano e de chipanzés foram identificadas
várias centenas de genes de miRNAs específicos de primatas (Berezikov et al., 2006). Em
concordância, o extenso sequenciamento de bibliotecas de cDNA de zebrafish e do seabass
(Lates calcarifer), enriquecidas por pequenos RNAs, permitiu a identificação de miRNAs
expressos em baixos níveis e revelou um grupo de miRNAs compartilhados exclusivamente
por peixes (Kloosterman et al., 2006; Xia et al., 2011). De modo similar, análises utilizando
sequenciamento de nova geração de miRNAs em mamíferos e aves identificaram centenas
de miRNAs exclusivos de cada grupo (Griffiths-Jones et al., 2006; Glazov et al., 2008).
Ainda que poucas espécies dos diversos grupos de organismos tenham sido analisadas
até o momento, os dados disponíveis sugerem que a descrição e a análise comparativa
do conjunto total de miRNAs transcritos, o chamado “miRNoma” ou “microRNoma”, em
diferentes espécies poderá contribuir para revelar como espécies e grupos taxonômicos
divergiram ao longo do processo evolutivo.
Além disso, a identificação de miRNAs grupo-específicos ou espécie- específicos de
origem recente tem se revelado uma estratégia altamente informativa para esclarecer os
processos de nascimento, evolução e morte de genes de miRNAs (Lu et al., 2008; Meunier
et al., 2013). Isso porque a maioria dos miRNAs conhecidos tem origem antiga e são altamente
conservados em decorrência da estabilidade funcional por eles adquirida. Por outro lado
há grande dinamismo nos miRNAs de origem recente, os quais evoluem mais rapidamente
(Plasterk, 2006). Esses miRNAs “jovens” aparentemente estão sob menor pressão de seleção do
que os miRNAs conservados, pois a grande maioria parece não estar integrada como elemento
dominante em redes regulatórias, tanto no genoma de plantas quanto no de animais (Fahlgren
et al., 2007). Como consequência muitos genes de miRNAs de origem recente surgem e são
rapidamente eliminados do genoma. Por exemplo, pela análise de genes de miRNAs de três
espécies de Drosophila, verificou-se que cerca de 96% desses foram eliminados do genoma,
enquanto apenas 4% foram mantidos por efeito da seleção natural (Lu et al., 2008). Em
mamíferos, também é notável a acelerada taxa de nascimento de novas famílias de miRNAs

38 Introdução ao mundo dos microRNAs

em placentários e marsupiais. Nesses organismos muitas famílias foram eliminadas logo
após seu surgimento, enquanto as poucas mantidas por seleção gradualmente adquiriram
altos níveis de expressão e integraram-se em diferentes vias regulatórias, exercendo diversos
papéis funcionais (Meunier et al., 2013).
Embora grandes avanços quanto à determinação da origem de miRNAs tenham sido
atingidos, permanecem em aberto questões relativas à frequência com que os genes de miRNA
emergem, e qual o conjunto de eventos necessários desde sua origem até que venham a ser
integrados em redes de regulação gênica.

3. Organização genômica de miRNAs em animais e plantas

Além do conhecimento sobre a diversidade do repertório de miRNAs dos organismos,
o entendimento de como os genes de miRNAs estão organizados no genoma representa um
passo fundamental para a compreensão dos processos que permeiam a evolução desses
pequenos RNAs regulatórios. Em plantas e animais, os genes de miRNAs apresentam ampla
heterogeneidade em relação à organização genômica e funcionalidade nas células, o que
implica que podem seguir caminhos evolutivos distintos.
Por exemplo, famílias de miRNAs tendem a acumular um maior número de membros
em plantas e estes ainda mostram-se mais similares entre si do que nas famílias de miRNAs
de animais (Li e Mao, 2006). Tal padrão sugere que a expansão das famílias de miRNAs em
plantas é mais recente, e também que o principal efeito da presença de múltiplas cópias
parálogas de um mesmo gene de miRNA em plantas é um aumento de dosagem. Já em
animais, membros de uma mesma família podem atuar sinergisticamente, mas por vezes
apresentam papéis funcionais distintos (Abbott et al., 2005 Hayes et al., 2006).
Com a disponibilidade de genomas completamente sequenciados para um número
crescente de espécies, tem também aumentado a parcela de contribuições científicas voltadas
à determinação da estruturação e distribuição dos genes e famílias de miRNAs no genoma
de plantas e animais (Olena e Patton, 2010; Thatcher et al. 2008;Turner et al. 2012; Nozawa
et al., 2012).
De acordo com estes estudos, os miRNAs podem ser classificados de três formas
distintas em relação à sua localização genômica: (i) miRNAs intergênicos, (ii) miRNAs
intrônicos e (iii) miRNAs exônicos, sendo estes dois últimos também conhecidos como
miRNAs intragênicos (Olena e Patton, 2010).

3.1 MiRNAs intergênicos

Os miRNAs intergênicos localizam-se entre duas unidades transcricionais, sua expressão
é regulada por seus próprios promotores (Figura 2A) e possuem características semelhantes
às unidades transcricionais de genes codificadores de proteínas, tais como sítios de início
de transcrição, regiões regulatórias e sinalização para cauda poli(A) (Olena e Patton, 2010).
Outra característica previamente descrita em animais (H. sapiens e C. elegans) mostrou
que o componente TATA-box, de reconhecida importância no processo de transcrição de genes
codificadores de proteína, não é encontrado próximo aos genes de miRNAs intergênicos.
Entretanto, em plantas (Arabidopsis thaliana e O. sativa) esse componente se encontra presente
nos genes de miRNA intergênicos. Outro ponto marcante se refere à localização de ilhas CpG

Origem e Evolução de MicroRNAs 39

 adjacentes aos genes de miRNAs intergênicos que apresentam uma característica espécie-
específica (Zhou et al., 2007), sugerindo diferentes níveis de complexidade na transcrição
dessas moléculas entre as espécies.
Em plantas, os miRNAs ocorrem majoritariamente em regiões intergênicas e/ou em
regiões antissenso a unidades transcricionais anotadas (Maher et al., 2006; Turner et al.,
2012; Nozawa et al., 2012). Em geral, 84% dos miRNAs de 11 espécies de plantas (A. thailana,
Carica papaya, Populus sp., Medicago sp., Glycine max, Vitis sp., Oryza sp., Sorghum sp., Zea
mays, musgo e alga verdes) foram anotados em regiões intergênicas (Nozawa et al., 2012).
Especificamente em G. max foi relatado que 97% do total de genes de miRNA estão localizados
em regiões intergênicas (Turner et al., 2012).
Em função dessas características, as regiões intergênicas tornaram-se importantes
fontes para a compreensão dos processos que regem a evolução dos genes de miRNAs em
diferentes espécies de plantas. Há, entretanto, algumas adversidades no uso de miRNAs
intergênicos, pois não há “sinalização” que associe um determinado miRNA à região na
qual este se insere no genoma, uma vez que tais regiões de inserção podem variar entre os
cromossomos de espécies distintas. Dessa maneira, torna-se importante a presença de unidades
transcricionais codificantes flanqueadoras conservadas para que as regiões intergênicas
possam ser úteis na identificação de eventos evolutivos (Maher et al., 2006).
Curiosamente, em animais a frequência de miRNAs intergênicos se aproxima da
frequência de miRNAs intragênicos, que corresponde a aproximadamente 50-50%, como
por exemplo em D. melanogaster (Nozawa et al., 2010) e H. sapiens (Olena e Patton, 2010).

3.2 MiRNAs intrônicos

Os miRNAs intrônicos estão localizados na região de um íntron de uma unidade
transcricional e geralmente se utilizam dos mesmos promotores de sua unidade transcricional
hospedeira (Figura 2B). Porém, um estudo realizado em C. elegans mostrou que aproximadamente
um terço dos miRNAs intrônicos possuem seus próprios promotores e apresentam expressão
independente de seus genes hospedeiros. O miR-58, por exemplo, é expresso em diversos
tecidos, com exceção do tecido nervoso, enquanto seu gene hospedeiro Y67D8A.1 é expresso
exclusivamente no tecido nervoso (Isik et al., 2010).
No caso dos miRNAs intrônicos, há instâncias particulares nas quais a sequência
precursora dos miRNAs (pre-miRNAs) apresenta o tamanho exato do íntron, e desta maneira,
após a transcrição e processamento de seu RNA hospedeiro, os íntrons removidos irão
diretamente formar o pre-miRNA. Portanto, as etapas iniciais da biogênese não são necessárias
para a formação desses miRNAs, tornando-os independentes de clivagem pela Drosha (Okamura
et al., 2007) (Figura 2B). Nesta via não canônica, o miRNA gerado recebe o nome de miRtron
(miRNA + intron) (ver capítulo “Regulação da abundância de miRNAs” para detalhamento
da biogênese dos miRNAs).
Em termos quantitativos os miRNAs intrônicos prevalecem, e constituem
aproximadamente metade do total de miRNAs de vertebrados (Godnic et al., 2013). Geralmente
os miRNAs intrônicos apresentam expressão similar àquela de seus genes hospedeiros,
embora haja exceções (Bell et al., 2010). Adicionalmente, análises quantitativas revelaram
que alguns miRNAs intrônicos atuam em vias correlacionadas às de seu gene hospedeiro.
Há casos em que os genes-alvo desses miRNAs atuam de maneira antagonista na via do gene
hospedeiro e, nestes casos, podem ser completamente inibidos por seus miRNAs intrônicos.

40 Introdução ao mundo dos microRNAs

Em contrapartida, os alvos que atuam de maneira sinérgica ao gene hospedeiro dos miRNAs
intrônicos sofrem “ajuste fino”, o que auxilia no controle preciso do processo biológico em
que estes genes hospedeiros e seus respectivos miRNAs intrônicos atuam (Lutter et al., 2010).

3.3 MiRNAs exônicos

Os miRNAs exônicos possuem frequência baixa ou nula entre as espécies, apresentam
baixa heterogeneidade, geralmente são encontrados no final de um éxon, estendendo-se para
o início do íntron adjacente de um gene não-codificador, e compartilham os promotores de
seu gene hospedeiro (Figura 2C). Por exemplo, H. sapiens apresenta apenas 5% de miRNAs
exônicos em relação ao total de miRNAs identificados na espécie. Para outras espécies
de animais e plantas (M. musculus, C. familiaris, D. rerio, D. melanogaster, C. elegans e A.
thailana) esses valores podem variar entre 0 a 10% (Maselli et al., 2008; Nozawa et al., 2012).
Um fato interessante quanto ao padrão exônico de organização genômica dos miRNAs
é que tal localização interfere no correto processamento do pre-miRNA, o que acaba inibindo
posteriormente sua própria biogênese e, por vezes, a atuação de seu gene hospedeiro (Rodriguez
et al., 2004; Olena e Patton, 2010; Berezikov et al., 2010).

3.4 Clusters de miRNAs

Outra forma comum de organização dos miRNAs é o arranjo em tandem, ou seja,
diversos genes de miRNAs distribuídos de forma sequencial e contígua numa determinada
região genômica. Este conjunto de miRNAs é chamado de cluster (do inglês, agrupamento) e
diz-se que eles estão clusterizados (Figura 3). Lagos-Quintana et al. (2001) foram os primeiros
a identificar e descrever um cluster de miRNAs e, a partir de então, diversos outros trabalhos
têm se dedicado ao estudo deste padrão organizacional. Os clusters são descritos como um
conjunto de miRNAs hospedados em regiões genômicas próximas umas das outras, com a
distância máxima de aproximadamente 10.000 nucleotídeos entre cada miRNA membro do
cluster sobre a mesma orientação genômica (Griffiths-Jones et al., 2008). Após emergirem,
estes agrupamentos tendem a se manter extremamente conservados entre as espécies, pois os
membros do cluster apresentam dispersão geralmente nula ou que ocorre em baixa frequência
(Mohammed et al., 2014). Os miRNAs maduros transcritos dessas regiões podem ter como
origem um único transcrito primário (pri-miRNA), ou seja, podem compartilhar entrei si um
único promotor e serem transcritos como uma unidade transcricional única (Griffiths-Jones
et al., 2008). A exemplificação do conceito de clusters de miRNAs é demonstrada na Figura 3.
Pesquisas recentes na área observaram que miRNAs pertencentes a um mesmo cluster
tinham seus níveis de expressão alterados de maneira similar entre condições experimentais
diversas aplicadas ao longo do desenvolvimento cardíaco de camundongo. Esses dados
levantaram a hipótese de que miRNAs podem ser produzidos como unidades transcricionais
únicas (Zhang et al., 2012b). Essa característica, além de demonstrar que os agrupamentos de
miRNAs são regiões policistrônicas, também indica que esses miRNAs podem e devem agir em
processos biológicos semelhantes e/ou auxiliando em processos biológicos complementares
aos processos principais. Os clusters miR-1-1/133a-2, miR-1-2/133a-1 e miR-206/133b, por
exemplo, estão presentes no genoma de peixes a mamíferos e são vitais para a homeostasia
da musculatura esquelética destes animais (Nachtigall et al., 2015).
Clusters são comuns em humanos e em zebrafish, uma vez que aproximadamente 48%
e 50% dos miRNAs intergênicos, respectivamente, encontram-se organizados neste tipo de

Origem e Evolução de MicroRNAs 41

 agrupamento. Por outro lado, nas espécies de plantas, apenas uma pequena parcela dos miRNAs
são encontrados de forma clusterizada e estes tendem a ter um tamanho inferior em relação
aos clusters encontrados em animais (Voinnet, 2009). Interessantemente, Zhou et al. (2011)
detectou que há uma maior expressão de clusters de miRNAs em plantas eudicotiledôneas em

Figura 2. Organização genômica dos miRNAs. A) MiRNAs intergênicos e clusterizados. B) MiRNAs intrônicos, miRtrons
e clusterizados. C) MiRNAs exônicos. Os retângulos em verde-claro representam os genes, os retângulos em roxo os
miRNAs e os retângulos verde-escuros os éxons. As setas representam os promotores dos seus respectivos genes.

Figura 3. Exemplificação do cluster miR-93/19d/25 na espécie Danio rerio. Estão representadas na figura a localização
cromossômica (cromossomo 14, versão do genoma Zv9), a possível estrutura secundária do cluster, as estruturas
secundárias dos hairpins dos miR-93, miR-19d e miR-25 e suas respectivas sequências maduras com níveis de expressão
em reads per million (RPM) obtidos através do banco de dados miRBase (v.21). As estruturas secundárias e suas respectivas
colorações foram obtidas através de algoritmos baseados em cálculo de mínima energia livre (MFE) - RNAFold.

42 Introdução ao mundo dos microRNAs

relação às monocotiledôneas, o que pode representar uma divergência evolutiva funcional
nestes dois tipos de plantas.

3.5 A importância da organização genômica em análises filogenéticas

Devido à estrutura organizacional e à alta taxa de conservação dos miRNAs entre
espécies, análises filogenéticas e quanto à origem dos miRNAs se tornam viáveis. Entretanto,
apenas a utilização da conservação e da nomenclatura dos miRNAs estabelecidas pelo miRBase
não são suficientes para traçar o histórico evolutivo de uma família de miRNAs. Em algumas
espécies o miR-252 recebe outra anotação, por exemplo: miR-2797 em Bombyx mori, miR-2943
no A. aegypti e miR-1002 e miR-968 nas espécies de Drosophila, apesar de todos possuírem a
mesma sequência seed, i.e., a região entre o segundo e oitavo nucleotídeos da extremidade
5’ do miRNA, requerida para o reconhecimento de alvos. Estes dados enfatizam que, em
alguns casos, a nomenclatura utilizada atualmente não corresponde à ortologia e à homologia
destes miRNAs (Mohammed et al., 2014). Dessa maneira, nesse processo de compreensão
dos princípios evolutivos, suas localizações genômicas devem ser consideradas, incluindo-se
dados relativos à presença de clusters, à distância entre os miRNAs clusterizados e ao tipo
de localização hospedeira.
Atualmente diversos trabalhos científicos se utilizam dessa metodologia para traçar
o histórico evolutivo dos miRNAs entre as espécies. Mohammed et. al (2014) analisaram a
família do miR-279 (Figura 4), a qual é composta por três miRNAs distintos: o miR-279, o
miR-996 e o miR-286. Os miRNAs miR-279 e miR-996 são clusterizados (miR-279/996) e foram
detectados neste padrão organizacional no genoma da grande maioria dos insetos (exceto no
grupo dos afídeos). Este cluster está localizado dentro do íntron do gene codificador da DNA-
polA2 (ortologo ao gene humano POLA2). Uma variação organizacional ocorre no genoma das
espécies de moscas de fruta Drosophila, nas quais o cluster miR-279/996 encontra-se em uma
região intergênica. Além disso, um locus intergênico do miR-279, extremamente conservado
entre animais não-cordados e considerado o ancestral desta família, não foi detectado no
genoma da abelha Apis mellifera, do mosquito Aedes aegypti e das espécies de Drosophila.
Cabe destacar que a espécie de afídio Acyrthosiphon pisum possui duas cópias parálogas do
miR-279 em seu genoma. Uma cópia intergênica e outra intrônica, que está hospedada dentro
do gene codificador da DNA-polA2. Com estes dados, o autor concluiu que, provavelmente,
o miRNA intergênico miR-279 sofreu uma transduplicação no genoma do afídio A. pisum,
sendo que a cópia paráloga está hospedada dentro da DNA-pol2A. Posteriormente, o miR-
279 intrônico sofreu uma duplicação em tandem seguida de ganho de função no genoma
de Hymenoptera, gerando o cluster miR-279/996. A cópia ancestral foi então deletada dos
genomas da abelha, mosquito e Drosophila, e finalmente, o cluster miR-279/996 teria sido
translocado para a região intergênica do genoma das moscas Drosophila.
Tanzer e Stadler (2004) também se utilizaram dos clusters de miRNAs para traçar o
histórico evolutivo do miR-17, gene pertencente ao cluster miR-17-106 (miR-17/-18/-19a/-19b/-
20/-25/-92/-93/-106a/-106b) em H. sapiens. Os autores estabeleceram comparações a partir
do nível de identidade (Blast) e presença/ausência dos miRNAs membros destes clusters em
diferentes espécies para a elaboração de um histórico evolutivo plausível, que identificou
processos de duplicação gênica e de perda de função (ou subfuncionalização) de miRNAs
como os principais agentes na diversificação deste cluster entre as espécies. Esse histórico
evolutivo pode ser analisado na Figura 5.

Origem e Evolução de MicroRNAs 43

 Outras análises também ressaltam que não apenas as regiões clusterizadas podem
servir para traçar processos evolutivos, mas também os outros tipos de regiões citadas
podem ser importantes para o levantamento desse histórico (Mohammed et al., 2014; Maher
et al., 2006). Maher e seus colaboradores descreveram o processo evolutivo dos miRNAs em A.
thailana utilizando processos de duplicação genômica em regiões intergênicas. Adicionalmente,
Mohammed e colaboradores conseguiram traçar o processo evolutivo do mir-995 e do mir-
998 por estes estarem localizados em regiões intrônicas de genes codificantes conservados
tais como E2f e cdc2c, o que lhes permitiu inferir como essas cópias de miRNAs teriam sido
adquiridas. Por outro lado os miRNAs exônicos cuja ocorrência é pouco frequente, atualmente
não se constituem no enfoque de análises evolutivas.

4. O genoma como substrato para a gênese de novos miRNAs

Conforme visto nos tópicos anteriores, ao longo do processo evolutivo muitos são os
genes de miRNAs originados e estes apresentam uma miríade de possíveis configurações
organizacionais no genoma. Entretanto, quais eventos, em nível molecular, contribuem para
promover o surgimento de um novo gene de miRNA?
Diversos estudos em plantas e animais têm demonstrado que as famílias de miRNAs
podem se expandir no genoma pelos mesmos mecanismos que incidem sobre os genes
codificadores de proteínas, que correspondem majoritariamente a eventos de duplicação
do DNA de diferentes magnitudes.
Entretanto, qualquer quer seja o mecanismo considerado, ao examinar-se o processo de
biogênese tem-se que o pré-requisito básico para que um miRNA seja funcional é a formação de
uma estrutura secundária em forma de hairpin por seu transcrito precursor (Han et al., 2006).
Isso porque todas as proteínas envolvidas no processo de biogênese de um miRNA reconhecem
e dependem dessa estrutura para gerar o miRNA funcional. Tendo em vista que transcritos de
RNA comumente formam estruturas em hairpin, a probabilidade de umas dessas estruturas
originar um novo miRNA é maior do que a probabilidade de surgir um novo gene codificador
de proteína, uma vez que os genes codificadores requerem uma estruturação mais complexa
para tornarem-se funcionais (Chen and Rajewsky, 2007; Ruby et al., 2007).
Desse modo, diversas são as possibilidades para o surgimento e evolução de novos
genes de miRNAs no genoma.

4.1 Duplicação gênica

De maneira geral, genes de miRNAs que possuem sequências homólogas e produzem
transcritos maduros contendo regiões seed idênticas (ou muito semelhantes – 95-100%
de similaridade) são agrupados em famílias (Ambros et al., 2003). Assim, os membros
pertencentes a essas famílias de miRNAs, que representam sequências parálogas, surgiram
predominantemente pelo processo de duplicação gênica (Hertel et al., 2006). Esse processo
pode ser considerado de dois tipos: (1) duplicação local ou “em tandem”, no qual o gene
duplicado permanece adjacente ao gene de origem, ou seja, permanece no mesmo transcrito;
e (2) duplicação insercional, que resulta na cópia do gene inserida em outro local do genoma
(no mesmo cromossomo ou em cromossomo diferente) (Figura 6), o que faz com que sejam
transcritos independentemente (Ambros et al., 2003). Atualmente, sabe-se que a maioria das
duplicações insercionais de miRNAs relatadas em linhagens de vertebrados estão associadas

44 Introdução ao mundo dos microRNAs

Figura 4. Histórico evolutivo dos miRNAs da família do miR-279 entre as espécies. Processo de duplicação (x2) e
de perda de funcão (-1 e X) de membros da família então representados, tais como processo de troca de localização
hospedeira ( ). As linhas verdes representam os genes codificadores ortólogos da DNA-polA2 e os quadrados seus
respectivos éxons. Em C. elegans miR-42 e miR-43 estão destacados por não pertencerem a família do miR-279. Os
miRNAs miR-44 e miR-45 apesar de possuírem nomes distintos dos demais apresentam alta similaridade com o miR-279.

Figura 5. História evolutiva do cluster do miR-17. Cada miRNA integrante do cluster está representado por sua
estrutura secundária em forma de hairpin e o “X” representa a perda de função de um miRNA. Os números nos quadrados
representam a ordem dos eventos evolutivos ocorridos, enquanto que os desenhos das espécies, em que grupo elas
ocorreram. Estima-se que inicialmente o cluster era composto pelos miRNAs miR-17, miR-19 e miR-92 (1). Três eventos
de duplicação em tandem ocorreram dando origem ao cluster miR-17/18/93/19/19b/92 (3). Posteriormente, um evento
de duplicação do cluster inteiro ocorreu, seguido pela perda de função e neofuncionalização de alguns miRNAs, dando
origem aos clusters C1, representados pelos miR-17/18/19/19b/93 e C2, miR-106b/93/19bII/25 (4). No ancestral comum dos
peixes Acanthopterygii e Sarcopterygii o cluster C1 sofreu novo evento de duplicação em tandem, originando o cluster miR-
17/18/19/20/19b/93 (5). Posteriormente, nos mamíferos (H. sapiens, P. troglodytes, M. musculus e R. norvegicus), o cluster
C1 sofreu mais um evento de duplicação completa dando origem aos clusters C1M-A, contendo o miR-17/18/19/20/19b/93
e C1M-B, contendo o miR-17/18/20/19b/93, enquanto que o cluster C2 perdeu outro miRNA formando o cluster C2M
miR-106b/93/25. Nos teleósteos (T. nigroviridis, T. rubripes e D. rerio), o cluster C1 sofreu duplicação completa dando
origem aos clusters C1T-A, contendo miR-17/18/19/20/19b/93 e C1T-C, contendo miR-18/19b. Adicionalmente, um evento
de duplicação genômica exclusivo dos teleósteos duplicou o cluster C1T-A, formando uma nova cópia deste cluster, o
C1T-B, que sofreu perda de função do miR-19. Por fim, o cluster C2 se manteve neste grupo, formando o cluster C2T.

Origem e Evolução de MicroRNAs 45

 a eventos de duplicação genômica que ocorreram durante o processo de evolução deste grupo
(Ambros et al., 2003; Heimberg et al., 2008; Gu et al., 2009; Campo-Paysaa et al., 2011). Além
disso, esse tipo de evento possui como vantagem o fato de permitir que mutações ocorram em
uma das cópias sem grandes variações fenotípicas, uma vez que uma das cópias irá manter
a função original do gene. Dessa maneira, o gene duplicado pode adquirir uma nova função,
processo denominado neofuncionalização, ou pode sofrer pequenas alterações em sua função
original que é, no entanto, compensada pela existência da primeira cópia, em um processo
chamado subfuncionalização (Force et al., 1999). Nesse contexto, pode-se concluir que o
processo de duplicação gênica, associado à neofuncionalização ou à subfuncionalização, é
um importante evento para o surgimento de novos genes de miRNAs.

4.2 Duplicação genômica

Quando se compara a abundância de genes de miRNAs em uma determinada família
conservada entre vertebrados e deuterostômios, observa-se um número significativamente
superior de membros no genoma de espécies de vertebrados (Hertel et al., 2006). A discrepância
entre o número de miRNAs de famílias conservadas entre espécies de vertebrados e outras
espécies de deuterostômios é considerada resultado da ocorrência de uma duplicação genômica
específica em vertebrados. De fato, sabe-se que ao longo da evolução dos vertebrados ocorreram
dois ciclos de duplicação genômica para a maioria dos grupos, exceto peixes teleósteos, que
vivenciaram um terceiro ciclo de duplicação genômica (Meyer e Van de Peer, 2005).
De fato, o estudo comparativo entre o repertório de miRNAs de famílias conservadas
no peixe zebrafish (que pertence ao grupo dos teleósteos) e outras espécies de vertebrados e
deuterostômios, demonstrou que essas famílias possuíam um número de miRNAs superior
em zebrafish. Além disso, a comparação de miRNAs pertencentes a 47 famílias específicas
de vertebrados relatou uma discrepância robusta entre zebrafish e humano (Campo-
Paysaa et al., 2011). Posteriormente outros trabalhos foram publicados, consubstanciando
a importância da duplicação genômica na diversificação do repertório de miRNAs no genoma

Figura 6. Surgimento de um novo gene de miRNA por duplicação gênica. Na duplicação local, os genes permanecem
próximos e são transcritos em conjunto. Na duplicação insercional os genes são alocados em regiões distintas e geram
dois transcritos diferenciados. As setas cinzas indicam região promotora do miRNA. Os retângulos cinza contendo dois
quadrados correspondem ao gene de miRNA. Os números 1 e 2 indicam as sequências 5p e 3p do miRNA inicial. Os
números 3 e 4 indicam as sequências 5p e 3p do novo miRNA duplicado.

46 Introdução ao mundo dos microRNAs

de vertebrados (Bhuiyan et al., 2013; Tani et al., 2013; Desvignes et al., 2014), permitindo,
assim, a subfuncionalização e/ou neofuncionalização dos genes parálogos dos miRNAs gerados
(Dehal e Boore, 2005; Putnam et al., 2008).
Interessantemente, um artigo recente relatou que após sucessivas duplicações genômicas
em soja, os genes de miRNAs que se mantiveram no genoma estavam relacionados com suas
funções biológicas cruciais e suas relações com os genes codificadores de proteína alvos – i.e.,
quando um gene alvo era mantido, a cópia do miRNA também se mantinha (Zhao et al., 2015).
Além disso, um estudo realizado em milho demonstrou que miRNAs possuem uma maior
probabilidade de serem mantidos no genoma do que genes codificadores de proteína após
um processo de duplicação genômica (Zhang et al., 2009). Esses dados mostram que tanto
no reino animal quanto no vegetal, o processo de duplicação genômica é importante para
a aquisição de novidades funcionais e está relacionado ao aumento do número de genes de
miRNAs e ao aumento na complexidade regulatória envolvendo essas moléculas.

4.3 De novo
Sabe-se que uma grande porção do genoma (aproximadamente 72%) é transcrito, porém
apenas 2% referem-se a genes codificadores de proteína (Guttman et al., 2009). Portanto,
existe uma grande quantidade de substrato de RNA que pode ser modificado e originar
novos genes de miRNA (Bentwich et al., 2005). Transcritos desestruturados e sem função
são considerados uma importante fonte de geração de novos genes de miRNAs, sendo este
processo denominado “de novo” (Figura 7) (Tang et al., 2010).
Contudo, a precisão da ação das enzimas Drosha e Dicer sobre a estrutura secundária
em forma de hairpin da molécula alvo demonstra que a possibilidade de surgimento de novo
de um gene de miRNA por um único evento evolutivo é improvável. Em vez disso, tem-se a

Figura 7. Esquema representando o surgimento “de novo” de um gene de miRNA a partir de uma região aleatória
do genoma. A seta cinza representa o promotor. O retângulo cinza, contendo dois quadrados cinza escuro, representa
um gene de miRNA.

Origem e Evolução de MicroRNAs 47

 evolução gradual e direcional para a formação de uma estrutura em hairpin que apresente todos
os atributos necessários para ser reconhecida pela maquinaria de processamento de miRNA
e tornar-se funcional (Liu et al., 2008). De fato, sequências com estruturas intermediárias em
hairpin são comumente encontradas em conjuntos de dados provenientes de sequenciamento
de última geração de pequenos RNAs (Berezikov et al., 2011), o que confirma a hipótese de
evolução gradual.
Inicialmente, um novo gene de miRNA é mais suscetível a possuir poucos alvos ao acaso,
uma vez que apenas sequências curtas (região seed) são necessárias para o reconhecimento
de um alvo. Porém, esta regulação ao acaso geralmente resulta em consequências deletérias
e não se estabelece (Plasterk, 2006). Chen e Rajewsky (2007) apresentaram um modelo de
controle transcricional de novos genes de miRNAs que podem evoluir nesse contexto. De
acordo com o modelo apresentado, novos miRNAs são inicialmente expressos em baixos níveis
e de modo tecido-específico, o que limita os efeitos deletérios gerados por ação randômica.
Gradualmente, alvos que resultam em ação deletéria são removidos do transcriptoma
por seleção natural, e, consequentemente, o nível de expressão do miRNA pode aumentar
quantitativa e qualitativamente (Chen e Rajewsky, 2007). Tal hipótese fora confirmada pela
comparação de miRNA de origem recente e miRNAs antigos conservados quanto aos níveis de
expressão gênica. Essa análise demonstrou que miRNAs de origem recente possuem um nível
de expressão significativamente inferior ao de miRNAs conservados (Berezikov et al., 2006;
Lu et al., 2008). Além disso, efeitos deletérios na homeostase decorrentes de altos níveis de
expressão de um miRNA recém-surgido foram relatados para Drosophila melanogaster (Tang
et al., 2010). Uma das implicações desse modelo é que os miRNAs que possuem baixo nível
de conservação e de expressão devem estar sob efeito de seleção purificadora ou negativa
e por isso ainda não exibem um alvo específico, substancialmente por eles regulado (Chen
e Rajewsky, 2007). De modo geral, esse modelo de origem de novo se aplica a qualquer
processo de surgimento de novos genes de miRNA.

4.4 Íntrons
A vasta maioria dos miRNAs descritos estão localizados em íntrons de genes codificadores
de proteínas (Rodriguez et al., 2004). Por exemplo, cerca de 50% e 20% dos miRNAs do genoma
de Homo sapiens e Caenorhabditis elegans, respectivamente, estão localizados em regiões
intrônicas de genes hospedeiros (Isik et al., 2010; Campo-Paysaa et al., 2011).
Íntrons são considerados trechos do genoma ideais para o surgimento de novos miRNAs
devido a quatro características principais: (1) são regiões desestruturadas que favorecem
a formação de uma estrutura em hairpin; (2) não necessitam do surgimento imediato de
uma nova unidade transcricional (promotores e regiões regulatórias), já que se utilizam da
unidade transcricional do gene hospedeiro; (3) são regiões transcritas com o gene, o que
possibilita o início da fixação como miRNAs funcionais, (4) são excisadas pela maquinaria
do processo de splicing, o que facilita o processo de biogênese de miRNAs. Juntos, todos esses
fatores contribuem para o surgimento de genes de miRNAs em regiões intrônicas (Figura 8).
Sabe-se que a maioria dos miRNAs espécie-específicos, considerados mais “jovens”,
estão localizados em íntrons, enquanto os miRNAs conservados, considerados mais “antigos”,
estão localizados em regiões intergênicas. Regiões genômicas que possuem uma função, mas
com o passar do tempo adquirem outra função, são chamadas de exaptações. Portanto, a
evolução de miRNAs em regiões intrônicas são chamadas de “exaptação intrônica” (Campo-
Paysaa et al., 2011).

48 Introdução ao mundo dos microRNAs

 Há evidência experimental de que uma substancial fração dos miRNAs intrônicos
possuem sua própria unidade transcricional (Martinez et al., 2008; Ozsolak et al., 2008; Isik
et al., 2010). Tal padrão torna fundamental a investigação pormenorizada desses chamados
miRNAs intrônicos “independentes”, em comparação aos miRNAs intrônicos “dependentes”,
para um maior conhecimento das diferenças na evolução entre esses dois tipos de miRNAs
intrônicos.

4.5 Pseudogenes, snoRNAs e tRNAs

Além de regiões intrônicas, um transcriptoma possui diversas fontes de transcritos
que podem ter sua estrutura secundária modificada em hairpin e originar novos genes de
miRNAs. Como exemplo, sabe-se da existência de diversos miRNAs derivados de genes de
snoRNA (pequeno RNA nucleolar), tRNA (RNA transportador) e pseudogenes (Devor, 2006;
Ender et al., 2008; Scott et al., 2009; Pederson, 2010; Brameier et al., 2011; Ono et al., 2011).
O principal mecanismo relatado para o surgimento de miRNAs a partir desses genes
é a modificação estrutural do transcrito a partir de mutações pontuais (Roberts et al., 2014).
Entretanto, sabe-se que snoRNAs e tRNAs podem ser processados tanto pela maquinaria de
RNAi, quanto pela maquinaria de miRNA, o que resulta em uma ampla variedade de pequenos
RNAs provenientes desses genes. Esses processos dificultam a identificação e diferenciação
entre um gene de miRNA funcional, que emergiu diretamente de um tRNA ou snoRNA, e
subprodutos do processo de biogênese canônico de tRNAs e snoRNAs (Berezikov et al., 2010).

Figura 8. Esquema representativo do processo de surgimento de um miRNA intrônico. A seta cinza representa o
promotor. O retângulo cinza claro contendo dois quadrados cinza escuro representa um gene de miRNA. Os retângulos
cinza de maior dimensão representam os éxons de um gene codificador de proteína.

Origem e Evolução de MicroRNAs 49

 Além disso, diversos pequenos RNAs derivados de tRNAs e snoRNAs foram identificados
complexados à proteínas da família Argonauta (Ender et al., 2008; Borroughs et al., 2011),
demonstrando uma possível ação como miRNAs. Assim, alguns desses pequenos RNAs
detectados foram experimentalmente validados como silenciadores gênicos através do
ensaio da luciferase in vitro (Ender et al., 2008), aumentando as evidências de uma ação
similar a miRNAs in vivo.
Deve-se considerar, também, o fato de que snoRNAs, tRNAs e pseudogenes possuem
unidades transcricionais próprias que podem ser utilizadas, como unidades transcricionais
do novo gene de miRNA nascente, facilitando o surgimento e a manutenção deste novo
miRNA no transcriptoma da célula. Nesse contexto, confirma-se que regiões que possuem
tRNAs, snoRNAs e pseudogenes possuem os subsídios necessários ao surgimento de novos
genes de miRNA.

4.6 Elementos transponíveis

Atualmente, sabe-se que os elementos transponíveis (TEs) são uma fonte importante
para a inovação genômica (revisado em Sinzelle et al., 2009 e Cordaux et al., 2010), pois
representam aproximadamente 50% do genoma em humanos (Venter et al., 2001) e até

Figura 9. Esquema representativo do processo de surgimento de um miRNA a partir de um elemento transponível.

O retângulo cinza escuro representa a região repetitiva gerada por um elemento transponível. A seta cinza representa
o promotor. O retângulo cinza com dois quadrados cinza escuro representa um gene de miRNA.

50 Introdução ao mundo dos microRNAs

80% do genoma de plantas (Diao et al., 2006). É amplamente reconhecido que os elementos
transponíveis também contribuem para o surgimento de novos genes de miRNA (Hertel
et al., 2006; Borchert et al., 2011). De fato, o primeiro estudo que descreveu um locus de
miRNA associado a uma região genômica gerada por elementos transponíveis hipotetizou
um modelo de como esse surgimento pode ocorrer (Smalheiser e Torvik, 2005). Esse
modelo se baseia no fato de que inserções próximas de elementos transponíveis em fitas
opostas são transcritas, geram estruturas secundárias em hairpin, devido à característica
de sequência palindrômica repetitiva (Figura 9). Essa característica faz com que o transcrito
seja reconhecido pela maquinaria de biogênese de miRNA e se torne funcional. Esse modelo
foi confirmado por diversos outros estudos posteriormente (Smalheiser e Torvik, 2005;
Borchert et al., 2006; Piriyapongsa e Jordan, 2007; Devor et al., 2009; Yuan et al., 2010). Em
adição a esse ponto, miRNAs originados de elementos transponíveis possuem duas outras
vantagens: (1) a possibilidade de uma colonização contínua do genoma; e (2) a regulação
de mRNAs que tenham sofrido ação do mesmo elemento transponível que gerou o miRNA
funcional (Hutvágner e Zamore, 2002). Esses dados demonstram como miRNAs derivados
de elementos transponíveis podem aumentar a complexidade regulatória em um genoma.
Atualmente, sabe-se da existência de diversos genes de miRNAs derivados de elementos
transponíveis. Estes genes de miRNAs são considerados recentes, menos conservados e
linhagem-específicos (Piriyapongsa e Jordan, 2007; Yuan et al., 2011). Vários trabalhos têm
reportado a crescente importância dos elementos transponíveis para a geração de miRNAs.
Por exemplo, um estudo identificou que 278 genes de miRNAs encontrados em humanos
são derivados de sequência repetitiva e se originaram a partir de elementos transponíveis
(Yuan et al., 2011). Borchert e colaboradores (2011) realizaram uma ampla caracterização
da origem molecular de miRNAs ao analisar mais de 15.000 loci de miRNAs de organismos
variados, e sugerem que a maioria destes loci funcionais tiveram origem a partir de elementos
transponíveis. De forma geral, esses e outros estudos demonstram uma participação efetiva
de regiões provenientes de elementos transponíveis na geração de novos genes de miRNA
no genoma.
A autenticidade de miRNAs derivados de sequências repetitivas já é bem documentada
e aceita na literatura (Piriyapongsa e Jordan, 2007). Entretanto, algumas complicações para
a anotação do surgimento de miRNAs derivados de sequências repetitivas residem no fato
de que alguns miRNAs surgem de genes de tRNA e snoRNA, que também possuem uma
origem de sequência repetitiva. Além disso, a região de origem específica do transcrito
não é identificada devido à natureza repetitiva de sua sequência. Assim, a anotação de um
miRNA proveniente de elemento transponível pode gerar sobreposição com a anotação de
outros pequenos RNAs que são gerados por sequências repetitivas (revisado em Ketting,
2011). Apesar da dificuldade de anotação de genes de miRNA provenientes de elementos
transponíveis eles são considerados uma fonte contínua e indispensável para o surgimento
de novos genes de miRNAs ao longo do tempo.

4.7 Transcritos antissenso de miRNA

Sabe-se que hairpins de miRNAs são sequências complementares imperfeitas. Assim,
a transcrição de alguns loci de miRNAs podem gerar transcritos com estruturas e sequências
de hairpin diferentes, mas que ainda podem ser processados pela maquinaria de biogênese
de miRNA. Essa transcrição pode resultar em um novo miRNA com sequências “madura”
e “star” (i.e., miRNA*) distintas (Ruby et al., 2007; Bender 2008; Stark et al., 2008; Tyler

Origem e Evolução de MicroRNAs 51

 et al., 2008), o que modifica as sequências-alvo desse novo transcrito, uma vez que, o principal
fator para o reconhecimento de alvos de um miRNA é sua sequência seed, presente na região
5’ do miRNA maduro. Dessa maneira, a produção de pequenos RNAs a partir de um locus
antissenso de miRNA (Figura 10), indica que esse processo é, de fato, uma das fontes de
surgimento e evolução de novos genes de miRNA.

Nota 1. Distinção entre os termos “miRNA” e “miRNA*”.

A transcrição de um gene de microRNA gera um transcrito primário (pri-miRNA)
que é processado por ela enzima Drosha em um microRNA precursor (pre-miRNA).
Este último apresenta uma estrutura em forma de “grampo de cabelo” (hairpin) que
é composta pelos braços 5p e 3p. O processamento do pre-miRNA pela enzima Dicer
resulta na liberação de um duplex de RNA. Uma das fitas deste duplex é escolhida
seletivamente para formar o miRISC, sendo denominada “fita guia” ou “miRNA
maduro” (Bartel, 2004; Schwarz et al., 2003), enquanto outra fita é degradada, sendo
denominada “passageira”, “miRNA star”, “star” ou miRNA*.

5. Mecanismos de diversificação dos transcritos de miRNAs

Existem mecanismos de diversificação associados à biogênese dos miRNAs que alteram
a expressão quantitativa e qualitativa desses genes. Estes mecanismos moleculares podem
contribuir para um aumento na diversidade do repertório de miRNAs maduros e, como
consequência, podem produzir alterações fenotípicas. Dentre estes mecanismos destacam-se:
(i) a geração de isomiRs (isômeros), (ii) seed shifting (mudanças de seed), (iii) arm switching
(mudanças de braço de leitura), (iv) hairpin shifting (mudanças na estrutura em forma de
grampo) e (v) edição de miRNAs.

Figura 10. Esquema representativo do processo de surgimento de um novo gene de miRNA a partir da transcrição
antissenso de uma sequência precursora. As setas cinzas representam o promotor do gene. Os retângulos cinza
claro representam os genes de miRNA. Os números nos quadrados e nos hairpins correspondem aos braços 5p e 3p.
UT: unidade transcricional.

52 Introdução ao mundo dos microRNAs

 5.1 Alteração da região seed e isomiRs
De acordo com a via canônica de biogênese, o miRNA é transcrito como um miRNA
primário (pri-miRNA) em forma de hairpin, que é processado pelas enzimas Drosha e Dicer
e forma uma estrutura dupla fita de miRNA de aproximadamente 22 pb. Em seguida, uma
das fitas geradas é acoplada a proteínas da família Argonauta e forma o complexo funcional
miRISC (Kim et al., 2009). Como as enzimas Drosha e Dicer não possuem uma clivagem 100%
precisa, múltiplas formas variantes de miRNAs podem ser produzidas como subprodutos a
partir de adição e/ou subtração de nucleotídeos na região dos terminais 5’ e/ou 3’ do miRNA
maduro. Essas formas variantes são denominadas isomiRs, i.e., isômeros ou isoformas de
determinados loci de miRNAs (Figura 11) (Guo et al., 2011; Kuchenbauer et al., 2008; Morin
et al., 2008; Ruby et al., 2006).
Um mesmo pre-miRNA pode gerar um pool de sequências isoméricas irmãs (isomeric
sibling miRNAs – isomiRs) (Ahmed et al., 2014). Nestas sequências, o tipo mais prevalente
de modificação identificada refere-se às extensões de um único nucleotídeo no terminal
3’ (Morin et al., 2008). Embora nucleotídeos adicionais 3’ sejam inseridos após os miRNAs
terem sido gerados, a diversidade no terminal 3’ do isomiR, em parte, talvez, contribua para
a variedade de terminais 5’ de suas fitas passageiras (i.e., o miRNA*). Outro aspecto refere-
se ao nível de divergência dos isomiRs que é semelhante àquele observado na análise da
sequência do miRNA canônico em relação ao miRNA*. Isto porque embora as sequências de
miRNA* sejam conservadas entre diferentes espécies de animais, elas não possuem o alto
nível de conservação das sequências de miRNA canônico (Guo e Lu, 2010).
Alterações no terminal 5’ são consideradas críticas pois resultam em mutações na
sequência seed, considerada a unidade responsável pela especificidade e funcionalidade de
um miRNA sobre o seu mRNA-alvo. A seed é altamente conservada (Lim et al., 2003; Wheeler
et al., 2009), sendo que a alteração de um único nucleotídeo nesta região pode influenciar na
atividade de um miRNA, ao criar novas possibilidades de regulação. Seed shifting (mudança
de da região seed) ocorre nos isomiRs 5’, os quais podem, em teoria, ter diferentes transcritos
como alvos considerando-se a via canônica de ação dos miRNAs (Bartel, 2009). Em função
dessas características, isomiRs 5’ são menos comuns do que isomiRs 3’ (Berezikov et al., 2011;
Chiang et al., 2010). No entanto, para alguns genes de miRNA (por exemplo, mir-79, mir-193
e mir-210 em D. melanogaster (Berezikov et al., 2011; Ruby et al., 2007) e mir-124, mir-133a,
mir-223 camundogos (Chiang et al., 2010) duas ou mais formas de isomiRs 5’ são encontrados
ao ponto de poderem ser comparados e até considerados a forma principal.
Embora miRNAs sejam conservados entre espécies, estas moléculas com alterações no
terminal 5’, muitas vezes podem desencadear um novo processo evolutivo, a partir do qual
desenvolvem uma nova função evolutivamente selecionada (Grimson et al., 2008; Wheeler
et al., 2009; de Wit et al., 2009). As mudanças evolutivas estáveis se referem ao movimento
de 1-2 nt em uma sequência madura de miRNA, tanto para a extremidade 3’ quanto para a
extremidade 5’ e esta alteração por vezes mantém-se conservada entre duas ou mais espécies
(Mallick e Ghosh, 2012). Existem dois tipos diferentes de seed shifting. No primeiro caso,
devido à adição de um nucleotídeo no terminal 5’, ocorre uma mudança no nucleotídeo
da posição 1, comparando esta sequência com outra de uma espécie diferente. No segundo
caso, ocorre uma mudança na sequência de um gene parálogo que difere na posição 1 em
relação a outras cópias do gene no genoma de uma mesma espécie ou de espécies diferentes
(Wheeler et al., 2009).

Origem e Evolução de MicroRNAs 53

 A diversidade de miRNAs observados, para uma determinada espécie, é o resultado
da duplicação de genes de miRNA. Este evento de duplicação quando seguido por um seed
shifting, irá contribuir para que o miRNA primitivo adquira uma nova função, alterando o
alvo previsto (Mallick e Ghosh, 2012), o que promoverá o aumento do repertório de miRNAs
em um organismo.
Atualmente, muitos autores aceitam que os isomiRs são ativos in vivo pois, além de
imunoprecipitarem complexados as proteínas da família Argonauta, mostraram também
atividade nos ensaios com luciferase e clivagem in vitro (Azuma-Mukai et al., 2008; Cloonan
et al., 2011; Lee et al., 2010; Morin et al., 2008). No entanto, não está claro qual a real
contribuição dos isomiRs ao repertório funcional de um gene de miRNA (Neilsen et al., 2012).
Existem evidências de que os isomiRs conferem robustez adicional à atividade do miRNA
canônico na regulação do mRNA alvo (Chiang et al., 2010; Fukunaga et al., 2012; Humphreys
et al., 2012). Da mesma forma, a manutenção de alvos comuns para isomiRs e miRNAs
canônicos seria evolutivamente benéfico pela redução de efeitos inespecíficos ou “off-targets”
(Cloonan et al., 2011). Além dessas mudanças na região seed, outras alterações durante a
biogênese podem conferir também novas funções aos miRNAs.

5.2 Edição de miRNA

A edição de RNA é um mecanismo que leva a um aumento na diversidade de miRNAs,
ao promover a modificação química de bases específicas em um transcrito de RNA tornando
a sequência final diferente de sua sequência genômica inicial. Em mamíferos, o mecanismo
de edição mais comum é catalisado pela ação de duas adenosinas desaminases no RNA,
conhecidas como ADAR e ADARB1 (ou ADAR1 e ADAR2; Nishikura, 2010). Estas enzimas
possuem como alvo moléculas de RNA de fita dupla (dsRNAs) e são competentes na conversão
de adenosina (A) em inosina (I), uma base com características de pareamento similar à
guanosina (G) (Bass, 2006).
Apesar de miRNAs maduros constituirem-se em moléculas de fita simples, eles são
excisados de uma sequência precursora que possui característica de fita dupla em forma de
hairpin e que serve como substrato para a ação das enzimas ADAR (Luciano et al., 2004; Yang
et al., 2006; Blow et al., 2006). Assim, as enzimas ADAR não possuem uma ação indiscriminada no
transcriptoma, uma vez que a edição de miRNAs transcritos foram detectados em uma pequena
porção e em bases específicas (Kawahara et al., 2007a). Entretanto, os fatores que influenciam
a especificidade na ação dessas enzimas ainda são desconhecidos (Kawahara et al., 2008).
Em humanos, a maior frequência de edição de miRNAs maduros se dá na região
seed (Alon et al., 2012), e essa edição acaba por redirecionar os miRNAs para novos alvos
(Kawahara et al., 2007b) Um bom exemplo para o caso, consiste no miR-376a-1. Estudos
revelaram que genes regulados pela forma editada do miR-376a-1 não eram afetados pela
forma canônica (ou sem edição) e vice-versa (Kawahara et al., 2007a). Além disso, a expressão
dos genes alvos eram inversamente proporcionais à frequência de edição desse miRNA
ao longo do desenvolvimento embrionário em camundongo (Ekdahl et al., 2012). Outra
questão marcante na edição de miRNAs reside no fato de que este processo pode alterar a
expressão de um miRNA editado ao inibir a ação das enzimas Drosha e Dicer no processo
de biogênese do miRNA (Yang et al., 2006; Kawahara et al., 2007b). Um estudo, realizado em
camundongos deficientes na produção de ADAR e ADARB1, demonstrou que um terço dos
miRNAs estão sub-expressos em comparação à expressão em camundongos selvagens ao
longo do desenvolvimento. Esses resultados indicam que a presença das proteínas ADAR

54 Introdução ao mundo dos microRNAs

pode interferir na finalização do processo de biogênese, ao se ligarem à molécula precursora
de miRNA, ainda que não haja edição (Vesely et al., 2012).
Notadamente alguns miRNAs conservados mostraram-se sujeitos à edição exatamente
na mesma posição nucleotídica em diferentes organismos, de peixes a humanos (Kawahara
et al., 2008; Chiang et al., 2010; Alon et al., 2012; Warnefors et al., 2014). Dentre esses miRNAs
conservados editados, alguns demonstraram expressão significativa no tecido nervoso (cérebro
e cerebelo) de macacos e humanos, o que sugere sua participação no processo evolutivo
desse tecido, altamente desenvolvido, em primatas (Warnefors et a., 2014). De fato, estes
achados quanto à acentuada edição de miRNAs em tecido neuronal são consistentes com a
predominante expressão neuronal das ADARs (Li et al., 2014).

5.3 Alteração de braço de leitura de miRNAs

A origem de novos miRNAs por “arm switching”, ou alteração de braço, foi reportada
tanto em relação a genes parálogos quanto para genes ortólogos (Marco et al., 2010; Wheeler
et al., 2009).
Neste tipo de evento, o que ocorre é simplesmente a troca dos braços, ou seja, o braço
que seria descartado agora passa a formar o miRNA maduro e vice-versa. Consequentemente
há uma mudança quanto à fita do duplex de miRNA que é escolhida para formar o complexo
funcional miRISC (Bartel, 2004; Schwarz et al., 2003).
Estudos anteriores sugerem que esta escolha do braço é governada pela estabilidade
assimétrica da formação da dupla fita miRNA-miRNA*, resultante da clivagem pela Dicer
(Schwarz et al., 2003; Hutvagner, 2005). Este padrão implica em um mecanismo guiado
primeiramente por propriedades termodinâmicas no processamento da dupla fita. No entanto,
verificou-se que as sequências do miR-10 do Tribolium casteneum e Drosophila melanogaster
mostraram oposição a este padrão de dominância. A dupla fita resultante entre essas espécies
possui sequências idênticas e, portanto, contêm propriedades termodinâmicas similares.
Entretanto, a escolha pelo braço é significativamente diferente entre as espécies. Esses dados
sugerem que as propriedades termodinâmicas envolvidas não são o principal fator para
seleção do braço a ser adicionado ao miRISC (Griffiths-Jones et al., 2011).
A seleção de um miRNA maduro (braço 5p ou 3p) é sempre arquitetada com
probabilidade desigual com base no mecanismo de seleção por pontes de hidrogênio (Griffiths-
Jones et al., 2006), mas a literatura recente sugere que a seleção dos diferentes braços pode
variar entre diferentes tecidos, estágios de desenvolvimento e espécies (Cheng et al., 2013;
Cloonan et al., 2011; Griffiths-Jones et al., 2011; Li et al., 2010, 2011, 2012a; Marco et al., 2010).
As mudanças quanto à escolha do braço podem ser muito significativas, visto que loci
homólogos de miRNA podem desempenhar funções discrepantes apenas por apresentarem
um padrão de expressão diferencial de um dos dois braços do miRNA (5p e/ou 3p). Além
de mudanças quanto à escolha do braço, mudanças no hairpin também podem alterar a
biogênese do miRNA.

5.4 Mudança de hairpin

Enquanto no arm switching a sequência precursora em hairpin se mantém a mesma,
no hairpin shifting (i.e., mudança da estrutura em formato de grampo) observa-se uma
modificação na estrutura do hairpin gerado (de Wit et al., 2009), ou seja, todo o hairpin é
“reconfigurado” (Figura 12).

Origem e Evolução de MicroRNAs 55

 Em algumas famílias de miRNA, o miRNA maduro é gerado a partir de um dos braços
de um dos membros da família e, ao mesmo tempo, pelo braço oposto do membro adjacente
da família (de Wit et al., 2009). Geralmente, famílias de miRNAs surgem por eventos de
duplicação; assim, arm switching do hairpin mantendo a mesma sequência do miRNA maduro
pode explicar a evolução de uma nova sequência de pre-miRNA a partir de um dos braços
do hairpin antigo com outro braço das sequências adjacentes up- ou downstream (Figura 12).
Esse processo de mudança de hairpin foi identificado em 8 de 15 famílias de miRNA
de nematódeos (de Wit et al., 2009), indicando ser um processo comum na evolução das
famílias e na diversificação dos transcritos de miRNA. É importante salientar que a mudança
na sequência genômica utilizada como molde provocada pelo hairpin shifting, promove a
geração de novas sequências de miRNA*, as quais passam a compor o novo repertório de
moléculas regulatórias e proporcionam, portanto, novas possibilidades para diversificação
dos miRNAs.

6. Considerações finais
Enquanto os eventos que levaram à formação inicial de muitos loci de miRNAs
nas primeiras formas de vida talvez nunca sejam totalmente compreendidos, os esforços
cumulativos dos trabalhos sumarizados neste capítulo demonstram, de forma inequívoca, uma
notável escalada de complexidade na história evolutiva dos genes e transcritos de miRNAs.
Toda a extensa rede de interações gênicas, cuja interatividade extrapola a divisão
dos reinos da vida e do limite celular, tecidual ou mesmo do organismo, tem se mostrado,
em maior ou menor escala, dependente da atividade moduladora dessa ampla classe de
pequenos RNAs regulatórios.
Em última análise, à medida que iniciativas em pesquisa voltadas à descoberta e
caracterização de miRNAs crescem em importância, novas ferramentas, metodologias e abordagens
tornaram-se obrigatórias para fomentar o entendimento da regulação da expressão de genes
e o funcionamento do próprio genoma. Consequentemente, todos os eventos e mecanismos
associados à origem e evolução de miRNAs, pautados nas diferentes sessões deste capítulo,
devem ser colocados em discussão considerando-se que, em última análise, interferem na
geração de novas interações miRNAs-alvos, e assim promovem o surgimento de variabilidade
genética. Mais do que isso, em função dos efeitos combinatórios complexos sobre a regulação
gênica exercidos por muitos miRNAs, cada qual com seu efeito próprio, é comum observar
que miRNAs e seus alvos co-evoluem (Barbash et al., 2014; Zhao et al., 2015). Em função disto,
polimorfismos acumulam-se não apenas nos miRNAs, como o exemplo dos isomiRs, mas também
nas sequências-alvo, e conjuntamente se constituem no substrato ideal para a geração de pequenas
variações fenotípicas sobre as quais a seleção natural poderá atuar. Resta ser determinada a
relativa contribuição da evolução de diferentes mecanismos de regulação gênica à evolução
dessa diversidade fenotípica em plantas e animais (Chen e Rajewski, 2007).
Em linhas gerais, a análise do componente evolutivo atrelada à análise estrutural e
funcional de miRNAs mostram-se fundamentais para o entendimento de grande parte dos
sistemas biológicos viventes e potencialmente se tornará um complemento indispensável
às mais diversas pesquisas em desenvolvimento, dado seu caráter integrador. Portanto, a
continuidade nas investigações sobre a origem e evolução de miRNAs nos mais diversos
organismos certamente trará novas contribuições quanto à centralidade dessas pequenas
moléculas no controle da expressão gênica frente a diferentes contextos no genoma.

56 Introdução ao mundo dos microRNAs

Figura 11. Representação do processo de geração de isomiRs de um miRNA. As letras verdes representam os
nucleotídeos flanqueadores da sequência madura segundo o miRBase. As letras azuis representam o transcrito do miRNA
maduro. As letras vermelhas representam as variação na sequência do miRNA maduro, que são chamadas de isomiRs.

Figura 12. Esquematização do processo de mudança de hairpin de um miRNA. A linha em preto perfaz toda a
molécula de RNA. A linha em verde, indica o miRNA 5’ inicial e o quadrado azul associado representa sua região seed.
A linha em vermelho indica o miRNA* do hairpin inicial que posteriormente deixa de compor o hairpin com a mudança
estrutural da molécula. A linha roxa representa o miRNA* do novo hairpin gerado.

Origem e Evolução de MicroRNAs 57

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Origem e Evolução de MicroRNAs 63
Regulação da abundância Capítulo
de miRNAs 3
Transcrição, processamento,
exportação, modificações
pós-transcricionais, edição e
degradação

Ighor L.G. Arantes1, Prof.a Dr.a Maité F.S. Vaslin2, Carolina Alves Pereira Corrêa3,
Prof. Dr. Tiago Campos Pereira4 e Prof. Dr. Régis L. Corrêa1
1
Depto. de Genética, Instituto de Biologia, UFRJ
2
Depto. de Virologia, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Goes, UFRJ
3
Depto. de Pediatria, FMRP, USP
4
Depto. de Biologia, FFCLRP, USP

Estruturação do capítulo
1. Introdução
2. Seção A – Biogênese e sua regulação
2.1 A transcrição de microRNAs
2.1.1 Regulação da transcrição
2.2 Processamento do pri-miRNA em pre-miRNA
2.2.1 Regulação do processamento por Drosha
2.3 Exportação para o citoplasma
2.4 Processamento do pre-miRNA no citoplasma
2.4.1 Regulação do processamento por Dicer
2.5 Processamento de miRNAs em plantas
2.6 Modificações pós-transcricionais
2.6.1 Regulação através da cauda
2.6.2 Edição de RNA
2.6.3 Metilação
2.7 Formação do complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC)
2.7.1 Regulação das proteínas AGO
2.7.2 Regras para a seleção da fita guia
2.8 Vias não canônicas de biogênese
3. Seção B – Degradação e sua regulação
3.1 Degradação de miRNAs
4. Considerações finais

Regulação da abundância de miRNAs 65

 1. Introdução
Até o início da década de 1990 sabia-se que o genoma de eucariotos era capaz de
produzir alguns tipos de RNAs não codificantes (ncRNAs), ou seja, RNAs que não apresentam
fases abertas de leitura (Open Reading Frames – ORFs) para a geração de proteínas. No
entanto, os ncRNAs mais conhecidos até então eram os RNAs transportadores (tRNAs) e
ribossomais (rRNAs), ambos envolvidos de alguma forma no processo de síntese proteica
a partir de RNAs mensageiros (mRNAs). Hoje, no entanto, sabe-se que eucariotos podem
produzir uma ampla gama de ncRNAs. Dentre esses RNAs, os microRNAs (miRNAs) são os
mais bem estudados e caracterizados. Esses RNAs apresentam uma fita simples contendo
de 20 a 24 nucleotídeos (nt) de extensão e atuam principalmente na regulação negativa da
expressão gênica, desestabilizando mRNAs e/ou interferindo na produção das proteínas
que codificam. A descoberta dos miRNAs e da rede de regulação em que estão envolvidos
revolucionou a genética nas últimas duas décadas (Axtell et al., 2011).
Mais de 60% dos genes humanos codificadores de proteínas contêm pelo menos um sítio
de ligação de miRNA conservado e, considerando-se que numerosos sítios não conservados
também existem, a maioria dos genes que codifica proteínas pode estar sob o controle de miRNAs
(Friedman et al., 2009). Assim, não é de se estranhar que biogênese e função dos miRNAs sejam
bem controladas e que sua desregulação é frequentemente associada a patologias, inclusive
câncer e desordens do desenvolvimento neurológico (Lujambio e Lowe, 2012).
A abundância de determinado miRNA em um determinado tecido em um determinado
período do desenvolvimento é resultado do balanço entre sua biossíntese (ou biogênese) e
sua degradação.
Neste capítulo serão apresentados detalhadamente: (i) o processo de biossíntese dos
miRNAs, que envolve diversas etapas (transcrição, processamento, exportação, modificações
pós-transcricionais, edição, associação com proteínas AGO – Kim et al., 2009; Krol et al., 2010;
Siomi e Siomi, 2010), (ii) a degradação deles, assim como (iii) a regulação desses dois processos.

2. Seção A – Biogênese e sua regulação

A biogênese de um miRNA diz respeito a todos os eventos, a partir do gene, até se chegar
ao miRNA maduro integrado ao complexo RISC, ou seja: (a) a transcrição, (b) a maturação
e (c) a incorporação do miRNA em RISC (figura 1) (Ha e Kim, 2014).
A maturação, por sua vez, refere-se às etapas que envolvem: (i) o processamento
do pri-miRNA por DROSHA, (ii) do pre-miRNA por DICER e (iii) outras modificações até a
obtenção do miRNA maduro (RNA de fita simples de 22 nt) antes de sua incorporação em
RISC (Lee et al., 2002).

2.1 A transcrição de microRNAs

Os miRNAs são produzidos a partir de precursores de RNA em forma de grampo
denominados miRNAs primários (pri-miRNAs). Esses são transcritos pela RNA polimerase II
(RNA Pol II) e o grampo em questão é caracterizado por um eixo de RNA de dupla fita (dsRNA)
com alguns nucleotídeos não pareados e conectados por uma região terminal de RNA fita
simples (alça). Possuem uma 7-metilguanosina (CAP) no 5’ terminal, são poliadenilados no 3’ e
apresentam tamanho variado, podendo ser constituídos por mais de mil nucleotídeos (Axtell

66 Introdução ao mundo dos microRNAs

 67
Regulação da abundância de miRNAs
Figura 1. Visão geral da biogênese de microRNAs. As modificações pós-transcricionais podem ocorrer em diferentes momentos da maturação. MiRISC é composto por AGO, miRNA
maduro e outras proteínas (contorno descontínuo).
 et al., 2011) (figura 1). Por outro lado, alguns estudos demonstram que a RNA Pol III também
pode participar do processo de transcrição dos miRNAs como, por exemplo, a transcrição de
alguns miRNAs virais (Pfeffer et al., 2005). Além disso, o tRNA pode originar alguns miRNAs
endógenos, fazendo com que haja uma participação indireta da RNA Pol III nesse processo,
já que essa enzima contribui para a transcrição dos tRNAs (Barbiaz et al., 2008).

2.1.1 Regulação da transcrição

Estudos aprofundados em diferentes genomas demonstraram que miRNAs podem,
de modo geral, estar em diversos locais e configurações: isolados ou agrupados em regiões
intergênicas ou em íntrons e éxons de genes codificantes (figura 2A-F). Genes de miRNAs isolados
apresentam promotores próprios e estão geralmente localizados em regiões intergênicas (figura
2A). No entanto, muitos miRNAs encontram-se agrupados lado a lado, formando unidades
policistrônicas, ou seja, unidades em que vários genes são regulados pelo mesmo promotor
e, consequentemente, transcritos simultaneamente (figura 2B). Genes de miRNAs localizados
em íntrons, no entanto, muitas vezes não apresentam promotores próprios, dependendo
da transcrição e processamento do mRNA heterogêneo (no qual estão embebidos) para
sua formação (figura 2C). Esse tipo de miRNA é muito mais comum em animais do que em
plantas (Axtell et al., 2011). Existem, no entanto, miRNAs localizados em íntrons possuindo
seus próprios promotores (Aboobaker et al., 2005; Martinez et al., 2008; Isik et al., 2010).
Nesses casos, o promotor localiza-se também dentro da região intrônica e o miRNA pode
apresentar orientação senso ou antissenso em relação ao mRNA (figura 2D). Existe ainda
uma classe peculiar de miRNAs localizados em íntrons chamados de miRtrons (junção das
palavras miRNA e íntron), que são processados pela maquinaria de recomposição (splicing)
responsável por excisar os íntrons e juntar os éxons (Okamura et al., 2007; Ruby et al., 2007;
Flynt et al., 2010)(figura 2E). A maioria dos miRtrons descritos até hoje foram encontrados
em animais, no entanto há evidências de que também possam existir em plantas (Zhu
et al., 2008). Semelhantemente, existem miRNAs localizados em éxons (figura 2F) e regiões 3’
não traduzidas de genes. Esses miRNAs, no entanto, são raros e foram encontrados apenas em
animais (Berezikov et al., 2011). Por fim, existem miRNAs localizados na junção entre éxons
e íntrons. Esse tipo de miRNA é mais observado em mamíferos do que em outros grupos.
A RNA Pol II efetua a transcrição dos miRNAs, sendo controlada por fatores de
transcrição associados, como p53, MYC, ZEB1, ZEB2 e MYOD1, e por reguladores epigenéticos,
como metilação do DNA e modificações de histonas. Promotores de miRNAs, assim como de
genes codificantes, apresentam TATA box, modificações em proteínas histona associadas com
atividade transcricional (e.g., acetilação) e elementos de reconhecimento de fatores básicos
de iniciação (e.g., fator de transcrição IIB - TFIIB) envolvidos na formação do complexo de
pré-iniciação da Pol II (Cai et al., 2004; Lee et al., 2004a; Megraw et al., 2006; Zhao et al., 2013).
Assim como mRNAs, miRNAs podem ser regulados por fatores ambientais. As plantas,
por serem sésseis, estão permanentemente expostas a estresses de diferentes naturezas.
Esses distúrbios, tanto bióticos quanto abióticos, são uma grande fonte de modulação da
transcrição de miRNAs. Centenas de miRNAs cujos níveis de expressão possuem relação
com a temperatura ambiente, por exemplo, já foram identificados.
Os fatores de transcrição que reconhecem e transcrevem genes de miRNAs podem
ser diretamente regulados pelos próprios miRNAs maduros, criando circuitos de “feedback”
negativos (Enright et al., 2003) (figura 3A-C). Em alguns casos, um fator de transcrição pode

68 Introdução ao mundo dos microRNAs

 69
Regulação da abundância de miRNAs
Figura 2. Possíveis localizações de miRNAs em genomas. Genes de miRNAs podem estar dispostos em regiões intergênicas (A-B) ou dentro de genes (C-F). (A) MiRNA isolado em região
intergênica. O processo de transcrição leva à produção de apenas um tipo de transcrito, contendo apenas um pre-miRNA. (B) MiRNAs agrupados em região intergênica. Cada transcrito
produzido pode conter mais de um pre-miRNA, dependendo do promotor existente. Quando o grupamento é controlado por um promotor único, cada transcrito apresentará mais de um pre-
miRNA, gerando, assim, mais de um miRNA. Se existirem promotores internos (setas hachuradas), no entanto, cada gene transcrito será uma unidade transcricional independente, gerando
apenas um tipo de miRNA maduro (de acordo com a linha hachurada da transcrição em A). (C) Genes de miRNAs residentes em íntrons podem ser controlados pelo promotor do gene onde
estão localizados ou podem possuir promotores próprios (setas hachuradas), na orientação senso ou antissenso em relação ao mRNA. Se isolados, cada transcrito apresentará apenas um tipo
de pre-miRNA. (D) Quando miRNAs intrônicos estão agrupados, o transcrito pode conter mais de um tipo de pre-miRNA, dependendo da existência de promotores internos (setas hachuradas)
dentro de cada gene de miRNA. (E) Quando o processamento de pri-miRNA para pre-miRNA de um gene intrônico ocorre de forma dependente da maquinaria de recomposição, ou seja,
independente de RNases do tipo III (Drosha e Dicer), caracteriza-se a existência de um miRtron. (F) Genes de miRNAs podem estar localizados também dentro de éxons de genes codificantes.
Setas sólidas na figura representam promotores gênicos. Setas hachuradas representam outras possibilidades de promotores independentes. Retângulos compostos por partes vermelhas,
pretas e azuis: gene de microRNA. Retângulos verdes: exóns. Retângulo composto por partes vermelhas, pretas e azuis e demarcado por linha verde: gene de microRNA dentro de um éxon.
Note que tanto no “locus gênico” quanto nos pri-miRNAs e pre-miRNAs a parte vermelha corresponde, por exemplo, à fita senso do miRNA, a parte preta, à alça e a parte azul, à fita antissenso.
 ativar um miRNA e esse, por sua vez, passa a reprimir o mRNA codificador do próprio fator
de transcrição, reduzindo seus níveis (figura 3A).
Além de “feedbacks” simples entre miRNAs e seus fatores de transcrição, já foram
observados casos de sistema de retroalimentação em laço, nos quais há a interação de um
terceiro componente, geralmente outro gene que é simultaneamente regulado pelos dois
primeiros componentes (figura 3D-H). Nesses processos há sempre um fator de transcrição
que regula ao mesmo tempo a expressão de um miRNA e de seu alvo.
Estudos da arquitetura das redes de interação entre miRNAs, seus reguladores e
alvos regulados têm observado que esse sistema permite uma modulação controlada de
genes importantes, impedindo flutuações excessivas de sua expressão. Processos importantes
como crescimento e diferenciação celular e até mesmo o desenvolvimento são norteados
pelo controle da expressão de miRNAs.

2.2 Processamento do pri-miRNA em pre-miRNA

O pri-miRNA é longo e apresenta uma estrutura de stem-loop, ou seja, um tronco (stem)
que apresenta 33-35 pares de bases, um terminal em forma de alça (loop) e segmentos de
fita simples (braços) de RNA tanto no lado 5’ como no lado 3’ (figura 1). O processamento
de pri-miRNAs ocorre no núcleo e pode ser realizado de forma simultânea com o processo
de transcrição (Kim e Kim, 2007; Morlando et al., 2008).
A primeira etapa da maturação é chamada de cropping e envolve a conversão do
pri-miRNA em pre-miRNA pela DROSHA (figura 1) (Ha e Kim, 2014). Essa é uma enzima
nuclear que possui um domínio de ligação a dsRNA e dois domínios do tipo RNase III, cada
um envolvido na clivagem de um dos braços do pri-miRNA (Lee et al., 2003). Assim, Drosha

Figura 3. Regulação transcricional de miRNAs. Resumo das possíveis interações entre fatores de transcrição (FT) e
miRNAs. (A) Um FT se liga no promotor do gene de miRNA e o induz. O miRNA produzido, por sua vez, inibe o mRNA
do FT que o ativa. (B) Um FT se liga no promotor do gene de miRNA e o reprime. O miRNA, quando produzido, inibe o
mRNA do FT que o reprime. (C) Interação entre dois fatores transcricionais e dois miRNAs. O FT1 induz a expressão
do miRNA1. Esse inibe o mRNA codificador do FT2. Quando produzido, o FT2 induz a expressão do miRNA2. Esse inibe
o mRNA do FT1. (D-H) Interações entre fatores de transcrição, miRNAs e alvos de miRNAs não relacionados com os
mRNAs codificadores dos fatores transcricionais: (D) FT ativa a expressão de um miRNA e de seu alvo. (E) FT reprime
a expressão de um miRNA e de seu alvo. (F) FT ativa um miRNA e colabora com ele na repressão de seu alvo. (G) FT
reprime expressão de um miRNA e ativa a expressão de seu alvo. (H) FT induz a expressão de um miRNA, podendo
tanto ativar quanto reprimir a expressão de seu alvo.

70 Introdução ao mundo dos microRNAs

apresenta em seu terminal carboxila, domínios RIIIDs, que são responsáveis pelos cortes
das extremidades 3’ e 5’, e um domínio dsRBD, que se liga a dsRNA.
A ação da enzima Drosha, no entanto, depende de outras proteínas acessórias, como
DGCR8 (DiGeorge Syndrome Critical Region 8), também conhecida como Pasha em invertebrados.
Esse cofator, que apresenta dois domínios de ligação a dsRNA-dsRBD, liga-se à região mediana
de DROSHA para dar suporte à atividade de ligação à dupla fita de RNA. Juntas, DGCR8 e
DROSHA formam um complexo chamado “microprocessador” (Denli et al., 2004; Gregory
et al., 2004; Han et al., 2004a; Landthaler et al., 2004), responsável por converter o pri-miRNA
em um miRNA precursor (pre-miRNA) em forma de hairpin (do inglês, grampo de cabelo) de
aproximadamente 65 nucleotídeos (Denli et al., 2004; Gregory et al., 2004; Han et al., 2004a;
Landthaler et al., 2004) (figura 1).
A clivagem de DROSHA define o terminal do miRNA, portanto é importante que o
microprocessador reconheça e clive precisamente o pri-miRNA. Dessa forma, DROSHA cliva
o hairpin a aproximadamente 11 pares de bases acima da junção basal e aproximadamente
22 pares de bases abaixo da porção do loop (Han et al., 2006; Zeng et al., 2005).

2.2.1 Regulação do processamento por DROSHA

Além de participarem do processamento em si, essas proteínas acessórias de Drosha
podem também regular a produção de miRNAs. Os dsRBDs de DGCR8, por exemplo, estabilizam
a expressão de Drosha. Essa, por sua vez, pode clivar grampos existentes no mRNA de DGCR8,
diminuindo seus níveis. Esse sistema mantém a proporção de Drosha e DGCR8, garantindo
o processamento correto de pri-miRNAs (Han et al., 2009; Triboulet et al., 2009). Outro
mecanismo de regulação pela proteína DGCR8 é a sua desacetilação pela Histona Desacetilase
1 (HDAC1), que aumenta a afinidade de DGCR8 com pri-miRNAs (Wada T. et al., 2012).
Determinados pri-miRNAs podem ser ainda regulados por outras proteínas específicas.
O exemplo mais emblemático ocorre no miRNA let-7 (“lethal-7”). Esse miRNA é altamente
conservado em animais e está envolvido no controle do ciclo celular. Sua expressão reprime
o processo de proliferação e inicia a conversão em células-tronco pluripotentes (Reinhart
et al., 2000). Problemas em sua regulação podem levar ao desenvolvimento de tumores
(Mayr et al., 2007). Em células-tronco, a proteína Lin-28 se liga especificamente ao pri-
miRNA de let-7, impedindo que seja clivado por Drosha (Viswanathan et al., 2008). Células
em diferenciação expressam menos Lin-28, promovendo o aumento de let-7. Muitos tumores
humanos apresentam expressão constitutiva de Lin-28, mostrando a importância de sua
regulação (Viswanathan et al., 2009). Existem outras proteínas que regulam conjuntos de
miRNAs compartilhando características específicas. É o caso, por exemplo, da regulação
positiva mediada por proteínas Smads, integrantes da cascata de sinalização mediada pelos
fatores de crescimento das famílias BMP (Bone Morphogenetic ProteinTransforming
Growth Factor Beta). Um conjunto de aproximadamente 20 miRNAs apresenta sequências de
ligação a proteínas Smads (Davis et al., 2010). Quando ativadas, essas proteínas promovem
uma aceleração do processo de biogênese desses miRNAs por Drosha (Davis et al., 2008).
Por fim, polimorfismos de um único nucleotídeo (SNPs) são encontrados em
miRNAs e podem afetar sua biogênese e/ou alterar sua especificidade com seu alvo (Ryan
et al., 2010). Por exemplo, um SNP de citosina para timina em uma região específica do
pri-miR-15a~16-1 reduz o processamento por DROSHA e, consequentemente, a produção

Regulação da abundância de miRNAs 71

 do miR-16 (Auyeung et al., 2013). Essa modificação pode estar associada com a patogênese
em leucemia linfóide crônica (Calin et al., 2005).

2.3 Exportação para o citoplasma

Após o processamento do pri-miRNA em pre-miRNA por Drosha, para que a maturação
seja concluída esse pre-miRNA precisa ser exportado do núcleo para o citoplasma. Para
isso, a proteína exportina 5 (EXP5) (figura 1) forma um complexo de transporte com uma
proteína nuclear RAN de ligação a GTP (RAN-GTP) e o pre-miRNA (Bohnsack et al., 2004;
Lund et al., 2004; Yi et al., 2003). Após a translocação do complexo pelo poro nuclear, GTP é
hidrolisado, resultando na desmontagem do complexo e posterior liberação do pre-miRNA
no citosol (Okada et al., 2009).

2.4 Processamento do pre-miRNA no citoplasma

Uma vez no citoplasma, o pre-miRNA é clivado por Dicer próximo à porção terminal da
alça para a liberação do duplex de miRNA. Homólogos de Dicer estão amplamente distribuídos
nos eucariotos, inclusive fungos, plantas e animais. Embora a maioria das espécies, incluindo
nematoides e mamíferos, possua uma única Dicer, algumas espécies possuem diversos
homólogos com diferentes funções. Por exemplo, na mosca D. melanogaster existem duas
Dicers, sendo uma responsável pela produção de miRNAs (Dicer-1) e outra envolvida com
a síntese de outros pequenos RNAs (Dicer-2) (Lee et al., 2004b).
Em geral, DICER cliva sítios que estão localizados a uma distância fixa da porção 3’
do dsRNA, que apresentam aproximadamente 21-25 nucleotídeos; porém esse mecanismo
depende da espécie e do tipo de DICER (Zhang et al., 2004; Macrae et al., 2006; MacRae
et al., 2007; Vermeulen et al., 2005).

2.4.1 Regulação do processamento por DICER

Assim como Drosha, a clivagem por Dicer necessita da ajuda de uma proteína ligante
a RNA de dupla fita (dsRBP). Nesse caso, a dsRBP em questão recebe o nome de TRBP (TAR
RNA-Binding Protein) em mamíferos e de Loquacious (Loqs) em D. melanogaster (Chendrimada
et al., 2005; Förstemann et al., 2005).
Em Droshopila spp. Dicer-1 se liga a uma das duas isoformas de Loqs, Loqs-PA e
Loqs-PB, cada uma contendo três dsRBDs. Similarmente, a Dicer de humanos interage com
TRBP, que é homólogo a Loqs-PB, também com três dsRBDs, e que regula o processamento
do pre-miRNA através da interação com algumas proteínas. Por exemplo, TRBP, pode ser
estabilizada através de fosforilação mediada por proteínas quinases específicas (Paroo
et al., 2009). O mRNA codificador de Dicer pode ser regulado também por let-7 (Forman
et al., 2008). KSPR facilita o processamento mediado por DICER através de sua interação
com o loop do pre-miRNA.
Outro exemplo de regulação é visto em condições sob hipóxia, em que o receptor do
fator de crescimento epidérmico (EGFR) fosforila AGO2, resultando em uma dissociação de
AGO2 de DICER e, consequentemente, na redução no processamento do pre-miRNA (Shen
et al., 2013).
Por fim, o processo de edição do miRNA assim como sua metilação também apresentam
um impacto na regulação de alguns pre-miRNAs, como será discutido (Trabucchi et al., 2009).

72 Introdução ao mundo dos microRNAs

 2.5 Processamento de miRNAs em plantas
O processamento de pri-miRNAs em pre-miRNAs em plantas se assemelha muito ao que
ocorre em animais (figura 4). Existem, no entanto, diferenças importantes. Por exemplo, em
plantas não existe uma enzima equivalente a Drosha e a clivagem de pri-miRNAs é realizada
por uma enzima Dicer (figura 4D). As enzimas Dicer são caracterizadas por possuírem dois
domínios de RNase III, um domínio de ligação a dsRNA, um domínio PAZ, e um domínio de
helicase DEAD/H box (Margis et al., 2006). Na planta modelo A. thaliana existem quatro genes

A. Via canônica em B. Via independente C. Via independente D. Via canônica em

células animais de Dicer em animais de Drosha em animais células de plantas
Gene MIR Gene MIR Gene MIR Gene MIR
RNA RNA RNA
Polimerase II Polimerase II Polimerase II

RNA
pri-miRNA Polimerase II/
5’CAP A(n) 5’CAP A(n) Spliceossomo 5’CAP A(n)
DCL1/TGH/
Drosha/DGCR8 Drosha/DGCR8 DRB1/SE/
CPL1/DDL

pre-miRNA
Citoplasma Núcleo

Citoplasma Núcleo

Citoplasma Núcleo
RAN-GTP/EXP-5

RAN-GTP/EXP-5
RAN-GTP/EXP-5

DCL1/TGH/
DRB1/SE/
Dicer/TRBP/ Dicer/TRBP/ CPL1/DDL
ADAR1 ADAR1

Núcleo
RAN-GTP/HST
miRNA:miRNA* RISC
AGO 2

Citoplasma
miRNA maduro/ RISC AGO 1-4 RISC RISC RISC
AGO 2 AGO 1-4 AGO 1
RISC

Inibição de alvos Inibição de alvos Inibição de alvos Inibição de alvos

específicos específicos específicos específicos

Figura 4. Biogênese de miRNAs em animais e plantas. (A) Na via padrão de geração de miRNAs em animais, os genes
de miRNAs são transcritos pelo complexo da RNA Pol II no núcleo. O pri-miRNA gerado apresenta 7-metilguanosina
(CAP) na ponta 5’ e poliadenilação [(A)n] na região 3’. Seu processamento inicial é feito por Drosha, uma proteína do
tipo RNase III. Drosha atua com outros parceiros, entre eles uma proteína ligadora de RNA dupla fita (dsRBP). Em
mamíferos, essa dsRBP é chamada DGCR8 (DiGeorge Syndrome Critical Region 8). O pre-miRNA gerado é então exportado
para o citoplasma pela proteína Exp-5 (Exportin-5), com auxílio da proteína de transporte nuclear RAN-GTP. Uma vez
no citoplasma, o pre-miRNA é convertido em duplex de miRNA através do complexo de Dicer. Uma dsRBP chamada
TRBP (TAR RNA-Binding Protein) em mamíferos e a proteína ADAR1 (Adenosine Deaminase Acting on RNA1) também
fazem parte do complexo. Em seguida, uma das fitas do duplex de miRNA é selecionada para entrar no complexo
RISC (RNA-Induced Silencing Complex), contendo proteínas do tipo Argonauta. Em mamíferos, miRNAs podem entrar
em quatro distintas proteínas Argonautas (AGO 1-4). O complexo irá então reprimir alvos específicos por clivagem ou
inibição da tradução. (B) Alguns miRNAs podem ser gerados através de uma via independente de Dicer. Todas as etapas
de transcrição e processamento de pri-miRNAs ocorrem como descrito na via canônica. Ao chegar no citoplasma, no
entanto, a proteína Argonauta AGO2 em mamíferos é capaz promover a maturação do pre-miRNA em miRNA, mesmo
sem o auxílio de Dicer. (C) MiRtrons em animais são capazes de gerar miRNAs maduros de uma maneira independente
de Drosha. Nesse caso, a própria maquinaria de recomposição faz a conversão de pri-miRNAs em pre-miRNAs. Esses
são exportados para o citoplasma e seguem a via padrão de processamento por Dicer. (D) Em plantas, os pri-miRNAs
são processados por um complexo contendo a enzima Dicer DCL1 (Dicer-like1), uma dsRBP chamada DRB1 (DsRNA
BINDING PROTEIN1), além das proteínas SE (SERRATE), TGH (TOUGH), CPL1 (C-TERMINAL DOMAIN PHOSPHATASE-
LIKE1), a proteína DDL (DAWDLE), entre outras. O processamento de pre-miRNAs também é realizado no núcleo pelo
complexo DCL1. No entanto, há ainda a participação da proteína HEN1 (Hua-Ehancer 1), que promove uma metilação
neles. O miRNA produzido é exportado com o auxílio da proteína HST (HASTY) para o citoplasma e incorporado em
RISC contendo AGO1, preferencialmente.

Regulação da abundância de miRNAs 73

 relacionados com a Dicer de animais (chamadas “Dicer-like” ou DCL), sendo um deles DCL1,
responsável pelo processo de biogênese de miRNAs (Park et al., 2002; Reinhart et al., 2002;
Xie et al., 2004).
DCL1 atua inicialmente clivando na base do “grampo” (de cabelo; hairpin) do pri-
miRNA, gerando o pre-miRNA (Bologna et al., 2009; Mateos et al., 2010; Song et al., 2010;
Werner et al., 2010). A prevalência de miRNAs de 21 nucleotídeos em plantas advém da
predominante ação de DCL1 nesse processo. Alguns precursores, no entanto, podem ser
processados por uma das outras DCLs de plantas, gerando miRNAs maduros de tamanhos
divergentes (Rajagopalan et al., 2006; Vazquez et al., 2008; Ben Amor et al., 2009).
Assim como ocorre na Drosha de animais, a ação da DICER depende da participação de
outras macromoléculas, organizando um complexo proteico e garantindo eficiência e acurácia
no processamento. As proteínas DRB1 (DsRNA Binding Protein 1) e SE (SERRATE) são duas
dessas colaboradoras. De maneira semelhante à proteína DGCR8 de animais, DRB1 possui
um sítio de ligação a dsRNA, sendo, portanto, sua equivalente funcional (Han et al., 2004b;
Vazquez et al., 2004; Kurihara et al., 2006). Dados recentes indicam que uma proteína da
mesma família de DRB1, chamada de DRB2 (DsRNA Binding Protein 2) também pode participar
da biogênese de alguns miRNAs, influenciando inclusive o modo de sua atuação posterior
em alvos (Reis et al., 2015). Já SE é uma proteína com domínio do tipo “dedo de zinco” (zinc
finger) e sua função no complexo é semelhante à observada para proteína ARS2 de animais
(Grigg et al., 2005; Yang et al., 2006a).
Outras proteínas podem ser encontradas no complexo com DCL1-DRB1-SE: a proteína
com domínio de ligação a dsRNA TGH (Tough) (Ren et al., 2012), a fosfatase CPL1 (C-terminal
domain Phosphatase-Like 1) (Manavella et al., 2012), a proteína ligante de treonina fosforilada
DDL (Dawdle) (Yu et al., 2008), a proteína rica em prolina SIC (SICKLE) (Zhan et al., 2012), a
proteína ligante de RNA MOS2 (MODIFIER OF SNC1-2) (Wu et al., 2013), as proteínas envolvidas
no processo de recomposição éxon-éxon CBP20 (CAP BINDING PROTEIN 20), CBP80 (CAP
BINDING PROTEIN 80) (Gregory et al., 2008; Kim et al., 2008; Laubinger et al., 2008) e STA1
(STABILIZED 1), além de componentes da maquinaria de transcrição, como a proteína NOT2b
(NEGATIVE ON TATA2b).
Cada proteína possui uma função específica no complexo de processamento. A proteína
STA1, por exemplo, está relacionada à regulação dos níveis transcricionais de DCL1 e também
ao processo de recomposição de pri-miRNAs. Plantas deficientes na produção dessa proteína
apresentam redução na concentração de miRNAs maduros e aumento na concentração de
pre-miRNAs, além de defeitos pleiotrópicos no desenvolvimento (Ben Chaabane et al., 2013).
Já a proteína MOS2 ajuda DRB1 a recrutar pri-miRNAs para o complexo (Wu et al., 2013).
CPL1, ao ser recrutado por SE, promove a desfosforilação da proteína DRB1 (Manavella
et al., 2012). Sabe-se que DRB1 desfosforilada é fundamental para o correto processamento
de pri-miRNAs mediado por DCL1 (Kurihara et al., 2006; Manavella et al., 2012). Apesar das
proteínas CBP20 e CBP80 participarem do processo de recomposição (Raczynska et al., 2010),
acredita-se que elas exerçam uma função independente desse mecanismo no processamento
de pri-miRNAs (Laubinger et al., 2008).
A proteína TGH atua como se fosse um arcabouço do complexo, garantindo que DCL1,
DRB1 e SE permaneçam ligadas ao pri-miRNA (Ren et al., 2012). Além disso, TGH se liga a
fatores basais de transcrição, como a proteína TBP, reconhecedora de elementos TATA box em
regiões promotoras (Calderon-Villalobos et al., 2005). Essa interação indica, portanto, que o
processamento de miRNAs pode ser realizado de forma simultânea ao mecanismo de transcrição.

74 Introdução ao mundo dos microRNAs

 Essa hipótese é reforçada pela presença de NOT2b ao complexo DCL1 (Wang et al., 2013).
Essa proteína faz parte de um complexo conservado em plantas e animais chamado CCR4-
NOT que está envolvido no processo geral de transcrição mediado por RNA Pol II, tanto em
genes codificadores (mRNAs) quanto para miRNAs (Collart e Panasenko 2012). Dessa forma, a
existência de componentes da maquinaria de transcrição e do processo de recomposição em
associação direta ou indireta com DCL1 indica que a clivagem de pri-miRNAs provavelmente
ocorre em paralelo a esses dois processos.
Pelo menos parte desse processamento ocorre em regiões (ou focos) subnucleares
denominados de Dicing Bodies (D-Bodies). Muitas das proteínas-chave do metabolismo de
pri-miRNAs em plantas, inclusive DCL1, DRB1, SE, TGH, CPL1 e SIC, estão localizadas nessas
regiões (Fang e Spector, 2007; Fujioka et al., 2007; Song et al., 2007; Manavella et al., 2012;
Ren et al., 2012; Zhan et al., 2012). Esses corpos nucleares diferem de outros bem conhecidos,
como os Cajal Bodies, indicando que são regiões especializadas no processamento de miRNAs.

2.6 Modificações pós-transcricionais

Alterações na sequência ou na estrutura do RNA afetam o processamento e maturação
dos miRNAs e existem muitos mecanismos diferentes que são capazes de induzir algumas
mudanças nas moléculas de RNA (Ha e Kim, 2014). Veremos alguns a seguir.

2.6.1 Regulação através da cauda

A adição de nucleotídeos à extremidade 3’ do RNA modifica o processamento do pre-
miRNA em miRNA (Ameres et al., 2013). A adição de uracila no precursor let-7 (pre-let-7) é o
mecanismo que mais tem sido estudado. A ligação de LIN28A na alça do pri-let-7 e de LIN28B
na alça do pre-let-7 interfere no processamento por DROSHA e DICER, respectivamente; ou
seja, essas proteínas vão induzir a adição de uracila nesses pequenos RNAs, o que bloqueia
a ação de DICER e de DROSHA, interferindo assim no processamento dos miRNAs (Thomson
et al., 2006; Wulczyn et al., 2007; Heo et al., 2008; Newman et al., 2008; Rybak et al., 2008;
Viswanathan et al., 2008; Loughlin et al., 2012; Nam et al., 2011).
A adenilação da cauda do RNA é outro mecanismo que ocorre principalmente após a
ação de DICER e que também pode modificar o processamento de miRNAs (Yoda et al., 2013).

2.6.2 Edição de RNA

A edição de RNA é um processo natural que promove a alteração da informação genética
contida no RNA sem envolver, contudo, mutações no DNA codificador. A edição mais conhecida
refere-se à conversão de adenosinas em inosinas em certos mRNAs, catalisada pela enzima
adenosina deaminase (ADAR) (Yang et al., 2006b). A edição de pri-miRNAs ou pre-miRNAs pode
impedir o processamento por Drosha ou por Dicer sendo, portanto, um regulador negativo
da biogênese de miRNAs (Kawahara et al., 2007a, 2007b). No entanto, quando ADAR1 está
complexada com Dicer, sua atividade de edição é reprimida. Nessa conformação, a enzima
passa a ser um regulador positivo da produção de miRNAs, aumentando a processividade
de Dicer. Sua interação com Dicer é tão importante que animais mutantes para essa enzima
apresentam uma desregulação global na produção de miRNAs (Ota et al., 2013).
Acredita-se que 16% dos miRNAs humanos sofrem esse tipo de edição. Só no cérebro
humano, por exemplo, existem 47 miRNAs editáveis por ADAR1 (Kawahara et al., 2008). Uma

Regulação da abundância de miRNAs 75

 edição específica inibe, por exemplo, a clivagem do pri-miR142 em humanos pela Drosha,
e isso contribui para que esse miR seja degradado por proteínas que tenham afinidade por
dsRNAs. Da mesma maneira, ADAR1 edita o pri-miR-151, o que impede seu processamento
eficiente pela DICER (Kawahara et al., 2007a).
Como ADARs interagem com distintos pri-miRNAs ou pre-miRNAs, elas podem
influenciar o acúmulo de vários miRNAs com edições independentes. Já foram relatados
também casos em que a edição mediada por ADARs ocorre em uma importante região do
miRNA denominada seed – a parte do miRNA maduro que é crucial para o reconhecimento
do mRNA-alvo. Essa região possui de 6 a 8 nucleotídeos e está localizada na extremidade 5’
do miRNA. Qualquer alteração nessa região, portanto, pode causar o não reconhecimento
do alvo ou até mesmo a aquisição de um alvo alternativo (Kawahara et al., 2007b).

2.6.3 Metilação
MiRNAs podem ainda ser quimicamente modificados. Essas alterações podem ocorrer
tanto na extremidade 5’, quanto na 3’ do miRNA produzido. No entanto, existem muito mais
edições conhecidas na região 3’.
Em plantas, o duplex miRNA/miRNA* gerado após a ação da enzima DCL1 é metilado
em sua extremidade 3’. A metilação ocorre especificamente na hidroxila localizada no carbono
2’ do último nucleotídeo da sequência e é catalisada pela enzima HEN1 (Yu et al., 2005).
Mutantes hen1 têm seus miRNAs portando diversas extensões de uridina nas extremidades 3’,
sugerindo, assim, que a prevenção dessa adição é um dos objetivos da metilação (Li et al., 2005).
Essa modificação protetora não é restrita aos miRNAs, sendo encontrada também
em diversas outras classes de RNAs não codificantes de plantas e algas, como siRNAs (Li
et al., 2005). Em animais, siRNAs também podem ser metilados (Horwich et al., 2007; Kirino
e Mourelatos, 2007; Saito et al., 2007). MiRNAs de animais, no entanto, geralmente não
apresentam esse tipo de modificação. Uma exceção ocorre em miRNAs que estejam ligados
com a proteína AGO2 de D. melanogaster (Okamura et al., 2009).
A proteção contra degradação pode ser mediada também, assim como ocorre em
mRNAs, através do processo de poliadenilação da região 3’ terminal. Ensaios in vitro na planta
Populus trichocarpa demonstraram que a adenilação previne a degradação exonucleotídica
da molécula (Lu et al., 2009). Esse tipo de modificação pode ser específica para determinados
miRNAs. Por exemplo, a polimerase poli-A citoplasmática GLD2 (também conhecida como
TUTase2) monoadenila e estabiliza especificamente o miR-122 em células hepáticas de
mamíferos (Katoh et al., 2009).
Recentemente foi mostrado que a RNA metiltransferase humana BCDIN3D metila a
extremidade 5’ do pre-miR-145 e do pre-miR-23b. Como a DICER interage com a extremidade
5’, essa modificação interfere no processamento do miRNA por essa enzima. Curiosamente,
BCDIN3D está envolvida na tumorigênese do câncer de mama, enquanto o miR-145 e o miR-
23b são possíveis supressores tumorais (Xhemalce et al., 2012).

2.7 Formação do complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC)

Em células humanas, a proteína denominada TRBP (TAR RNA-Binding Protein), com
o auxílio de uma RNA helicase (DHX9 – Fu e Yuan, 2013), recruta Dicer (portando o duplex
miRNA/miRNA*) e AGO2, formando assim o complexo denominado RLC (RISC Loading
Complex) (Chendrimada et al., 2005).

76 Introdução ao mundo dos microRNAs

 RLC é o responsável pela transferência do duplex miRNA/miRNA* de Dicer para
AGO2. RLC se desfaz assim que esse processo é concluído; agora miRISC (AGO2 carregada
com o duplex) pode entrar em ação. É importante ter em mente que a ordem e as etapas
precisas da montagem de RLC e RISC ainda estão sob investigação, apresentando dados
algumas vezes contraditórios.
Por exemplo, há estudos indicando que uma vez que AGO2 recebe o duplex
miRNA/miRNA* ela cliva uma das fitas (denominada fita passageira, que então se dissocia),
permanecendo carregada apenas com a fita guia (Matranga et al., 2005; Rand et al., 2005).
Outros estudos evidenciam que, formado-se miRISC, ocorre a separação das fitas do duplex
de RNA. Geralmente, a fita do duplex com menor estabilidade na região 5’ gera o miRNA
maduro (denominada fita guia), enquanto a outra fita (denominada passageira ou miRNA*)
é descartada (Khvorova et al., 2003; Schwarz et al., 2003; Okamura et al., 2004; Förstemann
et al., 2007; Tomari et al., 2007; Okamura et al., 2009).
AGO é caracterizada por se associar com pequenos RNAs, funcionando como efetora do
silenciamento gênico (Hammond et al., 2001; Mourelatos et al., 2002; Tabara et al., 1999). Ela
é o agente catalítico de RISC e possui quatro domínios: PAZ (compartilhado com Dicer), PIWI
(exclusivo da superfamília Argonauta), além de N-terminal e Mid (Hutvagner e Simard, 2008).
A proteína dispõe-se de forma bilobada, um lobo correspondendo ao domínio PAZ e o
outro a PIWI, flanqueados por Mid e N-terminal. PAZ possui ação de ligação à extremidade 3’ do
miRNA maduro. A outra extremidade do microRNA maduro liga-se a um receptáculo de ligação
ao fostato 5’ presente em Mid. O domínio PIWI assume uma conformação análoga à RNase H,
podendo dessa forma realizar uma clivagem endonucleolítica por reconhecimento de pares
de bases, processo guiado pelo pequeno RNA associado ao complexo (Sasaki e Tomari, 2012).
Em D. melanogaster o miRNA liga-se à proteína AGO1 (Okamura et al., 2004; Förstemann
et al., 2007; Tomari et al., 2007). Essa proteína possui preferência por duplex de pequenos
RNAs. apresentando bases não pareadas na região central, uma peculiaridade da grande
maioria dos miRNAs.
No entanto, o miRNA* pode ligar-se à AGO2, tornando-se, eventualmente, funcional
(Okamura et al., 2009). Em vertebrados existem quatro Argonautas (AGO1 a 4) capazes de se
ligarem a miRNAs. Em mamíferos, no entanto, apenas AGO2 possui atividade de clivagem dos
alvos dos miRNAs (Liu et al., 2004; Meister et al., 2004). A atividade endoribonucleásica de
AGO2 em mamíferos pode ter também um papel relevante no processamento de pre-miRNAs
em miRNAs, ajudando Dicer a clivar o braço 3’ do precursor (Diederichs e Haber, 2007).
Existem alguns casos, no entanto, em que AGO2 realiza todo o trabalho de processamento
de pre-miRNA, atuando de forma independente de Dicer, como no caso do pre-miR-451 de
vertebrados (Cheloufi et al., 2010; Cifuentes et al., 2010) (figura 4B). Após sua clivagem por
Drosha, o pre-miR-451 é demasiadamente pequeno para ser processado por Dicer e, dessa
forma, liga-se diretamente à AGO2, que promove a retirada do grampo e em seguida o restante
do precursor é aparado, liberando o miRNA maduro (Cheloufi et al., 2010; Cifuentes et al., 2010).

2.7.1 Regulação das proteínas AGO

Curiosamente, as proteínas AGO são estáveis quando estão ocupadas por um miRNA;
quando não estão ocupadas, elas se tornam instáveis. Além disso, a degradação mediada por
proteossoma e a autofagia podem também ser responsáveis pela instabilidade das proteínas
AGO (Smibert et al., 2013; Martinez et al., 2013).

Regulação da abundância de miRNAs 77

 2.7.2 Regras para a seleção da fita guia
A escolha da fita guia é determinada durante o passo de recrutamento da AGO e sua
escolha é baseada, principalmente, na estabilidade termodinâmica das duas extremidades
do duplex miRNA/miRNA* (Khvorova et al., 2003; Schwarz et al., 2003), ou seja, a fita que
apresenta uma relativa instabilidade na porção 5’ é tipicamente selecionada como fita guia.
R2D2 é a proteína que age como o “sensor de estabilidade termodinâmica” para siRNAs
e miRNAs, determinando qual das duas fitas permanecerá em RISC (Tomari et al., 2004b).
R2D2 se liga à extremidade mais estável do duplex de RNA, enquanto outra proteína, DCR-
2, se liga à extremidade menos estável, promovendo assim o recrutamento do duplex para
AGO em D. melanogaster (Pham et al., 2004; Tomari et al., 2004a).
A remoção da fita menos favorecida é faciltada pela endonuclease C3PO, que é um
complexo de translina e proteínas associadas a ela (TRAX) (Liu et al., 2009; Ye et al., 2011).
No entanto, esse mecanismo raramente é usado no processamento dos miRNAs, visto que
eles têm mismatches centrais que previnem o silenciamento (Liu et al., 2004; Förstemann
et al., 2007; Meister et al., 2004).
Outro mecanismo que pode determinar essa escolha é a sequência do primeiro
nucleotídeo, visto que as proteínas AGO selecionam a fita que tenha uma uridina na posição
1. Após a escolha da fita guia, a outra é degradada rapidamente (Czech et al., 2009; Ghildiyal
et al., 2010; Okamura et al., 2009; Hu et al., 2009; Lau et al., 2001).
Contudo, essa seleção não é completamente rígida, ou seja, a fita menos favorecida
pode ser escolhida como fita guia em algumas situações. Essa seleção alternativa da fita guia
tem sido observada em estudos que comparam isoformas de miRNAs em diferentes tecidos;
por exemplo, o miR-145-5p é uma isoforma dominante nos ovários, testículos e no cérebro,
enquanto o miR-145-3p foi encontrado em tecidos embrionários e em recém-nascidos. Essa
mudança na escolha da fita pode ser explicada, em parte, pelo processamento alternativo
de DROSHA, que muda a estabilidade termodinâmica das fitas (Wu et al., 2009).

2.8 Vias não canônicas de biogênese

Além do processo de biogênese descrito até aqui, vários mecanismos alternativos
podem gerar miRNAs (Yang et al., 2011; Xie et al., 2014). Sequências de pequenos RNAs em
células deficientes para DGCR8, DROSHA e DICER levaram à descoberta de miRNAs não
convencionas que podem ser produzidos independentemente do complexo de processamento
(Babiarz et al., 2008; Chong et al., 2010).
Uma via não canônica foi descrita pela primeira vez durante a produção de um
miRtron (Berezikov et al., 2007; Okamura et al., 2007; Ruby et al., 2007) em que a etapa de
processamento pela DROSHA é ignorada e um pequeno RNA precursor é gerado através
do proceso de recomposição éxon-éxon do mRNA (Flynt et al., 2010). A maquinaria de
processamento por Drosha pode competir com as proteínas de recomposição na geração
de miRNAs localizados em junções éxon-íntron (figura 5). Essa competição pode levar a
dois tipos de cenários. Quando a maquinaria de processamento por Drosha tem acesso ao
transcrito, o pre-miRNA é gerado e o éxon correspondente é perdido, ou seja, passa a não
fazer parte do mRNA. No entanto, quando a maquinaria de recomposição acessa o mRNA,
então o pre-miRNA não é gerado e, com isso, um trecho de sua sequência passa a fazer parte
do éxon do mRNA maduro (Melamed et al., 2013).

78 Introdução ao mundo dos microRNAs

 Dessa forma, essa competição entre as maquinarias acaba gerando um mecanismo
de recomposição alternativa (alternative splicing). A maquinaria de recomposição, em certos
casos, pode ajudar e não atrapalhar a produção de miRNAs. É o que ocorre em miRtrons.
Nesse caso, o próprio processo de recomposição gera uma estrutura similar ao pre-miRNA
(Okamura et al., 2007; Ruby et al., 2007) (figura 4C). O processamento por DROSHA pode ser
ignorado também em casos em que pequenos RNAs derivam de short hairpin RNAs, que são
gerados diretamente da transcrição (Babiarz et al., 2008; Chong et al., 2010).
Adicionalmente, pequenos RNAs podem ser originados também através de outros
RNAs não codificadores, como os tRNAs (Babiarz et al., 2008) ou pequenos RNAs nucleolares
(snoRNAs) (Ender et al., 2008), que também não dependem do processamento por DROSHA,
porém ainda dependente de DICER. Embora a maioria das vias alternativas dependa de
DICER, a biogênese do miR-451 não necessita dessa enzima e, ao invés disso, envolve uma
atividade catalítica de AGO2 (Cheloufi et al., 2010; Cifuentes et al., 2010; Yang et al., 2010).
A existência de vias alternativas reflete a flexibilidade evolutiva da biogênese dos
miRNAs. No entanto, a vasta maioria dos miRNAs funcionais são processados pela via
canônica, sendo que apenas cerca de 1% deles são produzidos de forma independente de
Dicer e Drosha em vertebrados. Além disso, a maioria dos miRNAs produzidos por vias
não canônicas, que são pouco abundantes, não são conservados, portanto sua relevância
funcional deve ser interpretada com cautela (Ha e Kim, 2014).

Figura 5. Competição entre a maquinaria de miRNA e a de recomposição para o processamento de miRNAs

localizados na borda entre éxons e íntrons. Caso a maquinaria de recomposição tenha acesso preferencial ao
transcrito em produção, a estrutura secundária do precursor de miRNA será desfeita e o processo de agrupamento de
éxons irá ser realizado de forma correta. Assim, uma parte do miRNA será incorporada no éxon do gene em questão.
Caso a maquinaria de miRNA tenha acesso ao transcrito nascente, o pri-miRNA será processado e o gene perderá um
de seus éxons.

Regulação da abundância de miRNAs 79

 3. Seção B – Degradação e sua regulação

3.1 Degradação de miRNAs

A manutenção dos níveis fisiológicos de miRNAs é crucial para o desenvolvimento
normal, uma vez que perturbações estão associadas a inúmeras doenças já descritas em
humanos. A homeostasia dos níveis de miRNAs transcorre através do controle de sua biogênese
e/ou degradação. A degradação de miRNAs, no entanto, tem recebido pouca atenção até o
momento.
É um conceito geral que o miRNA é molécula altamente estável, apesar de evidências
experimentais terem mostrado que sua meia-vida em linhagens celulares ou órgãos como
fígado e coração seja de poucas horas a alguns dias (van Rooij et al., 2007; Gatfield et al., 2009;
Krol et al., 2010). Entretanto, essa lenta degradação não parece ser um padrão universal dos
miRNAs, já que eles geralmente estão envolvidos com transições de fases do desenvolvimento
ou agem ligando ou desligando vias finamente reguladas. Vários exemplos de regulação da
degradação de miRNAs são conhecidos.
Em mamíferos, por exemplo, miR-29b é degradado de forma mais rápida ao longo das
etapas do ciclo celular do que em células paradas na mitose (Hwang et al., 2007). A aceleração
da degradação depende de sequências presentes na região 3’ de miR-29b. A estabilidade
de miRNAs também pode ser modulada por infecções virais. Em células de camundongo,
o nível de miR-27a, que apresenta atividade antiviral, diminui após a infecção com o vírus
da herpes (MCMV – Murine cytomegalovirus) (Buck et al., 2010). Evidencia-se, portanto, que
fatores do vírus e do hospedeiro podem neutralizar miR-27a, induzindo sua degradação por
um mecanismo desconhecido.
Algumas proteínas celulares com atividade de degradação de miRNAs já foram
identificadas. Em C. elegans, a degradação dos miRNAs maduros é mediada pela proteína
XRN-2 (5’-3’ EXORIBONUCLEASE), um conhecido fator do controle de qualidade de tRNAs
em leveduras. Apesar dos miRNAs celulares estarem dentro de complexos RISC, nos quais
ambas extremidades estão ligadas diretamente à proteína AGO, tornando-as resistentes
à ação de exonucleases, as células aparentemente têm uma forma de retirar miRNAs das
AGOs e expô-los à degradação por XRN-2. Essa degradação pode ser bloqueada pela adição
de RNAs-alvo de miRNAs, o que sugere que alvos podem modular a estabilidade de miRNAs
maduros (Chatterjee e Grosshans, 2009). Esses achados demonstram que a degradação dos
miRNAs é importante para que seja mantida uma homeostase, ou seja, para prevenir um
aumento exagerado dos níveis de expressão dos miRNAs.
Em plantas, a degradação de miRNAs é executada por proteínas SDN (SMALL RNA
DEGRADING NUCLEASE). Em arabidopsis, seu papel nessa regulação é explicitado pela
elevação global na concentração de miRNAs em mutantes triplos para as proteínas SDN1,
SDN2 e SDN3. O mesmo resultado não ocorre quando somente uma das SDNs é mutada,
pondo em evidência o caráter redundante de sua atuação. A ação exonucleotídica, contudo,
é suprimida caso o miRNA encontre-se metilado, processo detalhado anteriormente. SDN1
pertence à família de exorribonucleases 3’-5’ e atua sobre miRNAs de fita simples e não
sobre o duplex miRNA/miRNA* (Ramachandran e Chen, 2008).
Por ser um elemento fundamental para o funcionamento de RISC, proteínas Argonautas
são bastante reguladas (Johnston e Hutvagner, 2011). Níveis aumentados de proteínas AGO
em células de mamíferos estão correlacionados ao aumento dos níveis de miRNAs maduros

80 Introdução ao mundo dos microRNAs

(Diederichs e Haber, 2007). Esse efeito depende da ligação direta entre proteínas AGO e
miRNAs, sugerindo que essas proteínas são limitantes e servem para estabilizar os miRNAs.
Essa regulação titula em quantidades estequiométricas a expressão de miRNAs maduros
e proteínas AGO disponíveis para a montagem de RISC funcionais. Exemplos desse tipo de
regulação não faltam.
Sabe-se, por exemplo, que a fosforilação de determinados resíduos da AGO2 humana é
importante para sua atividade de ligação ao miRNA (Rüdel’ et al., 2011). Sabe-se também que
a fosforilação de outros resíduos em situações de hipóxia (falta de oxigênio) pode prejudicar
sua interação com Dicer, impedindo a maturação de determinados miRNAs (Shen et al., 2013).
Outro exemplo, em camundongos, é dado pelo gene alvo de let-7, o lin-41, que codifica
uma proteína membro da família TRIM. Lin41 é uma ligase de ubiquitina (ubiquitin-protein
ligase) e facilita a degradação de AGO2 pelo sistema de proteassoma em células-tronco
embrionárias (Rybak et al., 2009).
Outra indicação de que a concentração de proteínas AGO é um fator limitante para
a formação do complexo RISC foi observada em células humanas HEK293, nas quais a
superexpressão das distintas AGOs induz o aumento da abundância de miRNAs maduros
(Diederichs e Haber, 2007). O efeito inverso, ou seja, de miRNAs regularem níveis de AGO
também pode existir: as proteínas AGO1 de D. melanogaster e AGO2 de camundongo são
levadas à degradação pela via de proteassomo na ausência de miRNAs, evidenciando que
os níveis de AGO livres de pequenos RNAs devem ser baixos na célula (Smibert et al., 2013).

4. Considerações finais
MiRNAs estão envolvidos na regulação gênica de praticamente todas as vias metabólicas
celulares. Dessa forma, a modulação de sua biogênese/degradação é de suma importância
para a manutenção da homeostase celular.
A transcrição majoritária pela RNA Pol II e a existência de fatores envolvidos na
recomposição e processamento de RNAs deixam claro que miRNAs e mRNAs compartilham
muitos elementos regulatórios. Assim, a expressão de miRNAs pode ser modulada e integrada
com a resposta a diversos estresses e também com o desenvolvimento do organismo, de
forma semelhante à produção de mRNAs.
Existe, no entanto, uma grande variação nos requerimentos proteicos para a produção
de miRNAs. A sua localização no genoma também pode impactar bastante no seu processo
de biogênese. A existência de fatores específicos para a geração de determinados miRNAs
indica, dessa forma, que esses RNAs regulatórios não codificantes estão longe de serem
uma unidade universal.
O estudo aprofundado da biogênese de grupos de miRNAs em diferentes organismos
será de extrema importância para a elucidação de seu papel em várias redes regulatórias
celulares, inclusive de desenvolvimento e proteção de doenças, além de permitir uma visão
mais global de seu processo evolutivo.

Regulação da abundância de miRNAs 81

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Regulação da abundância de miRNAs 87
Nomenclatura Capítulo
de microRNAs 4

Prof. Dr. Francis de Morais Franco Nunes

Depto. de Genética e Evolução, UFSCar – SP

Estruturação do capítulo
1. Introdução
2. A biogênese dos miRNAs e sua relação com a nomenclatura
3. A nomenclatura e os bancos de dados
4. Convenções
5. Submissão de sequências para os bancos
6. Conceitos de “família de microRNAs”

Nomenclatura de microRNAs 89
 1. Introdução
O uso de nomenclatura científica é uma prática antiga. O filósofo grego Aristóteles
(384-322 a.C.) foi um dos pioneiros a formalizar regras para classificação de seres vivos. Por
muitos e muitos anos, a nomenclatura científica se restringiu principalmente às áreas de
Botância e Zoologia. Com o surgimento da Genética, no século XIX, e o grande avanço dessa
ciência que se deu a partir de meados do século XX, a nomenclatura científica tornou-se
importante para dar nome e significado aos genes.
No entanto, muitos genes foram batizados com nomes anedóticos, tais como dracula,
smurf, superman, clark kent, kryptonite, barbie, pokemon, merlot, cabernet, chardonnay, entre
inúmeros outros. Por mais que alguns desses nomes estejam associados a fenótipos observáveis
em indivíduos mutantes, eles não representavam necessariamente a funcionalidade do
gene em questão. A situação tornou-se ainda mais complexa frente à conservação evolutiva
dos genes. Por exemplo imaginemos um gene de nome atípico, presente em invertebrados
e vertebrados, que regule processos de morfogênese e que, quando mutado em humanos,
está associado a progressão tumoral. Não apenas um, mas milhares de genes já estiveram
ou ainda estão na mesma situação, gerando confusões que seriam evitáveis se houvesse
uma padronização. Além disso, existem inúmeros casos nos quais um grupo de pesquisa
clonou, sequenciou, caracterizou e nomeou um dado gene enquanto outro grupo fez o
mesmo porém adotando outro nome.
A fim de se evitar tais discrepâncias, grupos de geneticistas começaram a se organizar,
criando orientações para a anotação de elementos genéticos, codificadores e não codificadores
de proteínas, desde o fim da década de 1970. Busca-se, desde então, definir conceitos e regras,
simples e informativas, que se tornem convenções universais para atender às necessidades
da comunidade científica. Para a espécie humana, por exemplo, a organização HUGO (The
Human Genome Organisation) criou o Comitê HGNC (HUGO Gene Nomenclature Committee),
responsável por aprovar e/ou padronizar nomes e símbolos de genes e mantê-los disponíveis
em uma base de dados (www.genenames.org).
Há pouco mais de 20 anos foram descobertos pequenos RNAs não codificadores de
proteínas, com papel de reguladores da expressão gênica. O primeiro foi chamado de lin-4
(Lee et al., 1993; Wightman et al., 1993) e o segundo, de let-7 (Reinhart et al., 2000). Apenas
em 2001 cunhou-se o termo microRNAs (ou miRNAs) para referir e classificar o lin-4, o let-7 e
centenas de outros pequenos RNAs reguladores que haviam sido identificados por clonagem e
sequenciamento (Lagos-Quintana et al., 2001; Lau et al., 2001; Lee e Ambros, 2001). Por razões
históricas, até hoje se mantém a nomenclatura dos microRNAs lin-4, let-7, lsy-6 (de vermes),
bantam e iab (de insetos), os quais não seguem os critérios que serão discutidos a seguir.

2. A biogênese dos miRNAs e sua relação com a nomenclatura

A regulação gênica por microRNAs é uma característica ancestral das células eucarióticas
(Molnár et al., 2007; Zhao et al., 2007). A partir de seus loci genômicos, os microRNAs são
expressos em longos transcritos, individuais ou em clusters, sendo chamados de primários
ou primitivos (pri-microRNA). Os microRNAs adquirem estruturas secundárias em forma
de grampo (hairpin, stem-loop ou fold-back) e são processados no núcleo em estruturas
mais curtas (ver capítulo 3, sobre biogênese), passando a ser chamados de precursores
(pre-microRNA, com tamanho de, aproximadamente, 70 nucleotídeos). Uma vez exportado

90 Introdução ao mundo dos microRNAs

do núcleo para o citoplasma, cada pre-microRNA é finalmente processado em sua forma
madura (revisado por Bartel, 2004), com tamanho entre 19 e 24 nucleotídeos. São chamados
de miRtrons os microRNAs que se expressam a partir de íntrons de genes codificadores
de proteínas (Rodriguez et al., 2004; Ruby et al., 2007), eventos comuns em vertebrados e
menos frequentes em invertebrados e plantas (Griffiths-Jones et al., 2008).
Desde cedo, os cientistas estavam atentos à necessidade de se estabelecer critérios
para nomear microRNAs. Os loci genômicos que codificam microRNAs bem como os pre-
microRNAs são abreviados usando o prefixo mir, enquanto o prefixo das formas maduras
é grafado com a letra “R” em maiúsculo, miR. Ambas designações são seguidas de um
hífen e um único número de identificação, sendo portanto mir-# e miR-#, respectivamente
(Lagos-Quintana et al., 2001; Lau et al., 2001; Lee e Ambros, 2001). Sugere-se o uso de letras
e números em itálico para grafar os loci genômicos de tal forma que possam se diferenciar
dos pre-microRNAs (Ambros et al., 2003). Assim, gga-mir-17 é o locus do cromossomo 1 de
Gallus gallus a partir de onde se expressa o pre-microRNA gga-mir-17 (fonte: miRBase).
Quando presentes num mesmo cluster, os genes de microRNAs são expressos num
único transcrito policistrônico e numerados em ordem crescente, de 5’ para 3’, como é o
caso do cluster mir-35–mir-41 do verme Caenorhabditis elegans (Lau et al., 2001):
5’ mir-35 >> mir-36 >> mir-37 >> mir-38 >> mir-39 >> mir-40 >> mir-41 3’
Alguns genes de microRNAs apresentam várias cópias parálogas no genoma. Quando
tais parálogos originam sequências maduras idênticas, acrescenta-se mais um hífen e mais um
número. Dessa forma, os genes são nomeados assim: mir-#-1, mir-#-2, mir-#-3), enquanto as
formas maduras correspondentes são miR-#-1, miR-#-2, miR-#-3. Em humanos, os genes de
microRNAs hsa-mir-7-1, hsa-mir-7-2 e hsa-mir-7-3 encontram-se localizados nos cromossomos
9 (9q21.32), 15 (15q26.1) e 19 (19p13.3), respectivamente (fontes: HGNC e miRBase), e todos
expressam o microRNA maduro cuja sequência comum é 5’ UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGU
3’. Outros genes de microRNAs expressam sequências maduras não-idênticas mas muito
similares (homólogas). Nesse caso, usa-se o mesmo número e adiciona-se uma letra minúscula.
Sendo assim, a nomenclatura dos genes é grafada dessa forma: mir-#a, mir-#b, mir-#c,
enquanto as respectivas formas maduras são miR-#a, miR-#b, miR-#c. Esse é o caso, por
exemplo, dos microRNAs aga-mir-263a (localizado no cromossomo 3R, com sequência
madura aga-miR-263a: 5’ UGUAAUGGCACUGGAAGAAUUCAC 3’) e aga-mir- 263b (localizado
no cromossomo 2L, com sequência madura aga-miR- 263b: 5’ CUUGGCACUGGGAGAAUUCAC
3’) do mosquito Anopheles gambiae (fonte: miRBase). Os critérios acima foram sugeridos
por Lagos-Quintana e colaboradores (2001) e continuam válidos.

3. A nomenclatura e os bancos de dados

A partir de 2002 foi criada uma base de dados chamada The miRNA Registry (Griffiths-
Jones, 2004), que evoluiu para o que conhecemos hoje como miRBase (Griffiths-Jones
et al., 2006). Estabeleceu-se, a partir de então, uma comunidade de pesquisadores preocupados
em padronizar a nomenclatura dos microRNAs das mais diferentes espécies. Foram então
disponibilizadas orientações para a identificação e anotação de microRNAs, inclusive critérios
para validação experimental e convenções para nomeá-los (Ambros et al., 2003).
No miRBase, um prefixo de três caracteres indica o nome da espécie, como: hsa-mir-#
para Homo sapiens, cel-mir-# para Caenorhabditis elegans, dme-mir-# para a mosca Drosophila

Nomenclatura de microRNAs 91
 melanogaster. Em plantas, o pre-microRNA é indicado com letras em maiúsculas; por exemplo,
um microRNA da espécie Arabidopsis thaliana é nomeado por ath-MIR#. Além disso, é
muito comum em plantas o uso de letras, como sufixos, para indicar microRNAs maduros
cujas sequências são homólogas. Em milho (Zea mays), temos: zma-MIR160a, zma-MIR160b,
zma-MIR160c, zma-MIR160d, zma-MIR160e, zma-MIR160f, zma-MIR160g. Por outro lado,
nunca se usam sufixos numéricos na nomenclatura dos microRNAs de plantas (Griffiths-
Jones et al., 2008). Os microRNAs virais também possuem particularidades referentes
à nomenclatura. Convencionou-se associar os nomes dos microRNAs virais com os loci
genômicos que os hospedam. Por exemplo, os microRNAs ebv-miR-BART1, ebv-miR-BART4,
ebv-miR-BART6, ebv-miR-BART7, ebv-miR-BART11, ebv-miR-BART12, ebv-miR-BART19, ebv-
miR-BART21 e ebv-miR-BART22 originam-se do locus BART (BamHI A rightward transcripts)
do vírus Epstein-Barr (EBV) (Zhu et al., 2009).
No miRBase, a numeração dos microRNAs segue uma ordem sequencial. Por exemplo,
neste momento o mir-9500 é o último da lista dos microRNAs humanos, indicando que o
próximo a ser descoberto deverá ser nomeado como mir-9501. Por outro lado, se a nova
submissão for de um microRNA que guarda conservação evolutiva com algum microRNA
já nomeado em outra(s) espécie(s), o nome é mantido. É o caso do let-7, um dos microRNAs
mais conservados ao longo da história evolutiva dos metazoários (Pasquinelli et al., 2003).

4. Convenções
Algumas convenções têm sido aperfeiçoadas ao longo dos anos. Duas, em particular,
foram apresentadas no release 17 do miRBase.
A primeira mudança: após a ação da enzima Dicer, forma-se um duplex RNA-RNA.
Um dos membros do duplex (chamado guide strand) se acopla ao complexo RISC e o outro
membro geralmente é degradado (chamado passenger strand ou star). Foi observado, no
entanto, que ambos os membros do duplex poderiam potencialmente se ligar ao RISC e ser
funcionais, ainda que um pudesse predominar sobre o outro (Bartel, 2004; Yang et al., 2011).
Sendo assim, para a forma menos predominante adotou-se usar um asterisco (*) seguido
do número (Lau et al., 2001; Griffiths-Jones, 2004). No entanto, o asterisco está em desuso.
Passou-se a adotar os sufixos “-5p” ou “-3p” para indicar a extremidade do pre-microRNA da
qual se origina(m) o(s) membro(s) maduro(s). Por exemplo: hsa-miR-133a-5p originado da
porção 5’ do braço precursor e hsa-miR-133a-3p originado da porção 3’ do braço precursor.
A segunda mudança: nos diferentes genomas de eucariotos, alguns loci possuem
microRNAs na fita sense sobrepostos a microRNAs na fita antisense e por algum tempo foram
usados os sufixos “-S” ou “-AS”, respectivamente (Griffiths-Jones, 2004). No bicho-da-seda,
foram descritos, por exemplo, os microRNAs miR-263-S, miR-263-AS, miR-306-S e miR-306-AS
(Jagadeeswaran et al., 2010). Tal nomenclatura causou certa confusão pois, por mais que
ocupassem a mesma posição em fitas opostas, suas funções e alvos eram distintos. Para
resolver eventuais problemas em casos de ocorrência de similaridades de sequências, basta
manter o número e usar os sufixos “a”, “b”, “c” etc., conforme descrito anteriormente. Não
havendo qualquer similaridade, os microRNAs recebem numerações distintas.

92 Introdução ao mundo dos microRNAs

5. Submissão de sequências para os bancos
Com os avanços científicos nessa área, especialmente pelo volume de dados gerados
em plataformas de sequenciamento de última geração, o número de microRNAs conhecidos,
depositados e anotados na base de dados miRBase (release 21, http://www.mirbase.org/
cgi-bin/browse.pl) aumentou consideravelmente, sendo atualmente de 28.645 sequências
de pre-microRNAs, que expressam 35.828 microRNAs maduros, em 223 espécies, desde
eucariotos unicelulares (Molnár et al., 2007; Zhao et al., 2007) a humanos (Lu et al., 2008),
além de alguns vírus. Apesar das evidências científicas (Jiang et al., 2012; Zhou et al., 2012;
Lau et al., 2013), não existem sequências de microRNAs de fungos depositadas no miRBase
até o momento.
A fim de se evitarem problemas de nomenclatura, a equipe do miRBase discute com
os pesquisadores quais nomes são apropriados para seus novos microRNAs. Primeiro, o
pesquisador submete seu manuscrito usando nomes temporários. Enquanto isso, as novas
sequências são submetidas para o miRBase. Após receber o aceite para publicação, os nomes
dos novos microRNAs são atribuídos, evitando-se redundâncias.

6. Conceitos de “família de microRNAs”

Com base na ancestralidade comum de sequências, estruturas e funções, os microRNAs
têm sido agrupados em famílias, o que impacta diretamente a nomenclatura. Alguns autores
consideram “família” como um conjunto de microRNAs que compartilham sequências “seed”
(a região entre o primeiro e o oitavo nucleotídeos da extremidade 5’ do miRNA, requerida
para o reconhecimento de alvos. Os principais tipos de seeds são conhecidas como 1-8,
1-7, 2-8, 2-7, podendo gerar pareamentos perfeitos ou imperfeitos com os alvos, incluíndo
mismatches ou pareamentos G-U (Gaidatziz et al., 2007)), idênticas ou similares e os mesmos
alvos gênicos (Bartel, 2009). Outros autores usam a conservação das sequências precursoras
e maduras (Ding et al., 2011), bem como as estruturas secundárias, a colocalização genômica
(clusters), a corregulação e papéis em processos biológicos e vias metabólicas comuns entre
espécies (Kamanu et al., 2013) para tal classificação.
No entanto, a classificação de microRNAs em famílias não é tão simples. Zou et al. (2014)
destacam que apesar da alta conservação da família let-7, alguns membros da família não
compartilham similaridade de sequência, como é o caso de rno-let-7b-3p, do mamífero Rattus
norvegicus, e sme-let-7d, da planária Schmidtea mediterranea. Outro ponto importante é que
um mesmo microRNA precursor pode gerar duas ou mais sequências de microRNAs maduros,
portanto distintos, a partir de mesma extremidade (“-5p”, por exemplo), os quais podem não
compartilhar alvos e funções comuns. Por fim, microRNAs presentes num mesmo cluster
conservado entre espécies podem conter microRNAs com papéis funcionais independentes.
Nos próximos anos, o acúmulo de dados de sequências genômicas, de descoberta de
novos microRNAs e suas ações celulares, juntamente com o aperfeiçoamento das ferramentas
de bioinformática atualmente usadas para a classificação em famílias (alinhamentos múltiplos,
predição de estruturas secundárias, interações microRNAs-alvos, modelos de covariância,
support vector machine, entre outras) e dados experimentais deverão solucionar tais problemas
e contribuir para a definição de nomenclaturas robustas e realistas.

Nomenclatura de microRNAs 93
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Mecanismos de ação Capítulo
de microRNAs 5

Prof. Dr. Tiago Campos Pereira1, Cristiane de Santis Alves2,

Geraldo Felipe Ferreira e Silva3, Fausto Andrés Ortiz-Morea3
e Prof. Dr. Fábio Tebaldi Silveira Nogueira3
1
Depto. de Genética, FFCLRP, Universidade de São Paulo (USP), Ribeirão Preto, SP
2
Depto. de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, SP
3
Depto. de Ciências Biológicas, Escola Superior de Agronomia Luiz de Queiroz (ESALQ/USP), Piracicaba, SP

Estruturação do capítulo
1. Introdução
2. A maquinaria de silenciamento
3. Mecanismos de ação
3.1 Visão geral
3.2 Inibição da tradução
3.2.1 Competição pelo 5’ CAP
3.2.2 Inibição da montagem do ribossomo
3.2.3 Deadenilação seguida por inibição da iniciação da tradução
3.2.4 Dissociação prematura dos ribossomos (ribosome drop-off)
3.2.5 Redução da velocidade de elongação
3.2.6 Proteólise durante a fase de elongação
3.3 Desestabilização do RNA-alvo
3.3.1 Clivagem do RNA-alvo
3.3.2 Deadenilação seguida de remoção do 5’ CAP
3.4 Silenciamento transcricional
3.5 Promoção da transcrição
3.6 Aumento da eficiência de tradução
4. Concentração espacial do silenciamento gênico
4.1 Corpúsculos de processamento de RNA (P-bobies)
4.2 Retículo endoplasmático
5. Conclusões

Mecanismos de ação de microRNAs 95

 1. Introdução
O grande – e crescente – número de diferentes classes de RNAs não codificadores
(lncRNAs, siRNAs, miRNAs, piRNAs, tasiRNAs, qiRNAs, entre outros) medeiam uma miríade de
eventos no transcriptoma e genoma (silenciamento gênico, ativação da transcrição, deleção
de sequências genômicas etc.) (Fire et al., 1998; Yao et al., 2003; Li et al., 2006).
Neste capítulo abordaremos exclusivamente os mecanismos e processos conhecidos,
até o momento, pelos quais os miRNAs regulam a expressão gênica.

2. A maquinaria de silenciamento
O complexo de silenciamento induzido por RNA (RNA-Induced Silencing Complex),
ou simplesmente RISC, foi originalmente definido como um complexo ribonucleoproteico
[proteína(s) e um pequeno RNA], capaz de clivar RNAs mensageiros durante o processo de
RNAi (Hammond et al., 2000). Mais recentemente, o conceito de RISC foi ampliado, englobando
qualquer complexo de silenciamento (transcricional, pós-transcricional ou traducional) que
inclua a proteína Argonauta (AGO) e uma pequena molécula de RNA guia (microRNA ou
siRNA). Adicionalmente, o complexo também pode incluir proteínas auxiliares que ampliam
ou modificam sua função (Ameres e Zamore, 2013).
Portanto, a regulação da expressão gênica pode ser mediada por diferentes tipos
de complexo RISC: siRISC, miRISC ou RITS (siRNA-directed RISC, microRNA-directed RISC e
RNA-Induced Transcriptional Silencing complex, respectivamente) (Aukerman e Sakai, 2003;
Verdel et al., 2004; Jones-Rhoades et al., 2006; Wu et al., 2010).
Após o complexo miRISC ter sido montado, o RNA guia nele presente irá direcioná-lo
até o alvo, promovendo alguma entre as diversas formas de regulação da expressão gênica
descritas a seguir.

3. Mecanismos de ação de microRNAs

3.1 Visão geral

Durante os primeiros anos, a visão geral sobre os mecanismos de atuação dos miRNAs
era: (i) aqueles com pareamento perfeito levavam a desestabilização do RNA-alvo por meio
da atividade slicer (do inglês fatiadora) de algumas AGOs, evento tipicamente observado
em plantas; (ii) aqueles com pareamento imperfeito promoviam a inibição da tradução,
processo característico de animais.
Essa interação é mediada pela seed (do inglês semente), região constituída pelos
nucleotídeos na posição 2 a 8 da extremidade 5’ do miRNA que “semeia” (inicia) a hibridização
entre o miRNA e seu alvo. A partir dessa região, o restante do pequeno RNA “fecha o zíper”
juntamente com o RNA-alvo (Zamore; Haley, 2005).
Ao longo dos anos, o desenvolvimento de técnicas mais sensíveis e elaboradas
revelou um quadro mais detalhado, complexo e ainda não definitivo a respeito da ação dos
miRNAs. Primeiro, a degradação do RNA-alvo também pode ocorrer em animais (sendo o
processo majoritário em mamíferos – Guo et al., 2010), assim como a inibição da tradução

96 Introdução ao mundo dos microRNAs

é semelhantemente observada em plantas (Iwakawa e Tomari, 2013). Segundo, apesar do
grau de complementaridade ser um parâmetro importante, ele não é o único determinante
da forma como miRISC atua: miRNAs parcialmente complementares ainda podem levar à
clivagem do RNA-alvo (Ameres e Zamore, 2013). Terceiro, três novos mecanismos de ação
foram descritos: o silenciamento gênico transcricional e, paradoxalmente, a promoção da
transcrição e o aumento na eficiência de tradução. Cada mecanismo pode ser executado por
diferentes processos.
Por exemplo, o mecanismo de “inibição da tradução” pode ser devido aos seguintes
processos: (i) competição pelo 5’ CAP, (ii) inibição da montagem dos ribossomos, (iii)
deadenilação seguida por inibição da iniciação da tradução, (iv) desmontagem prematura
de ribossomos, (v) redução da velocidade de elongação ou (vi) proteólise durante a fase
de elongação. Por sua vez, o mecanismo de “desestabilização do transcrito-alvo” pode
ser devido aos seguintes processos: (i) clivagem do RNA-alvo ou (ii) deadenilação seguida
por retirada do 5’ CAP (decapping). Nos últimos dois casos, exorribonucleases continuam o
processo, degradando os produtos.
É muito importante enfatizar que não está claro, no presente momento, se esses
processos (referentes tanto ao RNA quanto à proteína) atuam de maneira independente,
sequencial ou simultânea. É possível que alguns miRNAs, em alguns tecidos, promovam o
silenciamento por um processo, ao passo que outros miRNAs, em outros tecidos, ajam por
outro processo, i.e., atuações independentes. Entretanto, também seriam possíveis ações
sequenciais: deadenilação seguida por inibição da iniciação da tradução com posterior
decapping. Alternativamente, poderia ocorrer a competição por 5’ CAP simultaneamente
à deadenilação.
Abordaremos neste capítulo cinco mecanismos gerais conhecidos de ação dos
miRNAs: (i) inibição da tradução, (ii) desestabilização do transcrito-alvo, (iii) silenciamento
transcricional, (iv) promoção da transcrição e (vi) intensificação da tradução.

3.2 Processos de inibição da tradução

3.2.1 Competição pelo 5’ CAP

Normalmente, a iniciação da tradução se dá através do reconhecimento da estrutura
5’ CAP pela proteína de ligação ao CAP (cap-binding protein – CBP). Em seguida, outros fatores
de iniciação da tradução se ligam ao complexo CBP-mRNA, juntamente com o tRNA-Met (RNA
transportador da metionina, que reconhece o códon de iniciação) e a subunidade menor do
ribossomo (40S), formando um complexo de pré-iniciação da tradução (Pestova et al., 2001;
Sonenberg; Dever, 2003). Após o complexo de pré-iniciação escanear o RNA mensageiro à
procura do códon de iniciação, o complexo de tradução é então montado, com a junção de
outros fatores de iniciação e a subunidade ribossomal maior (60S).
Três linhas de evidência sugerem que alguns miRNAs podem impedir a iniciação
da tradução por interferirem no reconhecimento do 5’ CAP. Na primeira, os pesquisadores
notaram que os miRNAs e seus alvos não estavam associados à fração polissomal (mRNAs
complexados a ribossomos) em ensaios de centrifugação em gradiente de sacarose, evidenciando
assim que os miRNAs impediam a associação dos mRNAs com ribossomos (Pillai et al., 2005).
Na segunda, percebeu-se que determinados transcritos, cuja tradução é independente de 5’
CAP, não são reprimíveis por miRNAs (Pillai et al., 2005; Humphreys et al., 2005; Mathonnet

Mecanismos de ação de microRNAs 97

 et al., 2007; Wakiyama et al., 2007). Por fim, outro grupo notou que a porção central da proteína
AGO apresenta um domínio semelhante ao da proteína de ligação ao CAP, responsável por
reconhecer 5’ CAP e possibilitar a tradução (Kiriakidou et al., 2007). Tomados em conjunto,
todos esses dados sugerem que talvez AGO seja capaz de competir por 5’ CAP in vivo, impedindo
dessa forma a iniciação da tradução (figura 1A).

3.2.2 Inibição da montagem dos ribossomos

Chendrimada e colaboradores (2007) sugerem que alguns miRNAs podem impedir
a iniciação da tradução por outro mecanismo: inibir a montagem dos ribossomos. Eles
observaram que AGO2 é capaz de se associar à eIF6 (eukaryotic translation initiation factor 6) e
à subunidade ribossomal maior. Contudo, como eIF6 impede a interação entre as subunidades
ribossomais maior e menor, essa associação impossibilitaria a montagem da organela e,
consequentemente, a tradução (figura 1B).

3.2.3 Deadenilação seguida pelo bloqueio da iniciação da tradução

Em um processo normal de tradução, a cauda poli-A interage com a proteína PABPC1
(poli-A binding protein C1), ao passo que o 5’ CAP interage com eIF4E/eIF4G (eukaryotic
translation initiation factor 4E/4G). Por sua vez, a interação entre PAPBC1 e eIF4G leva
à circularização do mRNA, evento essencial para a iniciação da tradução. Dois grupos
independentes (Mishima et al., 2006; Wakiyama et al., 2007) mostraram que alguns miRNAs
atuam impedindo essa interação.

Figura 1. Mecanismos e processos de repressão mediada por microRNAs. Mecanismos de “inibição da tradução”: A-F.
A) Competição pelo 5’ CAP. B) Inibição da montagem do ribossomo. C) Deadenilação seguida por inibição da iniciação
da tradução. D) Dissociação prematura dos ribossomos (ribosome drop-off). E) Redução da velocidade de elongação. F)
Proteólise durante a fase de elongação. Mecanismos de “desestabilização do RNA alvo”: G-H. G) Clivagem do RNA-alvo.
H) Deadenilação (representada pela linha pontilhada) seguida por remoção do 5’ CAP.

98 Introdução ao mundo dos microRNAs

 Usando extratos de células humanas ou embriões de zebrafish (o peixe paulistinha),
esses grupos conseguiram recapitular a inibição da tradução mediada por miRNAs em
mRNAs normais (com CAP na extremidade 5’ e poliadenilados na extremidade 3’). Contudo,
eles perceberam que mRNAs poliadenilados mas sem o 5’ CAP (esses mRNAs possuíam outra
estrutura na extremidade 5’ que permite uma tradução independente de CAP) não eram
reprimidos pelo miRNA let-7. Semelhantemente, mRNAs com 5’ CAP mas sem a cauda poli-A
também não eram reprimidos. Esses dados, em conjunto, evidenciavam que a repressão da
tradução mediada por let-7 era dependente tanto de 5’ CAP quanto da cauda poli-A.
Adicionalmente, por meio de ensaios com RNase H, os autores notaram ainda que let-7
promovia a deadenilação de mRNAs normais (5’ CAP e poliadenilados). Para determinar se
essa deadenilação era consequência da inibição da tradução, os pesquisadores mensuraram
o efeito de let-7 no tamanho da cauda poli-A na ausência da tradução. Eles observaram que
mesmo nessa condição a deadenilação ocorria. Portanto, esses resultados evidenciavam
que a deadenilação precedia a inibição da tradução por miRNAs.
Tomando todos esses dados em conjunto, os autores postularam um modelo no qual
let-7 inicialmente promove a deadenilação, evento esse que impediria a circularização do
mRNA (interação do 5’ CAP com cauda poli-A) inibindo, consequentemente, a tradução
(Mishima et al., 2006; Wakiyama et al., 2007) (figura 1C).

3.2.4 Dissociação prematura de ribossomos

Petersen e colaboradores (2006), por sua vez, apresentam um modelo no qual alguns
miRNAs levariam à desmontagem antecipada dos ribossomos (ribosome drop-off). Isso foi
evidenciado por meio de experimentos em que, ao contrário de outros grupos, foram observados
miRNAs em frações polissomais. Nesses estudos, os polissomos reprimidos (miRNAs associados
a mRNAs e a ribossomos) que foram tratados com inibidores da tradução se dissociavam
mais rapidamente do que os polissomos não reprimidos (mRNA associados a ribossomos) e
também tratados (figura 1D). Portanto, esses dados sugerem que os miRNAs seriam fatores
que tornariam os polissomos menos estáveis levando, de alguma forma, a uma dissociação
prematura in vivo.

3.2.5 Redução da velocidade de elongação

Maroney e colaboradores (2006) propõem outro processo pelo qual os miRNAs
interfeririam (figura 1E). Por meio de técnicas de sedimentação de polissomos após tratamento
com pactamicina (droga que inibe a iniciação da tradução) ou puromicina (que age como
um terminador prematuro de cadeia polipeptídica), os autores observaram variação no
número estimado de ribossomos interagindo com os mRNAs reprimidos em relação ao
controle experimental, sugestivo de que os miRNAs estariam reduzindo a velocidade da
fase de elongação durante a síntese proteica (Maroney et al., 2006).

3.2.6 Proteólise durante a fase de elongação

Alguns pesquisadores sugerem que os miRNAs promovem a degradação da cadeia
polipeptídica nascente no ribossomo, i.e., ainda durante a fase de elongação o polipeptídeo já
seria degradado (Nottrott et al., 2006). Esse modelo foi proposto por não se detectar, na fração
“polissomal reprimida”, as proteínas correspondentes aos transcritos-alvo dos miRNAs. Uma
vez que muitos pesquisadores consideram que a fração “polissomal reprimida” apresenta

Mecanismos de ação de microRNAs 99

 atividade de tradução, a não observação de proteínas deveria ser explicada pela ocorrência
de uma proteólise concomitante.
Contudo, esse modelo é controverso, pois ele se baseia em um dado negativo (ausência
de proteínas), ao invés de em evidências positivas diretas (e.g., a observação de uma protease
na fração polissomal). Adicionalmente, as evidências de que “polissomos reprimidos” são
traducionalmente ativos são questionáveis. Por fim, a identidade da provável protease
permanece desconhecida – a participação do proteassoma foi excluída, uma vez que os
inibidores desse sistema foram incapazes de restaurar a expressão proteica (figura 1F).

3.3 Desestabilização do RNA-alvo

3.3.1 Clivagem do transcrito-alvo

Apesar da clivagem do RNA-alvo ser um processo classicamente mediado por siRNAs,
miRNAs também podem fazê-lo. De certa forma, nesse contexto, miRISCs e siRISCs são
virtualmente indistinguíveis: ambos complexos estão carregados com RNAs totalmente
complementares ao alvo, capazes de guiar a atividade slicer de AGOs a realizar um corte
endonucleolítico (clivagem) em um sítio do alvo que é correspondente aos nucleotídeos 10
e 11 do RNA guia, principalmente em plantas (Llave et al., 2002; Palatnik et al., 2003).
Os produtos derivados dessa clivagem (fragmento 5’, que contém a estrutura 5’
CAP e o fragmento 3’, que contém a cauda poli-A) são então rapidamente degradados pela
maquinaria de decaimento de RNA (exorribonucleases 5’-3’ e 3’-5’), finalizando o processo
(Glazov et al., 2003; Souret et al., 2004; Orban e Izaurralde, 2005) (figura 1G). (Em plantas,
alguns fragmentos 5’ podem servir de molde para produção de fitas duplas de RNA e posterior
geração de siRNAs que atuam em trans, tais como miRNAs.

3.3.2 Deadenilação seguida de remoção do 5’ CAP

Em alguns casos, a proteína Argonauta pode se associar à proteína GW182 que, por sua
vez, recruta o complexo CCR4-NOT, que promove a remoção da cauda poli-A. Conjuntamente, a
enzima DCP2 também é recrutada e executa a retirada do 5’ CAP (Behm-Ansmant et al., 2006a).
Esses eventos desestabilizam o RNA, que então se torna alvo do complexo de decaimento de
RNA (5’-3’), i.e., exorribonucleases que irão degradar o transcrito (figura 1H).

3.4 Silenciamento transcricional

O mecanismo de silenciamento gênico transcricional (TGS) mediado por microRNAs é
menos conhecido, sendo observado tanto em animais quanto em plantas, porém envolvendo
processos diferentes.

3.4.1 Metilação do DNA

Em plantas, miRNAs longos (lmiRNAs) de 24 nt dependentes de DCL3 são direcionados
para AGO4 e desencadeiam a metilação de DNA (nos resíduos de citosina) no próprio locus
MIR (em cis), dos quais foram produzidos, e também atuam em trans em seus genes-alvo
(Wu et al., 2010). Contundentemente, a metilação se restringe às regiões do locus-alvo

100 Introdução ao mundo dos microRNAs

complementares ao miRNA ou do miRNA*, sendo poucos sítios metilados encontrados fora
do stem-loop, indicando que esse evento é altamente sequência-específico (figura 2).
Bao e colaboradores (2004) também encontraram evidências, em arabidopsis, de
que a interação entre os miRNAs miR165/miR166 com mRNAs dos genes PHABULOSA e
PHAVOLUTA levam, talvez através de lmiRNAs, à metilação de regiões cromossômicas
downstream desses dois genes.
Por fim, Khraiwesh e colaboradores (2010), trabalhando com o musgo Physcomitrella
patens, demonstraram que mutantes deficientes para a enzima DICER-LIKE1b apresentam
maturação normal de miRNAs. Curiosamente, essa mutação aboliu a clivagem dos RNAs-
alvo e, ainda mais surpreendentemente, os níveis desses transcritos-alvo são drasticamente
reduzidos. Os autores perceberam que esses mutantes acumulam duplexes de miRNA:RNA-
alvo e apresentam hipermetilação dos genes codificadores desses alvos, um evento típico
de silenciamento gênico transcricional, provavelmente mediado por RITS (complexo de
silenciamento transcricional mediado por RNA). Esse processo ocorre também na linhagem
selvagem sob tratamento hormonal, evidenciando que esse silenciamento pode ocorrer
naturalmente in vivo.

3.4.2 Modificações da cromatina

Já em animais, pelo menos dois processos parecem ocorrer. No primeiro, em que o
grau de complementaridade do microRNA é imperfeito, observa-se um silenciamento gênico
transiente e independente de metilação de DNA (Younger; Corey, 2011). Contudo, nota-se
o recrutamento de AGO2 para um ncRNA que se sobrepõe ao promotor do gene-alvo, uma
diminuição da ocupação desse mesmo promotor pela RNA polimerase II e um aumento na
dimetilação da lisina 9 na histona 3 (H3K9me2) – uma das marcas epigenéticas conhecidas
para o silenciamento da cromatina.
Na segunda, na qual há complementaridade perfeita do miRNA com regiões promotoras,
observa-se um silenciamento gênico caracterizado pela trimetilação da lisina 27 da histona 3
(H3K27me3) no promotor do gene-alvo (POLR3D). Isso ocorre provavelmente mediado pela
acumulação de AGO1, miR-320 e de EZH2 (uma enzima envolvida na metilação de histonas)
na região do promotor, levando a essa modificação da cromatina e ao TGS (Kim et al., 2008).

Figura 2. Silenciamento transcricional mediado por miRNAs. O modelo proposto sugere que miRISC seria capaz
de se ligar ao transcrito nascente, recrutando a DNA metiltransferase (DRM2), que promoveria a metilação (-CH3) de
sequências próximas no DNA. Essa modificação levaria ao silenciamento do gene-alvo.

Mecanismos de ação de microRNAs 101

 3.5 Promoção da transcrição
Os miRNAs são classicamente vistos como moléculas que promovem a sub-regulação
(pós-)transcricional dos genes. Contudo, para total surpresa, um grupo de pesquisadores
relatou em 2014 que miRNAs podem também interferir com a maquinaria de iniciação de
transcrição, promovendo uma intensificação desse processo, tanto em genes virais (HIV)
quanto humanos (Zhang et al., 2014a; 2014b).
É o caso, por exemplo, do miRNA let-7i, capaz de interagir com o motivo TATA-box,
facilitando assim a montagem do complexo de pré-iniciação da transcrição (composto pela
proteína de ligação ao motivo TATA-box e RNA polimerase II) sobre o promotor do gene IL-2.
Como resultado, nota-se uma elevação de 3 a 8 vezes na produção do transcrito correspondente
(Zhang et al., 2014b) (figura 3A).

3.6 Aumento da eficiência de tradução

Dois grupos identificaram outro mecanismo imprevisto de ação de miRNAs: a
intensificação da tradução. Vasudevan e colaboradores (2007) observaram que durante
a parada no ciclo celular, o miR396-3 direciona a associação das proteínas AGO e FXR1
(Fragile X mental Retardation-related protein 1) para a formação de microrribonucleoproteínas
(microRNPs) que interagem com elementos ricos em AU (AREs) presentes na 3’ UTR do mRNA
), ativando assim a tradução desse transcrito (figura 3B).
Outros dois microRNAs (let-7 e miRcxcr4 sintético) também apresentaram essa capacidade
durante a parada do ciclo celular. Contudo, durante a proliferação celular, esses dois miRNAs
promoviam a repressão traducional. Portanto, esse estudo evidenciou, pela primeira vez,
que alguns miRNAs podem promovem uma transição entre repressão e ativação da tradução,
dependendo do estado celular.

Figura 3. Mecanismos inesperados de ação de miRNAs. A) Promoção da transcrição. B) Aumento da eficiência de

tradução. AREs (AU-rich elements): elementos ricos em AU.

102 Introdução ao mundo dos microRNAs

 De maneira independente, Ørom e colaboradores (2008) verificaram que o miR-10a
é capaz de promover tanto a repressão quanto a indução da tradução de diferentes grupos
de genes. Em especial, eles perceberam que esse miRNA é capaz de se ligar ao motivo TOP
presente na 5’ UTR de mRNAs de proteínas ribossomais, intensificando a tradução desses
transcritos e, consequentemente, a biogênese de ribossomos. Contudo, a forma pela qual esse
fenômeno ocorre ainda não está clara, mas possivelmente deve ser semelhante à observado
pelo grupo de Vasudevan.

4. Concentração espacial da maquinaria de silenciamento gênico

Curiosamente, estudos recentes evidenciaram que os eventos de silenciamento gênico
mediado por microRNAs (e siRNAs) não são dispersos no citoplasma, mas sim concentrados
em focos (corpúsculos de processamento) ou em determinadas regiões (membrana do retículo
endoplasmático), como veremos a seguir.

4.1 Corpúsculos de processamento de RNA (P-bodies)

Os corpúsculos de processamento de RNAs (processing bodies, P-bodies) são agregados
ribonucleoproteicos citoplasmáticos existentes em leveduras, plantas e animais descobertos
há quase 20 anos (Bashkirov et al., 1997) nos quais ocorrem: (i) o armazenamento de mRNAs,
(ii) a repressão traducional reversível de mRNAs e (iii) o decaimento de mRNAs, mediados
por diversos mecanismos (revisto em Olszewska et al., 2012).
Contudo, a associação funcional clara entre P-bodies e microRNAs surgiu apenas
em 2005, quando um grupo de pesquisadores observou a colocalização tanto da proteína
AGO quanto de mRNAs reprimidos por microRNAs nesses agregados (Liu et al., 2005). Esse
dado evidenciou que mRNAs-alvo de miRNA são direcionados para os P-bodies, onde seriam
temporária e reversivelmente reprimidos ou desestabilizados.
Fortalecendo esse modelo, diversos outros componentes associados ao silenciamento
gênico também foram observadas nos P-bodies, tais como as proteínas VCS, SUO, XRN4,
GW182 e proteínas do complexo de remoção do 5’ CAP (Xu et al., 2006; Iwasaki et al., 2007;
Xu; Chua, 2009; Weber et al., 2008; Yang et al., 2012; Liu et al., 2005).
No entanto, mesmo sendo conhecido que alvos reprimidos se acumulam nos P-bodies,
apenas uma pequena fração das proteínas AGO está presente nesses focos (Leung; Sharp, 2013)
e alguns mRNAs (alvos de miRNAs) apresentam sublocalização celular apenas parcialmente
sobreposta com os P-bodies (Pillai et al., 2005). Esses dados indicam que a repressão traducional
pode ocorrer também em outros sítios intracelulares.

4.2 Retículo endoplasmático

Li e colaboradores (2013) demonstraram que a proteína AMP1 (Altered Meristem
Program 1) é especificamente necessária para a inibição traducional mediada por miRNAs
em arabidopsis e é um elemento integral de membrana de Retículo Endoplasmático (RE).
AMP1 é essencial para a eficiente exclusão de mRNAs (alvos de miRNAs) dos polissomos
ligados à membrana, demonstrando um papel funcional para o RE na inibição traducional
mediada por miRNAs. O mecanismo que governa o recrutamento tanto de AGO1 quanto do
mRNA-alvo para o RE é desconhecido, mas sabe-se que é independente de AMP1.

Mecanismos de ação de microRNAs 103

 5. Conclusões
Durante algum tempo o mundo dos pequenos RNAs foi marcado por dicotomias:
miRNA/siRNA, plantas/animais, inibição da tradução/clivagem do RNA-alvo.
Atualmente, essa categorização está em ruínas, a tal ponto de muitas vezes ser difícil
ter certeza se estamos lidando com um miRNA ou um siRNA. Muitos processos observados
originalmente com siRNAs, como TGS e indução da transcrição (Morris et al., 2004; Li
et al., 2006), foram descritos em miRNAs (Zhang et al., 2014a; 2014b; Wu et al., 2010). Portanto,
não seria de surpreender a eventual descoberta do envolvimento de microRNAs em diversos
outros mecanismos observados para outras classes de pequenos RNAs, tal como a deleção
gênica mediada por RNAs (Yao et al., 2003).
Por fim, é possível que alguns termos e expressões – tais como RISC – passem por
revisões conceituais futuramente, uma vez que é desconcertante manter um acrônimo
cujo sentido é “complexo de silenciamento induzido por RNA” para uma entidade capaz de
promover ativação da transcrição e intensificação da tradução.

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Mecanismos de ação de microRNAs 105
MicroRNAs virais e Capítulo
miRNAs celulares 6
contra vírus

Prof. Dr. Ivan de Godoy Maia1, Dr. Douglas Silva Domingues2, Dr.a Helena Sanches Marcon1
1
Departamento de Genética – Instituto de Biociências, UNESP, Campus de Botucatu – SP
2
Departamento de Botânica – Instituto de Biociências, UNESP, Campus de Rio Claro – SP

Estruturação do capítulo
1. Introdução
2. MicroRNAs codificados pelos vírus
3. O papel dos miRNAs modulando a interação vírus-hospedeiro
3.1 A influência na longevidade das células infectadas
3.2 A modulação da resposta imune do hospedeiro
3.3 A regulação da expressão viral e do hospedeiro
4. MicroRNAs celulares em resposta a vírus em animais
5. MicroRNAs celulares em resposta a vírus em vegetais
6. Conclusões e perspectivas

MicroRNAs virais e miRNAs celulares contra vírus 107

 1. Introdução
Os microRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codificadores (ncRNAs) que podem
participar da regulação de diferentes processos celulares, desempenhando funções importantes
no desenvolvimento, na resposta imune, na apoptose e na carcinogênese. Em paralelo, vários
relatos demonstram que os vírus produzem miRNAs que possuem papel fundamental no
ciclo replicativo viral e durante sua infecção. Neste capítulo exploramos diferentes exemplos
de como ocorrem as interações entre os miRNAs e os vírus em plantas e animais, seja pela
produção viral de miRNAs ou de miRNAs codificados pelos hospedeiros.

2. MicroRNAs codificados pelos vírus

O fato de o silenciamento por RNA estar primordialmente associado à defesa antiviral
fez com que, durante a coevolução com os seus hospedeiros, os vírus passassem a utilizar
e manipular os mecanismos de silenciamento gênico em benefício próprio. Um exemplo
interessante trata da utilização da maquinaria de biogênese de miRNAs do hospedeiro pelos
vírus para codificar seus próprios miRNAs. De fato, diversas evidências experimentais
demonstram que determinados vírus contêm em seu genoma as informações necessárias
para codificar miRNAs, e que esses são utilizados pelos vírus em seu ciclo infeccioso para
manipular a expressão gênica do hospedeiro ou regular a expressão de seus próprios genes
(revisto por Cullen, 2009). A grande maioria desses vírus utiliza a via canônica de biogênese
de miRNA, sendo totalmente dependente de fatores do hospedeiro para tal, muito embora
algumas exceções tenham sido observadas. Os precursores dos miRNAs virais são em geral
transcritos pela RNA polimerase II, mas, em alguns casos, a transcrição pela RNA polimerase
III foi relatada (caso dos adenovírus, por exemplo). Por outro lado, até o momento, nenhum
fator viral envolvido na biogênese dos miRNAs virais foi descrito (revisto por Cullen, 2009,
2011).
O primeiro relato da ocorrência de um miRNA viral ocorreu em 2004 quando
Pfeffer e colaboradores observaram a presença de 5 pre-miRNAs de origem viral em uma
linhagem de células (B95-8) infectadas pelo Epstein-Barr virus (EBV). O EBV é membro da
família Herpesviridae, estando associado a diversos tumores humanos. A partir desse estudo
pioneiro, verificou-se que o EBV é na realidade capaz de codificar 25 pre-miRNAs que dão
origem a 44 miRNAs maduros (Cai et al., 2006; Grundhoff et al., 2006; Zhu et al., 2009).
Curiosamente, a não observação desses pre-miRNAs no estudo de 2004 ocorreu porque a
cepa de EBV (B95-8 EBV) utilizada apresentava uma deleção da região do genoma responsável
pela codificação dessas moléculas.
Um levantamento realizado junto ao banco de dados miRBase (http://www.mirbase.
org/) em 7/5/2015 revelou a existência de 686 miRNAs virais catalogados. A maioria é
codificada por vírus animais cujo genoma é composto por moléculas de DNA (tabela 1),
sendo 95% pertencentes à família Herpesviridae, cujos membros chegam a produzir até
30 pre-miRNAs.

108 Introdução ao mundo dos microRNAs

Tabela 1. Principais espécies virais que codificam miRNAs

Família ou subfamília Espécies representativas Pre-miRNAs miRNAs maduros

Alpha-herpesvirinae Herpes simplex virus 1 18 27
Herpes simplex virus 2 18 24
Marek’s disease virus type 1 14 26
Bovine herpesvirus 1 10 12
Beta-herpesvirinae Human cytomegalovirus 15 26
Mouse cytomegalovirus 18 29
Gamma- herpesvirinae Epstein-Barr virus 25 44
Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus 13 25
Polyomaviridae Simian virus 40 1 2
Retroviridae Bovine leukemia virus 5 10
Adenoviridae Human adenovirus type 2 2 3
Baculoviridae Bombyx mori nucleopolyhedrosis virus 4 4
Ascoviridae Heliothis virescens ascovirus 1 1
Iridoviridae Singapore grouper iridiovirus 14 15
Fonte: adaptada de Kincaid e Sullivan (2012)

Os herpesvírus apresentam um ciclo de vida que alterna uma fase epissomal latente
com infecções líticas nas quais ocorre a replicação viral (revisto por Speck e Ganem, 2010)
(figura 1). A expressão dos miRNAs virais e dos seus transcritos alvos nessas duas fases do
ciclo viral pode ser comparada com aquela observada durante o processo de diferenciação
celular ao longo do desenvolvimento (figura 1A). O período de latência requer a expressão
de poucos produtos gênicos virais de maneira a permitir a replicação viral em sincronia com
a divisão celular e a evasão do sistema imune (figura 1B). Durante essa fase, os herpesvírus
expressam fortemente seus miRNAs (representados em verde), os quais são invisíveis para
o sistema imune do hospedeiro (Cai et al., 2006), com o intuito de regular os transcritos
dos genes virais envolvidos com a fase lítica. Por outro lado, durante a chamada fase lítica
replicativa (figura 1C), que culmina na produção de novos vírus e na lise da célula hospedeira,
mudanças significativas na expressão gênica do hospedeiro e viral são observadas. Nesse
caso, os transcritos dos genes virais envolvidos com a fase lítica (representados em rosa
na figura 1C) têm a sua expressão aumentada, uma vez que não se encontram sob forte
regulação dos miRNAs virais.
Como padrão geral, os vírus capazes de codificar miRNAs apresentam uma molécula
de DNA como intermediária de replicação; replicam-se no núcleo da célula hospedeira,
compartimento no qual têm acesso integral à etapa inicial de biogênese dos miRNAs, e
normalmente apresentam longos períodos de infecção latente. Adicionalmente, esses vírus
apresentam transcrição bidirecional o que faz com que a regulação sequência-específica
dos transcritos virais seja facilitada pela expressão de miRNAs de sentido contrário. Em
geral, as regiões do genoma viral que codificam miRNAs estão agrupadas em unidades
de transcrição específicas normalmente associadas à infecção latente, mais precisamente
próximas ou dentro das regiões codificadoras dos transcritos dos genes correspondentes.

MicroRNAs virais e miRNAs celulares contra vírus 109

 Figura 1. Analogia entre a latência viral e a diferenciação celular durante o desenvolvimento. A) Determinados
miRNAs do hospedeiro (representados em azul) podem auxiliar na diferenciação celular estimulando a transição de
um estágio de desenvolvimento para outro pela inversão dos níveis dos miRNAs celulares e dos seus transcritos alvos
endógenos (representados em roxo). B) De forma análoga, durante a fase de latência viral, os transcritos de genes virais
associados com a fase lítica não são expressos ou estão presentes em um nível muito baixo, enquanto que os miRNAs
virais (representados em verde) são expressos em altos níveis. C) O contrário é observado na fase lítica, durante a qual
se observa alta expressão dos transcritos virais silenciados na fase latente (representados em rosa) e baixa expressão
dos miRNAs virais (representados em verde) responsáveis pela regulação desses alvos. No esquema, o genoma viral
está representado por um epissoma circular no interior do núcleo. Fonte: modificado de Kincaid e Sullivan (2012)

Figura 2. Regulação do ciclo do HIV por miRNAs do hospedeiro. Determinados miRNAs têm como alvos fatores

texto] que atuam como reguladores positivos (+) ou negativos (-) da transcrição viral. Outros miRNAs atuam diretamente
sobre o RNA viral, inibindo a sua tradução. Como consequência, a quantidade de proteínas virais expressas é reduzida.
TR: Transcrição reversa; Int.: Integração; N: Núcleo celular. Fonte: modificado de Klase et al. (2012)

110 Introdução ao mundo dos microRNAs

 Apesar de existirem relatos na literatura, a real capacidade codificadora de miRNAs
dos vírus com genoma composto por moléculas de RNA de polaridade positiva ou negativa,
ou por RNA de dupla fita (dsRNA), ainda é alvo de grande controvérsia, especialmente se
considerarmos que a possível clivagem do RNA genômico viral para a excisão de um miRNA
pode ser altamente desvantajosa ao vírus (revisto por Cullen, 2011). Os retrovírus representam
uma exceção à referida regra, pois embora apresentem um genoma composto por uma
molécula de RNA, esses vírus incluem em uma etapa do seu ciclo infeccioso a produção de
uma molécula de DNA integrativa, produzida por transcrição reversa. Essa estratégia viabiliza
a produção de miRNAs virais no interior do núcleo de maneira similar aos vírus com genoma
de DNA. Porém, de forma não convencional, verificou-se que o retrovírus Bovine leukemia
virus (BLV) codifica pequenos miRNAs na forma de grampo que são transcritos pela RNA
polimerase III e diretamente utilizados como substrato pela enzima Dicer, evitando assim
a etapa de processamento nuclear via Drosha (Kincaid et al., 2012). Essa estratégia evita
uma possível clivagem, pela enzima Drosha, do genoma e dos transcritos virais gerados
pela RNA polimerase II, já que somente os RNAs subgenômicos virais transcritos pela RNA
polimerase III serão processados em miRNAs.
Ao contrário do observado para os vírus animais, poucos são os relatos que demonstram
a ocorrência de miRNAs codificados pelos vírus de plantas. Uma alegada razão para tal é que
a grande maioria dos vírus de plantas tem genomas compostos por moléculas de RNA que
se replicam no citoplasma da célula hospedeira, fato que impediria a ocorrência da etapa
de processamento nuclear necessária à biogênese dos miRNAs (revisto por Lu et al., 2008;
Ramesh et al., 2014). Entretanto, o uso de mecanismos de processamento independentes
de Drosha como o descrito para o BLV configura uma estratégia interessante que pode ser
satisfatoriamente utilizada pelos vírus que se replicam no citoplasma. Recentemente, Gao
e colaboradores (2012) demonstraram que o RNA viral do carmovírus Hibiscus chlorotic
ringspot virus (HCRSV) é capaz de penetrar o núcleo das células infectadas, fornecendo fortes
indícios de que esse RNA pode ser processado para dar origem a miRNAs virais. Com base
nessa premissa, cinco miRNAs putativos foram preditos no genoma do HCRSV e um deles,
denominado hcrsv-miR-H1-5p, foi detectado em folhas infectadas de Hibiscus cannabilis L.
Cabe ressaltar que o genoma do HCRSV é composto por um RNA de fita simples de polaridade
positiva de 3.911 nucleotídeos. De maneira semelhante, o RNA genômico do Turnip mosaic
virus (TuMV) também foi localizado no núcleo de células infectadas e dois miRNAs (TuMV-
mir-S1 e TuMV-mir-S2) codificados pelo vírus foram preditos e validados (Shazia, 2010;
revisto por Ramesh et al., 2014). Apesar desses importantes relatos, a relevância funcional
desses miRNAs virais ainda não foi demonstrada de forma efetiva.

3. O papel dos miRNAs modulando a interação vírus-hospedeiro

O fato de os miRNAs virais serem capazes de atuar como análogos de miRNAs celulares,
ou então serem vírus-específicos, apresenta relevância quando se analisa a funcionalidade
deles no contexto celular, uma vez que os alvos reconhecidos por eles podem ser oriundos
do hospedeiro ou então derivados do próprio vírus. Os miRNAs virais análogos aos miRNAs
do hospedeiro apresentam sequências “seeds” similares àquelas observadas em seus
correspondentes celulares. Mimetizar as sequências “seed” dos miRNAs celulares permite
ao miRNA viral reconhecer os mesmos alvos, o que torna possível ao vírus uma regulação
efetiva dos diferentes transcritos que estariam sob regulação do miRNA mimetizado. Kincaid

MicroRNAs virais e miRNAs celulares contra vírus 111

 e Sullivan (2012), entretanto, salientam que somente 15% dos miRNAs virais anotados em
humanos seriam capazes de mimetizar miRNAs celulares, o que indica que somente uma
pequena fração de miRNAs virais atuariam como análogos.
Considerando o modo de ação dos miRNAs virais e seus respectivos alvos, três grandes
grupos funcionais podem ser vislumbrados: (i) suporte a replicação viral, promovendo
maior longevidade e proliferação celular, (ii) modulação da resposta imune do hospedeiro
e (iii) regulação da expressão viral e do hospedeiro durante a transição do ciclo lítico para
o latente (revisto por Sullivan, 2008; Grundhoff e Sullivan, 2011; Kincaid e Sullivan, 2012).

3.1 A influência na longevidade das células infectadas

A inibição da morte celular programada, ou apoptose, é uma estratégia adotada por
diversos vírus com a finalidade de prolongar os períodos de infecção latente no hospedeiro. A
apoptose é um fenômeno altamente controlado cuja regulação envolve uma gama importante
de diferentes miRNAs celulares. Como parte de sua estratégia de controle da apoptose, diversos
vírus animais codificam miRNAs análogos a miRNAs celulares reconhecidamente implicados
na regulação da expressão de genes pró-apoptóticos. O miRNA miR-BART5 codificado pelo
EBV, por exemplo, suprime a expressão do gene pró-apoptótico PUMA (p53 up-regulated
modulator of apoptosis; Choy et al., 2008) promovendo assim uma “resistência” celular a
apoptose. Outras espécies virais, como o Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV),
codificam miRNAs que têm por alvo transcritos de genes envolvidos nos eventos iniciais e
tardios do processo apoptótico, como os que codificam receptores específicos e as caspases,
respectivamente (revisto por Kincaid e Sullivan, 2012).
A inibição do processo apoptótico pela ação dos referidos miRNAs virais está
diretamente associada à capacidade tumorigênica de determinados vírus como os herpesvírus
e poliomavírus. Especula-se que a indução da formação de tumores não traz vantagem a esses
vírus e que esse fenômeno é na realidade um reflexo negativo e acidental da interferência
viral no processo apoptótico e no ciclo celular. Nesse cenário, análises iniciais in silico
evidenciaram que alguns vírus codificam miRNAs cujas sequências “seed” são similares
àquelas de miRNAs celulares potencialmente oncogênicos. Em dois exemplos dessa possível
evolução convergente, observou-se que tanto o KSHV como Marek’s disease virus 1 (MDV1),
ambos vírus causadores de linfomas, codificam análogos funcionais do miRNA celular miR-
155 (revisto por McClure e Sullivan, 2008) cuja expressão alterada está diretamente associada
com o desenvolvimento de linfomas, indicando, portanto, alvos comuns. Em uma prova de
conceito, a infecção de galinhas com um mutante MDV1 defectivo na expressão do análogo de
miR-155 (denominado miR-M4) resultou em perda da capacidade viral de induzir linfomas em
células T, mas não afetou a replicação (Zhao et al., 2011). Esse dado indica que a capacidade
de transformação de células T pelo MDV1 requer a repressão de determinados transcritos
celulares pela ação de miR-M4. Em outro exemplo, Kincaid e colaboradores (2012) verificaram
que um dos miRNAs codificados pelo BLV (miR-B4) apresenta alta similaridade com o miRNA
celular miR-29, que possui ação oncogênica ou supressora dependendo do contexto em que se
encontra. Esses autores demonstraram que miR-B4 é capaz de controlar negativamente dois
transcritos alvos regulados por miR-29, cujos produtos atuam como supressores tumorais.
Com base no exposto pode-se concluir que os miRNAs virais, por possuírem papel
regulador sobre processos apoptóticos e tumorigênicos, representam elementos genéticos
capazes de alterar o ciclo de vida celular de forma a interferir na longevidade das células
do hospedeiro.

112 Introdução ao mundo dos microRNAs

 3.2 A modulação da resposta imune do hospedeiro
A supressão/modulação de componentes da resposta imune do hospedeiro tem sido
uma função predita para vários miRNAs virais, porém a maioria dos estudos que procuram
demonstrar essa função foram realizados in vitro, usando culturas de células (revisto por
Skalsky e Cullen, 2010; Kincaid e Sullivan, 2012). In vivo, o exemplo mais convincente da
ação de miRNA virais na evasão do sistema imune do hospedeiro foi obtido por Dölken e
colaboradores (2010) empregando o Murine cytomegalovirus (MCMV). Nesse estudo, a deleção
de dois miRNAs virais (miR-M23-2 e miR-m21-1) em um mutante nocaute do MCMV resultou
em atenuação do título viral (100 x) nas glândulas salivares de camundongos da linhagem
C57BL/6 durante a infecção subaguda. A linhagem C57BL/6 é capaz de controlar a infecção
aguda do MCMV pela ativação das células Natural Killer (NK) do sistema imune inato. Nas
glândulas salivares, o MCMV é praticamente resistente ao controle imune promovido pelas
células T pré-citotóxicas CD8+, sendo que somente a ação combinada de células T auxiliares
CD4+ e células NK resulta em controle efetivo da infecção viral. No estudo, camundongos
C57BL/6 defectivos nesses dois braços do sistema imune apresentaram um aumento no
título do vírus mutante, indicando que os miRNAs deletados estão implicados na evasão
do sistema imune nas glândulas salivares, órgão vital para a persistência e transmissão
horizontal do MCMV. Corroborando essa observação, os autores observaram que 77 genes
cujos produtos são relevantes para o sistema imune do hospedeiro são alvos preditos de
miR-M23-2 e miR-m21-1.

3.3 A regulação da expressão viral e do hospedeiro

Além de modular os componentes da resposta imune do hospedeiro como estratégia
de evasão, alguns vírus empregam seus miRNAs para limitar o número de proteínas virais
expressas durante o ciclo latente com a finalidade de minimizar sua antigenicidade.
Adicionalmente, como representado na figura 1B, tais miRNAs atuariam na modulação da
expressão de transcritos virais específicos especialmente na transição da fase latente para
a lítica (revisto por Skalsky e Cullen, 2010; Grundhoff e Sullivan, 2011).
O exemplo mais conhecido nesse sentido refere-se ao miR-BART2 do EBV que tem
como alvo a porção 3’ não traduzida do transcrito que codifica a subunidade catalítica
BALF5 da DNA polimerase viral, impactando negativamente a sua expressão durante a
fase latente. Em contrapartida, uma redução da expressão de miR-BART2, com consequente
restauração da expressão de BALF5, é observada no momento em que ocorre a indução
do ciclo lítico viral. Esse dado corrobora o uso dessa estratégia na regulação da replicação
viral prevenindo a expressão prematura de BALF5. De maneira similar, em invertebrados
foi demonstrado que um miRNA codificado pelo Heliothis virescens ascovirus (HvAV) é
capaz de promover a degradação de transcritos da DNA polimerase I viral, inibindo assim
a replicação (Hussain et al., 2008).
Um exemplo adicional nesse sentido está associado aos poliomavírus, como o Simian
virus 40 (SV40). Esses vírus codificam miRNAs durante a fase tardia do ciclo lítico, que são
complementares aos transcritos da fase inicial que codificam os antígenos T pequenos e
grandes, promovendo a clivagem desses (Sullivan et al., 2005). Essa suposta autorregulação
foi comprovada pelo uso de um SV40 defectivo na produção do pre-miRNA que dá origem
aos miRNAs virais. Nesse caso, a produção de antígenos T foi aumentada em cultura de
células infectadas com o vírus defectivo, se comparada com aquelas infectadas com o vírus
selvagem. Concomitantemente, um aumento da mortalidade das células infectadas pelo

MicroRNAs virais e miRNAs celulares contra vírus 113

 mutante por células T citotóxicas foi observado, o que indica que a supressão dos antígenos
T confere uma vantagem seletiva ao vírus. Porém, a comprovação dessa funcionalidade in
vivo ainda não pode ser obtida de forma definitiva (Sullivan et al., 2005).
Outro mecanismo interessante de autorregulação está relacionado à supressão de
transativadores virais por miRNAs virais. O Human cytomegalovirus (HCMV), por exemplo,
codifica duas proteínas regulatórias (IE72 e IE86) expressas no período imediatamente precoce
(immediate early; IE) que atuam como transativadores transcricionais de genes das fases
precoce e tardia, sendo essenciais à infecção lítica e à replicação viral. Grey e colaboradores
(2007) demonstraram que os transcritos de IE72 e IE86 são alvos do miRNA viral miR-UL112-1
e que a transfecção de miR-UL112-1 sintético em células em cultura, antes da inoculação
viral, inibe a produção de IE72 e, consequentemente, a replicação viral. A regulação de IE72
e IE86 pela ação de um miRNA viral permite ao vírus interferir na cinética de expressão dos
diferentes genes virais sob controle de tais ativadores.

4. MicroRNAs celulares em resposta a vírus em animais

Os miRNAs celulares podem atuar tanto na restrição quanto no estímulo da replicação
viral, o que revela a não existência de um padrão geral de atuação (Gottwein, 2013; Grishok,
2013). Diversos estudos documentam a relação entre os miRNAs codificados pelo hospedeiro
e seu impacto na infecção viral, especialmente em mamíferos (revisado por Zhou e Rana,
2013). Em humanos, um dos primeiros relatos sobre a defesa viral mediada por RNA foi
descrito por Lecellier e colaboradores (2005), que observaram a ação do miRNA celular miR-
32 limitando a replicação do retrovírus Primate foamy virus type 1. Desde então, diferentes
formas de interação foram descritas, revelando: (i) estratégias virais visando reprimir a
ação de miRNAs do hospedeiro, assim como (ii) casos de miRNAs celulares induzidos pela
infecção viral (revisado por Gottwein, 2013).
Um exemplo pioneiro de repressão de um microRNA do hospedeiro pela sua interação
com transcritos virais foi demonstrado em primatas. Diversas espécies de primatas podem ser
infectadas pelo Herpesvirus saimiri (HVS). No hospedeiro natural desse vírus, o macaco-de-
cheiro (gênero Saimiri), o HVS é assintomático; no entanto, em outras espécies de primatas esse
vírus pode levar à formação de linfomas (Damania, 2004). Dois pequenos ncRNAs expressos
por esse vírus, denominados HSUR1 e 2 (HSV U-rich RNAs), são capazes de interagir com o
miRNA celular mir-27, sendo que HSUR1 promove a sua degradação, o que resulta em um
aumento da expressão dos genes regulados pelo miRNA (Cazalla et al., 2010).
Dois exemplos distintos da interação entre miRNAs celulares e vírus podem ser
observados em duas importantes doenças humanas: na hepatite C provocada pelo flavivírus
Hepatitis C virus (HCV) e na síndrome da imunodeficiência adquirida causada pelo Human
immunodeficiency virus (HIV).
A hepatite C é uma importante doença em termos mundiais, com cerca de 170 milhões
de pessoas com infecções crônicas que podem levar a cirrose e câncer (Gottwein, 2013). A
alta taxa de mutação do HCV dificulta a identificação de medicamentos que possam ser
úteis no controle da doença. Evidências experimentais revelaram que o microRNA miR-
122, específico e com alta atividade transcricional no fígado, onde atua no metabolismo de
lipídeos, contribuiu para o tropismo do HCV pelos hepatócitos. Jopling e colaboradores (2005)
demonstraram que esse miRNA é capaz de regular positivamente a replicação do HCV por
meio da interação de sua sequência “seed” com dois sítios localizados na extremidade 5’ do

114 Introdução ao mundo dos microRNAs

RNA genômico viral. Embora o mecanismo envolvido nessa regulação positiva seja motivo
de controvérsia, resultados experimentais indicam que a ligação de miR-122 protege o RNA
viral da degradação promovida pela exonuclease citoplasmática Xrn1, que atua na direção
5’ 3’ e está envolvida no seu decaimento (Li et al., 2013). A ligação de miR-122 na região
5’ do RNA viral também estimula a sua tradução, mas não a ponto de explicar o seu efeito
na replicação viral (Henke et al., 2008), o que indica que outros mecanismos de regulação
estariam atuando nesse processo. O relatado envolvimento de miR-122 na replicação viral
o torna um alvo promissor para uso em estratégias de terapia gênica (Gottwein, 2013).
Em humanos, a replicação do HIV pode ser modulada por miRNAs celulares de duas
maneiras diferentes: a direta, pela atuação desses miRNAs sobre o RNA viral; ou a indireta,
pela regulação de genes que codificam fatores celulares importantes à replicação viral, como
exemplificado na figura 2 (como revisado por Klase et al., 2012).
Dentre os miRNAs com ação direta sobre o genoma viral, miR-29a foi o primeiro a
ser caracterizado, atuando como repressor da infectividade viral (figura 2). Outros miRNAs
de ação direta, como miR-28, miR-125b, miR-150, miR-223 e miR-382 possuem como alvo a
região 3’ não traduzida do genoma viral e podem estar envolvidos na fase de latência do
HIV em células T CD4+ (figura 2, à direita). Além disso, esses miRNAs restringem a replicação
viral em monócitos. Já os miRNAs miR-133b, miR-138, miR-149 e miR-326, que também têm
como alvo a região 3’ não traduzida, estão envolvidos na diminuição da replicação viral
(figura 2) (revisado por Klase et al., 2012).
Dentre os fatores celulares descritos como tendo papel importante na replicação
do HIV e que podem ser modulados por miRNAs celulares destacam-se a ciclina T1, os

NAD-dependente Sirtuin-1. Em geral, essas proteínas atuam como cofatores da proteína

transativadora Tat do retrovírus. Conforme revisado por Klase e colaboradores (2012), mais
de uma dezena de famílias de miRNAs podem ter como alvo esses genes, restringindo de
maneira indireta a replicação de HIV.
Por outro lado, pouco se conhece sobre os mecanismos de interação entre miRNAs e
vírus em invertebrados. Nesse caso, a maioria dos estudos está voltada para insetos vetores de
doenças virais. Em um exemplo interessante, Hussain e colaboradores (2012) demonstraram
que, em mosquitos do gênero Aedes, uma variante do West Nile virus (WNV Kunjin), cujo
genoma é composto por uma molécula de RNA de fita simples e polaridade positiva, codifica
um miRNA (KUN-miR-1) que favorece sua replicação e tem como alvo potencial um fator
de transcrição do tipo GATA (GATA4). Demonstrou-se que, na presença de KUN-miR-1, a
expressão de GATA4 é induzida, o que favorece a replicação viral por um mecanismo ainda
desconhecido. Por outro lado, em pernilongos do gênero Culex, demonstrou-se que a infecção
com esse vírus pode induzir transcricionalmente diversas famílias de miRNAs celulares
(Skalsky et al., 2010).

5. MicroRNAs celulares em resposta a vírus em vegetais

Como estratégia de defesa contra patógenos, as plantas desenvolveram uma ampla gama
de respostas “imunes”, algumas delas envolvendo miRNA celulares (revisto por Lu et al., 2008;
Ramesh et al., 2014). A primeira evidência da participação de um miRNA do hospedeiro na
resposta adaptativa das plantas a invasão por patógenos adveio de um estudo com a bactéria
fitopatogênica Pseudomonas syringae (Navarro et al., 2006). Os autores demonstraram que

MicroRNAs virais e miRNAs celulares contra vírus 115

 um miRNA celular (miR-393) capaz de regular negativamente a expressão de receptores
de auxina do tipo F-box é induzido em resposta à infecção bacteriana em arabidopsis. A
interferência na via de sinalização da auxina determinada por miR-393 reduz o crescimento
bacteriano na planta e promove maior tolerância.
A despeito do relatado papel biológico na resposta de defesa contra bactérias, até
o momento nenhuma comprovação experimental definitiva demonstrou a existência de
miRNAs celulares com atividade antiviral em plantas. Curiosamente, análises in silico
demonstram que diversos miRNAs de plantas (28% do total analisado; n = 911) possuem alvos
em diferentes genomas virais, o que sugere um potencial papel regulatório da patogenicidade
viral (Pérez-Quintero et al., 2010). Corroborando uma possível implicação dos miRNAs na
defesa antiviral, diversos relatos demonstram que a replicação viral é capaz de induzir
mudanças significativas na expressão de diferentes miRNAs celulares. Além disso, plantas
geneticamente modificadas capazes de expressar miRNAs artificiais com complementaridade
a regiões do genoma de diferentes vírus apresentam ampla resistência à infecção viral (Niu
et al., 2006; Qu et al., 2007).
Outro aspecto indicativo de uma possível participação dos miRNAs celulares na resposta
de defesa das plantas refere-se às evidências de que as proteínas virais supressoras de
silenciamento são capazes de interferir com a biogênese e expressão de miRNAs do hospedeiro
(Kasschau et al., 2003; Dunoyer et al., 2004; Gao et al., 2013). Nesse contexto, Várallyay e
colaboradores (2010) demonstraram que a proteína supressora p19 dos tombusvírus é capaz
de induzir a expressão de miR-168, que tem por alvo transcritos da proteína ARGONAUTA1
(AGO1), envolvida na geração dos pequenos RNAs interferentes secundários (siRNAs) associados
ao controle da infecção viral.
Tendo em vista a relatada presença de sequências-alvo nos genomas virais, acredita-
se que os miRNAs celulares tiveram origem a partir do evento de infecção das plantas pelos
vírus (Lu et al., 2008). Inicialmente, esses miRNAs desempenharam um papel fundamental na
resposta adaptativa da planta contra os vírus, o que garantiu uma sobrevivência satisfatória
ao hospedeiro. Adicionalmente, esses miRNAs contribuíram para a modelagem do hospedeiro
frente às diferentes infecções virais. No entanto, com o desenvolvimento de novos mecanismos
de defesa pelas plantas, muito desses miRNAs passaram a adquirir novos alvos e funções,
especialmente na regulação de genes endógenos.
Devido a alta taxa de mutação dos vírus, os miRNAs encontram-se sob forte pressão
seletiva, que aliada à necessidade de reguladores específicos resultou em uma especificidade
entre os miRNAs e seus alvos, possibilitando maior estabilidade desse mecanismo. Pode-se
concluir que as infecções virais contribuíram decisivamente para a evolução dos miRNAs
do hospedeiro, aumentando a diversidade genética e epigenética.

6. Conclusões e perspectivas
No presente capítulo discutimos o papel dos miRNAs, de origem celular ou viral, no
ciclo de vida dos vírus e os efeitos que essas moléculas podem ter no processo infeccioso.
Como relatado, os miRNAs apresentam grande diversidade funcional e podem desempenhar
inúmeros papéis nas interações com os vírus, atuando de forma positiva ou negativa sobre
essa importante classe de agentes patogênicos.
O relatado potencial dos miRNAs como agentes antivirais em plantas tem sido aplicado
no desenvolvimento de plantas transgênicas capazes de expressar miRNAs artificiais

116 Introdução ao mundo dos microRNAs

tendo como alvo importantes espécies virais. Diversos estudos demonstram que essa é
uma estratégia eficiente para a produção de plantas resistentes a vírus (conforme revisado
por Qu et al., 2012). Em animais, as constatadas alterações nos níveis de determinados
miRNAs podem ser utilizadas como biomarcadores para diagnóstico, prognóstico, tal como
auxiliar na resposta a terapias durante as infecções virais. Como exemplo, verificou-se que
os níveis de miR-122 são elevados em pacientes com infecção crônica por HCV, o que o torna
um biomarcador interessante (revisto por Gupta et al., 2012). Apesar de tais aplicações, o
entendimento das interações entre os miRNAs e os vírus bem como das diferentes estratégias
associadas ainda está na sua infância.

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MicroRNAs e Capítulo
desenvolvimento vegetal 7

Eder Marques da Silva1, Edna Gicela Ortiz Morea1,

Carlos Hernán Barrera Rojas1, Prof. Dr. Fábio Tebaldi Silveira Nogueira2.
Depto. de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, SP
1

Depto. de Ciências Biológicas, Escola Superior de Agronomia Luiz de Queiroz (ESALQ/USP), Piracicaba, SP
2

Estruturação do capítulo
1. Introdução
2. MicroRNAs e a transição de fase juvenil para fase adulta em vegetais
3. MicroRNAs e desenvolvimento foliar
4. Papel dos microRNAs na iniciação e desenvolvimento de órgãos reprodutivos
4.1 MiR172 atuando na regulação de genes de identidade floral
4.2 A via miR159/GAMYB-like é funcional ao longo do desenvolvimento das anteras e
também atua no tempo de florescimento
4.3 Interação entre vias reguladas por microRNAs durante o desenvolvimento floral
5. MicroRNAs e desenvolvimento de frutos
6. MicroRNAs e seus efeitos na formação e desenvolvimento do sistema radicular
6.1 MicroRNAs e seus efeitos na formação da raiz principal
6.2 MicroRNAs e seus efeitos funcionais na formação e desenvolvimento de raízes laterais
6.3 Correlação dos microRNAs com fatores ambientais no desenvolvimento do sistema
radicular
7. Outros aspectos relacionados ao desenvolvimento vegetal
8. Desafios e perspectivas das pesquisas relacionadas aos microRNAs

MicroRNAs e desenvolvimento vegetal 119

 1. Introdução
Assim que o primeiro microRNA (lin-4) foi descrito em estudos realizados com
Caenorhabditis elegans ficou claro que essa classe de pequenos RNAs atua de maneira essencial
ao longo do desenvolvimento pós-embrionário em animais (Lee et al., 1993). Trabalhos
posteriores desmonstraram que o microRNA lin-4 é amplamente conservado dentro do reino
animal (Ruvinsky e Ruvkun, 2003). Subsequentemente, outros pequenos RNAs passaram a ser
identificados, assim como o envolvimento deles em aspectos relacionados ao desenvolvimento
e ao surgimento de doenças (Li et al., 2006; Volinia et al., 2006).
Posteriormente aos achados em animais, essa classe de pequenos RNAs foi descrita
também em plantas (Lagos-Quintana et al., 2001; Reinhardt e Kuhlemeier 2002), nas quais
vários avanços foram feitos visando o melhor entendimento da sua ação e biogênese, bem
como efeitos biológicos. Assim como na área animal, pesquisadores da área vegetal foram
capazes de demonstrar que os miRNAs desempenham papéis cruciais em diversos processos
biológicos e que a correta expressão desses pequenos RNAs é fundamental em várias etapas
do desenvolvimento (Ori et al., 2007; Wu et al., 2009; Aukerman e Sakai, 2003; Nogueira
et al., 2007; Silva et al., 2014), tais como: brotação de órgãos laterais (Juarez et al., 2004; Nogueira
et al., 2007, 2009; Palatnik et al., 2003), desenvolvimento de ógãos reprodutivos (Aukerman
e SakaIi, 2003; Silva et al., 2014) e do sistema radicular (Meng et al., 2010; Khan et al., 2011).
A ampla contribuição funcional dos microRNAs regulando genes diretamente
relacionados ao desenvolvimento fica evidente quando se avaliam os fenótipos de plantas
mutantes defectivas na geração desses pequenos RNAs. Em Arabidopsis thaliana demostrou-
se que mutações em genes que são fundamentais para a biogênese de miRNAs têm por
consequência alterações pleiotrópicas consideráveis. Essa mudança drástica no padrão de
desenvolvimento é muito bem exemplificada nos mutantes dcl1 (Lu e Fedoroff, 2000), ago1
(Jacobsen et al., 1999), hen1 (Telfer e Poethig, 1998), hyl1 (Bohmert et al., 1998) e hst1 (Chen
et al., 2002). Nesses mutantes, distintas etapas da via de geração de miRNAs encontram-se
alteradas, e quando se comparam com plantas selvagens, diferenças contrastantes do ponto
de vista do desenvolvimento e crescimento podem ser percebidas (figura 1).
No mutante dcl1, por exemplo, a consequência é a letalidade, o que ratifica o grande
impacto que muitos microRNAs possuem ao longo da embriogênese; assim, somente mutantes
hipomórficos (com a função da proteína parcialmente afetada, reduzindo sua eficiência) são
capazes de completar o desenvolvimento de todas as fases embrionárias e geram plântulas
(Lu e Fedoroff, 2000).
Os fenótipos encontrados nos mutantes nulos hst1, hen1 e hyl1 são semelhantes aos
fenótipos exibidos por mutantes hipomórficos dcl1 (figura 1). Tais fenótipos são caracterizados
por: adaxialização das folhas, presença de tricomas abaxiais em folhas ainda jovens, reduzido
tamanho da flor e plantas com baixa estatura. Nos mutantes hipomórficos ago1, o fenótipo
também se assemelha aos já citados, porém difere no fenótipo molecular, pois esses não
possuem baixos níveis de transcritos de microRNAs. O que ocorre, de fato, é um acúmulo dos
respectivos transcritos alvo desses microRNAs, que deixam de ser silenciados em consequência
da ausência da enzima funcional ARGONAUTA1 (componente essencial da maquinaria de
silenciamento – RISC).
O uso de mutantes (como os citados anteriormente) e experimentos utilizando plantas
transgênicas de organismos modelos (nas quais vias específicas entre determinados microRNAs
e seus respectivos alvos são alteradas) demonstraram que muitas vias de regulação por
microRNAs são evolutivamente conservadas e presentes nas mais diversas espécies vegetais
avaliadas até o momento (Guo et al., 2008).

120 Introdução ao mundo dos microRNAs

 Neste capítulo serão abordados os papéis funcionais dos microRNAs ao longo do
desenvolvimento de órgãos vegetativos, como folhas e raízes e também órgãos reprodutivos
como flores, inflorescências e frutos. Adicionalmente, será visto que os microRNAs não atuam
de maneira independente: eles estão imersos em complexas vias que incluem interações com
fatores de transcrição (Liu e Chen, 2009), hormônios vegetais e também outros pequenos
RNAs, sendo que essas interações ocorrem nas mais diversas etapas da ontogenia vegetal.
O desenvolvimento pós-embrionário vegetal pode ser dividido em três fases: juvenil,
adulta vegetativa e adulta reprodutiva (Taiz e Zieger, 2010), sendo a transição de uma à outra
conhecida como mudança de fase (Poethig, 1990). O correto desenvolvimento de órgãos
vegetativos é um fator primordial no que diz respeito à determinação da arquitetura vegetal,
tanto na parte aérea quanto na parte radicular. Na parte aérea, a correta formação dos órgãos
vegetativos é que define a organização tridimensional do “corpo” da planta, inclusive padrão
de brotação lateral, forma e posição das folhas e órgãos florais (Reinhardt e Kuhlemeier, 2002).
Dados de diversos trabalhos evidenciam a contribuição significativa de microRNAs
na padronização e diferenciação de vários órgãos. Dessa forma, vale destacar a notável
contribuição de plantas transgênicas e mutantes de organismos-modelo, tais como A. thaliana,
as quais atuaram de forma decisiva na elucidação do papel de vários microRNAs durante o
desenvolvimento vegetal. Mais recentemente, o tomateiro (Solanum lycopersicum), devido às

Figura 1. Fenótipos de plantas mutantes em que a biogênese e/ou a ação dos miRNAs encontra(m)-se prejudicada(s).
A) Mutante hipomórfico dcl1. B) Mutante nulo hst. C) WT (tipo-selvagem). D) Mutante hyl1-2. E) Mutante hipomórfico
ago1. Fotos tiradas de plantas 47dias após germinação.

MicroRNAs e desenvolvimento vegetal 121

 suas características biológicas (planta simpodial, fruto carnoso e evidente), vem despontando
como ótimo organismo-modelo para estudo de microRNAs, como será exemplificado adiante.

2. MicroRNAs e a transição de fase

juvenil para fase adulta em vegetais
A contribuição funcional dos microRNAs no desenvolvimento de órgãos vegetativos
vem sendo alvo de muitas pesquisas ao longo dos anos, e já se tem demonstrado que eles
são fundamentais para isso. O miR156, por exemplo, possui como alvos alguns genes que
codificam membros pertencentes à família de fatores de transcrição do tipo SQUAMOSA
PROMOTER BINDING-LIKE PROTEINS (SPLs), específicos de plantas (Klein et al., 1996). Os
genes SPLs estão envolvidos na transição do estádio juvenil para o adulto (Cardon et al., 1999);
em arabidopsis estão presentes 16 membros da família SPL, dos quais dez são alvos do
miR156 (Schwab et al., 2005).
Dados de expressão gênica demonstraram que os níveis de transcritos do miR156 são
elevados em plantas juvenis de arabidopsis, suprimindo a expressão de seus respectivos alvos.
Conforme a planta avança nos estádios de desenvolvimento, os níveis de transcritos desse
miRNA diminuem gradualmente, promovendo dessa forma a mudança de fase (figura 2).
Experimentos foram conduzidos com o intuito de demonstrar a relevância funcional
desse padrão de expressão. Pesquisadores analisaram fenotípica e molecularmente plantas
transgênicas de arabidopsis que superexpressam o MIR156. Essas plantas apresentaram
fenótipo de redução da dominância apical, produzindo um maior número de ramos axilares.
Além disso, elas apresentaram atraso na mudança de fase de desenvolvimento, fazendo com
que permanecessem por mais tempo na fase juvenil e, consequentemente, promovendo
atraso no florescimento (Wu e Poethig, 2006). Finalmente, essas plantas produziram maior
número de folhas e, por conseguinte, aumentaram a biomassa, o que se deve principalmente

Figura 2. miR156 e miR172 no desenvolvimento. Esquema resumido demonstrando o padrão de expressão do miR156
e do miR172 durante as estapas de desenvolvimento vegetativo e reprodutivo de arabidopsis, evidenciando que a
expressão do miR156 reduz-se conforme a planta se desenvolve, e assim seus respectivos alvos (SPL9 e 10) ficam livres
de sua regulação, e esses alvos ativam a expressão do miR172 que consequentemente reprime os repressores florais
(AP2), fazendo com que a planta entre no estádio reprodutivo.

122 Introdução ao mundo dos microRNAs

ao encurtamento do plastochron, que é o tempo decorrente entre a produção de um primórdio
foliar e o próximo primórdio (Schwab et al., 2005; Schwarz et al., 2008).
Além de arabidopsis, fenótipos similares foram também observados em milho (Chuck
et al., 2007) e tomateiro (Silva et al., 2014), em plantas herbáceas e perenes (Wang et al., 2011),
sugerindo que a regulação da formação de órgãos laterais pela via microRNA156-SPL é
conservada entre linhagens que divergiram há aproximadamente 200 milhões de anos
(Cuperus et al., 2011). Adicionalmente, foi demonstrado que essa via também afeta a regulação
do desenvolvimento do fruto em tomateiro (Silva et al., 2014; ver seções posteriores).
Posteriormente a essas descobertas foram geradas plantas transgênicas de arabidopsis
nas quais a atividade do miR156 encontrava-se suprimida. Nessas plantas foi inserida uma cópia
de um transgene que mimetiza os mRNA-alvo do miR156, de tal forma que grande parte dos
transcritos do miR156 permanece “sequestrada” no transgene; em contrapartida, a expressão
dos transcritos dos genes SPLs se mantém elevada. O resultado observado foi a presença
de fenótipo reverso ao citado anteriormente para plantas transgênicas superexpressando
MIR156, o que contribuiu para confirmar os achados relacionados ao papel regulatório do
miR156 na manutenção do período juvenil das plantas.
Os microRNAs atuam em vias distintas e interagem com uma gama extensa de fatores
externos e internos. Dessa forma, não é inadequado imaginar que esses pequenos RNAs atuam
paralelamente e/ou de modo antagônico em vias específicas ao longo do desenvolvimento
vegetal, formando o que os pesquisadores rotularam como rede de interação entre microRNAs
(do inglês, microRNA networks), sendo que muitas dessas interações já foram demonstradas
experimentalmente (Rubio-Somoza e Weigel, 2011).
Nesse contexto, um exemplo de interação é constatado entre as vias reguladas pelos
microRNAs miR156 e miR172. O miR172 atua na regulação da família gênica APETALA2-
like (AP2-like), que são repressores florais (agem impedindo o florescimento) (Aukerman
e Sakai, 2003).
Nas plantas em que a expressão do miR156 é elevada, o acúmulo de transcritos do miR172
é reduzido (Aukerman e Sakai, 2003; Chuck et al., 2007; Jung et al., 2007; Tanaka et al., 2011; Wu
et al., 2009). Foi demonstrado que alguns genes-alvo do miR156, mais especificamente SPL9 e
SPL10, codificam fatores de transcrição que se ligam ao promotor do locus MIR172 e ativam
a sua expressão (Aukerman e Sakai, 2003; Chen, 2004; Kim et al., 2006; Schmid et al., 2003;
Schwab et al., 2005; Yant et al., 2010). Consequentemente, o miR172 atua silenciando seus
alvos, tornando a planta competente para a transição da fase vegetativa adulta para a fase
reprodutiva de seu ciclo de vida (figura 2). Notavelmente, esses fatores endógenos (miRNAs
e seus genes-alvo) são suficientes para induzir ou reprimir o florescimento de diferentes
espécies vegetais, independentemente do fotoperíodo (Wang et al., 2009).
Em resumo, o padrão de expressão dos microRNAs miR156 e miR172 age de maneira
coordenada e sequencial regulando a transição da fase, evidenciando, de maneira notável,
como a interação entre microRNAs pode coordenar etapas importantes do desenvolvimento.

3. MicroRNAs e desenvolvimento foliar

As folhas são órgãos vegetativos tipicamente especializados na transpiração e na
fotossíntese. Durante a sua formação, tanto fatores fisiológicos quanto genéticos controlam
os processos de divisão, expansão e diferenciação celular. Tal controle é responsável pela

MicroRNAs e desenvolvimento vegetal 123

 forma e tamanho final da folha e, portanto, pela diversidade de formas foliares encontradas
nas mais diversas espécies vegetais.
Ao longo do desenvolvimento da folha, mudanças coordenadas na expressão gênica estão
envolvidas na regulação dos eventos específicos da sua formação. Durante estas mudanças, os
microRNAs exercem papéis essenciais, coordenando temporal e espacialmente os processos
de desenvolvimento foliar (Taiz e Zeiger, 2010; Pulido e Laufs, 2010; Schommer et al., 2012).
Ao longo da formação dos tecidos foliares, três estádios podem ser reconhecidos. Esses
estádios são denominados: iniciação, aquisição de identidade dos subórgãos e diferenciação
de tecidos (Sinha, 1999). Durante o início do desenvolvimento foliar, um pequeno grupo de
células meristemáticas chamadas de P0 (Plastocron 0), localizadas nas camadas L1 e L2 do
meristema apical do caule (MAC), responde à concentração local máxima do fitormônio
auxina (figura 3). Esse grupo de células adquire identidade de células fundadoras de formação
dos tecidos foliares e forma uma projeção no flanco do MAC que representará o primeiro
primórdio foliar chamado de P1 (Reinhardt et al., 2000; Micol e Hake, 2003; Taiz e Zeiger,
2010; Rubio-Somoza e Weigel, 2011).
A produção de primórdios foliares em número e ordem ao redor do MAC (filotaxia)
é estabelecida pela concentração local máxima de auxina e por padrões geneticamente
determinados. Na região onde se forma o novo primórdio, dois eventos principais ocorrem
para a iniciação desse órgão, sendo eles (com algumas exceções): (i) a perda da expressão
dos fatores de transcrição KNOTTED-LIKE HOMEOBOX classe I (KNOXI) (Reiser et al., 2000)
e (ii) a separação dos cotilédones quando, de novo, estão se formando os primórdios foliares
(Aida et al., 1997).
Os genes KNOXI são expressos no MAC, onde regulam negativamente as vias de
biossíntese dos fitormônios giberelina (GA) e citocinina. Dessa forma, a repressão dos genes
KNOXI especifica a formação de células fundadoras da folha e permite a biossíntese desses

Figura 3. Representação do MAC, fonte dos órgãos aéreos da planta. L1 corresponde à camada de células que se
dividem anticlinalmente (perpendicularmente ao maior eixo da célula) e originam a epiderme. L2 (divisões anticlinais)
e L3 (divisões peri e anticlinais) são camadas de células que geram os tecidos internos e, portanto, o corpo da planta. A
zona periférica assinalada com a seta indica o local de formação do primórdio foliar (Braybrook e Kuhlemeier, 2010).

124 Introdução ao mundo dos microRNAs

fitormônios, contribuindo para o começo da formação do novo primórdio foliar (Hudson,
1999; Hake et al., 2004; Veit, 2009).
Entre os genes KNOXI presentes em arabidopsis encontram-se o SHOOT MERISTEMLESS
(STM), BREVIPEDICELLUS (BP), KNAT2 e KNAT6. Desses genes, BP e KNAT2 são reprimidos
durante o começo da formação do primórdio foliar, pela interação dos fatores de transcrição
do tipo ASYMMETRIC LEAVES 2 (AS2) e CINCINNATA-like TEOSINTE BRANCHED 1-CYCLOIDEA-
PCF (TCP), sendo esse último regulado pelo miRNA319. Essa regulação, portanto, assegura
o início e o subsequente desenvolvimento normal da folha (Li et al., 2012). Tal regulação
será discutida posteriormente.
Além do silenciamento dos genes KNOXI, a separação dos cotilédones desempenha um
papel na formação normal da folha. A separação dos cotilédones é geneticamente coordenada
por dois membros da família de fatores de transcrição chamados NAC: os genes CUC1 (CUP-
SHAPED COTYLEDON) e CUC2 (Aida et al., 1999). Os transcritos de CUC1 e CUC2 são alvos
do miR164, que os regula durante a separação dos cotilédones de arabidopsis (Rhoades
et al., 2002; Laufs et al., 2004). Em plantas que superexpressam o MIR164 se observa perda do
MAC, além de fusão dos cotilédones. Esse fenótipo também foi observado no duplo mutante
cuc1cuc2, assim, o fenótipo encontrado tanto nas plantas com a superexpressão do MIR164
quanto no duplo mutante permitiu demonstrar que esse miRNA age regulando CUC1 e CUC2.
A via miR164/CUC1/CUC2 estabelece o limite entre células meristemáticas indiferenciadas e
as células que estão competentes para a diferenciação, contribuindo portanto para o início
do desenvolvimento dos primórdios foliares (Aida et al., 1997; Laufs et al., 2004).
No segundo estádio do desenvolvimento da folha – chamado de aquisição de identidade
dos subórgãos –, distintas regiões do primórdio foliar adquirem identidade, como partes
específicas da folha ao longo dos eixos dorsoventral (adaxial/superior-abaxial/inferior),
proximal-distal (apical-basal) e lateral (margem-lâmina-nervura mediana). A face adaxial
está adjacente ao meristema e especializa-se para a absorção da luz, enquanto o lado abaxial
está distante do meristema e cumprirá funções de trocas gasosas. O eixo dorsoventral em
plantas superiores exibe vários graus de assimetria que são determinados pela expressão
polarizada dos genes HOMEODOMAIN-LEUCINE ZIPPER classe III (HD-ZIPIII ) na face adaxial,
e KANADI (KAN) e YABBY, na face abaxial (Juarez et al., 2004; Emery et al., 2003; McConnell
et al., 2001).
Em arabidopsis, três genes HD-ZIPIII, chamados PHABULOSA (PHB), PHAVOLUTA
(PHV) e REVOLUTA (REV), são expressos na face adaxial após a emergência do primórdio.
Essa expressão foi demostrada em mutantes com ganho e com perda de função para esses
três genes. Nos mutantes com ganho de função, ou seja, com elevados níveis de expressão
desses genes, foi observada adaxialização da folha, enquanto que nos mutantes com perda de
função observou-se abaxialização dos cotilédones e das folhas (McConnell et al., 2001; Emery
et al., 2003). A regulação dos genes HD-ZIPIII é feita de maneira coordenada, permitindo a sua
expressão polarizada no eixo adaxial, promovendo, portanto, a formação normal da folha.
Os genes PHB, PHV e REV foram preditos como alvos de dois miRNAs conservados
evolutivamente, o miRNA165 e o miRNA166 (Rhoades et al., 2002). Esses miRNAs estão entre os
miRNAs mais bem caracterizados em plantas. Eles diferem um do outro por um nucleotídeo na
sequência madura; em arabidopsis, duas cópias do gene MIR165 e sete cópias do gene MIR166
estão presentes no genoma (Reinhart et al., 2002) e, durante o desenvolvimento da folha, foi
observado que a expressão deles ocorre no meristema apical do caule e no primórdio foliar
(Kidner e Martienssen, 2004). Embora existam várias cópias dos genes MIR165 e MIR166 em

MicroRNAs e desenvolvimento vegetal 125

 diferentes espécies vegetais, a expressão dessas cópias gênicas é dinamicamente regulada
nas células do meristema apical vegetativo (Nogueira et al., 2009).
Os padrões de expressão dos genes HD-ZIPIII durante o desenvolvimento do eixo
dorsoventral da folha são complementados pela expressão abaxial de genes das famílias
KANADI e YABBY, demostrando a importância desse circuito durante a formação do eixo
dorsoventral. A superexpressão dos microRNAs miR165 e miR166 causa uma forte redução nos
níveis dos transcritos dos seus alvos e a planta exibe fenótipos semelhantes aos observados
nos mutantes com perda ou ganho de função para os alvos desses dois miRNAs (Williams
et al., 2005; Zhou et al., 2007). Esses fenótipos incluem: abaxialização de órgãos laterais
quando há perda de função dos genes HD-ZIPIII e perda de função da atividade do gene
YABBY quando há ganho de função dos genes-alvo para o miR165/166 (McConnell e Barton,
1998; Siegfried et al., 1999; McConnell et al., 2001; Emery et al., 2003). Contrariamente, a
perda de função dos genes KANADI leva à perda dos tecidos abaxiais e expressão de PHB,
PHV e REV (Eshed et al., 1999, 2001), enquanto o ganho de função de KANADI resulta na
abaxialização da folha (Eshed et al., 2001; Kerstetter et al., 2001).
Plantas geneticamente modificadas, com versões dos genes HD-ZIPII “resistentes”
aos miR165 e miR166 (contendo mutações específicas nos sítios de reconhecimento para
esses miRNAs), exibem fenótipos que incluem alterações nas funções do meristema e na
polaridade da folha (McConnell et al., 2001; Emery et al., 2003; Juarez et al., 2004). Por outro
lado, a superexpressão dos microRNAs miR165 e miR166 causa uma forte redução nos níveis
dos transcritos dos seus alvos e promove fenótipos semelhantes aos observados nos mutantes
com perda de função, os quais incluem principalmente perda do MAC e alteração na dorso-
ventralidade foliar (Williams et al., 2005; Zhou et al., 2007). Essas observações indicam
que a regulação dos genes HD-ZIPIII pelos miRNAs miR165 e miR166 é essencial para o
desenvolvimento normal das faces adaxial/abaxial das folhas. É importante destacar que, sem
a correta justaposição das faces adaxial/abaxial, não há expansão foliar e, consequentemente,
ocorre severa redução na área foliar fotossintetizante, o que impacta o desenvolvimento e
a sobrevivência do vegetal.
Além do observado em eudicotiledôneas (p. ex., arabidopsis), em monocotiledôneas
(milho), o eixo dorsoventral também é estabelecido pelo gradiente abaxial do miR166, o qual
reprime espacialmente a expressão dos fatores de transcrição HD-ZIPIII (Juarez et al., 2004;
Nogueira et al., 2007). Em conjunto, todas as observações mencionadas anteriormente indicam
que a regulação dos genes HD-ZIPIII pelos miRNAs miR165 e miR166 é essencial para o
desenvolvimento do padrão adaxial-abaxial da folha tanto em monocotiledôneas quanto
em eudicotiledôneas, indicando que as vias de regulação orquestradas por miRNA165 e
miRNA166 constituem um importante e altamente conservado sinal para a formação da
dorsoventralidade foliar (Juarez et al., 2004).
Além dos microRNAs mencionados, outro miRNA que participa da formação e
desenvolvimento da folha é o miR390 (Chitwood et al., 2009). Esse miRNA atua num circuito
de regulação que inclui um membro de um grupo robusto e biologicamente significativo de
pequenos RNAs não codantes chamados Trans-actin Small Interfering RNAs, ou tasiRNAs.
Esse grupo deriva de precursores dupla fita cuja produção é feita em resposta a microRNAs
específicos. Por exemplo, para a formação do tasiRNA codificado pelo gene TAS3, o miR390
liga-se à cadeia de RNA precursora oriunda da transcrição de TAS3. Essa cadeia é clivada
pela ação da Argonauta 7, que faz parte do complexo RISC. Um dos fragmentos clivados
é estabilizado pela SGS3 e convertido em um RNA de dupla fita pela RNA Polimerase VI

126 Introdução ao mundo dos microRNAs

dependente de RNA (RDR6). Essa molécula de dupla fita é então reconhecida e clivada
sequencialmente pela enzima DICER-LIKE4 (DCL4), gerando várias cadeias duplas de 21
nucleotídeos de comprimento. Uma das fitas do produto é incorporada no complexo RISC que
reconhecerá e clivará, em ação trans, os genes ARF2, ARF3 e ARF4, os quais codificam fatores
de transcrição do tipo AUXIN RESPONDE FACTORs (ARFs) (figura 4) (Allen e Howell, 2010).
O TAS3, em conjunto com o miR390, define uma rede de sinalização ao fitormônio
auxina, por meio da regulação dos já mencionados genes ARF2, ARF3 e ARF4 (Adenot
et al., 2006; Fahlgren et al., 2006; Garcia et al., 2006; Hunter et al., 2006). Na folha, os tasi-ARFs
(tasiRNAs que regulam especificamente os genes ARFs) regulam pós-transcricionalmente a
abundância de ARF3 e ARF4, os quais promovem a expressão de características adultas e,
consequentemente, controlam o início da fase adulta da folha (Fahlgren et al., 2006; Hunter
et al., 2006).
Durante o terceiro estádio de desenvolvimento da folha, chamado de diferenciação de
tecidos, os seguintes eventos ocorrem: as células da camada L1 do meristema especializam-se
como epiderme (composta pelas células epidérmicas, tricomas e células guarda); as células da
camada L2 diferenciam-se como células fotossintetizantes do mesófilo e, a partir da camada
L3, formam-se os elementos vasculares e as células da bainha vascular (Taiz e Zeiger, 2010).
Dois importantes miRNAs estão envolvidos nesse estádio do desenvolvimento e
regulam a expressão de genes específicos. Um deles é o miRNA156, altamente conservado
e intimamente associado a diferentes estádios do desenvolvimento das plantas. Como foi
mencionado anteriormente, esse microRNA tem como alvo a família de fatores de transcrição
SPL, dos quais oito membros estão associados ao desenvolvimento da folha; dentre eles
destacam-se os genes SPL3, SPL4 e SPL5, relacionados com a produção de tricomas (Wu e
Poething, 2006) e com mudanças associadas à heteroblastia (diferenças morfológicas entre
órgãos durante a ontogenia) (Usami et al., 2009). Os genes SPL9 e SPL15 estão envolvidos
na regulação da heteroblastia e alteração do plastocron (Schwarz et al., 2008), já os genes

Figura 4. Representação da ação do miRNA 390 na biogênese dos Tasi-ARFs (TAS3). O miR390 liga-se à cadeia de RNA
precurssora do TAS3 (1) e faz a clivagem pela ação da Argonauta 7 (2). O produto clivado é convertido em uma dupla fita
de RNA pela RDR6 (3), que posteriormente é fragmentada e chamada de tasi-ARFs pelo efeito da DCL4 (4). Esses fragmentos
são incorporados no complexo RISC (5), o qual reconhecerá e clivará, em ação trans, os seus respectivos alvos (6).

MicroRNAs e desenvolvimento vegetal 127

 SPL2, SPL10 e SPL11 estão associados à forma da lâmina e distribuição de tricomas (Shikata
et al., 2009).
Outro miRNA envolvido nesse estádio do desenvolvimento da folha é o miR319.
Esse miRNA, conservado entre diversas espécies de plantas, é codificado por três membros
(MIR319a, b e c) em arabidopsis, os quais regulam os genes do tipo TCP (TEOSINTE BRANCHED-
CYCLOIDEA-PCF), uma família de fatores de transcrição de plantas. A via de regulação miR319-
TCP participa de diferentes rotas biológicas, desde a biossíntese e sinalização de hormônios
até a proliferação e diferenciação celular (Cubas et al., 1999; Schommer et al., 2012). Durante
o desenvolvimento da folha foi observado que a família TCP está envolvida no controle
da divisão, expansão e diferenciação celular, ramificação e senescência (Nath et al., 2003;
Aguilar-Martínez et al., 2007; Schommer et al., 2008). Cinco dos 24 membros da família TCP
de arabidopsis (TCP2, TCP3, TCP4, TCP10 e TCP24) foram confirmados como alvos do miR319;
dentre eles, o TCP4 está associado com a complexidade da folha (Palatnik et al., 2003).
Em tomateiro (S. lycopersicum), o qual possui folhas compostas, foi encontrado um
homólogo do TCP4, o gene LANCEOLATE (La). Esse gene codifica um fator de transcrição
da família TCP que contém o sítio de ligação para o miR319 (Ori et al., 2007). Quando o
gene La não é reprimido pelo miR319 (no mutante de ganho de função para La), uma das
consequências é a formação de folhas simples e diferenciação precoce da margem da folha
(Mathan e Jenkins, 1960). Em contrapartida, a superexpressão do miR319 gera folhas de
dimensões maiores, com crescimento contínuo nas suas margens (Ori et al., 2007). Além dos
fenótipos observados em arabidopsis e tomateiro, em arroz também foi observada alteração
da lâmina foliar pela superexpressão do miR319 (Yang et al., 2013).
Embora a presença ou ausência do miR319 determine a complexidade da folha, o
gradiente de expressão desse miRNA, observado ao longo do eixo proximal-distal, também
desempenha um papel fundamental. Enquanto esse miRNA é expresso a níveis mais elevados na
parte proximal do órgão, o gene LANCEOLATE é mais expresso na parte distal (Ori et al., 2007).
Os fenótipos observados pela regulação dos genes TCP4 e LANCEOLATE, assim como
a presença do miR319 tanto em monocotiledôneas quanto em eudicotiledôneas, permitem
concluir que a rede de regulação miR319/TCP realça o papel potencial desse miRNA na
geração das diferentes formas foliares observadas na natureza.

4. Papel dos microRNAs na iniciação e

desenvolvimento de órgãos reprodutivos
O tempo de florescimento, bem como o desenvolvimento correto e organizado dos
órgãos e verticilos florais, são imprescindíveis para a reprodução e manutenção do ciclo
de vida dos vegetais, sendo esses processos orquestrados por uma gama de genes (muitos
dos quais codificam fatores de transcrição), com padrão de expressão espaço-temporal bem
determinado (Aukerman e Sakai, 2003).
Ao longo dos anos, estudos funcionais vêm mostrando que os microRNAs atuam como
“maestros”, regulando a expressão de muitos genes que possuem funções-chave na formação
e desenvolvimento de órgãos florais e frutos (Aukerman e Sakai, 2003; Silva et al., 2014).
A passagem do estádio vegetativo para o reprodutivo (transição floral) inicia-se com
o reconhecimento, por parte da planta, através das folhas, de sinais ambientais (fotoperíodo,
temperatura, entre outros) e endógenos (ação de hormônios e a expressão de genes específicos).

128 Introdução ao mundo dos microRNAs

Esses sinais iniciam a conversão do meristema apical vegetativo em um meristema de
inflorescência primária e na sequência forma-se lateralmente ao meristema de inflorescência
primária o meristema floral e, a partir dele, iniciam-se a formação e desenvolvimento dos
órgãos florais e, consequentemente, da flor como um todo (Taiz e Zeiger, 2010).
A transição floral como resumida acima é provavelmente a etapa mais importante
de todo o ciclo de vida dos vegetais devido à influência do tempo de floração no sucesso
reprodutivo das plantas (Taiz e Zieger, 2010). Portanto, avanços significativos foram obtidos
por estudos focados em análises moleculares visando determinar as vias genéticas envolvidas
no controle do tempo de floração, bem como no processo de transição floral. Como resultado
desses esforços, muitos genes importantes que integram a rede que atua na determinação
da identidade do meristema floral, assim como no tempo de florescimento e na transição
floral, foram identificados; muitos desses codificam fatores de transcrição.
Recentemente, pesquisadores têm conseguido demonstrar, de maneira irrefutável,
que muitos dos genes que possuem um papel crítico na complexa rede de regulação do
desenvolvimento floral sofrem ação regulatória por microRNAs. Além disso, esses pequenos
RNAs também estão envolvidos no correto desenvolvimento de regiões específicas da flor,
como será discutido adiante.

4.1 MiR172 atuando na regulação de genes de identidade floral

Entre os microRNAs que atuam no desenvolvimento floral temos um exemplo muito
bem explorado, o miR172 (Park et al., 2002), o qual possui como alvos os fatores de transcrição
pertencentes à família AP2-like. Essa família é composta por genes que codificam proteínas
conhecidas como repressores florais e possui cinco membros [TARGET OF EAT 1, 2 e 3
(TOE1, TOE2, TOE3), SCHLAFMUTZE (SMZ) e SCHNARCHZAPFEN (SNZ)], que são regulados
via miR172. A ação regulatória do miR172 ocorre por inibição da tradução, ao invés de
induzir clivagem do transcrito dos seus alvos, como ocorre com a maioria dos microRNAs.
Em arabidopsis foi demonstrado que os genes homeóticos AP2-like desempenham papéis
cruciais ao longo do desenvolvimento floral, tais como: estabelecimento da identidade do
meristema floral, regulação da organogênese floral e especificação da identidade floral
(Okamuro et al., 1997).
Como citado anteriormente, a expressão do miR172 é temporalmente oposta à expressão
do miR156 (figura 2), e os fatores de transcrição SPL9 e SPL10 atuam como ativadores
transcricionais do gene MIR172b. Logo, com a redução dos transcritos do miR156 ocorre
a expressão desses fatores transcricionais e, consequentemente, a expressão do MIR172b
(Aukerman e Sakai, 2003; Chen, 2004; Kim et al., 2006; Schmid et al., 2003; Schwab et al., 2005;
Yant et al., 2010).
O papel regulatório exercido pelo miR172 no desenvolvimento floral ficou evidente
quando pesquisadores analisaram fenótipos de plantas geneticamente modificadas para a
via miR172/AP2-like. Inicialmente foi demonstrado em arabidopsis que a superexpressão do
MIR172 tem, por consequência, fenótipo de florescimento precoce. Esses dados são consistentes
com o fenótipo oposto encontrado no transgênico superexpressando um gene AP2-like, mais
especificamente o gene TARGET OF EAT1 (TOE1), no qual é evidente o florescimento tardio
quando comparado às plantas selvagens de arabidopsis.
Para ratificar o papel da via miR172/AP2-like no desenvolvimento floral foram
analisadas plantas mutantes com perda de função para o gene TOE1 e TOE2. Essas análises

MicroRNAs e desenvolvimento vegetal 129

 indicaram que ao menos alguns membros da família AP2-like são regulados pelo miR172
e possuem função como repressores florais (Sakai et al., 2003; Chen 2004). Em conjunto,
esses experimentos demonstraram claramente que, quando o miR172 encontra-se com a
expressão aumentada, seus alvos encontram-se silenciados. Sendo esses alvos repressores
florais, a planta floresce precocemente e, assim, fica evidente que a via de interação miR172/
AP2-like atua de maneira crucial na determinação do tempo de floração e, por consequência,
no desenvolvimento floral (Aukerman e Sakai, 2003).

4.2 A via miR159/GAMYB-like é funcional ao longo do

desenvolvimento das anteras e também atua no tempo de florescimento
Os membros da família do miR159 atuam regulando negativamente os fatores de
transcrição codificados pelos genes MYB ou GAMYB-like. Tais fatores de transcrição foram
primeiramente descritos em células de aleurona de cevada (Hordeum vulgare) (Gubler
et al., 1995). Subsequentemente, os genes GAMYB-like foram também descritos em outras
espécies de plantas, tais como: A. thaliana, Oriza sativa, Avena sativa, Lolium temulentum
e Fragaria ananassa (Achard et al., 2004; Tsuji et al., 2006; Woodger et al., 2003; Csukasi
et al., 2012), nas quais foi demonstrado que a via miR159/GAMYB-like é conservada.
Ainda que a contribuição funcional da via miR159/GAMYB-like para o florescimento e
desenvolvimento floral não seja tão clara e bem caracterizada quanto a das vias miR156/SPL
e miR172/AP2-like (ver seções anteriores), pesquisadores tiveram êxito na demonstração da
participação do miR159 em alguns aspectos cruciais para o desenvolvimento floral. Um exemplo
é demonstrado em arabidopsis, na qual a via miR159/GAMYB-like está correlacionada com o
fitormônio GA para promover o florescimento (Terzi; Simpson, 2008; Yamaguchi e Abe, 2012).
Nesse contexto, a superexpressão do gene MIR159a em arabidopsis promove um
atraso no tempo de florescimento quando comparado com o de plantas de arabidopsis
selvagens. Foi evidenciado que devido à regulação realizada pelo miR159 nos transcritos
do gene MYB33 ocorre uma redução na expressão e, consequentemente, na atividade do
gene LEAFY, o que resulta no florescimento tardio (Achard et al., 2004). Isso ocorre porque
o gene LEAFY é crucial para a identidade de meristema floral e esse fato o classifica como
um gene importante para o florescimento (Blazquez; Weigel 2000; Gocal et al., 2001). O
fenótipo de atraso no florescimento também foi recentemente demonstrado em linhagens
de plantas transgênicas de gloxínia (Sinningia speciosa) com expressão ectópica do miR159
(Li et al., 2013).
Pesquisadores obtiveram sucesso na demonstração de que nas plantas de arabidopsis
com o gene MIR159a superexpresso surgiram anteras defeituosas e, consequentemente,
esterilidade dos órgãos masculinos das flores (Achard et al., 2004). Posteriormente a essas
descobertas demonstrou-se em arabidopsis que os genes MYB33 e MYB65, que são regulados
pós-transcricionalmente pelo miR159, atuam de maneira redundante para facilitar o
desenvolvimento das anteras (Millar e Gubler, 2005). Demonstrou-se subsequentemente
que a via miR159/GAMYB-like age de maneira semelhante em trigo (Wang et al., 2012) e
que ela também é ativa no receptáculo floral do morango (Fragaria x ananassa) (Csukasi
et al., 2012), dado que sugere sua participação efetiva em outros aspectos do desenvolvimento
floral, além do que já se tem demonstrado.

130 Introdução ao mundo dos microRNAs

 4.3 Interação entre vias reguladas por microRNAs
durante o desenvolvimento floral
Devido à complexidade do desenvolvimento dos órgãos reprodutivos e aos numerosos
processos celulares e moleculares necessários para que esses órgãos se desenvolvam de
forma padronizada, muitos programas genéticos são orquestrados por microRNAs que atuam
como reguladores de seus respectivos alvos, garantindo assim uma maior plasticidade ao
longo do desenvolvimento.
Nesse contexto, podemos citar a ação das vias miR159/GAMYB-like (ver seção anterior)
e miR319/TCP, que podem, independentemente, regular a via miR167/ARF (Rubio-Somoza
e Weigel, 2013). Inicialmente foi demonstrado que a via genética na qual o miR319 atua
encontra-se relacionada com o desenvolvimento foliar (ver seção anterior) (Palatnik et al., 2003).
Posteriormente foi observado que em arabidopsis, esse microRNA, mais especificamente o
miR319a, está relacionado também com o desenvolvimento de órgãos florais, uma vez que
ele participa da regulação dos transcritos do gene TCP4 (Nag et al., 2009).
Foi verificado em plantas selvagens de arabidopsis que o miR167 atua regulando
positivamente os transcritos dos genes ARF6 e ARF8 (Rhoades et al., 2002; Jones-Rhoades e
Bartel, 2004; Allen et al., 2005), que são importantes para a formação de órgãos florais (Sessions
et al., 1997). A expressão ectópica do miR167a em plantas de arabidopsis apresentou um
fenótipo de malformação das flores semelhante ao encontrado em plantas duplo-mutantes
arf6 arf8 (Nagpal et al., 2005). Esse dado evidencia que miR167 é crítico na determinação da
expressão espacial e temporal dos genes ARF6 e ARF8 nos estames e óvulos, assegurando o
correto desenvolvimento e formação desses órgãos e, consequentemente, a sua viabilidade
(Wu et al., 2006).
A correlação entre miR159, miR319 e miR167 é evidenciada pela análise do padrão
de expressão de miR167a, o qual é dependente dos alvos de miR159 e miR319 (MYB33 e
TCP4, respectivamente), uma vez que os alvos de miR159 e miR319 atuam na indução da
expressão do miR167, esse age reprimindo os genes ARF6/8. Portanto, a rede de interação
entre esses microRNAs é importante durante o desenvolvimento de sépalas, pétalas e estames
(Rubio-Somoza e Weigel, 2013).
Ainda que as interações entre miR159, miR319 e miR167 e entre miR156 e miR172 sejam
bons exemplos de redes de interação entre esses pequenos RNAs, imagina-se que existam
muitas outras redes de interação atuando de maneira coordenada em outros processos
genéticos relacionados ao desenvolvimento que ainda permanecem obscuras, especialmente
em etapas do desenvolvimento pouco estudadas em relação ao papel de miRNAs, tais como
o desenvolvimento e amadurecimento de frutos.

5. MicroRNAs e desenvolvimento de frutos

Os microRNAs estão envolvidos em uma gama de processos relacionados ao
desenvolvimento de órgãos vegetais. Dessa forma, pesquisadores procuraram correlacionar
o papel funcional desses pequenos RNAs ao longo do desenvolvimento e da padronização
dos tecidos que compõem os frutos (Todesco et al., 2010; Silva et al., 2014).
Os frutos são definidos como estruturas provenientes do ovário maduro que contêm
sementes (Seymour et al., 2013). Assim sendo, modificações no desenvolvimento do ovário
podem ter consequências na padronização da formação dos tecidos que constituem o fruto

MicroRNAs e desenvolvimento vegetal 131

 como um todo. Os frutos considerados verdadeiros derivam do gineceu (órgão reprodutor
feminino proveniente da fusão dos carpelos) e são encontrados somente em Angiospermas
(do grego: angeos “bolsa” e sperm “semente”), ou plantas com flores. Para o desenvolvimento
do fruto é necessário que a planta atravesse todas as etapas de desenvolvimento floral, o que
é imprescindível para o sucesso reprodutivo das Angiospermas. Frutos são frequentemente
classificados em secos (p. ex., milho, arroz) e carnosos (p. ex., tomate, abóbora). Porém existem
fortes similaridades entre as vias moleculares que atuam tanto no desenvolvimento como
na maturação de ambos os tipos de frutos (Seymour et al., 2013). Esses frutos, inclusive,
compartilham algumas similidades nas vias moleculares orquestradas por microRNAs.
Nesse contexto, o miR164 figura como um exemplo relacionado ao desenvolvimento
do ovário e, consequentemente, ao desenvolvimento do fruto. A utilização da planta mutante
de tomateiro (Cv. M82) com ganho de função para o fator de transcrição GOBLET (mutantes
Gob-4d), ortólogo do gene CUC de arabidopsis (Blein et al., 2008; Berger et al., 2009) e também
alvo do miR164, contribuiu para elucidar esse processo. Nesses mutantes, o gene GOBLET
encontra-se livre da regulação pelo miR164 devido à presença de uma mutação pontual
no sítio-alvo desse microRNA. A expressão ectópica do gene GOBLET nas flores e ovários
promove a geração de frutos com carpelos extras no interior do gineceu (Berger et al., 2009).
Em arabidopsis, planta que apresenta fruto seco (conhecido como siliqua), também foi
demonstrado que plantas transgênicas, nas quais a atividade do miR164 é reprimida,
ocorre o surgimento de tecidos ectópicos ao longo do desenvolvimento do fruto (Todesco
et al., 2010). Em conjunto, esses experimentos confirmam a participação desse pequeno
RNA no desenvolvimento do fruto.
Vias reguladas pelo miR156 estão imersas em diversos aspectos relacionados ao
desenvolvimento vegetal, mesmo entre espécies vegetais consideradas distantes evolutivamente.
Já se conhece, por exemplo, o papel do gene CNR (COLORLESS NON RIPENING), um membro da
família gênica SPL regulado pelo miR156. O gene CNR é crucial no controle do amadurecimento
do fruto do tomateiro (Manning et al., 2006; Moxon et al., 2008), fato que suscitou a seguinte
pergunta: além do seu relacionamento com o gene CNR, poderia o miR156 estar associado a
outros aspectos do desenvolvimento do fruto, tal como o desenvolvimento inicial do ovário?
A resposta a essa pergunta veio recentemente, quando pesquisadores demonstraram
que o miR156 possui papel relevante na padronização do desenvolvimento dos tecidos
do giceneu, ovário e, consequentemente, do fruto (Silva et al., 2014). Inicialmente foram
conduzidos experimentos de hibridização in situ utilizando sondas de LNA (locked nucleic
acid) com o intuito de demonstrar o padrão espaço-temporal de expressão do miR156 no
ovário de plantas selvagens de tomateiro (cv. Micro Tom). Com esse experimento foi possível
demonstrar que a expressão do miR156 encontra-se precisamente na região da placenta
e no interior do integumento dos óvulos em desenvolvimento (A), sugerindo que a ação
regulatória desse microRNA pode contribuir para o desenvolvimento inicial do ovário e,
consequentemente, para o desenvolvimento do fruto (Silva et al., 2014).
Visando confirmar a contribuição funcional do miR156 no desenvolvimento do fruto,
esses mesmos pesquisadores também obtiveram sucesso ao demonstrar que a superexpressão
do MIR156 em tomateiro gera, além dos fenótipos vegetativos discutidos anteriormente,
um fenótipo de indeterminação do fruto. Esse dado sugere que o aumento de expressão do
miR156 pode alterar o padrão normal de expressão de genes associados ao desenvolvimento
de novos órgãos, tais como os genes KNOXI e GOBLET. A expressão acentuada desses genes
leva as células dos tecidos do gineceu e ovário à perda de identidade, fazendo com que

132 Introdução ao mundo dos microRNAs

outros tecidos não relacionados surjam a partir do fruto (figura 5D). Além disso, análises
anatômicas das plantas de tomateiro superexpressando o miR156 revelaram a presença de
carpelos extras e parcialmente fusionados (Silva et al., 2014). Tais resultados indicam que
a via miR156/SPLs também está envolvida com a formação e o desenvolvimento inicial dos
tecidos associados ao fruto.

6. MicroRNAs e seus efeitos na formação

e desenvolvimento do sistema radicular
Tanto em monocotiledôneas quanto em eudicotiledôneas, o sistema radicular das plantas
desempenha papel importante na sua ancoragem e estabilidade no solo, proporcionando
suporte estrutural à parte aérea. A arquitetura de raiz primária, raízes laterais e adventícias
contribui para a captura de água, além de facilitar a extração de nutrientes necessários para
o crescimento e desenvolvimento da planta (de Dorlodot et al., 2007). A arquitetura do sistema
radicular (ASR) e a configuração espacial da forma e estrutura de sistemas radiculares possuem
características dinâmicas, como de plasticidade, para se adequarem às condições severas do
ambiente, podendo ser influenciadas por fatores ambientais (Malamy, 2005; Ingram e Malamy,
2010), Além disso, a ASR pode ser influenciada por mudanças globais na expressão gênica
(Osmont et al., 2007), na produção, sinalização e no transporte de fitormônios, principalmente
auxina e citocinina. A auxina está envolvida tanto no crescimento da raiz primária quanto
na iniciação e emergência da raiz lateral, provavelmente controlando componentes do ciclo
celular e resposta ambiental (Benjamins e Scheres, 2008; Malamy, 2010; Teale et al., 2006;

Figura 5. Padrão espaço-temporal de expressão do miR156. A) Em ovários de tomateiro selvagem (cultivar MT). B)
Controle legativo. C) Fruto selvagem de tomateiro selvagem (cultivar MT). D) Fenótipo do fruto do tomateiro geneticamente
modificado com a superexpressão do miR156. Seta maior demonstra a expressão miR156 no óvulo, seta menor indica
a expressão do miR156 na região da placenta do ovário. Fotos C e D foram gentilmente cedidas por Geraldo F. Silva.

MicroRNAs e desenvolvimento vegetal 133

 Vanneste et al., 2005; Vanneste e Friml, 2009). Conjuntamente, as alterações no padrão de
expressão gênica e fitormônios podem ser também correlacionadas com miRNAs. Estudos
recentes demonstram que alguns desses pequenos RNAs estão associados à sinalização e
homeostase da auxina. Nesta seção será discutido detalhadamente o envolvimento dos
miRNAs no sistema radicular e sua interação com hormônios e ambiente.

6.1 MicroRNAs e seus efeitos na formação da raiz principal

A raiz primária é estabelecida durante a embriogênese, quando os tecidos da raiz são
gerados pelo meristema apical radicular, o qual consiste de camadas celulares concêntricas
da epiderme, córtex, endoderme e periciclo que circundam um cilindro vascular central
com xilema e floema (Khan et al., 2011). No núcleo do meristema radicular é encontrado o
centro quiescente (QC), o qual tem por função manter duas camadas celulares adjacentes de
rápida divisão. As células meristemáticas funcionais servem como marcadores de base para
o desenvolvimento radicular (Berleth e Jurgens, 1993; van den Berg et al., 1997; Hamann
et al., 1999; Jiang e Feldman, 2005) e são responsáveis pelo crescimento contínuo de todos
os tipos de células da raiz (Jürgens, 2001).
As células meristemáticas produzem diferentes camadas, mediante divisões mitóticas,
e, subsequentemente, por expansão e diferenciação das diferentes células em função de
sua posição. Portanto, a raiz principal é formada e desenvolvida em três diferentes zonas:
1) a zona meristemática (MZ), na qual as células dividem-se continuamente para gerar
um conjunto de células que vão se diferenciar e alongarem-se, 2) a zona de alongamento
(EZ), na qual as células perdem a capacidade de se dividir e alongam o seu comprimento
e, geralmente, sua largura, e, por fim, 3) a zona de diferenciação (DZ), onde as células
adquirem as suas características e funções especializadas (Petricka et al., 2012).
Em monocotiledôneas, o sistema radicular deriva não só da ramificação de raízes
primárias, mas também de raízes nodais ou adventícias. As raízes não sofrem crescimento

Figura 6. MicroRNAs envolvidos no desenvolvimento da arquitetura do sistema radicular tanto na raiz principal (quarto
retângulo à direita) como na raiz lateral (primeiro à esquerda; primeiro e terceiro à direita); diferenciação do sistema
vascular (mais inferior), resposta a nutrientes (segundo à esquerda) e simbioses como nódulos (terceiro à esquerda) e
micorrizas (segundo à direita), em monocotiledôneas e eudicotiledôneas.

134 Introdução ao mundo dos microRNAs

radial secundário, e a raiz primária se diferencia no embrião da semente. Isso geralmente dá
origem a um sistema de raiz de um único eixo, ou sistema de raiz principal, com crescimento
vertical dominante pelo gravitropismo (resposta à gravidade); as raízes adventícias por sua
vez, são muito menos sensíveis ao gravitropismo que as raízes primárias (Klepper, 1992).
Considerando o grande impacto que os miRNAs possuem ao longo do desenvolvimento
vegetal e animal, nos últimos anos foram estudados o envolvimento dos miRNAs na formação
e desenvolvimento da raiz. O miR156, por exemplo, além de ter papel importante na parte
aérea das plantas (ver seções anteriores), também está envolvido na arquitetura do sistema
radicular. Plantas transgênicas de arroz que superexpressam esse miRNA apresentam maior
número de raízes com menor tamanho (Xie et al., 2012).
O sistema radicular de eudicotiledôneas é formado por um eixo radicular principal
único, do qual derivam as raízes laterais e os pelos radiculares, formando assim um sistema
radicular extensivamente ramificado (figura 6). Nas seções a seguir serão discutidos a formação
e o desenvolvimento do sistema radicular em eudicotiledôneas, focando estudos realizados
na planta modelo A. thaliana.
Em arabidopsis, o miR160 é o mais significativo regulador do crescimento e do
gravitropismo da raiz primária, regulando negativamente três membros da família de
fatores de transcrição ARFs (ARF10, ARF16 e ARF17) (Chen, 2009). A superexpressão do
miR160 promove divisão descontrolada e bloqueio da diferenciação na região distal da
ponta da raiz principal, apresentando um tumor no ápice da raiz e perda da sensibilidade
gravitacional. Corroborando essa observação, plantas duplo mutante de perda de função dos
genes arf10arf16, os quais são alvo do miR160, apresentam fenótipo similar (Wang et al., 2005).
Os miRNAs miR165 e miR166 estão associados ao estabelecimento da identidade abaxial
de órgãos laterais, por meio da regulação de transcritos dos genes HD-ZIPIII (Juarez et al., 2004;
Nogueira et al., 2007, 2009). Além disso, essa via é primordial para garantir a diferenciação
do sistema vascular, pois plantas transgênicas superexpressando o miR166 apresentaram
fenótipo de desorganização dos tecidos vasculares da raiz, o qual foi caracterizado por um
aumento do número de pólos do xilema divergentes do estelo, característico de raízes de
dicotiledôneas (Khan et al., 2011).

6.2 MicroRNAs e seus efeitos funcionais na

formação e desenvolvimento de raízes laterais
A formação das raízes laterais (RLs) é o principal fator que determina a arquitetura
do sistema radicular. O nível de ramificação das RLs tem grande impacto na eficiência
da planta na absorção de água e nutrientes, assim como na sua fixação ao solo (Khan et
al., 2011). As raízes laterais iniciam-se na zona de diferenciação, a partir de divisões celulares
anticlinais das células no periciclo, chamadas de células adjacentes aos pólos do xilema
(Dolan et al., 1993; Péret et al., 2009). Um subconjunto dessas células, denominadas células
fundadoras, é estimulado a se dividir e a formar o primórdio da raiz lateral (PRL). Essas divisões
anticlinais das células fundadoras abrangem a primeira fase (fase I) do desenvolvimento
das RLs (Malamy e Benfey, 1997; Casimiro et al., 2001; Dubrovsky et al., 2001). Estudos têm
demonstrado que populações de células derivadas do periciclo estão intimamente relacionadas
ao desenvolvimento parental de células subjacentes do xilema e floema (Ingram e Malamy,
2010). Na fase II, as células em divisão formam camadas para o exterior do periciclo, sendo
que, nas fases III e IV, as divisões anticlinais compõem-se de quatro camadas celulares que
formam o PRL propriamente dito, o qual começa a sobressair através da raiz primária

MicroRNAs e desenvolvimento vegetal 135

 formada nas etapas a seguir. Enquanto o PRL se desenvolve, ele atravessa a parede celular
da raiz primária mediante modificações enzimáticas da parede celular. Finalmente, a PRL
emerge da raiz primária e ativa seu próprio meristema para atuar como raiz lateral autônoma
(Péret et al., 2009).
A formação da raiz lateral é um processo estreitamente controlado, que envolve um
número variável de genes reguladores (Osmont et al., 2007; Petricka e Benfey, 2008; Péret
et al., 2009), além de ser acompanhado pela ação de fitormônios como a auxina (Boerjan
et al., 1995; Dubrovsky et al., 2008) e a citocinina (Werner et al., 2003; Li et al., 2006). Auxina,
por exemplo, controla positivamente a iniciação das raízes laterais, promovendo a divisão
das células do periciclo devido à sucessiva ativação de alguns membros da família ARF
(Fukaki et al., 2007), desempenhando, portanto, papel principal no desenvolvimento de
raízes laterais (Okushima et al., 2005a, 2005b; Wilmoth et al., 2005).
Além de estarem envolvidos no desenvolvimento da raiz principal (ver seção anterior),
os miRNAs estão também envolvidos no processo de formação e desenvolvimento das raízes
laterais e adventícias. A via miR160/ARF10/ARF16/ARF17, por exemplo, está envolvida na
iniciação das raízes laterais (Wang et al., 2005) (figura 6). Em arabidopsis, a superexpressão
do MIR160 resulta em plantas com fenótipo de aumento no número de raízes laterais, sendo
esse fenótipo corroborado em plantas duplo mutantes com perda de função de seus genes
alvo (arf10/arf16)(Wang et al., 2005).
Outro miRNA importante para o desenvolvimento do sistema radicular em arabidopsis
é o miR164, codificado por três genes nessa espécie: MIR164A, MIR164B e MIR164C (Bonnet
et al., 2004; Jones-Rhoades e Bartel, 2004; Reinhart et al., 2002; Wang et al., 2004). Plantas
mutantes com perda de função para os genes MIR164a e MIR164b produzem mais raízes
laterais que plantas selvagens (Guo et al., 2005). Fenótipo similar foi observado em plantas
superexpressando o gene do tipo NAM-ATAF-CUC1 (NAC), o qual codifica um fator de transcrição
alvo do miR164 (Xie et al., 2002; Guo et al., 2005). O gene NAC1 está envolvido na transmissão
de sinal da auxina e, consequentemente, afeta a emergência e o desenvolvimento das raízes
laterais (Xie et al., 2002). Em conjunto, esses estudos sugerem que a via miR164/NAM é
necessária para o correto desenvolvimento de raízes laterais.
O miR156, além de estar envolvido no desenvolvimento do sistema radicular em
monocotiledôneas (ver seção anterior), também tem papel importante no processo de
formação e desenvolvimento do sistema radicular em eudicotiledôneas. Plantas transgênicas
de arabidopsis superexpressando MIR156 apresentam fenótipo de elevada proliferação de
raízes laterais (Ortiz-Morea et al., 2013).
A via miR390/tasiARF-ARFs (seções anteriores), além de estar envolvida no
desenvolvimento da parte aérea, possui papel biológico na formação do sistema radicular.
Em arabidopsis, o miR390 dirige a clivagem dos transcritos do gene TAS3 para gerar os
tasiRNAs (Fahlgren et al., 2006; Nogueira et al., 2007). Como mencionado anteriormente,
alguns desses tasiRNAs são chamados de tasiARFs, pois “guiam” a clivagem de transcritos
dos genes ARFs (ARF2, ARF3 e ARF4). Tais genes estão envolvidos na homeostase da auxina,
regulando o crescimento e o desenvolvimento das raízes laterais (Marin et al., 2010; Yoon
et al., 2010).
A expressão do miR390 é ativada nas células do periciclo onde começa a se formar o
PRL, sendo que esse padrão de expressão permite a produção dos tasiARFs, os quais, por sua
vez, reprimem os genes ARF3 e ARF4 no novo primórdio (Marin et al., 2010). A via miR390/
TAS3-tasiARF mantém esses genes ARFs num intervalo de atividade que permite o crescimento

136 Introdução ao mundo dos microRNAs

adequado do meristema recém-formado, sendo que os genes ARF2, 3 e 4 contribuem para
a repressão da ativação do meristema (Marin et al., 2010). Adicionalmente, a via miR390/
tasiARF/ARFs afeta o tempo de desenvolvimento do primórdio da raiz lateral, pois mutações
que perturbam a produção de tasiARFs causam acúmulo de primórdios laterais jovens,
enquanto que plantas com elevados níveis de tasiARFs apresentam aumento de estádios
tardios do PRL (Marin et al., 2010).

6.3 Correlação dos microRNAs com fatores ambientais

no desenvolvimento do sistema radicular
As características do solo, como presença ou ausência de nutrientes, influenciam a
ASR, sendo que essa possui plasticidade para adequar-se a diferentes condições ambientais.
A absorção, o transporte e a assimilação de nutrientes como nitrogênio (N), fósforo (P)
e enxofre (S) são indispensáveis para o desenvolvimento das plantas. Esses nutrientes
também são denominados essenciais, pois têm um papel fisiológico claro (Epstein, 1999),
ou a sua ausência na planta a impede de completar seu ciclo de vida (Amon; Stout, 1939).
Estudos recentes têm correlacionado o papel dos miRNAs com esses nutrientes, enfocando
o desenvolvimento do sistema radicular.
O N é um dos nutrientes esenciais mais estudados. O nitrato inibe o crescimento da
raiz primária e aumenta a iniciação e a emergência da raiz lateral; em arabidopsis, a via
miR167/ARF8, por exemplo, está envolvida no crescimento e desenvolvimento de raízes
laterais. O ARF8 é alvo do miR167 e medeia a resposta ao N, sendo esse um conector entre
o ambiente e a plasticidade intermediada pela auxina para a formação e o desenvolvimento
da arquitetura da raiz lateral (Gifford et al., 2008). A superexpressão do miR167 promove
alteração na emergência da raiz lateral em resposta ao nitrato; fenótipo oposto foi observado
em plantas superexpressando uma versão de ARF8 resistente à regulação do miR167
(Gifford et al., 2008). Outra via correlacionada com o N é a via miR393/ARB3. O nitrato é
capaz de induzir a expressão do AFB3 em raízes, e metabólitos de N produzidos antes da
assimilação e redução de nitrato induzem a regulação negativa do gene AFB3 via miR393.
O tratamento de plantas de arabidopsis com nitrato promove o crescimento da ASR, tanto
da raiz primária quanto das raízes laterais, mediante a via miR393/AFB3, que responde a
N. Plantas superexpressando o miR393 e mutantes arb3 com perda de função respondem
de forma similar ao nitrato (Vidal et al., 2010).
O P possui também um papel essencial para a ASR. Plantas crescidas em deprivação
de P apresentam restrição na iniciação de raízes laterais (Martín et al., 2000). O miR399
está envolvido na via de regulação do P, sendo que seu papel regulatório é mediado pelo
gene não codificador IPS1 (INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION 1). O IPS1 restringe a
ativação do miR399 sequestrando-o e, consequentemente, impedindo sua ação regulatória,
dessa forma, os alvos desse microRNA permanecem livres para atuar em seus respectivos
processos biológicos. Esse processo é chamado “target mimicry” e acontece naturalmente
com o miR399 (Franco-Zorrilla et al., 2007). Além disso, o miR399 regula o gene PHO2, que
codifica uma enzima conjugante com ubiquitina E2 (Bari et al., 2006).
A absorção, o transporte e a assimilação de S e a relação desse elemento com a
regulação por miRNAs têm sido menos estudados. O miR595, por exemplo, está envolvido
na deprivação de sulfato; esse miRNA regula negativamente o gene SULTR2;1, que atua no
transporte de S, bem como os genes APS1, APS3 e APS4, que codificam ATP sulforilases
envolvidas na assimilação, transporte e absorção de enxofre. Em concentrações reduzidas

MicroRNAs e desenvolvimento vegetal 137

 desse nutriente, a expressão do miR395 é fortemente induzida (Jones-Rhoades e Bartel, 2004).
Plantas transgênicas de arabidopsis superexpressando o miR395 apresentam aumento no
número de raízes laterais sob condições de deficiência de S (Liang et al., 2010), sugerindo
um papel desse miRNA durante a formação de ASR associada a esse nutriente.
Muitas plantas apresentam mecanismos adicionais para a captura de nutrientes,
como as simbioses. Legumes, por exemplo, apresentam nódulos resultantes da associação
simbiótica entre bactérias do gênero Rhizobium e o sistema radicular (Taiz e Zieger, 2010).
Esse mecanismo é utilizado para a fixação de N atmosférico e geralmente é formado em
plantas com limitação desse nutriente. A superexpressão do miR169 afeta expressivamente
o desenvolvimento dos nódulos devido à redução dos níveis de transcritos do seu alvo
MtHAP2-1, esse é um fator de transcrição que está envolvido na diferenciação de células
corticais do primórdio do nódulo em M. truncatula (Combier et al., 2006). A superexpressão
do miR166 em M. truncatula resultou em aumento na densidade de raízes laterais e também
de nódulos (Boualem et al., 2008), muito provavelmente por meio da regulação de transcritos
dos genes HD-ZIPIII.
Foi sugerido que o miR482 está envolvido nos estádios iniciais de desenvolvimento
dos nódulos, sendo que os níveis de transcritos desse microRNA aumentam na fase inicial de
desenvolvimento. Além disso, esse microRNA parece estar envolvido no estabelecimento dos
nódulos, pois a superexpressão do miR482 aumenta o número de nódulos (Simon et al., 2009).
Além do envolvimento desses miRNAs no desenvolvimento dos nódulos, outros miRNAs
poderiam estar envolvidos, como é o caso de miR160 e miR167, uma vez que dados de
sequenciamento em larga escala demonstraram um acúmulo dos transcritos nos nódulos
maduros em M. truncatula (Lelandais-Brière et al., 2009; Wang et al., 2009).
As micorrizas também representam outro exemplo de associação simbiótica que auxilia
na captura de nutrientes, especialmente P. Micorrização é a simbiose entre fungos do solo
e o sistema radicular das plantas. No legume M. truncatula, o miR396 regula negativamente
a formação de micorrizas e o crescimento radicular, tendo como alvos genes que codificam
fatores de transcrição GRF (GROWTH-REGULATING FACTOR). Em plantas superexpressando
esse miRNA foi observada uma redução nos níveis de expressão de seis genes GRF alvos,
além de redução no crescimento da raiz e diminuição na formação de micorrizas. Em
contrapartida, plantas transgênicas mimicry para miR396 (plantas transgênicas nas quais
a atividade regulatória do miR396 é suprimida) apresentaram fenótipo contrário, sendo
constatado aumento na biomassa da raiz e com maiores associações micorrízicas (Bazin
et al., 2013).

7. Outros aspectos relacionados ao desenvolvimento vegetal

Ainda que as funções de um grande número de microRNAs tenham sido descritas com
a utilização de plantas transgênicas, alguns dados interessantes relacionados a microRNAs
vêm sendo correlacionados com desenvolvimento vegetal em outras espécies vegetais.
Nesse aspecto, as análises em larga escala com geração e sequenciamento de bibliotecas
de pequenos RNAs utilizando sequenciadores de alto desempenho (next generation sequecing),
com posterior avaliação computacional, vêm contribuindo significativamente não somente
para identificação de novos microRNAs mas também para sugerir que eles podem contribuir
para o desenvolvimento vegetal nos mais diversos grupos de plantas (Zanca et al., 2010; Song
et al., 2010; Ortiz-Morea et al., 2013).

138 Introdução ao mundo dos microRNAs

 Como exemplo podem-se destacar as análises de dados provenientes de sequenciamento
em larga escala de embriões somáticos de algodão (Gossypium hirsutum), que demonstaram
que alguns microRNAs encontram-se abundantes durante o processo de embriogênese
somática (conjunto de etapas pelas quais células somáticas diferenciam-se em embriões),
sugerindo uma participação dos microRNAs nesse processo (Yang et al., 2013). Esse fato
torna-se ainda mais relevante já que, em experimentos de embriogênese somática, o que
ocorre com o explante é semelhante morfologicamente ao que ocorre com embriões zigóticos
(George et al., 2008), o que demonstra que tais experimentos de embriogênese podem ser
empregados em estudos de desenvolvimento embrionário que tenham por objetivo identificar
o papel dos microRNAs nesse processo, uma vez que, e com o auxílio de sequenciamento
em larga escala, foi demonstrado que microRNAs estão expressos ao longo desse processo.
Outro dado interessante foi obtido com a análise computacional de bibliotecas de
pequenos RNAs em laranja (Citrus trifoliata). Esse estudo revelou a ocorrência de alterações
dinâmicas no pefil de expressão de microRNAs em diversos órgãos/tecidos analisados (p.
ex., caule jovem, caules adultos, raiz, folhas e flores, entre outros tecidos), sugerindo que
as vias reguladas por esses pequenos RNAs exercem papel funcional relevante ao longo do
desenvolvimento também nessa espécie (Song et al., 2013).
Nesse contexto é possível destacar também algumas análises em larga escala realizadas
em cana-de-açúcar (Saccharum sp.). Nosso grupo de pesquisa recentemente demonstrou
que o gene SsGAMYB é regulado pelo miR159 durante o desenvolvimento de gemas laterais.
Curiosamente, a maioria das sequências identificadas do miR159 foram provenientes de
bibliotecas de pequenos RNAs expressos em gemas inativas; esse dado, aliado ao fato de que o
acúmulo de transcritos do miR159 é profundamente reduzido nas gemas em desenvolvimento,
sugere que o gene SsGAMYB é predominantemente regulado em gemas axilares inativas pelo
miR159 (Ortiz-Morea et al., 2013). A importância dessa descoberta encontra-se no fato de que
a formação de gemas axilares/laterais, bem como sua posterior brotação (ramificação), é um
fator primordial no que diz respeito à determinação da arquitetura vegetal. A capacidade
de formação e desenvolvimento de ramos lateriais afeta tanto a biomassa foliar quanto o
número de inflorescências (Doust, 2007), sendo necessário para o sucesso reprodutivo de
muitas plantas.

8. Desafios e perspectivas das pesquisas

relacionadas aos microRNAs
Posteriomente à identificação dos microRNAs, avanços significativos foram feitos
visando descrever os mais diversos papéis funcionais desses pequenos RNAs. Contudo, no
reino vegetal, algumas perguntas desafiadoras ainda permanecem sem resposta. Dentre elas
é possível destacar: Existem mais redes de interação entre vias orquestradas por microRNAs
atuando, já que poucas encontram-se descritas? Como é o padrão de expressão dos microRNAs
nas espécies de plantas selvagens, e qual o papel ambiental desse padrão de expressão? Qual o
impacto de microRNAs ainda não identificados no desenvolvimento vegetal? Quão relevantes
são os microRNAs espécie-específicos para o sucesso reprodutivo da espécie que o possui?
As respostas a essas perguntas poderão fornecer novas concepções para os mecanismos que
regulam o desenvolvimento das plantas e que são orquestrados por microRNAs.

MicroRNAs e desenvolvimento vegetal 139

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MicroRNAs e desenvolvimento vegetal 145
MicroRNAs em insetos Capítulo
Papéis no desenvolvimento,
8
metamorfose, comportamento,
sistema imune e além

Felipe Martelli1, Natália Helena Hernandes1, Dr.a Camilla Valente Pires1,

Prof.a Dr.a Zilá Luz Paulino Simões2, Prof. Dr. Francis Morais Franco Nunes3
1
Depto. de Genética, FMRP, USP – SP
2
Depto. de Biologia, FFCLRP, USP – SP
3
Depto. de Genética e Evolução, UFSCar – SP

Estruturação do capítulo
1. Introdução
2. Ativação do genoma zigótico e embriogênese
3. Regulação do desenvolvimento e da metamorfose
4. Regulação do crescimento celular e corporal
5. Regulação de apoptose
6. Manutenção e diferenciação de células da linhagem germinativa
7. Regulação do desenvolvimento do sistema nervoso
8. Regulação do tempo de vida e envelhecimento
9. Regulação do sistema imune
10. Regulação da relação inseto vetor-parasita
11. Efeito sobre variações fenotípicas populacionais
12. Regulação do dimorfismo sexual e comportamento reprodutivo
13. Regulação do comportamento social
14. MicroRNAs na alimentação larval e na determinação de castas
15. Considerações finais

MicroRNAs em insetos 147

 1. Introdução
Os insetos surgiram há cerca de 400 milhões de anos, sendo hoje o grupo animal com
maior diversidade e abundância do planeta. A classe Insecta é composta por mais de 1 milhão
de espécies conhecidas (com estimativas de 30 milhões de espécies). Estima-se uma biomassa
de 1012 quilogramas de insetos vivos (em qualquer tempo), o que corresponde a cerca de 1019
indivíduos. Os insetos são encontrados em praticamente todos os tipos de ambientes: desertos,
fontes termais, geleiras, oceanos, sob condições de temperatura e altitudes extremas, entre
outros. A megadiversidade e grande sucesso evolutivo do grupo se devem à alta capacidade
reprodutiva, às asas, à coevolução com as angiospermas, ao tamanho pequeno (comparado a
outros metazoários), ao uso diferencial de nichos de acordo com a fase do desenvolvimento
e, finalmente, à proteção conferida pelo exoesqueleto. Os insetos são fundamentais para a
manutenção dos ecossistemas, participando de ciclos biogeoquímicos e teias alimentares,
reciclando matéria orgânica e/ou servindo de fonte alimentar para inúmeros seres vivos.
Além disso, muitos insetos possuem importância ecológica e agrícola por serem exímios
polinizadores de áreas naturais e cultivadas. Por outro lado, em torno de 1% das espécies
de inseto representam algum tipo de malefício para a economia ou saúde humana, sendo
vetores de doenças humanas e de animais domésticos, além de destruírem plantações.
Todas as características mencionadas acima denotam a relevância dos insetos para
o mundo. Consequentemente, os insetos se tornaram importantes alvos em diferentes áreas
da ciência. Por exemplo, no início do século XX, estudos genéticos conduzidos por Thomas
Hunt Morgan e colaboradores, usando a mosca drosófila (Drosophila melanogaster) como
organismo-modelo, permitiram compreender sobre a localização de genes nos cromossomos,
mutações, segregação e hereditariedade. Os trabalhos liderados por Morgan renderam-lhe
o Prêmio Nobel em Fisiologia ou Medicina, em 1933. Outros nobelistas foram agraciados em
decorrência de seus estudos com insetos: Hermann Joseph Muller, Karl Ritter von Frisch,
Edward Bok Lewis, Christiane Nüsslein-Volhard, Eric Wieschaus e Jules Alphonse Hoffmann.
O díptera D. melanogaster foi o segundo metazoário a ter o genoma sequenciado (o primeiro
foi o verme Caenorhabditis elegans), sendo os dados publicados em março de 2000 (Adams
et al., 2000). A elucidação do genoma da mosca abriu caminho para investigações genéticas
mais aprofundadas e em larga escala e serve, até hoje, como referência para compreensão
da biologia e evolução de inúmeros outros eucariotos (Jaubert et al., 2007).
Ainda que por muitos anos os geneticistas tenham voltado seu olhar prioritariamente
para os elementos genômicos diretamente envolvidos na síntese de proteínas (mRNA, tRNA,
rRNA), o foco agora está no estudo das partes funcionais dos genomas que são transcritas
mas não traduzidas. Entre as classes de RNAs não codificadores destacam-se os microRNAs
(miRNAs), que usualmente regulam negativamente a expressão de mRNAs e proteínas por
meio de mecanismos muito precisos (Bartel, 2009; Jones; Newbury, 2010).
Os primeiros microRNAs de insetos foram identificados em D. melanogaster, por meio
de técnicas de biologia molecular (clonagem de cDNA, sequenciamento e northern blot) ou
de análises de bioinformática que verificaram as estruturas secundárias e homologias de
sequências de microRNAs entre vertebrados e invertebrados (Lagos-Quintana et al., 2001;
Lau et al., 2001; Lee; Ambros, 2001).
Nos anos que se seguiram, os microRNAs começaram a ser identificados por análises
experimentais ou in silico, em outros insetos cujos genomas estão sequenciados ou por
meio de estudos de transcriptomas. Em junho de 2015 realizamos buscas nas bases de
dados NCBI-PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed), miRBase release 21 (http://

148 Introdução ao mundo dos microRNAs

www.mirbase.org) e miRNEST 2.0 (http://lemur.amu.edu.pl/share/php/mirnest/home.php) e
encontramos informações sobre microRNAs de 75 insetos, entre eles: Aedes aegypti, Anopheles
darlingi, Anopheles gambiae, Apis mellifera, Bombyx mori, Cochliomyia hominivorax, Culex
quinquefasciatus, Drosophila sp (12 espécies), Locusta migratoria, Nasonia sp (3 espécies),
Polypedilum vanderplanki, Spodoptera frugiperda e Tribolium castaneum. Essas mesmas
buscas revelaram cerca de 3.200 sequências de microRNA precursores e 4 mil sequências de
microRNAs maduros (incluindo as formas -5p e -3p) já identificadas em insetos, sendo muitas
dessas sequências conservadas. Para a maioria desses microRNAs maduros, os respectivos
genes alvos são ainda desconhecidos. O bicho-da-seda (mariposa), B. mori, é o inseto com
o maior número de microRNAs conhecidos até o momento: mais de 500 sequências tanto
de precursores quanto de maduros. Até junho de 2015 foram publicados 1.103 artigos ou
revisões de microRNAs em insetos (fonte PubMed-NCBI).
Os números indicam que o que conhecemos hoje é apenas uma pequena porcentagem
dos microRNAs de insetos, até porque a vasta maioria dos genomas desse grupo ainda não foi
sequenciada (Asgari, 2013). O Consórcio Internacional, denominado i5K, está sequenciando
os genomas de diferentes ordens de insetos, até se atingir a meta final de 5 mil espécies
(Robinson et al., 2011), o que certamente permitirá a ampliação dos conhecimentos sobre
os microRNAs e seus alvos gênicos. Sendo assim, muitos dos avanços científicos referentes
aos microRNAs de insetos ainda se restringem ao organismo-modelo D. melanogaster e a
alguns insetos cujas sequências genômicas estão disponíveis. A saber, o primeiro microRNA
mutante a ser estudado em um inseto foi o miR-14, em Drosophila, por Xu e colaboradores
(2003). Desde então, outros microRNAs com mutações de ganho ou perda de função foram
gerados nessa espécie, em busca de esclarecer suas funções (revisado por Lucas; Raikhel,
2013). A tabela 1 resume alguns processos biológicos em insetos que estão sob a ação de
microRNAs. Percebe-se que um mesmo microRNA pode estar envolvido em diferentes contextos,
redundância essa que sinaliza papéis pleiotrópicos (Smibert; Lai, 2010).

Tabela 1. MicroRNAs de insetos com funções conhecidas*.

Contexto biológico microRNA(s)

Sistema imune** let-7, miR-8
Apoptose, antiapoptose, proliferação miR-2, miR-6, miR-8, miR-11, miR-13, miR-14, miR-263a,
celular miR-263b, miR-278, miR-308, bantam
Embriogênese miR-1, miR-2a-1, miR-3, miR-4, miR-5, miR-6-1, miR-6-2,
miR-6-3, miR-9a, miR-10, miR-11, miR-13, miR-31, miR-184,
miR-286, miR-309, iab-4a, miR-311, miR-312, miR-313, miR-
9, miR-92b
Formação e/ou diferenciação de órgãos, miR-1, miR-7, miR-8, miR-100, miR-125, miR-133, miR-184,
tecidos, estruturas ou apêndices miR-9a, iab-4, iab-8, let-7, miR-278, miR-279, miR-263a, miR-
corporais 263b, bantam, miR-193, miR-2788
Linhagem germinativa miR-7, miR-184, miR-278, miR-275, miR-282, miR-306, miR-
309, miR-310, miR-313, bantam
Comportamento (social, cópula, miR-1, miR-8, miR-iab-4, miR-iab-8, let-7, miR-125, miR-184,
locomoção) miR-2786, miR-31a, let-7, miR-252, miR-275, miR-279, miR-
281, miR-13b, miR-133, miR-210, miR-278, miR-375, miR-92a,
miR-989, miR-750, miR-316, miR-3739, miR-3776, miR-3796,
miR3718a, miR, 3745, miR-3749, miR-3049
*Informações compiladas de diversos artigos listados nas Referências Bibliográficas.
**Vide Fullaondo e Lee (2012) para uma lista de dezenas de microRNAs potencialmente envolvidos na regulação de
genes de resposta imunológica em dípteros.

MicroRNAs em insetos 149

 Contexto biológico microRNA(s)
Ritmos circadianos bantam
Mudas e metamorfose let-7, miR-2, miR-100, miR-125, miR-14, miR-34, iab-4, mir-
48, mir-84, mir-241, miR-193, miR-2788
Desenvolvimento e fisiologia do sistema miR-7, miR-8, miR-124, miR-184, miR-277, mirR-278, miR-
nervoso, de órgãos sensoriais e junções 279, miR-9a, miR-34, miR-310, miR-313, bantam
neuromusculares
Divisão celular miR-7, miR-278, miR-309, bantam
Controle do crescimento/via de insulina miR-2, miR-6, miR-8, miR-14, miR-278, bantam
Fertilidade let-7, miR-184, miR-iab-8
Reprodução/Tecidos reprodutivos miR-34, miR-X47, miR-X103, miR-307*, miR-X52*, miR-275,
miR-14, miR-8, miR-184, miR-3, miR-309, miR-318, miR-7,
miR-278, miR-279, miR-989
Polifenismo let-7, miR-100, miR2a-1, miR-34, miR-X47, miR-X103, miR-
307*, miR-X52*, miR-276, miR-125, miR-1, let-7, miR-315,
miR-71, miR-9a
Longevidade/envelhecimento miR-14, miR-34, miR-277
Responsivos a estresse, ambiente ou miR-1, miR-184, miR-277, miR-279, let-7, miR-34, miR-1174,
dieta miR-1175, miR-989, miR-92, miR-2940, miR-34, miR-317,
miR-1174, miR-1175
Metabolismo, homeostase e vias de miR-1, miR-7, miR-315, miR-275, miR-278, miR-8, miR-14,
sinalização (hormonal, Notch, Wnt/Wg, bantam, miR-310, miR-313
insulina, Hippo, Hedgehog, TGF-beta,
outras)
*Informações compiladas de diversos artigos listados nas Referências Bibliográficas.
**Vide Fullaondo e Lee (2012) para uma lista de dezenas de microRNAs potencialmente envolvidos na regulação de
genes de resposta imunológica em dípteros.

Os microRNAs controlam pelo menos 30% de todos os genes em Drosophila (Ruby

et al., 2007), sendo que muitos desses possuem, na região 3’ UTR, sítios para ligação de mais
de um microRNA (Grün et al., 2005; Belles et al., 2011). Estima-se que um único microRNA
possa regular em torno de 50 a 100 genes, considerando as diferentes espécies de Drosophila
(Lai et al., 2003; Grün et al., 2005).
Praticamente todas as famílias de microRNAs de vertebrados possuem pelo menos
um ortólogo em insetos. Por exemplo, já se conhece ao menos 80 microRNAs compartilhados
entre humanos e espécies do gênero Drosophila (Ibáñez-Ventoso et al., 2008).
Embora existam muitos microRNAs conservados entre os animais, por exemplo: let-7,
miR-1, miR-7, miR-8, miR-9a, miR-10, miR-125, miR-133, miR-184, miR-210, miR-285, miR-304,
poucas relações microRNA-mRNA são filogeneticamente compartilhadas entre vertebrados
e invertebrados (Grün et al., 2005). Possíveis explicações são as diferenças nos tamanhos
das regiões 3’ UTR dos mRNAs nesses taxa (média de 400 nucleotídeos em D. melanogaster
e de 900 nucleotídeos em humanos), os quais, consequentemente, discordam em relação
aos sítios de ligação de microRNAs existentes (Grün et al., 2005). Por outro lado, as relações
microRNA-mRNA que são filogeneticamente compartilhadas estão supostamente envolvidas
em vias metabólicas ou em redes gênicas existentes nos ancestrais de ambos os clados (Grün
et al., 2005; Asgari, 2013).
Alguns genes de microRNAs encontram-se fisicamente próximos nos cromossomos, de
forma que alguns desses grupos (também chamados de clusters) são coexpressos. Acredita-se
que os microRNAs de uma mesma região sejam transcritos como uma unidade policistrônica,
que é posteriormente processada para originar os distintos microRNAs (Behura, 2007; Pitto
et al., 2008), embora isso não seja uma regra. Um caso curioso em Drosophila refere-se a

150 Introdução ao mundo dos microRNAs

dois microRNAs separados por apenas 126 pares de bases (pb) cujas expressões se dão em
momentos distintos da ontogênese: miR-275 é expresso durante o estágio larval, enquanto
miR-305, durante o estágio embrionário e adulto (revisado por Behura, 2007). Em Drosophila
existem pelo menos dez regiões genômicas em que se encontram clusters de microRNAs,
cada região contendo de 2 a 8 genes de microRNAs. Na abelha A. mellifera, seis dessas regiões
foram identificadas (revisado por Behura, 2007). Dentre elas, destacamos o cluster miR-
2 (constituído pelos microRNAs: mir-71, mir-2-3, mir-13a, mir-13b, miR-2-1, mir-2-2), cuja
organização e sequência genômicas são conservadas entre vários insetos (A. mellifera, B. mori
e T. castaneum). Curiosamente, os componentes do cluster miR-2 encontram-se separados
no genoma de espécies do gênero Drosophila, além de não apresentarem o membro miR-71
(Marco et al., 2010).
A expressão de inúmeros microRNAs é regulada espacial e/ou temporalmente ao
longo do desenvolvimento (revisado por Massirer; Pasquinelli, 2006; Behura, 2007). Uma
análise funcional dos microRNAs de Drosophila, baseada em termos da base de dados Gene
Ontology, ressalta a atuação desses elementos em inúmeros processos biológicos, tais como:
organização de cromossomos e biogênese, sinalização celular, crescimento, morfogênese,
organogênese, metamorfose, regulação de processos fisiológicos, apoptose, desenvolvimento
do sistema nervoso, ovogênese, comportamento, locomoção, entre outros (Grün et al., 2005).
Tais informações acabam por contribuir para o entendimento de questões de cunho ecológico,
como interações hospedeiro-parasita, e de cunho filogenético, como a evolução de diferentes
comportamentos e estilos de vida dos Hexapoda (revisado por Behura, 2007).
A seguir, apresentaremos a influência dos microRNAs sobre vários aspectos da vida
dos insetos.

2. Ativação do genoma zigótico e embriogênese

Entre a maturação do ovócito de Drosophila e o início da embriogênese desse organismo
existem evidências de que microRNAs de origem materna impedem a tradução de mRNAs
(Nakahara et al., 2005) até que o ovo esteja ativado (Von Stetina; Orr-Weaver, 2011). Esses
microRNAs, dentre eles o miR-34, são produzidos nas células foliculares (Soni et al., 2013).
No início da embriogênese dos insetos, e também dos vertebrados, dois processos
ocorrem na transição materno-zigótica do controle do desenvolvimento: primeiro, um
subconjunto de mRNAs maternos é degradado e, segundo, o genoma do zigoto é ativado.
A transcrição zigótica é também responsável pela produção de proteínas e de microRNAs
que suportam a eficiência na degradação dos mRNAs maternos (Tadros; Lipshitz, 2009).
Em Drosophila, dentre as moléculas maternas que atuam nessa transição, estão a proteína
SMG (Smaug) e o fator de transcrição Zelda (Zinc-finger early Drosophila activator). SMG é
requerida não apenas para a degradação de mRNAs, mas também controla a transcrição do
cluster miR-309 (Smibert; Lai, 2008), que atua na regulação direta dos mRNA maternos (Benoit
et al., 2009). Zelda controla a transcrição dos primeiros mRNAs transcritos pelo genoma
zigótico (Bosch et al., 2006; Liang et al., 2008) e de diversos microRNAs (miR-10, miR-9a, iab-4,
iab-4a, miR-1, miR-92b, miR-9a, miR-2a-1, miR-11, miR-6a, miR-965 e cluster miR-309). Esses
microRNAs regulam, por sua vez, a expressão de genes homeóticos, a formação da linha
mediana, o desenvolvimento muscular e a repressão de morte celular (Fu et al., 2014). Sabe-
se que microRNAs expressos na embriogênese de insetos também regulam genes ligados a

MicroRNAs em insetos 151

 apoptose (miR-1, miR-2, miR-13, miR-6, miR-11 e miR-308), formação da cabeça e abdômen
posterior (miR-2 e miR-13) (Boutla et al., 2003), segmentação (miR-31 e miR-9), crescimento
e formação do embrião (Learmen et al., 2005).
Em embriões de abelhas A. mellifera, a localização celular dos pri-miRNAs mir-9a
e mir-184 ajudou a determinar suas funções, na formação de peças bucais e controlando
eventos durante a blastoderme, respectivamente (Zondag et al., 2012). Além disso, o
silenciamento de Dicer (enzima da via de biogênese de microRNAs) causou defeitos na
membrana extraembrionária e no estabelecimento dos eixos anteroposterior e dorsoventral
(Zondag et al., 2012).

3. Regulação do desenvolvimento e da metamorfose

MicroRNAs são reguladores da metamorfose de insetos hemimetábolos e holometábolos
(Belles et al., 2011). Rubio e colaboradores (2012) investigaram os efeitos dos hormônios 20E
(20-hidroxi-ecdisona) e HJ (hormônio juvenil) sobre a expressão de microRNAs no penúltimo
e último estágios de ninfa (chamados N5 e N6, respectivamente) da barata Blattella germanica.
Foi verificado um aumento significativo na expressão de microRNAs do cluster let-7C (let-7-5p,
miR-100-5p e miR-125-5p) em resposta ao tratamento com 20E, momento que corresponde à
fase N6 em condições naturais. Já o miR-252-3p, cuja expressão é acentuada na fase N5, foi
inibido após o mesmo tratamento. Os microRNAs let-7-5p e miR-100-5p também regulam o
tamanho e venação das asas durante o desenvolvimento de baratas (Rubio; Belles, 2013).
Outro cluster envolvido na regulação da metamorfose é o cluster miR-2. Membros dessa
família regulam Krüppel homolog 1 (Kr-h1), envolvido na ativação de genes da metamorfose
que são dependentes de HJ (Lozano et al., 2015).
Em B. mori, 354 microRNAs foram experimentalmente validados como elementos
funcionais ao longo do desenvolvimento, usando a técnica de microarrays. Desse total, cerca
de 70% mostraram-se preferencialmente expressos em embriões e pupas, sugerindo forte
relação com a embriogênese e a metamorfose (Zhang et al., 2009). O miR-281 de B. mori
regula negativamente a expressão da isoforma B do receptor de ecdisona (EcR-B), um gene
que se expressa em tecidos larvais sujeitos à apoptose. Além disso, o miR-281 é inibido por
ecdisteroides (como o 20E). A ação coordenada desses três elementos (miR-281, EcR-B e 20E)
controla o desenvolvimento dos túbulos de Malpighi (Jiang et al., 2013).
Martin e colaboradores (2009) demonstraram que uma mutação no gene pasha, em
Drosophila, cujo produto proteico participa da biogênese dos microRNAs juntamente com
a enzima Drosha, ocasiona defeitos na formação dos discos imaginais. Em B. germanica, o
silenciamento da Dicer-1 inibiu a metamorfose, mantendo os indivíduos no estágio de ninfas
e incapazes de realizar mudas (Gomez-Orte; Belles, 2009).
Let-7 é o microRNA filogeneticamente mais conservado entre os animais e está
envolvido em inúmeros processos biológicos. No entanto, a principal função de let-7 é o
controle do tempo de desenvolvimento (revisado por Asgari, 2013; Kenny et al., 2013). Tanto
em D. melanogaster quanto em B. mori, os membros do cluster let-7C (que inclui let-7, miR-
100 e miR-125) respondem aos pulsos do hormônio 20E e, consequentemente, regulam os
processos que culminam nas transições larvais e na metamorfose (Bashirullah et al., 2003;
Sempere et al., 2002; 2003; Liu et al., 2007; Smibert; Lai, 2008). Deficiências em membros
desse cluster afetam a mobilidade e a neurogênese, reduzem a fecundidade nos organismos

152 Introdução ao mundo dos microRNAs

adultos e deixam a neuromusculatura com um fenótipo juvenil. O efeito pleiotrópico causado
pela deficiência de let-7 é um indicativo da enorme quantidade de alvos por ele regulado
(revisado por Asgari, 2013; Kenny et al., 2013).
Ainda no tocante às ações de microRNAs sobre o desenvolvimento das asas, destacam-
se miR-9a e iab-4. O microRNA miR-9a reprime apoptose enquanto o iab-4 tem como alvo
os transcritos do gene homeótico ultrabitorax (Ubx), regulando a transformação dos alteres
em asas (revisado por Asgari, 2013).
Em insetos, a repressão da metamorfose e o estímulo para o crescimento larval são
desencadeados pelos baixos títulos de ecdisteroides bem como por uma elevação da via da
insulina (Boulan et al., 2013). Paralelamente à ação dessas vias, o microRNA bantam regula
várias vias de sinalização como Hippo e Notch, tendo um papel na regularação do crescimento
corporal de forma autônoma (Boulan et al., 2013). A elevada expressão de bantam inibe
a produção de ecdisteroides nas células produtoras de ecdisona (presentes nas glândulas
protorácicas), inibindo a metamorfose e garantindo o crescimento (Boulan et al., 2013).
Na mariposa Helicoverpa armigera, o microRNA miR-24 regula o gene codificador
da enzima quitinase. Tal enzima degrada a quitina, polímero que é o principal constituinte
da cutícula. A elevada expressão de quitinase coincide com a muda larval e é regulada pelo
hormônio 20E. A expressão de miR-24 é inversamente relacionada à expressão de quitinase,
de forma que larvas de quarto instar alimentadas com miR-24 sintético apresentaram redução
nos níveis dessa enzima e não sofreram o processo de muda e, em alguns casos, morreram
(Agrawal et al., 2013).

4. Regulação do crescimento celular e corporal

Os microRNAs também regulam a proliferação e o crescimento celular e corporal
dos insetos. O miR-8, em Drosophila, promove o crescimento corporal ativando a via da
insulina no corpo gorduroso. Esse microRNA ativa o complexo PI3K (fosfatidilinositol 3
quinase), um componente da via da insulina, por meio da inibição do seu repressor Ush
(U-shaped) (Jin et al., 2012). A via da insulina é uma via neuroendócrina altamente conservada
no reino animal, sensora de nutrientes, responsável por controlar uma grande variedade
de processos biológicos como crescimento, amadurecimento, metabolismo energético e o
tempo de vida (revisado por Russel; Kahn, 2007; Piper et al., 2008). Em insetos, a via da
insulina é positivamente correlacionada à atuação do HJ e ambas antagonizam a ação dos
ecdisteroides (revisado por De Loof, 2008). A ação de ecdisteroides inibe os níveis de miR-
8, tendo um efeito negativo sobre a via da insulina, inibindo o crescimento corporal (Jin
et al., 2012). Vallejo e colaboradores (2011) mostraram que a família miR-8/miR-200 inibe
o supercrescimento celular induzido por Notch e, também, reprimem a metástase tumoral
em Drosophila e em humanos.

5. Regulação de apoptose
O controle do mecanismo de morte celular programada é fundamental para a
manutenção da homeostase celular e do crescimento dos organismos. Os microRNAs bantam,
miR-2, miR-11, miR-13, miR-14, miR-263 e miR-278 regulam a atividade de genes controladores

MicroRNAs em insetos 153

 da apoptose, reprimindo esse processo. Membros da família miR-2, por exemplo, inibem
transcritos das proteínas pró-apoptóticas lid, grim, reaper e sickle em Drosophila (revisado
por Asgari, 2013). Nesse organismo, a mesma família miR-2 apresenta um papel regulador
sobre o fator de transcrição dE2f1, relacionado ao ciclo e proliferação celular (revisado por
Lucas; Raikhel, 2013). Uma expressão incorreta desses elementos pode ocasionar câncer
e crescimento celular exacerbado por inibir a apoptose nos momentos em que ela se faz
necessária (revisado por Asgari, 2013; Lucas; Raikhel, 2013).
O miR-263 de Drosophila pertence a uma família de microRNAs filogeneticamente
conservada que inclui miR-96, miR-182 e miR-183, em mamíferos. O miR-263 regula o gene
pró-apoptótico hid, inibindo a morte celular programada. É interessante ressaltar que o
miR-96 foi também associado à perda de cabelo e surdez em camundongos e humanos,
fenótipos relacionados ao envelhecimento (revisado por Behura, 2007; Lucas; Raikhel, 2013).

6. Manutenção e diferenciação de
células da linhagem germinativa
Os microRNAs também desempenham tarefas na manutenção e renovação das
células-tronco da linhagem germinativa. O microRNA miR-184 é expresso maternalmente,
regulando a expressão de saxophone (sax), que por sua vez é o receptor de decapentaplégico
(decapentaplegic, dpp). O locus sax é importante para a progressão da ovogênese e, no
zigoto, controla os fatores K10 e Tramtracks69, que atuam no estabelecimento dos eixos
dorsoventral e anteroposterior nas fases iniciais da embriogênese (revisado por Asgari, 2013).
Em machos de Drosophila, uma deficiência em miR-7 impede a diferenciação das células-
tronco gaméticas em espermatócitos primários (revisado por Asgari, 2013). Nas fêmeas,
bantam, em condições normais, interage com a proteína dFmr1, garantindo a manutenção
das células germinativas nos ovários. Ainda, miR-7, miR-278 e miR-309 regulam o transcrito
Decapo (Dap), uma quinase dependente de ciclina, regulando dessa forma o ciclo celular da
linhagem germinativa (revisado por Asgari, 2013). A deficiência de Dicer-1, participante da
biogênese dos microRNAs, causa infertilidade em fêmeas da barata B. germanica (revisado
por Asgari, 2013).
Pancratov e colaboradores (2013) descobriram que miR-310 e miR-313 atuam sobre
a via Wnt/Wingless, tendo um importante papel sobre o desenvolvimento gonadal em
machos de Drosophila. A via Wnt/Wingless regula muitas redes gênicas relacionadas ao
desenvolvimento, sendo uma das mais prevalentes associadas ao câncer. Em moscas, o gene
armadillo
Atuam como antagonistas dessa via miR-310 e miR-313, reprimindo a atividade de armadillo.
As atividades desses microRNAs são essenciais para promover a correta proliferação e
diferenciação de células gaméticas e somáticas nos testículos de Drosophila, garantindo a
homeostase desse órgão (Pancratov et al., 2013).
Um microRNA específico de insetos encontrado em todos os insetos holometábolos
pesquisados é miR-282. A ausência desse microRNA em Drosophila promove uma redução na
produção de ovos devido ao aumento da apoptose nos tecidos ovarianos (Vilmos et al., 2013).
Em Drosophila, os microRNAs miR-275 e miR-306 regulam a expressão do gene
Bam (Bag of marbles) que, por sua vez, controla a diferenciação de espermatogônias para
espermatócitos (Eun et al., 2013).

154 Introdução ao mundo dos microRNAs

7. Regulação do desenvolvimento do sistema nervoso
Muitos microRNAs têm se mostrado imprescindíveis para um correto desenvolvimento
do sistema nervoso, entre eles os já citados: let-7, miR-7, miR-8, bantam e miR-9a, além de
outros como miR-34 e miR-124. Drosófilas com deficiências em alguns desses microRNAs
apresentam uma miríade de efeitos pleiotrópicos tais como: redução do tempo de vida,
neurodegeneração, desenvolvimento cognitivo prejudicado, defeitos neuromusculares. Por
exemplo, miR-8 regula processos relacionados à morfogênese da junção neuromuscular,
sistema imune, pigmentação e tamanho corporal em Drosophila (revisado por Asgari, 2013).
O miR-34 é um microRNA conservado entre invertebrados (Drosophila e C. elegans) e
vertebrados (camundongos e humanos) envolvido na reprogramação celular somática, tendo
um papel central na diferenciação neural inicial (Liu et al., 2012a; Soni et al., 2013). Esses
organismos apresentam um aumento da expressão de miR-34 com o avanço da idade (Liu
et al., 2012a). Em Drosophila, o aumento desse microRNA ocorre como forma de combater
efeitos do envelhecimento como a perda da locomoção e a deterioração cerebral. A perda desse
microRNA acarreta em um acelerado envelhecimento cerebral e declínio da sobrevivência (Liu
et al., 2012a). Não surpreendentemente, esse microRNA apresenta elevados níveis em cérebros
de pacientes com doença de Alzheimer, sugerindo uma possível estratégia para tratamentos
(Lucas; Raikhel, 2013). Soni e colaboradores (2013) demonstraram que, em Drosophila, o
miR-34 está presente em embriões mesmo antes do início do processo de transcrição do
zigoto, sendo, portanto, maternalmente herdado, de forma que sua expressão nos ovócitos
é dependente da maquinaria de processamento de microRNAs da mãe, evidenciando assim
sua importância nos aspectos relacionados ao desenvolvimento do sistema nervoso.
O microRNA miR-8 também foi indicado como possuindo um papel no combate à
neurodegeneração em Drosophila. Deficiências nesse microRNA também acarretam redução
da sobrevivência, malformação de pernas e asas e redução da coordenação neuromuscular
(Lucas; Raikhel, 2013).

8. Regulação do tempo de vida e envelhecimento

A ação dos microRNAs também é essencial para a determinação do tempo de vida,
estando envolvidos com o complexo e ainda pouco compreendido processo de envelhecimento.
Estudos com Drosophila têm evidenciado a participação dos microRNAs na modulação da
resposta de dano ao DNA, homeostase de proteínas, metabolismo mitocondrial e via da
insulina, fatores-chave relacionados ao envelhecimento. Em Drosophila, os microRNAs miR-
8, miR-14 e miR-278 contribuem para a homeostase energética, regulando a sinalização da
insulina e o metabolismo de gorduras (revisado por Asgari, 2013; Lucas; Raikhel, 2013).
Uma queda no metabolismo de gorduras e na expressão da via da insulina são fatores
responsáveis pela extensão do tempo de vida, observado por diferentes autores em muitos
organismos estudados como C. elegans, Mus musculus e Drosophila (Partridge et al., 2005;
Alic et al., 2011; Conn; Qian, 2013).
O miR-14, altamente conservado em insetos, tem como alvos os receptores de
ecdisteroides (EcR) (Smibert; Lai, 2008), tendo, portanto, um papel sobre a via de sinalização
de 20E. Mutações no miR-14 encurtam o tempo de vida de moscas (Lucas; Raikhel, 2013).
O miR-14 também desempenha um papel sobre o metabolismo, regulando a produção de
insulina no cérebro de Drosophila (Lucas; Raikhel, 2013). Em operárias de abelhas A. mellifera,

MicroRNAs em insetos 155

 o silenciamento de EcR em adultos faratos perturbou a expressão de 70 microRNAs, dentre
eles: let-7, miR-1, miR-9a, miR-14, miR-34, miR-100, miR-125, miR-133, miR-184 e miR-306
(Mello et al., 2014).
Ainda em Drosophila, sabe-se que a deleção de miR-125 encurta o tempo de vida,
enquanto sua superexpressão promove a longevidade (Garbuzov; Tatar, 2010) e a deleção
de miR-282 promove redução no tempo de vida enquanto superexpressão causa letalidade
no estágio larval (Vilmos et al., 2013).

9. Regulação do sistema imune

Em animais, de forma geral, a regulação bem coordenada do sistema imune é essencial
para a manutenção da homeostase, bem como para evitar a ativação de respostas de defesa
em momentos desnecessários. Em insetos não é diferente, e a participação dos microRNAs
é fundamental também nesse processo.
O sistema imune inato é a principal forma de defesa dos insetos contra vírus, bactérias
e fungos e os peptídeos antimicrobianos formam a primeira linha de combate na proteção
contra esses microrganismos (Ferrandon et al., 2007). Choi e Hyun (2012) demonstraram que
o miR-8 regula os níveis de expressão desses peptídeos em corpo gorduroso de Drosophila,
como Drosomicina e Dipteromicina, cujos níveis aumentam na ausência desse microRNA
mesmo em condições em que não há infecções.
Como revisado por Asgari (2013), em Drosophila, miR-8 também inibe a expressão
do peptídeo antimicrobiano Gram-negative binding protein 3, que ativa a via de Toll, em
condições de ausência de infecções. A atuação de miR-8 é, portanto, essencial para evitar
um gasto energético desnecessário na ativação do sistema imune em condições de ausência
de microrganismos infectantes. Etebari e Asgari (2013) mostraram ainda que, na mariposa
Plutella xylostella, o miR-8 promove um aumento na expressão do inibidor de serino-protease
Serpin 27, um regulador da via de Toll participante na resposta imune. A queda nos níveis
de miR-8 e de Serpin 27 durante uma infecção causam um aumento da via de Toll, o que
promove a ativação de cascatas de proteólise, importantes no combate a microrganismos
(Etebari; Asgari, 2013). O microRNA let-7 também desempenha atividades sobre o sistema
imune. Quando ocorre a ativação da resposta imunológica, let-7 atua inibindo a expressão
dos peptídeos antimicrobianos – isso ocorre até que a infecção atinja um limiar e a presença
desses peptídeos se torne importante (revisado por Asgari, 2013).
Descobriu-se recentemente que os vírus são capazes de alterar o sistema de defesa de
seu hospedeiro utilizando-o a favor da replicação viral por meio dos microRNAs (revisado
por Asgari, 2013). Os ascovírus são vírus de DNA dupla fita que infectam mariposas da
família Noctuidae, tendo efeito letal sobre as larvas. O primeiro microRNA produzido por
um vírus parasita de insetos a ser identificado foi o HvAV-miR-1 expresso por um ascovírus:
esse microRNA atua sobre o transcrito da Polimerase I viral, regulando a replicação do
ascovírus (revisado por Asgari, 2013).
Outro caso conhecido é o de B. mori, que é parasitada por um nucleopoliedrovírus,
o BmNPV. O microRNA bmnpv-miR-1, codificado pelo vírus, tem a interessante habilidade
de reprimir a atividade de uma proteína Ran ligadora de GTP (GTP-binding nuclear protein
Ran) da mariposa. Uma vez que essa proteína está envolvida no transporte dos microRNAs
endógenos do núcleo para o citoplasma, os pré-miRNAs produzidos pela mariposa ficam

156 Introdução ao mundo dos microRNAs

retidos no núcleo. Ou seja, um microRNA produzido pelo vírus impede a mariposa infestada
de completar a biogênese de seus próprios microRNAs, como o bmo-miR-8, produzido pela
mariposa e atuante no combate a replicação viral (revisado por Asgari, 2013).
Utilizando estratégias de bioinformática, 73 microRNAs de Drosophila foram
considerados como potenciais atores de respostas imunes (Fullaondo; Lee, 2012). Dentre
eles, destacamos microRNAs bem conhecidos e ligados a outras funções, tais como: bantam,
miR-2, let-7, miR-1, miR-9a, miR-14, miR-34, miR-92b, miR-124, miR-184, miR-210, miR-263a,
miR-276, miR-279, miR-306.

10. Regulação da relação inseto vetor-parasita

Os insetos são transmissores de inúmeros patógenos para plantas e animais, muitos
dos quais oferecem riscos para a agricultura e saúde animal, incluindo a humana. Embora,
ainda pouco compreendido, há um consenso de que o estudo do sistema imunológico dos
insetos é fundamental para o desenvolvimento de medidas de contenção de pragas agrícolas
e doenças infecciosas (revisado por Asgari, 2013).
Dentre os papéis desempenhados pelos microRNAs no sistema imune dos insetos
podemos ressaltar a regulação das interações entre o inseto hospedeiro e o parasita (revisado
por Asgari, 2013). O mosquito Aedes aegypti é o principal transmissor da dengue e da febre
amarela, doenças que juntas matam mais de 24 mil pessoas todos os anos (Clemons et al., 2010).
Em mosquitos hematófagos como o A. aegypti, a alimentação com sangue ocasiona uma grande
mudança no padrão de expressão gênica, o que inclui alterações nos perfis de expressão de
microRNAs, alguns dos quais exclusivos desse grupo de insetos (Li et al., 2009). O microRNA
miR-375, por exemplo, mostra-se induzido após alimentação com sangue, a ativação desse
elemento resulta no aumento nos níveis transcricionais do gene cactus (Hussain et al., 2013). A
ativação de cactus
antimicrobianos. Isso significa que a alimentação com sangue promove uma inibição da
resposta imunológica, tornando esses insetos mais propensos a infecções, como pelo vírus
da dengue, como comprovado por Hussain e colaboradores (2013).
Estudos como o de Hussain e colaboradores (2013) adicionam novas informações
para o entendimento da relação vetor-patógeno, importante para se desenvolver estratégias
que permitam o combate de doenças como a dengue.

11. Efeito sobre variações fenotípicas populacionais

Arif e colaboradores (2013) demonstraram pela primeira vez que variações na
expressão de um microRNA são responsáveis por alterações fenotípicas entre populações.
Seus estudos em Drosophila mostraram que miR-92a regula a expressão de shavenoid, gene
que controla o desenvolvimento de tricomas nas pernas, apêndices epidérmicos semelhantes
aos pelos de mamíferos na sua morfologia e função. Os diferentes padrões de expressão
desse microRNA são responsáveis por criar diferentes padrões de tricomas no fêmur do
segundo par de pernas, gerando variações fenotípicas entre D. simulans e D. melanogaster
e mesmo entre subpopulações de D. melanogaster (Arif et al., 2013).

MicroRNAs em insetos 157

 12. Regulação do dimorfismo sexual e comportamento reprodutivo
A barata Eupolyphaga sinensis possui um marcado dimorfismo sexual: as fêmeas
apresentam um tamanho corporal maior que os machos nas fases larvais, mas sobretudo
quando adultas, possuindo de 9 a 11 instares larvais, enquanto os machos, apenas 7; as fêmeas
adultas são totalmente desprovidas de asas, os machos possuem asas anteriores (Wu et al., 2013).
Wu e colaboradores (2013) identificaram 45 microRNAs diferencialmente expressos em E.
sinensis, dos quais 36 estavam reprimidos e 9 ativos na comparação macho-fêmea. O miR-14
foi encontrado ativo em machos em relação às fêmeas – animais que geralmente possuem
uma redução nesse microRNA têm menor tempo de vida e maior sensibilidade ao estresse;
KC-esi-bantam, ortólogo ao bantam de Drosophila, mostrou-se muito mais abundante em
fêmeas, o que também é interessante, uma vez que indivíduos que portam defeitos nesse
microRNA possuem tamanho reduzido; miR-315 juntamente com miR-8 e miR-9a têm uma
importante função no desenvolvimento de asas em Drosophila e não surpreendentemente
miR-315 e miR-8 mostraram elevados perfis de expressão em machos (Wu et al., 2013). Esses
microRNAs são apontados como possíveis candidatos a reguladores do dimorfismo sexual
nesse inseto hemimetábolo (Wu et al., 2013).
Com a disponibilidade das sequências do genoma do pulgão-da-ervilha Acyrthosiphon
pisum, o papel dos microRNAs tornou-se evidente até mesmo no estabelecimento das diferentes
estratégias sexuais adotadas por esse organismo. Nele foram identificados 149 microRNAs,
dos quais 55 são conservados filogeneticamente e 94 são exclusivos do grupo. Desses, cinco
mostram-se diferencialmente expressos quando os afídeos adotam estratégias partenogenéticas
em comparação a reprodução sexual: miR-34, miR-X47, miR-X103, miR-307 e miR-X52. Embora
sua função não esteja muito bem estabelecida, é evidente sua participação na regulação das
diferentes estratégias reprodutivas adotadas (Lucas; Raikhel, 2013).

13. Regulação do comportamento social

A plasticidade fenotípica é outra característica marcante da classe Insecta. Muitos
grupos possuem a habilidade de alterar sua morfologia e fisiologia em resposta a diferentes
condições ambientais como temperatura e disponibilidade de alimento (revisado por Asgari,
2013). Em alguns insetos, a plasticidade do fenótipo estende-se até mesmo ao comportamento
social.
A abelha A. mellifera é reconhecidamente o principal modelo biológico para estudar
os mecanismos e a evolução do comportamento social. Esse organismo possui uma divisão
do trabalho que se altera de acordo com a idade e se relaciona a diferentes tarefas ligadas
à alimentação. Nas primeiras duas semanas de vida, as abelhas operárias desenvolvem
tarefas dentro da colmeia, como construção de favos e alimentação da cria, essas operárias
apresentam elevados níveis de proteína vitelogenina e títulos basais de HJ. Por volta da
terceira semana de vida esses organismos iniciam uma transição social de comportamento,
começando as atividades de forrageamento: busca por pólen, resinas, água e néctar, os títulos
de HJ sobem e os níveis de vitelogenina caem drasticamente (Winston, 1993).
Assim como em inúmeros aspectos da vida, os microRNAs também desempenham
importantes papéis no comportamento social e uma análise do cérebro de abelhas jovens
que desempenham tarefas de alimentar as larvas em comparação com cérebros de abelhas
que forrageiam identificou 9 microRNAs diferencialmente expressos, além de 67 novos

158 Introdução ao mundo dos microRNAs

microRNAs em A. mellifera (Liu et al., 2012b). Os microRNAs miR-31a, let-7, miR-279 e miR-
275 estavam ativados no cérebro das abelhas jovens em comparação com as forrageiras,
enquanto miR-13b, miR-133, miR-210, miR-278 e miR-92a estavam ativados em cérebros de
forrageiras, se comparados a cérebros de abelhas jovens (Liu et al., 2012b).
Nunes e colaboradores (2013) mostraram que o silenciamento de vitelogenina em
abelhas forrageiras promove alterações nos perfis de microRNAs do cérebro e corpo gorduroso.
As abelhas que sofreram o silenciamento de vitelogenina por RNAi apresentaram aumento
na expressão de microRNAs que têm como alvo transcritos de enzimas que degradam
hormônio juvenil, como HJ esterase e HJ epóxido hidrolase (Nunes et al., 2013). Ou seja,
o silenciamento de vitelogenina culmina na ativação de microRNAs que, provavelmente,
promovem o aumento dos títulos de HJ.
Um estudo de Li e colaboradores (2012) demonstrou o envolvimento dos microRNAs
na regulação da dança do requebrado em forrageiras de A. mellifera. A dança do requebrado
promove o recrutamento de mais forrageiras para uma fonte de alimentos, fornecendo
informações sobre a direção e a distância dessa fonte (Winston, 1993). Comparando-se os
perfis de expressão de microRNAs em forrageiras que executam a dança contra forrageiras
que ainda não tiveram a chance de fazê-lo, Li e colaboradores (2012) notaram que miR-
278 e miR-282 mostraram-se inibidos nas abelhas dançarinas. Esses microRNAs regulam
alvos relacionados a atividade de cinases, funções neurais e metabolismo energético que,
portanto, estavam mais expressos nas abelhas dançarinas do que nas demais forrageiras (Li
et al., 2012). Embora ainda mais estudos sejam necessários, todos esses trabalhos demonstram
a importância dessas moléculas reguladoras para a transição e comportamento social em
A. mellifera, além de acrescentar mais informações quanto a abundância de microRNAs
nesse organismo (Liu et al., 2012b).

14. MicroRNAs na alimentação larval e na determinação de castas

A geleia real é uma substância produzida nas glândulas mandibulares e hipofaringeanas
de operárias jovens de abelhas do gênero Apis e oferecida como alimento para as larvas em
desenvolvimento. Shi e colaboradores (2012) demonstraram que a geleia real de duas espécies,
A. mellifera e A. cerana, possuem microRNAs, mas com repertório e nível de expressão bem
distintos. A geleia real de A. mellifera é mais rica que a de A. cerana tanto em relação ao
número de famílias de microRNAs presentes quanto à abundância, sendo os mais expressos:
bantam, miR-184, miR-14 e miR-252. Esse estudo destaca ainda que alguns microRNAs
encontrados na geleia real (como let-7, miR-34, miR-375) também foram detectados no leite
materno humano.
Guo e colaboradores (2013) compararam o conteúdo de microRNAs entre a geleia real
e a geleia de operárias, componentes alimentares que disparam os processos de determinação
e diferenciação das castas fêmeas (rainhas e operárias) em A. mellifera. A geleia real é única
fonte de alimento oferecida às larvas que desenvolvem-se em rainhas, enquanto a geleia
de operárias (uma mistura de geleia real acrescida de mel e pólen) é o alimento oferecido
apenas para as larvas que desenvolvem-se em operárias. Os dados de sequenciamento
mostraram que a geleia de operárias é mais complexa do que a geleia real em termos de
tipos de microRNAs e suas concentrações. Em particular, o estudo aponta que o miR-184 é
mais expresso em larvas de operárias do que em larvas de rainhas. A expressão diferencial

MicroRNAs em insetos 159

 de miR-184 na fase larval influencia o desenvolvimento de caracteres morfológicos, tais
como o comprimento do corpo e da probóscide, a morfologia das asas e o peso ao nascer,
os quais se diferem quando se comparam as castas na fase adulta.

15. Considerações finais

O avanço nas técnicas de sequenciamento e o número cada vez maior de insetos com
genomas sequenciados têm revelado a importância desempenhada pelos microRNAs na
biologia desses organismos e para as pesquisas de Entomologia. Os microRNAs fornecem
informações para o desenvolvimento de novas estratégias genéticas no combate a pragas
agrícolas e vetores de doenças (Lucas; Raikhel, 2013). D. melanogaster, A. aegypti e B. mori
apresentam respectivamente 466, 124 e 563 microRNAs maduros descritos até o momento,
dos quais a maioria possui uma função ainda indeterminada (Lucas; Raikhel, 2013). Se
consideramos o número de espécies e a diversidade dos insetos, concluímos que pouco se
conhece sobre esses reguladores nos Hexapoda. Isso serve de estímulo para que pesquisadores
continuem em seus esforços para determinar as funções (Dai et al., 2012) de microRNAs com
sequências conhecidas e para descobrirem novos microRNAs, a fim de desvendar o papel
dessas moléculas na ontogenia, ecologia e evolução dos insetos.

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MicroRNAs em insetos 163
miRNAs na Capítulo
fisiologia humana 9

Dr. Cesar Seigi Fuziwara, Prof.a Dr.a Carolina Beltrame Del Debbio e
Prof.a Dr.a Edna Teruko Kimura
Depto. de Biologia Celular e do Desenvolvimento
Instituto de Ciências Biomédicas – Universidade de São Paulo

Estruturação do capítulo
1. Introdução
2. MicroRNAs na fisiologia humana – visão geral
3. Tecido Muscular Cardíaco e Esquelético
3.1 Coração
3.2 Músculo esquelético
4. Cérebro: Desenvolvimento e plasticidade sináptica
5. Conclusões

miRNAs na fisiologia humana 165

 1. Introdução
Os miRNAs (miRNAs) participam da regulação dos níveis proteicos da célula, controlam
ativamente a homeostase, com grande implicação no desenvolvimento embrionário,
proliferação, diferenciação e metabolismo celular. No homem, o primeiro miRNA – let7 –
foi identificado em 2000 (Pasquinelli et al., 2000) e, atualmente, mais de 2.500 sequências
maduras de miRNA foram caracterizadas no genoma humano (miRbase v21 – www.mirbase.
org/) (tabela 1).

Tabela 1. Número de sequências de miRNAs depositadas no banco de dados miRBase v21 (www.mirbase.org).

Espécie Precursor (pre-miR) Maduro (miR)

Homo sapiens 1.881 2.588
Rattus norvegicus 495 765
Mus musculus 1.193 1.915
Drosophila melanogaster 256 466
Caenorhabditis elegans 250 434
Arabidopsis thaliana 325 427

Em algumas espécies, o número de genes de miRNA corresponde a 1-2% do número

de genes codificadores de proteínas (Bartel, 2009) e no genoma eles apresentam diferentes
classes de organização estrutural. Podem estar localizados no contexto das unidades de
transcrição não-codificante ou alojados dentro de genes que codificam para proteínas. Em
células de mamíferos, mais de 70% dos miRNAs estão localizados dentro de íntrons de genes
codificadores de proteínas, regulados pelo promotor do gene hospedeiro; ou, ainda, sobrepondo-
se ao gene codificador de proteína, pela transcrição na direção antissenso, utilizando um
promotor distinto (Brennecke; Cohen, 2003; Rodriguez et al., 2004). Curiosamente, muitos
genes de miRNA (cerca de 30%, em humanos – Chiang et al., 2010) apresentam-se em arranjos
policistrônicos, onde vários miRNAs maduros são gerados (cluster de miRNAs) a partir de um
único transcrito primário. O catálogo do genoma humano realizado pelo extensivo estudo
do Projeto ENCODE (Encyclopedia of DNA Elements, www.encodeproject.org) indica que
cerca de 70% do genoma humano apresenta sítios que geram transcritos codificadores e
não-codificadores de proteínas e que aproximadamente 6% desses segmentos se identificam
como pequenos RNAs (Djebali et al., 2012).
Uma população de miRNAs poderá ser direcionada para fora da célula. Estes miRNAs
são secretados envolvidos em vesículas (microvesículas ou exossomos) ou ligados a proteína
Argonauta2, atuando nas células circunvizinhas ou atuando em células distantes via secreção
na circulação.
Em mamíferos, inclusive o homem, a repressão da expressão gênica ocorre pelo
pareamento imperfeito do miRNA com a 3’ UTR de seus mRNAs-alvo, modulando os níveis
proteicos (Bartel, 2009). O controle pós-transcricional de miRNAs em mamíferos ocorre
predominantemente pela desestabilização do mRNA-alvo (mais de 80%) e, em pequena
proporção, devido à repressão da tradução (Guo et al., 2010). Estima-se que mais da metade de
todos os mRNAs codificados no genoma humano são alvos de miRNAs (Friedman et al., 2009).
Muitos miRNAs constituem “famílias de miRNAs” por compartilharem a mesma
sequência seed. (Nota: Há dois conceitos para “família de miRNAs”, um baseado em regras
de nomenclatura e outro baseado simplesmente no compartilhamento da mesma sequência

166 Introdução ao mundo dos microRNAs

seed. Aqui nos referimos ao segundo.) A análise computacional indica que uma família de
miRNAs regula mais de 300 diferentes mRNAs-alvo, e cerca de 50% dos mRNAs-alvo têm
sítios de complementariedade com múltiplos miRNAs (Brennecke; Cohen, 2003; Grimson
et al., 2007).
A presença de miRNAs no sistema adiciona uma substancial complexidade no controle
das redes moleculares de uma grande variedade de processos biológicos. O impacto de um
miRNA na expressão do gene-alvo correlaciona-se com a quantidade de moléculas de miRNA
maduro; os hepatócitos, por exemplo, apresentam altas concentrações – 50 mil moléculas
de miR por célula (Krutzfeldt et al., 2005).

2. MiRNAs na fisiologia humana – visão geral

Estudos de perfil de expressão de miRNAs em diversos orgãos e tecidos humanos
mostram uma “assinatura de miRNA” que identifica um tecido pela padrão de expressão
dos miRNAs (Lagos-Quintana et al., 2002; Landgraf et al., 2007; Marini et al., 2011; Poy
et al., 2004; Rao et al., 2006) (figura 1). Observa-se uma predominância específica de miRNAs
em alguns tecidos, como o miR-122 no fígado (70%) e o miR-1 no coração (cerca de 30%) e
músculo (figura 2). Além disso, quando se compara a expressão dos miRNAs entre diferentes
tecidos, alguns podem ser considerados “tecido-específicos”, i.e., quando apresentam níveis
20 vezes acima dos níveis de outros tecidos, como o miR-124 no cérebro e miR-1, miR133 e
miR-206 no músculo.
O entendimento do papel de cada miRNA nos tecidos, considerando a complexa rede
de interação miRNA:mRNA, está apenas começando. Aspectos que dificultam a análise de
função de determinado miRNA nas células ou tecidos decorrem do fato de que a manipulação

Figura 1. Expressão de miRNAs em diferentes tecidos humanos. São indicados alguns miRNAs altamente expressos
no cérebro, coração, fígado, músculo, pâncreas e tiroide. Fonte: Imagem construída a partir de ilustração do Creative
Commons.

miRNAs na fisiologia humana 167

 de um único miRNA pode não ter um efeito drástico porque existem “famílias de miRNAs”
cujos membros contêm a mesma sequência seed, portanto esses membros podem se sobrepor
funcionalmente (Bartel, 2009). Além disso, grande parte dos mRNAs contém dois ou mais
sítios de ligação para diferentes miRNAs que podem sinergizar ou antagonizar a expressão
de mRNAs-alvo.
Os modelos de “adição/superexpressão” ou “remoção/subexpressão” de um determinado
miRNA em linhagem celular e modelos animais, apesar das limitações acima descritas, têm
adicionado informações valiosas que podem ser extrapoladas para a fisiologia humana.
Os miRNAs têm sido associados a várias vias metabólicas, inclusive metabolismo do
colesterol e metabolismo de glicose. O miR-122, um miRNA fígado-específico e altamente
expresso (Tang et al., 2011), quando deletado em modelo animal promove uma redução
do colesterol sérico e de triglicérides. Da mesma forma, a utilização de antagomir (um
RNA antissenso inibidor) de miR-122 em ratos levou à diminuição de colesterol (Krutzfeldt
et al., 2005). O efeito sobre o colesterol no soro é devido, em parte, a uma redução da expressão
de enzima de biossíntese do colesterol em hepatócitos.
Várias famílias de miRNAs estão envolvidas no metabolismo da glicose. O miR-375 é
altamente expresso nas células da ilhota pancreática e controla negativamente a secreção de
insulina em células beta (Poy et al., 2004). O miR-375 tem como alvo o mRNA de miotrofina
(gene Mtpn) e inibe a expressão de miotrofina, uma proteína citoplasmática que induz a
exocitose de grânulos de insulina. Além disso, miR-124 e let-7b, miRNAs altamente expressos nas
ilhotas, atuam em conjunto com miR-375 no controle da expressão da miotrofina, mostrando
um exemplo de atuação convergente de vários miRNAs na tradução de uma única proteína
(Krek et al., 2005). Os miRNAs da família let-7, quando superexpressos em animal transgênico,
induzem uma redução na tolerância à glicose, e nestes animais quando se inibe a biogênese
de let-7 há uma melhora na captação de glicose (Zhu et al., 2011).
Notavelmente, nem sempre a disrupção de um gene de miRNA altamente expresso
nos tecidos adultos produz fenótipos deletérios na organogênese (Olive et al., 2015). Por

Figura 2. MicroRNAs predominantes em diferentes tecidos e orgãos no homem (Lagos-Quintana et al., 2002;
Landgraf et al., 2007; Rao et al., 2006).

168 Introdução ao mundo dos microRNAs

exemplo, apesar de o miR-208 ser específico do coração, o modelo animal com disrupção
desse gene desenvolve o orgão. Os efeitos deletérios da falta de miR-208 se refletem na
manutenção do estado de diferenciação celular, trofismo e defeito na resposta ao stress.
Deleções de miR-146 e de miR-122 também geram animais com intolerância ao stress (Tsai
et al., 2012; Zhao et al., 2013).
Os sistemas biológicos usam uma variedade de mecanismos para manter as suas
funções frente a perturbações ambientais e genéticas. Evidências crescentes indicam que
os miRNAs conferem robustez ao sistema biológico, auxiliando na correção das flutuações
no número de cópias transcritas (mRNAs) por influências endógenas ligadas a maquinaria
da transcrição ou a estímulos externos (Ebert; Sharp, 2012).
Até o momento, a maioria dos estudos tem focado na interação binária de determinado
miRNA e um único alvo para a definição de fenótipos. Contudo, não podemos ignorar que
cada miRNA exerce sua influência em múltiplos genes-alvo funcionalmente relacionados e
que, em conjunto, constituem uma rede de expressão gênica. Nesse contexto, apresentamos
a influência de miRNAs no músculo, coração e cérebro.

3. Tecido Muscular Cardíaco e Esquelético

O desenvolvimento e a fisiologia dos tecidos musculares cardíaco e esquelético são
modulados pela regulação pós-transcricional exercida pelos miRNAs. Estudos recentes têm
mostrado a participação dos miRNAs no processo de miogênese, crescimento muscular
embrionário, função cardíaca e hipertrofia. Os músculos cardíaco e esquelético apresentam
expressão enriquecida de determinados miRNAs denominados myomiRs, cuja expressão
está sob controle de fatores regulatórios miogênicos (do inglês MRF) como MyoD, Miogenina,
Myf5, Mf2, MRF4 e SRF (Rao et al., 2006; Zhao et al., 2005). Os myomiRs miR-1 e miR-133 são
expressos no coração e músculo esquelético, enquanto miR-208a é exclusivo do coração e miR-
206 exclusivo do músculo esquelético (Chen et al., 2006; Kim et al., 2006; van Rooij et al., 2007).

3.1 Coração
Os miRNAs regulam o correto desenvolvimento e a correta função do coração. Esse
fato foi constatado por um estudo em que a deleção do gene da Dicer em camundongo
genéticamente modificado resultou em cardiomiopatia dilatada progressiva, falência cardíaca
e morte pós-natal. Nesses animais observa-se a perda da expressão de proteínas contráteis
e severo desarranjo sarcomérico (Chen et al., 2008).
Um estudo de sequenciamento em larga escala no coração adulto de camundongos
mostrou que os 20 miRNAs mais expressos correspondem a mais de 90% dos transcritos de
miRNAs detectados nesse tecido (Rao et al., 2009). Dentre esses miRNAs destaca-se a alta
expressão de miR-1, que corresponde a 40-45% dos transcritos de miRNAs (Lagos-Quintana
et al., 2002; Rao et al., 2009).
miR-1 é transcrito a partir de dois genes, miR-1-1 e miR-1-2, localizados em cromossomos
diferentes, cuja expressão é influenciada pelos fatores de transcrição SRF, MyoD e Mef2 (Zhao
et al., 2005). O enriquecimento da expressão de miR-1 no coração adulto indica que esse miRNA
atua de maneira central na manutenção da função cardíaca. A desregulação na expressão
de miR-1 resulta em importantes defeitos no desenvolvimento e na função cardiovascular.
De fato, camundongos knockout para o gene de miR-1-2 apresentam múltiplos defeitos na

miRNAs na fisiologia humana 169

 função cardíaca, como interferência na morfogênese, que resulta em letalidade de 50% até a
amamentação, além de defeito na septação ventricular, disfunção ventricular, anormalidades
na condução elétrica e controle do ciclo celular (Zhao et al., 2007). Além disto, o aumento
de expressão de miR-1 no coração em desenvolvimento resulta em proliferação defeituosa
de miócitos ventriculares (Zhao et al., 2005). Um dos alvos validados de miR-1 é Hand2, um
fator transcricional essencial para o desenvolvimento cardíaco cuja expressão encontra-se
aumentada no coração de animais knockout para miR-1 (Zhao et al., 2007) e reduzida no
coração de animais com superexpressão desse miRNA (Zhao et al., 2005), indicando que
a regulação exercida por miR-1 sobre seus alvos, como Hand2, é essencial para o correto
desenvolvimento do coração.

3.1.1 Remodelamento cardíaco

O coração apresenta um crescimento hipertrófico em resposta a diversos estímulos de
estresse e hipotireoidismo, como resultado da modulação dos níveis de proteínas contráteis
da cadeia pesada da miosina (genes MYH). Nesse processo ocorrem a perda de expressão da
MYH6), a principal isoforma de miosina expressa no coração
MYH7). O
miR-208a está localizado no íntron 29 de Myh6, sendo expresso em altos níveis no coração
(van Rooij et al., 2007), enquanto que miR-208b está localizado no íntron 31 de Myh7.
A disrupção do gene de miR-208a (knockout) em camundongos resulta em animais
viáveis mas que apresentam perda contínua da contratilidade cardíaca desde idade jovem
até idade avançada. Além disso, a hipertrofia induzida por estímulos clássicos, como o
aumento de pressão cardíaca e a ativação da via de calcineurina, não ocorre nesses animais,

(van Rooij et al., 2007). Por outro lado, a expressão exógena de miR-208a no coração induz a
hipertrofia cardíaca em camundongos (Callis et al., 2009). Esse efeito é atribuído à redução
dos níveis proteicos de Thrap1, um componente do complexo receptor nuclear do hormônio

Rooij et al., 2007). Cabe ressaltar ainda que o nocauteamento de miR-208a leva à perda de
expressão de outro miRNA, miR-499, localizado no íntron do gene Myh7b (van Rooij et al., 2009),
e que também influencia no remodelamento cardíaco. A reposição de miR-499 nos animais
knockout
em animais hipotiroidianos, indicando que miR-499 é um mediador a jusante de miR-208a.
Outro miRNA associado ao remodelamento cardíaco é miR-195 que encontra-se
aumentado durante o processo de hipertrofia cardíaca em humanos e camundongos. O
aumento de miR-195 in vitro resulta em crescimento hipertrófico de cardiomiócitos, observado
pela organização da actinina no citoplasma. Esse processo também é observado in vivo
quando miR-195 é expresso especificamente no coração de camundongos e induz hipertrofia
em animais com poucas semanas de vida, e que progride para cardiomiopatia dilatada e
falência cardíaca em animais jovens (van Rooij et al., 2006).

3.2 Músculo esquelético

Assim como no coração, o tecido muscular esquelético apresenta enriquecimento
na expressão de diferentes myomiRs. A expressão conjunta de miR-1, miR-133a, miR-133b e
miR-206 corresponde a quase 25% de toda a expressão de miRNAs no músculo esquelético

170 Introdução ao mundo dos microRNAs

(McCarthy, 2008). Dentre esses miRNAs, miR-206 apresenta expressão exclusiva no músculo
esquelético (Kim et al., 2006).
miR-206 e miR-1 agrupam-se em uma mesma família uma vez que a sequência
de miR-206 apresenta 86% de identidade com a sequência de miR-1, sendo a região seed
idêntica entre esses miRNAs. Apesar desse fato, a função de miR-206 no músculo esquelético
parece ser específica. De fato, a expressão de miR-206 em mioblastos induz a diferenciação
muscular esquelética através da expressão de MHC, do fator de transcrição miogenina e da
multinucleação celular (Kim et al., 2006).
Por sua vez, miR-1 encontra-se altamente expresso no tecido muscular esquelético
(Zhao et al., 2005), sendo que seus dois genes de miR-1-1 e miR-1-2 encontram-se localizados
em cluster com os genes de miR-133a-2 e miR-133a-1, respectivamente (Chen et al., 2006).
Apesar da localização genômica em cluster, miR-1 e miR-133 exercem papéis distintos
na célula muscular esquelética. Enquanto miR-1 estimula a diferenciação celular, miR-133
induz a proliferação celular (Chen et al., 2006). A superexpressão de miR-1 acelera a miogênese
observada através do aumento de miogenina e MHC, e outros marcadores como MyoD,

et al., 2006). Por outro lado, a superexpressão de miR-133 inibe a expressão de miogenina

e MHC enquanto promove a proliferação do mioblasto.
miR-208b e miR-499 também são expressos no músculo esquelético, influenciando a
conversão de miofibras rápidas em lentas no músculo esquelético ao regular a expressão de

Nesse estudo, o duplo knockout de miR-208b e miR-499 resulta em animais que perdem
substancialmente miofibras do tipo I, observado no músculo sóleo, além de se observar

esquelético rápido em camundongos MCK-miR-499 causa a conversão das miofibras rápidas

em lentas no músculo sóleo de animais transgênicos (van Rooij et al., 2009), o que se reflete
em melhoramento de resistência (endurance), uma vez que esses animais correm 50% mais
do que animais selvagens quando desafiados em exercício de esteira.

4. Cérebro: Desenvolvimento e plasticidade sináptica

Os miRNAs são encontrados de forma particularmente abundante no tecido nervoso e
participam de diversas funções regulatórias, abrangendo desde o desenvolvimento neuronal
até a regulação de sua função. Até o momento, os dados indicam que a participação dos
miRNAs no desenvolvimento do cérebro não é voltada para a decisão do destino celular
(cell-fate) das células progenitoras neurais em neurônios, mas sim essencial para o seu
desenvolvimento apropriado e funcionamento adequado da célula nervosa madura (De
Pietri Tonelli et al., 2008).
A deleção condicional da Dicer em embriões de animais causa massiva hipotrofia do
córtex pós-natal, gerando fenótipos anormais nos neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo
(Kim et al., 2007), nas células de Purkinje do cerebelo (Schaefer et al., 2007), neurônios do
telencéfalo (Makeyev et al., 2007), neurônios excitatórios do córtex e hipocampo (Davis
et al., 2008) e nos progenitores neurais olfatórios (Choi et al., 2008), porém nenhum efeito
foi observado nas células neuroepiteliais adjacentes. Além disso, observou-se a morte de

miRNAs na fisiologia humana 171

 progenitores neurais, indicando que os miRNAs participam do desenvolvimento do sistema
nervoso desde estágios bem precoces desse desenvolvimento.
miR-124 é considerado um dos miRNAs específicos do sistema nervoso central e
apresenta funções bem conservadas no desenvolvimento neuronal de espécies que abrangem de
C. elegans a humanos (Darnell et al., 2006; Deo et al., 2006; Kloosterman et al., 2006; Krichevsky
et al., 2006; Lagos-Quintana et al., 2001; Sempere et al., 2004). Esse miRNA é responsável
por suprimir a expressão de transcritos não relacionados com a diferenciação neural (Lim
et al., 2005), tendo como alvo mais de 100 transcritos diferentes. Dessa forma, células não
neurais expostas ao miR-124 passam a emitir prolongamentos neurais conhecidos como neuritos
(Yu et al., 2008). miR-124 também estimula a proliferação de precursores neurais, assim como
promove sua diferenciação em neurônios. Os mecanismos moleculares pelos quais o miR-124
atua envolvem: (i) interação com a proteína de união de trato de polipirimidina (PTBP1), uma
proteína ligante de mRNA que influencia o processamento de pré-mRNA, assim como seu
metabolismo e transporte (Makeyev et al., 2007); (ii) ligação e inibição do Fator Silenciador
Neuronal Restritivo (NRSF/REST), um gene que atua como repressor transcricional de genes
neurais (Visvanathan et al., 2007); (iii) regulação de ATPases que atuam no complexo de Fatores
Associados ao Brg/Brm (BAF), responsável pelo remodelamento da cromatina relacionada
aos fatores específicos neurais (Yoo et al., 2009); (iv) subexpressão (down-regulation) de
Sox9, um fator inibidor de neurogênese (Cheng et al., 2009); e (v) modulação da expressão

as células-tronco neurais e membrana basal (Cao et al., 2007).

Além de controlarem a diferenciação neural, os miRNAs também podem controlar a
excitabilidade de neurônios adultos. O receptor de glutamato N-metil-D-aspartato (NMDA)
pode ser ativado, em parte, pelo aumento dos níveis de miR-219 (Kocerha et al., 2009). Em
conjunto com miR-132, miR-219 também pode alterar a responsividade neuronal ao potássio,
ao glutamato e ao NMDA. Os mecanismos envolvidos na excitabilidade neural onde os
miRNAs atuam também incluem o controle dos receptores de neurotransmissores no local
da sinapse. Por exemplo, miR-1 é responsável por diminuir a expressão dos receptores
nicotínicos e colinérgicos, alterando a sensibilidade neural a esses receptores nas junções
neuromusculares (Simon et al., 2008).
Além dos miRNAs atuarem na regulação da morfologia neuronal (Wayman et al., 2008),
diversos miRNAs e os componentes da maquinaria molecular que participam da regulação
mediada por eles [incluindo Dicer, eIF2c (homólogo Argonauta ), Armitage, FMRP (FMR1),
dentre outros] já foram observados nos locais de sinapse e espículas dendríticas (Cougot
et al., 2008; Lugli et al., 2008; Qurashi et al., 2007). Um dos primeiros a serem descritos nos
locais de sinapse foi miR-134, responsável pela repressão do mRNA da quinase da Proteína
Remodeladora de Sinapse (LIMK1). miR-138 também foi detectado em sinapses dendríticas e
é responsável por inibir a enzima APT1, responsável pela palmitoilação de diversas proteínas
da região sináptica (Siegel et al., 2009).
A participação dos miRNAs na regulação sináptica também pode levar a modulação
comportamental. A regulação da síntese proteica no local das espículas dendríticas é
fundamental nos processos de aprendizado e memória e nas alterações severas de cognição
e comportamento, como esquizofrenia, autismo, Síndrome de Tourette e transtorno bipolar,
que podem estar relacionadas a disfunções sinápticas e regulação por miRNAs. Por exemplo,
os transcritos de proteínas envolvidas na Síndrome de Tourette apresentam sítios de ligação
para o miRNA hsa-miR-189 (Abelson et al., 2005; Ozomaro et al., 2013).

172 Introdução ao mundo dos microRNAs

 Além da participação na diferenciação e função neural, diferentes miRNAs também
participam da regulação da diferenciação de células gliais, como os oligodendrócitos, e na
formação da bainha de mielina (Dugas et al., 2010; Zhao et al., 2010).

5. Conclusões
A descoberta dos miRNAs revelou um novo nível de regulação dos sistemas biológicos.
Além dos exemplos de atuação no sistema nervoso e em músculos apresentados neste capítulo,
a influência dos miRNAs na fisiologia humana se estende a diversos órgãos, incluindo fígado,
pâncreas, rins, ovários, placenta, testículos, retina, tecido adiposo, hematopoese e sistema
imune (Arner; Kulyte, 2015; Chiang et al., 2010; Del Debbio et al., 2010; Donadeu et al., 2012;
Latreille et al., 2014; Record, 2014; Ricarte Filho; Kimura, 2006; Sayed; Abdellatif, 2011;
Taganov et al., 2006; Tang et al., 2011).
No genoma humano, o grande número de miRNAs que se expressam num padrão
específico quanto aos tipos e abundância nos tecidos indica uma complexidade e uma alta
peculiaridade da atuação dos miRNAs nos diferentes tipos celulares. Além disso, adiciona-se
ao sistema, a presença de miRNAs circulantes, altamente estáveis e que no homem transitam
no sangue, ligados predominantemente à proteína Argonauta 2, os quais possibilitam a cada
tecido atuar como doador e/ou alvo de miRNAs (Arroyo et al., 2011) (veja mais informações
sobre miRNAs circulantes no capítulo 17. A expressão diferencial de miRNAs no estado
fisiológico e nas patologias tornam essas moléculas altamente promissoras como marcadores
biológicos e até mesmo agentes terapêuticos (Kasinski; Slack, 2011; van Rooij; Olson, 2012). O
antissenso de miR-122 (SPC3649-miravirsen) foi o primeiro a ser utilizado em ensaio clínico
em pacientes com hepatite C (Janssen et al., 2013; Lindow; Kauppinen, 2012). Atualmente estão
em andamento outros ensaios clínicos de miRNA como marcador molecular ou adjuvante
terapêutico em doenças crônicas e câncer (www.clinicaltrails.org).
Os miRNAs, desde a sua identificação e o reconhecimento de seu grande potencial na
função regulatória da expressão gênica, abriram uma nova fronteira no entendimento das
funções biológicas, trazendo avanços importantes na Fisiologia e Medicina – e com muito
ainda a ser explorado no futuro.

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Implicações patológicas Capítulo
da desregulação de 10
microRNAs

Dr.a Danyella B. Dogini, Dr. André S. Vieira, Simoni H. Avansini,

Alexandre H. Berenguer de Matos, Prof.a Dr.a Iscia Lopes-Cendes
Depto. de Genética Médica – Faculdade de Ciências Médicas, UNICAMP – SP

Estruturação do capítulo
1. Introdução
2. MicroRNAs nas doenças neurológicas
2.1 As epilepsias
2.2 A doença de Alzheimer
2.3 A doença de Huntington
3. MicroRNAs e os transtornos psiquiátricos
3.1 A Esquizofrenia
3.2 O Transtorno Afetivo Bipolar
3.3 O Autismo
4. MicroRNAs nas doenças cardiovasculares
5. MicroRNAs e as doenças autoimunes ou inflamatórias crônicas
5.1 O Lúpus Eritematoso Sistêmico
5.2 A Artrite Reumatoide
5.3 As doenças inflamatórias intestinais
6. Considerações finais

Implicações patológicas da desregulação de microRNAs 177

 1. Introdução
Estudos de expressão gênica demonstraram que diferentes células, tecidos e órgãos
dentro de um mesmo organismo possuem diferentes padrões de expressão gênica, embora
tenham o mesmo genoma. Além disso, essas assinaturas de expressão gênica são dinâmicas, ou
seja, são sensíveis a alterações durante o desenvolvimento, na presença de doenças, mudanças
no ambiente e terapia com drogas (Birchler; Veitia, 2007; Eckhardt et al., 2004). Portanto, o
entendimento dos mecanismos de regulação da expressão gênica é um dos desafios da medicina
genômica (Rédei et al., 2006; Jura et al., 2006). A descoberta de que a regulação gênica pode ser
realizada por pequenos RNAs não codificadores, principalmente pelos microRNAs (miRNAs),
constitui um marco importante no campo da biologia molecular moderna.
Nos últimos anos, a descoberta de novos miRNAs manteve-se em um ritmo acelerado
e de acordo com a última versão do banco de dados de miRNAs – miRBase – existem 28.645
entradas, representando hairpins precursores de miRNAs, e 35.828 produtos de miRNA
maduro que englobam 223 espécies (miRBase versão 21; junho de 2014, em http://microrna.
sanger.ac.uk/) (Griffiths-Jones, 2006). O fato de os miRNAs serem conservados entre espécies
enfatiza a importância fisiológica dessas pequenas moléculas e é um indicador da participação
delas em processos biológicos essenciais (Garzon et al., 2009). Estudos in silico predizem que
aproximadamente 60% dos genes podem ser regulados pelos miRNAs (Friedman et al., 2009).
Várias evidências recentes nos mostram que os miRNAs exercem um papel crucial
no desenvolvimento de muitas doenças humanas, podendo ser também marcadores do seu
progresso, prognóstico, diagnóstico e na avaliação da resposta ao tratamento (Blenkiron; Miska,
2007). A maioria das pesquisas sobre miRNAs e doenças humanas tem foco no estudo do papel
dos genes de miRNAs no processo da doença, com muitos estudos utilizando métodos de análise
de expressão dos miRNAs de forma global em amostras clínicas (Mattick; Makunin, 2006).
Uma das primeiras evidências do envolvimento de miRNAs em doenças humanas
veio da área de oncologia. Os miRNAs são conhecidos por seu envolvimento na regulação do
crescimento e diferenciação celular (Carleton et al., 2007; Esquela-Kerscher; Slack, 2006). A
seguir, apresentamos e discutimos vários aspectos da desregulação de miRNAs presentes em
algumas doenças humanas. A tabela 1 lista alguns exemplos de miRNAs cuja desregulação
já foi observada em doenças humanas.

Tabela 1. MicroRNAs cuja expressão foi encontrada alterada em doenças específicas.

Doença
Epilepsia de lobo temporal
Doença de Alzheimer
Doença de Huntington
Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA)
Esquizofrenia
Transtorno Afetivo Bipolar
Síndrome de Tourette
Hipertrofia cardíaca
Miocardite viral
Isquemia cardíaca
Infarto do miocárdio
Lúpus Eritematoso Sistêmico
Artrite Reumatoide
Esclerose Múltipla
MicroRNAs com expressão alterada
miR34a; miR-132; miR-134; miR-146a; miR-184
miR-9; miR-29; miR-107; miR-132-3p; miR-153; miR-339-5p
miR-34b; miR-125b; miR-146a; miR-150
miR-9; miR-206
miR-137; miR-198; miR-206; miR-365; miR-520c
let-7b; let-7c; miR-14; miR-24a; miR-30c; miR-34a; miR-128a;
miR-132; miR-221
miR-189
miR-22; miR-26b; miR-212; miR-312
miR-1; miR-155
miR-1; miR-133; miR-320
miR-1; miR-133a; miR-133b; miR-208
miR-21; miR-146a; miR148a
miR-124a; miR-146; miR-155; miR-246
miR-326

178 Introdução ao mundo dos microRNAs

2. MicroRNAs nas doenças neurológicas

2.1 As epilepsias
As epilepsias formam um grupo de doenças neurológicas crônicas decorrentes de
alterações das funções cerebrais associadas ou não a outras doenças do sistema nervoso, e
atingem de 1,5% a 2% da população geral (Hauser et al., 1996; Borges et al., 2004), o que faz
com que as epilepsias sejam consideradas um problema de saúde pública pela Organização
Mundial de Saúde. A característica comum a todas as síndromes epilépticas é a ocorrência de
crises epilépticas que são causadas por descargas neuronais anormais, as quais ocorrem de
forma passageira, sincrônica e desorganizada, levando às manifestações clínicas dependentes
da região (ou regiões) afetada(s) do sistema nervoso central (SNC) (Beghi, 2009).
McKiernan e colaboradores (2012) detectaram em espécimes saudáveis de hipocampo
humano a expressão de, aproximadamente, 200 miRNAs entre 380 miRNAs analisados.
Esses autores, ao trabalharem com espécimes de pacientes com a epilepsia do lobo temporal
mesial (ELTM), observaram uma diminuição dos miRNAs expressos. Desses, 24% não foram
detectados no tecido epiléptico e 51% apresentaram menor expressão quando comparados
com os controles. Os autores investigaram a possibilidade de uma falha na maquinaria de
maturação dos miRNAs e constataram uma diminuição significativa na expressão da enzima
Dicer, responsável pela formação de miRNAs maduros.
Diversos miRNAs apresentam envolvimento com mecanismos inflamatórios, sendo
o miR-146a o primeiro miRNA associado a inflamação em estudos com epilepsia (Aronica
et al., 2010). Esse miRNA regula a expressão de receptores toll-like (TLRs, sigla do inglês toll-
like receptors). Nível elevado desse miRNA foi encontrado em hipocampo de ratos imaturos
e adultos após status epilepticus e em espécimes de hipocampo de crianças e adultos com
epilepsia do lobo temporal (ELT) (Aronica et al., 2010; Omran et al., 2012). O aumento da
expressão do miR-146a está presente em neurônios e astrócitos, indicando a especificidade
de tipos celulares que produzem esse miRNA (Iyer et al., 2012). Outro miRNA associado a
processos inflamatórios do SNC na ELT é o miR-155. Esse miRNA apresenta um aumento da
expressão no tecido hipocampal de crianças com ELT e, além disso, também foi encontrado
diferencialmente expresso em modelos de ratos imaturos. Pode-se ressaltar que esse aumento

tecido nervoso (Ashhab et al., 2013).

Um dos primeiros miRNAs encontrados diferencialmente expressos no hipocampo de
animais modelos para ELT foi o miR-132 (Nudelman et al., 2010). Esses autores observaram
que a expressão do miR-132 estava aumentada no hipocampo de camundongos oito horas
após a administração de pilocarpina (droga convulsivante – Turski et al., 1983). A expressão
do miR-132 em neurônios é induzida pela atividade elétrica, ação de neurotrofinas e tem
como função a regulação gênica relacionada a plasticidade sináptica (Vo et al., 2005; Wayman
et al., 2008).
No modelo de epilepsia induzida por injeção intra-amígdala de ácido kaínico em
camundongos foi observado um aumento na expressão do miR-134 após status epilepticus.
Esse miRNA é expresso pelos neurônios piramidais em CA3, amígdala, interneurônios no
hilus e neurônios neocorticais nesse modelo animal (Jimenez-Mateos et al., 2012). Esse mesmo
estudo demonstrou que o tratamento de antagomir para esse miRNA específico resultou
em uma significante diminuição da severidade das crises nesse modelo de epilepsia. Além

Implicações patológicas da desregulação de microRNAs 179

 disso, a inibição da expressão do miR-134 foi capaz de reduzir outros eventos associados a
epileptogênese, como perda neuronal, gliose, sprouting e crises recorrentes.
Estudos recentes com animais induzidos por pilocarpina, sensíveis e resistentes à
ação de drogas antiepilépticas encontraram alterações no nível de expressão de quatro
miRNAs (miR-206, miR-374, miR-468 e miR-142-5p). Essas observações foram encontradas
através da comparação do grupo de animais resistentes com o grupo controle e com grupo
sensível (Moon et al., 2014). O miR-206 apresenta expressão diminuída quando realizada uma
comparação entre os grupos. Esse miRNA regula os níveis de BDNF (sigla do inglês, Brain-
derived neurotrophic factor – fator neutrófico derivado do cérebro), o qual apresenta sua
expressão aumentada após as crises e desempenha um importante papel na epileptogênese,
pois aumenta a excitabilidade neuronal (Binder et al., 2001; Lee et al., 2012). Apesar da
presença de expressão alterada dos miRNAs (miR-374, miR-468 e miR-142-5p) nesse trabalho,
ainda não estão claras as funções desses miRNAs nesses animais. Observou-se que o miR-
347 apresentou expressão diminuída quando comparado aos demais grupos, similarmente
ao miR-206. Além disso, os autores acreditam que miR-468 e miR-142-5p contribuem para
a farmacorresistência nesses animais.

2.2 A doença de Alzheimer

A doença de Alzheimer (DA) é um distúrbio neurodegenerativo que provoca deterioração
progressiva das funções cerebrais, como perda de memória, da linguagem, da razão e da
capacidade de cuidar de si mesmo (McKhann et al., 1984). Acredita-se que 5% da população
mundial com mais de 60 anos manifeste sintomas relacionados à doença de Alzheimer (Ferri
et al., 2005; Ballard et al., 2011).
Não se conhece a causa específica desse distúrbio, porém existem algumas lesões
cerebrais características. As duas principais são as placas senis decorrentes do depósito de

(APP) pela da enzima beta secretase 1 (BACE1), e dos emaranhados neurofibrilares, frutos
da hiperfosforilação da proteína Tau (Braak; Braak, 1995; Hardy; Selkoe, 2002).
Vários estudos recentes relacionam a desregulação dos miRNAs encontrados em
cérebros de pacientes com a progressão da doença. Dentre eles, destacam-se miR-9, miR-29,
miR-34, miR-106, miR-107, miR-146 e miR-181 (Schonrock; Gotz, 2012). Muitos deles têm sido
associados à alteração na regulação de genes-chave conhecidos pelo envolvimento em DA.
O miR-107 parece ser um dos mais relevantes nesse distúrbio neurodegenerativo, sua
baixa expressão foi observada nos estágios iniciais da doença no lobo temporal e correlacionado
com a alta expressão do gene BACE1 (Wang et al, 2008; Nelson; Wang, 2010). Os mesmos
autores confirmaram que miR-107 diminui com o avanço da doença e observaram que o
aumento de BACE1
da densidade de placas neuríticas (Wang et al., 2008). Do mesmo modo, Long et al. (2014)
observaram que a desregulação dos níveis de BACE1 pode ocorrer também em decorrência da
redução significativa dos níveis de miR-339-5p em amostras cerebrais de pacientes, quando
comparadas com as de indivíduos controles pareados cuidadosamente pela idade. A família
do miR-29 também tem se mostrado presente em casos esporádicos de DA. Esse cluster tem
sítios de ligação para o gene BACE1 e sua perda é correlacionada com a alta expressão de
BACE1 (Hebert et al., 2008; Zong et al., 2011).

180 Introdução ao mundo dos microRNAs

 Além desses miRNAs, destaca-se também o miR-9, que é altamente conservado,
expresso no cérebro e foi encontrado desregulado na DA (Schönrock; Gotz, 2012). Os alvos
desse miRNA incluem NFH, uma proteína encontrada em emaranhados neurofibrilares e
SIRT1, uma deacetilase que interage com a proteína Tau (Saunders et al., 2010; Liu et al.,
2011). O miR-146a, conhecido por seu papel regulador da imunidade inata, foi encontrado
hiperexpresso em hipocampo e córtex temporal em pacientes, sugerindo também uma relação
da via inflamatória associada à DA (Sethi; Lukiw, 2009). Por fim, evidências indicam que o
miR-153 contribui para a regulação pós-transcricional dos genes APP/APLP2 e sugerem um
papel também na DA (Long et al., 2012).
Outro aspecto curioso se refere à associação de miRNAs com DA em regiões específicas
do cérebro. A baixa expressão de miR-132-3p foi reportada em três diferentes áreas –
hipocampo, córtex pré-frontal e temporal – do cérebro de três coortes de pacientes e
validada por duas diferentes técnicas (sequenciamento de nova geração e hibridização
in situ). Foi observado também que, com o agravamento da doença, as células neuronais
mostraram menor expressão desse miRNA e o aparecimento da forma hiperfosforilada
da proteína Tau (Lau et al., 2013).
O uso de estratégias refinadas, como a microdissecação a laser, permite estudos
“espacialmente mais detalhados” sobre o perfil de expressão de miRNAs, considerando a
heterogeneidade celular do córtex cerebral humano. Por meio dessa técnica foi possível
observar a maior expressão global de miRNAs na substância cinzenta em comparação com
a branca em pacientes em estágios iniciais, quando comparados com indivíduos normais
(Wang et al., 2011).
E, por fim, o diagnóstico precoce e preciso é crucial para as tentativas de diminuir ou
retardar a progressão da doença. Dada a dificuldade de os métodos de imagem fornecerem
diagnóstico claro e decisivo tem-se buscado marcadores de diagnóstico e prognóstico menos
invasivos e estáveis. Tan e colaboradores (2014) apresentaram um perfil da expressão de
miRNAs circulantes no soro que foram validados em 158 pacientes com DA e 155 controles,
são eles: miR-98-5p, miR-885-5p, miR-483-3p, miR-342-3p, miR-191-5p e miR-let-7d-5p. Da
mesma maneira, mas em líquido cefalorraquidiano, foi demonstrado que os níveis de miR-
27a-3p estavam reduzidos quando comparados os níveis de expressão de 37 indivíduos do
grupo controle aos de 35 pacientes com DA (Sala Frigerio et al., 2013).

2.3 A doença de Huntington

A doença de Huntington (DH) é um distúrbio neurodegenerativo associado à coreia,
ou atetose, à perda da cognição e alterações psiquiátricas e é causada por uma expansão de
repetições do códon CAG no gene que codifica a proteína huntingtina (HTT) (Macdonald et al.,
1993). A DH é também caracterizada pela perda progressiva de neurônios no córtex e corpo
estriado, estima-se que a prevalência seja de 2-5 em 100.000 habitantes (Pringsheim et al., 2012).
Há poucos estudos que relacionam a desregulação dos miRNAs com a DH. Em modelos
celulares desse distúrbio, miR-146a, miR-125b e miR-150 foram encontrados hipoexpressos,
enquanto o miR-34b foi encontrado com a expressão aumentada na presença de proteína
HTT mutante (Sinha et al., 2010; Gaughwin et al., 2011). Também se observou que a família
do miR-200 estava alterada em córtex de camundongos mutantes de HTT nas fases iniciais
da doença, isso poderia levar ao comprometimento dos genes envolvidos na plasticidade e
sobrevivência neuronais (Jin et al., 2012).

Implicações patológicas da desregulação de microRNAs 181

 Os componentes-chave da biogênese de miRNA também foram associados a DH. Lee
e colaboradores (2011) demonstraram a desregulação de Dicer, Drosha e Exportin-5 em
diferentes fases do curso da doença em modelos animais. Zuccato et al. (2007) observaram
que há aumento na expressão do gene REST (do inglês RE1-Silencing Transcription Factor)
em neurônios de pacientes, diferentemente do que foi encontrado em neurônios saudáveis,
e sugerem que essa desregulação pode ter uma repercussão no aumento da repressão do
gene HTT e ocasionar um efeito negativo sobre a sobrevivência deste grupo celular.

3. MicroRNAs e os transtornos psiquiátricos

Os transtornos psiquiátricos ou mentais são geralmente caracterizados por uma
combinação de pensamentos, emoções e comportamentos anormais, o que ocasiona prejuízos
nos relacionamentos sociais (http://www.who.int/topics/mental_disorders/en). Dados do
Ministério da Saúde relatam que 3% da população brasileira têm transtornos mentais graves
e persistentes, que incluem esquizofrenia, transtorno afetivo bipolar, autismo e depressão
(Onocko-Campos; Furtado, 2006). Resultados recentes dos estudos de associação baseados
em genomas completos (do inglês genome-wide association studies – GWAS) indicam que a
maioria dos casos de distúrbios psiquiátricos é decorrente de centenas ou milhares de variantes
genéticas comuns atuando em conjunto para produzir um fenótipo neuropsiquiátrico e
sugerem que tanto a esquizofrenia quanto o transtorno bipolar são poligênicos, com milhares
de polimorfismos de nucleotídeo único (do inglês single-nucleotide polymorphism – SNPs)
comuns que contribuem para uma grande porcentagem na doença (Purcell et al., 2009).
Embora esses distúrbios possam ter um componente genético, a variabilidade
entre os pacientes tem dificultado a identificação dos principais genes que participam do
desenvolvimento desses transtornos (Miller; Wahlestedt, 2010). Isso sugere a participação
de moléculas reguladoras adicionais ainda não conhecidas. Diante isso, a desregulação da
expressão dos miRNAs pode ter papel importante em alguns dos aspectos do desenvolvimento
neurológico dos transtornos psiquiátricos. A identificação dos RNAs mensageiros (mRNAs)
alvos desses miRNAs também é um passo fundamental na construção de um panorama das
vias envolvidas pela expressão anormal desses miRNAs e potencialmente relacionadas com a
doença. A seguir, descrevemos os miRNAs envolvidos nos principais transtornos psiquiátricos.

3.1 A Esquizofrenia
De acordo com o Manual de Diagnóstico e Estatística da Sociedade Norte-Americana
de Psiquiatria (DSM-IV), a Esquizofrenia está presente em cerca de 1% da população geral. É
uma doença complexa caracterizada por uma desintegração dos processos de pensamento
e de capacidade de resposta emocional (DSM-IV). Alguns sintomas comuns da doença são
alucinações visuais e acústicas, delírios paranoicos, disfunção social e discurso e pensamento
desorganizado, a etiologia é complexa e pouco compreendida (DSM-IV). Não há dados da
prevalência desse distúrbio na população brasileira.
Níveis anormais de alguns miRNAs foram detectadas no cérebro de pacientes com
Esquizofrenia em comparação com o cérebro de indivíduos sem diagnóstico de distúrbios
neuropsiquiátricos. Perkins e colaboradores (2007) examinaram a expressão de 264
miRNAs no córtex pré-frontal (área Brodmann 9) a partir de um grupo de 15 pacientes
esquizofrênicos ou esquizoafetivos e 21 amostras de indivíduos controle e identificaram

182 Introdução ao mundo dos microRNAs

16 miRNAs diferencialmente expressos, dos quais 15 estavam com a expressão diminuída
nos pacientes. Os miRNAs miR-26b, miR-30b, miR-29b e miR-106b apresentaram os maiores
valores de alteração de expressão. Variantes raras nas sequências de pre-miRNAs (miR-18b,
miR-502 e miR-505) e de miRNAs maduros (let-7f, miR-188, miR-325, miR-509, miR-510 e miR-
660) foram encontradas com maior frequência em homens afetados por esse transtorno em
comparação com indivíduos saudáveis (Feng et al., 2009).
Hansen e colaboradores (2007) utilizaram uma amostra composta por 1.476 indivíduos
saudáveis e 840 pacientes com Esquizofrenia para estudar 18 SNPs. Os autores encontraram
dois SNPs (rs17578796 e rs1700) nos miR-206 e miR-198, respectivamente, que mostraram
uma associação significativa com a Esquizofrenia.
Da mesma forma, um recente GWAS com 21.856 indivíduos com Esquizofrenia de
ascendência europeia e 29.839 indivíduos controle resultou na associação do SNP rs1625579,
localizado a jusante do miR-137, com a Esquizofrenia. Esse miRNA é um regulador bem conhecido
do desenvolvimento neuronal, sugerindo com isso que ele pode mediar a desregulação do
mecanismo etiológico previamente desconhecido na Esquizofrenia (Ripke et al., 2011).

3.2 O Transtorno Afetivo Bipolar

Transtorno Afetivo Bipolar (TAB) é um distúrbio psiquiátrico grave e incapacitante,
com uma prevalência na população mundial de 1,5% (Hilty et al., 1999). É caracterizado por
episódios de mania ou hipomania, intercalados com períodos de depressão e de eutimia
(Barnette; Smoller, 2009).
As análises de miRNAs diferencialmente expressos entre os indivíduos saudáveis
e pacientes com transtorno bipolar revelaram uma redução significativa na expressão de
miR-132 no córtex pré-frontal desses pacientes (Miller; Wahlestedt, 2010). Esse mesmo grupo
encontrou vários genes-alvo desse mesmo miRNA, inclusive DNMT3A, GATA2 e DPYSL3, com
expressão alterada tanto durante o desenvolvimento neurológico normal como em córtex
pré-frontal de 35 pacientes adultos com Esquizofrenia, mostrando com isso que esses genes
podem ter função também em TAB (Miller et al., 2012).
Além disso, foi observado que a administração de cloreto de lítio e valproato,
estabilizadores de humor utilizados para tratar TAB, alteraram a expressão dos miRNAs:
let-7b, let-7c, miR-128a, miR-24a, miR-30c, miR-34a, miR-221 e miR-14. Os alvos identificados
desses miRNAs desregulados dão indícios de que eles podem estar envolvidos no crescimento
de neuritos e na neurogênese. Juntos, esses resultados indicam que a expressão de miRNAs
e de seus genes-alvo é afetada por drogas psicoativas (Zhou et al., 2009).

3.3 O Autismo
Grupo de distúrbios caracterizado por um espectro de prejuízos qualitativos na interação
social, associados com diferentes graus de déficits na comunicação, comportamentos repetitivos
e interesses restritos (DSM-IV). Estima-se que 1% a 2% da população seja acometida por
alguma forma de autismo (Kim et al., 2011). A causa desse grupo de distúrbios permanece
desconhecida mas em pelo menos 20% dos casos uma causa genética foi identificada (Delorme
et al., 2013). Pouco se sabe sobre a importância dos miRNAs para esse grupo de distúrbios.
Até o momento, a desregulação do padrão de expressão de miRNAs em indivíduos com essa
síndrome foi verificada primeiramente por Abu-Elneel e colaboradores (2008), que relataram

Implicações patológicas da desregulação de microRNAs 183

 diferenças na expressão de 28 miRNAs em tecidos cerebelares de 13 pacientes com Autismo
e 13 indivíduos controle, pareados com relação à idade, sexo e hemisfério estudado.
Sarachana e colaboradores (2010) também avaliaram os miRNAs desse grupo de
distúrbios e foram capazes de identificar genes que são susceptíveis de serem regulados
por miRNAs no Autismo. Eles validaram dois genes-alvo de miRNAs, ID3 e PLK2, que estão
envolvidos no ciclo circadiano bem como na modulação sináptica.

4. MicroRNAs nas doenças cardiovasculares

Doenças cardiovasculares, inclusive a complicação mais severa – infarto do miocárdio –
têm se tornado a principal causa de morte no mundo (Musunuru; Kathiresan, 2010; Donyav et al.,
2011). Mais de 80% das mortes súbitas no mundo são causadas por aterosclerose coronária
e as restantes 20% são causadas por outras doenças cardíacas, inclusive cardiomiopatias,
doença congênita do coração, hipertrofia cardíaca, doença da válvula aorta e outros distúrbios
cardíacos (Musunuru; Kathiresan, 2010).
Estudos recentes indicam que os miRNAs são altamente expressos no sistema vascular
e são moduladores críticos para a diferenciação, contração, migração e apoptose das células
vasculares, sendo que a desregulação da expressão desses miRNAs pode causar doenças
dos vasos (Qin; Zhang, 2011). Recentemente foi descrito um miRNA específico que regula
células endoteliais e a angiogênese: miR-126 (Small; Olson, 2011). Esse miRNA é conhecido
por ser um regulador da angiogênese e por regular a neoangiogênese depois de infarto do
miocárdio (Wang; Olson, 2009).
Através da clonagem direta (Lagos-Quintana et al., 2002) e do estudo de perfil de
expressão por microarranjos (Van Rooij et al., 2006), vários miRNAs que são expressos no
coração têm sido identificados. Em particular, miR-1 e miR-133 são altamente expressos
no coração e no músculo esquelético, sendo assim, são foco em diversos estudos seu papel
no desenvolvimento do tecido cardíaco. MiR-1 é altamente conservado entre espécies e é
o microRNA mais abundante no coração adulto, representando 24% de todos os miRNAs
presentes nesse órgão (Li et al., 2010).
A hipertrofia cardíaca se refere a uma extensa remodelagem do coração em resposta
a vários estímulos bioquímicos e patológicos. Devido ao alargamento dos miócitos e ao
aumento da fibroína, ocorre um aumento na espessura das paredes do ventrículo, levando à
insuficiência cardíaca e à morte súbita (Kehat; Molkentin, 2010). Estudos têm demonstrado
que genes da fase fetal do desenvolvimento cardíaco são reativados durante a hipertrofia
cardíaca (Abraham et al., 2002), os quais têm sido associados com a hiporregulação de
miR-26b e do fator de transcrição GATA-4 (Han et al., 2012). Trabalhos recentes evidenciam
o papel crítico do miR-22 no desenvolvimento da hipertrofia e na remodelagem cardíaca
em resposta ao estresse (Huang et al., 2013). Além do mais, cardiomiócitos hipertróficos
apresentam alta expressão dos miRs-212 e 132 e essa expressão aumentada leva a uma
diminuição da expressão do fator de transcrição anti-hipertrófico FOX3 (Ucar et al., 2012).
Outra doença cardíaca que também está relacionada com microRNAs é a miocardite
viral (VMC), condição que causa destruição irreversível dos miócitos e insuficiência cardíaca.
Esses sintomas são conhecidos por serem o resultado da uma resposta imunológica aguda
das viroses cardiotróficas. Durante a miocardite viral, o nível de expressão do miR-1 é
extremamente aumentado, correlacionando-se com a diminuição dos níveis da proteína

184 Introdução ao mundo dos microRNAs

conexina-43 no coração com VMC (Xu et al., 2012). Somando-se ao miR-1, outros microRNAs,
como miR-155, miR-146b e miR-21, apresentam-se induzidos durante a miocardite viral
aguda. Além disso, o miR-155 está anormalmente localizado em infiltrações por macrófagos
e em linfócitos-T. Interessantemente, a inibição do miR-155, através da utilização de LNA-
antagomirs, atenua a infiltração cardíaca dos macrófagos, diminui a ativação dos linfócitos-T
e reduz o dano no miocárdio na miocardite viral aguda (Corsten et al., 2012).

5. MicroRNAs e as doenças autoimunes ou inflamatórias crônicas

Os microRNAs estão envolvidos no desenvolvimento e maturação de diversos
componentes da imunidade inata, como granulócitos e macrófagos, e da imunidade adaptativa,
como linfócitos T e B. Além disso, esses RNAs regulatórios também desempenham importante
papel na regulação da função do sistema imune. Dessa forma, alterações na função dos
microRNAs relacionados a mecanismos do sistema imune possuem grande potencial de
impactar significativamente fenômenos como a resposta inflamatória, ou diversas patologias
autoimunes. A seguir serão abordados recentes descobertas que associam alterações na
função dos microRNAs e diversas patologias autoimunes e inflamatórias crônicas (Baltimore
et al., 2008; Dai; Ahmed, 2011).

5.1 O Lúpus Eritematoso Sistêmico

O Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) é uma doença autoimune que pode ser
caracterizada pela produção de autoanticorpos reativos a antígenos nucleares e de fosfolipídeos,
desencadeando lesões em diversos órgãos e sistemas. Alterações em diversos mecanismos do
sistema imunológico, tais como sinalização aberrante nas vias do NF-kB, TLR ou Interferon
tipo I, podem contribuir para a susceptibilidade a essa doença. A relação entre possíveis
alterações no padrão de expressão de miRNAs e o LES foi inicialmente explorada por Dai
e colaboradores em 2007. Esses autores investigaram o envolvimento da desregulação na
expressão de miRNAs em células sanguíneas circulantes no LES. Utilizando a técnica de
microarranjos de DNA, observaram um padrão alterado de expressão de miRNAs em células
sanguíneas mononucleares de pacientes com LES quando comparados a controles saudáveis
(Dai et al., 2007).
Dentre os diversos miRNAs cuja expressão se mostra alterada em células sanguíneas
de pacientes com LES, destaca-se o miR-146a. Esse miRNA é um regulador negativo de
diversos componentes da via de sinalização dos receptores tipo Toll e, além disso, apresenta
expressão reduzida em células sanguíneas de pacientes com LES. É interessante notar que a
superexpressão do miR-146a em células sanguíneas mononucleares de pacientes com LES, via
transformação genética, é capaz de reduzir a indução de Interferons tipo I (Tang et al., 2009).
Os miRNAs miR-21 e miR-148a foram encontrados superexpressos em linfócitos T
CD4+ de pacientes portadores de LES. O miR-148a atua suprimindo a expressão da DNA
metiltransferase 1 (DMT1) nessas células, favorecendo um estado de hipometilação. Além
disso, a repressão dos microRNAs miR-21 e miR-148a em linfócitos T CD4+ de pacientes com
LES leva a um aumento da expressão da DMT1 e do estado geral de metilação de diversas
regiões do DNA (Pan et al., 2010).

Implicações patológicas da desregulação de microRNAs 185

 5.2 A Artrite Reumatoide
A Artrite Reumatoide (AR) pode se caracterizar como uma doença autoimune e
inflamatória crônica que afeta as articulações. A progressão da doença acaba acarretando
a destruição de cartilagens articulares e erosão óssea (Cooles; Isaacs, 2011; Miao et al., 2013).
Diversos autores encontraram alterações na expressão de miRNAs em amostras
obtidas de líquido sinovial de pacientes com AR como, por exemplo, miR-124a, miR-155,
miR-246 e miR-146. Esse último apresenta a interessante correlação positiva com o mediador
inflamatório TNF-alfa no líquido sinovial de pacientes com AR. Também é possível ressaltar
o miR-124a, pois além de expressão alterada demonstrou-se que a indução da expressão
desse microRNA em sinoviócitos de pacientes com AR reduziu a proliferação dessas células
em cultura, sendo observada uma redução nas proteínas Quinase dependentes de ciclina
2 e na proteína Quimoatractant de monócitos 1 (Nakamachi et al., 2009; Abou-Zeid et al.,
2011; Miao et al., 2013).

5.3 As doenças inflamatórias intestinais

As doenças inflamatórias intestinais (DII), que incluem a Doença de Crohn e a Colite
Ulcerativa, são aquelas que podem ser caracterizadas por apresentarem ativação inadequada
da resposta imune adaptativa contra fatores luminais do tubo gastrointestinal, tais como
antígenos da flora normal. Essa ativação inadequada possuiria maior chance de se desenvolver
em indivíduos geneticamente suscetíveis. Um dos primeiros trabalhos a explorar o perfil de
expressão de miRNAs em DIIs foi realizado por Wu e colaboradores em 2008. Esses autores
encontraram 11 miRNAs diferencialmente expressos quando analisadas amostras de biopsias
de mucosa intestinal de pacientes com Colite Ulcerativa em comparação com controles
saudáveis. No entanto, até o presente momento a maioria dos estudos que exploraram a
desregulação da expressão de miRNAs em doenças inflamatórias intestinais são trabalhos
que buscaram apenas associação entre essas alterações de expressão e a doença. Um exemplo
de resultados advindos de tais estudos foi a observação de que miR-143 e miR-145 possuem
sua expressão reduzida em amostras de Colite Ulcerativa, e que seus genes-alvo, tais como
IRS-1, K-RAS, API-5 e MEK-2, possuem sua expressão aumentada nas mesmas amostras.
Entretanto, uma possível relação causal ou um potencial para alterar parâmetros de evolução
da doença ainda necessitam de maior exploração comportamental.

6. Considerações finais
Está bem estabelecido que mecanismos envolvendo a desregulação de miRNAs (indução
ou repressão) estão presentes em várias doenças humanas. Por outro lado, o imenso potencial
dos miRNAs como agentes terapêuticos tem sido cada vez mais reconhecido. Além disso, o
papel de miRNAs circulantes como novos marcadores para o diagnóstico e no estabelecimento
do prognóstico de doenças humanas também começa a ser reconhecido. Algumas terapias
baseadas em miRNA já foram validadas em modelos animais com relevância clínica e poucos
estão em fase de desenvolvimento pré-clínico. No entanto, a falta de sistemas efetivos de
entrega (delivery) e a baixa especificidade dos miRNAs terapêuticos permanecem como
obstáculo à sua aplicação efetiva como ferramenta terapêutica.

186 Introdução ao mundo dos microRNAs

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Uso de miRNAs no Capítulo
diagnóstico, prognóstico 11
1
e terapêutica

Dr. Júlio Cesar Cetrulo Lorenzi1,a e Dr.a Dalila Lucíola Zanette2,a

1
Rockefeller University, New York - Estados Unidos
2
Fundação Oswaldo Cruz, Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz, Salvador - Brasil
a
Depto. de Genética, FMRP, USP - SP

Estruturação do capítulo
1. Introdução
2. Diagnóstico e prognóstico baseados em miRNAs
2.1 Neoplasias
2.2 Neoplasias hematológicas
2.2.1 Leucemia Linfocítica Crônica
2.2.2 Mieloma múltiplo
2.2.3 Leucemias pediátricas agudas
2.2.4 Linfomas
2.3 Tumores sólidos
2.3.1 Câncer de próstata
2.3.2 Câncer colorretal
2.3.3 Câncer de pulmão
2.3.4 Câncer de mama
2.3.5 Câncer gástrico
2.3.6 Câncer cervical
2.4 miRNAs como biomarcadores em outras doenças
2.4.1 Diabetes
2.4.2 Doenças neurológicas
2.4.3 Epilepsia
2.4.4 Esclerose Múltipla
2.4.5 Doença de Alzheimer
3. Aplicações terapêuticas
3.1 Terapêutica baseada na inibição de miRNAs
3.2 Terapêutica baseada na reposição de miRNAs
3.3 Perspectivas para o uso terapêutico dos miRNAs

Uso de miRNAs no diagnóstico, prognóstico e terapêutica 191

 1. Introdução
Como visto anteriormente, é clara a importância da desregulação de miRNAs para o
desenvolvimento de diversas doenças. Neste capítulo iremos discutir os principais avanços
biomédicos em direção ao uso real de perfis de expressão de miRNAs para fins diagnósticos
(determinação do quadro clínico), prognósticos (determinação da provável evolução desse
quadro) assim como o uso de miRNAs/antimiRs com propósitos terapêuticos (tratamento).

2. Diagnóstico e prognóstico baseados em miRNAs

2.1 Neoplasias
O padrão de expressão de microRNAs é uma assinatura em potencial para a classificação,
diagnóstico e predição sobre a progressão do câncer (Duttagupta et al., 2011), sendo utilizados
para isso não somente amostras de biópsia dos tumores como também os fluidos biológicos
como soro, plasma, urina, escarro e outros, propiciando investigações minimamente invasivas.
O primeiro estudo que associou a desregulação dos microRNAs com doenças humanas
foi publicado em 2002 por Calin e colaboradores, descrevendo a deleção ou regulação negativa
de miR-15a e miR-16-1 na Leucemia Linfocítica Crônica (LLC) (Calin et al., 2002). Depois desse
relato, a atividade dos microRNAs como supressores tumorais e oncogenes foi demonstrada
em diversos tumores, como revisado em (Kasinski e Slack, 2011; Calin e Croce, 2006b).
Devido à participação dos microRNAs na regulação de grande parte dos genes
codificadores de proteínas, eles agem também sobre a regulação de quase todos os processos
biológicos das células (Friedman et al., 2009; Bartel, 2009) e, portanto, estão frequentemente
envolvidos com a patogênese das doenças humanas (Mendell e Olson, 2012). A expressão de
grupos de microRNAs pode caracterizar determinadas doenças e também seus diferentes
estágios e subtipos. Consequentemente, a expressão e função dos microRNAs podem ser úteis
como ferramentas para o diagnóstico e prognóstico das mais diversas patologias (Mendell
e Olson, 2012; Garzon et al., 2010), além de serem considerados também promissores alvos
terapêuticos (Pereira et al., 2013). Desse modo, diversos grupos de pesquisa concentraram-se
na tradução dos conhecimentos básicos sobre microRNAs em diversos processos patológicos
para a prática clínica. O perfil de expressão de microRNAs pode ser usado para diferenciar
amostras tumorais de amostras saudáveis, bem como subtipos, graus ou estágios do câncer e
das leucemias, sendo portanto úteis no diagnóstico dessas doenças. Além disso, os padrões de
expresssão dos microRNAs também já se mostraram úteis como ferramentas de prognóstico,
ou seja, são capazes de prever a progressão da doença em diferentes aspectos clínicos.
Apesar da grande evolução das técnicas de imagem para o diagnóstico e acompanhamento
das doenças neoplásicas, a análise do tecido tumoral por meio de técnicas invasivas (biópsias)
ainda é muito utilizada. Isso ocorre pois o número de biomarcadores confiáveis nos fluidos
biológicos ainda é baixo para que essa ferramenta menos invasiva de diagnóstico seja utilizada
com mais frequência na prática clínica. Nesse sentido, os microRNAs são extremamente
promissores, pois estão presentes de forma estável nos fluidos biológicos como saliva, plasma,
soro e urina (Madhavan et al., 2013). A grande estabilidade dos microRNAs nesses fluidos é
devida, em parte, ao fato de eles serem carreados dentro de vesículas chamadas exossomos.
Essas vesículas são formadas dentro das células e posteriormente liberadas ao fundirem-se

192 Introdução ao mundo dos microRNAs

com a membrana plasmática. O fator mais importante é que as células tumorais parecem
ser a fonte primária dos exossomos e, portanto, dos microRNAs circulantes, nestes pacientes
(Shen et al., 2013). Dessa maneira, os microRNAs encontrados nos exossomos em fluidos
biológicos refletem indiretamente o ambiente tumoral, já que provêm das células tumorais e
que são liberadas pelas vesículas para comunicação com as demais células tumorais, com o
estroma ou ainda para sinalização de forma sistêmica. Outras explicações para a existência
dos microRNAs nos fluidos incluem o rompimento de células em situações patológicas e a
subsequente libreração dos microRNAs nos fluidos. Além disso, já foi descrita a existência
de microRNAs circulantes que não estão dentro de exossomos e, sim, ligados a proteínas
como a ARGONAUTA e a NUCLEOFOSMINA (Shen et al., 2013).
Nesta seção serão abordados os principais microRNAs com função supressora tumoral
ou oncogênica cujo padrão de expressão tenha potencial ou já seja utilizado como ferramenta
de diagnóstico e prognóstico em neoplasias hematológicas e em tumores sólidos com grande
incidência.

2.2 Neoplasias hematológicas

Os microRNAs têm um papel muito importante na hematopoese, pois regulam
praticamente todos os estágios de diferenciação das células sanguíneas. Consequentemente, a
expressão aberrante dos microRNAs também está associada a diversas neoplasias hematológicas
(Vasilatou et al., 2010) e pode ser útil para o diagnóstico, classificação e monitoramento
dessas doenças.

2.2.1 Leucemia Linfocítica Crônica

O primeiro cluster de microRNAs usado para prognóstico e diagnóstico de leucemias
foi o cluster miR-15a/miR-16-1, inicialmente associado à Leucemia Linfocítica Crônica (LLC) e
posteriormente a outras neoplasias hematológicas e tumores sólidos. Esse grupo de microRNAs
possui atividade supressora tumoral e a expressão da sua forma madura pode desaparecer ou
diminuir devido: (i) à deleção da região 13q14.3, onde eles estão localizados, (ii) a mutações
de ponto na região 3’ do precursor do miR-16 ou (iii) à deleção do cluster miR-15a/miR-16
(Kasinski e Slack, 2011). Foi demonstrada a correlação inversa entre a expressão desses
microRNAs e a expressão do gene e da proteína Bcl-2 na LLC. Em seguida, o Bcl-2 foi definido
como alvo do cluster miR-15a/miR-16, sendo que na ausência desses miRNAs ocorria maior
expressão do Bcl-2, resultando na redução da apoptose das células tumorais, levando a um
patamar mais agressivo da LLC (Cimmino et al., 2005). O cluster miR15a/miR-16 correlaciona-
se com outros fatores prognósticos em LLC, como a expressão alta ou baixa de ZAP70 (70-
kD zeta-associated protein) e casos com região IgVH não mutada ou mutada, que indicam
prognóstico agressivo e indolente, respectivamente. Essa correlação posicionou o cluster
miR-15a/miR-16 como marcador de prognóstico em LLC (Calin e Croce, 2006a), na qual sua
menor expressão representa um melhor prognóstico (Calin et al., 2005). Mais recentemente
foi descrita uma rede maior de regulação em LLC na qual o supressor tumoral TP53 também
é alvo do miR-15a/miR-16 e regula outros microRNAs relacionados com o prognóstico de
LLC: miR-34a, miR-34b e miR-34c. Esses miRNAs, por sua vez, têm como alvo o próprio ZAP70
(Fabbri et al., 2011), explicando melhor a correlação com esse fator prognóstico.
A expressão elevada do oncogene Tcl1 (T cell leukemia/lymphoma 1) está associada
à forma agressiva de LLC, inclusive com o status de IgVH e ZAP70. Ocorre uma correlação

Uso de miRNAs no diagnóstico, prognóstico e terapêutica 193

 inversa entre a expressão de Tcl1 e de miR-29 e miR-181c. Ou seja, casos de LLC agressiva
apresentam maior expressão de Tcl1 e menor expressão de miR-29 e miR-181b (Herling et al.,
2006; Pekarsky et al., 2006). A menor expressão do miR-150 está associada com marcadores
de mau prognóstico, como maior expressão de ZAP-70 e status não mutado de IgVH (Mraz
et al., 2014). Outro miRNA com importância na LCC é o miR-223, uma vez que foi verificada
a associação de sua menor expressão com a agressividade e pior prognóstico na LLC. No
mesmo estudo foi também determinado que HSP90 (heat shock protein 90) é um alvo desse
miRNA e sua alta expressão também é associada com pior prognóstico, o que demonstra a
importância dessa via de regulação na LCC (Rodríguez-Vicente et al., 2015).
Um miRNA também estudado na LCC é o miR-155. Já foi determinado que indivíduos
com LCC têm elevados níveis de expressão desse miRNA em células B que progridem de um
estado normal para a linfocitose monoclonal de células B, culminando na LLC. Além disso,
no mesmo estudo foi demonstrado que o miR-155 pode ser usado como fator preditivo de
resposta ao tratamento, uma vez que, antes do tratamento, níveis plasmáticos significativamente
menores desse microRNA foram encontrados em pacientes que desenvolveram resposta
completa após o tratamento (Ferrajoli et al., 2013).
Além do miR-155, outros microRNAs circulantes foram descritos no diagnóstico e
acompanhamento da LLC: miR-195, miR-29a e miR-222, que são capazes de diferenciar pacientes
com LLC de controles. Também foi descrita uma assinatura de seis microRNAs (miR-29a,
miR-483-5p, miR-195, miR-185, miR-135a* e miR-15a) que consegue separar pacientes com
expressão positiva e negativa para ZAP70, apesar de não ser capaz de realizar essa mesma
segregação para o status de IgVH (Moussay et al., 2011).

2.2.2 Mieloma Múltiplo

No Mieloma Múltiplo (MM), foi descrita uma assinatura de microRNAs associada com
diferentes anormalidades citogenéticas e estágios clínicos da doença. O miR-21 e o cluster
miR-17-92 são oncogênicos no MM, levando à maior sobrevivência celular e menor apoptose
(Wong et al., 2012). Já miR-15a e miR-16-1 são microRNAs que agem como supressores tumorais

a sobrevivência das células no MM (Roccaro et al., 2009). Porém, há um relato contraditório

que aponta a superexpressão do cluster miR-15a/miR-16-1 como fator de mau prognóstico no
Mieloma Múltiplo (Gao et al., 2012). MiR-181a, miR-181b, o cluster oncogênico miR-106b-25
e miR-32 estão regulados positivamente no MM e interagem com o gene PCAF, codificador
de uma histona acetiltransferase que regula a expressão de p53 nessa doença (Lionetti et
al., 2012). Foi estabelecido também que a expressão aumentada de três microRNAs é capaz
de agrupar pacientes com MM de acordo com a classificação TC (referente à translocação
existente e expressão de Ciclina D1): miR-99b, let-7e e miR-125a-5p, que estão localizados na
região 19q13.33 nos casos de TC4, que apresentam t(4;14). Nos casos de TC5 (translocação
MAF), ocorre a expressão moderada de um grupo parálogo de microRNAs: miR-99a, let-7c
e miR-125b, localizados na região 21q21.1 (Lionetti et al., 2009). A expressão de miR-25 e de
miR-30d é elevada em pacientes com MM. A inibição desses microRNAs aumenta a expressão
de p53 e resulta em maior apoptose (Kumar et al., 2011).

2.2.3 Leucemias pediátricas agudas

Nas leucemias pediátricas agudas, como a Leucemia Mielóide Aguda (LMA) e a
Leucemia Linfocítica Aguda (LLA) do tipo B, a expressão de alguns microRNAs nos blastos

194 Introdução ao mundo dos microRNAs

leucêmicos está associada com a resposta clínica e pode ser usada como fator preditivo
de recaída (Cocco e Airoldi, 2011). Schotte et al. (2011) definiram um grupo de microRNAs
que determina uma resposta clínica desfavorável, de forma independente do subtipo de
LLA: miR-33, miR-215, miR-369-5p, miR-496, miR-518 e miR-599. Por outro lado, miR-10a,
miR-134, miR-214, miR-484, miR-572, miR-580, miR-624 e miR-627 são fatores preditivos de
boa resposta clínica. Em relação às anormalidades citogenéticas e às respostas clínicas,
foi descrito que a regulação negativa do let-7b está restrita a LLA-B com rearranjos MLL
e associa-se com a maior expressão do oncogene c-Myc. A translocação t(12;21) apresenta
superexpressão específica de miR-99a, miR-100, miR125b, miR-383 e let-7c (Schotte et al.,
2011). De forma mais ampla, miR-7 e miR-216 foram associados a um mau prognóstico e
miR-150, miR-191, miR-312, miR-486 e miR-487 foram associados a um prognóstico favorável
em LLAs pediátricas (de Oliveira et al., 2012). Foram descritas também associações entre
miR-146a, miR-181a e miR-181c com menor sobrevida e de miR-221 com maior sobrevida,
em pacientes com LLA (de Oliveira et al., 2012; Ohyashiki et al., 2010).

2.2.4 Linfomas
Em linfomas, o padrão de expressão do miR-155 é muito importante para diferenciar
o Linfoma de Burkitt (LB), no qual a expressão do miR-155 é ausente do Linfoma Difuso
de Grandes Células B (LDGCB) no qual o miR-155 está expresso (Di Lisio et al., 2012a). A
perda da expressão do miR-155 correlaciona-se com a presença da translocação MYC-IGH,
típica do LB. No LB, a expressão do MYC encontra-se desregulada, como consequência de
translocações entre o MYC (8q24) e genes de imunoglobulinas. O MYC regula a expressão de
vários microRNAs, que por sua vez agem coordenadamente para controlar a expressão de
MYC. Assim, o LB é caracterizado pelo descontrole dessa alça de regulação, do qual participam
let-7a, let-7e, let-7f, miR-34b, miR-98, miR-331 e miR-363, além do cluster miR-17-92, que está
expresso no LB e é alvo transcricional de MYC (Di Lisio et al., 2012b). O cluster miR-17-92
também foi capaz de diferenciar o LDGCB de células B germinativas (LDGCB-CBG) do linfoma
folicular de alto grau (LF grau 3) (Fassina et al., 2012). Malumbres et al. (2009) definiram um
grupo de microRNAs que podem ser utilizados para diferenciar dois tipos de LDGCB com
prognósticos distintos, o LDGCB-CBG do LDGCB de células B ativadas (LDGCB-CBA). Dentre
esses microRNAs, a alta expressão do miR-222 associou-se com o subtipo CBA e também com
menor sobrevida total e sobrevida sem progressão (Malumbres et al., 2009). No linfoma
de células do manto (LCM), pacientes com menor expressão do miR-29 apresentam menor
sobrevida, sendo esse um parâmetro comparável ao Índice de Prognóstico Internacional
do LCM. Já a perda do miR-20b está associada a um prognóstico favorável (Di Lisio et al.,
2012b). Quanto aos microRNAs circulantes, miR-21, miR-155 e miR-210 estão mais expressos
em pacientes com linfoma difuso de células B grandes em relação aos controles saudáveis
(Lawrie et al., 2008). O miR-221 plasmático foi capaz de diferenciar pacientes de controles
em um estudo, além de correlacionar-se com a sobrevida no linfoma extranodal de células
T e natural killers (Guo et al., 2010).

2.3 Tumores sólidos

2.3.1 Câncer de próstata

O câncer de próstata foi o primeiro tipo de câncer utilizado para estabelecer os
microRNAs circulantes como biomarcadores sanguíneos. Foi identificado e validado um
painel de cinco microRNAs com expressão diferencial nos pacientes com câncer de próstata

Uso de miRNAs no diagnóstico, prognóstico e terapêutica 195

 em relação a pacientes com HBP. Três desses microRNAs estão hipoexpressos (let-7e, let-7c
e miR-30c) e dois estavam hiperexpressos (miR-622 e miR-1285) nos pacientes com câncer
(Chen et al., 2012). O miR-141 plasmático é capaz de permitir o diagnóstico de câncer de
próstata com uma sensibilidade de 60% e especificidade de 100% e, juntamente com o miR-
375, apresenta correlação com o score de Gleason (Mitchell et al., 2008; Brase et al., 2011). O
miR-141 plasmático também consegue predizer a resposta clínica com 78,9% de sensibilidade
(Gonzales et al., 2011) e diferencia tumores de próstata metastáticos e localizados. O miR-375
diferencia pacientes com metástase e correlaciona-se com o status dos linfonodos (Brase et
al., 2011). A avaliação do nível plasmático do miR-26a tem a capacidade de discriminar entre
câncer e hiperplasia benigna da próstata com 89% de sensibilidade e 56% de especificidade.
Já os microRNAs miR-21 e miR-221 estão mais expressos em pacientes com câncer de próstata
em comparação com indivíduos saudáveis (Yaman Agaoglu et al., 2011) e o miR-221 parece
ser elevado em pacientes com tumores dependentes de andrógenos (Zheng et al., 2012).

2.3.2 Câncer colorretal

Já foram publicadas dezenas de estudos sobre a expressão de miRNAs no câncer
colorretal (CCR). No total, 170 diferentes miRNAs estão regulados positivamente em amostras
tumorais de CCR. A regulação positiva de miR-21 foi demonstrada em 15 estudos, a de miR-31,
miR-135b e miR-183, em 11, 9 e 8 estudos, respectivamente. A regulação negativa do miR-145
foi demonstrada em 15 estudos, seguida da do miR-143, demonstrada em 9 estudos, e da de
miR-1, miR-195 e miR-378, demonstradas em seis trabalhos cada (Mazeh et al., 2013). Um
estudo associou a expressão de miR-21, miR-31, miR-143 e miR-145 em amostras de tumor e
margem com características clínicas. Foi demonstrado que a expressão do miR-21 aumenta
de forma consistente e significativa de acordo com o estágio do CCR, em casos com linfonodos
positivos e em pacientes com doença disseminada. O miR-31, cuja regulação positiva já havia
sido associada com o estágio clínico, não foi associado nesse estudo. Porém foi descrita a
correlação positiva entre a expressão do miR-31 com o grau de diferenciação do tumor
(Slaby et al., 2007). Em outro estudo, os níveis de miR-21 e miR-135b correlacionaram-se
positivamente com o estágio do CCR, ao passo que miR-96 e miR-135b correlacionaram-se
com metástase hepática (Xu et al., 2012). Muitos estudos também investigaram os níveis
plasmáticos e séricos de miRNAs nos CCR e encontraram correlação entre a expressão dos
miRNAs nesses fluidos e no tecido tumoral. O miR-21 conseguiu diferenciar pacientes com
CCR de indivíduos saudáveis com alta especificidade e 90% de sensibilidade (Kanaan et al.,
2012). Os microRNAs miR-601 e miR-760 estavam significativamente menos expressos no
plasma de pacientes com CCR em relação a indivíduos saudáveis e foram validados em uma
coorte de 191 pacientes e controles (Wang et al., 2012b). Dois microRNAs do cluster miR-17-92
(miR-17-3p e miR-92a) se apresentam em níveis elevados no plasma de pacientes com CCR
e podem discriminar esses pacientes de indivíduos saudáveis com 89% de sensibilidade e
70% de especificidade. O miR-141 é um marcador de CCR avançado. Quanto ao prognóstico,
a expressão alta do miR-21 no tecido tumoral está associada a um mau prognóstico em CCR
(Okayama et al., 2012). Dos três miRNAs mais comumente relatados como superexpressos
no CCR (miR-21, miR-221 e miR-222), apenas os níveis do miR-221 foram considerados altos
o suficiente para sua utilização como biomarcador, segundo Pu et al. (2010). Além disso, esse
estudo demonstrou que a expressão do miR-221 correlaciona-se com prognóstico do CCR (Pu
et al., 2010). A regulação positiva do miR-141 no plasma de pacientes com CCR está associada
com metástase e teve correlação com os níveis de Antígeno Carcinoembrionário (CEA) e
com o mau prognóstico (Cheng et al., 2011). A maior expressão do miR-21 está associada

196 Introdução ao mundo dos microRNAs

a estágios avançados da doença (Feng et al., 2011). A menor expressão do miR-195 foi um
fator independente de predição de maior sobrevida e esse miRNA estava mais expresso em
pacientes com metástases em linfonodos e em estágios avançados da doença (Wang et al.,
2012c). O miR-125b é um fator independente de predição de tamanho do tumor, invasão e
mau prognóstico (Nishida et al., 2011).
A expressão de miRNAs também foi analisada em amostras de fezes de pacientes
com CCR e foi identificada a maior expressão significativa do cluster miR-17-92, miR-21 e
miR-135 em relação a indivíduos saudáveis, com sensibilidade de 74% e especificidade de
79% em uma coorte de 206 pacientes e controles (Koga et al., 2010). A superexpressão do
miR-144* consegue detectar pacientes com CCR com sensibilidade e especificidade de 74%
e 87%, respectivamente (Kalimutho et al., 2011). A superexpressão do miR-21 e do miR-92a
nas fezes e no tecido tumoral foi confirmada e também diminuiu significativamente após
remoção cirúrgica dos tumores (Wu et al., 2012).

2.3.3 Câncer de pulmão

Alguns microRNAs podem ser usados para discriminar pacientes com diferentes
tipos de câncer de pulmão de pacientes saudáveis. A baixa expressão de let-7a foi observada
repetidamente em amostras tumorais de pulmão, comparadas com as de pulmões saudáveis
(Kumar et al., 2008). É possível fazer essa distinção de forma não invasiva por meio da expressão
de alguns microRNAs no escarro, tais como miR-210, miR-708, miR-205, miR-21, miR-486,
miR-375 e miR-200b (Yu et al., 2010). Também, entre os métodos minimamente invasivos
de diagnóstico e acompanhamento, podem ser avaliados os níveis séricos e plasmáticos de
microRNAs. Níveis plasmáticos de miR-21, miR-210, miR-126, miR-486-5p, miR-25 e miR-223
também podem ser usados para identificar pacientes com câncer de pulmão de células não
pequenas (CPCNP) (Shen et al., 2011). MiR-155 e let-7a foram associados à menor sobrevida
e mau prognóstico, respectivamente (Yanaihara et al., 2006). A baixa expressão do miR-128b
correlaciona-se com a resposta terapêutica ao EGFR, pois esse receptor é seu alvo em CPCNP.
Além do miR-128b, outros cinco microRNAs (let-7a, miR-221, miR-137, miR372 e miR-182)
são usados para determinar o risco de recaída nesse tipo de câncer (Yu et al., 2008). A maior
expressão de miR-221 e miR-222 correlaciona-se com formas agressivas do CPCNP (Garofalo
et al., 2009). Além do miR-21 ser elevado no soro de pacientes com CPCNP em relação a
indivíduos saudáveis, a sua maior expressão sérica também correlaciona-se com a formação
de metástases e com menor sobrevida (Wang et al., 2011). O miR-21 foi frequentemente
associado também com metástase de linfonodos, câncer avançado e com o monitoramento
pós-operatório (Le et al., 2012; Liu et al., 2012b). Os microRNAs circulantes miR-25 e miR-223
foram considerados marcadores de diagnóstico promissores para o CPCNP (Chen et al., 2008).
Os níveis séricos dos microRNAs miR-1, miR-30d, miR-486 e miR-499 relacionam-se com a
sobrevida no CPCNP. Pacientes que tenham dois ou mais desses microRNAs hiperexpressos
no soro apresentam menor sobrevida do que pacientes que apresentam apenas um ou
nenhum desses microRNAs (Hu et al., 2010b).
A empresa Rosetta Genomics comercializa um kit de diagnóstico chamado Rosetta Lung
Cancer Test que avalia a expressão de oito miRNAs em amostras citopatológicas e é capaz
de diferenciar os quatro principais tipos de câncer de pulmão com 93,7% de sensibilidade
e 97,9% de especificidade (Gilad et al., 2012). A mesma empresa também oferece um kit
que diferencia o CPCNP escamoso e não escamoso, baseado na análise da expressão de
microRNAs em biópsias de tecido tumoral. A sensibilidade e especificidade do teste foram
avaliadas em 97% e 91%, respectivamente (Gilad et al., 2012).

Uso de miRNAs no diagnóstico, prognóstico e terapêutica 197

 2.3.4 Câncer de mama
Atualmente não existem marcadores circulantes para a detecção precoce do câncer
de mama que estejam em uso na rotina clínica, mas existem diversos estudos nesse âmbito.
Por exemplo, o miR-30a e o miR-155 circulantes foram considerados melhores marcadores
de carcinoma de mama metastático do que os marcadores sanguíneos gerais, antígeno
carcinoembrionário (CEA) e antígeno carboidrato (CA) (Sun et al., 2012; Zeng et al., 2013). O nível
sérico do miR-155 é elevado em tumores primários de mama, em relação a indivíduos normais.
Já o miR-10b e o miR-34a, além do próprio miR-155, são elevados no soro de pacientes com
metástases (Roth et al., 2010). O alto nível sérico do miR-195b consegue discriminar indivíduos
saudáveis de pacientes com câncer de mama com sensibilidade de 88% e especificidade de
91% (Heneghan et al., 2010b), assim como o miR-21 e o miR-29a (Hu et al., 2012). A expressão
baixa de miR-30 correlaciona-se com tumores negativos para o receptor de estrógeno e de
progesterona. Altos níveis de miR-213 e miR-203 correlacionam-se com tumores avançados.
O miR-10b e o miR-21 estão associados com o grau do tumor, invasão vascular e potencial
metastático (Iorio et al., 2008). As progestinas e a heregulina são importantes na etiologia
do câncer de mama, dado o papel crítico da progesterona e dos fatores de crescimento da
via do EGF/Erbb (Epidermal Growth Factor) na tumorigênese da glândula mamária. Tanto
as progestinas quanto o ligante heregulina regulam negativamente miR-16, por meio da
sua ação via Stat-3 e c-Myc, que agem portanto na inibição da ação supressora tumoral
do miR-16 (Rivas et al., 2012). O miR-145 é um fator de prognóstico importante no câncer
de mama, pois tem como alvo o receptor alfa do estrógeno, além de exercer função pró-
apoptótica dependente de p53 (Spizzo et al., 2010). Foi descrita uma alta expressão do miR-
195 no sangue de pacientes com câncer de mama que não foi detectada em pacientes com
outros tipos comuns de câncer ou em pacientes saudáveis, demonstrando sua utilidade no
diagnóstico do câncer de mama (Heneghan et al., 2010a). Os níveis circulantes de miR-125b
estão associados com a resistência à quimioterapia (Wang et al., 2012a) e por muito tempo ele
foi considerado como supressor tumoral no câncer de mama devido à sua baixa expressão
no tecido tumoral. No entanto, evidências recentes sugerem que a sua alta expressão não
está somente associada com a resistência à quimioterapia, mas também com a quantidade
de células-tronco tumorais e com a metástase no câncer de mama (Wang et al., 2013). Um
caso semelhante ocorre com o miR-205, cuja expressão pode estar aumentada ou diminuída
no câncer de mama, levantando dúvidas em relação ao seu papel supressor tumoral ou
oncogênico. No entanto, no caso do miR-205 foi descrita sua menor expressão em tumores
de mama metastáticos e, portanto, esse miR pode ter correlação negativa com metástase
(Greene et al., 2010). Esses dois casos aparentemente contraditórios ressaltam a importância
de se considerar com cuidado a heterogeneidade e complexidade do câncer e do papel dos
microRNAs nessa doença.

2.3.5 Câncer gástrico

Os microRNAs miR-106a e miR-17 encontram-se significativamente elevados no plasma
de pacientes com câncer gástrico (CG) em relação a controles saudáveis, podendo ser úteis
como biomarcadores desse tipo de câncer (Zhou et al., 2010). A expressão sérica de três
microRNAs (miR-221, miR-376 e miR-744) é capaz de diferenciar indivíduos com CG de
indivíduos saudáveis com 82,4% de sensibilidade e 58,8% de especificidade, sendo capazes de
identificar esse câncer até cinco anos antes do diagnóstico clínico (Song et al., 2012). O miR-21
é um fator independente de mau prognóstico nos tumores gástricos. A sua alta concentração
plasmática está associada a pior prognóstico e menor sobrevida (Komatsu et al., 2013). A

198 Introdução ao mundo dos microRNAs

menor expressão do miR-451 está associada a sobrevida geral e livre de doença (Bandres
et al., 2009; Brenner et al., 2011). O miR-221 está superexpresso nos tumores gástricos em
comparação ao tecido normal adjacente. Além disso, a sua maior expressão está associada
com a progressão tumoral e com mau prognóstico (Liu et al., 2012a). Recentemente o aumento
dos níveis do miR-199a-3p foi relatado no CG e esse microRNA apontado como candidato a
biomarcador para detecção precoce desse tipo de câncer (Li et al., 2013). Os miRNAs miR-
451 e miR-486 também foram validados como biomarcadores, pois seus níveis são elevados
em pacientes com CG antes da remoção cirúrgica do tumor e os níveis caem após a cirurgia
(Konishi et al., 2012). Os níveis plasmáticos de miR-106b, miR-20a e miR-221 são elevados
nos pacientes com CG em relação aos controles, apresentando potencial para uso como
biomarcadores para a detecção precoce do CG (Cai et al., 2013). A maior expressão de miR-
21 e miR-223 e menor expressão do miR-218 foi capaz de diferenciar pacientes com CG de
indivíduos saudáveis. Além disso, a expressão do miR-223 correlacionou-se especificamente
com a infecção por Helicobacter pylori, um importante agente etiológico do CG (Li et al., 2012).
O nível de expressão do miR-196a é maior no tecido tumoral gástrico primário em relação ao
tecido normal adjacente. Além disso, a expressão do miR-196a também encontra-se elevada
no soro dos pacientes e associa-se com o estágio da doença e com a recaída (Tsai et al., 2012).
No entanto, existe muita variação nos estudos relacionados com a expressão de miRNAs no
CG, possivelmente devido à heterogeneidade desse tipo de tumor (Leja et al., 2012).

2.3.6 Câncer cervical

Um perfil comum de expressão de microRNAs em câncer cervical, caracterizado
por maior expressão de miR-21 e miR-155 e menor expressão de miR-126, miR-145, miR-
424 e miR-450, foi relatado por três estudos independentes, como revisado por (Zheng e
Wang, 2011). A maior expressão do miR-127 no estágio inicial de carcinomas cervicais de
células escamosas invasivos é um marcador de metástase em linfonodos (Lee et al., 2008).
A maior expressão do miR-146a ocorre no câncer cervical, mas não nas lesões pré-malignas
induzidas por HPV (Wang et al., 2008). Os microRNAs miR-143 e miR-145 estão regulados
negativamente no câncer cervical em relação ao tecido cervical saudável (Pereira et al., 2010)
e estão igualmente modulados negativamente em todas as linhagens de câncer cervical,
incluindo as linhagens HPV negativas, indicando que sua função na tumorigênese cervical
é independente da infecção pelo HPV (Torres et al., 2011). A expressão do miR-200a é capaz
de predizer a sobrevida no câncer cervical e estudos funcionais sugerem que a expressão
desse microRNA afeta o potencial metastático de células tumorais cervicais (Hu et al., 2010a).
Chen et al. (2013) sugeriram que um perfil de seis microRNAs (miR-1246, miR-20a, miR-2392,
miR-3147, miR-3162-5p e miR-4484) são promissores biomarcadores preditivos de metástase
de linfonodos no câncer cervical de células escamosas (Chen et al., 2013).
Existe um enorme interesse na aplicação da dosagem dos miRNAs, especialmente dos
níveis circulantes, para o diagnóstico e prognóstico de diversas patologias. Nesse sentido,
os tumores sólidos têm os resultados mais promissores. Apesar de a maioria das evidências
encontradas nos estudos ainda não ser utilizada rotineiramente na prática clínica, há um grande
potencial para isso. Os maiores fatores limitantes são a especificidade e a sensibilidade dos
testes, que devem ser próximas de 100% para que sejam estabelecidos novos biomarcadores.
Para superar essa limitação, os miRNAs devem ser testados em um grande número de amostras,
e deve haver reprodutibilidade dos resultados. O uso de painéis de miRNAs pode contribuir
positivamente nesse aspecto, tornando a utilização dessas moléculas como marcadores de
diagnóstico e prognóstico uma realidade próxima.

Uso de miRNAs no diagnóstico, prognóstico e terapêutica 199

 2.4 miRNAs como biomarcadores em outras doenças
Apesar de a maioria dos estudos associados ao uso de miRNAs como biomarcadores estar
relacionado a neoplasias, o mesmo fenômeno tem sido demonstrado em outras enfermidades.

2.4.1 Diabetes
As doenças metabólicas, incluindo a diabetes, são outro grande exemplo da capacidade
regulatória dos miRNAs, uma vez que eles são capazes de alterar o metabolismo da glicose e
da homeostase de lipídeos (Lynn, 2009). Já foi demonstrado que a alteração da expressão de
miRNAs em pacientes com diabetes pode causar alterações na produção e secreção de insulina
pelas células beta-pancreáticas (Chen et al., 2014). O uso de miRNAs como biomarcadores na
diabetes é bem documentado, sendo que a quantificação de determinados miRNAs em fluidos
corporais possibilita o monitoramento do desenvolvimento e da progressão da doença. A
elevada expressão de 12 miRNAs (miR-152, miR-30a-5p, miR-181a, miR-24, miR-148a, miR-210,
miR-27a, miR-29a, miR-26a, miR-27b, miR-25 e do miR-200a) analisados no soro de pacientes
foi associada a diabetes do tipo 1 (Nielsen et al., 2012). Outros estudos demonstram que os
níveis séricos do miR-23a, com sensibilidade de 79,2% e especificidade de 75% (Yang et al.,
2014), e do miR-126 (Liu et al., 2014) são capazes de discriminar pacientes com diabetes do
tipo 2 de controles saudáveis. Em relação a diabetes gestacional já foi determinado que os
níveis séricos de miR-132, miR-29a e miR-222 são preditivos para essa doença, com uma
sensibilidade de 66,7% e especificidade de 63,3%.

2.4.2 Doenças neurológicas

O estudo de biomarcadores para doenças neurológicas é considerado desafiador,
uma vez que o acesso ao tecido doente é complicado, desse modo a avaliação dos níveis
circulantes de determinados miRNAs pode ser uma alternativa para esse tipo de doença.

2.4.3 Epilepsia
Um exemplo é a Epilepsia, doença caracterizada pela ocorrência de repetidas convulsões
causadas pela ativada anormal e dessincronizada de neurônios no cérebro (Henshall, 2014).
Em busca de determinar novos marcadores séricos para essa doença, foi realizado um estudo
de larga escala que demonstrou a elevada expressão dos miRNAs: Let-7d-5p, miR-106b-5p,
miR-130a-3p miR-146a-5p e uma diminuição da expressão dos miR-15a-5p e miR-194-5p
nos pacientes, em comparação com indivíduos saudáveis. Entre esses miRNAs, o miR-106b-
5p foi determinado como o melhor preditor para a doença, com sensibilidade de 80,3% e
especificidade de 81,2%.

2.4.4 Esclerose Múltipla

Outra doença favorecida pelo estudo dos miRNAs é a Esclerose Múltipla (EM). Essa
doença, caracterizada pela degradação da bainha de mielina em neurônios motores ainda
não tem sua causa totalmente estabelecida, porém a atividade autoimune dos linfócitos T
nesses pacientes é aceita como o componente ativo da doença (Hemmer et al., 2015). Desse
modo, diversos estudos já demonstraram a desregulação da expressão de miRNAs (Lindberg
et al., 2010; Otaegui et al., 2009; Keller et al., 2009) em linfócitos T isolados do sangue periférico
(Lorenzi et al., 2012; Fenoglio et al., 2011). Recentemente também foi demonstrado que o

200 Introdução ao mundo dos microRNAs

tratamento clássico com as drogas Natalizumab ou Acetato de Glatimer (Ingwersen et al.,
2015; Meira et al., 2014; Waschbisch et al., 2011) normaliza os níveis de expressão dos miRNAs:
miR-17, miR-18a, miR-20b, miR-29a, miR-103 no sangue periférico dos pacientes com EM. Já
em um ensaio clínico, quando o transplante de medula óssea foi usado como tratamento para
a EM, foi verificado que após o transplante ocorre a normalização na expressão de miR-16,
miR-155 e miR-142-3p em linfócitos T CD4+ isolados do sangue periférico (Arruda et al., 2015).

2.4.5 Doença de Alzheimer

Diversos estudos mostraram o potencial uso dos miRNAs como biomarcadores para
a Doença de Alzheimer. Já foi definida a alteração dos níveis séricos específicos dos miRNAs:
miR-98-5p, miR-885-5p, miR-483-3p, miR-342-3p, miR-191-5p e miR-let-7d-5p nos pacientes
em comparação com indivíduos saudáveis, sendo que o miR-342-3p apresentou a melhor
sensibilidade, 81,5%, e especificidade, 70,1%, para a determinação da doença (Tan et al.,
2014). Outro estudo analisou a expressão específica de miRNAs no fluido cérebro-espinhal
e demonstrou a expressão elevada dos miRNAs: miR-100, miR-146a, miR-1274a, miR-103,
miR-375, miR-505, miR-708, miR-4467, miR-219, miR-296, miR-766 e miR-3622b-3p. Porém
nenhum dos miRNAs analisados alcançou os níveis mínimos de sensibilidade e especificidade
necessários para ser utilizado como biomarcador. Nesse caso, eles são apenas considerados
informativos na comparação com indivíduos saudáveis (Denk et al., 2015).

3. Aplicações terapêuticas
Quando pensamos no uso dos miRNAs na terapêutica devemos dividir essa ideia em
dois grandes segmentos: (i) o primeiro relacionado ao uso de drogas inibidoras de miRNAs e
o segundo (ii) composto da aplicação direta dos miRNAs como drogas. Desse modo, a seguir
abordaremos esses dois conceitos isoladamente, para melhor entendimento.

3.1 Terapêutica baseada na inibição miRNAs

A inibição terapêutica de miRNAs é entendida como um passo importante no tratamento
de diversas doenças, uma vez que inúmeros estudos já demonstraram a importância central
da desregulação de determinados miRNAs em diversas patologias.
Entre essas condições podemos destacar o câncer, para o qual o termo “oncomiR”
foi cunhado, evidenciando a frequente relação de diversos miRNAs com a tumorigênese
(Hammond, 2006). Os oncomiRs são miRNAs capazes de reprimir genes supressores de
tumor; sua ação pode favorecer o aparecimento ou o crescimento tumoral. Um oncomiR
muito bem descrito é o miR-21, que já foi detectado em glioblastomas (Ciafrè et al., 2005),
tumores de pâncreas (Bloomston et al., 2007) e mama (Iorio et al., 2005). Nesses tumores
foi demonstrado que o miR-21 tem como alvo genes supressores tumorais como o PTEN
(phosphatase and tensin homologue) e PDCD4 (programmed cell death 4) (Frankel et al., 2008;
Meng et al., 2007). Tendo em mente a importância desse oncomiR, a empresa Regulus, em
conjunto com a indústria Sanofi-Aventis, está desenvolvendo uma molécula moduladora
desse oncomiR. O primeiro estudo publicado relacionado com a atividade desse modulador
demonstrou que a inibição do miR-21 com a utilização de uma dose de 20 mg/kg foi capaz de
reduzir a fibrose hepática em modelo animal (Chau et al., 2012). Também foi determinado
que a ação do inibidor se deve ao reestabelecimento da expressão das proteínas PPAR-

Uso de miRNAs no diagnóstico, prognóstico e terapêutica 201

 alfa (peroxisome proliferator activated receptor alfa) e Mpv17, determinados como alvos do
miR-21, importantes nesse modelo. A determinação do mecanismo de ação desse inibidor
demonstra que essa droga foi capaz de agir simultaneamente em dois genes-alvo, fato esse
possível apenas por se tratar de uma droga inibidora de miRNAs.
Outro exemplo muito bem descrito relacionando inibição de um miRNA com aplicação
terapêutica é o uso da droga chamada Miravisen. Essa droga, que atualmente se encontra
em um teste clínico fase 3 (mais informações no site www.clinicaltrials.gov, identificador:
NCT01872936), é utilizada no tratamento da Hepatite C e atua na inibição do miR-122 em
células hepáticas. O estudo dessa droga foi iniciado a partir da determinação da expressão
prevalente desse miRNA em células do fígado (Lagos-Quintana et al., 2002). O segundo passo
foi a determinação da importância central do miR-122 na replicação vírus da Hepatite C
(Jopling et al., 2005). O mecanismo proposto é o seguinte: o RNA viral contém duas regiões-
alvo do miR-122 e, uma vez que ocorre a ligação desse miRNA e a consequente clivagem
dessa parte do RNA viral, sucede-se uma potencialização da replicação viral. Tendo em vista
a relação entre o vírus e esse miRNA, a empresa Santaris iniciou o desenvolvimento de um
inibidor para esse miRNA. No ano de 2010 foram revelados os resultados desse que foi o
primeiro teste pré-clínico em primatas aprovado com uso de inibidores de miRNAs. Nessa
primeira avaliação foi demonstrado que a administração da droga não gerava efeitos colaterais
importantes e que também ocorria a diminuição drástica da contagem viral no sangue dos
macacos tratados (Lanford et al., 2010). No teste seguinte, realizado em humanos (Janssen
et al., 2013), verificou-se que o tratamento durante quatro semanas com doses de 5 mg/kg da
droga eliminou completamente a contagem viral. Atualmente, o Miravisen faz parte de um
teste clínico fase 3 no qual ele é comparado com as mais eficientes drogas atuais, em busca
da comprovação de sua eficácia. Recentemente, os pesquisadores responsáveis por essa
droga publicaram um artigo de revisão no qual comentam todas as fases do desenvolvimento
dessa droga (Lindow e Kauppinen, 2012). Os autores chamam a atenção para o fato de que o
desenvolvimento de uma droga baseada na inibição de um miRNA se deu em apenas duas
décadas após o descobrimento dos miRNAs, mostrando o rápido desenvolvimento desse
campo de pesquisa.

3.2 Terapêutica baseada na reposição de miRNAs

Terapias relacionadas à reposição de miRNAs são baseadas principalmente na existência
de miRNAs considerados supressores tumorais. Esses miRNAs estão envolvidos na modulação
da expressão de genes relacionados à gênese ou ao crescimento tumoral descontrolado. Um
exemplo clássico de miRNAs supressores tumorais são os membros do cluster miR-15a/16-1.
Como comentado anteriormente, esses miRNAs têm como principal alvo o gene BCL2 (B-cell
CLL/lymphoma 2), caracterizado como central no controle da apoptose. Nesse contexto, a
empresa Mirna Therapeutics está desenvolvendo um modulador que mimetiza o miR-16 e
que está sendo testado em alguns modelos de câncer, porém essa molécula ainda se encontra
em estágios iniciais de desenvolvimento.
Essa mesma empresa estuda outro microRNA: miR-34, conhecido por regular diversos
importantes genes relacionados ao controle da proliferação e do ciclo celular, entre eles
MYC, MET, RRAS, NANOG, CCND1 e MYB (Hermeking, 2010). A fim de testar a ação do miR-34
sobre o crescimento tumoral, foi utilizado um modelo animal de câncer pulmonar. Nesse
teste foi demonstrado que após 10 semanas de crescimento tumoral, uma única dose de um
modulador mimetizador do miR-34 foi capaz de induzir a apoptose das células tumorais,

202 Introdução ao mundo dos microRNAs

levando à diminuição da massa tumoral em 60% (Trang et al., 2011). Os resultados obtidos
em testes em modelos experimentais levaram a empresa a solicitar o primeiro teste clínico
dessa droga, agora chamada MRX34. Nesse teste clínico iniciado em 2013 (mais informações
no site www.clinicaltrials.gov, identificador: NCT01829971) será determinada a segurança
do uso dessa droga em pacientes com câncer hepático ou metástases hepáticas provenientes
de outros tumores.
Um resumo de todos os exemplos apresentados, somados a outras drogas em fase de
desenvolvimento, é mostrado na tabela 1.

3.3 Perspectivas para o uso terapêutico dos miRNAs

Durante a última década, uma grande quantidade de estudos tem focado na exploração
da biologia dos miRNAs, aumentando exponencialmente o conhecimento sobre a (des)
regulação dessas moléculas em organismos saudáveis e, principalmente, em doenças. Toda
essa informação vislumbra a possibilidade do uso de miRNAs no diagnóstico, prognóstico
e em oportunidades terapêuticas. Esse fato é confirmado pelos mais de 273 testes clínicos
registrados na plataforma clinicaltrials.gov, que avaliam o uso de miRNAs como biomarcadores
ou drogas. Ainda devemos destacar o crescente número de patentes solicitadas e obtidas
relacionadas aos miRNAs. Uma análise dessas patentes verificou que 49% são relacionadas a
tecnologias para modulação de miRNAs e novas técnicas de administração dos moduladores
de miRNAs, e que a doença mais estudada é o câncer, com mais de 13% dessas patentes (van
Rooij et al., 2012). Esse fato é explicado principalmente pela falta de tratamentos eficazes,
severidade da doença e pela maior facilidade de aprovação de testes clínicos para essa
condição.
Nesse ambiente de rápido crescimento em que diversas oportunidades terapêuticas
são possíveis já se visualiza no mercado de biotecnologia um movimento de grandes empresas
farmacêuticas na direção de colaboração com ou mesmo compra de empresas menores,
como as mencionadas anteriormente. Como exemplos desse movimento podemos citar a
colaboração do grupo Sanofi-Aventis com a empresa Regulus, a compra da empresa SiRNA
pela empresa Merck e a incorporação da empresa Santaris Pharma pela gigante Roche,
resultado de uma transação no valor de 450 milhões de dólares (Grant, 2014). Desse modo
entendemos que o futuro das aplicações terapêuticas baseadas em miRNAs deverá ser no
mínimo interessante, uma vez que grandes esforços acadêmicos e industriais estão sendo
aplicados nessa área.

Tabela 1. Principais moduladores de miRNA sendo desenvolvidos e as empresas responsáveis por essas
drogas.

Método miRNA
Indicação terapêutica Status
de ação alvo
Santaris Pharma (http://www.santaris.com/)
Hepatite C Inibição miR-122 Fase II
Hipercolesteromia Inibição miR-122
miRagen Therapeutics (http://www.miragentherapeutics.
com/)
Falha cardíaca crônica Inibição miR-208/499 Pré-clínico
Remodelamento cardíaco pós-infarto Inibição miR-15/195 Pré-clínico
Policitemia Vera Inibição miR-451 Pré-clínico
Doença de artérias periféricas Inibição miR-92 Otimização

Uso de miRNAs no diagnóstico, prognóstico e terapêutica 203


Indicação terapêutica
Síndrome Cardiometabólica
Fibrose Cardíaca
Mirna therapeutics (http://www.mirnarx.com/)
Câncer
Câncer
Câncer
Regulus Therapeutics (http://www.regulusrx.com/)
Fibrose Hepática
Aterosclerose
Carcinoma Hepatocelular
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204 Introdução ao mundo dos microRNAs
Método miRNA
Status
de ação alvo
Inibição miR-378 Otimização
Reposição miR-29 Otimização
Reposição miR-34 Otimização
Reposição miR-16 Otimização
Reposição Let-7 Otimização
Inibição miR-21 Pré-clínico
Inibição miR-33 Pré-clínico
Inibição miR-21 Pré-clínico
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209
Análise molecular de Capítulo
microRNAs 12
Técnicas para clonagem, análise da
expressão gênica e bancos de dados
para identificação de miRNAs

Dr.a Ana Paula Körbes1 e Dr.a Flávia Cristina de Paula Freitas2

1
Depto. de Genética, UFRGS – RS
2
Depto. de Genética, FMRP, USP – SP

Estruturação do capítulo
1. Introdução
2. Técnicas para clonagem de miRNAs
2.1 Métodos de isolamento e purificação de pequenos RNAs
2.2 Métodos de quantificação
2.3 Estratégias de clonagem de miRNAs
3. Técnicas para análise de expressão gênica
3.1 Northern blot
3.2 Hibridização in situ
3.3 RT-qPCR
3.3.1 Normalização e análise dos dados
3.4 Microarranjos
3.4.1 Normalização e análise dos dados
3.5 Sequenciamento em larga escala
3.5.1 Análise dos dados
3.6 Quantificação das moléculas primárias e precursoras dos miRNAs
4. Bancos de dados para análises de identificação dos miRNAs

Análise molecular de microRNAs 211

 1. Introdução
Os métodos de análises moleculares são ferramentas importantes para compreender
o papel dos microRNAs (miRNAs) na regulação de processos biológicos complexos como o
desenvolvimento, rotas metabólicas, diferenciação e morte celular. Todas as pesquisas que
investigam esses temas visam identificar os miRNAs-chave para esses processos biológicos. Em
linhas gerais, os métodos atuais para identificação de miRNAs podem ser divididos em dois
grupos: (1) as investigações experimentais; e (2) as predições computacionais (Berezikov et
al., 2006; Krützfeldt et al., 2006). A abordagem experimental enfoca primeiro no isolamento e
detecção da expressão de miRNAs e depois na utilização da bioinformática para determinar as
sequências de miRNAs isoladas e sequenciadas. Por outro lado, a abordagem computacional
utiliza algoritmos para primeiro realizar a predição de miRNAs candidatos a partir da
análise de características estruturais de sequências genômicas e depois recorre às técnicas
experimentais para validar os candidatos.
O desenvolvimento de protocolos de clonagem direcional de pequenos RNAs foi
um marco para o estudo de miRNAs, pois permitiu a rápida descoberta de centenas de
sequências em plantas e em animais (Lagos-Quintana et al., 2001; Lau et al., 2001; Reinhart
et al., 2002). A grande vantagem da técnica de clonagem é que ela pode ser utilizada para o
estudo de qualquer organismo, mesmo para os quais haja pouca ou nenhuma informação
genômica disponível. A crescente disponibilidade de sequências de genomas e transcritomas
possibilitou o desenvolvimento de algoritmos de predição de miRNAs, que se tornaram cada
vez mais sofisticados e passaram a integrar plataformas de ferramentas para análise de
miRNAs on-line (Johnson, 2012a; Kang; Friedlander, 2015). Esses esforços foram rapidamente
acompanhados pelo desenvolvimento de protocolos experimentais para a validação e
estudos funcionais dos miRNAs identificados. Procedimentos tradicionalmente usados para
análises de RNAs mensageiros (mRNAs) foram adaptados ao estudo de pequenos RNAs,
tais como os microarranjos, RT-qPCR multiplex e a hibridização in situ (Huang et al., 2011).
Recentemente, a associação de sequenciamento em larga escala com as avançadas ferramentas
de bioinformática permitem um acelerado avanço na descoberta de novos miRNAs. Esse
fato pode ser comprovado pelo grande número de publicações e sequências depositadas nos
principais bancos de dados de miRNAs. A funções dos miRNAs podem agora ser estudadas
através de técnicas mais sofisticadas, que ainda estão sendo desenvolvidas para diferentes
organismos-modelo (Meyers et al., 2006; Jin et al., 2010).
Este capítulo apresenta uma revisão das principais etapas para a clonagem e construção
de bibliotecas de cDNA enriquecidas para transcritos com sequências entre 17 e 24 nucleotídeos
(nt) de tamanho. É nessa fração de pequenos RNAs que se encontram os miRNAs de 21-22 nt.
Com o avanço das técnicas de sequenciamento, bibliotecas de cDNA de pequenos RNAs são
atualmente utilizadas tanto para detecção quanto quantificação de pequenos RNAs. Além
disso, abordaremos os métodos de detecção e quantificação de miRNAs utilizados para a
validação e análise de expressão. Esperamos oferecer uma orientação na escolha da técnica
mais adequada aos objetivos do estudo do pesquisador que inicia suas pesquisas com miRNAs.

2. Técnicas para clonagem de miRNAs

O isolamento e a clonagem de pequenos RNAs de amostras biológicas é o método mais
direto e confiável para a descoberta de novos miRNAs e análise de expressão. Os primeiros
protocolos de clonagem foram desenvolvidos para a identificação de miRNAs em animais

212 Introdução ao mundo dos microRNAs

pelos grupos de Ambros, Bartel e Tuschl e depois adaptados para o uso em plantas (Lagos-
Quintana et al., 2001; Lau et al., 2001; Lee; Ambros, 2001; Reinhart et al., 2002; Sunkar; Zhu,
2004). Atualmente existem vários protocolos de clonagem disponíveis, inclusive como kits
comerciais. As metodologias clássicas de clonagem são também utilizadas nos protocolos
para construção de bibliotecas de sequenciamento em larga escala (Lu et al., 2007; Hafner
et al., 2008; Linnarsson, 2010). Além disso, a clonagem também é de grande importância na
construção de alguns vetores para estudos funcionais dos miRNAs.
A primeira etapa da clonagem é a extração de RNA total de alta qualidade e o isolamento
da fração de RNAs de tamanho pequeno (20-25 nt). Em seguida, realiza-se a adição sequencial
de adaptadores nas extremidades 3’ e 5’ e a transcrição reversa dos fragmentos. Conforme
o método escolhido (descritos na seção 2.3), a adição de adaptadores poderá ocorrer em
simultâneo com a transcrição reversa dos fragmentos. Por último, realiza-se a amplificação
por PCR e a clonagem dos fragmentos em vetores. Os clones individuais da biblioteca de
cDNA resultante são então sequenciados. Alternativamente, os fragmentos gerados pelo PCR
podem ser diretamente sequenciados pelo método tradicional de Sanger ou em larga escala.
Alguns protocolos realizam uma etapa de concatemerização dos insertos após a ligação dos
adaptadores, maximizando o número de pequenos RNAs que poderão ser sequenciados e
identificados a partir de um único fragmento longo (figura 1).

2.1 Métodos de isolamento e purificação de pequenos RNAs

A qualidade do RNA isolado é um dos parâmetros mais críticos para qualquer análise
molecular de miRNAs, por isso é fundamental que o RNA isolado seja de alta qualidade. Um
RNA de alta qualidade deve ser íntegro (livre de degradação), livre de proteínas, nucleases ou

Figura 1. As etapas básicas da clonagem de pequenos RNAs. Primeiro um RNA total de alta qualidade é isolado
e, a partir desse, a fração de pequenos RNAs é obtida. Depois adicionam-se adaptadores nas extremidades 3’ e 5’,
seguindo-se uma reação de transcrição reversa para converter o RNA em cDNA. Em alguns protocolos, a etapa de
adição de adaptadores ocorre simultaneamente à transcrição reversa (ver figura 2). Após a amplificação por PCR, os
fragmentos estão prontos para serem clonados em um vetor ou utilizados em análises de expressão. Alternativamente
(setas pontilhadas), os cDNAs amplificados podem ser concatenados utilizando-se os sítios de restrição incluídos nos
adaptadores.

Análise molecular de microRNAs 213

 inibidores enzimáticos e livre de contaminação com DNA (Bustin et al., 2009). A degradação
do RNA leva ao acúmulo de pequenos fragmentos de RNA que, além de influenciar na
quantificação da fração real de pequenos RNAs, poderão interferir nas etapas da clonagem.
Por outro lado, o DNA genômico residual nas amostras de RNA total é crítico para o processo
de clonagem de miRNAs (Chappell et al., 2005).
Os principais métodos moleculares de análise de miRNAs utilizam RNA total purificado
ou enriquecido para pequenos RNAs. Cabe ressaltar que miRNAs e outros pequenos RNAs
representam uma pequena fração, em torno de 5% a 10%, da massa total de RNA (Devor
et al., 2009). Diversos protocolos para a extração total de RNA podem ser empregados, mas
alguns podem alterar a representatividade da fração de miRNAs (ver nota 1).
Existem dois métodos básicos para o isolamento de RNA: a extração química com
solventes orgânicos (fenol) e a extração baseada em imobilização do RNA em uma matriz de
sílica ou filtro de fibra de vidro (glass fiber filter – GFF). A extração com fenol-clorofórmio
é a que resulta em maior rendimento e, por isso, é o método mais popular. A etapa de
precipitação do RNA deve ser realizada com álcool, pois pequenos RNAs não coprecipitam
com transcritos longos de RNA quando utilizado o cloreto de lítio (LiCl). Um método de
isolamento amplamente utilizado, tanto para estudos de mRNA quanto de miRNAs, faz uso
do reagente orgânico TRIzol® (Invitrogen). Entretanto, um estudo recente demonstrou que
durante a extração com TRIzol® ocorre a perda seletiva de pequenas sequências de RNA
de baixo conteúdo de CG (Kim et al., 2012).
Muitos kits comerciais, baseados em colunas de ligação, foram especialmente
desenvolvidos para permitir a recuperação de pequenas moléculas de RNA a partir de tecidos
ou células de animais e vegetais ou a partir de leveduras e bactérias. Kits de isolamento
de RNA total utilizam colunas de purificação com membranas de silica gel que não ligam
a fração de pequenos RNAs. Atualmente, todas as principais empresas fornecedoras de
reagentes oferecem um kit específico para o isolamento de miRNAs. Alguns kits específicos
para miRNAs, como por exemplo PureLink® (Ambion), miRNeasy Mini (Qiagen), mirPremier®
(Sigma-Aldrich), NucleoSpin® miRNA (Macherey-Nagel) e Quick-RNA™ MicroPrep (Zymo
Research), utilizam colunas de sílica com um protocolo otimizado, efetivamente recuperando
a fração de pequenos RNAs. Conforme o protocolo utilizado, esses kits realizam o isolamento
de uma única fração contendo apenas pequenos RNAs (~17-200 nt), ou de frações separadas
ou combinadas de RNA total e de pequenos RNAs.
Dentre todos os kits, o mirVana® (Ambion) foi um dos mais utilizados em uma
amostra aleatória de publicações (Johnson, 2012b). Esse kit explora as vantagens dos dois
métodos básicos de extração, utilizando uma extração orgânica seguida de imobilização do
RNA em filtros de GFF. Com esse método, é possível realizar uma etapa de enriquecimento
para pequenos RNAs (de 10-200 nt) por meio de duas etapas de filtração sequencial com
diferentes concentrações de etanol. Assim, pode-se obter uma fração altamente enriquecida
para pequenos RNAs ou purificar RNA total contendo pequenos RNAs.
Para alguns tipos de análise molecular, como quantificação da expressão, pode-se
utilizar cDNA sintetizado a partir de RNA total contendo pequenos RNAs quando a quantidade
de material biológico inicial for limitada. O RNA total também poderá ser utilizado para
a clonagem de miRNAs, mas os RNAs longos e abundantes competirão na ligação com as
moléculas adaptadoras (ver nota 2). Em função disso, a utilização de métodos de enriquecimento
para miRNAs ajuda a reduzir o ruído experimental em experimentos como clonagem,
microarranjos e sequenciamento em larga escala. Para tanto, é possível realizar uma etapa

214 Introdução ao mundo dos microRNAs

adicional de isolamento de RNAs de tamanho entre 17 e 24 nt, para separar os miRNAs
maduros de sequências precursoras de miRNA. O método mais eficiente é a separação do
RNA em um gel de poliacrilamida desnaturante (denaturing polyacrylamide gel – dPAGE) e a
posterior extração da banda com a faixa de tamanho desejada, da qual os miRNAs maduros
são purificados (Elbashir et al., 2001; Johnson et al., 2005; Cummins et al., 2006; Lu et al.,
2007; Hafner et al., 2008). Para acelerar esse processo, a Ambion desenvolveu o flashPAGE
Fractionator, um equipamento de eletroforese especializado que utiliza geis pré-moldados (pre-
cast gels) e tampões (buffers) otimizados para o equipamento, que possibilitam o isolamento
direto de uma fração de RNA de 10-40 nt. De acordo com alguns grupos, esse é um método
reproduzível e que permite um rendimento de miRNAs de até 80%, em comparação ao
rendimento variável, que raramente excede 50% do dPAGE convencional (Shingara et al.,
2005). Em geral, podemos observar na literatura que muitos grupos de pesquisa optam por
realizar a extração de RNA total com o kit mirVana e realizar o enriquecimento da amostra
com um dos métodos de fracionamento em gel, sem usar as colunas do kit, visto que já foi
demonstrada a alteração na representatividade de miRNAs após o enriquecimento com
colunas (Redshaw et al., 2013).
Uma variação no método de isolamento de pequenos RNAs com enriquecimento de
amostra foi descrito por Lau, visando melhorar a qualidade do RNA através da eliminação
dos abundantes RNAs transportadores (tRNAs) e ribossomais (rRNAs) e seus produtos de
degradação (Lau, 2008). Esse protocolo utiliza uma coluna de troca iônica (Hitrap Q, GE
Healthcare) para reter RNAs complexados e não complexados com ribonucleoproteínas. A
eluição com concentrações crescentes de sal (acetato de potássio) permite a dessorção de
miRNAs, piRNAs e mRNAs, tRNAs, rRNA em frações distintas. Dessa forma, o RNA de interesse
pode ser isolado ou frações podem ser combinadas para conter dois ou mais tipos de RNA
desejados. Com um objetivo semelhante, outros métodos de redução da quantidade de rRNA
estão disponíveis em kits comerciais como, por exemplo, a linha de produtos RiboMinus
(Invitrogen), GeneRead rRNA Depletion (Qiagen), RiboGone-Mammalian (Clontech), Ribo-
Zero (Illumina), entre outros.
Por fim, um método mais sofisticado de enriquecimento de miRNAs em células animais
consiste na imunoprecipitação de microribonucleoproteínas complexadas com miRNAs e
mRNAs-alvo (complexo RISC). Um exemplo muito utilizado dessa técnica é a imunoprecipitação
de miRNAs associados a proteínas Argonauta (AGO). Nesse protocolo, utilizam-se anticorpos
monoclonais antiAGO imobilizados em uma matriz ou em esferas magnéticas para recuperar o
complexo AGO-miRNA/mRNA-alvo e depois isolar o RNA (Hayashida et al., 2009). As principais
vantagens do método para a clonagem são o alto enriquencimento da amostra para miRNAs
com relevância fisiológica e a baixa contaminação com fragmentos da degradação de tRNAs
e rRNAs, além de possibilitar o estudo dos mRNAs-alvo posteriormente.

Notas
1) Para maior eficiência, os protocolos mais antigos recomendavam o uso de tubos
de reação siliconados, pois os tubos normais podem reter alguns ácidos nucléicos
de baixo peso molecular.
2) As etapas de purificação adicionais quase sempre resultam em alguma redução
na quantidade de RNAs. Dessa forma, é necessário fazer testes de extração com o
material de estudo para ponderar sobre o custo-benefício no resultado almejado.

Análise molecular de microRNAs 215

 2.2 Métodos de quantificação
O método mais simples de quantificação do RNA total isolado é através da medição
da densidade óptica (DO) com um espectofotômetro, que deve ser sensível e adequado à
medição de pequenos volumes, como, por exemplo, NanoDrop (Thermo Scientific), NanoVue
(GE Healthcare) e NanoPhotometer (Implen). Para estimar a pureza da amostra realiza-se
o cálculo da razão A260/A280, que deve ser maior que 1,8 (Bustin et al., 2009).
A integridade do RNA é tradicionalmente avaliada pela separação das diferentes
frações (5S, 18S, 28S) das subunidades de RNA ribossomal (rRNA) por eletroforese, em gel
de agarose de alta resolução (e.g., 4%) ou em um gel de poliacrilamida. A qualidade do RNA
é visualmente estimada pela razão de 28S/18S, que deve ser ~2,0. Valores menores indicam
degradação. Por ser um método subjetivo, a eletroforese tradicional tem sido substituída na
última década pela eletroforese capilar microfluídica (Kirchner et al., 2014). Hoje, a tecnologia
lab-on-chip, eletroforese capilar automatizada em um microchip, é a mais recomendada para
o controle da integridade do RNA. Diferentes instrumentos estão disponíveis comercialmente,
tais como o 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) e o Experion (Bio-Rad Laboratories). Esses
equipamentos calculam a razão de 28S/18S (boa qualidade = ~2,0) a partir da comparação dos
picos e bandas representados em um eletroferograma e um gel virtual, respectivamente, com
um marcador de tamanho e massa de RNA (ladder). Além disso, o software do instrumento
calcula um valor numérico, que varia de 1 a 10 para a integridade do RNA, onde 1 representa
o RNA todo fragmentado e degradado e 10 representa o RNA intacto e não fragmetnado. O
termo que designa esse valor nas análises é RNA integrity number (RIN), no 2100 Bioanalyzer,
e RNA quality index (RQI), no Experion. Para uso com o 2100 Bioanalyzer, o kit Small RNA
Assay foi especialmente desenvolvido para a quantificação precisa de pequenos RNAs de
15-40 nt de amostras de RNA total ou enriquecidas. O kit calcula a concentração de miRNAs
tanto em quantidades absolutas (picogramas – pg) como na porcentagem do total de pequenos
RNAs (%). Como a quantificação da fração de miRNAs na fração total de pequenos RNAs é
questionável e excessivamente influenciada pela integridade do RNA, o kit Small RNA Assay
não deve ser usado como a única metodologia de quantificação ou para a quantificação
exata de miRNAs (Becker et al., 2010).

2.3 Estratégias de clonagem de miRNAs

O procedimento de clonagem é baseado na ligação de adaptadores às moléculas de
pequenos RNAs. Os adaptadores possibilitam a transcrição reversa e a clonagem direcional
dos insertos em vetores ou o sequenciamento direto com oligonucleotídeos que pareiam nas
regiões adaptadoras. É importante salientar que a qualidade dos oligonucleotídeos adaptadores
é um dos parâmetros críticos no processo de clonagem. Como o tamanho dos adaptadores
pode variar de ~20-50 nt, os oligonucleotídeos comprados devem preferencialmente ter
passado por algum método de purificação após a síntese, tal como Reverse Phase Cartridge
Purification (RPC) ou HPLC de fase reversa (Chappell et al., 2005).
Os protocolos existentes dependem das propriedades das extremidades dos miRNAs,
diferindo basicamente na estratégia de ligação dos adaptadores ao fragmento de pequeno
RNA (figura 2). Os métodos de adição de adaptadores são classificados em dependentes ou
independentes do fosfato 5’ e são escolhidos conforme o tipo de miRNA que será clonado. Os
miRNAs (e siRNAs) canônicos, resultantes da clivagem pela endorribonuclease Dicer (uma
RNase do tipo III), apresentam a extremidade livre 5’ monofosfatada (p) e a extremidade
3’ com uma hidroxila (OH). Outra classe de siRNAs presente em Caenorhabditis elegans

216 Introdução ao mundo dos microRNAs

 217
Análise molecular de microRNAs
Figura 2. Estratégias de ligação dos adaptadores 3’ e 5’ para clonagem de pequenos RNAs. Na grande maioria dos protocolos, a etapa de ligação dos adaptadores inicia-se com a
extremidade 3’ dos miRNAs, seguida do adaptador 5’. Os adaptadores 3’ podem ser ligados aos miRNAs através de três métodos distintos, enquanto os adaptadores 5’ são ligados por um
dos dois métodos principais. Note-se que o adaptador 3’ (representado por um retângulo cinza médio) gerado na estratégia de poliadenilação é simplesmente uma pequena cauda poli-A.
*Esse processo é chamado de troca de fita molde porque na transcrição reversa convencional a fita molde é um RNA, mas nesse caso há uma transição: a enzima passa a usar o cDNA
como molde. A molécula resultante é complementar ao cDNA, portanto, tecnicamente ela não é um cDNA. RT: transcrição reversa.
 é produzida pela ação da enzima RNA polimerase dependente de RNA (RNA-dependent
RNA polymerase – RdRP) e possui a extremidade 5’ trifosfatada (Pak; Fire, 2007; Sijen et al.,
2007). Outras modificações podem ainda ser incorporadas durante o processamento dos
miRNAs como, por exemplo, em plantas, onde a extremidade 3’ é metilada logo após o seu
processamento pela DICER-LIKE (Li et al., 2005).
O primeiro passo universal da clonagem é a ligação de uma sequência adaptadora
na extremidade 3’ OH do pequeno RNA, que pode ser realizada de três formas distintas
(figura 2). Os dois primeiros métodos foram desenvolvidos para prevenir a circularização
dos miRNAs durante a reação de ligação com o adaptador 3’. O primeiro método inicia-se
com uma reação de desfosforilação, com uma enzima fosfatase alcalina. Depois, a ligação do
adaptador 3’ é realizada com a T4 RNA ligase em presença de ATP e, em seguida, procede-se
com a refosforilação do fragmento ligado, com uma polinucleotídeo quinase (T4 PNK). O
segundo método consiste em utilizar um adaptador 3’ pré-adenilado na sua extremidade 5’ e
bloqueado na sua extremidade 3’ com um nucleotídeo terminador, como um dideoxinucleotídeo
(e.g., ddC). A pré-adenilação do adaptador serve de substrato para a T4 RNA ligase e elimina
a necessidade de ATP, enquanto que a extremidade bloqueada impede a concatemerização
dos adaptadores. Alguns protocolos utilizam nessa etapa uma ligase especial, a T4 RNA ligase
2 ou a versão truncada K227Q (New England Biolabs), que é otimizada para a ligação de
extremidades 5’ pré-adeniladas e que permite a clonagem de miRNAs com extremidades
metiladas com eficiência semelhante a miRNAs não modificados (Zhuang et al., 2012). O
terceiro método consiste na poliadenilação da extremidade 3’, criando uma extensão para
atuar como um adaptador para um oligo(dT) na etapa posterior de transcrição reversa.
Embora simples, esse último método não funciona bem para a clonagem de miRNAs de
plantas, pois a metilação da extremidade 5’ bloqueia a ação da poli(A) polimerase.
A próxima etapa da clonagem é a ligação do segundo adaptador, na extremidade 5’ do
microRNA. Esse procedimento pode ser realizado através de dois métodos, dependendo de
como o primeiro adaptador foi adicionado. Se o método de ligação foi utilizado, normalmente
a segunda etapa também será com ligação, dependente do monofosfato 5’ do miRNA. A
ligação do adaptador 5’, que contém o grupamento OH na sua extremidade 3’, necessário
para a ligação ao miRNA, é realizada com a T4 RNA ligase na presença de ATP. Se o objetivo
da clonagem incluir pequenos RNAs com extremidade 5’ trifosfatada, pode-se adicionar uma
etapa de desfosforilação antes da ligação, para gerar extremidades monofosfatadas (e.g., com
a enzima 5’ RNA Polifosfatase), que permitem a ligação do adaptador. Em seguida, o cDNA
é sintetizado com um oligonucleotídeo complementar ao adaptador 3’ e uma transcriptase
reversa.
Contudo, se o primeiro método escolhido foi o de poliadenilação, o adaptador 5’ será
adicionado pelo método de troca de fita molde (template switching). Essa estratégia baseia-
se no fato de que algumas transcritases reversas adicionam vários nucleotídeos extras na
extremidade 3’ do cDNA recém-sintetizado. Como esses nucleotídeos extras não pareados são
geralmente deoxicitidinas, usa-se um adaptador contendo uma sequência com poli(G) para
induzir a transcritase reversa a continuar a síntese a partir do adaptador 5’, incorporando a
sequência dele no cDNA fita simples. Essa tecnologia é utilizada no kit comercial de síntese de
cDNA SMART da Clontech (Zhu et al., 2001). Esse método é independente do monofosfato 5’ e
permite a clonagem de todos os tipos de pequenos RNAs de uma amostra, tais como miRNAs,
siRNAs, piRNAs, entre outros. Os kits de clonagem miRCat e miRCat-33 (IDT technologies)

218 Introdução ao mundo dos microRNAs

reúnem os protocolos e componentes necessários para a clonagem 5’ fosfato dependente e
fosfato independente, respectivamente.
Após a ligação dos adaptadores e da transcrição reversa, a população de cDNA resultante
é amplificada por PCR. O número de ciclos da PCR deve ser otimizado, observando-se que
não se deve ultrapassar 30 ciclos, para não introduzir distorções na proporção de pequenos
RNAs (Hafner et al., 2008). Os fragmentos amplificados podem ser diretamente inseridos em
qualquer vetor de clonagem ou primeiro concatenados em fragmentos maiores. A etapa de
concatenação é realizada através da digestão do cDNA com enzimas de restrição, cujos sítios
foram introduzidos nos adaptadores, e posterior ligação com T4 DNA ligase. Essa estratégia
é derivada da metodologia Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) desenvolvida na década
de 1990, e sua principal vantagem é aumentar a informação obtida a partir de um clone
sequenciado pelo método tradicional de Sanger. Os fragmentos simples ou concatenados são
inseridos em vetores comerciais de clonagem. Os vetores mais frequentemente utilizados na
construção de bibliotecas são pCR2.1-TOPO e TOPO-TA (Invitrogen) ou pGEMT-easy (Promega).
Além disso, alguns kits, como o ExactSTART, incluem vetores de clonagem próprios (e.g.,
pCDC1-K Cloning-Ready).
A biblioteca de cDNA construída poderá ser usada para diversas aplicações. Se o
objetivo da clonagem for a caracterização das diferentes sequências de miRNAs da amostra,
procede-se com o sequenciamento tradicional de clones individuais. Uma limitação da técnica
é que miRNAs pouco expressos ou presentes em apenas algum tipo celular ou condição
específica são mais difíceis de serem identificados por clonagem em vetores. Em princípio,
essa limitação pode ser superada utilizando-se o sequenciamento direto em larga escala de
bibliotecas de pequenos RNAs, sem a utilização de vetores, preparadas a partir de diferentes
tipos de amostras.
Os métodos clássicos descritos acima são laboriosos e demorados, pois envolvem
purificações em gel para remover o excesso de adaptadores entre as etapas de adição de
adaptadores. Para acelerar todo o processo, que tradicionalmente leva de uma a duas
semanas para ser concluído, e para reduzir a perda de material em cada purificação de
gel, foram desenvolvidos protocolos híbridos, que levam cerca de dois dias. Na plataforma
de ferramentas ExactSTART (EpiBio), uma primeira etapa opcional consiste no tratamento
da fração enriquecida com pequenos RNAs com uma 5’ RNA polifosfatase, para converter
todos os RNAs trifosfatados em monofosfatados (Vaidyanthan et al., 2009). Em seguida,
a estratégia de poliadenilação é utilizada na extremidade 3’ e um adaptador é ligado na
extremidade 5’ com T4 RNA ligase. Os kits ExactSTART podem ser usados para a clonagem
de pequenos RNAs de plantas, mas nesse caso a fração de miRNAs estará sub-representada
como consequência da baixa eficiência de poliadenilação deles. O fabricante anuncia que
todo o processo pode ser concluído em menos de um dia (4-6 horas).
Com o surgimento do sequenciamento em larga escala, outras modificações técnicas
foram introduzidas em algumas etapas da preparação das bibliotecas, muitas delas visando
aumentar a eficiência de ligação dos adaptadores (Lu et al., 2007; Malone et al., 2012; Lee; Yi,
2014). Em geral, a maioria das adaptações implica na utilização de equipamentos e reagentes
sofisticados de kits comerciais, o que tornou a preparação mais onerosa. Pensando nisso,
McGinn e Czech desenvolveram uma variação da preparação dessas bibliotecas com custos
reduzidos, de fácil adaptação para o uso com as principais plataformas de sequenciamento
disponíveis (McGinn; Czech, 2014).

Análise molecular de microRNAs 219

 3. Técnicas para análise de expressão gênica

3.1 Northern blot

O método de northern blot (ou RNA blot) foi um dos primeiros métodos a serem
empregados na análise da expressão de RNAs e sua principal vantagem é a precisão na
identificação do peso molecular do RNA-alvo. Os procedimentos envolvidos na técnica de
northern blot são em geral simples e fazem parte da rotina da maioria dos laboratórios de
biologia molecular. E por não requerer grandes equipamentos ou análises complexas, é
uma técnica ainda bastante usada, apesar de outras tecnologias terem sido desenvolvidas.
O primeiro passo na execução do northern blot é a extração do RNA total a partir de uma
amostra de tecido ou cultivo celular. Tanto o RNA total como apenas a fração de pequenos
RNAs (< 200 nt) podem ser utilizados nesse procedimento. Em seguida, o RNA (total ou a
fração de pequenos RNAs) é aplicado em um gel de agarose ou poliacrilamida e submetido à
eletroforese, resultando na separação dos RNAs de comprimentos diferentes. As moléculas de
RNA são transferidas do gel para uma membrana de nylon ou nitrocelulose por capilaridade
ou por vácuo, mantendo o mesmo padrão de separação que as moléculas de RNA apresentavam
no gel. A membrana que agora contém as moléculas de RNA é incubada com uma sonda
marcada e cuja sequência é complementar a uma parte do RNA-alvo ou complementar à
molécula inteira. No caso dos miRNAs, é comum utilizarem-se sondas complementares à
molécula inteira do miRNA-alvo, ou seja, as sondas, em geral, possuem o mesmo comprimento
que seu miRNA-alvo. Mais detalhes das etapas de execução desse procedimento podem ser
encontrados no artigo de Varallyay e colaboradores (2008).
O desenho de sondas específicas para detecção dos miRNAs-alvo é possível quando
se conhece a sequência da molécula madura. Em situações especiais nas quais a sequência
madura do miRNA não é conhecida mas a sequência do RNA-alvo sim, é possível aplicar
o método descrito por Hamilton e Baulcombe, originalmente aplicado para siRNAs (1999).
Nesse trabalho, os autores isolaram a fração de RNAs com baixo peso molecular, separaram
os fragmentos de tamanhos diferentes por eletroforese e imobilizaram os fragmentos (siRNAs)
em membranas. Para a marcação do mRNA-alvo foram utilizadas sondas marcadas com
32
P. Antes de serem hibridadas com o siRNA imobilizado na membrana, as sondas foram
hidrolisadas em fragmentos de aproximadamente 50 nt. A identificação do comprimento
do siRNA foi estimada através da comparação do padrão de migração de oligonucleotídeos
de DNA marcados com 33P (Hamilton; Baulcombe, 1999).
Diferentes tipos de marcações foram utilizados nas sondas para a detecção de transcritos
de RNAs. Os primeiros protocolos de northern blot faziam uso de sondas radioativas que
eram marcadas com radioisótopos como 32P (Trayhurn, 1996). No entanto, a maioria das
instituições de pesquisa proibiu o uso de material radioativo porque oferecia riscos à saúde
dos pesquisadores e, assim, houve necessidade de se substituir as sondas radioativas por
não radioativas. Ramkissoon e colaboradores (2006) compararam o poder de resolução de
ambas as sondas, radioativas e não radioativas, na detecção de miRNAs em experimentos de
northern blot com diferentes linhagens celulares. As sondas não radioativas foram marcadas
com digoxigenina (DIG), que é um esteroide encontrado exclusivamente em plantas do
gênero Digitalis (revisado por Ganapaty et al., 2003) e que é reconhecido por um anticorpo
altamente específico conjugado a um sistema repórter (Holtke; Kessler, 1990). Ao comparar
os resultados obtidos, os autores observaram que a ação detectora de ambos os tipos de
sondas foi equivalente em todas as linhagens celulares testadas (Ramkissoon et al., 2006).

220 Introdução ao mundo dos microRNAs

 A marcação de sondas com biotina também emergiu como uma alternativa ao uso
da radioatividade. Huang e colaboradores (2014) desenvolveram um protocolo utilizando
sondas biotiniladas em experimentos de northern blot para estudar miRNAs das espécies
de plantas Arabidopsis thaliana e Oryza sativa. Além de serem mais seguras, as sondas
marcadas com biotina podem ser estocadas por até seis meses a 4 °C e reutilizadas por até
100 vezes, enquanto as sondas radioativas podem ser armazenadas por no máximo um mês
e precisam ser remarcadas a cada uso. Outra vantagem das sondas biotiniladas é que elas
são mais sensíveis e requerem menor quantidade de RNA total: 2-5 µg, enquanto alguns
protocolos chegam a usar 20-60 µg (Huang et al., 2014). A detecção das sondas biotiniladas
é feita com uma solução de estreptavidina conjugada com uma peroxidase que pode ser
encontrada no produto Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module (Thermo Scientific).
O comprimento diminuto dos miRNAs é um desafio no desenho de sondas e na
padronização das condições ideais de realização das técnicas de expressão. Com o objetivo
de melhorar o poder de resolução e a especificidade das sondas utilizadas no northern
blot, os pesquisadores passaram a utilizar ácidos nucleicos “trancados” (do inglês, locked
nucleic acid, LNA). LNA é um análago ao RNA que apresenta uma modificação química na
conexão entre o açúcar e o fosfato que compõem a cadeia nucleotídica (Obika et al., 1997;
Koshkin et al., 1998). Essa alteração na estrutura do nucleotídeo confere maior estabilidade
térmica ao oligonucleotídeo quando pareado com suas moléculas-alvo (Koshkin et al., 1998;
Braasch; Corey, 2001; Kurreck et al., 2002; Frieden et al., 2003; Petersen; Wengel, 2003).
Valoczi e colaboradores (2004) exploraram as propriedades de hibridação de moléculas
LNA com seu RNA-alvo ao testarem sondas de DNA e sondas quiméricas DNA-LNA (ambas
marcadas com fosforamidato) em animais e plantas. A resolução na detecção de miRNAs
maduros aumentou ao menos 10 vezes em comparação às sondas de DNA; simultaneamente,
essas sondas modificadas com LNA mostraram-se altamente específicas. Além de serem
altamente eficientes como sondas de northern blot, as mesmas sondas podem ser usadas
para hibridação in situ e em microarranjos (Valoczi et al., 2004). Outro trabalho combinou
a especificidade das sondas modificadas com LNA com a marcação com DIG. Os resultados
obtidos revelaram que essa combinação reduz o tempo necessário para a realização desse
tipo de experimento e, assim como as sondas biotinilidas, as sondas modificadas com LNA
e marcadas com DIG podem ser armazenadas por ao menos seis meses (Kim et al., 2010).
Outros trabalhos reportaram resultados semelhantes quanto ao aumento da especificidade
e redução no tempo necessário para execução dos experimentos de northern blot quando
sondas modificadas com LNAs foram utilizadas (Varallyay et al., 2008; Gao; Peng, 2011;
Lopez-Gomollon et al., 2012).
Nos últimos anos, o protocolo de execução do northern blot foi aprimorado, de modo
que o uso de sondas não radioativas e modificadas com LNAs fez dessa uma técnica mais
segura e precisa na detecção de transcritos de miRNAs. No entanto, a grande desvantagem do
northern blot é o fato de ser uma técnica de pequena escala, ou seja, cada sonda desenhada
é específica para um miRNA. Isso torna o uso do northern blot inviável em estudos em que o
objetivo é analisar a expressão de centenas de miRNAs. Além disso, uma grande quantidade
de RNA total (ao menos 2-5 µg) ou de pequenos RNAs (1 µg) é necessária para a realização da
técnica. Assim, dependendo da quantidade de RNA disponível e da escala do estudo, o uso de
técnicas mais sensíveis e de larga escala como a transcrição reversa seguida pela reação em
cadeia da polimerase com caráter quantitativo (RT-qPCR), microarranjos e sequenciamento
de nova geração seria mais adequado.

Análise molecular de microRNAs 221

 3.2 Hibridização in situ
A técnica de hibridação in situ tem por finalidade a localização de transcritos em
tecidos ou células em cultivo. Identificar o exato local em que um miRNA está presente sugere
sua importância para determinado órgão e sua participação em um processo biológico. O
método de hibridação in situ consiste no uso de sondas marcadas para localizar o RNA-alvo
em um tecido devidamente preparado e fixado. Existem inúmeros protocolos de preparação
e fixação que variam de acordo com as características dos tecidos e células. Os protocolos de
preparação e fixação de tecidos não serão descritos aqui, pois além de serem muito variados,
discuti-los estaria além do escopo deste capítulo.
O pequeno comprimento dos miRNAs é mais uma vez um desafio para o uso da
técnica de hibridação in situ na localização dos transcritos de miRNAs. Os pesquisadores
se inspiraram nos experimentos de northern blot e fizeram uso de sondas modificadas com
LNAs, pois já se sabia que os LNAs aumentavam a especificidade e a estabilidade térmica do
pareamento entre a sonda e o RNA-alvo (Koshkin et al., 1998; Braasch; Corey, 2001; Kurreck
et al., 2002; Frieden et al., 2003; Petersen; Wengel, 2003). Wienholds e colaboradores (2005)
utilizaram sondas modificadas com LNA e marcadas por DIG para localizar a expressão
de 115 miRNAs em embriões de peixes. Outro trabalho extremamente importante testou
diferentes condições na execução do ensaio de hibridação in situ também em embriões
de peixes. Primeiro, a habilidade de detecção de sondas de DNA convencionais e sondas
modificadas com LNA foram comparadas e observou-se que as sondas convencionais não são
capazes de hibridar com os miRNAs expressos em embriões de peixes. Além disso, diferentes
comprimentos de sondas modificadas com LNA foram testados e notou-se que sondas de
22 a 12 nt de comprimento são capazes de identificar o miRNA-alvo mas que perdem essa
capacidade se seu comprimento for diminuído para 10 a 8 nt. Os autores defendem o uso
de sondas mais curtas, pois isso ajudaria na normalização da temperatura de pareamento
entre a sonda e o miRNA-alvo e facilitaria a execução de ensaios de hibridação in situ em
larga escala. Para testar o protocolo em outra espécie, os pesquisadores realizaram ensaios
de hibridação in situ em embriões de camundongos, localizando a expressão de 15 miRNAs
(Kloosterman et al., 2006). Sondas modificadas com LNA e marcadas com DIG também podem
ser usadas em ensaios de hibridação in situ para localizar transcritos de miRNAs em tecidos
congelados, conforme demostrado por Song e colaboradores (2010).

3.3 RT-qPCR
Uma técnica frequentemente encontrada como parte da rotina de laboratórios, a RT-
qPCR é relativamente simples e tem sido usada para avaliar a expressão de miRNAs. A sigla
“RT” vem de transcrição reversa (do inglês, reverse transcription), que é a primeira etapa
da técnica. A sigla “PCR” é a abreviação da expressão em inglês Polymerase Chain Reaction
(ou Reação em Cadeia da Polimerase). A PCR pode ser qualitativa, na qual se verifica a
presença ou ausência de um transcrito; ou quantitativa, quando é possível acessar os níveis
de expressão do transcrito-alvo. Aqui será discutido o uso da PCR quantitativa ou PCR em
tempo real, que é abreviada por RT-qPCR. Mais informações sobre as etapas desse método
podem ser encontrados na revisão de Garibyan e Avashia (2013).
Um dos desafios encontrados na análise da expressão de miRNAs por RT-qPCR é o
comprimento curto dessas moléculas. Uma saída foi aumentar o comprimento dos miRNAs,
de modo que o cDNA produzido seja longo o suficiente para ser amplificado por qPCR.
Existem dois métodos bem estabelecidos que garantem o aumento do comprimento dos

222 Introdução ao mundo dos microRNAs

miRNAs: a poliadenilação e o uso de iniciadores stem-loop. O método de poliadenilação
consiste em adicionar uma cauda poli(A) em todas as moléculas de RNA da amostra; essa
cauda poli-A serve de sítio de ancoramento para um iniciador reverso universal (oligo dT)
utilizado na síntese do cDNA pela enzima transcriptase reversa (Fiedler et al., 2010) (figura
3). Em seguida, a amplificação por qPCR é feita utilizando-se um iniciador direto (forward
primer) específico para o miRNA-alvo e um iniciador universal reverso (reverse universal
primer), complementar à extremidade 5’ do iniciador reverso universal. A reação de detecção
é baseada em fluoróforos intercalantes como, por exemplo, o SYBR® Green, comercializado
por diversas companhias (Life Technologies, Sigma-Aldrich, Qiagen).
O outro método que leva ao aumento do comprimento dos miRNAs maduros faz uso
dos iniciadores stem-loop. Os iniciadores stem-loop são específicos para cada miRNA e são
desenhados de modo que sua porção 3’ seja complementar aos seis últimos nucleotídeos
da extremidade 3’ do miRNA-alvo. Dessa maneira são produzidos cDNAs correspondentes
apenas ao miRNA-alvo cujo iniciador stem loop específico foi utilizado na síntese. Na etapa
de amplificação por qPCR utiliza-se um iniciador reverso universal e um iniciador direto
específico para o miRNA-alvo. A detecção dos níveis dos transcritos pode ser feita com base na
fluorescência emitida por um agente intercalante como SYBR® Green ou pela sonda Taqman
(Kramer, 2011; Varkonyi-Gasic; Hellens, 2011; Chen et al., 2005) (figura 4).
A grande desvantagem do SYBR® Green está na sua inespecificidade. O SYBR® Green
aumenta sua fluorescência ao se ligar a moléculas de DNA dupla-fita e essa propriedade
é utilizada na detecção de produtos de PCR. No entanto, o SYBR® Green se liga a qualquer
molécula de DNA dupla-fita e, assim, não discrimina entre diferentes produtos de PCR ou de
pareamento indesejado entre os iniciadores (chamado de primer-dimers) (Benes; Castoldi,
2010). Apesar de ser um método mais caro, as sondas Taqman agem de maneira mais específica
que o SYBR® Green. Trabalhos que usaram stem loop e a sonda Taqman na avaliação da
expressão de miRNAs relataram maior especificidade e eficiência na reação de PCR para
miRNAs em relação ao método da poliadenilação, além da otimização da temperatura de
pareamento entre os iniciadores e as moléculas de cDNA (Chen et al., 2005; Kramer, 2011;
Mestdagh et al., 2008).
A vantagem do método da poliadenilação é que todo miRNA presente na amostra
será poliadenilado e submetido a reação com a transcriptase reversa. Assim, a amostra de
cDNA sintetizada representará todos os miRNAs presentes na amostra de RNA inicial e, por
isso, pode ser usada na detecção dos níveis de expressão de diversos miRNAs. Nesse aspecto,
o método de poliadenilação oferece maior flexibilidade quando comparado ao método dos
iniciadores stem loop. No entanto, é possível usar um conjunto variado de iniciadores stem
loop na síntese de cDNA, a exemplo do que foi publicado por Mestdagh e colaboradores
(2008). Nesse trabalho, os pesquisadores utilizaram o produto MegaplexTM RT Primers (Life
Technologies), que oferece um pool de iniciadores stem loop para todos os miRNAs conhecidos
para humanos e roedores. Desse modo, diversos miRNAs estariam representados na amostra
de cDNA e seus níveis de expressão poderiam ser acessados pela qPCR.
A RT-qPCR convencional é uma técnica cara e de pequena escala, já que os iniciadores
devem ser desenhados um a um e são específicos para cada miRNA. Para superar o alto
custo e a pequena escala da técnica de RT-qPCR, pesquisadores têm feito uso de dispositivos
microfluídicos que permitem a realização da qPCR em uma escala maior e com volume
menor de reação. Um exemplo desses dispositivos é o Fluidigm dynamic array systems,
que consiste em circuitos fluídicos integrados por válvulas e canais interconectados que

Análise molecular de microRNAs 223

 Figura 3. Método de poliadenilação dos miRNAs. Uma cauda poli-A é adicionada na molécula de miRNA maduro
pela enzima polimerase poli-A. Em seguida, um iniciador universal complementar à cauda poli-A é utilizado na síntese
do cDNA por transcrição reversa. As moléculas de cDNA sintetizadas por esse método são em geral submetidas a
quantificação por PCR em tempo real, com uso de fluoróforos intercalantes como, por exemplo, o reagente SYBR® Green.

Figura 4. Método dos iniciadores stem loop para a síntese de cDNAs a partir de miRNAs maduros. Iniciadores stem
loop específicos aos miRNAs-alvo são utilizados na síntese do cDNA por transcrição reversa. As moléculas de cDNA
sintetizadas podem ser quantificadas por PCR em tempo real usando-se dois métodos: agentes intercalantes ou sondas
Taqman. Os agentes intercalantes, como o SYBR® Green, ligam-se às moléculas de cDNA dupla-fita e emitem fluorescência
que é capturada e utilizada na quantificação dos transcritos de miRNA. As sondas Taqman são sondas específicas marcadas
com uma molécula repórter que emite fluorescência durante a síntese da molécula complementar ao transcrito-alvo.
Assim, os dois métodos diferem no momento da amplificação em que os níveis dos transcritos são medidos. As reações
podem ser feitas em placas convencionais de PCR, em tempo real, com 96 ou 394 poços; ou, ainda, em maior escala,
utilizando-se dispositivos microfluídicos em que é possível analisar a expressão de até 96 miRNAs em oito amostras.

224 Introdução ao mundo dos microRNAs

permitem controlar o movimento de moléculas biológicas e reagentes para dentro de
microcâmaras (Jang et al., 2011; Melin; Quake, 2007). Com esse dispositivo, a expressão de até
96 miRNAs pode ser medida em uma única corrida. Além disso, o volume de reação é de 10
nanolitros por microcâmara, o que reduz os gastos com reagentes (na RT-qPCR convencional,
utilizam-se 10-20 microlitros). Em um estudo comparativo, Jang e colaboradores (2011)
demonstraram que os resultados obtidos com o Fluidigm são altamente correlacionados
com os dados gerados por RT-qPCR convencional. Assim, os dispositivos microfluídicos
são uma opção atrativa para a detecção de miRNAs por analisarem dezenas de miRNAs
simultaneamente, reduzirem os custos com reagentes e ainda manterem o alto poder de
resolução da RT-qPCR (figura 4).
Um problema da técnica de RT-qPCR em larga escala é que as condições ideais
de amplificação para cada miRNA podem variar bastante por causa das diferenças nas
sequências dos iniciadores. Alguns pesquisadores têm superado esse inconveniente
através da incorporação de LNA na sequência dos iniciadores (Pritchard et al., 2012).
Cada LNA incorporado aumenta a temperatura de pareamento do iniciador com o cDNA
em aproximadamente 5 °C, dependendo da posição da LNA no oligonucleotídeo iniciador.
Consequentemente, iniciadores modificados com LNA podem ser desenhados de modo que
as temperaturas de pareamento satisfaçam um determinado intervalo (Benes; Castoldi,
2010). Outra vantagem do uso de iniciadores modificados com LNA é que são capazes de
discriminar entre miRNAs de uma mesma família, ainda que a diferença entre eles seja
de apenas um nucleotídeo (Raymond et al., 2005).

3.4 Normalização e análise dos dados.

O objetivo da normalização dos dados obtidos pela técnica de RT-qPCR é corrigir possíveis
diferenças entre as amostras, de modo que a real expressão do miRNA-alvo seja medida;
por isto, a escolha do RNA normalizador é crucial e deve-se optar por um transcrito que seja
afetado minimamente pelas diferentes condições biológicas. A estratégia de normalização
mais utilizada para os dados de RT-qPCR é o uso de um ou mais RNAs-controle, no caso dos
miRNAs, é comum o uso de pequenos RNAs nucleolares. No entanto, Peltier e colaboradores
(2008) investigaram quais RNAs apresentaram expressão mais estável entre um conjunto de
amostras e observaram que alguns miRNAs, e não pequenos RNAs nucleolares, seriam mais
adequados para cumprir o papel de normalizador para aquele conjunto de amostras, pois
apresentavam perfis de expressão mais estáveis. Programas como geNorm (Vandesompele et
al., 2002) e NormFinder (Andersen et al., 2004) avaliam a expressão de diferentes transcritos
e apontam os RNAs com menor variação entre diferentes amostras, que poderiam ser usados
como normalizadores no cálculo da expressão de miRNAs.
Há dois métodos de se calcular a expressão de um transcrito a partir de dados de
RT-qPCR: quantificação absoluta e quantificação relativa. A quantificação absoluta calcula
o número de cópias de um transcrito. A quantificação relativa representa os valores de
expressão do RNA-alvo em relação à expressão de um calibrador interno. A quantificação
relativa é mais comumente usada e aplicada de acordo com o método comparativo Ct,
também conhecido como 2 . Schmittgen e Livak (2008) escreveram uma revisão sobre o
método comparativo de Ct e mais informações sobre análise dos dados de qPCR podem ser
encontrados no trabalho de Pfaffl (2001).

Análise molecular de microRNAs 225

 3.5 Microarranjos
Microarranjo foi uma das primeiras técnicas de larga escala a ser utilizada na análise
da expressão de genes e de miRNAs. Nesse método, as moléculas de RNA são marcadas com
fluorescência e hibridadas com sondas impressas em uma lâmina de vidro; em seguida essa
lâmina é digitalizada para recuperar a informação dos RNAs expressos na amostra e os dados
gerados são processados (figura 5). Em comparação às técnicas discutidas anteriormente
(northern blot, hibridação in situ e RT- qPCR), os procedimentos envolvidos na técnica de
microarranjo são mais laboriosos, a análise dos dados é complexa e requer conhecimentos
avançados em estatística e bioinformática. Detalhes dos passos de execução da técnica de
microarranjos podem ser encontrados nos trabalhos de Thomson e colaboradores (2004)
e de Ruan e Li (2009).
O passo de marcação das moléculas de RNA é crucial na obtenção de dados de qualidade,
pois o uso de técnicas de marcação tendenciosas podem comprometer os resultados. Nesse
sentido, diversos métodos de marcação das moléculas de miRNAs têm sido desenvolvidos com
o objetivo de se alcançar máxima eficiência na marcação, obter sinal de qualidade e evitar
marcação tendenciosa. Moléculas fluorescentes podem ser adicionadas diretamente nas
moléculas de miRNA ou incorporadas indiretamente às moléculas de cDNA obtidas a partir
dos miRNAs por transcrição reversa. Existem dois tipos de marcações diretas: a marcação
direta enzimática e a marcação direta química. No primeiro método de marcação direta
enzimática, a enzima T4 RNA ligase adiciona um nucleotídeo marcado com um fluoróforo
na extremidade 3’ do miRNA. Outro exemplo de marcação direta enzimática consiste na
adição de uma sequência de nucleotídeos [por exemplo, uma cauda poli(A)] na extremidade
3’ do miRNA; em seguida, essa sequência de nucleotídeos é ligada por um oligonucleotídeo

Figura 5. Método de análise da expressão de miRNAs por microarranjo. O esquema apresenta a sequência de
eventos de um experimento por microarranjo. Inicialmente, as moléculas de RNAs pequenos são isoladas. Em seguida
são marcadas com fluorescência e hibridadas com sondas complementares previamente ancoradas a uma lâmina. Após
a hibridação, a imagem da lâmina é capturada e segue-se a análise dos dados.

226 Introdução ao mundo dos microRNAs

complementar marcado com fluorescência (Git et al., 2010). A marcação por ação da enzima
T4 RNA ligase é amplamente utilizada, mas sabe-se que a ação dessa enzima pode favorecer
algumas sequências de RNAs em detrimento de outras (Ohtsuka et al., 1977; Romaniuk et
al., 1982; Nelson et al., 2008).
Além desses métodos, há também o de marcação direta por modificação química
que consiste na etiquetagem (labelling) do grupo 3’ OH do miRNA maduro com algum
reagente químico, como a platina, por exemplo. A grande vantagem desse método é que a
marcação direta da extremidade 3’ do miRNA não é influenciada pela sequência do RNA;
assim, todos os miRNAs têm as mesmas chances de serem marcados (Li; Ruan, 2009). Apesar
dessa vantagem, outros pesquisadores alertaram para a produção de sinais espúrios ao se
empregarem produtos inespecíficos como a platina para marcar o RNA; por serem mais
abundantes, os RNAs ribossomais e transportadores acabavam sendo marcados também
(Thomson et al., 2004).
A marcação indireta é particularmente interessante quando não é possível conseguir
quantidades suficientes de miRNAs para realizar o microarranjo. Nesse método, o alvo
para a marcação não é o próprio miRNA, mas o produto gerado pela transcrição reversa.
As vantagens desse método são: 1) maior estabilidade do cDNA em relação aos miRNAs; 2)
maior chance de que miRNAs pouco expressos sejam analisados, já que a marcação acontece
no passo de síntese do cDNA. No entanto, o uso de iniciadores randômicos (random primers)
na transcrição reversa frequentemente introduz erros nas moléculas de cDNA e, assim,
atrapalha a hibridação entre o cDNA marcado e a sonda, deturpando os resultados (Li; Ruan,
2009). Outro método de marcação indireta envolve a marcação de produtos de RT-PCR a
partir de miRNAs. Nesse método, dois adaptadores são adicionados nas extremidades 3’ e
5’ dos miRNAs e servem de sítio de ligação para os iniciadores que serão utilizados na RT-
PCR. Os iniciadores são marcados com biotina ou fluorescência, o que resulta na marcação
dos produtos amplificados na PCR. Um ponto fraco dessa técnica é que a presença de fitas
antissenso pode interferir no processo de hibridação entre a fita senso e as sondas (Li; Ruan,
2009). Cada método de marcação das moléculas de miRNA tem pontos fortes e pontos fracos, o
que não invalida o uso de nenhum deles. No entanto, é importante conhecer as características
de cada método para escolher aquele mais adequado a cada situação estudada. Além disso,
os inconvenientes de cada método devem ser levados em consideração no momento de
analisar e interpretar os dados de expressão gerados.
Nos microarranjos, assim como nas outras técnicas discutidas anteriormente, os
desafios impostos pelo comprimento curto dos miRNAs são superados com o uso de sondas
modificadas com LNAs. Como centenas de miRNAs podem ser analisados de uma só vez, a
temperatura de pareamento das centenas de sondas pode variar mais de 20 °C entre si. Castoldi
e colaboradores (2006) resolveram esse problema usando sondas modificadas com LNAs. A
proporção de LNAs na sonda pode ser calculada de modo que a temperatura de pareamento
das sondas que compõem as lâminas de hibridação seja uniforme (Baskerville; Bartel, 2005).
A normalização da temperatura de pareamento das sondas permite equalizar as condições
de hibridação adequada para todos os miRNAs, que cobrem um intervalo de 45 °C a 74 °C. O
uso das sondas modificadas com LNAs também aumenta a especificidade de hibridação, o
que é bastante útil na discriminação entre miRNAs membros da mesma família, já que muitas
vezes esses diferem um do outro por apenas um nucleotídeo (Roush; Slack, 2008; Griffiths-
Jones, 2004). Assim, o uso de sondas com LNA garante maior afinidade de pareamento com o

Análise molecular de microRNAs 227

 miRNA marcador, permite a distinção entre membros muito similares de uma mesma família
de miRNAs e padroniza a temperatura de pareamento das sondas (Git et al., 2010).

3.6 Normalização e análise dos dados

A análise da expressão de genes e miRNAs avaliadas pela técnica de microarranjos
começa pela captura de imagens da lâmina; nesse processo, os pontos de fluorescência são
capturados por um aparelho de digitalização (scanner) e em seguida é feita a identificação dos
miRNAs e seus níveis de expressão. Os parâmetros utilizados no escaneamento das lâminas
devem ser sempre os mesmos, para que diferentes experimentos sejam comparáveis entre
si. Depois é necessário corrigir os valores de fluorescência calculados para os pontos de
hibridação, de modo a descontar a intensidade inerente da própria lâmina (background). O
próximo passo é normalizar os valores de intensidade de fluorescência, descontando diferenças
de incorporação do corante, de hibridação entre o miRNA e a sonda e do próprio processo de
digitalização (Yin; Zhao, 2007). Após a normalização, as razões entre as amostras e a referência
são calculadas e transformadas em log2, associando assim um valor de expressão para cada
miRNA. Entre os programas usados na etapa de normalização e de cálculo diferencial estão
as bibliotecas desenvolvidas na plataforma R, como parte dos pacotes do Bioconductor
(http://www.bioconductor.org/).
Centenas de trabalhos já foram publicados usando a técnica de microarranjos para
quantificar mRNAs e miRNAs; assim, uma de suas grandes vantagens é o fato de estar bem
estabelecida e de seus aspectos positivos e negativos serem bem conhecidos. A vantagem que
o microarranjo tem em relação às técnicas como RT-qPCR e northern blot é ser uma técnica
de larga escala em que se pode investigar a expressão de centenas de miRNAs de uma só vez.
A técnica de microarranjos é muito mais barata que o sequenciamento de nova geração e é
tão específica e sensível para investigar a expressão de miRNAs quanto o sequenciamento.
No entanto, o sequenciamento de nova geração é o único método capaz de descobrir novos
miRNAs e novas variantes (Willenbrock et al., 2009).

3.7 Sequenciamento em larga escala

A tecnologia de sequenciamento paralelo massivo, também chamado de sequenciamento
em larga escala, permite o sequenciamento simultâneo de centenas de milhares a dezenas
de milhões de clones de cDNA de pequenos RNAs. A grande eficiência dessa técnica se deve
ao uso da amplificação por PCR in vitro, o que simplificou significativamente o intensivo
trabalho de produção de clones bacterianos e de montagem de placas de sequenciamento.
Estima-se que uma célula típica de mamífero contenha cerca de 100 mil transcritos de miRNAs
(Calabrese et al., 2007). Devido à grande cobertura do método, o número de reads obtidos por
miRNAs pelo sequenciamento em larga escala (miRNA-seq) é diretamente proporcional à sua
abundância na amostra. Logo, sequências que estão presentes em menos de uma cópia por
célula ainda podem ser detectadas pelo sequenciamento em larga escala. Em função disso e
do alto grau de confiabilidade, esse tipo de sequenciamento possibilitou oportunidades sem
precedentes para detecção da expressão de miRNAs em larga escala, levando à caracterização
da expressão de miRNAs conhecidos e a identificação de novos miRNAs com alta resolução.
Nos últimos anos, diversas plataformas de sequenciamento foram desenvolvidas
com base na tecnologia de sequenciamento por síntese e por ligação. São exemplos de
sequenciamento por síntese as plataformas 454/Roche (Margulies et al., 2005) e HiSeq2500/

228 Introdução ao mundo dos microRNAs

Illumina (Bentley et al., 2008) e do sequenciamento por ligação a plataforma SOLiD/Life
Technologies (Valouev et al., 2008). Além de variarem no método de sequenciamento, essas
plataformas diferem na quantidade e no comprimento das reads geradas. A tecnologia
Illumina é a mais amplamente utilizada em estudos de miRNA e os equipamentos atuais,
como o HiSeq 2500, são capazes de gerar em torno de um bilhão de reads de até 250 nt em
menos de dois dias.
Para o sequenciamento de pequenos RNAs, a fração correspondente (RNAs menores
que 200 nt) é isolada do RNA total por eletroforese em gel desnaturante. De acordo com o
protocolo de preparação da Illumina, as moléculas de pequenos RNAs são fragmentadas e, em
seguida, recebem adaptadores nas suas extremidades 3’ e 5’ por ação da enzima T4 RNA ligase.
Os adaptadores introduzem sítios de ligação para iniciadores usados na transcrição reversa
e na PCR por ponte. Nesse tipo de PCR, oligonucleotídeos complementares aos adaptadores
adicionados nas extremidades 3’ e 5’ dos miRNAs são ancorados em uma lâmina de vidro,
na qual acontece a PCR em ponte e a reação de sequenciamento. As moléculas de cDNA
são desnaturadas em fitas simples e sua porção 5’ pareia com o adaptador complementar
ancorado na lâmina. Por ação da polimerase, é sintetizada a fita complementar ao cDNA
imobilizado anteriormente. No passo seguinte, o novo fragmento está ligado à lâmina por
sua extremidade 3’; esse fragmento se dobra e pareia sua extremidade 5’ com o adaptador
complementar (formando uma ponte), de modo que a síntese de uma nova molécula de
cDNA aconteça. O processo é repetido até formar agrupamentos de cDNA senso e antissenso.
A clivagem de um dos adaptadores resulta em agrupamentos de fita simples de mesma
orientação. Após serem preparados, os produtos amplificados são submetidos a reações
de sequenciamento. O primeiro ciclo de sequenciamento é iniciado com a incorporação de
um único nucleotídeo fluorescente, seguido da digitalização em alta resolução de toda a
lâmina. Emissão de fluorescência indica agrupamentos nos quais houve adição do nucleotídeo
questionado e, assim, inicia-se a revelação da sequência do fragmento representado em
cada agrupamento. A cada ciclo, um nucleotídeo marcado é fornecido para a síntese, a que
se segue uma etapa de lavagem para remoção dos nucleotídeos não incorporados. Após a
digitalização, o terminal 3’ bloqueado e o fluoróforo são clivados e a reação de incorporação
do próximo nucleotídeo prossegue. A leitura das bases é feita pela análise sequencial das
imagens capturadas em cada ciclo de sequenciamento. Mais detalhes sobre o método podem
ser encontrados nas revisões de Huang e colaboradores (2011) e de Metzker (2010).
As lâminas onde acontecem as reações de PCR em ponte e de sequenciamento são
divididas em oito linhas. Cada linha pode ser usada para sequenciar o transcriptoma de uma
ou várias amostras. Nesse último caso, um conjunto de adaptadores especiais é adicionado
às moléculas de miRNAs para identificar a amostra de origem (multiplex). O aumento no
número de amostras por linha reduz a quantidade de reads produzidas por amostra. No
entanto, Metpally e colaboradores (2013) observaram que 5 milhões de reads por amostra são
suficientes para análises de expressão diferencial de miRNAs de modo a obter significância
estatística e garantir a descoberta de novos miRNAs. Assim, os custos com reagentes podem
ser drasticamente reduzidos se diferentes amostras forem sequenciadas em uma mesma
linha, sem que haja prejuízo na cobertura dos transcritos, uma vez que no Hiseq2500, por
exemplo, 500 milhões de reads são geradas por linha a cada corrida.
As grandes vantagens do sequenciamento em larga escala são a caracterização do
perfil de expressão de todos os miRNAs expressos em uma amostra, identificação de novos
miRNAs, alta resolução para distinguir miRNAs de uma mesma família que diferem por

Análise molecular de microRNAs 229

 um nucleotídeo e grande volume de dados em um só experimento. No entanto, esse grande
volume de dados requer infraestrutura computacional robusta e conhecimento avançado
em bioinformática.

3.8 Análise dos dados

A análise dos dados gerados pelo sequenciamento de larga escala é bastante complexa e
exige habilidades computacionais avançadas, já que os arquivos gerados pelos sequenciadores
são grandes e difíceis de serem processados em computadores convencionais. Em geral, é
necessário montar um sistema que envolva servidores e clusters gerenciado por um analista
de sistemas. A análise computacional das bibliotecas de miRNAs começa com a remoção
da sequência dos adaptadores e das reads de baixa qualidade. Em seguida, as reads são
mapeadas contra o genoma e a informação resultante desse mapeamento pode ser usada
para identificar e quantificar o nível de expressão dos miRNAs. Os programas de mapeamento
mais utilizados são BWA (Li; Durbin, 2009), Bowtie (Langmead; Salzberg, 2012; Langmead
et al., 2009) e SOAP2 (Li et al., 2009). Após calcular o número de reads provenientes de cada
miRNA expresso na amostra, é preciso normalizar essa contagem para que os valores entre
diferentes bibliotecas sejam comparáveis. Em geral, a quantificação digital da expressão de
miRNAs é calculada contando o número de reads de um determinado miRNA e dividindo-o
pelo total de reads da amostra (Pritchard et al,. 2012). Existem diversos programas que fazem
o cálculo diferencial da expressão dos miRNAs. Entre os mais conhecidos estão o edgeR
(Robinson et al., 2010), DESeq (Anders; Huber, 2010) e baySeq (Hardcastle; Kelly, 2010). Duas
revisões de 2013 compararam diferentes programas e discutiram seus prós e contras. Soneson
e Delorenzi (2013) compararam 11 métodos disponíveis na plataforma R e observaram
que não há um método que possa ser usado em todas as situações; consequentemente, a
escolha do método depende das condições experimentais. Seyednasrollah e colaboradores
(2013) compararam os oito programas mais utilizados na detecção da expressão diferencial
e concluíram que a ferramenta utilizada pode afetar significativamente os resultados da
análise dos dados, destacando a importância dessa escolha. O número ideal de replicatas
biológicas para cada experimento também deve ser ponderado. Liu e colaboradores (2014)
mostraram que sequenciar menos reads e mais replicatas biológicas é uma estratégia efetiva
para aumentar o poder e a acurácia na análise diferencial da expressão dos miRNAs.
Na identificação de novos miRNAs, deve-se ter o cuidado de checar se a nova molécula
é verdadeiramente um miRNA, pois comumente estudos baseados em RNA-seq identificam
pequenos RNAs que nem sempre são miRNAs (Pritchard et al., 2012). Assim, é necessário
checar se os miRNAs putativos atendem aos critérios que definem verdadeiros miRNAs, como:
1) apresentar comprimento de aproximadamente 22 nt; 2) checar se a sequência precursora
recuperada do genoma apresenta uma estrutura em grampo (hairpin) quando submetida a
um programa de dobramento, como o RNAfold (Gruber et al., 2008); 3) verificar se há reads
que correspondem a ambos os braços 3p e 5p do precursor; 4) checar se os novos miRNAs
são conservados em outras espécies (Pritchard et al., 2012). A validação dos novos miRNAs
pode ainda ser feitas por outras técnicas como northern blot e RT-qPCR.

Nota
Read (em português, “leitura”) corresponde à sequência de nucleotídeos obtida na
reação de sequenciamento para cada fragmento. O conjunto de reads originadas de
uma amostra é chamado de biblioteca.

230 Introdução ao mundo dos microRNAs

 3.9 Quantificação das moléculas primárias e precursoras dos miRNAs
A grande maioria dos trabalhos que investigam a expressão dos miRNAs tem como
alvo principal as moléculas maduras. Poucos trabalhos avaliaram a expressão das moléculas
primária (pri-miRNA) e precursora (pre-miRNA) dos microRNAs. Koscianska e colaboradores
demonstraram que a técnica de northern blot pode ser aplicada no estudo da distribuição
de variantes de comprimentos de miRNAs e de seus precursores. Esse estudo concluiu que
informações sobre a expressão das moléculas precursoras dos miRNAs são úteis na avaliação
da precisão das clivagens de Drosha e Dicer durante a biogênese dos miRNAs em humanos
(Koscianska et al., 2011). A amplificação de moléculas precursoras também é possível com
uso de iniciadores modificados com LNA no ensaio da RT-qPCR; para distinguir da expressão
dos miRNAs maduros, os iniciadores devem ser complementares a regiões fora do tronco que
contenham a sequência do miRNA maduro (Pritchard et al., 2012). Além disso, resultados de
RT-qPCR de expressão da sequência precursora estavam de acordo com o perfil de expressão
do miRNA maduro obtido por northern blot (Schmittgen et al., 2004). No entanto, a estrutura
secundária da molécula precursora pode dificultar o acesso dos iniciadores (RT-qPCR) e das
sondas (northern blot) aos sítios complementares na molécula de miRNA.

4. Bancos de dados para análises de identificação dos miRNAs

Diversos bancos de dados on-line reúnem coleções de dados gerados por clonagem,
sequenciamento e predição computacional. Esses bancos apresentam ferramentas de busca
com as quais é possível identificar rapidamente uma sequência de miRNA por homologia
às sequências depositadas. Os dois bancos de dados mais populares são:
miRBase (http://www.mirbase.org/): É um banco de dados compreensivo e
periodicamente atualizado, incluindo todos os organismos dos diferentes taxa para
os quais foram identificados miRNAs;
PMRD (Plant MicroRNA Database) (http://bioinformatics.cau.edu.cn/PMRD/): É um banco
de dados dedicado a integrar os dados disponíveis dos miRNAs de plantas, desde as
sequências até genes-alvo, perfil de expressão e localização genômica, entre outros.
A procura manual pode ser feita nos diversos bancos de dados disponíveis, mas
essa tarefa não é trivial no caso de milhões de reads oriundos do sequenciamento em larga
escala. A análise do grande volume de dados de sequenciamento é normalmente realizada
off-line, como descrito na seção 3.5. Após a identificação de sequências que representam
miRNAs verdadeiros, realiza-se a anotação dos dados através de alinhamentos com miRNAs
conhecidos. As sequências-referência para essa análise podem ser obtidas dos bancos de
miRNAs, dos quais é possível baixar todas as sequências depositadas para um organismo
ou grupo taxonômico. Alguns sítios oferecem protocolos e algoritmos de análise que podem
ser baixados para realizar análise de dados de sequenciamento em larga escala off-line
(standalone softwares). Os mais conhecidos são o miRanalyzer, o miRNAkey e o miRDeep.
Devido ao grande avanço das pesquisas de miRNAs, contamos hoje com uma gama
de ferramentas on-line que podem ser utilizadas para análises complementares (Johnson,
2012a; Kang; Friedlander, 2015). É importante lembrar que muitos sítios criados não se
tornam populares e acabam rapidamente desatualizados, por isso deve-se prestar atenção
a esse fato na hora de escolher a sua ferramenta de análise. Fóruns de bioinformática são
altamente recomendados para essa finalidade. O sítio ncRNA KnowledgeBase (http://www.

Análise molecular de microRNAs 231

 ncrna.org/KnowledgeBase) reúne uma coleção completa de informações sobre ferramentas
de bioinformática destinadas a análises funcionais de RNAs não codificantes, bem como links
para as ferramentas e bancos de dados mais utilizados. Em destaque, alguns dos bancos
com ferramentas diversas:
UEA sRNA toolkit (http://srna-tools.cmp.uea.ac.uk/): Conjunto de diversas ferramentas
específicas para análise de miRNAs provenientes de plantas ou de animais;
miRDB: Uma base de dados on-line para a predição de alvos de miRNA e anotação
funcional em animais (humanos, camundongos, ratos, cachorros e galinhas);
Diana tools: Diversas ferramentas, como banco de dados com evidências experimentais
sobre alvos de miRNAs em animais, algoritmos de predição de alvos, identificação
de rotas moleculares alteradas por miRNAs e até um servidor para rodar análises
mais sofisticadas dos fluxogramas de bioinformática;
miR2Disease: Uma base de dados com vários recursos sobre o envolvimento de miRNAs
em doenças humanas;
Mireval: Ferramenta para predição de miRNAs a partir de sequências genômicas.

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Abordagens Capítulo
computacionais e 13
moleculares para
identificação de alvos
de microRNAs

Prof. Dr. Régis Lopes Corrêa1, Kelly Costa de Almeida, Thiago Sardou Charret2,
Dr. Júlio Cesar Cetrulo Lorenzi3,4, Prof. Dr. Tiago Campos Pereira5
e Prof. Dr. Vinícius D’Avila Bitencourt Pascoal2
1
Depto. de Genética, Instituto de Biologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro - RJ
2
Depto. de Ciência Básica, Nova Friburgo, Universidade Federal Fluminense - RJ
3
Depto. de Genética, FMRP, USP - SP
4
Rockefeller University, New York - Estados Unidos
5
Depto. de Biologia, FFCLRP, Universidade de São Paulo - SP

Estruturação do capítulo
1. Introdução
2. Métodos de identificação de alvos in silico
2.1 TargetScan, PicTar, miRanda, PITA, Rna22, Diana-microT e psRNAtarget
3. Métodos moleculares
3.1 Baseados na superexpressão de miRNAs
3.1.1 Seguida por análise via northern blot
3.1.2 Acompanhada por ensaios de bioluminescência
3.1.2.1 Controles negativos
3.1.2.2 Controle de normalização
3.1.2.3 Limitações
3.1.3 Seguida por análise com microarranjos
3.1.4 Seguida por sequenciamento em larga escala e proteômica
3.2 Baseados na inibição da atividade de miRNAs
3.3 Detecção do sítio de clivagem por 5’ RACE
3.4 Detecção experimental de alvos de miRNAs em escala genômica
3.4.1 PARE (= Degradome)
3.4.2 GMUCT
3.5 3.5 Imunoprecipitação de proteínas Argonauta
3.5.1 RIP-Chip
3.5.2 TAP-Tar
3.5.3 HITS-CLIP
3.5.4 PAR-CLIP
3.5.5 iCLIP
3.5.6 CLASH
4. Considerações finais

Abordagens computacionais e moleculares para identificação de alvos de microRNAs 237

 1. Introdução
O entendimento da função dos microRNAs (miRNAs) depende, em grande parte,
da identificação de seus alvos, que pode ser feita de duas principais formas: (i) predição
computacional dos alvos (in silico) ou (ii) experimentação molecular.
Na predição computacional usa-se a sequência do miRNA para buscar possíveis alvos
em bancos de genomas ou transcriptomas disponíveis para o organismo em estudo. É um
método simples e rápido para a proposição de alvos. No entanto, em função das diferentes
peculiaridades do modo de ação dos miRNAs (clivagem ou inibição da tradução; requerimentos
de pareamento dentro e fora da região seed, entre outros) os métodos in silico podem gerar
um grande número de falsos-positivos. Nesse contexto, os métodos moleculares para a
identificação e/ou validação de predições computacionais foram desenvolvidos.

2. Métodos in silico para predição de alvos

Desde a descoberta dos primeiros miRNAs, diversos programas de predição de alvos
foram desenvolvidos. A maioria dessas ferramentas apresenta interfaces gráficas, na internet,
que facilitam o uso para pessoas não familiarizadas com linguagens computacionais. No
entanto, muitas delas podem ser baixadas e usadas em linha de comando, permitindo uma
manipulação mais precisa dos dados. Existem diversos softwares de predição, sendo os
mais populares: TargetScan, PicTar, miRanda, PITA, Rna22, Diana-microT e psRNAtarget
(figura 1; tabela 1).

Figura 1. Principais características dos programas usualmente utilizados para a predição de alvos de miRNAs
em animais e plantas. Parâmetros como restrição das análises à 3’ UTR de transcritos, necessidade de conservação
dos sítios de ligação em outras espécies e requerimento de pareamento na região “seed” do miRNA são mostrados por
todos os principais programas.

238 Introdução ao mundo dos microRNAs

Tabela 1. Características dos principais programas de identificação de alvos de miRNAs in silico.

Regiões Requer Outras

Programa Organismos Pareamento seed
analisadas conservação? características
TargetScan Vertebrados, Completo 3’ UTR Sim Parâmetros de
nematódeos, insetos pareamento e
convervação podem
ser personalizados
Pictar Vertebrados, Permitido, desde que 3’ UTR Sim Emite probabilidade
nematódeos, insetos não seja G:U de o sítio ser
verdadeiro
Miranda Mamíferos, Permitido, se 3’ UTR Sim Robustez dos dados
nematódeos, insetos compensado em avaliada pelo
outras partes programa miRSVR
PITA Mamíferos, Até duas bases não 3’ UTR Não Tamanho de seed
nematódeos, insetos pareadas, sendo uma manualmente
delas G:U determinado
Rna22 Mamíferos, Até seis alterações G:U 3’ UTR Não Número de bases
nematódeos, insetos não pareadas
determinado pelo
usuário
Diana-microT Mamíferos, Permitido 3’ UTR; Não Permite integração
nematódeos, insetos CDS com dados de
sequenciamento em
larga escala
psRNATarget Plantas Permitido 3’ UTR; Não Estima forma de

CDS regulação (clivagem

ou inibição da
tradução)

Em geral, todos permitem predizer alvos de um miRNA específico em bancos de dados

genômicos ou transcriptômicos e também verificar se um determinado transcrito pode
ou não ser regulado por miRNAs já conhecidos. Alguns têm como ferramenta adicional a
capacidade de fazer análises baseadas em miRNAs ou transcritos submetidos pelo usuário,
sem depender, dessa forma, de bancos disponíveis na internet. Como as regras de interação
miRNA-alvo podem variar de um organismo para outro, muitos programas só podem ser
usados para determinadas espécies.
O programa TargetScan foi o primeiro desenvolvido para a determinação de alvos
de miRNAs (Lewis et al., 2003). Ao contrário do que poderia indicar o nome, o programa faz
muito mais do que apenas uma simples varredura por alvos de miRNAs. Várias regras são
levadas em conta para a determinação deles. Por exemplo, o programa requer pareamento
completo na região correspondente ao seed do miRNA com a 3’ UTR do alvo predito. Mas
permite bases não pareadas fora dessa região, desde que certas propriedades termodinâmicas
do duplex sejam mantidas. A restrição da análise à 3’ UTR de transcritos se deve ao fato
de a maioria dos miRNAs experimentalmente testados se ligarem preferencialmente nessa
região (Lewis et al., 2003).
Além disso, o programa parte do pressuposto de que interações verdadeiras entre
miRNAs e alvos deveriam ser conservadas ao longo do processo evolutivo. Portanto, um filtro
é feito e somente interações semelhantes encontradas em outras espécies são mantidas.
A análise pode ser feita para humanos, camundongos, ratos, o nematoide Caenorhabditis
elegans, a mosca Drosophila melanogaster, cachorros, galinhas, chimpanzés, macacos rhezus
(Macaca mulata), gado bovino (Bos taurus), gambás, entre outros.

Abordagens computacionais e moleculares para identificação de alvos de microRNAs 239

 Os programas PicTar e miRanda compartilham algumas funções com o TargetScan,
inclusive requerimento de conservação evolutiva da interação miRNA-alvo e análise restrita
à 3’ UTR de transcritos. No entanto, PicTar e miRanda aceitam diferentes níveis de mal
pareamentos na região do seed do miRNA. O programa PicTar permite mal pareamento
nessa região, desde que esse não aumente a energia livre de ligação do par miRNA-alvo e
que também não contenha pareamentos do tipo G:U (Krek et al., 2005). O programa emite
também uma probabilidade do sítio localizado ser de fato verdadeiro. Já o programa miRanda
faz inicialmente um alinhamento de todo o miRNA com a 3’ UTR do alvo e coloca somente
um peso na região 5’, o que corresponderia à localização da região “seed” (Betel et al., 2008).
Os pareamentos errados nessa região devem, no entanto, ser compensados em outras partes
do duplex.
Além disso, miRanda apresenta um programa irmão chamado miRSVR que calcula a
robustez dos dados emitidos através de um algoritmo de aprendizado de máquina (Betel et
al., 2010). Esse tipo de abordagem envolve o desenvolvimento de programas de inteligência
artificial capazes de melhorar a eficácia de acerto em função de dados inseridos. No caso
específico do miRSVR, dados de interações experimentalmente confirmadas entre miRNA e
seus alvos são usados para o “treinamento” do programa, aumentando a confiabilidade das
predições. Tanto PicTar quanto miRanda podem ser usados para a maioria dos vertebrados
com genoma sequenciado e também para D. melanogaster e C. elegans.
Ao contrário de TargetScan, PicTar e miRanda, os programas PITA, Rna22, Diana-microT
e psRNAtarget não analisam se as interações entre miRNAs e alvos são ou não conservadas
em outras espécies. Essa alteração de comando, em teoria, diminuiria a confiabilidade dos
dados, no entanto permite o descobrimento de interações que são específicas de cada grupo,
como a de um miRNA evolutivamente novo com seu alvo. Diana-microT e psRNAtarget se
diferenciam ainda mais por não restringirem suas análises às 3’ UTRs dos transcritos-alvo.
O programa PITA faz uma varredura das regiões 3’ UTRs dos transcritos em busca de
sítios de ligação de miRNAs (Kertesz et al., 2007). Na interface gráfica disponível na internet
é possível escolher regiões seed de 6 a 8 nt, permitindo-se até duas bases não pareadas, sendo
uma delas necessariamente do tipo G:U. Caso o programa seja rodado localmente, no entanto,
alterações na região seed podem ser personalizadas. O programa então faz um cálculo da
probabilidade de regulação, levando em conta também a estrutura termodinâmica do pareamento
miRNA-alvo. PITA pode ser usado para humanos, camundongos, D. melanogaster e C. elegans.
O programa Rna22 permite uma flexibilização de mal pareamentos na região seed
ainda maior (Miranda et al., 2006): até seis alterações do tipo G:U são permitidas e o duplex
pode ter de 10 a 19 regiões não pareadas, à escolha do usuário. Ele usa um algoritmo para
reconhecer e capturar padrões observados em um conjunto grande de miRNAs usados como
entrada. Em seguida esse padrão é buscado na 3’ UTR de genes.
O programa Diana-microT foi inicialmente desenvolvido para a detecção de alvos de
miRNA apenas na 3’ UTR (Kiriakidou et al., 2004). Atualizações mais recentes, no entanto,
estenderam a análise também para regiões codificantes (Reczko et al., 2012). Assim como a
maioria dos programas, o Diana-microT faz uma análise de conservação do sítio de ligação
identificado. No entanto, não usa essa informação para eliminar alvos da análise. Uma grande
vantagem do Diana-microT é a possibilidade de integração com dados de sequenciamento
de nova geração. O usuário pode, por exemplo, fornecer como entrada uma lista de mRNAs
e/ou miRNAs diferencialmente expressos, restringindo a análise a condições experimentais
específicas.

240 Introdução ao mundo dos microRNAs

 O programa psRNAtarget também permite uma grande flexibilização na entrada
de dados, com possibilidade de uso de miRNAs e transcritos fornecidos pelo usuário ou já
existentes no servidor (Dai; Zhao, 2011). Como dito anteriormente, o psRNAtarget não requer
conservação de sítio de ligação e não se restringe à 3’ UTR dos transcritos. O programa, no
entanto, é reservado para análises em plantas. Dependendo do grau de pareamento do par
miRNA-alvo e também da acessibilidade da região, medida pela energia necessária para
desnaturação, o programa estima se a regulação ocorre através de clivagem ou inibição de
tradução. Mas a estimativa não leva em consideração dados recentes de que a biogênese dos
miRNAs em plantas também determina o tipo de regulação de seus alvos (Reis et al., 2015).

3. Métodos moleculares

3.1 Baseados na superexpressão de miRNAs

As tentativas iniciais para detecção de alvos de miRNAs de forma experimental
foram feitas através da sua superexpressão por transgenia. O sistema parte do princípio
de que a superexpressão do miRNA aumentaria a regulação de seu alvo a ponto de ser
experimentalmente visível. Muitas vezes os ensaios são conduzidos através da coexpressão
do miRNA em estudo junto com seu alvo computacionalmente predito (para outros detalhes
técnicos, vide capítulo 15).
A identificação e/ou validação de um determinado alvo pode ser feita mediante
superexpressão do respectivo miRNA: (i) seguida por análise via northern blot (ii) acompanhada
por ensaios de bioluminescência, (iii) seguida por análise com microarranjos ou (iv) seguida
por sequenciamento em larga escala.

3.1.1 Seguida por análise via northern blot

O primeiro desenho experimental desse tipo foi desenvolvido para plantas em 2002, logo
após a descoberta de miRNAs em arabidopsis. Nesse caso, os autores superexpressaram um
miRNA de arabidopsis na presença ou ausência de seu alvo predito, além de outros controles
(Llave et al., 2002). A expressão, no entanto, foi feita de forma transiente (não estável) em
folhas de Nicotiana benthamiana, uma espécie próxima ao tabaco. MiRNAs em plantas atuam
principalmente por degradação de seus alvos. Dessa forma, os autores usaram a técnica de
northern blot para detectar o acúmulo do alvo em função de sua coexpressão com o miRNA. E
a correlação esperada foi de fato observada: na ausência do miRNA, o alvo acumula em altas
concentrações, mas quando o miRNA é colocado no sistema sua expressão é praticamente
abolida (Llave et al., 2002). Apesar de não ser uma prova absoluta, o comportamento dos
RNAs, nesse caso, indica fortemente que o gene em questão pode estar de fato sendo regulado
pelo miRNA, corroborando as previsões computacionais. Esse procedimento, no entanto, só
é capaz de detectar ação de miRNAs em alvos quando a regulação ocorre por clivagem, uma
vez que a técnica de northern blot detecta apenas a estabilidade de transcritos.

3.1.2 Acompanhada por ensaios de bioluminescência

Posteriormente, o método foi refinado para eliminar essa restrição, permitindo também
a avaliação de alvos regulados por inibição de tradução. Para tanto, ao invés de coexpressar

Abordagens computacionais e moleculares para identificação de alvos de microRNAs 241

 o miRNA com seu alvo predito, utilizou-se uma versão modificada do gene codificador da
proteína marcadora (fluorescente) GFP. Mais especificamente, os pesquisadores identificaram
qual seria a região do alvo que se ligaria ao miRNA estudado (portando potenciais MREs) e
clonaram apenas essa parte a jusante (downstream) da 3’ UTR do gene codificador de GFP
(Parizotto et al., 2004).
Portanto, caso a interação computacional predita fosse realmente verdadeira, o miRNA
passaria a guiar o complexo RISC para o mRNA codificador da proteína GFP (portando a 3’
UTR do gene-alvo predito), induzindo sua regulação. A proteína GFP, quando presente, gera
uma luminosidade verde fluorescente sob luz ultravioleta. No entanto, essa luminosidade é
perdida caso o miRNA inicie a degradação de seu RNA por clivagem ou iniba sua tradução
(figura 2 - mais adiante).
Um sistema parecido foi adaptado para o estudo da função de miRNAs em animais,
mas utilizando a região codificadora de Luciferase , outra proteína empregada em ensaios de
atividade (figura 3). Da mesma forma que em plantas, o sítio de ligação predito do miRNA em
seu alvo é clonado na 3’ UTR do gene codificador de Luciferase (luciferase::3’UTR) (Jin et al.,
2013). Algumas empresas, no entanto, disponibilizam bibliotecas contendo genes marcadores
fusionados com 3’ UTR de distintos genes de animais-modelo, eliminado a necessidade da
etapa inicial de clonagem.
Existem diversas variações no desenho de experimental com Luciferase. Por exemplo,
pode-se optar por um tipo celular que não expresse o miRNA em investigação (ou o faça
apenas em níveis reduzidos). Portanto, ao transfectar essas células apenas com o plasmídeo

Figura 3. Ensaio com Luciferase para validação da interação de miRNA com possíveis alvos em células de
mamíferos. Células de mamíferos são transfectadas com um vetor expressando tanto a Firefly luciferase (FL; fusionada
à 3’ UTR sob investigação) quanto a Renilla luciferase (RL), além de um gene marcador de resistência (para seleção).
Idealmente, essas células não expressam o miRNA sendo estudado. A) A transfecção com o plasmídeo sozinho leva à
emissão do sinal da FL e RL (esse último é usado como normalizador da eficiência de transfecção). B) Se a interação
predita in silico entre o miRNA e o MRE da 3’ UTR for verdadeira, ao se realizar a cotransfecção do plasmídeo com o
RNA mimético (com sequência idêntica ao miRNA estudado), esse último irá levar a redução da proteína e consequente
queda do sinal (fluorescência). C) Como controle negativo, pode-se cotransfectar as células com um miRNA scrambled,
que será incapaz de interagir com o MRE, evidenciando que o processo é sequência-específico; mantém, assim, a
fluorescência verde. D) Alternativamente, pode-se construir uma versão da 3’ UTR sem o MRE (ou portando mutações).
Semelhantemente, o miRNA mimético será incapaz de se ligar a ele, validando assim, mais especificamente, o local de
interação entre o miRNA e a 3’ UTR. E) Por fim, pode-se cotransfectar com um miRNA mimético portando mutações na
seed, evidenciando, de maneira complementar ao exemplo em “D”, o local preciso de interação do miRNA e a 3’ UTR.
MRE (microRNA response element): a região de 21-22 nt, dentro do RNA alvo, à qual o miRNA se liga especificamente.
MCS (multiple cloning site): sítio para clonagem da 3’ UTR sob investigação. Cabeça de seta: promotor para transcrição.

242 Introdução ao mundo dos microRNAs

expressando luciferase::3’UTR, deve-se observar um sinal de fluorescência normal. Em um
segundo grupo, realiza-se a cotransfecção do plasmídeo expressando luciferase::3’UTR junto
ao RNA mimético (mimic RNA, cuja sequência é idêntica ao miRNA investigado). Nesse grupo,
o sinal deve reduzir (ou desaparecer), evidenciando que o RNA mimético interagiu com a
3’ UTR e promoveu a queda do sinal. Em geral, os níveis de luminescência são avaliados de
24 a 48 horas após a transfecção.

3.1.2.1 Controles negativos

Há diversos tipos de controles negativos que podem ser utilizados nos experimentos
com Luciferase (assim como com os de GFP, mediante adaptações necessárias). O primeiro
e mais simples deles baseia-se na transfecção apenas do plasmídeo expressando Luciferase
fusionada à 3’ UTR, sem adição de RNAs miméticos (já mencionada). O segundo refere-se à
cotransfecção desse plasmídeo junto com um miRNA scrambled. Nesse caso, esse miRNA não
será capaz de interagir com a(s) MRE(s) presente(s) na 3’ UTR, evidenciando que o processo
é sequência-específico. Um terceiro controle baseia-se na cotransfecção do RNA mimético
junto a um plasmídeo expressando Luciferase com uma versão da 3’ UTR com deleções ou
mutações na(s) MRE(s). Nesse procedimento, o miRNA mimético será incapaz de se ligar
à 3’ UTR, evidenciando-se precisamente o local onde o miRNA interage (Kuhn et al., 2008;
Nicolas, 2011). Um quarto controle negativo possível refere-se ao uso de um RNA mimético
contendo mutações na região seed, inviabilizando assim a interação com as potenciais MREs.
É importante ressaltar que um desenho experimental não precisa, necessariamente,
incluir todos esses controles negativos. Contudo, a inclusão de cada um deles irá, aditivamente,
fortalecer a hipótese de que determinado miRNA interage fisicamente com determinado
MRE, promovendo a queda dos níveis proteicos.

3.1.2.2 Controle de normalização

Na prática, as eficiências de transfecção são sempre menores que 100%, i.e., algumas
células não incorporam o plasmídeo. Adicionalmente, as taxas de transfecção podem ser
diferentes entre grupos (controle negativo sem RNA mimético versus grupo experimental
com RNA mimético), inviabilizando a normalização baseada no grupo controle negativo.
Uma estratégia elegante para resolver esse dilema baseia-se em um controle de
normalização, i.e., o mesmo plasmídeo que expressa Firefly luciferase::3’UTR também
expressa um segundo gene marcador (Renilla luciferase) não fusionado a sítios de ligação
do miRNA em estudo. Firefly luciferase (FL) emite luz amarela-esverdeada e é oriunda do
besouro Photinus pyralis; já a Renilla luciferase (RL) emite luz azul e é originária do cnidário
Renilla reniformis.
Assim, após a transfecção, realiza-se a leitura dos dois sinais: um deles evidenciará
a taxa de transfecção (RL – gene marcador sem MREs) e o outro evidenciará a interação
do miRNA mimético com a 3’ UTR (FL – gene marcador com MREs). A normalização é feita
dividindo-se esses valores (FL/RL) em cada grupo separadamente.

3.1.2.3 Limitações
Os métodos baseados na observação indireta de proteínas através de fluorescência
ou bioluminescência permitem avaliar de forma relativamente rápida se um determinado

Abordagens computacionais e moleculares para identificação de alvos de microRNAs 243

 alvo é realmente ou não regulado por um miRNA. No entanto, essas abordagens apresentam
baixa escalabilidade. Um único miRNA pode chegar a ter mais de 100 alvos, dessa forma
torna-se praticamente inviável testar centenas de alvos preditos através desse sistema.
Para contornar essa limitação foram desenvolvidos protocolos para avaliar o impacto
em larga escala da superexpressão de miRNAs. Assim como anteriormente, o miRNA em
estudo é superexpresso de alguma forma em células ou organismos, de maneira estável ou
não, e em seguida são aplicadas técnicas de análise global de expressão, como microarranjos,
RNA-seq ou proteômica (Pritchard et al., 2012). Esses métodos, portanto, permitem avaliar
de forma global como os miRNAs impactam a fisiologia celular.

3.1.3 Seguida por análise com microarranjos

A técnica de microarranjos baseia-se na hibridação de RNAs expressos em determinadas
situações em um chip contendo sequências genômicas, transcriptômicas ou oligos provenientes
do organismo estudado (Pritchard et al., 2012). Os RNAs são previamente convertidos em
cDNAs e marcados com fluorocromos distintos, usualmente cianina 3 (cy3) e cianina 5 (cy5).
A hibridação do DNA acaba gerando padrões de cores em cada ponto do chip, em função
da presença ou ausência de determinados genes nas amostras. Espera-se, portanto, que a
superexpressão de um determinado miRNA gere uma repressão de seus alvos nas células ou
tecidos estudados. Dessa forma, os genes significativamente reprimidos no microarranjo são
selecionados como candidatos a alvo. Para diminuir o número de falsos-positivos em geral
usam-se também controles onde a sequência do miRNA encontra-se alterada em regiões-
chave do processo de clivagem, como na décima posição, por exemplo (Lim et al., 2005).
Assim, genes reprimidos nesses controles são retirados da análise, mesmo que tenham sido
detectados também na expressão do miRNA selvagem. Mesmo tomando-se esse cuidado, no
entanto, o número de possíveis alvos pode ser ainda muito grande.
Para tentar focar em alvos verdadeiros, tenta-se buscar assinaturas entre os genes
reprimidos que tenham semelhança com o miRNA em estudo. Como dito antes, sabe-se
que o pareamento da região seed do miRNA (bases 2 a 8) é fundamental para que ocorra
a regulação (Lewis et al., 2005). Assim, conjuntos gênicos contendo bases complementares
à sequência seed do miRNA são finalmente selecionados para avaliações mais detalhadas
(Lim et al., 2005). A grande limitação dessa técnica se deve à aplicabilidade restrita apenas
a miRNAs que levam à clivagem de seus transcritos-alvo.

3.1.4 Seguida por sequenciamento em larga escala e proteômica

Mais recentemente, o impacto da superexpressão de miRNAs no transcriptoma
de células passou a ser feito também através da técnica de RNA-seq. Trata-se do uso de
sequenciamento em larga escala, também chamado de nova geração, para a quantificação
da expressão gênica (Pritchard et al., 2012). Os mesmos controles aplicados no caso de
microarranjo também são usados e genes reprimidos contendo assinaturas da sequência
seed são selecionados como candidatos (Xu et al., 2010).
Assim como na técnica de microarranjos, RNA-seq encontra apenas alvos clivados por
miRNAs e não os que são reprimidos via inibição de tradução. Para isso, foi desenvolvida outra
técnica com princípio semelhante: superexpressão de miRNA, seguida de análise proteômica.
O primeiro estudo desse tipo foi realizado com o miRNA miR-1, altamente expresso em
células musculares esqueléticas e cardíacas (Lagos-Quintana et al., 2002). Observou-se que

244 Introdução ao mundo dos microRNAs

das 504 proteínas analisadas, miR-1 foi capaz de regular significativamente 12, indicado que
o impacto de miRNAs na fisiologia celular pode ser grande (Vinther et al., 2006).

3.2 Baseados na inibição da atividade de miRNAs

A obtenção de organismos com inativação específica de um determinado miRNA
pode ser também uma ferramenta importante para a descoberta de alvos regulados por ele.
Técnicas desse tipo possuem o mesmo princípio dos experimentos anteriores descritos para
superexpressão, mas com resultados esperados inversos. Ou seja, parte-se do princípio de
que a inativação de um miRNA levaria a um acúmulo de seus respectivos alvos.
De fato, os primeiros alvos de miRNAs foram identificado através dessa metodologia
no nematoide Caenorhabiditis elegans (Lee et al., 1993; Reinhart et al., 2000). A descoberta
de genes desregulados no mutante por técnicas de análise de expressão gênica em larga
escala, como sequenciamento massivo e microarranjos (Pritchard et al., 2012), ou até mesmo
por estudos de reversão de fenótipos por varredura genética (genetic screening) poderiam
indicar os alvos em potencial de miRNAs em estudo.
A obtenção de mutações genéticas, no entanto, não é uma ferramenta prática para
a maioria dos organismos, inclusive mamíferos. Dessa forma, foram desenvolvidas outras
metodologias para a inibição de miRNAs, como o uso de oligonucleotídeos complementares
a miRNAs (antimiRs e antagomiRs) (Davis et al., 2006; Krutzfeldt et al., 2005; Obad et
al., 2011) e sistemas de “esponja artificiais”, nos quais a região de ligação do miRNA é
adicionada em um transgene, usualmente codificador de proteínas marcadoras, como
GFP (Hammond, 2007; Yan et al., 2013). Mais recentemente estão sendo desenvolvidos
também métodos para a inativação de miRNAs através da edição de genomas. Tecnologias
de TALENs (Transcription Activator-Like Effector Nucleases) e CRISPR (Clustered Regularly
Interspaced Short Palindromic Repeats) já foram utilizadas com sucesso para manipular
genomas e com isso inativar interações de miRNAs com seus alvos (Bassett et al., 2014;
Kim et al., 2013). Ambas as metodologias baseiam-se no direcionamento de nucleases
para os genes codificadores dos microRNAs em questão, gerando mutações. No caso de
TALENs, o direcionamento é realizado através de proteínas bacterianas manipuladas para
o reconhecimento de sequências específicas de nucleotídeos. Já no sistema CRISPR, o
direcionamento é feito por pequenos RNAs chamados sgRNAs (single guide RNAs) acoplados
à proteína Cas9 (Terns; Terns, 2014).
Detalhes técnicos sobre o uso dessas estratégias específicas para inibição e disrupção
de genes miRNAs podem ser vistos no capítulo 14.

3.3 Detecção do sítio de clivagem por 5’ RACE

Apesar de experimentos de superexpressão de miRNAs darem um bom indicativo de
regulação, eles não são capazes de provar que o miRNA está de fato diretamente responsável
pela redução do alvo predito. Pode-se sempre especular, por exemplo, que a superexpressão
de um miRNA leva à regulação de outro gene não relacionado com o alvo predito e a supressão
desse pelo miRNA pode acabar levando também a uma repressão do alvo predito de forma
indireta, através de uma rede gênica regulatória. Assim foram desenvolvidas técnicas
complementares para a detecção de regulações diretas, sendo que uma versão modificada
do método RACE (Rapid Amplification of CDNA Ends) é a mais comumente utilizada (Llave
et al., 2002).

Abordagens computacionais e moleculares para identificação de alvos de microRNAs 245

 Figura 2. Ensaio de GFP para validação da interação de miRNA com possíveis alvos em plantas. Suspensões líquidas
da bactéria Agrobacterium tumefaciens contendo as construções de interesse são infiltradas em folhas, geralmente da
espécie Nicotiana benthamiana, através do uso de seringas (sem agulha). Dessa forma, genes de interesse carreados pela
bactéria são expressos de forma transiente nas plantas, após o processo de infecção. A) Construção controle contendo
apenas a região codificante da proteína verde fluorescente marcadora (GFP), controlada por um promotor constitutivo.
Fazendo-se luz ultravioleta (UV) incidir na folha, partes expressando GFP apresentam coloração verde, enquanto que
as demais partes da folha, não infiltradas, emitem coloração vermelha (luz emitida pela clorofila quando irradiada por
UV). B) A região de ligação do miRNA com seu alvo predito (miR BS, do inglês miRNA Binding Site; o mesmo que MRE)
é clonada na região 3’ UTR. Na ausência de superexpressão do miRNA em estudo, no entanto, deveria haver acúmulo
de GFP, observando-se coloração verde na área infiltrada. C) Coexpressão de GFP-miR BS com o miRNA sendo testado
pode levar a dois tipos de resultado: caso o miRNA em questão de fato reconheça o sítio predito, esse passará então a
regular o transcrito de GFP, mediando sua clivagem ou reprimindo sua tradução. Nessa condição, a região infiltrada
apresentaria quantidades reduzidas de GFP, ou até mesmo sua eliminação (coloração vermelha). No entanto, caso o
miRNA não reconheça o sítio de ligação clonado na construção, então GFP continua sendo expressa, resultando em uma
coloração verde de intensidade parecida com a dos controles.

Figura 4. Técnica RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) utilizada para identificação dos alvos clivados por
microRNAs. A técnica utiliza um adaptador de RNA (que se liga à extremidade 5’ gerada pela clivagem do RNA-alvo por
slicer/microRNA), transcrição reversa, nested PCR e sequenciamento do amplicon para identificar o sítio de clivagem.
PD: primer direto, ancorado no adaptador 5’. PD(N): primer direto, usado na nested PCR, ancorado mais internamente
no adaptador 5’. PRU: primer reverso universal, ancorado na cauda poli(T). PRGS(N): primer reverso gene-específico,
usado na nested PCR, ancorado na extremidade do gene. O retângulo pontilhado indica a transição entre sequência do
RNA-alvo e adaptador, ou seja, o local onde o miRNA mediou a clivagem.

246 Introdução ao mundo dos microRNAs

 A técnica de RACE (figura 4) usualmente é utilizada para a amplificação e clonagem
das extremidades 5’ ou 3’ de mRNAs. O procedimento foi modificado para tentar detectar
os produtos da clivagem mediada por miRNAs (Chen et al., 2010). Durante esse processo,
a proteína Argonauta cliva o RNA-alvo em uma região correspondente às bases 10 e 11 do
miRNA guia associado, cortando-o em dois fragmentos. Em função da clivagem, o fragmento
3’ gerado passa a apresentar um fosfato na extremidade 5’, permitindo dessa forma a ligação
de um adaptador de RNA através de uma enzima RNA ligase (Llave et al., 2002). Em teoria, a
extremidade 3’ OH do adaptador não se poderia ligar a (extremidade 5’ de) outros tipos de
RNA em função da presença de CAP 5’ (7metilguanosina trifosfato, presente na extremidade
5’ em mRNAs íntegros) ou pela ausência de fosfato 5’ (em degradações espúrias de RNA não
mediadas por Argonauta). A cauda poli-A do fragmento 3’ é então usada para a síntese de cDNA
através de transcriptase reversa. Em seguida são realizados dois processos de amplificação
por PCR (Polymerase Chain Reaction), uma não específica, usando oligonucleotídeos para o
adaptador e oligo-dT, e outra específica, usando oligonucleotídeo reverso para o gene alvo de
interesse. Esse produto final de amplificação é clonado e sequenciado. Caso o gene candidato
seja realmente alvo de um miRNA, o fragmento clonado deve iniciar sua sequência em uma
região equivalente ao meio do miRNA responsável por sua clivagem (Chen et al., 2010). A
existência dessa correlação é praticamente uma garantia de que o processo de clivagem do
gene em estudo foi realmente guiado por um miRNA.
Muitas vezes, as interações previstas por bioinformática ou através de estudos de
superexpressão de miRNAs são confirmadas através da técnica de 5’ RACE modificado. Em
função de suas particularidades funcionais, a maioria dos estudos desse tipo são realizados
em miRNAs de plantas. Mas a técnica tem sido aplicada com sucesso em animais, não só
para o estudo de miRNAs mas também de pequenos RNAs interferentes (siRNAs) (Yekta et
al., 2004). No entanto, essa metodologia também apresenta limitações de escalabilidade,
sendo inviável a realização de um estudo em escala transcriptômica. Além disso, depende
de conhecimento prévio do alvo para funcionar. Portanto, novas versões modificadas de
5’ RACE foram desenvolvidas para a detecção experimental de alvos de forma “cega”, ou
seja, sem conhecimento a priori de quais genes seriam candidatos (Addo-Quaye et al., 2008;
German et al., 2008; Gregory et al., 2008).

3.4 Detecção experimental de alvos de miRNAs em escala genômica

Existem duas metodologias para a detecção experimental de alvos de miRNAs em
escala genômica: PARE (German et al., 2008) e GMUCT (Gregory et al., 2008).

3.4.1 PARE
A técnica de PARE (Parallel Analysis of RNA Ends), também chamada de Degradome
(Addo-Quaye et al., 2008), é derivada da técnica 5’ RACE e é a mais utilizada atualmente.
Ela tira proveito da extremidade 5’-monofosfato livre do produto da clivagem do mRNA 3’
mediado por Argonauta, capturando essa sequência através da ligação de um adaptador de
RNA (figura 5). Após essa etapa realiza-se uma transcrição reversa para a síntese de cDNA.
Até esse ponto, a princípio, todos os RNAs eventualmente clivados por miRNAs teriam sido
ligados com adaptadores e convertidos em cDNA. Na técnica de PARE, no entanto, o adaptador
5’ possui um sítio de reconhecimento da enzima de restrição Mme I, uma endonuclease
especial que corta o DNA 20 bases após o seu sítio de reconhecimento. Quando utilizada,

Abordagens computacionais e moleculares para identificação de alvos de microRNAs 247

 portanto, a enzima reconhece seu sítio na sequência adaptadora e corta 20 bases à frente, já
na região correspondente ao RNA alvo da clivagem pelo miRNA. O reconhecimento na região
adaptadora, portanto, permite que todos os alvos clonados sofram o processo de clivagem,
sem a necessidade de conhecimento prévio. A digestão pela Mme I gera extremidades coesivas
que são usadas para a ligação de outro adaptador, dessa vez em forma de DNA dupla fita.
Após essa etapa, obtém-se uma biblioteca contendo um adaptador 5’, um fragmento de 20
nt do alvo de miRNA e um adaptador na ponta 3’. A biblioteca é então amplificada por PCR
usando oligonucleotídeos específicos para as sequências adaptadoras, não sendo necessário,
assim, restringir a análise a genes específicos, como no caso da técnica de 5’ RACE tradicional.
Recentemente, a técnica de PARE foi aprimorada, passando a usar sequências adaptadoras
compatíveis com o sequenciamento em larga escala da plataforma Illumina (Zhai et al.,
2014). Dessa forma, a biblioteca de fragmentos clivados por miRNAs pode ser diretamente
sequenciada de forma massiva, gerando dados de clivagem em escala transcriptômica.
A análise dos dados de PARE é feita através da comparação das etiquetas de 20 nt
dos alvos sequenciadas. O procedimento é parecido com o descrito anteriormente para a
técnica de 5’ RACE modificado. Assume-se que as primeiras bases da região do alvo clonada
deveriam mapear nas proximidades da 10ª base do miRNA responsável pela regulação.

Figura 5. Princípios da técnica PARE (Parallel analysis of RNA Ends). Utilizando adaptadores de RNA, a técnica possibilita
uma análise ampla de todos os RNAs mensageiros clivados por Argonautas/microRNAs na amostra analisada sem
conhecimento prévio de sequência. A endonuclease Mme I apresenta uma particularidade: seu sítio de reconhecimento
(presente no adaptador 5’, círculo com linha contínua) fica a alguns nucleotídeos de distância de seu sítio de clivagem
(localizado no RNA-alvo, seta curva). O retângulo pontilhado indica a transição entre sequência do RNA-alvo e adaptador,
ou seja, o local em que o miRNA mediou a clivagem. (As regiões poli-A/poli-T foram representadas por linhas a partir
do 6º elemento da imagem.)

248 Introdução ao mundo dos microRNAs

Assim, as milhões de leituras obtidas por sequenciamento são comparadas com um banco
de miRNAs disponíveis para o organismo em questão. Os alvos de miRNAs em potencial são
selecionados e para cada um deles é gerado um gráfico de “degradação” chamado “t-plot”, no
qual a abundância de fragmentos sequenciados na biblioteca é plotada ao longo da sequência
do gene-alvo. Dessa forma, descobre-se não somente que genes são clivados por miRNAs,
mas também onde no transcrito essa clivagem ocorre e, da mesma forma, sua intensidade.
Obviamente, todas essas análises são feitas por bioinformática.
A ferramenta mais comumente utilizada para essa finalidade chama-se CleaveLand
(Brousse et al., 2014). No entanto, outras também fazem análises semelhantes, como PAREsnip
(Stocks et al., 2012), SeqTar (Zheng et al., 2011) e SoMART (Li et al., 2012). Recentemente
foi desenvolvida uma nova ferramenta chamada sPARTA que permite a análise de dados
de PARE mesmo em organismos que não apresentam banco de miRNAs descrito (Kakrana
et al., 2014).

3.4.2 GMUCT
A técnica GMUCT (Genome-wide Mapping of Uncapped and Cleaved Transcripts),
originalmente descrita em 2008 (Gregory et al., 2008), foi posteriormente aprimorada,
reduzindo-se consideravelmente sua complexidade e tempo de execução, versão chamada
GMUCT 2.0 (Willmann et al., 2014). Uma das principais vantagens do novo protocolo é a
baixa quantidade de material requerida: até 5 µg de RNA total. O protocolo de PARE, por
exemplo, necessita de no mínimo 40 µg de RNA total para ser executado.
Assim como em PARE, um adaptador é adicionado na extremidade 5’ de transcritos
clivados por miRNAs. A transcrição reversa, no entanto, é realizada através de pequenos oligos
de seis bases aleatórias (random primers) fusionados com um adaptador na extremidade 3’.
Os adaptadores 5’ e 3’, dessa forma, são usados para amplificar a biblioteca, adicionando-se
sequências compatíveis com a plataforma de sequenciamento em larga escala da empresa
Illumina. O mapeamento das sequências obtidas no genoma do organismo de interesse
pode então revelar padrões consistentes com produtos de clivagem mediados por miRNAs
ou outros tipos de RNAs não codificantes.

3.5 Imunoprecipitação de proteínas Argonauta

Métodos de identificação de alvos em escala transcriptômica baseados em PARE ou
técnicas semelhantes só podem ser aplicados em casos em que a regulação pelo miRNA ocorre
através de clivagem de alvos. Para tentar identificar alvos em escala global independente
do mecanismo de ação dos miRNAs, uma série de métodos baseados em imunoprecipitação
de proteínas Argonauta foram desenvolvidos (figura 6). Essas técnicas fundamentam-se
no uso de anticorpos que reconhecem componentes celulares específicos, permitindo que
esses sejam retirados de solução. Para tanto, o complexo anticorpo-antígeno é acoplado
em alguma plataforma sólida, como resinas ou microesferas de polietileno, permitindo
sua concentração. Dependendo dos tampões e intensidade das lavagens, no entanto, outros
componentes celulares que porventura estejam quimicamente ligados à molécula-alvo, de
forma direta ou indireta, também podem ser precipitados. Como proteínas Argonauta se
ligam tanto ao miRNA quanto ao transcrito-alvo, sua imunoprecipitação por anticorpos
específicos pode revelar também quais RNAs celulares estão possivelmente sofrendo processo
de repressão mediado por RISC.

Abordagens computacionais e moleculares para identificação de alvos de microRNAs 249

 3.5.1 RIP-Chip
A primeira metodologia desenvolvida para esse fim recebeu o nome RIP-Chip
(Ribonucleoprotein ImmunoPrecipitation-microarray) (Ikeda et al., 2006). Nesse caso, faz-se
uma extração de RNA a partir do material imunoprecipitado que é então hibridado em um
chip de microarranjo, como anteriormente explicado. Através desse procedimento, portanto,
descobre-se não só que RNAs estão sendo regulados pela proteína, mas também o nível de
regulação. A técnica de RIP-Chip, no entanto, produz um alto número de falsos-positivos,
ou seja, acúmulo de RNAs que não interagem com a proteína Argonauta, mas que foram
imunoprecipitados de forma não específica.

3.5.2 TAP-Tar
Para tentar contornar esse limitante, a técnica de RIP-Chip foi modificada, recebendo o
nome de TAP-Tar (Tandem Affinity Purification of miRNA TARget mRNAs) (Nonne et al., 2010).
Nessa técnica são realizados dois processos de imunoprecipitação seguidos, diminuindo-
se assim a concentração de RNAs inespecíficos. Para tanto, inicialmente os extratos
celulares são tratados com um miRNA modificado específico, contendo uma biotina na sua
extremidade 5’. A biotina é uma proteína muito pequena envolvida na síntese de ácidos
graxos e alguns aminoácidos. Ela, no entanto, possui altíssima afinidade química por uma
proteína bacteriana chamada estreptavidina. Espera-se, assim, que o miRNA inserido no
sistema seja incorporado em proteínas Argonauta, conduzindo essas para os RNAs-alvo.
Dessa forma, após a imunoprecipitação da Argonauta, um segundo processo de precipitação
pode ser realizado através da interação específica e forte entre a biotina e a estreptavidina,
reduzindo-se consideravelmente o número de falsos-positivos. Assim como em RIP-Chip, o
material final é usado para extração de RNA e esse, hibridado em chips de microarranjo.
As técnicas de RIP-Chip e TAP-Tar, portanto, permitem a identificação de RNAs
associados com Argonauta, não importando se o mecanismo de regulação ocorre por clivagem

Figura 6. Imunoprecipitação de Argonautas permite capturar, a partir da amostra de interesse, os complexos

Argonauta/microRNA interagindo com seus alvos.

250 Introdução ao mundo dos microRNAs

ou inibição de tradução, apesar de o segundo mecanismo ser mais facilmente observado,
em função da maior estabilidade do transcrito. No entanto, as duas técnicas apresentam
fortes limitações. Como as interações são analisadas em extratos celulares, ou seja, após o
rompimento de células ou tecidos, existe uma chance de os resultados observados serem
factoides, ocasionados pela reunião acidental de RNAs e miRNAs. Por exemplo, algumas das
interações observadas em extratos jamais poderiam ocorrer in vivo em função do miRNA
e seu alvo serem normalmente expressos em tecidos diferentes. E mesmo que o par seja
expresso no mesmo tipo celular, esses podem estar localizados em regiões diferentes da célula,
como citoplasma e retículo endoplasmático. Além disso, muitas interações verdadeiras entre
miRNAs e alvos podem ser perdidas simplesmente por não sobreviverem aos processos de
imunoprecipitação. No caso específico de TAP-Tar, a presença da biotina no miRNA pode
também provocar alterações imprevisíveis com seus alvos.

3.5.3 HITS-CLIP
Para resolver todas essas questões, uma técnica chamada HITS-CLIP (HIgh-Throughput
Sequencing of RNA isolated by CrossLinking ImmunoPrecipitation) foi desenvolvida (Chi et
al., 2009). Assim como as demais, HITS-CLIP também se baseia na imunoprecipitação de
proteínas Argonauta com anticorpos específicos. Porém, nessa técnica foi adicionado um
passo inicial de hibridação em que as interações de miRNAs com seus alvos e desses com
Argonauta são “congeladas” através da irradiação com luz ultravioleta. Esse processo, portanto,
evita o pareamento espúrio de miRNAs com alvos novos não relacionados ao seu contexto
celular original, solucionando um dos principais problemas associados às técnicas RIP-Chip e
TAP-Tar. Após a aplicação de ultravioleta, o material segue o processo de imunoprecipitação
da Argonauta e extração do RNA utilizado para sequenciamento em larga escala, gerando
dados em escala genômica.

3.5.4 PAR-CLIP
Um refinamento da técnica HITS-CLIP foi mais recentemente desenvolvido,
denominando-se PAR-CLIP (PhotoActivatable-Ribonucleoside-enhanced CrossLinking and
ImmunoPrecipitation) (Hafner et al., 2010). Nessa técnica, o comprimento de onda do ultravioleta
irradiado foi modificado, passando de 254 nm para 365 nm, permitindo uma ligação mais
forte entre os componentes. Essa modificação só é possível, no entanto, devido à incorporação
prévia de nucleotídeos fotoativos pelas células. A recuperação de RNAs após esse procedimento
é de 100 a 1.000 vezes maior do que pelo método de irradiação de ultravioleta convencional.
Além disso, esses análogos de nucleotídeos promovem mutações de timina para citosina,
facilitando a identificação de onde, exatamente, os miRNAs pareiam nos alvos.

3.5.5 iCLIP
Além de HITS-CLIP e PAR-CLIP, existem ainda duas metodologias chamadas iCLIP
(individual-nucleotide resolution Cross-Linking and ImmunoPrecipitation) (Konig et al., 2010) e
CLASH (cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids) (Kudla et al., 2011) que também tiram
proveito da irradiação por ultravioleta para estabilizar interações entre RNAs e proteínas.
No protocolo iCLIP, após a estabilização e imunoprecipitação proteica, um adaptador
é ligado nos RNAs antes da realização da transcrição reversa. No entanto, esse processo é
feito ainda na presença de polipeptídeos derivados da proteína imunoprecipitada. Dessa

Abordagens computacionais e moleculares para identificação de alvos de microRNAs 251

 forma, a enzima sempre interrompe a síntese de cDNA nos sítios onde o polipeptídeo está
ancorado, ainda resultado do “congelamento” promovido pela luz ultravioleta, gerando
fragmentos truncados. Através de um processo de circularização, os cDNAs truncados podem
então ser utilizados para amplificação por PCR e em seguida sequenciados em larga escala.
O mapeamento dessas sequências no genoma, dessa forma, indica a posição exata em que a
proteína estava ligada com o RNA, pois equivale à posição em que houve a interrupção do
processo de transcrição reversa. A técnica iCLIP já foi usada para testar diversas interações
entre RNAs e proteínas, sendo recentemente também aplicada para o estudo de Argonautas
associadas com miRNAs em C. elegans (Broughton; Pasquinelli, 2013).

3.5.6 CLASH
Já a metodologia CLASH diferencia-se das demais pelo fato de tentar identificar não
só o RNA-alvo, mas também associar diretamente o miRNA que medeia a repressão. Em
outras palavras, o método é desenvolvido para detectar híbridos de RNA-RNA associados
com proteínas. Para tanto, após o tratamento com ultravioleta e imunoprecipitação, o
miRNA é fisicamente ligado com seu alvo, formando uma quimera. Populações de RNAs
híbridos são então sequenciadas e em seguida programas de bioinformática são aplicados
para reconstruir o pareamento original que existia entre os RNAs. Uma síntese de todas as
técnicas moleculares pode ser vista na tabela 2.

4. Considerações finais
MiRNAs são considerados hoje em dia importantes reguladores de praticamente todos os
processos celulares. Entender que genes são regulados por eles, portanto, é fundamental para
compreender seus papéis fisiológicos. Desde seu descobrimento, no entanto, a identificação de
alvos de miRNAs mostrou-se uma tarefa bastante complicada. Para chegar ao desenvolvimento
de todas as técnicas hoje existentes, um grande esforço de ciência básica foi executado com o
objetivo de entender melhor as regras biológicas de seleção e repressão de alvos por miRNAs.
Após o entendimento das primeiras regras, diversas ferramentas computacionais de
identificação de alvos foram desenvolvidas. A utilidade dessas ferramentas é óbvia, uma vez
que permitem a identificação rápida de alvos, a baixo custo. Os programas existentes podem
levar em consideração diferentes aspectos da biologia dos miRNAs, como necessidade ou não
de pareamento na região seed, conservação ou não do sítio de ligação dos miRNAs em outras
espécies relacionadas e restrição ou não das análises em regiões 3’ UTRs dos transcritos. Dados
experimentais em animais já foram capazes de confirmar diversas interações inicialmente
preditas por bioinformática, especialmente nos programas que colocam mais peso nas análises
na região seed. Contudo, a identificação in silico apresenta grandes limitações e gera alto
número de falsos-positivos.
Com o intuito de aprimorar a identificação de alvos, diversos procedimentos
experimentais foram desenvolvidos. A técnica a ser escolhida, no entanto, depende do objetivo
da pesquisa. Se a análise restringe-se a poucos miRNAs, então técnicas como superexpressão
seguida por sequenciamento massivo ou Chip, 5’ RACE modificado ou uso de proteínas
marcadoras podem ser bastante reveladoras.
No entanto, se o objetivo da pesquisa é ter uma visão global de todos os RNAs degradados
por miRNAs em uma determinada condição de crescimento ou estresse, então técnicas de

252 Introdução ao mundo dos microRNAs

PARE ou semelhantes podem ser a melhor escolha. Mas se uma visão global de RNAs inibidos
traducionalmente por miRNAs também é relevante, então técnicas de imunoprecipitação
de proteínas Argonauta como PAR-CLIP, iCLIP ou CLASH são mais indicadas. Estamos, no
entanto, longe de conhecer todos os detalhes do processo de regulação e seleção de alvos de
miRNAs. Dessa forma, novos aprimoramentos ou técnicas podem ser gerados em um futuro
próximo para a identificação de alvos ou até de redes regulatórias.
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Estratégias para Capítulo
depleção de miRNAs 14
AntimiRs, esponjas artificiais
e modificações genéticas

Prof.a Dr.a Cláudia Vianna Maurer-Morelli1 e

Prof. Dr. Vinícius D’Ávila Bitencourt Pascoal2
1
Depto. de Genética Médica, FCM - UNICAMP - SP
2
Depto. de Ciência Básica, Nova Friburgo, Universidade Federal Fluminense - RJ

Estruturação do capítulo
1. Introdução
2. Oligonucleotídeos antissenso - antimiRs
2.1 Vantagens e limitações dos antimiRs
3. Esponjas artificiais de miRNAs
3.1 Vantagens e limitações das esponjas de miRNAs artificiais
4. Modificações em genes de microRNAs
4.1 Knockouts por métodos convencionais
4.2 Knockouts condicionais
4.3 Vantagens e limitações dos knockouts por métodos convencionais
4.4 Knockouts via CRISPR/Cas9
4.5 Exemplos de aplicação
4.6 Vantagens e limitações dos knockouts por CRISPR/Cas9
5. Conclusões

Estratégias para depleção de miRNAs 255

 1. Introdução
Este capítulo tem por objetivo apresentar estratégias para depleção (i.e., a redução
ou anulação) do nível de determinado miRNA na célula, tal como a inibição no nível pós-
transcricional (via antimiRs ou esponjas artificiais de miRNAs) ou modificação dos genes de
microRNAs (gerando organismos knockout e nulos). Independente da abordagem empregada,
os estudos de perda de função são um meio elegante de se compreender o papel e a relevância
de um miRNA em condição fisiológica ou patológica (Ruberti; Barbato; Cogoni, 2012). Por
existirem muitos e diferentes protocolos em cada técnica, neste capítulo serão apresentadas
as bases conceituais de cada estratégia, seus princípios de ação, aplicações, método de análise,
vantagens e desvantagens, além de recursos facilitadores para quem pretende empregar
algumas dessas ferramentas.

2. Oligonucleotídeos antissenso - antimiRs

Oligonucleotídeos antissenso de miRNAs, conhecidos de forma geral como antimiRs,
são moléculas de RNA artificialmente desenhadas para serem complementares aos miRNAs
endógenos maduros. Uma vez introduzido na célula, o antimiR se liga por complementariedade
ao miRNA-alvo (fita guia em miRISC), prevenindo assim a interação com seus mRNAs-alvo
(figura 1) (Stenvang et al., 2012). Tipicamente, essa técnica gera um efeito transiente, reprimindo
apenas temporariamente os miRNAs endógenos; no entanto, pela facilidade de aplicação,
esse método tornou-se muito popular para as investigações de alvos e funções de miRNAs
(Stenvang et al., 2012; Horwich; Zamore, 2008; Krützfeldt et al., 2005).
Importante lembrar que ao se introduzir uma molécula exógena é natural que ela
seja alvo de nucleases. Portanto, para que um antimiR promova uma inibição eficiente,
deve-se levar em consideração que, além da especificidade, essa molécula deve ser resistente
à degradação (Stenvang et al., 2012; Kurreck, 2003). Essa resistência pode ser obtida por
meio de modificações químicas específicas que, em alguns casos, são também capazes de
aumentar a afinidade ao seu alvo (Stenvang et al., 2012; Esau, 2008).
Nesse aspecto, o leitor encontrará diferentes modificações e, consequentemente,
diferentes nomes para as moléculas antimiR, segundo essas modificações (Stenvang et al.,
2012). Essas alterações podem estar concentradas na ribose, na base ou, ainda, no grupamento
fosfato (Horwich; Zamore, 2008). Não se pode dizer que há uma melhor modificação dentre

Figura 1. Mecanismo de ação de moléculas antimiR. MiRISC é capaz de se ligar ao mRNA-alvo, inibindo sua tradução
(esquerda). O antimiR se liga ao miRNA presente em miRISC, impedindo-o de agir sobre o mRNA-alvo (direita).

256 Introdução ao mundo dos microRNAs

todas, mas sim que há boas opções que devem ser selecionadas de acordo com a necessidade
da experimentação (Lennox; Behlke, 2011).
As modificações na posição 2’ da ribose conferem não somente maior resistência
para o antimiR no ambiente intracelular mas também tornam essas moléculas mais
eficientes em relação à sua afinidade com seus alvos. As modificações mais usadas desse
tipo são: 2’-O-metil (2’-OMe), 2’-O-metoxietil (2’-MOE) e 2’-fluoro (2’-F), todas conferindo
boa estabilidade ao antimiR (Esau, 2008).
O nucleotídeo do tipo LNA (do inglês locked nucleic acid) possui uma modificação
que bloqueia metade da ribose por meio de uma ponte metil entre as posições 2’ oxigênio
(2’-O) e 4’ carbono (4’-C). Essa modificação faz com que o antimiR LNA adquira uma
conformação bloqueada, altamente resistente e eficiente mesmo em situação onde há
altas concentrações de GC (Stenvang et al., 2012; Horwich; Zamore, 2008).
Quando o antimiR está conjugado a uma molécula de colesterol ele é denominado
antagomiR. Essa molécula, de 21 a 23 nucleotídeos, possui modificações 2’-O-metil e ligação
fosforotioato associada a uma molécula de colesterol na posição 3’ e tem se mostrado
estável, eficiente e de fácil carreamento, principalmente para ser aplicada em estudos in
vivo (Krützfeldt et al., 2005).
A resistência dos antimiRs também pode ser aumentada por modificações no
arcabouço (backbone), como a troca de um oxigênio por um enxofre na ligação fosfodiéster,
de modo a formar uma ligação fosforotioato (Stenvang et al., 2012). Apesar da comprovada
resistência às nucleases, esse tipo de modificação diminui a afinidade pelo alvo, mas por
outro lado pode ser necessária para ensaios de longa duração (Esau, 2008).
Importante ressaltar que há outra classe de oligonucleotídeos antissenso denominados
Morfolinos (MO) que geralmente possuem 25 nt e se ligam por complementariedade a
um RNA ou miRNA, promovendo a inibição da molécula-alvo. Devido ao seu arcabouço
modificado, essas moléculas são estáveis e resistentes à degradação in vivo. Além disso,
os MOs não desencadeiam a resposta imune do organismo (Skromne; Prince, 2008) e não
promovem a degradação de seus RNAs-alvo, como acontece com outras moléculas (Bill et
al., 2009; Summerton, 2007; Nasevicius; Ekker, 2000). Essa técnica tem sido muito utilizada
para o silenciamento temporário (geralmente em torno de cinco dias) de mRNAs ou de
miRNAs por microinjeção direta, em especial em embriões de zebrafish (Danio rerio, o
peixe paulistinha) (Rajaram et al., 2014; Wang et al., 2013). Uma evolução dessas moléculas
são os “Vivo-Morfolinos”, que podem ser usados em animais adultos e em tempo curto
(três dias), sendo sugerido um protocolo de dois dias de injeções intravenosas seguido de
análise fenotípica ao terceiro dia. Essa molécula mostrou-se eficiente em múltiplos tecidos
in vivo (Morcos; Li; Jiang, 2008).
O protocolo para se desenhar um antimiR é geralmente simples, rápido e muitas
empresas especializadas oferecem esses serviços em seus sites (vide alguns exemplos
de recursos Web no final desta seção). Importante destacar que todos os experimentos
precisam ser confirmados quanto a sua especificidade, então é desejável o uso de um
controle negativo confiável. Esse controle negativo pode ser: (i) uma sequência antissenso
não relacionada (e.g., um antissenso para um gene não relacionado, de outra espécie), (ii)
uma versão scrambled do antimiR experimental (i.e., um antimiR com a mesma composição
nucleotídica, porém com sequência embaralhada) ou (iii) o mesmo antimiR desenhado
com uma região de mal pareamento (mismatch de 4 bases) na região complementar à seed
do miRNA (Horwich; Zamore, 2008).

Estratégias para depleção de miRNAs 257

 A administração da molécula é um passo crítico na técnica e pode ser realizada por
meio de: injeção (in vivo), microinjeção (embriões) ou transfecção usando-se um lipídio
catiônico (células) (Stenvang et al., 2012; Bill et al., 2009; Horwich; Zamore, 2008; Morcos;
Li; Jiang, 2008). A concentração de antimiRs pode variar dependendo do sistema estudado
e do meio de administração, mas geralmente fica entre 10-50nM quando se trata de estudo
em cultura celular, sendo no máximo 100 nM ao se utilizar lipídio (Wang, 2009a).
Após a introdução dos antimiRs no sistema de estudo (in vitro ou in vivo), a inibição
do miRNA pode ser confirmada e quantificada por diferentes métodos, como northern blot
(observação de gel shift do heteroduplex antimiR:miRNA) ou ainda microarray (investigando
as alterações no transcriptoma após a intervenção no miRNA de interesse) (Stenvang et al.,
2012). Pode-se também quantificar o nível do mRNA-alvo por RT-qPCR (quando o mecanismo
de ação for desestabilização do RNA) ou o nível proteico do gene-alvo do miRNA inibido, por
western blot. Adicionalmente, a validação da inibição de um miRNA pode ser testada por ensaios
que envolvam genes repórteres como GFP ou Luciferase , pois por esse método espera-se que
a atividade repórter esteja aumentada quando houver uma diminuição eficiente do miRNA
endógeno (vide cap. 13) (Stenvang et al., 2012; Wang, 2009a; Esau, 2008; Horwich; Zamore, 2008).

2.1 Vantagens e limitações dos antimiRs

Certamente, uma das maiores vantagens dos antimiRs é oferecer uma inibição rápida
e confiável do miRNA-alvo para entender seu papel ou validar quais são seus mRNAs-alvo.
Essa molécula é adquirida comercialmente (assim como os primers), portanto não há nenhum
tipo de procedimento laboratorial prévio para sua obtenção.
Contudo, uma limitação dessa estratégia está relacionada a uma característica inerente
a muitos miRNAs: o compartilhamento de sequências seed; portanto, o fenótipo esperado
pode não ser tão evidente. Adicionalmente, frente à eventual necessidade de se aumentar
a concentração de antimiRs (para melhor inibição), pode-se elicitar efeitos não desejáveis.
Por fim, a limitação de determinado antimiR não conseguir inibir simultaneamente diversos
miRNAs com diferentes seeds, como as esponjas artificiais de miRNAs, discutidas a seguir
(Wang, 2009a; Esau, 2008; Horwich; Zamore, 2008).
Recursos web para predição de alvo, desenho, aquisição de moléculas antissenso e
controles (positivo e negativo), entre outros são apresentados a seguir:
AntagomirBase http://bioinfo-presiuniv.edu.in/antagomirbase_intro.php
miRBase http://www.mirbase.org/
Ambion® Anti-miR™ miRNA Inhibitors http://www.lifetechnologies.com/br/en/
home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/mirna-profiling-/ambion-anti-
mir-inhibitors.html
IDT® miRNA Inhibitors https://www.idtdna.com/pages/products/mirna
Gene-Tools http://www.gene-tools.com/
Exiqon http://www.exiqon.com/lna-technology

3. Esponjas artificiais de miRNAs

Em plantas, animais e humanos é possível encontrar moléculas de RNA não codificadoras,
conhecidas como esponjas de miRNAs, que atuam como um importante mecanismo regulatório
endógeno (vide cap. 17). Essas esponjas naturais diminuem a ação de miRNAs sobre seus

258 Introdução ao mundo dos microRNAs

mRNAs-alvo uma vez que elas servem de “chamarizes” ou “armadilhas” para os miRNAs
(Tay et al., 2015; Wang et al., 2013; Ivashuta et al., 2011).
Com base nos mecanismos dessas esponjas naturais, pode-se desenhar construções
artificiais que funcionam com o mesmo princípio. As esponjas artificiais de miRNAs podem
ser definidas como transcritos, expressos a partir de promotores fortes (como RNA polimerase
II ou III), contendo múltiplas sequências em tandem que são complementares a miRNAs
específicos ou famílias de miRNAs de interesse (Ebert; Neilson; Sharp, 2007).
De modo contrário aos antimiRs, que agem em miRNAs individuais, as esponjas
competem (com os mRNAs-alvo) de forma múltipla, servindo de “armadilha” para os miRNAs
com a mesma família seed (Tay et al., 2015; Ebert; Neilson; Sharp, 2007). Esse tipo de construção
propicia uma diversidade de ação que pode ser mais eficiente na geração de um determinado
fenótipo, pois explora processos envolvendo múltiplos miRNAs e, consequentemente, múltiplos
genes, o que é mais próximo da realidade biológica (Ebert; Neilson; Sharp, 2007).
Ao se desenhar uma esponja de miRNAs deve-se levar em conta o pareamento direto
de bases na região seed do miRNA maduro, para a eficiência da interação molécula-alvo
(Tay et al., 2015). Apesar de alguns estudos apontarem para uma eficiente ação inibitória
com esponjas de sequências perfeitamente pareáveis (perfect match), é recomendado que,
ao se construir uma esponja, a sequência complementar ao miRNA maduro apresente um
anelamento imperfeito pela introdução de quatro bases centrais não pareáveis (mismatches)
(Kluiver et al., 2012; Ebert; Neilson; Sharp, 2007). O objetivo desses mismatches é criar
uma protuberância, impedindo assim a clivagem pela Argonauta 2 e, consequentemente,
protegendo a integridade da esponja (figura 2). Portanto, essa estratégia aumenta a eficiência
da esponja artificial de miRNAs e garante uma expressão mais estável, desejável em estudos
que requeiram uma perda de função de longo prazo (Kluiver et al., 2012a; 2012b; Gentner
et al., 2009; Ebert; Neilson; Sharp, 2007).
Outro aspecto importante para a eficiência dessa construção é a inclusão de múltiplos
locais de ligação de miRNA. Após testarem esponjas com diferentes números de sítios de
ligação, Ebert e colaboradores relataram que construções com mais de seis sítios de ligação
parecem exercer pouco efeito aditivo na eficiência da esponja e podem aumentar a chance
de serem degradadas (Kluiver et al., 2012a; 2012b; Ebert; Sharp, 2010; Ebert; Neilson; Sharp,
2007). Importante destacar que, entre os oligonucleotídeos antissenso de miRNA devem haver
variações nas sequências irrelevantes, para diminuir a chance de recombinação entre eles
durante a clonagem (figura 2) (Ebert; Sharp, 2010; Ebert; Neilson; Sharp, 2007).

Figura 2. Esponja artificial de miRNAs. Exemplo de um cassete de expressão de uma esponja, com um gene repórter
GFP fusionado a 3’ UTR portando repetidos sítios de ligação ao miRNA-alvo (sequências antissenso ao microRNA). O
mal pareamento (mismatch) entre miRNA e esponja previne a clivagem pela Argonauta2, tornando a esponja estável.
CMV: promotor do citomegalovírus; Sinal: sequência para poliadenilação

Estratégias para depleção de miRNAs 259

 Outros aspectos que devem ser levados em consideração são: (i) definir o melhor
promotor para a expressão da esponja, de acordo com a aplicação desejada, e (ii) que a eficácia
da esponja é depende da concentração de miRNA do tecido ou organismo analisado. Ebert e
Sharp (2010) apresentam uma tabela que resume diferentes construções de esponjas e suas
aplicações. No entanto, é importante ressaltar que antes de se confeccionar a esponja há a
necessidade de uma validação in silico quanto à sua especificidade (Kluiver et al., 2012a;
2012b). Com esse objetivo podemos citar dois softwares disponíveis na internet: (i) PITA,
que é um executável que pode ser baixado por meio do endereço http://genie.weizmann.
ac.il/pubs/mir07 (Kertesz et al., 2007) e (ii) STarMir, para calcular a energia necessária para
a hibridização entre miRNA e alvo, disponível no site http://sfold.wadsworth.org (Long et
al., 2007).
Para exemplificar a construção de uma esponja artificial, encontram-se esquematizados
na figura 3 os principais passos de um protocolo descrito por Wang (2009b) e que teve por
base o estudo original de Ebert e colaboradores (2007). Outros tipos de construção e vetores
usados em esponjas de miRNAs podem ser encontrados em Ebert e Sharp (2010) e Kluivert
et al. (2012).
A validação funcional da esponja pode ser realizada em células que contenham
miRNAs-alvo em abundância. Caso isso não seja possível, deve-se realizar uma cotransfecção
de células com a esponja e miRNAs miméticos (Wang, 2009b). Assim como descrito para os
antimiRs, a eficiência da transfecção pode ser mensurada por ensaios com gene repórter
GFP ou Luciferase (Svoboda, 2015; Kluiver et al., 2012a; 2012b; Otaegi et al., 2011). Os níveis
das proteínas-alvo dos miRNAs investigados podem ser mensurados por meio do western
blot e se espera que estejam superexpressos.

3.1 Vantagens e limitações das esponjas artificiais de miRNAs

A grande vantagem das esponjas artificiais de miRNAs reside no fato de serem simples,
custo-efetivas e com alta eficiência na inibição de múltiplos miRNAs; consequentemente,
evita-se a aplicação de um coquetel com vários antimiRs para se atingir o mesmo objetivo
(Svoboda, 2015). Além disso, as esponjas de miRNAs podem ser estáveis, caso o cassete de
expressão da esponja seja inserido no genoma (Ebert; Neilson; Sharp, 2007).
No entanto, quando comparadas com os antimiRs, o tempo para se desenhar, construir
e testar os vetores é maior. Além disso, a transfecção das esponjas é considerada menos
eficiente quando comparada com a dos antimiRs (Horwich; Zamore, 2008).
Alguns recursos web para desenho, aquisição e protocolo para o uso das esponjas
artificiais de miRNAs são apresentados:
Addgene https://www.addgene.org/search/advanced/?q=sponge
PITA http://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07
STarMir http://sfold.wadsworth.org

4. Modificações em genes de microRNAs

Outra forma de se reduzir os níveis intracelulares de determinado miRNA é
promover mutações no respectivo gene codificador. Ao contrário dos antimiRs e esponjas
que temporariamente reduzem (mas não anulam) os níveis de certo miRNA, mutações no

260 Introdução ao mundo dos microRNAs

gene codificador desse miRNA são permanentes e podem zerar os níveis da versão funcional
do microRNA dentro da célula.
É importante ressaltar que existem diferentes tipos de mutações como a deleção por
inteiro de um gene codificador do microRNA que gera células/organismos denominados “nulos”
(sem o gene) (Fragoso et al., 2012), assim como a deleção de parte crucial do gene ou mutações
pontuais (inserção deleção de poucos nucleotídeos) que inviabilizam a funcionalidade do
miRNA e geram células/organismos denominados knockout (KO). De uma forma ou de outra,
a célula ficará totalmente desprovida da versão madura funcional do miRNA, permitindo
assim conduzir os estudos.

Figura 3. Esquema para a construção de uma esponja artificial de miRNAs. A figura mostra os principais passos de
um protocolo para a construção de uma esponja artificial de miRNAs. Esse protocolo é baseado no trabalho de Wang
(2009b), que teve por base o estudo original de Ebert e colaboradores (2007).

Estratégias para depleção de miRNAs 261

 4.1 Knockouts gerados por métodos tradicionais
Em linhas gerais, a estratégia para se nocautear um gene baseia-se na microinjeção de
uma versão modificada do seu gene de interesse em células embrionárias (de camundongos,
por exemplo). Deve-se, portanto, criar uma versão de mutação que inviabilize a produção
de uma proteína (ou microRNA) funcional (Park; Choi; McManus, 2010; Wang, 2009c).
Importante ressaltar que essas células embrionárias darão origem a um animal
denominado de geração F0 e que é considerado uma quimera. Se células contendo a mutação
desejada derem origem à linhagem germinativa, esse alelo poderá ser herdado (ou seja, o
camundongo poderá transmitir esse alelo para sua prole). Esse animal quimera (F0), ao ser
cruzado com um animal normal, pode gerar um animal inteiro com a mutação desejada
(considerado geração F1). Destaca-se que a prole de animais F1 apresentará apenas um, dos
dois alelos do genoma, mutado, sendo considerado heterozigoto para a mutação. Portanto,
será necessário realizar cruzamentos seletivos a fim de se obter um camundongo homozigoto,
ou seja, portando dois alelos mutados; o que ocorre geralmente a partir da F2 (Hall; Limaye;
Kulkarni, 2009; Wang, 2009c).
Em resumo, os métodos tradicionais para criação de um animal KO são: (i) laboriosos,
caros e tecnicamente complexos (por demandarem técnicas especializadas para a manutenção
de células pluripotentes e pessoal técnico bem treinado), (ii) morosos (por demandar
cruzamentos até se obter um animal com os dois alelos mutados) e (iii) dependentes de
um pouco de “sorte”, visto que a recombinação é aleatória. No entanto, uma vez obtido o
animal homozigoto para a mutação, pode-ser manter uma linhagem knockout para o gene
de interesse por meio de cruzamentos controlados.
Organismos KO para as enzimas-chave do processamento de miRNAs (como a Dicer
e a Argonauta2) são inviáveis. Contudo, animais KO para genes individuais de miRNAs são
viáveis em diversas espécies, como camundongos, C. elegans e drosófilas (Morita et al., 2007;
Bernstein et al., 2003); Park; Choi; McManus, 2010).
É importante salientar que nem sempre o nocauteamento individual de genes de
miRNAs promove fenótipos óbvios, visto que muitos miRNAs possuem redundância funcional
ou trabalham em cooperação. Nesses casos faz-se necessário que os genes codificadores dos
miRNAs redundantes (ou dos que atuam em cooperação) sejam simultaneamente nocauteados
para que se estabeleça o fenótipo. Isso torna a abordagem ainda mais complexa e difícil
(Park; Choi; McManus, 2010; Liu et al., 2008).

4.2 Knockouts condicionais

Em alguns casos, a disrupção de um determinado gene de miRNA pode levar à morte
do embrião, impedindo, dessa forma, o estudo mais aprofundado sobre o papel desse miRNA
(Park; Choi; McManus, 2010). Isso ocorre porque esse miRNA específico teria uma função
essencial durante o desenvolvimento.
Uma abordagem para contornar esse problema é o knockout condicional (ou deleção
condicional) por meio do sistema CreLoxP, que garante um controle espacial e temporal
da modificação genética (Gavériaux-Ruff; Kieffer, 2007). Nesse sistema, camundongos com
sítios LoxP flanqueando o gene de interesse são cruzados com camundongos transgênicos,
expressando a enzima Cre recombinase, sob o controle de um promotor que dirige o tempo
e local da expressão da Cre. O cruzamento entre os animais carregando essas alterações
permitirá que haja uma recombinação mediada pela Cre no gene “floxado” (gene flanqueado

262 Introdução ao mundo dos microRNAs

por sítios LoxP), ou seja, a Cre recombinase reconhece locais LoxP e retira a sequência
de DNA entre eles, gerando assim um animal knockout (ou nulo) para o gene de interesse
(Gavériaux-Ruff; Kieffer, 2007).
Esse protocolo tem sido usado com sucesso por muitos pesquisadores (Park; Choi;
McManus, 2010). Para investigar a função do cluster miR17~92, um grupo de pesquisadores
usou a estratégia do knockout condicional em progenitores de néfrons e seus derivados
e observou que os animais mutantes desenvolveram sinais de doença renal (Marrone et
al., 2014). Semelhantemente, Barritt e colaboradores (2012) construíram um animal Pax2-
Cre/Dicer1 e observaram uma disrupção do crescimento palatal e da mineralização óssea
durante o desenvolvimento, criando uma oportunidade para novas investigações das funções
de miRNAs mediando vias de sinalização durante a palatogênese (Barritt et al., 2012).

4.3 Vantagens e limitações dos knockouts

gerados por métodos tradicionais
Organismos KO representam uma eficiente estratégia para o estudo da função de
microRNAs (assim também como a identificação de seus genes-alvo), pois ela zera os níveis
de determinado miRNA dentro da célula (ao contrário da inibição, que simplesmente reduz).
No entanto, dentre as dificuldades podemos citar: (i) que muitos genes de miRNAs
apresentam múltiplas cópias e (ii) que muitos miRNAs apresentam redundância de função.
Portanto, nesses casos, o nocauteamento de um gene de miRNA não é suficiente para promover
alterações fenotípicas, pois outras cópias funcionais (ou outros miRNAs com função similar)
irão mascarar a ausência do gene mutado (Park; Choi; McManus, 2010).
Adicionalmente, comparada com outras técnicas, como as de inibição (por antimiRs
ou esponjas) ou de knockout via CRISPR/Cas9 (que será discutida a seguir), os métodos
convencionais para nocautear genes são relativamente caros, demorados, laboriosos e
complexos (Wang, 2009c).
Recursos web para dados integrados de genética, genômica, fenótipos, linhagens de
camundongos e distribuição de recursos:
International Knockout Mouse Consortium (IKMC) http://www.knockoutmouse.org
International Mouse Phenotyping Consortium - http://www.mousephenotype.org/
European Mouse Mutant Archive - EMMA - (participante do IKMC) http://www.
emmanet.org
Mouse Genome Database (MGD) http://www.informatics.jax.org
CREATE (Coordination of resources for conditional expression of mutated mouse
alleles) http://www.creline.org/
Jackson Laboratory http://jaxmice.jax.org/index.html

4.4 Knockouts gerados por CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 (do inglês Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-
associated protein 9), é uma técnica recente (2012) que permite a edição de genomas (disrupção,
adição ou alteração de sequência de genes) e que tem chamado a atenção da comunidade
científica por ser rápida, simples, eficiente e escalonável (uso em larga escala) (Sternberg;
Doudna, 2015; Hsu; Lander; Zhang, 2014).

Estratégias para depleção de miRNAs 263

 A técnica baseia-se em dois principais componentes: a proteína Cas9 e uma molécula
de RNA denominada gRNA (do inglês guide RNA). Cas9 é uma endonuclease com dois domínios
catalíticos, HNH e RuvC, cada qual responsável por clivar uma das fitas de DNA, formando
assim a quebra da dupla fita (Hsu; Lander; Zhang, 2014; Jinek et al., 2012). O gRNA é uma
molécula simples formada pela fusão do crRNA (que contém a sequência complementar
ao DNA-alvo) e do tracrRNA (que tem a missão de recrutar a Cas9). O gRNA se complexa à
Cas9 para guiá-la até a sequência-alvo no genoma a ser editada (Sternberg; Doudna, 2015;
Jinek et al., 2012).
A sequência nucleotídica da gRNA é desenhada para emparelhar, por
complementariedade, com uma região de 20 nt a partir da sequência NGG do gene-alvo
(sequência PAM, do inglês protospacer-adjacent motif) (Sternberg; Doudna, 2015). É por meio
do reconhecimento da região PAM na fita oposta, que o sgRNA conduz a Cas9 à sequência-
alvo no genoma para a clivagem da dupla fita (figura 4). É importante dizer que a sequência
PAM pode ser encontrada em vários pontos do genoma, o que permite que a técnica possa
ser aplicada em múltiplos lugares de interesse (Doudna; Charpentier, 2014). A clivagem da
dupla fita permite que o mecanismo de reparo celular natural seja recrutado, resultando (i)
no reparo por recombinação homóloga ou (ii) no reparo por junção de pontas não homólogas
(Doudna; Charpentier, 2014; Mali et al., 2013).
O reparo por recombinação homóloga pode levar à precisa correção da dupla fita de
DNA se houver a coadministração de moléculas sintéticas de DNA com a sequência certa.
Por sua vez, o reparo por junção de pontas não homólogas tende a introduzir indels (inserção/
deleção de um número variável de nucleotídeos), levando à perda de função (nocauteamento)
do gene-alvo (Hsu; Lander; Zhang, 2014; Harrison et al., 2014).

4.5 Exemplos de aplicação

Até o momento a maioria dos trabalhos que empregam o sistema CRISPR/Cas9 estão
focados em genes codificadores de proteínas, mas já é possível encontrar trabalhos que
obtiveram sucesso no knockout de genes de miRNA.

Figura 4. Representação de um sistema CRISPR/Cas9. O RNA guia (gRNA) é formado pela fusão entre o crRNA (que
carreia a sequência complementar ao alvo) e o tracrRNA (que recruta a Cas9) e guia a nuclease Cas9 até o alvo genômico
próximo à sequência PAM (Protospacer Adjacent Motif). A clivagem do alvo genômico recruta o mecanismo de reparo
por junção de pontas não homólogas, facilitando, assim, a inserção de indels no local.

264 Introdução ao mundo dos microRNAs

 Como exemplo podemos citar o trabalho de Jiang e colaboradores (2014), que usaram
o sistema CRISPR/Cas9 para investigar a função do miR-93 (um oncomiR) em células HeLa.
Nesse trabalho, os pesquisadores desenharam uma construção para alvos da região 5’ do
miR-93, que inclui a sequência seed e região de processamento da Drosha. Eles demonstraram
que pequenos indels causaram uma eficiente disrupção do miR-93 nas células mutadas,
garantindo não só um knockout específico como um retardo no processamento da Drosha
(Jiang et al., 2014).
Além de alguns outros exemplos em células humanas (Ho et al., 2015), esse sistema
também já foi aplicado em importantes modelos experimentais, como o zebrafish. Nesse
modelo o CRISPR/Cas9 foi empregado para a completa deleção de um miRNA individual (dre-
mir-126a) e de um cluster de miRNA no cromossomo 9. Para isso, foi construído um par de
gRNAs com 19-21nt e correspondência complementar a região 5’ do alvo (miRNA individual
ou cluster). A coinjeção de gRNAs levou a mutações no gene dre-mir-126a e resultou em
largas deleções no cromossomo 9, na região do cluster de miRNAs (Xiao et al., 2013).
Importante dizer que para os estudos de perda de função, a abordagem mais comum
é baseada em plasmídeos que coexpressam Cas9 e o gRNA de interesse. Recentemente,
Liang e colaboradores (2015) descreveram um método de produção de gRNA in vitro e
otimizaram as condições de transfecção do complexo Cas9/gRNA mediada por lipídeo ou
por eletroporação, com a obtenção de resultados com até 94% de eficiência e em apenas
quatro dias de trabalho. Nesse estudo os pesquisadores transfectaram diferentes células
de mamíferos, inclusive humanas (Liang et al., 2015). Apesar de o estudo ter sido realizado
em gene codificante de proteína, representa um potencial para o uso com genes de miRNA.

4.6 Vantagens e limitações do CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 é bem mais eficiente do que os métodos tradicionais (microinjeção de
versão mutada do gene) para a geração de organismos KO porque essa técnica promove a
clivagem da sequência-alvo no genoma, evento esse que inexoravelmente induz a um processo
de reparo que naturalmente gera mutações (indels) no sítio clivado. Em contraposição,
os métodos tradicionais dependem de eventos de recombinação ao acaso entre a versão
mutada e a sequência-alvo no genoma, apresentando, portanto, menores taxas de sucesso.
Comparando-se a tecnologia CRISPR/Cas9 com outras técnicas de edição de genes,
como Zinc-Finger Nucleases (ZFNs) (Kim et al., 2009) e TALENs (Joung; Sander, 2013), fica
claro que a primeira é mais fácil de ser implementada, prática e flexível. Isso porque ZFNs
e TALENs são nucleases que precisam ser desenhadas especificamente para cada sítio no
genoma a ser interrogado. No caso de CRISPR/Cas9, uma vez adquirida a endonuclease Cas9,
o pesquisador pode investigar vários alvos no genoma simplesmente alterando o gRNA
conjugado, procedimento esse muito simples e de baixo custo (Sternberg; Doudna, 2015;
Hsu; Lander; Zhang, 2014). Além disso, CRISPR/Cas9 é capaz de gerar a disrupção simultânea
de ambos os alelos em grande parte dos experimentos (Harrison et al., 2014), podendo-se
obter imediatamente animais com fenótipos sem a necessidade de cruzamentos (descritos
para os métodos tradicionais). Alguns recursos web para desenho, aquisição e protocolo
do CRISPR/CAs9:
Addgene https://www.addgene.org/CRISPR/
CRISPR design http://crispr.mit.edu/
e-CRISP http://www.e-crisp.org/E-CRISP/

Estratégias para depleção de miRNAs 265

 miR-CRISPR http://mir-crispr.molbiol.ox.ac.uk/fulga/miR-CRISPR.cgi
GeneArt® CRISPR Products and Services https://www.lifetechnologies.com/br/en/
home/life-science/genome-editing/geneart-crispr.html
ORIGENE http://www.origene.com/CRISPR-Cas9/
SIGMA http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/crispr?lang=pt&region=BR
IDT http://www.idtdna.com/pages/products/genes/crispr

5. Conclusões
A inibição de miRNAs, assim como a alteração de seus genes codificadores são
abordagens poderosas para se compreender o papel biológico desses pequenos RNAs, assim
como uma esperança terapêutica para certas doenças.
Isso pode ser alcançado com estratégias rápidas, de efeito temporário e parcial (como
os antimiRs e esponjas) ou via abordagens mais trabalhosas, de efeito permanente e total
(como os organismos KO). Também é importante lembrar da existência, de “bancos de
knockouts”, que possuem imensas coleções de amostras (sementes, células, embriões etc.)
portadoras de mutações em pontos distintos no genoma e com informações de fácil acesso
via web. O uso desses bancos com o objetivo de buscar uma amostra portando mutações no
gene de miRNA de interesse é uma possibilidade adicional para conduzir o estudo.

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MiRNAs artificiais, Capítulo
miméticos e 15
superexpressão de
miRNAs endógenos

Dr.a Franceli Rodrigues Kulcheski1,

Dr.a Daniela Zimbardi2 e
Prof. Dr. Tiago Campos Pereira3
1
Centro de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul - RS
2
Depto. de Genética, IBB - UNESP, Botucatu - SP
3
Depto. de Biologia, FFCLRP, Universidade de São Paulo - SP

Estruturação do capítulo
1. Introdução
2. Superexpressão de miRNAs endógenos – Prof. Dr. Tiago C. Pereira
3. MicroRNAs artificiais (amiRNAs) – Dr.a Franceli R. Kulcheski
3.1 Vantagens sobre outras técnicas de silenciamento
3.2 Parâmetros para projetar amiRNAs
3.3 Construção de amiRNAs
3.4 Aplicações no estudo de função gênica
3.5 Uso no melhoramento genético de plantas
4. miRNAs miméticos (miRNA mimics, mimetic miRNAs) – Dr.a Daniela Zimbardi e
Prof. Dr. Tiago Campos Pereira
4.1 Aspectos gerais
4.2 Aplicações
4.3 miRNAs miméticos funcionais
5. Conclusões

MiRNAs artificiais, miméticos e superexpressão de miRNAs endógenos 269

 1. Introdução
Algumas perguntas biológicas demandam que se elevem os níveis de determinado
microRNA endógeno no ambiente celular. Outras demandam a criação de microRNAs com
novas sequências, inexistentes na natureza.
Por exemplo: “Quais são os papéis biológicos de miR-3771?” Para responder essa
questão, uma possível estratégia seria observar os fenótipos emergentes no organismo durante
a inibição e superexpressão desse miRNA. “Seria possível produzir plantas geneticamente
modificadas expressando um miRNA desenhado especificamente contra determinada praga?”
Essas perguntas, e outras, podem ser respondidas por meio de uma dentre três diferentes
abordagens: (i) superexpressão de miRNAs endógenos, (ii) microRNAs artificiais (amiRNAs)
e (iii) microRNAs miméticos (microRNA mimics; mimetic miRNAs).
Infelizmente, nem sempre há uma clara padronização desses conceitos na literatura
científica. Isso ocorre porque esse campo de pesquisa evolui muito rapidamente e muitos
grupos de pesquisa/empresas usam as expressões de maneira indiscriminada. Portanto,
o leitor deve estar ciente de que a categorização aqui apresentada nem sempre estará tão
clara na literatura.

2. Superexpressão de microRNAs endógenos

Vários estudos objetivam identificar a função de determinado miRNA endógeno.
Para isso pode-se, por exemplo, realizar uma análise fenotípica (em células, tecidos ou
no organismo) nas quais os níveis do miRNA foram inibidos assim como intensificados. As
alterações fenotípicas (opostas) em cada um desses dois grupos revelarão o papel desse
gene no organismo.
Outros grupos de pesquisa têm como meta elevar os níveis de certo miRNA celular
cuja atuação é de interesse para a saúde, a agronomia ou a biotecnologia; por exemplo, um
miRNA com ação antitumoral.
Para promover essa elevação dos níveis intracelulares de determinado miRNA
endógeno, uma possível estratégia é a sua superexpressão, i.e., levar a célula a produzir
(por transcrição gênica) um maior número de moléculas de miRNA maduro (figura 1). Isso
pode ser obtido através: (i) administração de vetores de expressão do miRNA (Truettner et
al., 2013) ou (ii) modificação genética (integração, no genoma, de um cassete de expressão
contendo uma ou várias cópias do gene do miRNA endógeno) (Ghag et al., 2015). De uma
maneira transiente (vetores) ou estável (integração), a célula apresentará uma atividade
transcricional intensificada desse gene de miRNA, resultando em níveis elevados do miRNA
maduro correspondente.
Muitas empresas já comercializam vetores de expressão contendo genes de miRNAs
para algumas das principais espécies-modelo, tornando essa abordagem relativamente
simples. Alternativamente, a produção de plantas e animais geneticamente modificados
superexpressando o miRNA pode ser gerada por estratégias convencionais de transgênese.

3. MicroRNAs artificiais (amiRNAs)

Nos últimos anos, estudos abordando a biossíntese e o processamento de microRNAs
(miRNAs) provaram que o processamento do precursor do miRNA (pre-miRNA) é amplamente
dependente da estrutura precursora e não da sequência do miRNA maduro e seu antissenso

270 Introdução ao mundo dos microRNAs

(miRNA/miRNA*). Alguns estudos têm demonstrado que alterar alguns nucleotídeos (nt)
dentro da sequência miRNA/miRNA* não afeta a biogênese e nem mesmo o processamento
do miRNA, desde que o restante da sequência precursora não seja alterada. Baseada nessas
observações foi desenvolvida a técnica de microRNAs artificiais (amiRNAs) (figura 1).
Essa tecnologia baseia-se na utilização de estruturas de pre-miRNAs endógenos
para produzir miRNAs maduros artificiais. Esses amiRNAs são projetados para atingir
determinado(s) alvo(s), como ocorre com os miRNAs naturais. A estratégia de amiRNA foi
primeiramente utilizada para reprimir a expressão de genes de células humanas (Zeng et
al., 2002) e, subsequentemente, foi então empregada na pesquisa de plantas (Parizotto et al.,
2004; Schwab et al., 2006). Enquanto o silenciamento de genes mediado por small interfering
RNAs (siRNAs) e short hairpins RNAs (shRNAs) constituem a primeira e segunda gerações
de interferência gênica via RNA (RNAi), respectivamente, amiRNA é considerada a terceira
geração de tecnologia de silenciamento gênico.
Nas próximas sessões serão abordados os parâmetros para projetar amiRNAs, suas
vantagens em relação a outras tecnologias de silenciamento e as aplicações de amiRNAs
no estudo de função gênica, bem como aplicações no melhoramento genético de plantas.

3.1 Vantagens sobre outras técnicas de silenciamento

Anteriormente ao desenvolvimento de amiRNAs, várias outras metodologias foram
utilizadas explorando o silenciamento gênico pós-transcricional a fim de reprimir a expressão
de genes e estudar a sua função. Essas estratégias foram principalmente baseadas na produção
de siRNAs derivados de RNAs de dupla fita (dsRNAs) introduzidos em plantas de diversas
formas. Uma dessas vias é o silenciamento gênico induzido por vírus (do inglês virus-induced
gene silencing ou VIGS), o qual utiliza genomas virais como vetores para introduzir dsRNAs
a fim de silenciar o gene de interesse (Lu et al., 2003). Embora essa abordagem tenha várias
vantagens, a principal dificuldade está em identificar um vetor viral adequado que atue
como silenciador sem causar algum sintoma.
Alternativas baseadas na produção de siRNAs incluem a superexpressão de um gene-alvo
(geralmente na direção antissenso) através de transformação genética (Jorgensen et al., 2006)
e na construção de fragmentos de DNA com estrutura senso-alça-antissenso, tendo um íntron
como alça, a qual será transcrita originando uma estrutura em forma de grampo chamada
hairpin (Helliwell; Waterhouse, 2005). Como os insertos produzidos nessas abordagens são
amplos (longos), geralmente ocorre a produção de diversos siRNAs a partir de um dsRNA.
Além disso, uma vez que o sinal de siRNA é amplificado (produzindo frequentemente
múltiplos siRNAs secundários), o risco de silenciamento de genes não desejados (off-target)
é aumentado devido a uma complementariedade casual (Schwab et al., 2006; Xu et al., 2006).
Adicionalmente, o transgene pode ser autossilenciado e assim perder a atividade sobre o
alvo após algum tempo ou gerações (Molnar et al., 2009). Dessa forma, o uso de amiRNAs
tem oferecido uma abordagem alternativa para silenciar genes-alvo de uma forma efetiva
e contornando as dificuldades observadas nessas outras tecnologias.
AmiRNAs são desenhados a partir de um precursor de miRNA endógeno, o qual
é utilizado como um suporte estrutural, também chamado backbone. Nesse, a região do
miRNA/miRNA* é substituída por uma sequência específica complementar a uma região do
gene-alvo que se deseja silenciar (Schwab et al., 2006). A biogênese desse novo precursor será
a mesma que a de um miRNA endógeno, uma vez que a estrutura secundária do precursor
é mantida intacta.

MiRNAs artificiais, miméticos e superexpressão de miRNAs endógenos 271

 Dessa forma, em análises de função gênica, amiRNAs podem ser projetados para
silenciar quaisquer genes de interesse e, até mesmo, múltiplos genes, sendo que uma sequência
de amiRNA com pouca similaridade a um alvo não desejado pode ser escolhida a fim de
evitar o efeito off-target (Ossowski et al., 2008; Park et al., 2009).

Figura 1. Comparação entre três categorias apresentadas neste capítulo. A biogênese de um miRNA endógeno
convencional é apresentada como base. A superexpressão de um miRNA endógeno pode ser obtida, por exemplo,
através do aumento do número de cópias desse gene (transgenia ou uso de vetores); consequentemente, o número de
miRISCs na célula será maior. Um microRNA artificial pode ser construído usando-se um backbone de um miRNA com as
sequências maduras de outro miRNA (linhas pontilhadas). Em todos esses casos há dependência de maquinaria celular
de transcrição e processamento. MiRNAs miméticos são gerados por síntese química e obtidos comercialmente como
duplexes de RNA, prontos para serem carregados em RISC. Portanto, a administração de miRNAs miméticos aumenta
o nível intracelular do miRNA endógeno mimetizado.

272 Introdução ao mundo dos microRNAs

 Uma vez que os amiRNAs (assim como os miRNAs canônicos) atuam em trans, o
que significa que regulam genes diferentes daqueles que os originam, observou-se que sua
atividade silenciadora tem maior estabilidade comparada à de longos dsRNA (que podem se
autossilenciar) (Molnar et al., 2009; Zhao et al., 2009). Também é possível gerar construções
expressando amiRNAs múltiplos e não relacionados devido o seu pequeno tamanho, bem como
projetar amiRNAs que atuem sobre um alelo específico ou até sobre variantes alternativas
de splicing de um determinado gene (Lin et al., 2009; Niu et al., 2006; Schwab et al., 2010).
Também se tem sugerido que amiRNAs possuem menores chances de risco biológico ou
problemas de impacto ambiental quando utilizados na agricultura comparados a outras
estratégias devido a sua alta especificidade (Duan et al., 2008; Liu; Chen, 2010). Outras vantagens
incluem silenciamento fita-específico, expressão diferencial nos tecidos e a possibilidade
de complementação sem clivagem dos alvos (através do pareamento imperfeito na região
de clivagem, evitando que o mRNA alvo seja clivado) (Ossowski et al., 2008).
Até o momento, as principais desvantagens associadas aos amiRNAs são: (i) tempo para
desenho da estrutura e sua síntese em laboratório (comparado aos miRNAs miméticos, que
são adquiridos comercialmente) e (ii) limitações relacionadas a sua aplicação em controle
de viroses (Lin et al., 2009). Isso ocorre porque os vírus apresentam elevadas taxas de
mutação, portanto alterações na sequência viral reconhecida pelo amiRNA podem inviabilizar
a interação e, consequentemente, o silenciamento.

3.2 Parâmetros para projetar amiRNAs

Os amiRNAs são essencialmente projetados para mimetizar miRNAs endógenos. Suas
sequências devem ser projetadas de acordo com os fatores determinantes da interação entre
um miRNA e seu alvo. Assim como ocorre em plantas, geralmente se desenham miRNAs
com cerca de 21 nt. Além disto, como o objetivo é que a atividade dos amiRNAs seja similar
à dos miRNAs naturais, devem ser seguidos três critérios principais durante sua projeção: (i)
a presença de uma uracila (U) na região terminal 5’ (característica da maioria dos miRNAs
de plantas e animais); (ii) apresentar relativa instabilidade na região 5’ com relação ao
amiRNA* na dupla fita; (iii) possuir uma adenina (A) na 10ª posição da fita madura do
amiRNA (Mallory et al., 2004; Reynolds et al., 2004; Seitz et al., 2011).

Figura 2. Principais critérios utilizados na projeção de amiRNAs. A complementariedade entre as sequências do

amiRNA e do amiRNA* deve seguir a mesma relação estrutural que ocorre entre miRNA e miRNA* naturais. Dessa forma
são mantidas as seguintes características: (i) presença de uma uracila (U) na região terminal 5’ (característica da maioria
dos miRNAs de plantas e animais); (ii) menor estabilidade termodinâmica na região 5’ do amiRNA funcional com relação
ao amiRNA* na dupla fita; (iii) possuir uma adenina (A) na 10ª posição da fita madura do amiRNA.

MiRNAs artificiais, miméticos e superexpressão de miRNAs endógenos 273

 Lembrando que, como ocorre no processamento dos miRNAs endógenos, na região
do braço (stem) do precursor está inserida a dupla miRNA/miRNA*, sendo que o final da
região 5’ de uma dessas fitas é termodinamicamente menos estável (i.e., contém mais erros
de pareamento ou menor concentração de GC, comparativamente à fita complementar) e que
ao final do processamento a fita com menor estabilidade é preferencialmente incorporada
no complexo RISC (figura 2) (Khvorova et al., 2003; Schwarz et al., 2003). O princípio de
assimetria entre as fitas de miRNA e miRNA* é impreterivelmente seguido na projeção de
amiRNAs. O duplex amiRNA/amiRNA* deve manter a relação estrutural observada entre
miRNA/miRNA* naturais, i.e., a mesma proporção de mismatches (ou erros de pareamento)
(Schwab et al., 2006).
Para que um amiRNA reprima efetivamente seu alvo, o pareamento entre o alvo e a
porção 5’ do amiRNA (posição entre o 2º e o 12º nt) deve ser perfeito. Se ocorrer a presença
de até dois mismatches na região 5’, esses devem ser compensados pelo perfeito pareamento
na porção 3’. Mismatches no provável sítio de clivagem (entre as posições 10ª e 11ª) e mais do
que dois mismatches consecutivos na região 3’ devem ser evitados (figura 3). Geralmente, de
1 a 3 mismatches são deliberadamente mantidos na região 3’ do amiRNA a fim de reduzir a
probabilidade deste amiRNA atuar como primer pela ação de RNA polimerases dependentes
de RNA (do inglês RNA-dependent RNA polymerase ou RdRP) e desencadear a produção
de siRNAs secundários. A probabilidade de uma transatividade mediada por RdRP pode

Figura 3. Parâmetros de reconhecimento entre o amiRNA e o mRNA-alvo. A hibridização entre o amiRNA e seu
respectivo alvo seguem os padrões de reconhecimento entre miRNAs e alvos canônicos. Em animais, um pareamento
perfeito entre a região seed do miRNA e seu alvo são imprescindíveis. Enquanto em plantas uma alta complementariedade
entre ambas as sequências com ausência total de mismatches nos sítios de clivagem são cruciais para a regulação do
alvo pelo miRNA.

274 Introdução ao mundo dos microRNAs

ser verificada através da análise da sequência-alvo do amiRNA. Assim, utiliza-se a região
circundante (de 200 a 300 nt) ao sítio de ligação do amiRNA no mRNA-alvo para predizer
o potencial dessa sequência produzir siRNAs secundários. Como regra, a energia livre do
pareamento entre amiRNA e alvo não deve exceder -30 kcal/mol [valor de hibridização
calculado pelos programas Mfold (Zuker, 2003) ou RNAcofold (Bernhart et al., 2006)] (Schwab
et al., 2006; Ossowski et al., 2008; Yadava; Mukherjel, 2012).
A projeção de um amiRNA deve ser feita para atingir apenas o gene de interesse,
evitando-se ou limitando-se as chances de off-target silencing, i.e., o silenciamento de um
gene que não seja o alvo. A especificidade dos amiRNAs pode ser testada via algoritmos
de predição de alvos de miRNAs como, por exemplo, o RNAhybrid (http://bibiserv.techfak.
uni-bielefeld.de/rnahybrid/) (Rehmsmeier et al., 2004) e o psRNATarget (http://plantgrn.
noble.org/psRNATarget/) (Dai; Zhao, 2011), os quais permitem testar hibridizações entre
sequências de RNAs. Durante essa investigação, atenção maior deve ser dada aos sítios
críticos de hibridização como, por exemplo, a região seed entre os nucleotídeos de posição
2 a 8 em animais (Brennecke et al., 2005; Lewis et al., 2005) e 9 a 11 em plantas (Schwab et
al., 2006) (figura 3).
Atualmente existem muitas ferramentas de bioinformática disponíveis para auxiliar na
construção de amiRNAs. Alguns aplicativos estão disponíveis em sites de livre acesso, sendo
que a maioria deles incorpora os parâmetros descritos acima. São alguns exemplos: WMD
(http://wmd3.weigelworld.org/cgi-bin/webapp.cgi), microRNA Target Finder and Designer
(http://sydney.edu.au/science/molecular_bioscience/waterhouse/amiR_new/), P-SAMS amiRNA
Designer (http://p-sams.carringtonlab.org/amirna/designer) e Vienna RNA Package (http://
www.tbi.univie.ac.at/RNA/). Esse último auxilia na determinação da energia livre mínima
para hibridização.

Figura 4. Construção de amiRNAs segundo protocolo descrito por Schwab et al. (2006). A introdução do amiRNA
no precursor ocorre pela troca das sequências de miRNA/miRNA* pelo amiRNA/amiRNA* através de mutagênese sítio-
dirigida. Esse processo é feito através de uma série de PCRs que se sobrepõem. Oligonucleotídeos I e IV são usados para
substituir miRNA/miRNA* (vermelho pontilhado) por amiRNA/amiRNA* (azul). Primers A e B são baseados na sequência
do precursor ou, nesse caso, no plasmídio empregado. A obtenção de pre-miRNAs funcionais é feita pela combinação dos
produtos de PCR A-IV, II-III e I-B em uma única reação com os primers A e B. Quando o precursor contendo as sequências
de amiRNAs for introduzido no organismo, a produção desses amiRNAs seguirá a via canônica de processamento de
miRNAs. Fonte: adaptado de http://wmd3.weigelworld.org/cgi-bin/webapp.cgi

MiRNAs artificiais, miméticos e superexpressão de miRNAs endógenos 275

 3.3 Construção de amiRNAs
Seguindo-se o protocolo para projetar amiRNAs, esses podem ser inseridos em
um vetor apropriado, o qual auxiliará na entrega do amiRNA dentro da célula. No espaço
intracelular, o precursor deve ser reconhecido pela maquinaria de biogênese de miRNAs,
a qual irá processá-lo como qualquer precursor e dessa forma liberar um amiRNA maduro
que silenciará seu mRNA-alvo. Assim, a introdução do amiRNA dentro do precursor ocorre
pela troca das sequências de miRNA/miRNA* pelo amiRNA/amiRNA* através de mutagênese
sítio-dirigida (figura 4). Esse processo é feito através de uma série de PCRs que se sobrepõem,
utilizando-se oligonucleotídeos apropriados (Schwab et al., 2006).
Inicialmente, o pre-amiRNA é sintetizado por PCR em partes e depois fusionado
através do uso de dois oligonucleotídeos terminais, a fim de se obter uma sequência única.
Na figura 4 são sumarizados os passos para a produção de um amiRNA via protocolo descrito
por Schwab et al. (2006) e utilizado em plantas. O protocolo completo, com descrição da
síntese de amiRNAs passo a passo pode ser acessado no site http://wmd3.weigelworld.org/
downloads/Cloning_of_artificial_microRNAs.pdf. Uma alternativa a essa metodologia pode
ser a síntese comercial de sequências completas de pre-amiRNAs.
Na maioria dos estudos de amiRNAs em plantas tem se utilizado precursores naturais
como: ath-miR159a, ath-miR164b, ath-miR169d, ath-miR172a, ath-miR319 e osa-miR528.
Entretanto, a eficiência de processamento dos amiRNAs pode variar de acordo com o backbone
ou precursor escolhido na construção do vetor, como é o caso do precursor ath-miR390a,
que produz um grande número de amiRNAs maduros com um processamento altamente
acurado (Carbonell et al., 2014). Dessa forma, a escolha do vetor é crucial para gerar uma
quantidade apropriada do amiRNA desejado. Esses vetores podem ser obtidos com os grupos
de pesquisa que os desenvolveram.
Em mamíferos, precursores do miR16, miR206 e miR331, entre outros, têm sido
utilizados na produção de amiRNAs. Além disso, tanto em animais quanto em plantas uma
nova abordagem tem sido desenvolvida, a qual consiste em agrupar mais de um amiRNA para
assim atingir múltiplos genes (Hu et al., 2009). O número ótimo de amiRNAs concatenados
em um precursor não deve ser maior que quatro. Aparentemente a posição relativa de um
amiRNA em um vetor de expressão multiamiRNAs não afeta sua atividade de silenciamento
(Hu et al., 2010).

3.4 Aplicações no estudo de função gênica

O silenciamento gênico mediado por amiRNAs tem auxiliado na identificação da
função de inúmeros genes, sendo nos últimos anos o método de escolha para estudo de
genômica funcional tanto em plantas quanto em animais. Nessa sessão serão sumarizados
alguns exemplos de genes que tiveram seu papel revelado através de amiRNAs.
Em plantas, proteínas de choque térmico (Heat shock protein ou HSPs) são conhecidas
pelo seu papel crucial como chaperonas e na resposta a vários estresses. Entretanto, sua
importância no desenvolvimento dos cloroplastos foi identificada através do silenciamento
de proteínas homólogas de Hsp70s em arabidopsis. A repressão das proteínas cpHsc70-1 e
cpHsc-2 gerou plantas com morfologia alterada dos cloroplastos, bem como com ausência
ou diminuição significativa de tilacoides, comprovando a participação desses dois genes na
determinação da estrutura de plastídios (Latijnhouwers et al., 2010). Outro exemplo é o papel
das proteínas arabinogalactanas ou proteína arabinogalactânica (AGPs) no desenvolvimento do

276 Introdução ao mundo dos microRNAs

pólen e pistilos, o qual foi elucidado através da repressão desses genes por amiRNAs. As AGPs
são glicoproteínas ricas em hidroxiprolina e altamente glicosiladas. Elas estão presentes em
todas as plantas, mas seu papel na reprodução vegetal foi comprovado através do silenciamento
de dois genes de AGPs via amiRNAs. A repressão de AGP6 e AGP11 causou desenvolvimento
incompleto dos grãos de pólen, nos quais se observaram citoplasma condensado, protrusão
da membrana e presença de pequenos vacúolos líticos (Coimbra et al., 2009).
Em Medicago truncatula, o silenciamento de dois genes flotillin-like (FLOT2 e FLOT4)
demonstrou a sua importância durante o processo de simbiose. FLOT2 e FLOT4 são necessários
para o início da infecção pela rizobactéria Sinorhizobium meliloti. Nas linhagens silenciadas
houve um significativo decréscimo na formação de nódulos, além disso os nódulos formados
eram pequenos e brancos, sugerindo incapacidade de fixar nitrogênio (Haney;Long, 2010).
Inúmeros outros trabalhos tiveram sucesso na comprovação de novos papéis funcionais
para genes já conhecidos utilizando amiRNAs. Por exemplo, através da expressão tecido-
específica de um amiRNA que tinha como alvo o gene Flowering Locus (FL), envolvido
na indução floral responsiva ao fotoperíodo, foi possível demonstrar que o sinal móvel
ao longo da planta eram as proteínas FL e não o RNA mensageiro, como se acreditava
(Mathieu et al., 2007). Bomblies et al. (2007) utilizaram amiRNAs para demonstrar que genes
NBS-LRR AT5G41740/AT5G41750 estão envolvidos na produção de necrose observada em
respostas autoimunes de híbridos de arabidopsis. Em outro estudo, a tecnologia de amiRNAs
foi utilizada para confirmar o efeito inseticida de flavonoides em plantas transgênicas de
tabaco. Nesse caso, o gene de arabidopsis AtMYB12, envolvido na biossíntese de flavonoides,
foi introduzido e superexpresso em plantas de tabaco, as quais apresentaram resistência
ao ataque dos insetos Spodoptera litura e Helicoverpa armigera. Entretanto, quando um
amiRNA foi projetado para suprimir a biossíntese de flavonoides, a resistência a insetos foi
revertida nessas plantas (Misra et al., 2010).
Como um indicativo do potencial de amiRNAs em plantas, o projeto Arabidopsis 2010
propôs desenvolver uma biblioteca de amiRNAs para 22 mil genes de A. thaliana, com a
projeção de pelo menos três amiRNAs para cada gene. Essa biblioteca está sob os cuidados
dos Laboratórios de Cold Spring Harbor e almeja oferecer uma ferramenta de investigação
gênica em ampla escala (Schwab et al., 2010).
Em animais, os estudos utilizando amiRNAs têm, no geral, concentrado esforços em
esclarecer a função de genes relacionados ao desenvolvimento dos vários tipos de cânceres.
Um trabalho abordando a relação do receptor de neurocinina-1 (NK1R) com alcoolismo
também utilizou amiRNAs (Baek et al., 2007). Para testar se o NK1R está associado ao sistema
de recompensa que envolve o alcoolismo, os pesquisadores injetaram amiRNAs-NKR1 no
cérebro de camundongos e após quatro semanas avaliaram seu comportamento com relação
ao consumo de álcool. Foi observado um decréscimo significativo de NKR1 no hipocampo, bem
como uma diminuição do consumo de álcool nos camundongos tratados comparativamente
aos controles. Nesse caso, o uso de amiRNAs, além de estar associado a ferramenta de estudo
da função gênica, pode ainda ser considerado um possível agente terapêutico.
Outro estudo explorando amiRNAs abordou o papel do receptor da quimiocina (CXCR4)
com relação ao perfil invasivo e metastático do câncer de mama. Com a aplicação de um
amiRNA para CXCR4 em células tumorosas cultivadas in vitro foi observada uma atividade
reduzida de migração e invasão. Já in vivo houve redução nas metástases de pulmão (Liang
et al., 2007). No mesmo cenário, Wang S. et al. (2012) utilizaram amiRNAs para determinar
o papel e possível mecanismo da metaderina (MTHD) no crescimento de células de mama

MiRNAs artificiais, miméticos e superexpressão de miRNAs endógenos 277

 MDA-MB-231. Já existiam estudos prévios indicando a associação de MTHD com a propagação
desse tipo de câncer. Entretanto, nesse trabalho, utilizando uma construção amiRNA-MTDH,
os autores observaram uma diminuição da mobilidade e migração dessas células. Além
disto ocorreu uma inibição da proliferação das células MDA-MB-231. Embora os autores não
tenham demonstrado as bases moleculares envolvidas nesse processo, eles comprovaram
que o MTHD está envolvido no crescimento invasivo ou infiltrante do câncer de mama.
Similar abordagem foi realizada para investigar o papel da PRL-3 em câncer gástrico em
humanos (Wang H. et al., 2012). Sabe-se que o prognóstico do câncer gástrico está relacionado à
penetração do tumor na parede do estômago e à presença de gânglios linfáticos comprometidos
pelo câncer ou metastáticos. Previamente já se sabia da expressão aumentada de PRL-3 em
gânglios linfáticos metastáticos, mas sua função no desenvolvimento do tumor ainda não
estava clara. Com a injeção de amiRNAs para PRL-3 em células de câncer gástrico SGC7901
de humanos pode-se observar redução na atividade invasiva e migratória delas, bem como
supressão da proliferação celular, reduzindo-se a taxa de crescimento do tumor.

3.5 Uso no melhoramento genético de plantas

O desenvolvimento de culturas que atinjam maiores níveis de produtividade é sem
dúvida um dos principais objetivos da agricultura mundial. Diante das previsões de crescimento
populacional mundial, atingindo 9 bilhões de habitantes em 2050, existe o desafio de se
criarem métodos avançados e eficientes para aumentar a produção de alimentos (Carrer
et al., 2010). Nesse cenário, a biotecnologia de plantas ocupa um papel central na busca de
soluções para atenuar os problemas de produção versus consumo.
A aplicação do silenciamento gênico mediado por amiRNAs tem se mostrado uma
ferramenta promissora na manipulação de caracteres de importância agronômica. Os amiRNAs
podem representar baixo risco biológico quando comparado com outras estratégias, devido
ao fato de que essa estratégia não utiliza vetores virais e, como o tamanho do inserto é
pequeno, ocorre redução de probabilidade de recombinação e transferência gênica horizontal.
Recentemente, as vantagens no uso de amiRNAs relacionadas à biossegurança têm apontado
o fato desses representarem uma solução para um problema dos organismos geneticamente
modificados: a contenção de transgenes (Sablok et al., 2011). Uma forma de impedir que
uma cultivar geneticamente modificada cruze com populações naturais é gerar plantas
transgênicas apresentando macho-esterilidade ou incapazes de produzir pólen viável. Sistemas
de controle de esterilidade masculina, tanto citoplasmática quanto nuclear, são geralmente
utilizados para produção comercial de sementes híbridas de alta qualidade, entretanto
esses sistemas não são reversíveis. Em estudos recentes, a esterilidade masculina foi obtida
via transformação estável de berinjela (Solanum melongena) através do silenciamento de
fatores transcricionais chamados fatores associados à TBP (TBP-associated factors ou TAFs),
os quais são fundamentais em diversos aspectos do desenvolvimento das plantas, inclusive
produção de pólen (Toppino et al., 2010). Nesse trabalho, pesquisadores silenciaram dois
genes TAFs que são amplamente expressos em anteras utilizando amiRNAs sob regulação
de promotores específicos de antera. O sucesso na construção desse sistema em berinjela,
o qual não representa uma planta-modelo, demonstra que essas aplicações de amiRNAs
podem ser empregadas em plantas não comumente utilizadas em transformação gênica.
Mais um exemplo de aplicações de amiRNAs no melhoramento de culturas é a
manipulação do aroma do grão de arroz. A enzima betaína aldeído desidrogenase (betaine-
aldeyde dehydrogenase ou BADH2) inibe a 2-acetil-1-pirrolina (2AP), a qual é o principal

278 Introdução ao mundo dos microRNAs

componente da fragrância de grãos (Chen S. et al., 2008). Dessa forma, Chen e colaboradores
(Chen M. et al., 2012) desenvolveram grãos de arroz aromatizados utilizando um amiRNA
para silenciar a BADH2. A produção de um genótipo de arroz aromatizado é um marco para
a tecnologia de amiRNAs e demonstra o alto potencial desse método comparativamente aos
programas de melhoramento de plantas convencionais, os quais são muitas vezes laboriosos
e demorados.
Os amiRNAs também têm sido utilizados para obtenção de plantas resistentes a vírus
que comprometem as culturas. Um exemplo é o desenvolvimento de linhagens transgênicas
de trigo com resistência ao vírus do mosaico estriado (wheat streak mosaic virus ou WSMV),
causador de uma das doenças mais avassaladoras desse cereal. Para obtenção das plantas
transgênicas foi utilizado o precursor do miR395, caracterizado por ser policistrônico (i.e.,
gera mais de um produto funcional final) e conter cinco braços, também conhecido como
FanGuard (FGmiR395), no qual foram inseridos cinco regiões correspondentes ao genoma viral.
Consequentemente, o vetor construído conseguiu silenciar genes virais e, dessa forma, essas
plantas transgênicas apresentaram imunidade ao WSMV (Fahim et al., 2012). Adicionalmente,
a construção introduzida foi estavelmente herdada nas progênies seguintes, comprovando
o potencial de amiRNAs na geração de plantas imunes a vírus.
Na tabela 1 apresentam-se outros exemplos de aplicações de amiRNAs no melhoramento
genético, demonstrando a ampla plasticidade dessa tecnologia nos mais diversos aspectos
fisiológicos das plantas.

Tabela 1. Exemplos de aplicações de amiRNAs em espécies vegetais com potencial uso na agricultura.

Espécie Gene-alvo Função Fenótipo resultante Referência

Arabidopsis MYB14 Fator transcricional,
thaliana envolvido com tolerância
ao frio
FAD2, FAE1, Genes envolvidos na
FATB biossíntese de ácidos
graxos
Oryza sativa Sp11 Spotted leaf 11 – confere
tolerância à morte
celular durante estresses
ambientais
XAL3 Resistência à infecção por
bactérias
Nicotiana CMV2b Atua no silenciamento
benthamiana do supressor do vírus
Cucumber mosaic virus
(CMV)
Single L Motivos conservados da
(replicase) replicase L do vírus do
motivo B2 e Watermelon silver mottle
D – WSMoV virus (WSMoV)
Nicotiana HC-pro Silenciamento do supressor Alta resistência específica à Simon-Mateo;
tabacum do Potato virus Y (PVY)
Plantas com aumento de Chen Y. et al.,
tolerância ao congelamento 2013
Aumento na composição de Belide et al.,
óleos na semente 2012
Folhas manchadas, mais Warthmann et
tolerantes al., 2008
Resistência à mancha foliar Li et al., 2012
do arroz
Plantas apresentaram Qu et al., 2007
efetiva resistência à
infecção por CMV
Plantas apresentaram Kung et al., 2012
resistência ao WSMoV
através do atraso no
desenvolvimento dos
sintomas
infecção por PVY e PVX Garcia, 2006

Fonte: adaptado de Tiwari et al. (2014)

MiRNAs artificiais, miméticos e superexpressão de miRNAs endógenos 279

 Espécie Gene-alvo Função Fenótipo resultante Referência
Solanum Genes 2a 2a – proteína componente Plantas apresentaram Zhang et al.,
lycopersicum e 2b do complexo RdRP alta atividade antiviral 2011
(necessário para (supressão da invasão e
movimento viral); 2b movimentação viral)
– proteína com papel na
supressão do silenciamento
de RNA
Solanum CBP80 Proteína ligadora do CAP Plantas apresentaram Pieczynski et al.,
tuberosum aumento na tolerância à 2013
seca, hipersensitividade
a ABA, aumento de
estômatos e tricomas nas
folhas, cutículas compactas
com baixo número de
microcanais
Vitis vinifera CP1 e CP2 Coat protein (CP) do vírus Degradação de RNA viral Jelly et al., 2012
grapevine fanleaf virus nas folhas infectadas
(GFLV)
Fonte: adaptado de Tiwari et al. (2014)

4. miRNAs miméticos (miRNA mimics; mimetic miRNAs)

4.1 Aspectos gerais

Um miRNA mimético é um pequeno duplex de RNA (duas cadeias de 22 nt)
quimicamente sintetizado, adquirido comercialmente e que mimetiza a sequência nucleotídica
de determinado microRNA endógeno (Khan et al., 2015) (figura 1). Por exemplo, “let-7 mimic”
é um duplex de RNA sintético com sequência nucleotídica idêntica ao do let-7 natural,
portanto, mimetizando-o.
Inicialmente, os miRNAs miméticos foram concebidos como moléculas de RNA de
fita simples (Guimaraes-Sternberg et al., 2006), sendo introduzidos diretamente em células
de eucariotos com o objetivo de aumentar ou restaurar a atividade de miRNAs maduros
endógenos e, consequentemente, proporcionar a repressão pós-transcricional dos genes-
alvo de interesse. Uma vez que os miRNAs miméticos são “sintéticos” (pois foram obtidos
por síntese química) é comum a literatura científica e empresas referirem-nos por esses
dois termos, como sinônimos.
Diferentemente dos amiRNAs, miRNA miméticos não se utilizam da estrutura precursora
dos miRNAs endógenos, portanto não dependem da maquinaria transcricional nem de outros
processamentos celulares. Entretanto, algumas desvantagens em relação aos amiRNAs também
podem ser identificadas como: (i) baixa estabilidade e rápida degradação que ocorre pela
ação de nucleases endógenas (e.g., XRN-2, SDN1, SDN2 e SDN3; vide capítulo 3), resultando
em uma resposta transiente (Wang, 2011) e (ii) aspectos relacionados a toxicidade e ativação
do sistema imunológico (Sioud M., 2005; van Rooij et al., 2014).
Por exemplo, foi observado que a administração de pequenos duplexes de RNA (siRNAs
ou miRNAs miméticos) podem induzir uma resposta não específica de interferon mediada
por receptores Toll-like (Karikó et al., 2004; Hornung et al., 2005; Kleinman et al., 2008;
Peacock et al., 2011). Dessa forma, algumas modificações químicas podem ser introduzidas

280 Introdução ao mundo dos microRNAs

na própria sequência do miRNA mimético (fita antissenso do duplex) com o emprego de
nucleotídeos análogos ou incorporação de modificações terminais (como adição de bases
invertidas e grupos biotinilados ou alquilados) (Peacock et al., 2011).
Adicionalmente, estratégias de delivery específicas podem ser realizadas de acordo
com o objetivo do estudo. Entre elas, os miRNAs miméticos podem ser encapsulados por
envoltórios lipídicos ou serem transportados por carreadores virais, permitindo-se, assim,
o aumento de sua resistência à degradação e a redução da toxicidade (Pereira et al., 2013).
Os miméticos são usualmente empregados em estudos envolvendo células de mamíferos
(modelos animais e humanos), tanto in vitro quanto in vivo. Nos ensaios in vitro, comumente,
essas moléculas são transfectadas com o auxílio de lipossomas. Nos ensaios in vivo, são
injetadas por via intravenosa ou por administração local diretamente no sítio de interesse
(intratumoral por exemplo) complexados com nanopartículas lipossomais ou polietilenimina
(van Rooij et al., 2014).
Experimentos envolvendo miméticos devem conter certos controles. Para verificar a
especificidade da resposta mediada pelos miméticos, utiliza-se como controle negativo um
mimético apresentando cinco mismatches na região seed do miRNA, abolindo assim sua
habilidade de se associar com o mRNA-alvo. Para averiguar a capacidade de o mimético
promover o silenciamento pode-se cotransfectar células com um plasmídeo expressando
GFP fusionada a uma 3’ UTR responsiva a esse microRNA. Por sua vez, a confirmação do
silenciamento do gene-alvo pelo mimético pode ser realizada por RT-qPCR, western blot,
imunohistoquímica ou outros.
Já os eventuais efeitos off-target mediados pelo mimético podem ser mensurados
via RT-qPCR/western blot (quando se conhecem possíveis alvos acidentais) ou microarrays/
proteômica (quando não se sabe quais seriam os potenciais alvos acidentais).

4.2 Aplicações
Uma das principais aplicações dos miRNAs miméticos é a restauração da função de
miRNAs supressores de tumor, que possuem o potencial de regular oncogenes, frequentemente
alterados em câncer (Zhao et al., 2015; Su et al., 2015). Várias dessas moléculas têm demonstrado
potencial para o tratamento dessa doença em estudos envolvendo modelos animais. Algumas
estão, inclusive, em fase de testes pré-clínicos, como os miRNAs miméticos do let-7 e miR-16,
pela Mirna Therapeutics.
Além desses, um miRNA mimético do miR-34, desenvolvido pela mesma empresa e
chamado MRX34, entrou em fase I de testes clínicos em 2013 para tratamento de câncer de
fígado primário ou metástase com envolvimento do fígado, em uma administração injetável
formulada com lipossomas. O miR-34 representa uma família de miRNAs compreendendo
3 membros, miR-34a, -34b e -34c, que compartilham a mesma sequência seed. Essa família
controla o ciclo celular e apoptose e é descrita como frequentemente alterada em várias
malignidades (van Rooij et al., 2014).

4.3 miRNAs miméticos funcionais

Muito frequentemente, pesquisadores desenham miRNAs cujas sequências não são
encontradas na natureza, objetivando: (i) silenciar um alvo para o qual não há miRNAs
naturais (e.g., contra um patógeno) ou (ii) criar um miRNA alvo-específico (Wang Z., 2011).
Esses miRNAs personalizados são obtidos por síntese química e adquiridos comercialmente.

MiRNAs artificiais, miméticos e superexpressão de miRNAs endógenos 281

 Apesar de não mimetizarem as sequências nucleotídicas de miRNAs endógenos, essas
moléculas são capazes de se associar a RISC, promovendo um eficiente silenciamento gênico.
Assim, por mimetizarem funcionalmente miRNAs, a literatura também se refere a elas como
“miRNAs miméticos”.
De certa forma, os “miRNAs miméticos funcionais” estão para os “miRNAs miméticos”
assim como os “miRNAs artificiais” estão para os “miRNAs endógenos”. Contudo, o leitor deve
ficar muito atento, pois literatura científica e empresas nem sempre fazem uma distinção clara
e categorização entre miRNAs miméticos, sintéticos, miméticos funcionais e miRNAs artificiais.

5. Conclusões
Estratégias utilizando sequências derivadas de miRNAs (tabela 2) constituem a
terceira geração de moléculas mediadoras de silenciamento gênico. Além das propriedades
tipicamente observadas em siRNAs/shRNAs, os miRNAs e seus derivados têm o potencial de
ir além, podendo ser desenhados racionalmente para: (i) promover a clivagem do RNA-alvo
ou inibição da tradução e (ii) para atingir um, poucos ou múltiplos alvos.
É importante considerar que há outras sequências e construções genéticas além das
três categorias básicas aqui apresentadas, gerando um continuum de possibilidades. Por
exemplo, há miRNAs virais capazes de mimetizar miRNAs endógenos celulares (Dahlke et
al., 2012; Manzano et al., 2013).

Tabela 2. Comparação entre superexpressão de miRNAs endógenos, miRNAs artificiais e miméticos.

miRNA mimético
Superexpressão miRNA mimético
miRNA artificial funcional (miRNA
Características de miRNAs (miRNA mimic;
(amiRNA) mimic; mimetic
endógenos mimetic miRNA)
miRNA)
Estrutura da Gene de miRNA miRNA precursor Duplex Duplex
molécula clonado em vetor (clonado em vetor miRNA/miRNA* miRNA/miRNA*
ou integrado no ou integrado no
genoma genoma)
Obtenção Construção genética em laboratório Síntese química – aquisição comercial
Processamento Requer processamento pela maquinaria Não requer processamento, apenas
endógeno celular (Drosha, Dicer) e incorporação incorporação em RISC
em RISC
Natureza da Natural (endógena) Apesar de Natural (endógena) Artificial (i.e.,
sequência constituído por não conhecida
nucleotídica partes naturais na natureza)
(backbone), a
construção final
é artificial (i.e.,
não conhecida na
natureza)
Número de Apresenta o mesmo Um ou vários alvos Apresenta o mesmo Um ou vários alvos
alvos número de alvos do (dependente do número de alvos do (dependente do
miRNA endógeno desenho) miRNA mimetizado desenho)
Mecanismo de Apresenta o Clivagem ou Apresenta o Clivagem ou
silenciamento mesmo mecanismo inibição da tradução mesmo mecanismo inibição da tradução
mediado pelo (dependente do mediado pelo (dependente
miRNA endógeno desenho) miRNA mimetizado do desenho)
Principais Plantas e animais Plantas e animais Mamíferos Mamíferos
modelos
utilizados

282 Introdução ao mundo dos microRNAs

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285
Predição computacional Capítulo
de microRNAs em 16
genomas

Fábio Ribeiro Cerqueira1, Yuri Bento Marques1,2, Thales Francisco Mota Carvalho1,
José Cleydson Ferreira da Silva1, Marcos Fernando Basso3,
Guilherme Loss de Morais4 e Joseane Biso de Carvalho4
1
Departamento de Informática - Universidade Federal de Viçosa
2
Instituto Federal do Norte de Minas Gerais
3
Laboratório de Genética e Biotecnologia - Embrapa Agroenergia, PqEB
4
Laboratório de Bioinformática - Laboratório Nacional de Computação Científica

Estruturação do capítulo
1. Introdução 3.2.5 CID-miRNA
2. Bancos de dados de microRNAs 3.2.6 SSCprofiler
2.1 miRBase 3.2.7 Virgo
2.2 Human microRNA Disease Database 3.2.8 microPred
2.3 miRNAMap 2.0 3.2.9 PlantMiRNAPred
2.4 miR2Disease 3.2.10 miRPara
2.5 PMRD e PNRD 3.2.11 miRNAFold
2.6 miRNEST 2.0 3.2.12 HuntMi
2.7 miRCancer 3.2.13 HeteroMirPred
2.8 VIRmiRNA 3.2.14 MirnaSearch
2.9 ViRBase 3.2.15 MirBoost
2.10 Critérios para depósito em bancos 3.2.16 miRNA-dis
de dados 3.3 Métodos baseados em dados de
3. Métodos para predição computacional de sequenciamento de nova geração
miRNAs 3.3.1 Controle de qualidade dos
3.1 Métodos comparativos dados de small RNA-Seq
3.1.1 Srnaloop 3.3.2 miRCat
3.1.2 MiRScan 3.3.3 miRDeep
3.1.3 MirCheck 3.3.4 miRExpress
3.1.4 ProMiR 3.3.5 mirTRAP
3.1.5 MirAlign 3.3.6 MIReNA
3.1.6 RNAmicro 3.3.7 miRanalyzer
3.1.7 microHARVESTER 3.3.8 mirExplorer
3.1.8 MiRFinder 3.3.9 miRDeep-P
3.1.9 MiRRim 3.3.10 miRDeep2
3.2 Métodos não comparativos 3.3.11 miREvo
3.2.1 Noções sobre aprendizagem de 3.3.12 deepBlockAlign
máquina 3.3.13 miRDeep*
3.2.2 Triplet-SVM 3.3.14 miRPlant
3.2.3 Vmir 3.3.15 miRdentify
3.2.4 MiPred 4. Considerações finais e perspectivas

Predição computacional de microRNAs em genomas 287

 1. Introdução
Desde o reconhecimento dos microRNAs (miRNAs) como uma classe distinta de
reguladores fundamentais para diversos processos celulares em vários organismos (Reinhart
et al., 2000; Pasquinelli et al., 2000), a caracterização desses pequenos RNAs passou a ser uma
atividade essencial no estudo de genomas. No entanto, os procedimentos experimentais para
identificação dos loci de miRNAs ainda apresentam grandes limitações no que concerne ao
custo e à morosidade (Xu et al., 2009; Yao et al., 2012). Por esse motivo, diversos métodos
computacionais têm sido propostos para que o número de hipóteses a serem verificadas
experimentalmente seja significativamente reduzido.
Neste capítulo será apresentado o estado da arte dos métodos computacionais para
predição de miRNAs em genomas. A divisão das abordagens descritas aqui é feita como no
texto de Gomes et al. (2013), em que os métodos são organizados em comparativos e não
comparativos para designar os que utilizam como principal linha de solução a conservação
de elementos funcionais de genomas de espécies filogeneticamente próximas e aqueles que
não se utilizam de filogenia, respectivamente. No entanto, os métodos baseados em dados
de sequenciamento de nova geração (NGS – Next Generation Sequencing), que a princípio
deveriam ser colocados na categoria dos não comparativos, aqui são colocados em uma seção
exclusiva, como uma terceira categoria, devido à importância que tais métodos têm ganhado.
Além disto, alguns desses métodos utilizam informações filogenéticas de espécies próximas
à estudada para predição de miRNAs já identificados, o que colocaria essas abordagens
também como comparativas. Assim, para evitar possíveis confusões para o leitor, é mais
coerente descrever os procedimentos de predição de miRNAs que utilizam dados de NGS
em uma seção independente.
Também é apresentada uma revisão sobre bancos de dados de miRNAs disponíveis
atualmente. Esses repositórios são fundamentais como fonte de informações referentes a
miRNAs previamente caracterizados, quer seja para a predição de miRNAs em genomas de
organismos próximos filogeneticamente a organismos já estudados, quer seja para construção
de conjuntos de treinamento para algoritmos de aprendizagem de máquina (AM). Vale ainda
mencionar a existência de bancos de dados que proveem perfis de expressão de miRNAs
em determinadas doenças de grande impacto para a saúde pública como, por exemplo, o
miRCancer (Xie et al., 2013).
Destaca-se, ainda, que para todos os métodos, as entradas e saídas mais significativas
dos respectivos programas computacionais estão devidamente descritas. É importante perceber
que essas informações são bastante variadas e, de modo geral, os artigos de revisão sobre o
tema não as descrevem claramente. Uma entrada pode ser, por exemplo, um fragmento de
DNA e, nesse caso, deseja-se identificar a localização dos genes de miRNA. O que ocorre é
que grande parte dos programas reporta somente a localização dos precursores de miRNAs
(pre-miRNAs), pois é muito menos complexo predizer pre-miRNAs comparativamente à
predição do gene completo que expressa o miRNA primário (pri-miRNA). Outra informação
importante de se detectar é a localização genômica do miRNA propriamente. Porém, da
mesma forma, é bastante comum que os programas, principalmente os do tipo ab initio,
ou seja, que avaliam uma sequência de DNA sem utilizar qualquer informação externa,
limitem-se a informar somente a localização do pre-miRNA, uma vez que há uma grande
dificuldade de se detectar padrões na sequência que evidenciem a localização do miRNA,
dado seu tamanho reduzido.

288 Introdução ao mundo dos microRNAs

 Ainda sobre as entradas e saídas dos programas computacionais atualmente utilizados,
uma entrada comum é uma sequência candidata a pre-miRNA e a tarefa do programa é
somente classificar se a sequência candidata é positiva ou negativa. Dessa forma, nota-se que
há uma significativa variação (outras serão vistas no decorrer do texto) de tipos de entrada
e saída dos programas e, nesse sentido, o presente capítulo traz esclarecimentos para os
diversos casos, além de explicitar para quais organismos cada método é mais adequado.
Por fim, destacamos os métodos baseados em NGS que, além de proporcionarem a
localização de miRNAs e seus precursores, podem fornecer o perfil do seu nível de expressão.
A necessidade de se conhecer o perfil do nível de expressão sob uma determinada condição
tem sido crescente, com o objetivo de se obter evidências para a compreensão de processos
fisiológicos importantes, com grande potencial biotecnológico (Katiyar-Agarwal; Jin, 2010).
Avanços na área de biologia molecular, NGS e bioinformática têm sido fundamentais
para a compreensão e desenvolvimento de novas estratégias para identificação de miRNAs.
O conhecimento dos métodos aqui descritos poderá auxiliar no desenvolvimento das análises
envolvendo pesquisas com miRNAs e na interpretação dos resultados obtidos.

2. Bancos de dados de microRNAs

A caracterização funcional de miRNAs tem fornecido evidências para o entendimento
de importantes processos biológicos e lançado desafios em diversas áreas de pesquisa. O
crescente número de genomas completos sequenciados e a necessidade de identificar seus
miRNAs e precursores têm exigido o desenvolvimento de ferramentas de bioinformática
cada vez mais robustas.
Desde os primeiros miRNAs identificados, utilizando técnicas tradicionais de genética
molecular, até atualmente, com o auxílio de abordagens NGS, já foram identificados milhares
de miRNAs, que foram anotados e disponibilizados em bancos de dados públicos específicos
(Kozomara; Griffiths-Jones, 2014). Diversos genes de miRNAs são conservados entre espécies
filogeneticamente próximas. Contudo, outros miRNAs são confirmados como sendo espécie-
específicos. Diante disto, a caracterização dos miRNAs de um determinado organismo é
dependente de uma busca inicial daqueles já identificados e, em seguida, da identificação
de novos miRNAs particulares da espécie em estudo. Dessa forma é imprescindível conhecer
os repositórios de miRNAs previamente identificados. A seguir, alguns desses repositórios
são apresentados e descritos. A tabela 1 sumariza as informações de cada banco de dados,
em ordem cronológica de criação, incluindo a URL para cada caso.

2.1 miRBase
Os miRNAs identificados encontram-se disponíveis em diversos bancos de sequências
de acesso aberto. Porém o principal exemplo desses repositórios, e que tornou-se referência
nos principais estudos envolvendo miRNAs, é o miRBase (Griffiths-Jones, 2004; Griffiths-Jones
et al., 2006; Kozomara; Griffiths-Jones, 2014), principalmente por ser o banco de dados mais
completo em termos do número de miRNAs depositados, por conter informações relevantes
sobre eles, por ser atualizado constantemente e por oferecer aos usuários opções de interação
com os seus dados. A primeira versão do miRBase foi disponibilizada em 2002, contendo
218 sequências de pre-miRNAs provenientes de cinco espécies (Griffiths-Jones, 2004). Esse
número teve um crescimento significativo graças aos avanços na área de biologia molecular,

Predição computacional de microRNAs em genomas 289

 experimentos de small RNA-Seq e na área computacional, chegando a dezenas de milhares de
sequências de pre-miRNAs, provenientes de diversas espécies, classificadas em Chromalveolata,
Metazoa, Mycetozoa, Viridiplantae e Viruses (Kozomara; Griffiths-Jones, 2014). Para cada
miRNA depositado no miRBase, é disponibilizado ao usuário um número de acesso; um
acrônimo; uma breve descrição; a classificação em nível de família; a sequência do pre-miRNA
contendo os miRNAs correspondentes, bem como o tamanho, forma experimental com que
foram obtidos os dados e como foram sequenciados; coordenadas genômicas; primeira
referência em que o miRNA foi descrito, bem como publicações posteriores associadas; links
de acesso aos alvos preditos; dentre outras informações.

2.2 Human microRNA Disease Database

O Human microRNA Disease Database (HMDD) integra informações recuperadas do
miRBase fazendo importantes correlações relativas aos dados funcionais dos miRNAs (Lu et al.,
2008). Por exemplo, correlaciona um alvo de miRNA, numa situação de funcionamento anormal
dele, com a doença resultante associada em humanos. O HMDD é atualizado regularmente
e a sua segunda versão foi lançada recentemente (Li et al., 2014), apresentando diversas
opções para facilitar a interação dos usuários com seus dados.

2.3 miRNAMap 2.0

O miRNAMap 2.0 é um banco de dados de miRNAs e alvos em genomas de 12 metazoários,
incluindo humanos, ratos, camundongos, cachorros, galinhas, zebrafish, Caenorhabditis
elegans, entre outros (Hsu et al., 2008). Apresenta ferramentas de predição de alvos de
miRNAs (miRanda, RNAhybrid e TargetScan), bem como perfil de expressão dos miRNAs
e alvos, podendo informar ao usuário a especificidade dos miRNAs por tecido e expressão
diferencial dos mesmos em células normais ou cancerosas.

2.4 miR2Disease
O miR2Disease é um banco de dados de curadoria manual, atualizado a cada dois
meses, que tem como objetivo prover informações abrangentes sobre o funcionamento
anormal de miRNAs em diversas doenças humanas (Jiang et al., 2009). Os miRNAs foram
recuperados do miRBase e as informações relacionadas a seus alvos e à doença resultante
foram recuperadas do repositório de literatura científica PubMed. Pesquisadores também
podem submeter ao miR2Disease miRNAs, seus alvos e a doença correlacionada, caso
essas informações não tenham sido já disponibilizadas em outros repositórios. Para cada
relação miRNA-doença encontrada no repositório são disponibilizados o identificador
do miRNA, o nome da doença relacionada, uma descrição da relação entre o miRNA e a
doença (utilizando vocabulário médico), o perfil de expressão do miRNA nas condições de
ocorrência da doença, o método utilizado para verificação da expressão do miRNA, os alvos
que foram verificados experimentalmente e a referência ao trabalho científico que originou
as informações disponibilizadas.

2.5 PMRD e PNRD

O PMRD (Plant miRNA Database) combina dados disponíveis de miRNAs de plantas
depositados em bancos de dados públicos, baseados na literatura recente, com dados gerados
in-house (Zhang et al., 2010). O PMRD é atualizado constantemente (a cada 6-8 meses) e

290 Introdução ao mundo dos microRNAs

contém informações de sequência, estrutura secundária, genes-alvo e perfil de expressão.
Atualmente, há 8.433 miRNAs coletados de 121 espécies de plantas no PMRD (release 11/2014),
incluindo as plantas-modelo (Arabidopsis, arroz, soja e álamo) e grandes culturas, como
trigo, milho, sorgo, cevada, laranja, algodão, tomate, mandioca, videira, etc.
O PNRD (Plant Non-coding RNA Database) é a versão atualizada do PMRD, a qual
inclui, além dos miRNAs, outras categorias de ncRNAs tais como: lncRNAs, tRNAs, rRNAs,
tasiRNAs, snRNAs e snoRNAs (Yi et al., 2015). O PNRD apresenta ferramentas de análise e
busca por função dos ncRNAs: busca por palavra-chave do ncRNA, busca por função baseada
na literatura, busca pelo alvo de miRNA, predição de novos miRNAs, BLAST e epigenômica
de miRNAs.

2.6 miRNEST 2.0

O miRNEST 2.0 é outro exemplo de banco de dados que integra informações referentes
a miRNAs de plantas, animais e vírus (Szczesniak et al., 2012; Szczesniak; Makalowska, 2014).
As informações disponíveis nesse banco de dados são provenientes de predições (novos
miRNAs e seus respectivos alvos, miRtrons, entre outras) realizadas por outras ferramentas
computacionais, bem como informações recuperadas de outros repositórios, a exemplo
do miRBase. A predição de novos miRNAs foi realizada utilizando 171 bibliotecas de small
RNA-Seq disponibilizadas no GEO database. A associação desses miRNAs com seus alvos foi
realizada utilizando 18 bibliotecas de análises de degradoma correspondentes a 10 espécies
de plantas, também recuperadas do GEO database. O miRNEST integra diversas ferramentas
e permite interações de seus dados com o usuário.

2.7 miRCancer
O banco de dados miRCancer armazena miRNAs recuperados do miRBase que estão
envolvidos em doenças cancerígenas em humanos (Xie et al., 2013). As informações referentes
aos miRNAs diferencialmente expressos durante o desenvolvimento da doença, seus alvos
e a doença associada são recuperadas do repositório PubMed. O miRCancer disponibiliza
informações atualizadas contendo o nome dos miRNAs, com respectiva regulação de expressão,
tipo do câncer envolvido, perfil de expressão (regulação positiva ou negativa) e a referência
bibliográfica. O miRCancer é atualizado regularmente, utilizando uma abordagem de mineração
de texto para buscar informações abrangentes na literatura. Em seguida, os dados passam
por curadoria manual. A associação do miRNA com a doença pode ser buscada pelo nome
do miRNA ou da doença, independentemente, ou pela combinação de ambos.

2.8 VIRmiRNA
O VIRmiRNA é um banco de dados dedicado somente aos miRNAs virais, com três
subdivisões de dados: miRNAs, alvos e miRNAs antivirais (Qureshi et al., 2014). Apresenta
ferramentas para predição de alvo e análise da conservação da região seed de miRNAs entre
os miRNAs virais e celulares, além de BLAST para consulta no próprio banco de dados e
em outros, como o miRBase e PMRD. O VIRmiRNA pode ser usado para o entendimento
de interações vírus-hospedeiro e identificação de novos alvos para o desenvolvimento de
terapias antivirais. Esse banco apresenta em seu repositório: 1.308 miRNAs codificados
por 44 vírus, 7.283 alvos de miRNAs em 15 vírus e 542 miRNAs antivirais produzidos pelo
hospedeiro contra 24 vírus.

Predição computacional de microRNAs em genomas 291

 2.9 ViRBase
O ViRBase disponibiliza dados de miRNAs e outros ncRNAs (lncRNAs e snoRNAs)
virais e do hospedeiro associados com a interação vírus-hospedeiro e redes de interação na
infecção viral (Li et al., 2015). A busca é feita por palavra-chave, símbolo, categoria e fonte do
ncRNA do vírus ou hospedeiro, bem como método de validação. A versão atual do ViRBase
disponibiliza e armazena mais de 12 mil interações de ncRNA associados com vírus, vírus-
hospedeiro, hospedeiro-vírus e hospedeiro-hospedeiro que envolvem mais de 460 ncRNAs
não redundantes e 4.400 genes codificadores de proteínas de 60 vírus e 20 hospedeiros.

2.10 Critérios para depósito em bancos de dados

Para depósito nos bancos de dados de miRNAs, a exemplo do miRBase, é necessário que
o pre-miRNA ou miRNA candidato atenda diversos critérios. Após a predição ou identificação
de um candidato a novo miRNA, é preciso certificar-se de que ele ainda não tenha sido
descrito nem esteja disponível nos diversos bancos de dados existentes. O próximo passo é
verificar se o candidato atende os critérios de qualidade, tais como estrutura e sequência,
e que não seja proveniente de um tRNA, rRNA ou qualquer outro RNA que forme estrutura
secundária em forma de grampo (hairpin), para que possa continuar sendo avaliado como
um miRNA candidato (Meyers et al., 2008). O candidato é avaliado manualmente por um
grupo de especialistas e é classificado em nível de família. Em caso afirmativo, a integração
definitiva no repositório e a liberação dos dados somente são feitas depois da publicação do
artigo científico que descreve todo o processo de identificação e validação.

Tabela 1. Bancos de dados públicos para armazenamento de informações referentes a miRNAs.

Bancos de dados Informação Referência URL*

miRBase Armazena e disponibiliza livremente Griffiths-Jones (2004); www.mirbase.org
dados de miRNAs provenientes Kozomara; Griffiths-
de 223 espécies pertencentes a Jones (2014)
diferentes grupos.
Human microRNA Integra informações de miRNAs de Lu et al. (2008) 202.38.126.151/
Disease database humanos recuperadas do miRBase, Li et al. (2014) hmdd/mirna/md
correlacionando com seus alvos e as (versão 1)
respectivas doenças associadas em cmbi.bjmu.edu.
humanos. cn/hmdd (versão
2)
miRNAMap 2.0 Integra informações referentes Hsu et al. (2008) mirnamap.mbc.
a miRNAs e genes-alvo de nctu.edu.tw/
metazoários, aliando-se aos perfis index.php
de expressão dos miRNAs e alvos em
diferentes tecidos.
miR2Disease Integra informações detalhadas Jiang et al. (2009) www.
sobre miRNAs de humanos, seus mir2disease.org
alvos e suas associações com a
doença causada.
PMRD e PNRD Armazena e integra informações Zhang et al. (2010) bioinformatics.
de miRNAs e outras classes de Yi et al.(2015) cau.edu.cn/PMRD
pequenos RNAs não codificantes em structuralbiology.
plantas. cau.edu.cn/PNRD

292 Introdução ao mundo dos microRNAs

Bancos de dados Informação Referência URL*
miRNEST 2.0 Integra informações referentes a Szczesniak et al. (2012) mirnest.amu.
miRNAs, novos e conhecidos, de Szczesniak; edu.pl
plantas, animais e vírus, integrando- Makalowska (2014)
os, com seus respectivos alvos, a
partir de dados de degradoma e
informações de outros repositórios.
miRCancer Integra informações de miRNAs, Xie et al. (2013) mircancer.ecu.
seus alvos e a doença cancerígena edu
em humanos com que estão
envolvidos.
VIRmiRNA Disponiliza dados de interação entre Qureshi et al. (2014) crdd.osdd.net/
vírus e hospedeiro mediada por servers/virmirna/
miRNAs. index.html
ViRBase Disponiliza dados de interação entre Li et al. (2015) www.rna-society.
vírus e hospedeiro mediada por org/virbase
miRNAs e por outros ncRNAs.
*Os sítios indicados foram acessados em junho de 2015.

3. Métodos para predição computacional de miRNAs

3.1 Métodos comparativos

Os métodos comparativos de identificação de miRNAs são baseados na conservação
do genoma entre espécies filogeneticamente próximas (Gomes et al., 2013). Alguns métodos
utilizam simplesmente a homologia de sequências. No entanto, outras abordagens mais
sofisticadas utilizam algoritmos de AM, nos quais características da conservação de sequências
são usadas como atributos para o desenvolvimento de modelos de predição, a exemplo das
ferramentas computacionais ProMiR, RNAmicro, MiRFinder e MiRRim (Nam et al., 2005; Hertel;
Stadler, 2006; Huang et al., 2007; Terai et al., 2007). A seguir são apresentados os principais
métodos computacionais que utilizam abordagens comparativas para a predição de miRNAs
em sequências genômicas. A tabela 2 resume a lista dos métodos em ordem cronológica.

3.1.1 Srnaloop
Esse método foi desenvolvido para auxiliar na identificação de miRNAs presentes no
genoma de C. elegans (Grad et al., 2003). Desenvolvido para identificar sequências nucleotídicas
com potencial de codificação de RNAs que apresentem formação de hairpins, o método
baseia-se na comparação de sequências de DNA ou RNA de forma semelhante ao algoritmo
BLAST (Altschul et al., 1990), porém diferenciando-se por suportar sequências de tamanhos
menores e alinhar sequências de pares de bases complementares. O Srnaloop atribui uma
pontuação para cada hairpin identificado utilizando parâmetros tais como: energia livre,
estrutura, complementaridade de sequências, entre outros.

3.1.2 MiRScan
O MiRScan foi construído para identificação de miRNAs em C. elegans e C. briggsae
(Lim et al., 2003). O método busca sequências conservadas que formem hairpins com base

Predição computacional de microRNAs em genomas 293

 nos parâmetros do RNAfold (Hofacker, 2003), bem como nas características das sequências.
Em sua abordagem, o MiRScan avalia um potencial hairpin atribuindo-lhe um escore. Esse é
obtido na comparação do candidato com um conjunto de dados de 50 pre-miRNAs altamente
conservados em C. elegans e C. briggsae. As características analisadas do pre-miRNA nessa
comparação são: pareamento de bases na extremidade 3’ com a extremidade 5’; conservação
das sequências na extremidade 5’; conservação um pouco menos rigorosa da extremidade 3’;
certos padrões nas cinco primeiras bases, especialmente o aparecimento de uracila na primeira
posição; e tendência de haver loops internos simétricos e mismatches na região interna.

3.1.3 MirCheck
É uma abordagem computacional para identificação de miRNAs em genomas de
Arabidopsis thaliana e de Oryza sativa que utiliza diversas características, sendo uma delas
a conservação entre essas duas espécies (Jones-Rhoades; Bartel, 2004). A proposta é baseada
em características conhecidas de miRNAs em plantas, tais como: a maioria dos miRNAs de
A. thaliana tem homólogos já identificados no genoma do arroz; as estruturas secundárias
de hairpins, em sua maioria, podem ser preditas pelo software RNAfold se for dada uma
sequência suficientemente longa para conter tanto o miRNA quanto o miRNA*; os hairpins
de A. thaliana e arroz geralmente são mais conservados no miRNA e miRNA* do que no
segmento que os une; todos os matches a miRNAs conhecidos no genoma da A. thaliana,
com exceção dos que são antissenso com relação a regiões codificantes, têm potencial para
formar hairpin e são, portanto, anotados como miRNAs; e muitos miRNAs de A. thaliana são
considerados altamente complementares aos seus mRNAs-alvo, sendo essa característica
conservada em arroz também. Um dos passos realizados pelo MirCheck para identificar
miRNAs foi verificar estruturas secundárias, com o objetivo de identificar sequências de
20 nucleotídeos (nt) que sejam potenciais miRNAs, tendo como entrada uma sequência
candidata a pre-miRNA, uma estrutura secundária do candidato ao hairpin e uma sequência
20-mer dentro do hairpin para ser avaliada como um potencial miRNA.

3.1.4 ProMiR
Utilizando alinhamento de sequências com modelos probabilísticos co-learning,
baseados em Modelos Ocultos de Markov (HMM – Hidden Markov Models), o ProMiR prediz
miRNAs a partir de genomas próximos filogeneticamente (Nam et al., 2005). Esse método
foi o primeiro a utilizar um modelo probabilístico e apresentar validação experimental dos
resultados. Os autores descrevem todo o processo utilizado na identificação de miRNAs em
humanos, avaliando simultaneamente a sequência e a estrutura do pre-miRNA, que de forma
simplificada baseia-se em: identificação das sequências do genoma que apresentam estrutura
de hairpin; verificação da expressão do pre-miRNA das sequências encontradas utilizando
o algoritmo BLAST e o banco de ESTs (Expressed Sequence Tags) do NCBI; filtragem dessas
sequências utilizando o ProMiR para predição de pre-miRNAs candidatos; nova filtragem para
reduzir a quantidade de falsos-positivos levando em consideração estabilidade termodinâmica
do hairpin e conservação; e validação experimental.

3.1.5 MirAlign
É uma ferramenta computacional de interface web que está baseada na estrutura e
informação de sequências de miRNAs conhecidos (Wang et al., 2005). A partir de um possível
precursor de miRNA, é realizado um pré-processamento extraindo candidatos a miRNAs com

294 Introdução ao mundo dos microRNAs

auxílio do algoritmo BLAST e por filtragem de sequências já conhecidas. O MirAlign atribui
uma pontuação a possíveis miRNAs baseada nas seguintes etapas: a estrutura secundária
do candidato a pre-miRNA é predita utilizando-se o software RNAfold e aplica-se a regra de
que a energia livre mínima (MFE) deve ser inferior a 20 kcal/mol; é calculada a pontuação de
similaridade de sequência (min_seq_sim) entre o candidato e os miRNAs conhecidos utilizando
o CLUSTALW (Larkin et al., 2007), sendo que os candidatos com min_seq_sim menores que
70 são excluídos; são avaliadas algumas propriedades do miRNA candidato em relação à
sua posição, por exemplo, a posição do candidato não pode estar no loop final ou diferir
muito de seus homólogos conhecidos; utilizando o software RNAforester (Höchsmann, 2005),
é calculado o alinhamento da estrutura secundária em potenciais homólogos para medir
a conservação; e depois de alinhar todos os possíveis pares de homólogos, uma pontuação
de semelhança total é atribuída a cada sequência candidata a miRNA. Por fim, é exibido o
melhor candidato (o que obteve maior pontuação de semelhança total) a miRNA, destacado
na sequência do pre-miRNA candidato.

3.1.6 RNAmicro
O RNAmicro combina análise comparativa com método de AM para predição de miRNAs
(Hertel; Stadler, 2006). Inicialmente, é realizado um pré-processamento que identifica possíveis
hairpins de pre-miRNAs conservados utilizando alinhamento múltiplo de sequências. Em
seguida, cria-se um vetor de atributos numéricos de cada um desses hairpins, explorando
12 propriedades com base em sua estrutura, composição e conservação da sequência, bem
como na estabilidade termodinâmica. Por fim, utiliza-se a abordagem máquina de vetores
de suporte (SVM – Suport Vector Machine) (Tan et al., 2006), utilizando a função kernel RBF,
para criar um preditor que com base nos atributos empregados seja capaz de encontrar
precursores em uma dada sequência. Na etapa comparativa, são utilizados filtros menos
rigorosos para identificar possíveis hairpins de pre-miRNAs, descartando aqueles em que as
estruturas não contenham uma haste com pelo menos 10 pares de bases ou que contenham
dois ou mais loops com pelo menos cinco pares de bases cada um. De acordo com os autores,
o software foi testado em genomas de mamíferos, urocordados e nematoides.

3.1.7 microHARVESTER
Esta ferramenta é capaz de predizer miRNAs em plantas com base em padrões de
conservação e critérios de similaridade de sequência (Dezulian et al., 2006). A partir dos
candidatos a miRNAs e seus precursores, o microHARVESTER realiza filtragens, como, por
exemplo: filtragem dos precursores candidatos a partir da avaliação do alinhamento da
sequência do miRNA; filtragem dos precursores candidatos a partir da aplicação de uma
versão modificada do algoritmo de alinhamento Smith-Waterman (Smith; Waterman, 1981),
a fim de determinar a sequência do miRNA maduro no precursor candidato; filtragem dos
pre-miRNAs candidatos a partir da análise de MFE da sequência candidata utilizando os
parâmetros do software RNAfold; e para cada candidato que passou pelos filtros é criado um
alinhamento múltiplo de sequências usando o software T-Coffee (Di Tommaso et al., 2011).
Após todas essas análises, o microHARVESTER exibe um relatório em formato PDF contendo
informações da análise correspondentes a cada miRNA candidato.

3.1.8 MiRFinder
O MiRFinder classifica pre-miRNAs candidatos utilizando comparação de sequências
de espécies relacionadas e um método de AM (Huang et al., 2007). O método executa um

Predição computacional de microRNAs em genomas 295

 pipeline com as seguintes etapas: utilizando uma adaptação do algoritmo de Smith-Waterman,
é realizada uma busca em regiões genômicas que possuam potencial de formação de hairpins;
utilizando os parâmetros do software RNALfold (Lorenz et al., 2011), as sequências dos hairpins
candidatos são dobradas, obtendo-se as estruturas secundárias; os melhores hairpins e loops
são selecionados, sendo novamente avaliados, mas, dessa vez, utilizando-se o software RNAfold
para obter os valores de MFE, entre outros valores relacionados ao hairpin; classificação
das sequências como hairpins ou não hairpins típicos de pre-miRNAs utilizando SVM. O
MiRFinder foi testado com sucesso em pares de genomas galinha/humano e das mosca-da-
fruta D. melanogaster/D. Pseudoobscura.

3.1.9 MiRRim
O MiRRim implementa um algoritmo baseado em HMM que utiliza propriedades
evolutivas e estruturais de pre-miRNAs para identificação de miRNAs (Terai et al., 2007).
Para ajustar o HMM, os autores utilizam características estruturais extraídas de um conjunto
de dados formado por 290 miRNAs e 50 nt adjacentes a eles, sendo essas características:
o escore de conservação, calculado pelo alinhamento múltiplo realizado pelo algoritmo
phylo-HMM; o z-score, obtido a partir da significância estatística da MFE; o potencial para
formação de hairpin; e o potencial para formação de loops e hairpins simétricos.

Tabela 2. Métodos de predição de miRNAs/pre-miRNAs por abordagem comparativa. A saída +/- é para
indicar que a ferramenta realiza uma classificação binária, respondendo meramente se o candidato
dado como entrada é verdadeiro ou falso.

Método Organismo Principal entrada* Tipo de saída Referência URL**

Srnaloop C. elegans Sequência de DNA pre-miRNA Grad et al. arep.med.
(2003) harvard.edu/
miRNA
MiRScan C. elegans Candidato a pre-miRNA +/- Lim et al. (2003) genes.mit.edu/
mirscan
MirCheck A. thaliana e Candidato a pre-miRNA, miRNA Jones-Rhoades; bartellab.wi.mit.
O.sativa estrutura secundária e Bartel (2004) edu/software.
sequência candidata ao html
miRNA
ProMiR H. sapiens Candidato a pre-miRNA miRNA Nam et al. bi.snu.ac.kr/
(2005) ProMiR
MirAlign Animais Candidato a pre-miRNA miRNA Wang et al. bioinfo.
(2005) au.tsinghua.edu.
cn/miralign
RNAmicro Mamíferos, Sequência de DNA pre-miRNA Hertel; Stadler www.tbi.univie.
urocordados e (2006) ac.at/~jana/
nematoides software/
RNAmicro.html
microHARVESTER Plantas Candidato a miRNA + +/- Dezulian et al. www-ab.
precursor (2006) informatik.
uni-tuebingen.
de/software/
microHARVESTER
MiRFinder Animais Candidato a pre-miRNA +/- Huang et al. www.
(2007) bioinformatics.
org/mirfinder
MiRRim Animais Sequência de DNA miRNA Terai et al. www.ncrna.org/
(2007) software/miRRim
*Sequência de DNA: Contig, scaffold ou qualquer fragmento de DNA; **Os sítios indicados foram acessados em junho de 2015

296 Introdução ao mundo dos microRNAs

 3.2 Métodos não comparativos
Os métodos não comparativos se baseiam em características estruturais intrínsecas
de miRNAs/pre-miRNAs. Não utilizam, em geral, conservação de sequência como os métodos
comparativos. A abordagem mais comum é a utilização de conjuntos de miRNAs/pre-miRNAs
validados, denominados conjuntos de treinamento, para a construção de modelos de predição
que utilizam padrões identificados nos exemplos de treinamento para realizarem classificação
em dados futuros. Assim, o modelo pode ser aplicado em regiões de genomas de interesse,
onde ainda não há miRNAs identificados.
Nessa categoria destacam-se os métodos baseados em aprendizagem de máquina.
As principais vantagens desses métodos são a alta sensibilidade, a relativa rapidez (uma
vez que o modelo já tenha sido construído) e possibilidade de identificação de miRNAs
em diversas espécies, mesmo distantes filogeneticamente (desde que as características dos
miRNAs nessas espécies sejam semelhantes). A principal limitação, até o presente momento,
é a baixa precisão, levando à predição de um número significativo de miRNAs/pre-miRNAs
falsos-positivos.
Como as técnicas de AM são dominantes nas abordagens não comparativas, uma
breve descrição é feita a seguir sobre conceitos relativos a essa área, principalmente as
abordagens chamadas supervisionadas. Para maiores detalhes, inclusive sobre os algoritmos
mais utilizados e como eles funcionam, recomenda-se o livro de Tan et al. (2006).

3.2.1 Noções sobre aprendizagem de máquina

Subárea da inteligência artificial, a aprendizagem de máquina (AM) tem como
objetivo principal desenvolver algoritmos que sejam capazes de realizar aprendizagem e
predição sobre dados, de modo a extrair conhecimento que, de outra forma, em particular
por inspeção manual, seria complexo e custoso de se conseguir, quando não inviável (Tan
et al., 2006).
A utilização de AM é indicada quando técnicas tradicionais de computação não são
suficientes para resolver determinado problema devido ao fato de esse não apresentar
características claras que levem sempre a uma solução, ou seja, não há, ou ainda não se
descobriram, regras bem definidas que resultem sempre nas melhores respostas. Nesses
casos, as soluções por AM, embora não sejam capazes de acertar sempre, indicam direções/
tendências mais prováveis.
Alguns exemplos de áreas onde a utilização de AM é bastante comum são: motores
de busca, processamento de linguagem natural, diagnóstico médico, análise do mercado
de ações, visão computacional, jogos eletrônicos, análise de crédito, detecção de fraude em
transações bancárias e diversos problemas em bioinformática.
Em relação à bioinformática, as estratégias de AM estão presentes em um grande
número de soluções para análise de dados em diversos problemas, tais como: descoberta
de novos genes e predição de suas funções; predição de sítios de ligação para fatores de
transcrição; predição da estrutura secundária e terciária de proteínas a partir da sequência de
aminoácidos; predição de docking de proteínas; mineração de textos científicos; identificação
de biomarcadores em dados de espectrometria de massa, dentre outros (Inza et al., 2010),
além da predição de novos miRNAs.
Para descoberta de novos miRNAs, os chamados métodos de aprendizagem
supervisionado são dominantes. Esses métodos de AM têm como objetivo realizar a classificação

Predição computacional de microRNAs em genomas 297

 dos dados. Consistem em utilizar características, ou na terminologia mais usual: atributos,
de exemplos, também chamados de instâncias, já conhecidos e devidamente rotulados, ou
seja, que têm sua classe já conhecida, para induzir um modelo de predição que generaliza
o conhecimento obtido do conjunto de treinamento. Cada método supervisionado tem a sua
maneira de estabelecer um modelo. Porém, em todos os casos, um modelo de predição pode
ser entendido como uma função que mapeia o conjunto de atributos de uma instância numa
classe, de maneira que para instâncias futuras, das quais se conhecem os atributos, mas
não a classe, essa possa ser predita pelo modelo gerado. Para um melhor entendimento, a
figura 1 ilustra uma abordagem supervisionada bastante frequente nos diversos métodos
não-comparativos de predição de pre-miRNAs.
Os principais métodos não comparativos são descritos a seguir e sumarizados na
tabela 3 em ordem cronológica.

3.2.2 Triplet-SVM
O Triplet-SVM foi proposto para classificar pre-miRNAs (Xue et al., 2005). Inicialmente,
recebe como entrada sequências de candidatos a pre-miRNA em formato FASTA. Então utiliza
o software RNAfold para gerar a estrutura secundária de cada sequência informada. Assim,
cada estrutura secundária tem seus triplets extraídos, contabilizados e normalizados. Por fim,
os valores encontrados são dados como entrada a um classificador SVM que classifica cada
pre-miRNA candidato como positivo ou negativo. Para realizar o treinamento do classificador,
foram utilizados 193 pre-miRNAs humanos que não apresentam múltiplos loops, obtidos
do miRBase versão 5, como exemplos positivos. Adicionalmente, foram utilizadas 8.494
sequências que formam hairpins, obtidas de regiões codificantes de proteínas do DNA humano,
como exemplos negativos.

Figura 1. Estratégia geral de métodos de AM supervisionados para predição de pre-miRNAs. (A) Inicialmente, são
obtidas as sequências de pre-miRNAs conhecidos através de bases de dados como as que foram descritas neste capítulo.
Sequências de pre-miRNAs são rotuladas como exemplos positivos (p. ex.: rótulo 1). Já as sequências de outros tipos de
RNA são rotuladas como exemplos negativos (p. ex.: rótulo 0). (B) Em seguida, são extraídos determinados atributos das
estruturas primária e secundária de cada sequência. (C) Atributos como: energia livre mínima, delta G, frequência de
cada nucleotídeo, quantidade de loops, quantidade de bojos (regiões de mismatch), características da haste (como número
de partes que se complementam), triplets, dentre outros. (D) Com a extração dos atributos, é utilizado um algoritmo
de AM, como Random Forest, SVM, Redes Neurais Artificiais etc., para a indução de um modelo. (E) Um modelo é uma
generalização da relação que pode ser extraída dos dados de treinamento entre os valores de atributos e os rótulos da
classe, de maneira que quando for necessário classificar uma nova sequência candidata a pre-miRNA extraem-se os
atributos dela e o modelo, de acordo com os valores dos atributos, fará a predição da classe (positiva ou negativa). (F)
Uma sequência candidata a pre-miRNA que será classificada com o modelo induzido a partir do conjunto de treinamento.

298 Introdução ao mundo dos microRNAs

 3.2.3 Vmir
O Vmir implementa uma abordagem para realizar a predição de novos pre-miRNAs
em eucariotos (Grundhoff et al., 2006). Como entrada, recebe a sequência a ser analisada; o
valor mínimo de um escore utilizado para filtragem de pre-miRNAs improváveis; o tamanho
da janela (subsequência sendo analisada) e do passo, ou seja, do número de nucleotídeos a
saltar para obter outra subsequência à frente; e os tamanhos mínimo e máximo do hairpin.
Inicialmente, utiliza uma janela de tamanho informado e avança nela em passos de tamanho
definido. Então, utiliza o software RNAfold para gerar as estruturas secundárias dos hairpins
contidos na janela. Aqueles candidatos que atendam ao tamanho mínimo informado são
selecionados e analisados. Por fim, cada candidato tem seus atributos comparados às sequências
de um conjunto de dados com 175 pre-miRNAs humanos conhecidos e 5.500 pseudo-hairpins.
Alguns dos atributos utilizados são: porcentagem de nucleotídeos pareados, tamanho da
maior haste, posição relativa do loop terminal e ocorrência de bojos (regiões de mismatch).
As sequências candidatas que atingirem pontuação 0 ou 1 são descartadas, enquanto que
aquelas com pontuação 2 são mostradas.

3.2.4 MiPred
O MiPred tem sua implementação disponibilizada via interface web e realiza a
classificação de pre-miRNAs (Jiang et al., 2007). Como entrada, recebe sequências de possíveis
pre-miRNAs em formatos FASTA, CGC, GenBank ou EMBL. Inicialmente, cada sequência
informada tem sua estrutura secundária avaliada quanto à formação de hairpin. Caso positiva,
são extraídos atributos da sequência que são dados como entrada para um classificador
denominado Random Forest (Breiman, 2001). Para realizar o treinamento do classificador,
foram obtidos 462 pre-miRNAs humanos no miRBase versão 8.2. Desses, 36 foram descartados
por possuírem múltiplos loops. Portanto, 426 pre-miRNAs humanos foram utilizados como
exemplos positivos. Adicionalmente, foram analisados 8.494 exemplos negativos do trabalho
de Xue et al. (2005), em que só foram utilizados como exemplos negativos para treinamento
aqueles que atenderam a valores típicos relativos aos seguintes critérios: tamanhos mínimo
e máximo, quantidade de pareamentos, energia livre e ausência de múltiplos loops.

3.2.5 CID-miRNA
Essa abordagem prediz a localização de pre-miRNAs em uma sequência a partir da
seguinte entrada de dados informada em seu servidor web: uma sequência de DNA; escore
mínimo; escore estrutural mínimo; e tamanhos mínimos da haste terminal e da janela
(Tyagi et al., 2008). Para realizar a predição, foi construído um modelo de Gramática Livre
de Contexto Estocástica (SCFG) (Sakakibara et al., 1994). Para a construção da gramática
foram utilizadas características das estruturas primárias e secundárias de 474 sequências
de pre-miRNAs humanos validados como exemplos positivos (obtidos no miRBase). Para
garantir que não houvesse duplicidades, as sequências com alta homologia foram retiradas.
Adicionalmente, foram utilizadas 300 sequências de rRNA humano como exemplos negativos,
obtidas no GenBank. O CID-miRNA utiliza o algoritmo CYK, que determina se uma cadeia de
caracteres pode ser gerada por uma determinada gramática livre de contexto, para definir
um escore através da triagem dos conjuntos positivos e negativos. Por fim, foi utilizado um
classificador J48 através do Weka toolkit (Tan et al., 2006; Hall et al., 2009), com o intuito de
construir uma árvore de decisão para determinar o melhor valor de escore discriminante

Predição computacional de microRNAs em genomas 299

 entre exemplos positivos e negativos. Como resultado final, são apresentados os pre-miRNAs
que atendem aos escores definidos, assim como as respectivas estruturas secundárias.

3.2.6 SSCprofiler
O SSCprofiler utiliza o método probabilístico Modelos Ocultos de Markov (HMM) para
realizar a predição de novos pre-miRNAs em Homo sapiens (Seymore et al., 1999; Oulas et
al., 2009). É necessário informar uma sequência genômica; as coordenadas na sequência
informada em que o algoritmo deve realizar a busca (perfazendo no máximo mil nt); valores
limiares (thresholds) que servirão de valores discriminantes na HMM; energia livre mínima;
dentre outros parâmetros relacionados à estrutura secundária do hairpin e à conservação.
Por utilizar informação de conservação, esse método tem também um viés comparativo. No
entanto, essa não é a característica mais marcante dessa abordagem. Os aspectos intrínsecos
da estrutura secundária do precursor são, sem dúvida, dominantes no SSCprofiler.
Inicialmente, é realizada a predição da estrutura das sequências analisadas e avaliada
a sua conservação. Em seguida, os candidatos a pre-miRNAs são filtrados de acordo com os
parâmetros informados anteriormente. Após isso, são extraídos os atributos das sequências,
que incluem aspectos da estrutura secundária e da conservação. Por fim, esses dados são
fornecidos como entrada para o HMM. Para treinar o HMM foram utilizados 249 pre-miRNAs
humanos obtidas no miRBase versão 12. Adicionalmente, foram utilizadas 8 mil sequências do
tipo 3’ UTR do genoma humano como exemplos negativos. Essas sequências foram utilizadas
como negativas porque não havia registros de miRNAs nessas regiões. Ao final, o programa
mostra as posições dos pre-miRNAs encontrados e as respectivas estruturas secundárias.

3.2.7 Virgo
O método Virgo, que tem sua implementação disponibilizada via interface web,
realiza a predição de novos pre-miRNAs a partir de uma sequência genômica de até 5
mil nt (Kumar et al., 2009). Em primeiro lugar, utiliza o software RNAfold para predizer a
estrutura secundária dos candidatos. A seguir, realiza um filtro para descartar os candidatos
que não atendam às características de pre-miRNAs conhecidos. Para cada candidato restante
são extraídos atributos para realizar a classificação com o algoritmo SVM light (Joachims,
1999). Para treinar o classificador, foram utilizadas sequências de 377 miRNAs precursores
humanos validados experimentalmente como exemplos positivos. Ademais, foram utilizadas
430 sequências artificiais como exemplos negativos. O software dá como saída os candidatos
que foram classificados positivamente pelo classificador.

3.2.8 microPred
O microPred também baseia-se em técnicas de AM para classificar pre-miRNAs
(Batuwita; Palade, 2009). Recebe como entrada sequências de possíveis pre-miRNAs em
formato FASTA. Na continuidade, cada uma das sequências candidatas tem sua estrutura
secundária gerada utilizando-se o software RNAfold e, então, 49 atributos são extraídos. Após
a extração, são selecionados os 21 melhores atributos, ou seja, aqueles que proveem mais
informação para a tarefa de classificação. Por fim, os dados são fornecidos como entrada
para um algoritmo SVM. Para realizar o treinamento do classificador, foram utilizadas 691
sequências não redundantes de pre-miRNAs humanos como exemplos positivos, obtidas
através do miRBase versão 12. Os autores construíram a base de exemplos negativos juntando
754 sequências de ncRNAs (exceto miRNAs) às 8.494 sequências negativas do trabalho de
Xue et al. (2005). Ao final, o programa exibe os candidatos classificados como pre-miRNAs.

300 Introdução ao mundo dos microRNAs

 3.2.9 PlantMiRNAPred
Esse método disponibiliza um servidor web para classificação de pre-miRNAs em
plantas (Xuan et al., 2011). Recebe como entrada sequências de candidatos a pre-miRNA em
formato FASTA. Em seguida, para cada sequência, extrai 115 atributos da estrutura primária e
secundária, essa última com o auxílio do software RNAfold, para então passar à classificação
com um modelo de aprendizagem por SVM. No entanto, visando maximizar a eficiência da
classificação, os atributos redundantes são antes descartados. Adicionalmente, os atributos
são ordenados pelo ganho de informação (Tan et al., 2006). Os que não atenderem certos
valores limiares são eliminados. Para realizar o treinamento do classificador, foram utilizados
1.906 pre-miRNAs de plantas obtidos no miRBase versão 14, como exemplos positivos. Como
exemplos negativos, foram utilizadas 2.122 sequências das espécies Arabidopsis thaliana e
Glicine max, extraídas de regiões que codificam proteínas. O programa reporta a classificação
dos candidatos como pre-miRNAs ou pseudo pre-miRNAs.

3.2.10 miRPara
Esse método deu origem a um software livre para predição de miRNAs maduros e pre-
miRNAs tendo como entrada grandes sequências genômicas (Wu et al., 2011). Primeiramente, a
sequência de DNA informada é dividida em fragmentos de 500 nt com 200 nt de sobreposição.
Para cada fragmento de 500 nt é utilizado o software UNAFold para predição de candidatos
a pre-miRNAs (Markham; Zuker, 2008). Em seguida, os hairpins com menos de 60 nt e
aqueles que contenham segmentos com sobreposição são rejeitados. Os demais hairpins
são então reavaliados com o software UNAFold. Após essa etapa, os hairpins restantes são
investigados visando encontrar candidatos a miRNA. Para realizar essa análise são extraídos
77 atributos de cada candidato. O miRPara é mais um método que utiliza um modelo de
aprendizagem construído por uma abordagem SVM. Os modelos de classificação incluídos no
método utilizaram 5.576 sequências validadas de miRNAs/pre-miRNAs obtidas no miRBase
versão 13 como exemplos positivos. Esses exemplos foram empregados em três modelos:
animais, plantas e global, o primeiro com 4.886 sequências de animais, o segundo com 1.215
sequências de plantas e o terceiro com todas as 5.576 sequências validadas. Para o conjunto
de dados negativo foram criadas 5.576 sequências artificiais. Os autores descrevem que
várias proporções distintas entre o número de exemplos negativos e positivos foram testadas,
para avaliar o efeito do desbalanceado na eficiência do modelo. Aqueles candidatos a pre-
miRNA/miRNA que são classificados como verdadeiros pelo modelo SVM são mostrados
como saída do programa.

3.2.11 miRNAFold
Disponibilizado via interface web, é utilizado para localizar pre-miRNAs em uma
sequência informada (Tempel; Tahi, 2012). A sequência é avaliada janela por janela, a partir
do fornecimento da seguinte entrada: tamanho da janela, parâmetros espécie-específicos
e porcentagem de atributos a serem verificados como filtro nas etapas do algoritmo. Para
cada janela é construída uma matriz par-base, ou seja, em que os caracteres da subsequência
sendo investigada são representados pelas linhas e os caracteres da sequência inversa
são representados pelas colunas, e cada célula da matriz é preenchida de acordo com a
complementaridade das bases da linha e coluna correspondentes. O valor da célula será
zero para indicar ausência de complementaridade ou um valor inteiro positivo i para indicar

Predição computacional de microRNAs em genomas 301

 complemento na i-ésima base de uma sequência de bases complementares. Dessa maneira, uma
sequência que se complemente, e que forme o que os autores chamam de haste longa exata,
é facilmente detectável, pois forma uma diagonal de números inteiros positivos na matriz.
Numa primeira etapa, o método realiza uma busca na matriz por possíveis hastes
longas exatas. Para cada haste longa encontrada são extraídos 12 atributos. Esses atributos
são analisados para definir as hastes exatas que têm maior probabilidade de fazer parte de
um precursor. As que passam pelo filtro são estendidas para que sejam encontradas hastes
mais longas, chamadas de não exatas, pois incluem partes que não se complementam. Cada
haste longa não exata tem 18 atributos extraídos que são utilizados, de forma similar à fase
anterior, para filtrar as hastes mais prováveis. Essas, da mesma maneira, são estendidas
visando reconstituir a estrutura completa dos pre-miRNAs candidatos, que também têm
uma série de atributos analisados para reportar os pre-miRNAs finais e as respectivas
estruturas secundárias. A análise de cada etapa é realizada a partir dos valores observados
ao estudar os atributos dos pre-miRNAs conhecidos em Homo sapiens, Mus musculus, Rattus
norvegicus, Gallus gallus, Xenopus tropicalis, Danio rerio, Drosophila melanogaster, Bombyx
muri, Caenorhabditis elegans, Ciona intestinalis, Zea mays, Medicago truncatula, Oriza sativa
e Arabidopsis thaliana contidos no miRBase versão 17.

3.2.12 HuntMi
É uma abordagem para classificação de pre-miRNAs (Gudys et al., 2013). Como entrada,
recebe candidatos a pre-miRNAs em formato FASTA. Como saída, informa se cada sequência
enviada é verdadeiramente um pre-miRNA. A ferramenta computacional fornece modelos
prontos para classificar pre-miRNAs de plantas, animais e vírus. Além disto, é possível criar
novos modelos com conjuntos de dados de treinamento informados pelo usuário. Para os
modelos criados no trabalho reportado pelos autores, os exemplos positivos foram obtidos a
partir de todos os pre-miRNAs validados experimentalmente contidos no miRBase versão 17.
Para os exemplos negativos, foram utilizados RNAs mensageiros de animais, plantas e vírus.
Nesse processo foram extraídas subsequências dos mRNAs, nas quais o início da sequência
foi aleatoriamente escolhido e o final calculado para que os exemplos negativos tivessem o
mesmo tamanho dos positivos, garantindo assim a mesma distribuição de tamanhos entre
as duas classes. Para realizar a classificação, além dos 21 atributos utilizados no método
microPred, foram criados sete novos atributos. A fim de resolver o desbalanceamento
entre a quantidade de exemplos positivos e negativos, foram testadas diversas estratégias
e classificadores como: Naive Bayes, Redes Neurais Artificiais, SVM, Random Forest, APLSC,
SMOTE e ROC Select (Chawla et al., 2002; Tan et al., 2006). Como resultado final, Random
Forest + ROC Select apresentaram os melhores desempenhos.

3.2.13 HeteroMirPred
É um método que realiza a classificação de precursores de miRNAs (Lertampaiporn
et al., 2013). Recebe como entrada sequências de possíveis pre-miRNAs. A seguir, são
extraídos 125 atributos de cada sequência informada. Os candidatos a pre-miRNAs são
então classificados por um conjunto de algoritmos: K-Nearest-Neighbor, Random Forest
e SVM (Tan et al., 2006). Para treinar os classificadores, foram utilizados 600 pre-miRNAs
de H. sapiens, 200 de O. sativa e 200 de A. thaliana, obtidos do miRBase 17, como exemplos
positivos. Adicionalmente, foram utilizadas 4 mil sequências negativas do trabalho de Xue
et al. (2005), extraídos de regiões codificantes de proteína do genoma humano. Para lidar

302 Introdução ao mundo dos microRNAs

com o problema de desbalanceamento entre as classes, a técnica SMOTE foi aplicada nas
instâncias positivas para aumentar em 50% o número de exemplos (Chawla et al., 2002).
Por outro lado, é feita uma reamostragem dos exemplos negativos, retirando-se 25% das
instâncias. Os autores descrevem que são gerados quatro modelos usando cada algoritmo
a partir dos conjuntos de dados balanceados. O método também aplica técnicas de seleção
de atributos para selecionar os melhores. Como saída do programa, são apresentados como
verdadeiros pre-miRNAs as sequências candidatas aprovadas pelo conjunto de classificadores.

3.2.14 MirnaSearch
O MirnaSearch está disponível como um servidor web e foi concebido para predição
de novos pre-miRNAs e respectivos miRNAs (Titov; Vorozheykin, 2013). Utiliza a abordagem
HMM cujo treinamento empregou 1.872 pre-miRNAs humanos obtidos do miRBase versão
20 como exemplos positivos e 1.872 sequências aleatórias de pseudo-precursores como
conjunto negativo. Para realizar a busca por novos miRNAs e precursores, utiliza padrões
das estruturas primária e secundária [esta gerada através do software GaRNA (Titov et al.,
2002)] de pre-miRNAs candidatos extraídos da sequência genômica informada. Após um
pre-miRNA ser predito, é realizada outra análise para encontrar o miRNA maduro nele
contido. Como saída do programa, são mostrados pre-miRNA, miRNA maduro e a estrutura
secundária. A HMM foi treinada apenas em miRNAs de H. sapiens. Em consequência disso,
embora seja possível realizar a busca utilizando o genoma de qualquer espécie, não são
esperados os mesmos resultados de seletividade e sensibilidade.

3.2.15 MirBoost
O método MirBoost visa a classificação de pre-miRNAs (Tran et al., 2015). Para tal,
utiliza uma técnica de AM denominada ensemble em que vários modelos são gerados para que
a classificação seja feita em conjunto por eles. Em particular, o método utiliza a abordagem
ensemble chamada Boosting (Tan et al., 2006), que no caso do MirBoost gera os modelos
empregando uma variação da técnica SVM denominada weakened SVM (Li et al., 2005).
O programa recebe como entrada sequências de possíveis pre-miRNAs. Para realizar a
classificação, são extraídos 187 atributos de cada sequência candidata, sendo 32 atributos da
haste exata mais longa, 45 da haste não exata e 110 da sequência completa. Visando eliminar
atributos redundantes, foram utilizadas diversas técnicas de seleção de atributos implementadas
no software Weka. Os atributos selecionados por mais de uma técnica foram mantidos.
Para a construção do modelo foram utilizados como exemplos positivos 863 pre-miRNAs
humanos contidos no miRBase versão 18. Para os exemplos negativos, foram utilizadas
regiões exônicas de genes codificantes de proteínas, sequências de tRNAs, siRNAs, snRNAs
e snoRNAs. Além disto, o programa permite a criação de modelos próprios a partir de
dados informados pelo usuário. Ao final, o programa classifica os pre-miRNAs fornecidos
na entrada como verdadeiros ou falsos.

3.2.16 miRNA-dis
O método miRNA-dis disponibiliza sua implementação via interface web para
classificação de pre-miRNAs de animais, plantas e vírus (Liu et al., 2015). Inicialmente, o
programa recebe como entrada sequências candidatas a pre-miRNA no formato FASTA. Em
seguida, para cada sequência informada, é construído um vetor de atributos para classificação
extraídos da estrutura secundária que o pacote Vienna produz (Hofacker, 2003).

Predição computacional de microRNAs em genomas 303

 O método também utiliza a abordagem SVM. Para a criação dos modelos, foram
utilizadas 1.872 sequências de pre-miRNAs validados obtidos do miRBase versão 20 como
exemplos positivos. Adicionalmente, foram obtidos 8.489 exemplos negativos dos dados do
trabalho de Xue et al. (2005). Para amenizar o desbalanceamento entre as classes, nenhuma
sequência com homologia foi selecionada. Do conjunto de dados negativos obtidos, 1.612
sequências foram aleatoriamente escolhidas, compondo o conjunto negativo final. Na saída
do programa, cada sequência candidata é rotulada como verdadeira ou falsa. Para avaliar
o método, foram utilizadas sequências de pre-miRNAs de animais, plantas e vírus obtidas
do miRBase versão 21. Com o objetivo de evitar overfitting, ou seja, fazer com que o modelo
preditivo construído não seja adequado somente aos dados de treinamento mas sim genérico,
as sequências com mais de 80% de homologia com as sequências humanas foram retiradas.
O método apresentou uma média de 87,02% de precisão em outras espécies.

Tabela 3. Métodos de predição de miRNAs/pre-miRNAs por abordagem não comparativa. A saída +/- é
para indicar que a ferramenta computacional realiza uma classificação binária, respondendo meramente
se o candidato dado como entrada é verdadeiro ou falso.

Principal Tipo de
Método Organismo Referência URL**
entrada* saída
Triplet-SVM Eucariotos Candidato a +/- Xue et al. bioinfo.au.tsinghua.edu.
pre-miRNA (2005) cn/mirnasvm
Vmir Eucariotos Sequência de pre- Grundhoff et booksite.elsevier.
DNA miRNA al. (2006) com/9780123739179
MiPred Eucariotos Candidato a +/- Jiang et al. www.bioinf.seu.edu.cn/
pre-miRNA (2007) miRNA
CID-miRNA H. sapiens Sequência de pre- Tyagi et al. mirna.jnu.ac.in/cidmirna
DNA miRNA (2008)
SSCprofiler H. sapiens Sequência de pre- Oulas et al. mirna.imbb.forth.gr/
DNA miRNA (2009) SSCprofiler.html
Virgo Vírus Sequência de pre- Kumar et al. miracle.igib.res.in/virgo
DNA miRNA (2009)
microPred Eucariotos Candidato a +/- Batuwita; www.cs.ox.ac.uk/people/
pre-miRNA Palade (2009) manohara.rukshan.
batuwita/microPred.htm
PlantMiRNAPred Plantas Candidato a +/- Xuan et al. nclab.hit.edu.cn/
pre-miRNA (2011) PlantMiRNAPred
miRPara Eucariotos Sequência de pre- Wu et al. 159.226.126.177/mirpara/
DNA miRNA e (2011) cgi-bin/form.cgi
miRNA
miRNAFold Eucariotos Sequência de pre- Tempel; Tahi evryrna.ibisc.univ-evry.
DNA miRNA (2012) fr/miRNAFold
HuntMi Eucariotos Candidato a +/- Gudys et al. adaa.polsl.pl/agudys/
pre-miRNA (2013) huntmi/huntmi.htm
HeteroMirPred Eucariotos Candidato a +/- Lertampaiporn ncrna-pred.com/
pre-miRNA et al. (2013) premiRNA.html
MirnaSearch H. sapiens Sequência de pre- Titov; wwwmgs.bionet.nsc.ru/
DNA miRNA e Vorozheykin mgs/programs/rnaanalys/
miRNA (2013) index.html
MirBoost Eucariotos Candidato a +/- Tran et al. evryrna.ibisc.univ-evry.
pre-miRNA (2015) fr/miRBoost/index.html
miRNA-dis Animais, Candidato a +/- Liu et al. bioinformatics.hitsz.edu.
plantas e pre-miRNA (2015) cn/miRNA-dis
vírus
*Sequência de DNA: Contig, scaffold ou qualquer fragmento de DNA; **Os sítios indicados foram acessados em junho
de 2015.

304 Introdução ao mundo dos microRNAs

 3.3 Métodos baseados em dados de sequenciamento de nova geração
Devido a muitos miRNAs não serem conservados em nível de espécie e com o aumento
da disponibilidade de novos genomas, bem como de dados gerados por NGS, tem sido cada
vez mais necessária a utilização de ferramentas de bioinformática para análise desses dados
no intuito de identificar novos miRNAs. Os métodos para tal são fundamentais, uma vez que o
perfil de pequenos RNAs (small RNAs – smRNAs) e os níveis de expressão fornecem evidências
para a compreensão de processos regulatórios celulares importantes. A quantidade de reads
que mapeiam em regiões correspondentes a precursores e aos próprios miRNAs permite
estimar o nível de expressão desses. Os avanços na análise de dados de NGS e de ferramentas de
bioinformática que implementam a combinação de métodos comparativos e não comparativos
possibilitaram a identificação de novos miRNAs, além do conhecimento do seu nível de
expressão em diversos organismos. O sucesso dessas análises é dependente da realização
correta de etapas que vão desde o planejamento e elaboração dos experimentos biológicos,
passando pelo NGS, até as análises de bioinformática, utilizando métodos e ferramentas
computacionais adequadas e robustas que atendam as necessidades de cada estudo.

3.3.1 Controle de qualidade dos dados de small RNA-Seq

O planejamento e o desenvolvimento correto dos experimentos biológicos refletem no
sucesso das análises e interpretação dos dados. É de extrema importância o uso de metodologias
adequadas que permitam a recuperação de smRNAs, provenientes dos organismos em estudo,
em quantidade, qualidade e pureza. A disponibilidade de kits comerciais (p. ex.: mirVanaTM
miRNA Isolation Kit, Ambion, Texas, USA) para o isolamento de smRNAs tem contribuído
para o sucesso na identificação desses por NGS. Para a construção das bibliotecas small
RNA-Seq, kits comerciais também estão disponíveis (p. ex.: TruSeq small RNA SBS kit v. 3,
Illumina; 3’ IDT miRNA cloning linker, Integrated DNA Technologies) e resumem-se em: (i)
seleção dos smRNAs por tamanho (15-30 nt); (ii) ligação de adaptadores nas extremidades
3’ e 5’ dos smRNAs; (iii) remoção de adaptadores não ligados a smRNAs e síntese da fita
complementar ao smRNA (cDNA); e (iv) PCR com oligonucleotídeos específicos que anelam
nesses adaptadores. O sequenciamento das moléculas de cDNA é feito por NGS e algumas
empresas proveem o serviço de preparo das bibliotecas e sequenciamento NGS utilizando
diferentes plataformas (p. ex.: Illumina HiSeq 2000 e 2500).
As tecnologias de NGS produzem de milhões a bilhões de reads em poucos dias, com
acurácia próxima a 99,99% e com custos considerados aceitáveis (Knief, 2014). O uso de
NGS para smRNAs é realizado geralmente em sentido único (single-end) e com as bibliotecas
multiplexadas. A demultiplexação dos dados correspondentes a essas bibliotecas é baseada
na sequência do adaptador utilizado, o qual contém uma sequência de indexação específica
para cada uma (DNA barcode ou index sequence), podendo ser realizada com programas
específicos (p. ex.: CASAVA pipeline version 1.8.4; Illumina). Esse processo geralmente permite
um mismatch e gera arquivos de saída em formato FASTQ.
A qualidade dos reads gerados é importante para a confiabilidade dos resultados. Essa
avaliação pode ser realizada com base na porcentagem de bases de um read que apresenta
valor de escore igual ou superior a 20 (Q20) ou 30 (Q30) (probabilidade de ter 1 base incorreta
em 100 ou 1.000 bases, respectivamente), utilizando programas como FASTX Toolkit version
0.0.6 (hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/) ou FastQC software (Andrews, 2010).
O processo denominado trimming, que consiste na remoção dos adaptadores,
oligonucleotídeos e bases indeterminadas, representadas pelo caractere “N”, é realizado

Predição computacional de microRNAs em genomas 305

 com auxílio de programas como Prinseq (Schmieder; Edwards, 2011), FASTX Toolkit ou
Trimmomatic software (Bolger et al., 2014). A filtragem dos reads por tamanho (geralmente
entre 18-28 nt) também pode ser feita com o FASTX Toolkit ou o Prinseq software.
Alinhamentos locais de reads das bibliotecas a outros conjuntos de dados de sequências
podem ser realizadas utilizando-se os programas Bowtie (Langmead et al., 2009; Langmead;
Salzberg, 2012), PatMan (Prüfer et al., 2008), BWA (Li; Durbin, 2009), entre outros, permitindo
variações no número de mismatches no alinhamento. A caracterização do perfil de smRNAs
geralmente utiliza conjunto de dados de rRNA, tRNA, miRNAs conhecidos, genomas de referência,
retroelementos, transposons, RNAs não codificantes, produtos de splicing, entre outros.
A expressão diferencial de miRNAs já conhecidos, baseando-se no número de reads
que neles mapeiam, pode ser realizada utilizando-se os mesmos programas de alinhamento
descritos acima, e a contagem de matches, através de scripts desenvolvidos localmente.
A expressão diferencial dos miRNAs é representada pelo número dos respectivos reads
mapeados na biblioteca normalizada e pode ser analisada utilizando-se desde o IDEG6
software (Romualdi et al., 2003), que utiliza o método de normalização RPM (reads per 1
million: número de reads mapeados no miRNA/número de reads filtrados de cada biblioteca
x 1 milhão), até programas disponíveis no Bioconductor (http://www.bioconductor.org/), tais
como DEGseq Bioconductor R package version 1.20.0 (Wang et al., 2010), que determina a
expressão diferencial usando distribuição Binomial ou Poisson, normalização dos dados
por três métodos (none, loess ou median) e métodos para o ajuste de p-values e q-values (p.
ex.: métodos BH e ST).
Outro fato que deve ser destacado é que os métodos de predição de miRNAs, que
utilizam dados de NGS, devem levar em consideração a existência de isoformas de miRNAs
(isomiRs) (Morin et al., 2008) e miRNA Offsets (moRNAs) (Bortoluzzi et al., 2011). Esses têm
sequências de aproximadamente 20 nt de comprimento que, respectivamente, apresentam
variações de tamanho ao miRNA considerado referência e tangenciam a região que produz
o miRNA canônico. Para as predições de precursores utilizando dados de NGS, deve-se ficar
atento à possibilidade de a ferramenta oferecer alguma forma de tratamento de isomiRs
e moRNAs, evitando redundância na predição. Programas como o miRCat e o mirDeep2
possibilitam a filtragem desses no processo de predição. Caso se queira confirmar a existência
de isomiRs e moRNAs nos precursores preditos, um mapeamento de reads, oriundos de NGS,
aos pre-miRNAs possibilitará a identificação desses.
Abaixo são descritos os principais métodos atualmente disponíveis que têm sido
amplamente utilizados para a predição de miRNAs a partir de dados de NGS. A tabela 4
provê uma sumarização dos métodos aqui listados, em ordem crescente do ano em que
foram propostos.

3.3.2 miRCat
É um método que permite identificar miRNAs e seus precursores a partir de dados
provenientes de plantas e animais (Moxon et al., 2008). Sua implementação foi feita na
plataforma Java e faz parte do The UEA Plant sRNA Toolkit. As predições baseiam-se em
critérios que podem ser ajustados pelo usuário.
Como entrada principal do programa, o usuário fornece os reads e o genoma referência.
O miRCat alinha os reads ao genoma utilizando a ferramenta computacional PatMan (Prüfer
et al., 2008). As regiões genômicas que apresentarem abundância de reads mapeados (mínimo

306 Introdução ao mundo dos microRNAs

de cinco) e que apresentarem características que atendam aos critérios preestabelecidos
são consideradas miRNA candidatos. Os critérios para escolha de um locus candidato são:
não conter mais que quatro reads mapeados não sobrepostos; cada hotspot – i.e., região
do genoma com um grande número de reads mapeados – de um locus candidato não deve
localizar-se mais distante do que 200 nt do hotspot vizinho; pelo menos 90% dos smRNAs
mapeados em um lócus candidato devem ter a mesma orientação.
Após essa primeira etapa de seleção, o passo seguinte é fazer uma análise mais a
fundo de cada locus para identificar os miRNAs, utilizando-se dos seguintes critérios: os reads
mais abundantes que mapeiam em um locus são considerados como o provável miRNA; a
sequência genômica que flanqueia esse hotspot é obtida utilizando-se diferentes comprimentos
de janela (p. ex.: 50 nt à esquerda e 50 nt à direita do hotspot); cada uma dessas sequências
assim obtidas é avaliada quanto a sua capacidade de formação de estrutura secundária
em forma de hairpin, utilizando-se o software RNAfold; características típicas (abaixo) de
hairpins são, em seguida, verificadas para cada janela de sequência testada; dentre todos
os hairpins originados das janelas consideradas, aquele com menor energia mínima livre
ajustada (AMFE) é escolhido como pre-miRNA candidato; o pre-miRNA candidato é novamente
avaliado, mas, dessa vez, pelo programa randfold (Bonnet et al., 2004). Caso o AMFE seja
maior que um valor limiar, o pre-miRNA candidato é desconsiderado.
As características típicas de hairpin analisadas pelo miRCat ao testar várias janelas
de sequência são: o hairpin não deve conter mais que três mismatches entre a sequência
do miRNA e o miRNA* candidato; o número de nucleotídeos alinhados entre o miRNA e o
miRNA* deve ser na proporção de 17 bases das 25 que se utilizam para delimitar o miRNA;
o hairpin candidato deve ser de tamanho mínimo de 75 nt (para plantas) e 50 nt (para
animais); a porcentagem de bases pareadas entre a extremidade 5’ e a extremidade 3’ do
hairpin candidato deve ser de pelo menos 50%.
Quase todos esses parâmetros são ajustáveis pelo usuário antes do início da análise.
Entre os arquivos de saída da análise gerados estão uma tabela contendo as informações
relacionadas ao pre-miRNA e os seus miRNAs candidatos, tais como: cromossomo; posição
de início e término do pre-miRNA candidato no locus; fita senso ou antissenso; porcentagem
de GC do hairpin; valores de MFE e AMFE; número de reads mapeados; sequência; posição
de início e término do miRNA no hairpin, dentre outras. Um segundo arquivo de saída é
utilizado para gerar a imagem dos pre-miRNAs identificados com os respectivos miRNA e
miRNA* mapeados, através da ferramenta RNA/Folding Annotation também implementada
no The UEA Plant sRNA Toolkit.

3.3.3 miRDeep
Para realizar a separação de miRNAs de outros pequenos RNAs sequenciados e
de produtos de degradação em dados de small RNA-Seq, o miRDeep utiliza um modelo
probabilístico para atribuir um escore que reflete o grau de confiança para rotular um
determinado RNA como miRNA maduro (Friedländer et al., 2008). O escore é calculado de
acordo com a posição e a frequência do RNA sequenciado com relação à estrutura secundária
do pre-miRNA e é proporcional à compatibilidade dessas características com o que se conhece
sobre o processamento dos pre-miRNAs no interior da célula. Em particular, espera-se que
a quantidade de reads mapeados na parte do hairpin que corresponde ao miRNA maduro
seja bem maior que o número de reads que mapeiam nas outras partes geradas pela enzima
Dicer, ou seja, no loop e no miRNA*. A ferramenta computacional é capaz de detectar miRNAs

Predição computacional de microRNAs em genomas 307

 já conhecidos e predizer novos. Também provê a possibilidade de estimar a taxa de falsos-
positivos e a sensibilidade das predições que realiza.
Após realizar o mapeamento dos reads no genoma, o miRDeep executa os seguintes
passos: descarta reads que mapeiem em muitos loci, pois provavelmente são reads de regiões
repetidas do genoma; descarta reads que mapeiem em outros tipos de RNAs, como rRNAs e
tRNAs, caso a anotação do genoma tenha sido fornecida (opcional); extrai as subsequências
do genoma em que há um mapeamento significativo de reads, para que esses trechos sejam
candidatos a precursor; descarta candidatos a precursor que fujam às características esperadas
de um hairpin de miRNA; atribui um escore utilizando um modelo probabilístico que leva em
consideração características do hairpin, como estabilidade energética, bem como o número
de reads mapeados nas partes do hairpin correspondentes aos produtos que nesse método
supõe-se serem produzidos pela enzima Dicer (miRNA maduro, miRNA* e loop), e fornece a
lista de miRNAs e respectivos precursores que obtiveram escore siginificativo; e provê uma
estimativa da taxa de falsos-positivos e sensibilidade (opcional).
A validação do método foi realizada através de experimentos com dados de small
RNA-Seq de C. elegans, H. sapiens e Canis familiaris. O miRDeep é implementado na linguagem
de programação Perl e está disponível para os sistemas Linux, Windows e outros sistemas
que suportem essa linguagem de programação.

3.3.4 miRExpress
Essa ferramenta tem como principal finalidade identificar e avaliar o perfil de
expressão de miRNAs já conhecidos a partir de dados de small RNA-Seq (Wang et al. 2009).
O primeiro passo é a identificação e contagem de reads únicos e trimming para a remoção
de sequências completas ou parciais de adaptadores. O segundo passo é alinhar os reads a
miRNAs conhecidos disponibilizados no miRBase. O alinhamento é baseado no algoritmo
de Smith-Waterman e é implementado no esquema Single Instruction Multiple Data (SIMD)
utilizado para processamento paralelo. Finalmente, no terceiro passo, perfis de expressão
são construídos computando-se a contagem dos reads para cada miRNA de acordo com os
alinhamentos.
Os reads que não se alinharem a miRNAs conhecidos na espécie em análise podem
ser submetidos a alinhamento com miRNAs de outras espécies, possibilitando a descoberta
de novos miRNAs na espécie de interesse. O miRExpress é implementado para o sistema
operacional Linux.

3.3.5 mirTRAP
O que diferencia o mirTRAP de outros métodos é, principalmente, a utilização dos
seguintes três critérios para análise de um pre-miRNA candidato (Hendrix et al., 2010). Primeiro,
a enzima Dicer poder gerar, a partir do pre-miRNA, não só o miRNA, o miRNA* e o loop, mas
também o moRNA e o moRNA*. Segundo, a fita oposta ao pre-miRNA raramente apresenta
mapeamento de reads. Quando isso ocorre, os produtos antissenso dos loci de miRNAs conhecidos
têm matching perfeito com os miRNAs da fita referência. Isso contrasta com os loci de outros
tipos de RNA (p. ex.: endo-siRNA e piRNA). Nesses casos, os produtos antissenso se apresentam
deslocados em vários pares de bases. Finalmente, como terceiro critério, miRNAs tendem
a ocorrer em regiões genômicas que não possuem outros tipos de pequenos RNAs. Assim,

308 Introdução ao mundo dos microRNAs

exceto nos casos de ocorrência de miRNAs antissenso e miRNAs de clusters genômicos, não
há, normalmente, nenhum ou há poucos reads na vizinhança de um miRNA.
Após mapear os reads ao genoma utilizando o BLAST, o algoritmo realiza os seguintes
passos: identificação de regiões contíguas no genoma com mapeamento de reads; filtragem
para eliminar as regiões contíguas que tenham pelo menos 160 nt ou que correspondam
a repeats ou tRNAs; utilização das regiões contíguas restantes, consideradas como pre-
miRNAs candidatos, como entrada para o programa RNAfold para geração dos respectivos
hairpins; análise do mapeamento de reads em cada hairpin de modo a identificar os possíveis
cinco produtos da enzima Dicer (miRNA, miRNA*, moRNA, moRNA* e loop); verificação de
características típicas concernentes, principalmente, aos três critérios mencionados acima,
para listagem das predições finais de miRNAs e respectivos pre-miRNAs.

3.3.6 MIReNA
Esse método demonstra grande flexibilidade, pois pode funcionar de quatro formas
diferentes: como classificador de pre-miRNAs, em que recebe potenciais pre-miRNAs como
entrada e os classifica como positivos ou negativos; como preditor de novos pre-miRNAs a
partir de uma sequência de DNA informada, gerando estruturas secundárias de trechos da
sequência de entrada e verificando se atendem a critérios típicos dessa estrutura; predição de
miRNAs a partir de uma base de dados de miRNAs conhecidos; e predição de novos miRNAs/
pre-miRNAs utilizando dados de small RNA-Seq (Mathelier; Carbone, 2010). Assim, é um
método que se encaixa em todas as categorias de abordagens apresentadas neste capítulo.
No caso de predições baseadas em dados de NGS, uma vez identificadas as regiões
candidatas a pre-miRNAs no genoma referência de acordo com o mapeamento de reads, as
sequências respectivas são dadas como entrada para o RNAfold e cinco critérios (também
utilizados nos outros casos de uso do MIReNA) devem ser atendidos para eliminação de
falsos-positivos: o pre-miRNA candidato deve apresentar características que possibilitem
a identificação do miRNA e do miRNA*; a distância entre o miRNA e o miRNA* deve ser
coerente; a porcentagem de bases não pareadas entre o miRNA o miRNA* não deve ultrapassar
um valor pré-estipulado; o valor de AMFE do pre-miRNA não deve ultrapassar um valor
predefinido; e o valor de MFEI (minimum free energy index) do pre-miRNA não pode ser maior
que um valor estabelecido. Após essa filtragem, os pre-miRNAs remanescentes são novamente
avaliados e filtrados com base nas condições de processamento pela Dicer, verificando-se
a sua identidade com outros RNAs não codificantes.
O MIReNA é implementado na linguagem C. Mas seu funcionamento requer as seguintes
instalações: compilador Perl, compilador Python, ambiente bash e o RNAfold v.1.8.x.

3.3.7 miRanalyzer
Sua primeira versão, disponibilizada em 2009, requer, além do genoma referência, um
arquivo de entrada em formato FASTA contendo os reads e suas frequências na biblioteca small
RNA-Seq (Hackenberg et al., 2009). Para alinhamento, utiliza o algoritmo Bowtie. Inicialmente,
filtra os reads com base no tamanho (predefinido pelo usuário) e na qualidade (bases “N”).
Os reads que passaram pelo processo de filtragem são submetidos a uma primeira etapa,
onde são alinhados a sequências de RNAs conhecidos (RNAs não codificantes, retroelementos,
elementos transponíveis, tRNAs, rRNAs, cis-elementos regulatórios, produtos de splicing,
sequências de transcritos do organismo referência).

Predição computacional de microRNAs em genomas 309

 Numa segunda etapa são identificados miRNAs conhecidos através de uma busca
aos dados de sequências de miRNAs disponibilizados pelo miRBase.
Na terceira e última etapa, os reads remanescentes são utilizados para a predição de
novos pre-miRNAs e os respectivos miRNAs. Para avaliar os possíveis miRNAs/pre-miRNAs
selecionados a partir do mapeamento de reads, os autores empregam uma abordagem por
AM chamada Random Forest (Breiman, 2001). Para isso, cada região candidata é dada como
entrada para o software RNAfold para obtenção do hairpin mais provável, sendo, em seguida,
avaliada pelo classificador Random Forest, utilizando-se vários atributos, tais como: número
de reads que mapeiam o pre-miRNA candidato; a energia livre média (MFE) do hairpin; o
número de bases no loop; o conteúdo GC do loop; o número de bojos (mismatches) na haste;
dentre outros. O modelo de classificação foi construído utilizando dados de humanos, ratos
e C. elegans.
Os miRNAs/pre-miRNAs preditos podem ser visualizados em contexto genômico
por meio dos navegadores UCSC Genome Browser e NGSmethDB (Karolchik et al., 2003;
Hackenberg; Barturen; Oliver, 2011). O miRanalyzer pode ser utilizado via servidor web ou
através da versão disponível para uso em servidores locais. Uma nova versão do miRanalyzer
foi disponibilizada dois anos após seu lançamento (Hackenberg; Rodríguez-Ezpeleta; Aransay
2011), com atualizações e novas implementações, inclusive pacotes de parâmetros para
31 espécies (sendo seis de plantas), ferramentas para análise de expressão diferencial e
identificação de alvos de miRNAs.

3.3.8 mirExplorer
Método aplicável a animais e plantas para predição de novos miRNAs/pre-miRNAs
baseado na abordagem de AM Adaboost (Tan et al., 2006). O Adaboost é utilizado tanto no
módulo chamado mirExplorer-genome, que só tem como entrada uma sequência de DNA e
que, portanto, só se baseia em características intrínsecas do pre-miRNA, quando no módulo
chamado mirExplorer-NGS, que utiliza dados de small RNA-Seq (Guan et al., 2011).
Os atributos levados em consideração para a construção do modelo relacionam-se
a características da estrutura secundária do pre-miRNA e do processamento das enzimas
Drosha e Dicer. Para o módulo mirExplorer-NGS, além dessas características, o pre-miRNA
deve ter pelo menos dois reads únicos mapeados ou a frequência total de reads mapeados
deve ser maior que dois. Além disto, a porcentagem de reads mapeados na fita negativa do
pre-miRNA deve ser menor que 10%. As estruturas secundárias dos pre-miRNAs candidatos
são avaliadas com auxílio do software RNAfold.
Os dados de small RNA-Seq fornecidos como entrada são filtrados para remoção de
reads correspondentes a RNAs não codificantes (rRNA e tRNA), mRNAs e miRNAs conhecidos.
Os reads são então mapeados ao genoma de referência e os atributos são avaliados com o
algoritmo Adaboost.
O mirExplorer foi escrito na linguagem de programação Pascal e compilado usando
a plataforma Lazarus IDE, podendo ser utilizado de uma forma independente do tipo de
sistema operacional.

3.3.9 miRDeep-P
MirDeep-P é uma variante do algoritmo mirDeep adaptado para predizer miRNAs/
pre-miRNAs em genomas de plantas (Yang; Li, 2011). Os reads de small RNA-Seq, que devem

310 Introdução ao mundo dos microRNAs

ser fornecidos em formato FASTA, passam inicialmente por filtragem e trimming. Após essa
etapa inicial, o algoritmo Bowtie é utilizado para realizar o alinhamento dos reads a genomas-
referência ou transcriptomas. Os hotspots de reads mapeados em um determinado locus
servem como um ponto de partida para a busca de novos pre-miRNAs. Uma abertura de
janela com tamanho de 250 nt (que pode ser ajustada pelo usuário) é utilizada para extrair
a sequência do pre-miRNA candidato. Para cada pre-miRNA candidato, um possível hairpin
é obtido com o software RNAfold. As características da estrutura secundária do hairpin são
avaliadas pelo algoritmo miRDeep com um sistema de escore específico para plantas.
O miRDeep-P é capaz também de avaliar a expressão diferencial dos novos miRNAs
com base na quantidade de reads que mapeiam no pre-miRNA candidato. O mirDeep-P foi
validado com dados de small RNA-Seq obtidos de Arabidopsis thaliana, arroz e mamoeiro.
O programa foi desenvolvido na linguagem Perl a partir do algoritmo central do miRDeep.

3.3.10 miRDeep2
É uma versão atualizada do algoritmo miRDeep, utilizada para identificação de
miRNAs conhecidos e para predição de novos miRNAs a partir de dados gerados por NGS
(Friedländer et al., 2012). Os arquivos de entrada são em formato FASTA (dados de small
RNA-Seq, genoma de referência e arquivos de miRNAs já conhecidos). Tem como principais
vantagens, com relação ao algoritmo original, uma maior acurácia na predição e melhor
eficiência computacional, permitindo analisar quantidades maiores de dados.
Essa nova versão utiliza o software Bowtie para alinhamento dos reads, utiliza o
RNAfold para avaliação da estrutura secundária de candidatos a pre-miRNA e traz melhorias
na interface gráfica, possibilitando maior interatividade do usuário com os resultados das
análises. O programa é dividido em três módulos. O primeiro trata do processo de filtragem/
trimming dos reads e mapeamento deles ao genoma referência, gerando um arquivo de saída
em formato FASTA com as descrições dos hotspots (coordenadas genômicas). O segundo
refere-se à identificação de pre-miRNAs conhecidos e predição de novos, utilizando como
arquivo de entrada o arquivo de saída do módulo anterior. A sequência de cada pre-miRNA
candidato é extraída do genoma-referência e sua estrutura secundária é avaliada com o
RNAfold. O hairpin é analisado com base nos critérios da formação típica da estrutura
secundária, características do miRNA/miRNA* e formação do loop. Finalmente, no terceiro
módulo é realizada uma análise dos reads mapeados nos precursores selecionados nas
etapas anteriores para produzir uma tabela de contagem.

3.3.11 miREvo
O método miREvo está disponível como programas tanto na versão linha de comando
(CLI) quanto na versão interface gráfica do usuário (GUI). As predições que realiza utilizam
o algoritmo miRDeep2, mas com a devida parametrização para o caso de plantas. Além
disto, implementa modificações que permitam análises com bases evolutivas dos miRNAs.
Foi validado com conjunto de dados de NGS obtidos de D. melanogaster e A. thaliana (Wen
et al., 2012).
O miREvo foi desenvolvido com a finalidade de auxiliar na análise de miRNAs a partir
de dados de small RNA-Seq utilizando uma abordagem por homologia de sequências em
espécies relacionadas, alinhando genomas completos de múltiplas espécies (WGAs – whole
genome alignments). O método emprega o algoritmo Bowtie para o mapeamento de reads.

Predição computacional de microRNAs em genomas 311

 Inicialmente, o miREvo realiza o trimming e a filtragem dos reads: remoção de
adaptadores, remoção de reads idênticos, eliminação de reads que mapeiam em sequências
de mRNAs e RNAs não codificantes de proteína (p. ex.: tRNAs e rRNAs). Após isso, mapeia
os reads filtrados a miRNAs conhecidos e os que não se alinharam a esses são mapeados ao
genoma. Aqueles que tiveram um grande número de matches no genoma são eliminados, pois
provavelmente correspondem a regiões repetidas do genoma. Os outros reads mapeados ao
genoma são utilizados para a delimitação de subsequências que são consideradas potenciais
precursores de miRNAs. Esses candidatos são então avaliados com o miRDeep2, que indicará os
precursores mais prováveis e respectivos miRNAs maduros. Por fim, os WGAs são analisados
para detectar homólogos de miRNAs e medir as distâncias evolucionárias par a par entre
as múltiplas espécies, bem como analisar a divergência de expressão entre elas, caso haja
bibliotecas de small RNA-Seq, também para as outras espécies.

3.3.12 deepBlockAlign
Esse método tem como ponto de partida a formação de aglomerados de reads mapeados
em genomas de referência e não leva em consideração a estrutura secundária do pre-miRNA
candidato (Langenberger et al., 2012). Usando o algoritmo Blockbuster (Langenberger et al.,
2009), os grupos de reads sobrepostos são decompostos em blocos de reads que possuam
posições similares de início e término no genoma. Blocos sobrepostos e proximamente
espaçados formam um grupo de blocos ou locus. O objetivo do deepBlockAlign é estabelecer
uma forma de medir a proximidade entre os grupos de blocos para identificar aqueles que
compartilham características em comum e que, portanto, corresponderiam a RNAs não
codificantes do mesmo tipo. Assim, pode-se distinguir, por exemplo, miRNAs de tRNAs. Para
destacar os grupos de blocos que compartilham características em comum, o deepBlockAlign
realiza um clustering hierárquico.
O processo de clustering é mais uma vertente de AM, chamada de aprendizagem
não-supervisionada, em que se objetiva construir clusters tais que a similaridade entre
elementos de mesmo cluster seja maximizada, enquanto que a similaridade de elementos
de clusters distintos seja minimizada. Para comparar os elementos, emprega-se alguma
medida de proximidade (distância ou similaridade) baseada nos atributos das instâncias
sendo agrupadas. No caso dos grupos de blocos do deepBlockAlign, que são as instâncias a
passarem pelo clustering, os atributos são a expressão relativa dos blocos, a distância entre
blocos e a forma dos blocos, i.e., a distribuição de reads dentro dos blocos, no que concerne
à posição de mapeamento.
O alinhamento de reads ao genoma é realizado pelo algoritmo Segemehl (Hoffmann
et al., 2009; Otto et al., 2014) e o clustering hierárquico, pelo programa pvclust (Suzuki;
Shimodaira, 2006). O deepBlockAlign pode ser utilizado para dados de small RNA-Seq obtidos
de plantas e animais e é implementado na linguagem C.

3.3.13 miRDeep*
É uma extensão do algoritmo miRDeep que implementa diversas abordagens
similares ao miRDeep2, porém desenvolvido por grupos de pesquisa diferentes (An et al.,
2013). Permite arquivos de entrada de NGS no formato BAM, SAM ou FASTQ. A ferramenta
computacional permite o pré-processamento dos dados (filtragem e trimming dos reads);
realiza alinhamentos utilizando o software Bowtie, gerando um arquivo de saída em formato

312 Introdução ao mundo dos microRNAs

SAM; integra algoritmos para recuperação da sequência do precursor candidato a partir do
genoma-referência e avalia diversas características do pre-miRNA, do miRNA, do miRNA* e
da possível estrutura secundária correspondente; e realiza a predição de alvos dos miRNAs
conhecidos identificados ou miRNAs novos preditos, utilizando o algoritmo TargetScan.
A validação dos pre-miRNAs candidatos é feita utilizando-se abordagens semelhantes
às implementadas no miRDeep e miRDeep2. O miRDeep* é implementado na plataforma
Java e pode ser utilizado nos sistemas operacionais Linux, MacOS, Windows e qualquer
outro que tenha suporte a Java.

3.3.14 miRPlant
O miRPlant é um método que se assemelha ao miRDeep e suas variações, sendo
também considerado uma extensão do miRDeep*, mas no qual a predição de novos miRNAs/
pre-miRNAs é baseada em características específicas para plantas, tais como estrutura do
hairpin e a estratégia de identificação da região de sua excisão (An et al., 2014). A principal
vantagem comparado aos métodos da linha miRDeep, além de melhorias na interface gráfica,
é que o miRPlant é altamente recomendado para predição a partir de dados de small RNA-
Seq obtidos de plantas, uma vez que os critérios utilizados na predição são todos baseados
nas características da biogênese de miRNAs de plantas, possibilitando maior acurácia.
Os arquivos de entrada podem ser em formato FASTQ ou FASTA. Resumidamente,
o miRPlant realiza os seguintes passos: filtra os reads com base na qualidade, tamanho e
remove sequências adaptadoras; seleciona os reads e utiliza o software Bowtie para alinhá-
los a um genoma referência, sem permitir mismatches; a região genômica que apresentar
um agrupamento de reads mapeados em forma de hotspot é extraída e avaliada com base
nas características da estrutura secundária, ou seja, no seu potencial para formar hairpin;
e o algoritmo mirDeep é utilizado com a finalidade de determinar um valor de escore para
o pre-miRNA candidato predito.
Para validação do método, foram utilizados 16 conjuntos de dados de small RNA-Seq
provenientes de A. thaliana, Medicago truncatula e Prunus persica, demonstrando uma
acurácia 10% superior ao software miRDeep-P. O miRPlant é uma plataforma integrada escrita
em Java que pode ser utilizada em sistemas operacionais Unix/Linux, MacOS X e Windows.

3.3.15 miRdentify
O miRdentify implementa um pipeline de análise de dados de small RNA-Seq para
predição de miRNAs/pre-miRNAs em humanos, animais, nematoides e moscas-das-frutas
(Hansen et al., 2014). Inicialmente, os reads passam por filtragem e trimming através do
algoritmo fa2tab, implementado no próprio miRdentify. Em seguida, os reads são mapeados
no genoma referência usando-se o software Bowtie. Após isso, as sequências genômicas
contendo os hotspots de reads mapeados são extraídas com uma abertura de janela de 46
a 80 nucleotídeos (valor ajustável pelo usuário). As características da estrutura secundária
desses candidatos são então avaliadas utilizando-se o software MultiRNAFold v1.1 (Andronescu
et al., 2005).
Após análise da estrutura secundária das sequências candidatas a pre-miRNAs,
apenas aquelas que apresentarem MFE < -14 e características para identificação de miRNAs
e respectivos miRNAs* são mantidas como pre-miRNAs promissores. Em seguida, esses
pre-miRNAs candidatos são novamente avaliados com base nas características dos miRNA,

Predição computacional de microRNAs em genomas 313

 miRNA* e das suas sequências, características da estrutura do pre-miRNA, entre outros
parâmetros, atribuindo-se um valor de escore a cada um dos candidatos.
Para treinamento do método, um conjunto de dados foi criado utilizando dados de
miRNAs já conhecidos e recuperados a partir do miRBase. Dessa forma, os valores de escore
atribuídos aos pre-miRNAs candidatos são comparados aos valores de escore dos pre-miRNAs
já conhecidos. Quando os pre-miRNAs candidatos têm escore semelhante aos já conhecidos,
os primeiros são considerados como verdadeiros. A ferramenta computacional foi validada
com dados obtidos de humanos e testada com dados obtidos de ratos, moscas-das-frutas e
nematoides, sugerindo que pode ser utilizada para animais, de modo geral.

Tabela 4. Métodos de predição de miRNAs/pre-miRNAs baseados em sequenciamento de nova geração. A

saída +/- é para indicar que a ferramenta computacional realiza uma classificação binária, respondendo
meramente se o candidato a pre-miRNA dado como entrada é verdadeiro ou falso.

Principal
Método Organismo Tipo de saída Referência URL**
entrada*
miRCat Animais/ Reads/Genoma pre-miRNA/ Moxon et al. srna-workbench.cmp.uea.
Plantas miRNA (2008) ac.uk
miRDeep Animais Reads/Genoma/ pre-miRNA/ Friedländer www.mdc-berlin.
Banco de dados miRNA et al. (2008) de/8551903/en
de miRNAs
miRExpress Animais/ Reads pre-miRNA/ Wang et al. mirexpress.mbc.nctu.edu.tw
Plantas miRNA/Nível de (2009)
expressão
mirTRAP Animais Reads/Genoma pre-miRNA/ Hendrix et flybuzz.berkeley.edu/
miRNA al. (2010) miRTRAP
MIReNA Animais/ Candidato a pre-miRNA/ Mathelier; www.lgm.upmc.fr/mirena/
Plantas pre-miRNA/ miRNA/+/- Carbone index.html
Reads/ (2010)
Sequência de
DNA
miRanalyzer Animais Reads/Genoma pre-miRNA/ Hackenberg; bioinfo5.ugr.es/miRanalyzer/
miRNA/Nível de Rodríguez- miRanalyzer.php
expressão Ezpeleta;
Aransay
(2011)
mirExplorer Animais/ Reads/Genoma premiRNA/ Guan et al. biocenter.sysu.edu.cn/mir
Plantas miRNA (2011)
miRDeep-P Plantas Reads/Genoma pre-miRNA/ Yang; Li www.australianprostate
miRNA/Nível de (2011) centre.org/research/
expressão software/mirdeep-star
miRDeep2 Animais Reads/Genoma/ pre-miRNA/ Friedländer www.mdc-berlin.
Banco de dados miRNA/Nível de et al. (2012) de/8551903/en
de miRNAs expressão
miREvo Animais/ Reads/Genoma pre-miRNA/ Wen et al. evolution.sysu.edu.cn/
Plantas miRNA/Nível de (2012) software/mirevo.htm
expressão
deepBlockAlign Animais/ Reads/Genoma pre-miRNA/ Langenberger rth.dk/resources/dba/
Plantas miRNA et al. (2012) download.php

miRDeep* Animais Reads/Genoma pre-miRNA/ An et al. www.

miRNA/Nível de (2013) australianprostatecentre.
expressão/Alvo org/research/software/
mirdeep-star
miRPlant Plantas Reads/Genoma pre-miRNA/ An et al. www.
miRNA (2014) australianprostatecentre.org/
research/software/mirplant
miRdentify Animais Reads/Genoma pre-miRNA/ Hansen et al. www.ncrnalab.
miRNA (2014) dk/#mirdentify/mirdentify.
php
* Sequência de DNA: Contig, scaffold ou qualquer fragmento de DNA; **Os sítios indicados foram acessados em junho
de 2015.

314 Introdução ao mundo dos microRNAs

 Com o intuito de facilitar a escolha da ferramenta computacional de predição de
miRNAs, a figura 2 apresenta, de forma resumida, todas as ferramentas descritas neste capítulo.
Ao visualizar essa figura, pode-se escolher a ferramenta que atenda a objetivos específicos,
consoantes aos tipos de dados de entrada e saída desejados, levando em consideração os
diferentes reinos (Animalia, Plantae e Virus).

4. Considerações finais e perspectivas

É importante ressaltar que embora os métodos até agora propostos para predição de
miRNAs tenham trazido grande contribuição para a sua localização nos genomas de interesse,
há ainda significativas limitações nos diversos procedimentos. Por exemplo, no caso de métodos
não comparativos que utilizam AM, mesmo proporcionando uma alta sensibilidade, ou seja,
sendo capazes de detectar a vasta maioria dos miRNAs (e/ou seus precursores), pelo menos nos
conjuntos de dados que são utilizados para teste, os métodos identificam, da mesma forma,
um alto número de falsos-positivos, isto é, apresentam precisão baixa. A questão da baixa
precisão é um problema para a validação experimental, uma vez que o objetivo da aplicação
de ferramentas computacionais é exatamente prover candidatos com alta probabilidade de
serem verdadeiros-positivos para que a necessidade de validação laboratorial, com os custos
e tempo envolvidos, seja minimizada. Parte dessa limitação, e que também afeta os métodos

Figura 2. Ferramentas computacionais de predição de miRNAs. As ferramentas para os diferentes grupos taxonômicos
estão indicadas pelas letras: A (animais); P (plantas); AP (animais e plantas); V (vírus); APV (animais, plantas e vírus).
Os tipos de dados de saída correspondem aos números: 1 - Sequência (e muitas vezes a estrutura secundária) dos
precursores de miRNAs; 2 - Sequência dos miRNAs maduros; 3 - Nível de expressão; 4 - Alvos putativos; 5 - Classificação
(positivo ou negativo) de pre-miRNAs candidatos.

Predição computacional de microRNAs em genomas 315

 comparativos, se deve à qualidade das informações presentes nos bancos de dados disponíveis.
Muitos dos miRNAs (ou precursores) anotados são falsos-positivos. Isso impacta diretamente
na qualidade dos modelos de predição, especialmente os modelos das abordagens baseadas
em AM, que utilizam tais informações para a montagem de um conjunto de treinamento.
Note-se que apesar dos significativos avanços nos estudos para caracterização de miRNAs, a
biogênese dessas moléculas ainda não é completamente compreendida e sua complexidade
não permite extrapolar as regras para todos os organismos. Por exemplo, entre plantas e
animais já se sabe que há diferenças tanto na biogênese quanto na regulação dos alvos.
Mesmo para espécies próximas é arriscado considerar que o processamento de pri-miRNAs
e os mecanismos de regulação dos miRNAs sejam os mesmos.
Ainda sobre a construção de conjuntos de treinamento para os algoritmos baseados
em AM, a definição de exemplos negativos adequados para tal também é uma questão que
precisa ser mais bem trabalhada em propostas futuras. Se validar experimentalmente um
candidato a miRNA já é uma tarefa complicada, validar um candidato como não miRNA
é ainda mais complexo. Dessa forma, frequentemente utilizam-se outros tipos de RNAs
como exemplos negativos para contrastar com os positivos nos conjuntos de treinamento.
O que ocorre é que esses exemplos negativos muitas vezes têm estruturas bem diferentes
dos miRNAs e, dessa forma, o modelo gerado não será capaz de identificar como negativas
sequências que não são miRNAs, mas que possuem estrutura semelhante a essas. Por isto,
a determinação de um conjunto de exemplos negativos de qualidade pode também trazer
grande benefício na performance dos métodos.
É necessário, ainda, que dados de benchmarking sejam definidos para facilitar a
avaliação das ferramentas tanto individualmente quanto no processo de comparação com
as demais abordagens. As tabelas aqui mostradas, por exemplo, não incluem a performance
das ferramentas computacionais exatamente porque os números fornecidos em cada artigo
respectivo não fazem sentido quando colocados juntos na comparação dos vários métodos
disponíveis. Isso se dá porque cada trabalho utiliza um conjunto de dados diferente para
realizar sua avaliação. Além disso, diferentes métricas para avaliação são utilizadas em cada
artigo, o que também coloca empecilhos às comparações. Portanto, as métricas para apreciar
os métodos também precisam de padronização para facilitar o processo de benchmarking.
Outro ponto em aberto com respeito à caracterização de miRNAs, num espectro mais
amplo, é a necessidade de relacionar os miRNAs identificados com as respectivas funções.
Essa é uma importante lacuna que precisa ser preenchida por novos algoritmos.
É necessário enfatizar que as categorias descritas no presente texto são complementares.
Métodos comparativos facilitam a identificação de miRNAs já previamente conhecidos em
espécies evolutivamente próximas e ajudam na definição da função celular atrelada, caso já
seja conhecida na espécie-referência. Por outro lado, os métodos não comparativos, que se
utilizam de características próprias de miRNAs (ou de precursores) para realizar a predição,
proveem a possibilidade de detectar miRNAs espécie-específicos. Adicionalmente, os métodos
que utilizam dados de NGS alavancam ainda mais a sensibilidade, podendo fornecer, ademais,
o perfil do nível de expressão de miRNAs. Portanto, quando possível, a utilização de métodos
das três categorias, de maneira complementar, é recomendada.
A pesar dos vários desafios atinentes à caracterização de miRNAs que há pela frente,
muito já se conquistou com os métodos propostos até o momento, tanto no que concerne
à identificação quanto no que se refere à definição das funções celulares, resultando em
bancos de dados que concentram importante conhecimento biotecnológico. Essas informações
possibilitam potenciais pesquisas que podem culminar em avanços como, por exemplo, o

316 Introdução ao mundo dos microRNAs

controle de doenças severas que sabidamente têm suas causas relacionadas ao funcionamento
anormal de certos miRNAs. Sem mencionar as potencialidades na área do agronegócio, no
que se refere a maximizar a produção agrícola.
Novos avanços no campo experimental trarão melhorias no campo computacional
que, por sua vez, proporcionarão adicionais progressos aos métodos laboratoriais, num ciclo
promissor que produzirá nos próximos anos um crescimento significativo no conhecimento
de diversas atividades celulares importantes que ainda necessitam de elucidação numa
variedade de organismos de interesse.
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Novas fronteiras Capítulo
em miRNAs 17

Dr.a Amanda Freire de Assis1 , Beatriz Alves Guerra2, Emilio Tarcitano2,

Dr.a Ernna Hérida Domingues de Oliveira1, Prof. Dr. Marcelo A. Mori2,
Silas Pinto da Silva2 e Prof. Dr. Tiago Campos Pereira3

(listados em ordem alfabética)

1
Depto. de Genética, FMRP - USP, Ribeirão Preto - SP
2
Depto. de Biofísica, Universidade Federal de São Paulo - SP
3
Depto. de Biologia, FFCLRP - USP, Ribeirão Preto - SP

Estruturação do capítulo
Seção 1. RNAs endógenos competidores: esponjas naturais de miRNAs
Dr.a Amanda Freire de Assis e Dr.a Ernna Hérida Domingues de Oliveira
1.1 Introdução
1.2 Considerações moleculares para as interações entre ceRNAs
1.3 Identificação de ceRNAs
1.4 RNAs circulares: uma nova e curiosa classe de ceRNAs
Seção 2. miRNAs circulantes
Prof. Dr. Marcelo A. Mori, Emilio Tarcitano, Silas Pinto da Silva e Beatriz Alves Guerra
2.1 Introdução
2.2 miRNAs circulantes em humanos
2.3 Transporte intertecidual de miRNAs
2.4 Presença de miRNAs em fluidos corporais
2.5 Papel biológico de miRNAs circulantes
2.6 Perspectivas
Seção 3. miPEPs: peptídeos codificados por pri-miRNAs
Prof. Dr. Tiago Campos Pereira
3.1 miPEPs
3.2 Perspectivas

Novas fronteiras em miRNAs 321

 RNAs endógenos competidores: esponjas naturais de miRNAs

1.1 Introdução
Uma das técnicas utilizadas para se estudar a função de miRNAs é conhecida como
esponjas artificiais de miRNAs (vistas no capítulo 14). Em síntese, essas são moléculas sintéticas
de RNA contendo elementos responsivos a miRNAs (MREs – do inglês microRNA response
elements), i.e., sítios aos quais os miRNAs se ligam (figura 1). Assim, ao sequestrá-los, é
possível correlacionar o fenótipo gerado na célula ao papel biológico do miRNA. Geralmente
esponjas artificiais apresentam MREs específicos para um determinado miRNA.
RNAs endógenos competidores (ceRNAs – do inglês competing endogenous RNAs) são
transcritos naturais de genes codificadores e não codificadores de proteínas que atuam como
esponjas endógenas de miRNAs (endogenous miRNA sponges) (figura 1). Os ceRNAs possuem
MREs e, portanto, podem competitivamente se ligar a microRNAs, sequestrando-os de seus
mRNAs-alvo primários. Contudo, diferentemente das esponjas artificiais, os ceRNAs contêm
MREs para uma combinação de diferentes microRNAs. Dessa forma, os ceRNAs atuam na
regulação da expressão gênica pois impedem a ação repressora dos microRNAs sobre seus
alvos através de uma diminuição da disponibilidade de miRNAs no citoplasma (Seitz, 2009;
Poliseno et al., 2010; Salmena et al., 2011; Tay et al., 2011).
Um dos primeiros exemplos de ceRNA foi descrito em plantas por Franco-Zorrila e
colaboradores (2007). Em seu estudo com Arabidopsis thaliana, os autores demonstraram que
o RNA não codificador IPS1 (Induced by Phosphate Starvation 1) possui um efeito sequestrador
efetivo sobre o miR-399 por mimetizar o MRE de seu mRNA-alvo PHO2 (Putative Ubiquitin-
conjugating Enzyme E2 24), um mecanismo que foi chamado de target mimicry.
Em 2011, foi levantada a hipótese de que haveria uma rede de interação entre os
ceRNAs, na qual eles estariam se comunicando e corregulando seus níveis citoplasmáticos
através da competição por um conjunto limitado de miRNAs (Salmena et al., 2011). Ou seja,
todos os transcritos que contivessem MREs comuns poderiam se comunicar e regular uns
aos outros, competindo especificamente por miRNAs compartilhados (figura 1).

Figura 1. RNAs endógenos competidores (ceRNAs). Pseudogenes, long non-coding RNAs (lncRNAs), RNAs circulares
(circRNAs) e outros mRNAs podem atuar como ceRNAs e sequestrar os miRNAs de seus mRNAs-alvo. ORF: Quadro aberto
de leitura (open reading frame) AAAA: cauda poli-A.

322 Introdução ao mundo dos microRNAs

 Estudos recentes forneceram suporte experimental para essa hipótese. Por exemplo,
o trabalho de Policeno e colaboradores (2010) demonstrou que o pseudogene PTENP1 possui
regiões de MREs perfeitamente conservadas para o mesmo conjunto de microRNAs que
interagem com seu gene ancestral PTEN e que de fato, no meio intracelular, PTENP1 e PTEN,
estão sujeitos à mesma regulação pós-transcricional mediada pelo mesmo conjunto de miRNAs.
Nesse contexto outros estudos extrapolaram essas análises e as evidências experimentais
mostraram que várias classes de RNAs atuam como ceRNAs, inclusive RNAs não codificadores
como: (i) RNAs não codificadores longos (Poliseno et al., 2010; Cesana et al., 2011; Wang et al.,
2010; Fan et al., 2013; Kallen et al., 2013; Wang et al., 2013); (ii) transcritos de pseudogenes
(Poliseno et al., 2010; Marques et al., 2012; Johnsson et al., 2013), bem como (iii) mRNAs
(Tay et al., 2011; Karreth et al., 2011; Sumazin et al., 2011; Lee et al., 2009; Jeyapalan et al.,
2011; Kumar et al., 2013). Esse envolvimento dos mRNAs na rede de ceRNAs traz à tona a
possibilidade de que os mRNAs estejam também envolvidos em uma variedade de funções
“não codificadoras” (Ala et al., 2013).
De maneira geral, esses estudos sugerem que as 3’ UTRs de RNAs não codificadores e
codificadores de proteínas exercem uma atividade biológica poderosa através da sua habilidade
em agir como esponjas endógenas de microRNAs. Contudo, os ceRNAs não codificadores
seriam inibidores mais eficazes, pois estariam dedicados exclusivamente à interação com
os microRNAs, sem qualquer interferência da atividade de tradução. Por fim, as 3’ UTRs
dos genes codificadores de proteínas, além de atuarem como elementos cis reguladores que
alteram a estabilidade de seus próprios transcritos, agiriam também como elementos trans
reguladores na modulação da expressão de outros genes (Salmena et al., 2011).

1.2 Considerações moleculares para as interações entre ceRNAs

Embora tenham sido descritos muitos exemplos de interações entre ceRNAs, pouco se
sabe sobre as condições moleculares necessárias para a atividade dos ceRNAs. Fatores como
a abundância de microRNAs e dos ceRNAs, a localização subcelular, o número de miRNAs
e MREs compartilhados assim como a afinidade entre o miRNA-ceRNA podem modular
a eficiência da rede de interações entre ceRNAs (Ebert; Sharp, 2010; Salmena et al., 2011;
Mukherji et al., 2011; Wee et al., 2012; Tay et al., 2014).
Estudos recentes utilizando modelos matemáticos ajudaram a aperfeiçoar a dinâmica
das interações entre ceRNAs. Condições ótimas para a atividade dos ceRNAs in silico foram
determinadas e essas foram confirmadas experimentalmente usando-se o PTEN e o seu
ceRNA VAPA. Os estudos apontaram que os níveis de expressão dos diferentes componentes
da rede de interação (ceRNAs e miRNAs) influenciam na regulação cruzada e que uma
regulação ótima é adquirida em concentrações equimolares dos ceRNAs e miRNAs. Além
disso, observou-se que a perturbação de qualquer um dos componentes da rede afeta a
mesma como um todo, pois existiria um mecanismo de titulação que calcula a taxa de
transcrição, degradação, associação e dissociação dos diferentes RNAs (Ala et al., 2013).
Figliuzzi e colaboradores (2013) também postularam que a abundância relativa dos ceRNAs
e miRNAs, sua estequiometria e o número de MREs compartilhados e interações indiretas
são determinantes cruciais da corregulação entre ceRNAs.

1.3 Identificação de ceRNAs

A interação entre os ceRNAs de uma rede depende das MREs localizadas em cada
transcrito (Salmena et al., 2011). Portanto, a predição dessa interação está sujeita à identificação

Novas fronteiras em miRNAs 323

 dos MREs nos transcritos de interesse. Vários algoritmos de predição de interações miRNA/
RNA-alvo, inclusive TargetScan, miRanda, rna22 e PITA, têm sido usados com sucesso (Tay
et al., 2014; Kartha; Subramanian, 2014). Porém, a predição de alvos de miRNAs é uma
tarefa desafiadora visto que os critérios de identificação ainda estão evoluindo (Bartel,
2009). Tay e colaboradores (2011) desenvolveram uma abordagem denominada MuTaMe
(mutually targeted MRE enrichment), que envolve análise computacional integrada à validação
experimental. Usando o algoritmo de predição de alvos do Rna22 (Miranda et al., 2006) os
autores geraram o MuTaMe scores para mRNAs humanos. O programa avalia um ceRNA
em potencial através do número de miRNAs compartilhados pelos transcritos de interesse,
o número de MREs preditos em um transcrito para um miRNA em particular, a distribuição
das MREs de um miRNA em particular no transcrito e a razão entre o número total de MREs
preditos em um transcrito com o número total de miRNAs que reconhecem esses MREs.
Outro método matemático desenvolvido foi o algoritmo HERMES, o qual utiliza análise
multivariada para avaliar o alcance e o potencial tumorigênico de interações regulatórias
mediadas por miRNAs (Sumazin et al., 2011). Hermes usa uma vasta coleção de perfis de
expressão de mRNAs e miRNAs obtidos das mesmas amostras tumorais para identificar
atividade moduladora de miRNAs.
Um banco de dados de interações preditas entre ceRNAs (ceRDB – do inglês competing
endogenous RNA database) foi desenvolvido para auxiliar na identificação de ceRNAs para
um dado mRNA. O programa examina a co-ocorrência de MREs na 3’ UTR de mRNAs com
base no genoma total. A predição das interações miRNA-mRNA são obtidas do TargetScan
e os scores de interação são definidos para cada mRNA adicionando-se o número total de
MREs que se sobrepõem com o miRNA para o mRNA de interesse. Esses scores são então
utilizados para ranquear a predição dos ceRNAs em potencial (Sarver; Subramanian, 2012).
Uma alternativa para as estratégias de predição in silico são as técnicas bioquímicas
de alta capacidade, as quais identificam interações endógenas entre miRNAs e seus alvos.
Exemplos desses métodos envolvem HITS-CLIP (high-throughput sequencing of RNA isolated
by crosslinking immunoprecipitation) e PAR-CLIP (photoactivatable-ribonucleoside-enhanced
crosslinking and immunoprecipitation), a qual é uma modificação da metodologia HITS-CLIP
com um aperfeiçoamento na recuperação do RNA (Tay et al., 2014). Ambas as tecnologias
usam o sequenciamento em larga escala das moléculas de RNA que foram imunoprecipitadas
com uma proteína de interesse (vide capítulo 13).

1.4 RNAs circulares: uma nova e curiosa classe de ceRNAs

Uma classe adicional de ceRNA foi recentemente identificada, sendo denominada
de RNAs circulares (circRNAs, do inglês circular RNAs) (Hansen et al., 2011; 2013; Memczak
et al., 2013). Embora os pesquisadores já tivessem conhecimento prévio da existência de
transcritos circulares há pelo menos vinte anos (Nigro et al., 1991), essas moléculas por
muito tempo foram consideradas como artefatos provenientes do processamento de RNA
(Cocquerelle et al., 1993), ou agentes patológicos como o vírus da hepatite (Kos et al., 1986)
e alguns viroides de plantas (Sanger et al., 1976). Apenas recentemente os circRNAs foram
adicionados à crescente lista de RNAs não codificantes (ncRNAs) e atualmente os circRNAs
têm despertado grande atenção na comunidade científica por dois principais motivos.
O primeiro deles refere-se às evidências de que uma grande quantidade de circRNAs
endógenos são expressos nas mais diversas espécies, dentre elas mamíferos, nematoides,
drosófila, plantas, leveduras e protistas, sendo a maioria abundante e estável. Além disso,

324 Introdução ao mundo dos microRNAs

alguns circRNAs revelaram-se conservados entre diferentes espécies (Memczak et al., 2013;
Jeck; Sharpless, 2014; Salzman et al., 2013; Wang et al., 2014). Um estudo recente estima que
haja mais de 25 mil circRNAs diferentes em células humanas, derivados de mais de 14% de
genes transcritos em fibroblastos (Jeck et al., 2013).
O segundo motivo refere-se às principais funções propostas para os circRNAs: (i)
regulação do processamento alternativo de RNAs (Ashwal-Fluss et al., 2014; Zhang et al.,
2014), (ii) regulação da transcrição (Chao et al., 1998), (iii) interação com proteínas que se
ligam a RNA e interação com complexos ribonucleoproteicos (Rameo et al., 1998; Hentze;
Preiss 2013) e (iv) esponjas de miRNAs (Hansen et al., 2013; Memczak et al., 2013).
A maioria dos circRNAs de organismos eucariotos é produzida durante o processo de
recomposição do RNA (splicing), podendo ser originados a partir de éxons (denominados,
portanto, de circRNAs exônicos) ou de íntrons (circRNAs intrônicos). Ambos (exônicos e
intrônicos) podem ser produzidos pela ligação direta da extremidade 5’ com a 3’ de RNAs
lineares; ou através de um processo denominado de backsplicing, mediado pela maquinaria
de recomposição (spliceosome), onde ocorre a junção da região 3’ de um éxon a jusante
(downstream) de um determinado gene com a região 5’ de um éxon a montante (upstream)
desse mesmo gene (Jeck et al., 2014). Dessa forma, os circRNAs podem compreender um
único éxon ou múltiplos éxons.
Os circRNAs são distintos dos RNAs lineares porque eles são desprovidos das estruturas
terminais (i.e., 5’ CAP ou a cauda poli-A) que frequentemente determinam a estabilidade do
transcrito. Por outro lado, a ausência de extremidades livres no circRNA os torna resistentes
a ataques de exorribonucleases, portanto mais estáveis e duradouros que os demais RNAs
lineares (Vicens et al., 2014).
A diversidade, abundância e conservação dos circRNAs sugerem fortemente que
essas moléculas exerçam funções biológicas importantes. Com base nessas informações,
estudos detalhados demonstraram que, em mamíferos, dois circRNAs atuam como RNAs
endógenos competidores: os circRNAs exônicos CDR1as e Sry, que se ligam a miRNAs sem
degradá-los (Hansen et al., 2013; Memczak et al., 2013; Ebert et al., 2007; Franco-Zorrilla et
al., 2007; Poliseno et al., 2010).
O circRNA CDR1as origina-se do processamento do transcrito antissenso do gene CDR1,
que codifica uma proteína relacionada à degeneração cerebral. CDR1as contém mais de 70
MREs para o miR-7, e associam-se com proteínas Argonautas. Uma vez que eles sequestram o
miR-7, ocorre a supressão da atividade desse miRNA no cérebro de camundongos, acarretando
o aumento dos níveis de expressão do alvo do miR-7 (Hansen et al., 2013; Memczak et al., 2013).
Além disso, a expressão ectópica de CDR1as na espécie-modelo zebrafish (o peixe
paulistinha), que naturalmente produz miR-7 mas não CDR1, afetou o desenvolvimento
cerebral de embriões, recapitulando o fenótipo associado à perda de função do miR-7. Nesse
trabalho, os autores sugeriram que circRNAs podem atuar também em funções neuronais
e desordens neurológicas (Hansen et al., 2013; Memczak et al., 2013).
Similarmente, o circRNA Sry, altamente expresso em testículos murinos, é oriundo
do gene Sry (determinante do sexo no cromossomo Y) e contém 16 sítios de ligação para
o miR-138. Um estudo recente revelou que esse cicRNA SRY atua sequestrando o miR-138,
sugerindo-se que esse sequestro poderia favorecer o aumento da expressão dos possíveis
RNA-alvo desse miRNA (Hansen et al., 2013).
Baseados em todas essas evidências apresentadas, os circRNAs têm mudado a visão
da comunidade científica acerca da regulação pós-transcricional, levando a um novo nível

Novas fronteiras em miRNAs 325

 de complexidade fascinante. Entretanto, há muito ainda a ser descoberto sobre os circRNAs
e suas funções, antes e depois de se tornarem um RNA circular.

miRNAs circulantes

2.1 Introdução
Em meados da década de 1990, estudos conduzidos por Craig Mello e Andrew Fire
utilizando o nematoide Caenorhabditis elegans identificaram um mecanismo sem precedentes
de silenciamento gênico mediado por RNA de dupla fita, o que mais tarde foi denominado
interferência por RNA (RNAi) (Fire et al., 1998). Mello e Fire demonstraram que a injeção
de RNA de dupla fita no espaço extracelular do verme resultava em silenciamento sistêmico
do gene alvo de sequência complementar ao RNA injetado. Em poucos anos, as proteínas
que participavam desse processo foram identificadas e homólogos foram observados em
várias espécies, inclusive humanos. Como era de se esperar, consistente com a conservação
evolutiva de um mecanismo intrincado de silenciamento gênico por RNA de dupla fita, uma
via de RNAi endógena foi descoberta em praticamente todos os metazoários, tendo os miRNAs
como seu agente principal (Lagos-Quintana et al., 2001; Lau et al., 2001; Lee; Ambros, 2001).
Mais tarde, a partir da segunda metade dos anos 2000, com a observação recorrente
da presença de RNAs na circulação e em outros fluidos biológicos humanos (El-Hefnawy et
al., 2004; Fleischhacker; Schmidt, 2007), uma pergunta fundamental tornou-se cada vez mais
óbvia: estariam miRNAs sendo secretados ativamente por células humanas para agir em
tecidos distais e controlar a expressão gênica de uma maneira endócrina? Essa hipótese foi
em parte baseada nos experimentos de prova de princípio em C. elegans, cujo silenciamento
gênico sistêmico por RNA de dupla fita se mostrou dependente de uma proteína conservada
evolutivamente denominada SID-1 (Winston et al., 2002; Feinberg; Hunter, 2003), ou em
experimentos em plantas, onde a compreensão sobre pequenos RNAs como moléculas
sinalizadoras já era conhecida (Yoo et al., 2004). Além disso, estudos com RNAs sintéticos
em camundongos ajudaram a elucidar mecanismos de transporte de RNAs circulantes em
mamíferos. Foi visto que a ligação covalente de moléculas lipofílicas, como colesterol, ácidos
graxos ou ácidos biliares, à RNA de fita simples ou de dupla fita pequenos (antagomirs
ou siRNAs), favorecia a estabilidade e a captação dessas espécies por células receptoras
de camundongos, além de ajudar a promover o silenciamento gênico sistêmico mediado
pelas mesmas (Krutzfeldt et al., 2005; Wolfrum et al., 2007). Interessantemente, a captação
pelas células de camundongos dos RNAs modificados parecia depender da interação dessas
moléculas com lipoproteínas, receptores de lipoproteínas e transportadores de membrana,
como a proteína homóloga à SID-1 de C. elegans (Wolfrum et al., 2007). Dessa forma, assim
como inferido em C. elegans quando a via de interferência por RNA foi descoberta, a prova
de que o transporte de espécies de RNA exógenos e o silenciamento mediado pelas mesmas
aconteciam em mamíferos por meio de uma via conservada abriu pressuposto para a busca
de moléculas endógenas que atuavam da mesma maneira em humanos.

2.2 miRNAs circulantes em humanos

Essa hipótese começou a ser testada em 2007, por Valadi e colaboradores, que mostraram
a presença de mRNAs e miRNAs em exossomos secretados por mastócitos humanos e murinos
(Valadi et al, 2007). Os autores ainda demonstraram que essas espécies de RNA poderiam

326 Introdução ao mundo dos microRNAs

ser transferidas de uma célula secretora para uma célula receptora por meio de vesículas
exossomais carreadoras. Mais tarde, exossomos e outras vesículas contendo miRNAs foram
encontradas na circulação de mamíferos, inclusive humanos, e foi demonstrado que esses
miRNAs podiam silenciar genes em células receptoras (Skog et al., 2008; Zernecke et al.,
2009). Além de vesículas, miRNAs foram encontrados na circulação em complexos proteicos,
inclusive lipoproteínas (Vickers et al., 2011) ou Argonauta 2 (Arroyo et al., 2011). Dado o
perfil característico desses miRNAs circulantes e a correlação desse perfil com algumas
patologias humanas, principalmente o câncer, foi proposta a quantificação desses miRNAs
para o diagnóstico de doenças (Chim et al., 2008; Gilad et al., 2008) (mais informações no
capítulo 11).
Apesar da literatura ainda escassa sobre o tema, o que se deve em parte à recente
descoberta do fenômeno e a sua aparente complexidade, o estudo de miRNAs circulantes
tem um potencial enorme para elucidar a coordenação intertecidual da expressão gênica em
organismos multicelulares. É atraente hipotetizar que algumas células do organismo, mesmo
em situações fisiológicas, poderiam secretar vesículas ou complexos ribonucleoproteicos
contendo miRNAs para controlar a expressão gênica de células distais. Assim como no sistema
neuro-endócrino canônico, que envolve hormônios proteicos e esteroides, essa sinalização
intertecidual estaria envolvida com a homeostase metabólica do organismo, mediando a
resposta do mesmo a alterações ambientais.
A confirmação de tal hipótese, no entanto, é condicional ao entendimento de fenômenos
que ainda permanecem elusivos, como a determinação do real papel fisiopatológico dos
miRNAs circulantes, dos mecanismos de secreção e captação desses miRNAs, dos processos
que controlam a formação dos complexos vesiculares ou ribonucleoproteicos contendo
miRNAs, das células que os secretam, dentre outros. Nesta seção, apresentaremos o status
quo sobre miRNAs circulantes e deixaremos algumas perguntas em aberto para experimentos
que se sucederão nessa nova área promissora do conhecimento.

2.3 Transporte intertecidual de miRNAs

MiRNAs podem ser transportados na circulação de mamíferos por meio de um grupo
diversificado de estruturas que incluem vesículas lipídicas (exossomos, microvesículas,
shedding vesicles ou corpos apoptóticos), lipoproteínas (Low-Density Lipoprotein – LDL ou
High-Density Lipoprotein – HDL) e complexos ribonucleoproteicos (ligados a Argonauta 2
ou Nucleofosmina 1). Há também transporte intercelular de miRNAs por meio de junções
comunicantes (gap junctions).
Exossomos são vesículas de 40-100 nm derivadas da fusão de endossomos multivesiculares
com a membrana plasmática (Thery et al., 2002; Kosaka et al., 2010; Mause; Weber 2010;
Ohshima et al., 2010; Thery, 2011). Endossomos primários são fundidos em multivesículas
endossomais, onde há maturação e rearranjo vesicular seguidos de sinalização para fusão
com lisossomos ou, no caso dos exossomos, com a membrana plasmática. Essa sinalização
de exocitose ainda é pouco conhecida mas parece envolver Rab35, uma Rab GTPase (Hsu et
al., 2010) e ceramida, cuja biossíntese é regulada pela esfingomielinase neutra 2 (nSMase2)
(Trajkovic et al., 2008; Kosaka et al., 2010). Todas as células eucarióticas parecem manter
a capacidade de secretar exossomos, mas essa função foi mais caracterizada em células
tumorais, inflamatórias, epiteliais, neuronais e de origem mesenquimal, inclusive células
musculares e adipócitos, de mamíferos (Valadi et al., 2007; Skog et al., 2008; Rosell et al.,
2009; Vrijsen et al., 2010; Kuwabara et al., 2011; Lachenal et al., 2011; Vickers; Remaley,

Novas fronteiras em miRNAs 327

 2012; Ferrante et al., 2015). Esses exossomos secretados aparecem na circulação e em outros
fluidos biológicos (veja mais informações adiante) e são bastante estáveis, já que a presença
da bicamada lipídica confere resistência à degradação do conteúdo exossomal, por exemplo,
contra RNases (Thery et al., 2002; Cocucci et al., 2009; Kahlert; Kalluri, 2013; Schneider;
Simons, 2013; Melo et al., 2014).
Exossomos podem carregar, além de miRNAs, proteínas e mRNAs que podem ser
traduzidos nas células receptoras (Valadi et al., 2007). Esse conteúdo exossomal não parece
ser organizado de forma aleatória, já que estudos identificaram uma assinatura exossomal
diferente da observada na célula de origem, fortalecendo a hipótese de que células exportam
moléculas seletivas via exossomos (Valadi et al., 2007; Wang et al., 2010). Essas observações
ainda são corroboradas por estudos que mostram o enriquecimento de miRNAs oncogênicos
em exossomos oriundos de células cancerígenas (Ohshima et al., 2010; Pigati et al., 2010;
Melo et al., 2014). Interessantemente, exossomos derivados de células de câncer de mama
têm a capacidade de sintetizar miRNAs maduros por carregar pre-miRNAs e a maquinaria
necessária para processá-los (Melo et al., 2014).
Além dos exossomos, vesículas extracelulares derivadas da evaginação da membrana
plasmática, também conhecidas como microvesículas ou shedding vesicles, transportam
miRNAs em fluidos biológicos (Chen et al., 2012). Os corpos apoptóticos, outra classe de
microvesículas, são liberados por células durante o processo de apoptose, e também carregam
miRNAs (Zernecke et al., 2009). As diferenças entre exossomos e microvesículas estão
principalmente relacionadas ao tamanho (40-100 nm versus 100-1000 nm, respectivamente)
e à biogênese dessas vesículas extracelulares (exocitose de endossomos multivesiculares
versus evaginação da membrana plasmática, respectivamente) (Raposo; Stoorvogel 2013).
No entanto, considerando a presença de ambos os tipos de carreadores em fluidos biológicos
e devido à limitação da maioria dos métodos atuais para o isolamento e diferenciação dos
tipos de vesículas extracelulares, em muitos estudos não é possível discriminar a proporção
de exossomos e microvesículas, o que dificulta o discernimento dos seus conteúdos, dos seus
mecanismos de controle de secreção e de suas funções (Raposo; Stoorvogel 2013). Apesar
disso, cada uma das classes de vesículas extracelulares tem sido relatada por possuir uma
assinatura própria de miRNAs (Vickers et al., 2011), indicando que diferentes vesículas
podem participar de vias de sinalização extracelular distintas.
Descobertas recentes ainda levam à conclusão de que a maioria dos miRNAs circulantes
não está incluída em vesículas extracelulares (exossomos ou microvesículas), mas associada
a complexos ribonucleoproteicos. Arroyo e colaboradores mostraram que apenas 10%
dos miRNAs circulantes estão associados a vesículas extracelulares, estando 90% deles
potencialmente ligados a complexos ribonucleoproteicos (Arroyo et al., 2011). Em grande
parte, esses complexos parecem conter Argonauta 2 (Collino et al., 2010; Arroyo et al., 2011;
Turchinovich et al., 2011), uma ribonuclease membro do RNA – induced silencing complex
(RISC) e essencial para o silenciamento gênico mediado por miRNAs (Meister et al., 2004).
Outra proteína associada a miRNAs na circulação é a nucleofosmina 1 (NPM1), que protege
miRNAs de degradação por RNases (Wang et al., 2010). Partículas de antígeno de superfície
do vírus da hepatite B circulantes também contêm miRNAs (Novellino et al., 2012). Essas
partículas parecem formar um complexo com Argonauta 2 e conter, como esperado, miRNAs
específicos do fígado (Novellino et al., 2012).
Lipoproteínas, dentre elas LDL e HDL, também carregam miRNAs na circulação. Foi
demonstrado que o perfil de miRNAs carregados por HDL varia e correlaciona-se com a

328 Introdução ao mundo dos microRNAs

presença de doenças cardiovasculares em humanos e ratos (Vickers et al., 2011). O padrão
de miRNAs transportados por LDL, no entanto, é distinto dos transportados por HDL e
assemelha-se mais ao perfil de miRNAs exossomais (Vickers et al., 2011), sugerindo que
exossomos e LDL podem carregar miRNAs em um complexo único. O mecanismo de secreção
de complexos HDL-miRNA também parece ser distinto do descrito para exossomos, já que
a inibição da nSMase2 com siRNAs ou agentes químicos diminui a exportação de miRNAs
via exossomos, apesar de aumentar a exportação via HDL (Kosaka et al., 2010; Kogure et al.,
2011; Mittelbrunn et al., 2011; Vickers et al., 2011). A formação do complexo HDL-miRNA
parece ser favorecido pelo efluxo de colesterol e fosfolipídeos via ABCA1 (ATP – binding
cassette transporter A1)
(Vickers et al., 2011).
Curiosamente, vários autores demonstraram que junções comunicantes (gap junctions)
– conhecidas por promover o transporte intercelular de moléculas pequenas e íons – também
atuam como transportadoras de miRNAs e outros RNAs pequenos em mamíferos e plantas
(Mittelbrunn et al., 2011). O transporte de miRNAs por meio de gap junctions, foi observado
em células cardíacas (Kizana et al., 2009; Hosoda et al., 2011), células do estroma da médula
óssea e células tumorais (Lim et al., 2011). Ainda não está claro se o mecanismo de transporte
desses RNAs via junções comunicantes é passivo ou ativo, mas a proteína conexina 43 parece
estar envolvida nesse processo (Kizana et al., 2009).
Esses achados demonstram que miRNAs podem ser secretados no meio extracelular
e transportados em fluidos corporais por meio de diferentes carreadores. Em seguida,
abordaremos a presença de miRNAs circulantes em diferentes fluidos e discutiremos o
papel biológico desses miRNAs em células receptoras.

2.4 Presença de miRNAs em fluidos corporais

MiRNAs extracelulares foram identificados em diferentes fluidos biológicos humanos e de
outros mamíferos, dentre eles plasma, saliva, urina, líquido seminal, líquido cefalorraquidiano,
líquido amniótico, colostro, leite materno, fluido peritonial, lavado brônquico, fluido pleural
e lágrimas (Chim et al., 2008; Gilad et al., 2008; Weber et al., 2010). A fácil obtenção de parte
desses fluidos aliada à correlação do perfil de miRNAs extracelulares com diversas doenças
humanas abriu novas frentes de estudo para a determinação da função biológica desses
miRNAs e gerou perspectivas para o diagnóstico dessas doenças.
Num estudo conduzido por Weber e colaboradores (2010), a composição de miRNAs
foi avaliada em 12 fluidos humanos diferentes e mostrou-se distinta em cada um deles.
Alguns miRNAs mostraram-se fluido-específicos enquanto outros foram comuns a todos
eles. MiRNAs do plasma apresentaram uma assinatura única que os distinguia de todos os
outros fluidos, o que sugere que os miRNAs exportados para o sangue estão sob influência
de algum tipo de mecanismo seletivo de secreção (Weber et al., 2010).
De fato, entre todos os fluidos, os miRNAs presentes no sangue são os mais bem
caracterizados e os que apresentam um maior número de estudos que os correlacionam
com doenças humanas. De acordo com Chen e colaboradores, grande parte dos miRNAs
presentes no soro de indivíduos é expressa por células do sangue, enquanto que pequena
parte deles é encontrada apenas no soro ou apenas nas células sanguíneas (Chen et al.,
2008). Isto sugere que, em condições fisiológicas, a maior parte dos miRNAs circulantes
provém de células sanguíneas. Entretanto, há evidências recentes que indicam que miRNAs
séricos exossomais são em grande parte oriundos do tecido adiposo (https://endo.confex.

Novas fronteiras em miRNAs 329

 com/endo/2014endo/webprogram/Paper16904.html, acesso em: abr. 2015). Células tumorais
são também importantes fontes de miRNAs circulantes (Melo et al., 2014).
Alguns dos primeiros trabalhos que demonstraram a presença de miRNAs circulantes
e sugeriram a quantificação dos mesmos como ferramenta diagnóstica foram realizados no
final dos anos 2000. Chim e colaboradores (2008), por exemplo, identificaram e caracterizaram
miRNAs placentários no plasma maternal, enquanto Lawrie e colaboradores (2008) encontraram
alguns miRNAs específicos aumentados no soro de pacientes com linfoma de células B
(Chim et al., 2008; Lawrie et al., 2008). Desde então, o perfil de miRNAs do plasma, do soro
ou de outros fluidos vem sendo correlacionado com diferentes tipos de patologias humanas
(tabela 1 e capítulo 11).
O desenvolvimento de metodologias de extração de RNAs de amostras de fluidos de
fácil acesso, como a saliva ou a urina, vem direcionando os esforços para a identificação e
quantificação robusta do perfil de miRNAs nessas amostras. Além da facilidade de coleta,
esses fluidos são praticamente livres de contaminação com células sanguíneas, de hemólise
ou do uso de anticoagulantes, três das principais causas de artefatos metodológicos em
quantificação de miRNAs circulantes (Weber et al., 2010). Salazar e colaboradores, por
exemplo, desenvolveram um método que permite detectar miRNAs utilizando somente 200
µL de saliva humana. Esse método possibilitou a identificação de três miRNAs como possíveis
marcadores de carcinomas escamosos de cabeça e pescoço (Salazar et al., 2014). Além de
miRNAs, outros RNAs não codificantes, como piRNAs e circRNAs, foram identificados em
amostras de saliva humana (Bahn et al., 2015). A detecção de miRNAs na urina também
possibilitou a identificação de possíveis marcadores de tumores uroteliais (Weber et al.,
2010) e outros (tabela 1).
Curiosamente, miRNAs já foram encontrados em fluidos salivares de mosquitos
transmissores de doenças infecciosas, como na saliva de mosquitos transmissores do vírus
Chikungunya (Maharaj et al., 2015). Esses miRNAs parecem ser importantes para a transmissão
viral e estabelecimento da infecção durante o contato com o hospedeiro, sugerindo que
a inibição de miRNAs na saliva do mosquito pode representar uma boa alternativa para
reduzir o número de casos da doença.
Presentes em tantos fluidos corporais, os miRNAs são moléculas promissoras para
o diagnóstico de doenças. O papel biológico desses miRNAs circulantes permanece porém
elusivo. Não está claro se eles refletem subfenômenos celulares oriundos das complicações
decorrentes das doenças com os quais estão associados ou desempenham um papel regulatório
na etiopatogênese das mesmas. Apesar das evidências ainda escassas, alguns miRNAs circulantes
diferencialmente expressos em patologias ou em situações fisiológicas parecem ser captados
por células receptoras para controlar a expressão gênica e desempenhar um papel regulatório
importante (Pegtel et al., 2010; Zhang et al., 2010).

Tabela 1. MiRNAs em fluidos biológicos e correlações com doenças humanas.

MicroRNAs diferencialmente
Fluido biológico Condição estudada Referências
expressos no fluido biológico
Plasma Caracterização de miR-141, miR-149, miR-299-5p, Chim et al., 2008
microRNAs placentários miR-135b, miR-141
Soro Linfoma de células B miR-155, miR-210, miR-21 Lawrie et al., 2008
Plasma Gravidez ectópica miR-517 Miura et al., 2015
Plasma Epilepsia miR-106b-5p Wang et al., 2015
Soro Pancreatite autoimune miR-150-5p Hamada et al., 2015
Soro Tireoidite de Hashimoto miR-125a-3p Peng et al., 2015

330 Introdução ao mundo dos microRNAs

 MicroRNAs diferencialmente
Fluido biológico Condição estudada Referências
expressos no fluido biológico
Soro Miocardiopatia dilatada hsa-miR-155 e hsa-miR-636; Miyamoto et al., 2015
recuperada hsa-miR-646 e hsa-miR-639
Líquido sinovial Artrite reumatoide e miR-16, miR-132, miR-146a, Murata et al., 2010
osteoartrite miR-223, miR-155
Leite materno microRNAs regulatórios miR-181a, miR-17 e vários Kosaka et al., 2010
do sistema imune outros
Plasma e líquido Doença de Alzheimer miR-34a, miR-146a, miR-125b, Kiko et al., 2014
cérebro-espinal miR-29a e miR-29b
Líquido cérebro- Glioblastoma miR-21 Akers et al., 2013
espinal
Saliva Câncer de cabeça e miR-9, miR-134 e miR-191 Salazar et al., 2014
pescoço
Urina Doença renal policística miR-1, miR-133, miR-223 e Ben-Dov et al., 2014
autossomal dominante e miR-199
doença renal crônica

2.5 Papel biológico de miRNAs circulantes

Descobertas seminais de Valadi e colaboradores (2007) mostraram que exossomos
carregando miRNAs poderiam ser captados por células receptoras, inclusive células de
espécies diferentes, de maneira a manter a função dos RNAs carreados (Valadi et al., 2007).
Esse foi o primeiro grande passo na elucidação dos mecanismos pelos quais miRNAs
circulantes poderiam participar de um processo de comunicação intercelular. Desde então,
várias espécies de miRNAs foram encontradas na circulação, associadas a diferentes tipos
de carreadores e correlacionadas com diversas situações fisiopatológicas. A função desses
miRNAs permanece, no entanto, pouco conhecida, com exceção feita a alguns exemplos
que demonstram a capacidade dessas moléculas circulantes de agir em células receptoras.
Halkein e colaboradores (2013), por exemplo, demonstraram que exossomos carregando
miR-146a eram capazes de regular a expressão dos genes-alvo desse miRNA em células
receptoras quando esses exossomos eram oferecidos no meio de cultura de cardiomiócitos
de ratos (Halkein et al., 2013). Exossomos contendo miR-146a estão aumentados no plasma de
pacientes com cardiomiopatia periparto, e a inibição do miRNA parece atenuar a disfunção
cardíaca em um modelo murino da doença.
Além de exossomos, outros estudos indicam que microvesículas podem carrear
miRNAs funcionais para células receptoras. Zernecke e colaboradores (2009) mostraram
que a expressão da quimiocina CXCL12 aumenta em células HUVEC em resposta à presença
de corpos apoptóticos provenientes de células endoteliais no meio de cultura (Zernecke et
al., 2009). A análise mais refinada desse mecanismo revelou que era a expressão elevada
de miR-126 nesses corpos apoptóticos a responsável pela elevação dos níveis de CXCL12 nas
células HUVEC. Além disso, a administração de corpos apoptóticos carregando miR-126 foi
capaz de retardar o aparecimento de placas ateroscleróticas em modelos murinos da doença.
Em outro estudo, Zhang e colaboradores (2010) identificaram a presença de miR-150
em microvesículas secretadas de células monocíticas humanas sadias (Zhang et al., 2010). Foi
demonstrado que essas microvesículas podem ser captadas por células endoteliais humanas
em cultura para entregar miR-150, inibindo a expressão de c-Myb, um gene-alvo desse miRNA.
Além disso, as microvesículas aumentam a expressão de miR-150 em células sanguíneas
de camundongo quando injetadas de forma intravenosa nos animais. Interessantemente,

Novas fronteiras em miRNAs 331

 o estudo indicou que pacientes com aterosclerose apresentam microvesículas sanguíneas
contendo níveis mais elevados de miR-150, os quais parecem ter um impacto maior na
migração de células de linhagem endotelial humana em cultura, processo mediado pela
proteína c-Myb, sugerindo uma implicação dessas microvesículas contendo miR-150 na
patogênese da doença.
Utilizando uma estratégia mais holística, Collino e colaboradores (2010) isolaram
microvesículas contendo miRNAs provenientes de células mesenquimais e células-tronco.
A predição dos alvos desses miRNAs indicou que essas microvesículas estavam enriquecidas
em moléculas que controlam processos importantes de diferenciação celular, manutenção da
sobrevivência celular, regulação do sistema imune e até mesmo desenvolvimento de órgãos
(Collino et al., 2010). Certa seletividade por vias-alvo específicas foi observada em exossomos
oriundos de células tumorais, que parecem carregar miRNAs de caráter oncogênico (Melo
et al., 2014).
Grande parte dos miRNAs presentes na circulação está complexada com proteínas,
em especial a Argonauta 2 (Arroyo et al., 2011). Apesar disso, ainda não se têm evidências
consistentes de que essa grande quantidade de miRNAs tenha atividade nos fluidos corporais,
nem mesmo se eles são capazes de ser captados por outras células quando complexados
com proteínas. No que diz respeito aos miRNAs associados à Argonauta 2, as evidências
indicam que esses miRNAs são liberados de maneira inespecífica após a morte celular, não
estando claro se esses têm algum papel funcional (Turchinovich et al., 2013). Há também
descrição in vitro de miRNAs exportados juntamente com a proteína NPM1, contudo não
existem evidências in vivo de associação intracelular ou extracelular desses complexos ou
indicação de atividade funcional dos mesmos (Wang et al., 2010; Turchinovich et al., 2011).
Foi demonstrado, no entanto, que moléculas de HDL têm papel ativo na transferência
do miR-223 para células endoteliais, promovendo a diminuição de um dos alvos desse miRNA,
o mRNA que codifica para a proteína de adesão ICAM-1 (Intercellular Adhesion Molecule
1) (Tabet et al., 2014). Moléculas de HDL oriundas de camundongos nocaute para miR-
223 não inibem ICAM-1 tão eficientemente, sugerindo uma possível ação anti-inflamatória
e antiaterogênica de miR-223 circulante carregado por HDL. Interessantemente, células
endoteliais não expressam miR-223, o que reforça a importância dos miRNAs como moléculas
sinalizadoras e reguladoras de processos celulares não autônomos.

2.6 Perspectivas
Apesar de se conhecerem de maneira geral alguns mecanismos pelos quais miRNAs são
secretados, carregados na circulação e importados por células receptoras, onde possivelmente
exercem papel fisiológico, pouco se sabe sobre os detalhes e a dimensão desses fenômenos
num contexto in vivo. Poucos estudos e limitações metodológicas, como a dificuldade em
classificar, definir e isolar seletivamente complexos contendo miRNAs circulantes, a diferença
nos métodos de coleta dos fluidos biológicos, o uso majoritário de cultura de células nos estudos
e a preferência pela análise de miRNAs circulantes em contextos patológicos, dificultam a
extrapolação dos dados para organismos complexos em situações fisiológicas. Ainda não está
claro, portanto, se miRNAs circulantes podem ser regulados para contribuir para a resposta
fisiológica de organismos multicelulares. Além disso, um fator limitante nos estudos, como
dito anteriormente, é que grande parte dessas espécies de miRNAs presentes nos fluidos
está complexada à Argonauta 2, porém não se conhece nenhuma possível função para essas
espécies nesse estado. Outro fator importante é que a quantidade de miRNAs na circulação é
indiscutivelmente muito menor no meio extracelular do que dentro das células, deixando a

332 Introdução ao mundo dos microRNAs

dúvida se quantidades tão pequenas teriam alguma relevância funcional (Turchinovich et al.,
2013). Apesar disso, estudos recentes vêm reforçar o papel funcional de miRNAs circulantes
em uma nova área de investigação que abre portas para o entendimento de como processos
biológicos são coordenados entre diferentes tecidos de organismos multicelulares. O potencial
diagnóstico e etiopatogênico de miRNAs circulantes ainda eleva o caráter promissor desses
estudos e desperta interesse em diversas áreas do conhecimento.

miPEPs: peptídeos codificados por pri-miRNAs

3.1 miPEPs
“A ciência é um edifício em construção – a cada momento um novo tijolo é adicionado”
(autor desconhecido). Muitas vezes esse processo nos surpreende por revelar fenômenos
sequer imagináveis. É o exemplo de alguns genes codificadores de miRNAs, capazes de gerar
dois produtos funcionais totalmente distintos: (i) um miRNA maduro e (ii) um pequeno
peptídeo de aproximadamente 20 resíduos de aminoácidos (aa) com função regulatória
(Lauressergues et al., 2015). Esse é um caso nítido de uma descoberta fruto de mentes
aguçadas, cujos passos são descritos a seguir.
Um grupo de pesquisadores franceses alinhou sequências nucleotídicas de 284
ecótipos da planta Medicago truncatula, comparando as regiões em torno do miR171b. Eles
notaram que apenas 0,85% dos SNPs identificados se localizavam na região do pre-miRNA
correspondente, evidenciando claramente um uma seleção para manter essas sequências.
Em especial, não foi encontrado nenhum SNP nas sequências correspondentes ao miRNA
maduro ou ao miRNA*.
Em contraste, o promotor e a região 3’ do pri-miR171b eram bem mais divergentes –
8% e 15% dos SNPs, respectivamente. Contudo, a porção 5’ se apresentava mais conservada
(3% dos SNPs), sugerindo a existência de uma possível região codificadora na região. Uma
busca computacional identificou dois quadros abertos de leitura (open reading frames –
ORFs), sendo um deles de 20 aa e denominado miPEP171b (microRNA171b-encoded peptide).
Para validar a existência de miPEP171b, os autores geraram anticorpos contra esse
putativo peptídeo, cuja expressão foi detectada com sucesso por meio de western blot, a
partir de extratos da planta tipo selvagem. Ensaios de microscopia de imunofluorescência
detectaram miPEP171b na mesma região onde o miR171b é expresso, evidenciando uma
coexpressão e, possivelmente, um papel regulador de miPEP171b sobre miR171b.
Para investigar essa hipótese, o grupo realizou uma série de estudos genéticos e
bioquímicos. Inicialmente eles deletaram a ORF codificadora do miPEP171b, o que resultou na
redução do acúmulo do pri-miR171b. Em contrapartida, a superexpressão de miPEP171b levou
ao efeito oposto. Nenhum dos diversos outros miRNAs analisados foi afetado, evidenciando
um fenômeno alvo-específico.
Adicionalmente, mutações sinônimas nessa ORF (modificando a sequência nucleotídica
sem alterar o peptídeo resultante) não afetaram o acúmulo do miR171b, ao passo que uma
única mutação pontual (no códon de iniciação dessa ORF) levava à redução do acúmulo do
pri-miRNA171b. Em conjunto, esses dois experimentos evidenciaram que o produto funcional
final dessa região é um peptídeo, não um RNA regulador.

Novas fronteiras em miRNAs 333

 Em outro experimento, a administração do peptídeo sintético miPEP171b em plantas
também levou à acumulação de miRNA171b, ao passo que o controle negativo (um peptídeo
scrambled) não gerou o mesmo resultado. Por fim, os pesquisadores notaram ainda que
esse peptídeo promove o acúmulo de pri-miR171b por interferir na transcrição e não na
estabilidade desse transcrito.
Tomados em conjunto, esses dados revelavam que o pri-miR171b é um RNA bicistrônico,
sendo um desses cistrons codificador de um peptídeo de 20 aa, capaz de regular específica
e positivamente o acúmulo do pri-miR171b. Por fim, os autores identificaram e testaram
seis outros miPEPs em M. truncatula e A. thaliana, todos eles gerando resultados similares,
evidenciando que esse fenômeno pode ser bem mais geral.

3.2 Perspectivas
Este trabalho trouxe à luz um evento em loop totalmente inesperado: a regulação de
proteínas por microRNAs, por sua vez regulados por microproteínas (miPEPs). Simultaneamente,
diversas perguntas difíceis e certos paradoxos surgem: Exatamente através de qual mecanismo
miPEP171b afeta a transcrição? Qual é a base molecular para sua especificidade? Como
ocorre a tradução (um evento tipicamente citoplasmático) de miPEP171 se o pri-miR171b
é processado no núcleo.
Talvez a resposta esteja na integração dos miPEPs com outros fenômenos recém-
descritos e igualmente curiosos: (i) a observação de tradução no núcleo (Iborra et al., 2001)
e (ii) a descoberta de pequenos peptídeos regulatórios (11 a 32 aa) (Kondo et al., 2010).
Estudos investigando possíveis interconexões entre esses elementos poderão revelar um
magnífico mundo novo.

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Novas fronteiras em miRNAs 337
Índice remissivo
5’ RACE....................237, 245, 247, 248, 252
A cropping....................................................... 70
adaptador 3’......................................217, 218
adaptador 5’.............217, 218, 246, 247, 248
ADAR................................. 54, 55, 73, 75, 76
AntagomiR...................... 168, 179, 185, 245,
257, 258, 326
AntimiR...................192, 245, 256, 257, 258,
259, 260, 263, 266
B Diana-microT.................. 237, 238, 239, 240
bioluminescência..................... 237, 241, 243
Braço...... 30, 52, 55, 56, 70, 77, 92, 230, 274
C E
C3PO........................................................... 78
CAP......................66, 73, 74, 97, 98, 99, 100,
103, 247, 249, 280, 325
CCR4-NOT.........................................75, 100
ceRNA............................... 322, 323, 324, 337
circRNA....................322, 324, 325, 326, 330
CLASH.............................. 237, 251, 252, 253
clonagem........................... 90, 148, 184, 211,
212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 231,
242, 247, 259
cluster de miRNA.................... 41-45, 90, 91,
93, 265, 309
CRISPR.....................245, 263, 264, 265, 266
D
DCL...................73, 74, 75, 76, 100, 121, 127
Deadenilação................................ 28, 97-100
Decapping (=remoção do CAP)............. 97,
98, 100, 103
Degradome........................................237, 247
DGCR8......................................71, 73, 74, 78
Dicer-like...................... 73, 74, 101, 127, 218
Duplicação................................ 43-47, 54, 56
Edição de RNA........................52, 54, 55, 66,
72, 75, 76
elemento transponível.........................50, 51
elongação............................ 28, 95, 97, 98, 99
Endorribonuclease.............................30, 216
Esponja.................... 245, 256, 258-261, 263,
266, 322, 323, 325
Exorribonuclease................. 80, 97, 100, 327
Exportação............................. 65, 66, 72, 329
Exportin-5.....................................72, 73, 182
Índice remissivo 339
 F M

Família de miRNAs (conceito)................. 93 Maturação................................66, 67, 70, 72,

73, 75, 81, 101, 179
Metilação......................... 68, 72, 73, 76, 100,
G 101, 185, 218
Microarranjo........................... 184, 185, 212,
GMUCT........................... 237, 247, 249, 254
214, 221, 226, 227, 228, 241, 244, 245, 250
Guia (fita, RNA ou oligo).......52, 77, 78, 96,
microprocessador....................................... 71
100, 256, 264
GW182.............................. 100, 103, 104, 105 miRanda...................237, 238, 240, 290, 324
miR BS....................................................... 246
miRISC.............................. 52, 53, 55, 67, 77,
H 96, 97, 100, 101, 256, 272

Hibridização in situ......... 132, 181, 212, 222
HITS-CLIP....................... 237, 251, 253, 324
I miRNA intergênico..............................39, 43
iCLIP................................. 237, 251, 252, 253
imunoprecipitação................. 215, 249, 250,
251, 252, 253
IsomiR......................... 52, 53, 54, 56, 57, 306
miRNA*.................51, 52, 53, 55, 56, 57, 73,
76, 77, 78, 80, 101, 271, 273, 274, 275, 276,
282, 294, 307, 308, 309, 311, 313, 314, 333
miRNA artificial....................................... 270
miRNA intrônico....................................... 49
miRNA maduro.............................52, 53, 55,
56, 57, 66, 67, 69, 76, 77, 167, 178, 224, 227,
231, 259, 270, 295, 303, 307, 308, 333
miRNA mimético................... 242, 243, 260,
270-273, 275, 277, 279-282

L miRNA star................................................. 52
miRtron......................... 6, 40, 42, 68, 69, 73,
let-7........................28, 29, 30, 31, 32, 58, 60, 78, 79, 91, 291
62, 71, 72, 75, 81, 83, 84, 85, 86, 87, 90, 92,
93, 94, 99, 102, 149, 150, 152, 153, 155, moRNAs................................... 306, 308, 309
156, 157, 159, 161, 162, 168, 175, 176, 206, MRE.......................... 242, 243, 246, 322-325
233, 235, 254, 280, 281, 319, 335
LNA..........................132, 185, 221, 222, 225,
227, 231, 257 N
Loquacious.................................................. 72
northern blot26, 31, 148, 220, 221, 222,
Luciferase.............50, 54, 242, 243, 258, 260 226, 228, 230, 231, 233, 235, 237, 241, 258

340 Introdução ao mundo dos microRNAs

O R
off-target.....................54, 271, 272, 275, 281
oncomiR................................... 117, 201, 265
ORF................................. 26, 31, 66, 322, 333
P retículo endoplasmático..................103, 251
PAR-CLIP......................... 237, 251, 253, 324
PARE.................237, 247, 248, 249, 253, 254
Passageira (fita, RNA ou oligo).....52, 53, 77
PAZ........................................................73, 77
P-bodies.............................................103, 105
PicTAR...............................................237, 240
piRNA...................21, 96, 215, 218, 308, 330
PITA..................237, 238, 239, 240, 260, 324
PIWI............................................................. 77
poliadenilação.....73, 76, 217, 218, 219, 223,
224, 259
pre-miRNA................. 40, 41, 52, 53, 56, 65,
66, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 113,
231, 270, 288, 289, 290, 292, 294, 295, 296,
298, 301, 302, 303, 304, 307, 308, 309, 310,
311, 312, 313, 314, 318, 319, 320, 333
pri-miRNA.................. 41, 52, 53, 65, 66, 69,
70, 71, 72, 73, 74, 79, 82, 84, 231, 288
proteólise.....................................97, 100, 156
psRNAtarget..............................237-241, 275
Q
qPCR....... 211, 212, 221, 222, 223, 225, 226,
228, 230, 231, 232, 234, 235, 258, 281
R2D2............................................................ 78
RAN-GTP.............................................72, 73
RdRP......................................... 218, 274, 280
recomposição.............. 68, 69, 73, 74, 75, 78,
79, 81, 325
ribossomo.............27, 28, 95, 97, 98, 99, 103
RIP-Chip................................... 237, 250, 251
RISC.......................60, 65, 66, 73, 76, 77, 78,
80, 81, 83, 84, 85, 86, 87, 92, 96, 104, 105,
120, 126, 127, 215, 233, 242, 249, 253, 272,
274, 282, 328
RITS.............................................96, 101, 105
RLC........................................................76, 77
RNase H.................................................77, 99
RNase III...................................70, 73, 84, 87
RT-qPCR.211, 212, 221, 222, 223, 225, 226,
228, 230, 231, 232, 234, 235, 258, 281
S
scrambled......................... 242, 243, 257, 334
SDN......................................................80, 280
seed...................33, 43, 44, 48, 52, 53, 54, 57,
76, 93, 96, 111, 112, 114, 166, 167, 168, 171,
174, 238, 239, 240, 242, 243, 244, 252, 254,
257, 258, 259, 265, 274, 275, 281, 284, 291
SERRATE........................... 73, 74, 83, 84, 87
sibling miRNAs.......................................... 53
silenciamento transcricional.............97, 101
siRISC..................................................96, 100
siRNA.......................84, 85, 86, 96, 104, 140,
141, 142, 220, 253, 267, 271, 284, 308
Índice remissivo 341
 slicer.............................................96, 100, 246
snoRNA............49, 50, 51, 79, 291, 292, 303
stem-loop................29, 30, 70, 90, 101, 223,
232, 234, 236
stRNA....................................................29, 30
switching..........52, 55, 56, 59, 176, 218, 236
T
TAP-Tar............................ 237, 250, 251, 254
target mimicry......................... 137, 138, 322
342 Introdução ao mundo dos microRNAs
TargetScan....................... 237, 238, 239, 240,
290, 313, 324
tasiRNA.............................................126, 254
TATA....................................... 39, 68, 74, 102
testes clínicos....................................203, 281
TGS........................................... 100, 101, 104
TRBP............................. 60, 72, 73, 76, 82, 84
V
via não canônica...................................40, 78