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Química Bioorgânica 80 (2018) 245–252

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Química Bioorgânica

página inicial da revista: www.elsevier.com/locate/bioorg

Projeto e síntese de análogos de donepezil como inibidores duplos de AChE

T
e BACE-1
Moustafa T. Gabra,b,ÿ, Mohammed S. Abdel-Raziqc,d
aDepartamento de Química Medicinal, Faculdade de Farmácia, Universidade de Mansoura, Mansoura 35516, Egito
bDepartamento de Química, Universidade de Iowa, Iowa City, IA 52242, EUA
c
Faculdade de Farmácia, Universidade de Mansoura, Mansoura 35516, Egito
d
Escola de Química e Biociências Moleculares, Universidade de Queensland, St Lucia 4072, Queensland, Austrália

INFORMAÇÕES DO ARTIGO ABSTRATO

Palavras-chave: Ligantes direcionados a múltiplos alvos (MTDLs) centrados na inibição de ÿ-secretase 1 (BACE-1) estão surgindo como
doença de Alzheimer terapias inovadoras para abordar a complexidade das doenças neurodegenerativas. Uma nova série de análogos de
Acetilcolinesterase ÿ- donepezil foi projetada, sintetizada e avaliada como MTDLs contra doenças neurodegenerativas. O perfil de donepezil, um
Secretase 1
potente inibidor de acetilcolinesterase (hAChE), na inibição de BACE-1 foi alcançado através da introdução de ligantes de
Análogos de donepezila
amida de cadeia principal para os compostos projetados que são capazes de ligação de hidrogênio com o sítio catalítico
Permeabilidade
BACE-1. Ensaios in vitro e estudos de modelagem molecular revelaram o duplo modo de ação dos compostos 4–6 contra
hAChE e BACE-1. Notavelmente, o composto 4 apresentou inibição potente de hAChE ( valor de IC50 de 4,11 nM) e
inibição de BACE-1 ( valor de IC50 de 18,3 nM) em comparação com donepezil ( valores de IC50 de 6,21 e 194 nM contra
hAChE e BACE-1, respectivamente). Além disso, 4 revelou potencial propriedade quelante de metal, baixa toxicidade em
células de neuroblastoma SH SY5Y e capacidade de atravessar a barreira hematoencefálica (BBB) no ensaio PAMPA-BBB,
o que torna 4 uma vantagem potencial para otimização adicional de novos ligantes pequenos para o tratamento de Doença de Alzheimer

1. Introdução Donepezil, um potente e seletivo inibidor de hAChE, é um medicamento aprovado

A doença de Alzheimer (DA), uma doença neurodegenerativa progressiva, é a causa
mais comum de demência em idosos [1]. Estima-se que aproximadamente um terço das
pessoas com mais de 85 anos sejam afetadas pela DA. A disfunção no sistema colinérgico
do prosencéfalo basal é considerada uma marca registrada da DA que está diretamente
associada ao comprometimento da memória e déficit cognitivo [2]. Consequentemente, a
inibição da acetilcolinesterase (AChE), uma enzima que catalisa a hidrólise da acetilcolina,
surgiu como uma abordagem valiosa no tratamento da DA por melhorar as funções
colinérgicas em pacientes com DA [3]. Os inibidores da AChE ainda são os únicos
medicamentos aprovados pela FDA como terapêutica paliativa no estágio sintomático
inicial da DA [4]. O bloqueio da produção de placas ÿ amilóides (Aÿ) é uma abordagem
terapêutica alternativa para a DA através da inibição da ÿ-secretase 1 (BACE-1) [5]. A
clivagem extracelular da proteína precursora de amilóide (APP) por BACE-1 é a etapa
limitante na deposição de placas Aÿ no cérebro que contribui significativamente na
patogênese da DA [5]. A complexidade atual da terapia da DA, bem como a baixa eficácia
dos inibidores principais de BACE-1 e AChE, direcionaram a pesquisa para a identificação
de ligantes direcionados a múltiplos alvos (MTDLs) como potenciais terapêuticos da DA
[6].
pela FDA para o tratamento de demência leve a grave na DA [7-9]. A potência e a
segurança do donepezil direcionaram enormes esforços de pesquisa com o objetivo de
projetar análogos do donepezil para a terapia da DA [10-12]. A estrutura cristalina de
raios-X do donepezil com hAChE (código PDB: 4EY7) identificou dois sítios principais
para interações receptor-ligante: o sítio aniônico catalítico (CAS) com resíduos Trp86,
Tyr130, Tyr133, Phe 338 e o sítio aniônico periférico (PAS ) incluindo resíduos Trp286,
Tyr341, Asp74 [13-16]. A análise da ligação de donepezil a hAChE revelou dupla
interação de donepezil com CAS e PAS [17-19]. A porção indanona do donepezil empilha-
se contra o resíduo Trp286 no PAS, enquanto o anel benzílico apresenta interação ÿ–ÿ
com o resíduo Trp 86 no CAS (Fig. 1). Além disso, o grupo carbonila da porção indanona
está envolvido na ligação de hidrogênio com o resíduo Phe295.
O projeto baseado em estrutura de inibidores de hAChE contando com donepezil
como chumbo compartilhou as características estruturais exibidas na Fig. 2. A estrutura
geral dos inibidores de hAChE revelou um anel aromático substituído por metoxi que
, esses
interage com PAS de hAChE um centro básico que se liga
dois
a CAS
fragmentos,
e um ligante
comoentre
CH2,
CONH e CONHCH2 [20-23].

Identificação da estrutura de BACE-1 com inibidores polipeptídicos (PDB

ÿ Autor correspondente em: Departamento de Química Medicinal, Faculdade de Farmácia, Universidade de Mansoura, Mansoura 35516, Egito.
E-mail: gabr2003@gmail.com (MT Gabr).

https://doi.org/10.1016/j.bioorg.2018.06.031 Recebido
em 27 de abril de 2018; Recebido em formulário revisado em 20 de junho de 2018; Aceito em 23 de junho
de 2018 Disponível online em 25 de junho de 2018 0045-2068/ © 2018 Elsevier Inc. Todos os direitos

reservados.
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Fig. 1. Estrutura cristalina de raios-X da acetilcolinesterase humana recombinante em complexo com donepezil (PDB ID: 4EY7). (A) pose de encadernação 3D. (B) pose de ligação 2D.

Fig. 2. Estrutura geral dos inibidores de hAChE baseados

em donepezil.

Fig. 3. Estruturas químicas dos compostos I-III.

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código: 1M4H) por abordagens baseadas em estrutura suportadas por difração de raios X
para inibidores de BACE-1 [24,25]. Os resíduos Asp32 e Asp228 em
BACE-1 desempenha um papel fundamental na catálise da hidrólise das ligações amida de
APP, que são identificados como sítios catalíticos de BACE-1 [26]. O inibidor de BACE-1 à
base de isatina (I, Fig. 3), identificado usando uma abordagem de triagem virtual de alto
rendimento, exibiu uma inibição potente de BACE-1
com valor de IC50 de 2,4 µM através de interações de ligação de hidrogênio com
os resíduos catalíticos de aspartato [26]. Essa estratégia de design foi ainda mais
estendido recentemente para identificar MTDLs baseados em BACE-1 através da
introdução de ligações de amida de ligação a derivados de isoquinolina para permitir
formação de ligação de hidrogênio com o sítio ativo BACE-1 [27]. No objetivo de
desenvolvimento de MTDLs potentes, as características farmacofóricas exibidas
por inibidores de hAChE foram ajustados para incorporar outros
grupos que podem inibir BACE-1. Neste contexto, o multi-direcionado Fig. 4. Atividade da AChE determinada na presença de donepezil e compostos
derivado de cumarina (II, Fig. 3) exibiu potência inibitória submicromolar dupla de AChE e 4-9 (0,1 ÿM). O controle negativo representa a atividade da AChE na ausência do
BACE-1 [28]. Além disso, o análogo donepezil (III, compostos testados. Os dados representam a média de três determinações diferentes
A Fig. 3) surgiu como uma pista potencial para inibidores duplos de AChE/BACE-1 com indicação do erro padrão, (**p < 0,05, vs controle; ***p < 0,01 vs. controle; ##p <
0,05, vs donepezil; ###p < 0,01 vs. donepezila
devido à rigidez estrutural causada pela dupla ligação na porção in danone [29]. O
(ANOVA)).
desenvolvimento de MTDLs centrados em BACE-1 é
limitada devido ao baixo perfil farmacocinético e penetração no SNC
capacidade dos compostos de chumbo, bem como a complexidade de obter um suavemente para fornecer compostos alvo 4-6 em rendimentos úteis.
perfil inibitório equilibrado contra múltiplos alvos [25,30]. Baseado em Além disso, o refluxo de 4-6 e hidreto de alumínio e lítio em tetra-hidrofurano produziu
essas descobertas, as estratégias de pesquisa se concentraram no desenvolvimento de compostos 7-9 (Esquema 1).
moléculas híbridas caracterizadas por semelhança com drogas conhecidas para DA
[31-33]. Neste estudo, relatamos a síntese e avaliação de análogos do nepezil que mantêm
2.2. Atividades inibitórias duplas de hAChE e BACE-1
as características estruturais gerais necessárias
para inibição de hAChE (Fig. 2). Além disso, os ligantes de amida de cadeia principal são
O efeito biológico dos compostos sintetizados 4-9 tem sido
introduzido no modelo de donepezil para maximizar a inibição de BACE-1
avaliados por suas atividades inibitórias exercidas sobre a hAChE in vitro e
através de interações de ligação de hidrogênio com o aspartato catalítico
atividades BACE-1. Para testar o poder de inibição preliminar, o hAChE
resíduos com base em achados anteriores [26,27]. Além disso, ligantes de amida
e as atividades BACE-1 foram medidas na ausência ou na presença
são propostos para introduzir a capacidade de quelação de metais para os ligandos
de 0,1 ÿM de compostos 4-9 e donepezil (Figs. 4 e 5). Os resultados
projetados, o que representa uma abordagem terapêutica vital para a DA. A eficácia da
relatado na Fig. 4 revelou que o composto 4 exibiu a maior atividade inibitória em hAChE,
estratégia de design foi ainda validada através da avaliação de
que foi maior do que a exibida por
análogos sem as ligações amida da espinha dorsal. Modelagem molecular
donepezila. Além disso, os compostos 5 e 6 demonstraram
estudos foram empregados para investigar o mecanismo de interação dupla de
potência do donepezil em termos de atividade inibitória sobre hAChE. Tal
os novos compostos com hAChE e BACE-1. Além disso, a capacidade de
Os achados demonstram claramente a importância do padrão de substituição de 3,4-
os novos compostos identificados neste estudo para atravessar o sangue-cérebro
dimetoxi de 7 no efeito inibitório de hAChE do testado
barreira (BBB) e seu efeito na viabilidade do neuroblastoma SH-SY5Y
as células foram ainda avaliadas. compostos. Além disso, os compostos 7-9 revelaram geralmente menor atividade como
inibidores de hAChE, o que revela que as ligações amida desempenham um papel importante.
papel fundamental na interação com o receptor-alvo. Na Tabela 1, a potência inibidora de
2. Resultados e discussão 4-9 em hAChE é expressa como IC50, que representa
a concentração de inibidor necessária para diminuir a atividade da enzima
2.1. Química em 50%. Composto 4, o membro mais ativo deste estudo apresentou
Valor de IC50 de 4,11 nM em comparação com o valor de IC50 de 6,21 nM para do nepezil.
Uma abordagem geral para a síntese dos compostos projetados é
descrito no Esquema 1. Conforme mostrado no Esquema 1, o isonipecótico inicial O efeito de 4-9 na atividade BACE-1 foi comparado ao exibido
ácido 1 reagiu com cloreto de benzoíla 2 sob irradiação de microondas para por donepezil (Fig. 5). Curiosamente, os compostos 4-6 exibiram
proporcionar o composto 3 com um bom rendimento. Acoplamento adicional de 3 com Atividade inibitória BACE-1 a 0,1 ÿM em contraste com o efeito do pezil feito. É digno de
benzilaminas substituídas sob irradiação de micro-ondas prosseguiu nota mencionar que a potência comparável de 4-6 como

Esquema 1. Síntese de compostos 4-9.

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com hAChE e BACE-1, um estudo de docking molecular baseado no raio-X

estruturas cristalinas de hAChE (código PDB 4EY7) e BACE-1 (código PDB
1M4H) foi realizado. Os resultados do estudo de encaixe usando hAChE
(código PDB 4EY7) como mostrado na Fig. 7A e B indicaram que o composto 4
cobriu o desfiladeiro de ligação em uma orientação satisfatória comparável ao
a de donepezil resultando em potente atividade inibitória de hAChE. o
a fração benzil substituída com dimetoxi ocupou o PAS de hAChE em interação por
empilhamento ÿ–ÿ com resíduos Trp286 e Tyr341. De forma similar
para donepezil, o resíduo Phe295 de hAChE estava envolvido em hidrogênio
ligação com a ligação amida de 4. Além disso, a porção piperidinil
interações hidrofóbicas estabelecidas com Phe297, Phe338 e Tyr124
resíduos no CAS de hAChE (Fig. 7).
Além disso, o composto 4 apresentou ligação preferencial ao BACE-1
(código PDB 1M4H) com energia de ligação estimada de -18,76 kcal mol-1
o que está de acordo com o ensaio inibitório BACE-1 in vitro.
Fig. 5. Atividade BACE-1 determinada na presença de donepezil e compostos 4-9 (0,1 ÿM).
A análise detalhada da interação de ligação é exibida no 2D
O controle negativo representa a atividade BACE-1 na ausência dos compostos testados.
modo de ligação de 4 na Fig. 8. A porção piperidinil de 4 é esticada em
Os dados representam a média de três determinações diferentes com indicação do erro
um bolso da enzima alvo revelando interações com Gly11, Ile110
padrão. (**p < 0,05, vs
e resíduos Gln12. A fração benzil substituída com dimetoxi de 4 foi
ao controle; ***p < 0,01 vs. controle; ##p < 0,05, vs donepezil; ###p < 0,01 vs.
donepezila (ANOVA)). envolvidos no empilhamento ÿ–ÿ com resíduos Tyr71 e Tyr198. Além disso,
os ligantes de amida em 4 exibiram ligação de hidrogênio com Asp228,
Resíduos Thr232 e Thr72 do sítio catalítico de BACE-1. Além disso,
tabela 1
o modo de ligação do donepezil ao BACE-1 (código PDB 1M4H) foi examinado. A interação
Valores IC50 (nM) dos compostos 4-9 para sua atividade inibitória de AChE e BACE-1.
de ligação 2D de donepezil exibida na Fig. 9
revelou interação de donepezil com ligação de hidrogênio a Thr232 e
Comp. Dor BACE-1
Thr72 resíduos. Sem interação de ligação de hidrogênio com Asp228
IC50 (nM)a IC50 (nM)a
resíduo para donepezil valida ainda mais seu papel fundamental na maximização da
4 4,11 ± 0,12 18,3 ± 0,17 potência in vitro do composto 4 contra BACE-1 em comparação com o pezil feito. Da mesma
5 8,46 ± 0,23 18,5 ± 0,13 forma que o composto 4, donepezil exibiu empilhamento ÿ–ÿ com
6 9,78 ± 0,14 19,1 ± 0,06
Resíduos Tyr71 e Tyr198. Levando em consideração a análise de
7 145 ± 1,42 243 ± 1,13
os resultados de docking e ensaios enzimáticos in vitro, foi confirmado que
8 157 ± 2,43 277 ± 2,11
9 165 ± 1,75 253 ± 1,62 o composto 4 foi um inibidor duplo de hAChE e BACE-1.
Donepezil 6,21 ± 0,04 194 ± 1,24
Inibidor de BACE-1 IV Ndb 15,1 ± 0,06 2.5. Permeabilidade da barreira hematoencefálica in vitro

Valores em negrito representam os melhores resultados.

uma
No processo de desenvolvimento de terapêuticas para doenças neurológicas, a
Os dados são apresentados como valores médios ± desvio padrão (n = 3).
b capacidade de um fármaco de permear a barreira hematoencefálica (BHE) é
Nd; não determinado.
uma propriedade crucial para drogas do sistema nervoso central (SNC). O paralelo
ensaio de permeabilidade de membrana artificial para BBB (PAMPA-BBB) é um teste de alta
Os inibidores de BACE-1 sugerem que o padrão de substituição do metoxi
grupos na fração benzil não tem influência na interação potencial técnica de rendimento usada para avaliar a capacidade de pequenas moléculas de
transversal ao BBB expresso como permeabilidade efetiva (Pe, cm/s) [34].
com BACE-1. No entanto, os compostos 7-9 sem a amida principal
os ligantes exibiram atividade inibitória BACE-1 insignificante a 0,1 ÿM em A validação do ensaio foi realizada comparando os valores de Pe dos compostos 4-6 com a
cafeína como uma droga de baixa permeabilidade passiva e
concorda com a nossa hipótese proposta. Os valores IC50 de 4-6 como
BACE-1 estavam na faixa de 18,3-19,1 nM, o que confirmou ainda mais donepezil como um fármaco de alta permeabilidade passiva. Com base nos valores de Pe
obtidos (Tabela 2), os compostos 4-6 mostraram alta permeabilidade passiva
sua potência em comparação com o valor de IC50 de 194 nM para donepezil.
Esses resultados validam ainda mais nossa hipótese de adaptar donepezil com valores de Pe variando de 20,13 a 22,97 × 10ÿ6 cm/s, que é
comparável ao valor de Pe de donepezil 23,35 × 10ÿ6 cm/s. Além disso, o
modelo para a atividade inibitória de BACE-1 através da introdução de
ligantes de amida de cadeia principal em 4-6. Composto 4 exibiu melhor dual lipofilicidade de um fármaco é considerado um parâmetro crítico que afeta sua
propriedades farmacocinéticas. Compostos com lipofilicidade moderada
atividade e valores de IC50 mais baixos contra hAChE e BACE-1 do que o
Donepezil aprovado pela FDA. (Log D7.4 0-3) possuem um bom equilíbrio entre solubilidade e capacidade de permeabilidade
necessária para absorção oral e permeação da membrana celular em
ensaios baseados em células [35]. Em geral, as drogas do SNC possuem (Log D7.4 ~ 2)
2.3. Teste de citotoxicidade in vitro
o que é ideal para penetração BBB e baixa responsabilidade metabólica. Para
examinar a probabilidade de sucesso dos compostos investigados 4-6,
O efeito dos compostos 4-6 na viabilidade celular foi avaliado em células de
seu Log D7.4 foi determinado experimentalmente usando frasco de agitação
neuroblastoma SH SY5Y. Os compostos 4-6 não afetaram as células SH-SY5Y
método (Tabela 2). Compostos 4–6 exibidos ótimos (Log D7.4 ÿ 2)
viabilidade, em comparação com os controles não tratados e rotenona como
necessários para drogas do SNC, o que os torna potenciais leva a mais
controle positivo (Fig. 6). Uma triagem adicional no nível de 10 doses revelou
desenvolvimento como terapêutica da DA.
que 4-6 possuíam valores de IC50 > 50 ÿM contra células de neuroblastoma SH-SY5Y.
Esses resultados demonstram a utilidade potencial desses
2.6. Capacidade quelante de metais
compostos como pistas para o desenvolvimento de terapêuticas para doenças neurológicas
doenças.
Numerosos estudos relataram níveis mais altos de biometais, como Cu2+
e Zn2+ em um cérebro com DA em comparação com um cérebro saudável [36-38]. Esses
2.4. Modelagem molecular resultados sugeriram que a destruição do equilíbrio de íons metálicos no SNC é
uma causa subjacente de doenças neurodegenerativas. De fato, vários levam
A fim de obter uma visão sobre o mecanismo de interação dupla de 4 compostos com propriedades quelantes de metais têm se mostrado promissores

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Fig. 6. O efeito do donepezil, compostos 4-6 e rotenona na viabilidade das células SH-SY5Y em três concentrações diferentes. Como controles, foi utilizado meio RPMI na ausência ou na presença de 0,1% de
DMSO.

Fig. 8. Interação 2D do composto 4 com o sítio ativo de BACE-1 (código PDB 1M4H). As linhas
tracejadas representam ligações de hidrogênio. As interações hidrofóbicas são mostradas por linhas
sólidas verdes.

notável efeito hipercrômico que explica a interação potencial entre 4 e Cu2+

(Fig. 10). Esses resultados indicam que 4 pode efetivamente quelar Cu2+ e,
assim, servir como quelante de metal no tratamento de DA. A propriedade
quelante de metal de 4 é atribuída à presença das ligações amida, bem como
dos grupos dimetoxi.

3. Conclusão

Há uma necessidade premente de desenvolver MTDLs para doenças

Fig. 7. (A) Interação 3D do composto 4 com o sítio de ligação de hAChE (código PDB 4EY7). Os
neurodegenerativas que combinem requisitos estruturais para potência com
átomos são coloridos da seguinte forma: vermelho para átomos de oxigênio, azul para átomos de
a estrita necessidade de toxicidade tolerável e permeação de BBB. Em
nitrogênio, branco para átomos de hidrogênio e ciano para átomos de carbono. (B) Interação 2D do
composto 4 com o sítio de ligação de hAChE (código PDB 4EY7).
resumo, os análogos de donepezil são introduzidos neste estudo como
As linhas tracejadas representam ligações de hidrogênio. As interações hidrofóbicas são mostradas por hAChE dual e BACE-1 em inibidores que são considerados MTDLs
linhas sólidas verdes. promissores como terapêuticos para doenças neu rodegerativas. O perfil do
modelo de donepezil com potente inibição de hAChE para exercer inibição
de BACE-1 foi alcançado através da introdução de ligações amida de cadeia
potencial como terapia de AD [39-41]. Essas descobertas nos levaram a
principal aos compostos 4-6 que são capazes de ligação de hidrogênio ao
postular que a incorporação de ligantes de amida nos compostos projetados
sítio ativo de BACE-1. Na triagem biológica preliminar, os compostos 4-6
poderia introduzir propriedades quelantes de metal que seriam úteis no
mantiveram excelente atividade inibitória de hAChE comparável à droga
projeto de MTDLs para tratamento de DA. A propriedade quelante de metal
aprovada pela FDA, donepezil. Além disso, 4-6 exibiram inibição BACE-1
do composto 4 foi examinada registrando seus espectros de absorção UV-
significativamente superior em comparação com donepezil. Os análogos
visível com comprimento de onda variando de 200 a 500 nm na presença de
correspondentes 7-9 sem os ligantes amida apresentaram atividade inibitória
concentrações crescentes de Cu2+. Os espectros de absorção diferencial
mínima contra BACE-1, o que demonstrou o papel fundamental das ligações
obtidos após adição incremental de Cu2+ (5-50 ÿM) a 4 revelaram
amida na interação com o receptor alvo. O composto candidato ideal 4 exibiu valores de I

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Fig. 9. Interação 2D do donepezil com o sítio ativo do BACE-1 (código PDB 1M4H). As linhas tracejadas representam ligações de hidrogênio. As interações hidrofóbicas são mostradas por
linhas sólidas verdes.

mesa 2 4. Experimental
Permeabilidade PAMPA-BBB (Pe × 10ÿ6 cm sÿ1 ) de 4–6 e controles expressos como
Pe, suas lipofilicidades em pH 7,4 (Log D7,4) e sua penetração preditiva para 4.1. Química
o SNC.

Comp.
Educaçao Fisica

Registro D7.4 Previsão de penetração no SNC

Todos os materiais de partida, reagentes e solventes comercialmente disponíveis
(× 10ÿ6 cm sÿ1 ) foram usados como fornecidos, salvo indicação em contrário. Os rendimentos informados são
rendimentos isolados. A purificação de todos os produtos finais foi realizada por
4 20.13 2,27 Alto
cromatografia em coluna flash de gel de sílica. Clorofórmio: metanol ou
5 22.43 2,43 Alto
6 22,97 2,49 hexano: acetato de etilo foram usados como solventes de eluição. Próton (1 H) e
Alto
Donepezil 23h35 2,71 Alto carbono (13C) NMR foram coletados no espectrômetro Bruker NMR em
Cafeína 2,24 -0,63 Baixo 400 MHz para 1 H e 100 MHz para 13C. Os deslocamentos químicos (ÿ) são relatados
partes por milhão (ppm) em relação ao solvente não deuterado residual.
Os pontos de fusão foram registrados usando um aparelho de ponto de fusão capilar
e não estão corrigidos. Espectros de massa de alta resolução foram obtidos usando
ionização por pulverização de elétrons (ESI). Pureza (> 95%) dos compostos 4-9 foi
confirmado por HPLC analítico.

4.1.1. Ácido 1-benzoilpiperidina-4-carboxílico (3)

Fig. 10. Espectro de absorção UV-vis diferencial do composto 4 (25 ÿM) em
metanol na presença de concentrações crescentes de CuCl2 (5-50 ÿM). o
espectros diferenciais foram obtidos por subtração da absorção da mistura
espectros dos espectros do ligante livre e CuCl2 no correspondente
concentração.
hAChE e BACE-1, respectivamente. Além disso, 4 apresentaram potencial capacidade
de quelação de biometal, alta permeabilidade no ensaio PAMPA-BBB e nenhuma
efeito sobre a viabilidade de células de neuroblastoma SH-SY5Y em sua eficácia
concentração. Estudos de modelagem molecular revelaram ainda a dupla
capacidade de ligação de 4 aos sítios ativos de hAChE e BACE-1. A liderança
os compostos identificados nesta investigação mostraram-se como scaffolds
promissores para o desenvolvimento de novos compostos multialvos potentes para
doenças neurológicas.
Uma mistura de ácido isonipecótico 1 (129 mg, 1,0 mmol), benzoíla
cloreto 2 (140 mg, 1,0 mmol) e Et3N (0,32 mL, 2,5 mmol) em THF (5
mL) foi agitado sob irradiação de micro-ondas (120 W) a 70°C por
15 min. A mistura de reação foi acidificada usando HCl 1 M (10 mL) e
extraído com diclorometano (3 x 25 mL). O orgânico combinado
camadas foram secas sobre Na2SO4 anidro, filtradas e concentradas
sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por flash
cromatografia em coluna usando 5% de acetato de etila em hexano, seguido por
80% de acetato de etilo em hexano como eluente para dar 3 (94%) como um sólido branco.
1
Pf 136–138 °C. H NMR (400 MHz, CDCl3) ÿ 1,71-1,85 (m, 3H),
2,03-2,06 (m, 1H), 2,59 (tt, 1H, J = 10,4, 4,1 Hz), 3,04-3,12 (m, 2H),
3,72–3,76 (m, 1H), 4,48–4,52 (m, 1H), 7,36–7,44 (m, 5H), 11,16 (br s,
1H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) ÿ 40,4, 41,4, 46,8, 126,7, 128,3,
129,6, 135,3, 170,7, 178,3. HRMS (ESI): calculado para C13H14NO3 [M-H]- ,
232.0973; encontrado, 232.0979.
4.1.2. 1-Benzoil-N-(3,4-dimetoxibenzil)piperidina-4-carboxamida (4)
Para uma solução do composto 3 (233 mg, 1,0 mmol) em MeCN (4 mL),
PyBroP (466 mg, 1,0 mmol) e Et3N (0,32 mL, 2,5 mmol) foram adicionados
e agitou-se à temperatura ambiente durante 10 minutos. Uma solução de 3,4-di
metoxibenzilamina (167 mg, 1,0 mmol) em MeCN (3 mL) foi então
adicionado e a mistura de reação agitada sob irradiação de micro-ondas
(80 W) a 90°C durante 20 min. O solvente foi removido sob
pressão, e a mistura bruta foi suspensa em H2O (20 mL) e
extraído com diclorometano (2 x 20 mL). O orgânico combinado
camadas foram secas sobre Na2SO4 anidro, filtradas e concentradas
sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por flash
cromatografia em coluna usando 10% de acetato de etila em hexano, seguido
por 50% de acetato de etil em hexano como eluente para render 4 (91%) como amarelado

250
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sólido branco. Pf 177–179 °C. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) ÿ 1,63-1,81 (m,
3H), 2,27–2,33 (m, 2H), 2,71–2,86 (m, 2H), 3,67–3,71 (m, 1H), 3,77 (s, 3H),
3,78 (s, 3H), 4,25 (d, 2H, J = 5,4 Hz), 4,52–4,56 (m, 1H), 6,68–6,75 (m, 3H),
7,10–7,19 (m, 2H), 7,25–7,35 (m, 3H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) ô 41,3,
42,5, 42,8, 46,8, 55,5, 55,6, 110,9, 119,6, 126,4, 127,9, 128,2, 128,7, 129,4,
135,6, 148,0, 148,7, 129,4, 135,6, 148,0, 148,7,
HRMS (ESI): calculado para C22H27N2O4 [M + H]+, 383,1970; encontrado,
383.1967.
4.1.3. 1-Benzoil-N-(2-metoxibenzil)piperidina-4-carboxamida (5)
Usando o procedimento dado para a preparação de 4, acoplamento de 3
(233 mg, 1,0 mmol) e 2-metoxibenzilamina (137 mg, 1,0 mmol) deu 5 (87%)
como um sólido amarelo pálido após purificação por cromatografia em coluna
flash usando 40% acetato de etilo em hexano como eluente. Mp H NMR (400
152–153°C. 1 MHz, CDCl3) ÿ 1,52–1,75 (m, 4H), 2,26–2,32 (m, 1H), 2,31–
2,81 (m, 2H), 3,61–3,66 (m, 1H), 3,70 (s, 3H), 4,28 (d, 2H, J = 5,6 Hz), 4,46–
4,51 (m, 1H), 6,74–6,81 (m, 2H), 6,90 (t, 1H, J = 5,7 Hz), 7,08–7,16 (m , 2H),
7,22-7,32 (m, 5H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) ô 38,1, 38,2, 42,2, 46,7, 54,8,
109,8, 120,0, 125,9, 126,2, 128,0, 128,1, 128,3, 129,1, 135,6, 156,8, 169,8.
HRMS (ESI): calculado para C21H25N2O3 [M + H]+, 353,1865; encontrado,
353.1871.
4.1.4. 1-Benzoil-N-(4-metoxibenzil)piperidina-4-carboxamida (6)
Usando o procedimento dado para a preparação de 4, acoplamento de 3
(233 mg, 1,0 mmol) e 4-metoxibenzilamina (137 mg, 1,0 mmol) deu 6 (82%)
como um sólido branco amarelado após purificação por cromatografia em
coluna flash usando 50% acetato de etilo em hexano como eluente. Mp H
1 188–191 °C. NMR (400 MHz, CDCl3) ÿ 1,62–1,82 (m, 4H), 2,27–2,32 (m,
1H), 2,82–2,87 (m, 2H), 3,65–3,69 (m, 1H), 3,73 (s, 3H), 4,26 (d, 2H, J = 5,7
Hz), 4,52-4,57 (m, 1H), 6,50 (br s, 1H), 6,79 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 7,10 (d, 2H,
J = 8,4 Hz), 7,24-7,36 (m, 5H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) ô 41,3, 42,5,
42,7, 47,0, 55,1, 113,8, 126,5, 128,3, 128,8, 129,5, 130,3, 135,8, 158,7, 170,2,
173,7. HRMS (ESI): calculado para C21H25N2O3 [M + H]+, 353,1865;
encontrado, 353.1869.
4.1.5. 1-(1-Benzilpiperidin-4-il)-N-(3,4-dimetoxibenzil)metanamina (7)
A uma solução de 4 (382 mg, 1,0 mmol) em THF (8 mL), LiAlH4 (189 mg,
5,0 mmol) foi adicionado a 0°C. A mistura de reação foi refluxada por 6 horas,
depois foi resfriada até a temperatura ambiente e extinta com H2O (10 mL) e
extraída com diclorometano (2 x 10 mL).
As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre Na2SO4 anidro,
filtradas e concentradas sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado
por cromatografia em coluna flash usando 30% de acetato de etil em hexano
1 H NMR
para produzir 7 (76%) como um sólido amarelo. Pf 144–146 °C.
(400 MHz, CDCl3) ÿ 1,21–1,28 (m, 3H), 1,65–1,70 (m, 2H), 1,89–1,94 (m,
2H), 2,48 (d, 2H, J = 6,7 Hz), 2,83– 2,87 (m, 2H), 3,45 (s, 2H), 3,69 (s, 2H),
3,83 (s, 3H), 3,85 (s, 3H), 6,77-6,80 (m, 2H), 6,86 (s, 1H) , 7,23-7,31 (m, 5H).
13C RMN (100 MHz, CDCL3) ÿ 30,5, 36,0, 53,5, 53,7, 55,2, 55,7, 55,8, 63,3,
110,8, 111.1, 119,9, 126,7, 128,0, 129,0, 133,0, 138.4, 147.8, 148.8. HRMS
(ESI): calculado para C22H31N2O2 [M + H]+, 355,2385; encontrado, 355.2388.
4.1.6. 1-(1-Benzilpiperidin-4-il)-N-(2-metoxibenzil)metanamina (8)
Usando o procedimento dado para a preparação de 7, composto 5 (352
mg, 1,0 mmol) e LiAlH4 (189 mg, 5,0 mmol) deu 8 (69%) como um sólido
branco amarelado após purificação por cromatografia em coluna flash usando
1H
40% de acetato de etila em hexano como eluente. Pf 135–136 °C.
NMR (400 MHz, CDCl3) ÿ 1,26–1,34 (m, 2H), 1,48–1,53 (m, 1H), 1,70–1,75
(m, 2H), 1,94–1,99 (m, 2H), 2,49–2,54 (m , 2H), 2,90 (d, 2H, J = 6,5 Hz), 3,50
(s, 2H), 3,80 (s, 2H), 3,83 (s, 3H), 6,84-6,98 (m, 2H), 7,23-7,35 ( m, 7H). 13C
NMR (100 MHz, CDCl3) ô 30,4, 36,0, 49,3, 53,3, 53,6, 55,0, 63,3, 110,0,
120,2, 122,4, 126,7, 127,9, 128,0, 129,0, 129,5, 138,5, 128,0, 129,0, 129,5,
138,5. HRMS (ESI): calculado para C21H29N2O [M + H]+, 325,2279;
encontrado, 325.2284.
251
Química Bioorgânica 80 (2018) 245–252
4.1.7. 1-(1-Benzilpiperidin-4-il)-N-(4-metoxibenzil)metanamina (9)
Usando o procedimento dado para a preparação de 7, composto 6 (352
mg, 1,0 mmol) e LiAlH4 (189 mg, 5,0 mmol) deu 9 (71%) como um sólido
branco amarelado após purificação por cromatografia em coluna flash usando
1H
50% de acetato de etila em hexano como eluente. Pf 150–151 °C.
NMR (400 MHz, CDCl3) ÿ 1,25–1,35 (m, 2H), 1,49–1,53 (m, 1H), 1,70–1,74
(m, 2H), 1,94–2,01 (m, 2H), 2,53 (d, 2H) , J = 6,7 Hz), 2,90–2,93 (m, 2H),
3,51 (s, 2H), 3,74 (s, 2H), 3,82 (s, 3H), 6,89 (d, 2H, J = 8,5 Hz), 7,26 (d, 2H, J
= 8,5 Hz), 7,31-7,37 (m, 5H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) ô 30,5, 36,1, 53,4,
53,6, 55,1, 55,2, 63,4, 113,6, 126,7, 128,0, 129,0, 129,1, 132,6, 138,5, 158,4.
HRMS (ESI): calculado para C21H29N2O [M + H]+, 325,2279; encontrado,
325.2282.
4.2. Testes biológicos
4.2.1. Atividades inibitórias duplas de hAChE e BACE-1
A atividade inibitória dos compostos sintetizados contra AChE foi medida
usando o método espectrofotométrico de Ellman [42]. A AChE recombinante
humana foi obtida de Sigma Aldrich. Acetiltiocolina (ATC) e 5,5'-ditio-bis(ácido
2-nitrobenzóico) (DTNB) foram adquiridos da Sigma Aldrich e soluções
estoque de 0,01 M em H2O foram preparadas. A hidrólise enzimática de ATC
foi monitorada por absorção UV-visível a 412 nm na presença e ausência de
várias concentrações de inibidores a 25 °C em fosfato de potássio 0,1 M, pH
7,0. Para determinar o valor de IC50 , seis concentrações diferentes de cada
composto foram usadas para obter atividades enzimáticas entre 5% e 95%.
Todas as reações foram realizadas em triplicata. Os valores de IC50 foram
calculados usando regressão não linear (GraphPad Prism 5 (GraphPad
Software, San Diego, CA, EUA, 5,00)) plotando as atividades enzimáticas
residuais em relação à concentração de inibidor aplicada.
Todos os compostos foram testados como inibidores de BACE-1 usando
um kit de ensaio de transferência de energia de ressonância de fluorescência
(FRET) de PanVera BACE-1 [43,44]. As análises foram realizadas de acordo
com o protocolo fornecido. O comprimento de onda foi otimizado para
excitação de 553 nm e 576 nm para monitoramento de emissão. As soluções-
mãe dos compostos testados foram preparadas em DMSO e diluídas
adicionalmente com tampão de ensaio (acetato de sódio 50 mM; pH 4,5). 10
µL de substrato BACE-1 (750 nM) foi misturado com 10 µL de composto de
teste (ou tampão de ensaio; ou seja, amostra em branco), então 10 µL de
BACE-1 (1 Unidade/mL) foram adicionados para iniciar a reação . Após 60
min de incubação a 25°C, 10 µL de acetato de sódio 2,5 M foram adicionados
para parar a reação. O sinal de emissão foi monitorado em 576 nm. A
porcentagem de inibição foi calculada a partir de [1 ÿ (S60 ÿ S0)/(C60 ÿ C0)]
× 100, onde S0 e S60 são as intensidades de fluorescência da amostra de
teste (enzima, substrato, composto de teste) no início da reação e após 60
min, respectivamente, enquanto C0 e C60 são as intensidades de
fluorescência analógica da amostra em branco (enzima, substrato, tampão). Cada compo
O Inibidor BACE-1 IV (Cayman Chemical) foi usado como um composto de
referência. O ensaio ANOVA (análise de variância) foi realizado para avaliar
a diferença entre os grupos experimento e controle. A significância foi fixada
em p < 0,05.
4.2.2. Ensaio de viabilidade celular
As células de neuroblastoma SH-SY5Y foram cultivadas em meio Roswell
Park Memorial Institute (RPMI) suplementado com 2 mM de L-glutamina, 100
UI/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina e 10% (v/v) de soro fetal
bovino (FBS). As células foram mantidas em placas de cultura a 37°C em
uma atmosfera de umidade saturada contendo 95% de ar e 5% de CO2. As
células foram semeadas a uma densidade inicial de 104 células/cm2 em
placas de cultura. Em uma confluência de 80%, as células foram separadas
por tratamento com tripsina (0,25%) por 2 min, suspensas em meio fresco
sem FBS e transferidas para 96 multipoços (1 × 104 células/poço). Após 24
h da semeadura, as células foram incubadas na ausência ou na presença
das 3 concentrações diferentes (50, 150 e 450 nM) dos compostos 4-6,
donepezil e rotenona. A viabilidade das células foi avaliada após 48 h de
tratamento como atividade mitocondrial usando o ensaio MTT [45-47]. Resumidamente, a
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tratamento o meio foi removido e as células foram incubadas com
100 ÿL de MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio) (0,5 mg/ml) por 1 h. Em
seguida, a solução foi removida, o formazan formado solubilizado em 100 ÿl de HCl 0,1 N em 90%
(v/v) 2-propanol e a absorbância medida em 570 nm em leitor de microplacas (BioRad 680, EUA).
Os resultados foram expressos como valores de absorbância a 570 nm das células tratadas
versus células de controle.
4.3. Estudos de modelagem molecular
As estruturas 2D do composto 4 e donepezil foram construídas e convertidas para o 3D
usando o software vLife MDS 3.0. As estruturas 3D foram então minimizadas energeticamente até
o gradiente rms de 0,01 usando o campo de força CHARMM22. Todos os confórmeros foram
então minimizados energeticamente até o gradiente rms de 0,01. O software Molegro foi usado
para estudos de encaixe molecular e o software Lead IT foi usado para gerar poses de ligação 2D
do composto 4 e donepezil.
4.4. Permeabilidade da barreira hematoencefálica in vitro
A capacidade dos compostos investigados de penetrar na barreira hematoencefálica foi
avaliada usando um ensaio paralelo de permeação de membrana artificial (PAMPA) para barreira
hematoencefálica de acordo com o método estabelecido por Di et al. [35]. Donepezil e cafeína
foram usados como compostos de referência no ensaio PAMA. A microplaca doadora (placa de
filtro de 96 poços, membrana de PVDF) e a microplaca aceitadora (em placa de 96 poços
amassada) foram ambas obtidas da Millipore. A microplaca aceitadora de 96 poços foi preenchida
com 300 ÿL de PBS/EtOH (7:3) e a membrana do filtro foi impregnada com 10 mL de PBL em
dodecano (20 mg/mL). O composto foi dissolvido em DMSO a uma concentração de 5 mg/mL
seguido de diluição 50 vezes com uma mistura de PBS/EtOH (7:3) para obter uma concentração
final de 100 ÿg/mL. Depois disso, 200 ÿL de solução diluída e 300 ÿL de PBS/EtOH (7:3) foram
adicionados aos poços doadores.
A placa de filtro doadora foi colocada na placa de aceitação para fazer o lado inferior da membrana
do filtro em contato com a solução tampão. Após deixar este conjunto sanduíche por 16 h a 25°C,
a placa doadora foi removida e as concentrações do composto testado nos poços aceitador,
doador e de referência foram medidas com um leitor de placas UV. Cada amostra foi analisada
em três corridas independentes em quatro poços. Os valores de log D7.4 foram obtidos usando o
método do frasco agitado conforme relatado anteriormente [35].
4.5. Propriedade de quelação de metal
O estudo da quelação de metais foi realizado em metanol a 25 °C usando espectrofotômetro
SHIMADZU UV-vis com comprimento de onda variando de 200 a 500 nm. Os espectros de
absorção do composto 4 (25 ÿM, concentração final) sozinho ou na presença de CuCl2 (5-50 ÿM)
por 30 min em metanol foram registrados em células de quartzo.
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