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Microbiologia e Procedimentos de
Análise Microbiológica de Alimentos
Governador
Cid Ferreira Gomes
Vice Governador
Francisco José Pinheiro
Secretária da Educação
Maria Izolda Cela de Arruda Coelho
Secretário Adjunto
Maurício Holanda Maia
Secretário Executivo
Antônio Idilvan de Lima Alencar
Disciplina
Microbiologia e Procedimentos de Análise
Microbiológica de Alimentos
INDICE
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 15
4.2 PROCEDIMENTOS:...................................................................................................... 74
4.3 COLETA/TRANSPORTE/ ESTOCAGEM/ PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE ...... 76
Alimentos:
Fatores intrínsecos – características próprias do alimento;
Fatores extrínsecos – características ligadas ao ambiente do alimento.
Intrínsecos:
a) atividade de água (Aa; Wa);
b) acidez (pH);
c) potencial de oxi-redução (Eh);
d) composição química;
e) fatores antimicrobianos naturais;
f) interações entre microrganismos presentes.
Extrínsecos:
a) umidade;
b) temperatura ambiental;
c) composição química da atmosfera.
Importante: estes fatores podem ter efeito interativo.
1.1.2 pH
Há valores mínimos, ótimos e máximos. De modo geral pH neutro (6,5 - 7,5) é o
ideal. As bactérias não toleram grandes variações de pH; fungos e leveduras são mais
acidófilos. Em função do pH os alimentos são divididos em 3 grupos:
Baixa acidez pH acima de 4,5;
Ácidos pH entre 4,0 e 4,5;
Muito ácido pH abaixo de 4,0.
“Classificação baseada no pH mínimo para multiplicação e produção de toxina do C.
botulinum (4,5) e no pH mínimo para a multiplicação da maioria das bactérias”.
Em geral:
1- Frutas; refrigerantes; vinhos e vinagres deterioração em geral
devido a fungos e leveduras (pH < 3,5).
2- Carnes e pescados pH ideal para a proliferação de bactérias,
fungos e leveduras.
Carnes relação “stress” vs. Glicogênio.
Ação do pH adverso sobre o metabolismo dos microrganismos:
Em geral:
Vegetais +300 +400 mV;
Carnes
a) Grandes massas inteiras -200 mV;
b) Moídas +200 mV;
c) No abate +200; após 30 horas -250 (anaeróbios).
1.2 Extrínsecos
2
Mesófilos : 25o.C- 40o.C – ótimo 35o.
Termófilos: 40o.C a 60o.C – ótimo 55o.
2.1 Aplicabilidade
1 Introdução
A presença de microrganismos nos alimentos não significa necessariamente um perigo
para a saúde do consumidor ou uma qualidade inferior destes produtos. A maior parte dos
alimentos se converte em perigo potencial ao consumidor só depois de terem sido violados os
princípios elementares de higiene. Práticas consideradas de risco podem levar contaminações
ao produto final, podendo causar alterações de ordem sensorial, possibilitando a ocorrência
de toxinfecções alimentares.
Vários agentes causadores de doenças no homem podem ser transmitidos pelos
alimentos:
Produtos químicos (metais pesados, pesticidas);
Toxinas naturais de plantas e de animais (alcalóides, histaminas);
Vírus (hepatite, poliovirus);
Parasitas (amebas, helmintos);
Bactérias patogênicas;
Fungos toxigênicos;
Veremos a seguir, os microorganismos que, presentes em alimentos, podem ser
responsáveis pelo que denominamos “doenças microbianas de origem alimentar” ou
“toxinfecções alimentares”.
Embora as estatísticas brasileiras sejam precárias, acredita-se que a incidência de
doenças microbianas de origem alimentar em nosso país seja bastante elevada. Mesmo em
países desenvolvidos, nos quais o abastecimento de gêneros alimentícios é considerado seguro
do ponto de vista de higiene e saúde pública, a ocorrência de doenças desta natureza é
significante e vem aumentando, apesar dos avanços tecnológicos nas áreas de produção e
controle de alimentos. Nos Estados Unidos, estima-se que 24 milhões de casos ocorram por
ano, afetando, um em cada 10 habitantes.
Mecanismos de patogenicidade
Além das enterotoxinas, as cepas de S.aureus produzem várias outras toxinas, como
-toxina, -toxina, estafiloquinase, toxina do choque tóxico, etc. No entanto, apenas as
enterotoxinas não têm interesse em alimentos. Atualmente, essa denominação para as
enterotoxinas não é considerada a mais adequada, uma vez que os sintomas da intoxicação
parecem estar mais relacionados ao estímulo imunológico do que ao desequilíbrio eletrolítico
da mucosa.
As enterotoxinas são termoresistentes. Tal fator é especialmente importante para a
indústria de alimentos, porque a maioria dos alimentos processados sofre algum tratamento
térmico durante o processamento. Por exemplo, a pasteurização do leite destruirá o
microrganismo – S.aureus- mas não inativará a toxina, caso esteja presente.
Apesar das enterotoxinas não serem destruídas facilmente pelo calor, sabe-se que as
quantidades geralmente presentes em alimentos (0,5-10g/100g de alimento) envolvidos em
surtos de intoxicação são desnaturadas durante o processo de enlatamento. Isto, no entanto,
não é motivo para que os cuidados durante o armazenamento dos alimentos sejam
negligenciados, permitindo a sua produção antes do processamento.
Não existe concordância entre os vários autores sobre a quantidade mínima de
enterotoxina necessária para causar sintomatologia em seres humanos. De um maneira geral,
estima-se entre 0,015 e 0,37 g de enterotoxina por quilo de peso corpóreo. Características
individuais também devem ser levadas em consideração.
Medidas de controle
Como os estafilococos encontram-se amplamente disseminados pela natureza, torna-
se impossível a sua eliminação do ambiente.
A manipulação do alimento pelo homem, um dos reservatórios desta bactéria, já indica
uma provável contaminação. O aquecimento do alimento logo após a sua manipulação
destróis as células bacterianas e ajuda na prevenção da intoxicação. No entanto, se cuidados
apropriados não forem tomados após este aquecimento, o microrganismo poderá desenvolver-
se e produzir a toxina.
Para prevenir a intoxicação estafilocócica, é importante manter os alimentos
suscetíveis sob refrigeração. O resfriamento rápido de toda a massa alimentícia é uma das
medidas para a prevenção e controle desta intoxicação. Quando da impossibilidade destas
medidas, deve-se tomar cuidados especiais para se evitar a contaminação no preparo deste
alimento.
No caso de enterotoxinas, acredita-se serem necessárias entre 105 e 106 unidades
formadoras de colônias de S.aureus por grama do alimento para que a toxina seja formada em
níveis capazes de provocar intoxicação. Como normalmente, a bactéria encontra-se presente
em números baixos, é preciso que ocorra sua multiplicação. Ao controlar-se, portanto, fatores
que afetam o crescimento de S. aureus, a produção da enterotoxina também estará sendo
controlada e, conseqüentemente, os surtos de intoxicação.
Epidemiologia
C. botulinum encontra-se amplamente destribuído pela natureza, sendo o solo e o
ambiente aquático seu habitat principal. Vários trabalhos realizados em diversos países
indicam que o número de esporos de C. botulinum no solo pode ser bastante elevado.
C. botulinum do tipo A é o mais freqüente no oeste dos Estados Unidos e em países da
América Latina, como Argentina e Brasil. Os do tipo B são comuns no leste dos Estados
Unidos e na Europa. Entretanto, as cepas americanas são do tipo proteolítico (grupo I) e as da
Europa são não-proteolíticas (grupo II). O tipo E parece ser exclusivo do ambiente aquático,
sendo comum no Japão, na Suécia e na antiga União Soviética. Os animais sadios têm um
importante papel na distribuição dos esporos e tanto vertebrados como invertebrados contém
C. botulinum no seu conteúdo intestinal.
Listeria monocytogenes.
Características do microrganismo
Conhecido como microbiologistas há muito tempo, na área de Microbiologia
Veterinária. Porém, tornou-se um dos mais importantes patógenos veiculados por alimentos
na década de 80, devido a eclosão de diversos surtos de listeriose humana.
Apesar de na nona edição do Bergey s Manual of Systematic Bacteriology oito
espécie estarem relacionadas ao gênero listeria – L monocytogenes, L ivanovii, L. innocua, L.
welshimeri, L. seeligeri, L. denitrificans foi reclassificada como Jonesia denitrificans e,
recentemente, as espécies L. grayi e L. murrayi foram agrupadas em uma única espécie,
Listeria grayi. A espécie L. ivanovii, por sua vez, foi subdividida em duas subespécies: L.
ivanovii subsp. Ivanovii e L. ivanovii subsp. Londoniensis.
L. monocytogenes _ é um bacilo Gram (+), não formador de esporos, aneróbio
facultativo, móvel devido a flagelos peritríquios, apresentando movimento característico
denominado tombamento, que auxilia na sua identificação; apresente reação positiva para
catalase e negativa para oxidade.
L. monocytogenes apresenta crescimento na faixa de 25o.C a 44o.C, embora existam
relatos sobre o crescimento de 0o.C. Este microrganismo suporta repetidos congelamentos e
descongelamentos. O tempo de geração a 35o.C varia conforme o meio em que se encontra:
em leite achocolatado é de 0,65h, em creme 0,67 h e em leite desnatado e integral é de 0,69
hora. A 4o.C, esses tempos são de 1,34 a 1,56 dias em leite desnatado.
Embora o pH ótimo para o crescimento desta bactéria esteja entre seis a oito, ele pode
crescer em uma faixa maior, entre cinco a nove. Em meios de cultura, no entanto, já se
Características do microrganismo
Embora várias espécies de Campylobacter estejam associadas à doença, C. jejuni, C.
coli e C. lari (anteriormente denominado Campylobacter NARTC e C. laridis) são as
espécies mais freqüentemente isoladas em casos de gastrenterite humana.
Recentemente foi proposta a criação da família Campybacteriaceae para abrigar as
inúmeras espécies de Campylobacter. Entre suas principais características destacam-se: forma
de bacilos curvos, espiralados, muito finos e compridos (0,2 a 0,5 nm de largura e 0,5 a 5nm
de comprimento), Gram (-), móveis com único flagelo polar que apresenta de duas a três
vezes o comprimento da célula. O flagelo é responsável pelo seu movimento característico em
saca-rolha ou em vaivém. Não formam esporos e culturas de vários dias adquirem morfologia
cocóide. Não fermentam nem oxidam açucares, obtendo energia a partir de aminoácidos ou de
componentes intermediários do ciclo do ácido tricarboxílico. São oxidase positiva e redutores
de nitrato. As espécies C. coli e C. lari são bastante semelhantes a C. jejuni, sendo a
diferenciação entre elas baseada apenas em testes bioquímicos.
A característica mais marcante do gênero Campylocacter é a microaerofilia,
requerendo tensão baixa de oxigênio para sua multiplicação. O crescimento é inibido quando
a concentração de O é menor que 3% e maior que 15%, sendo 5% a concentração ideal.
Além disso, são capnofílicos, ou seja, requerem cerca de 10% de CO2 para sua multiplicação.
C. jejuni, C. lari crescem em faixa estreita de temperatura, que varia entre 30o.C e
47oC, com um ótimo de 42o.C, razão pela qual são, muitas vezes, denominados
campilobacters termofílicos.
Essas bactérias são altamente sensíveis ao sal, sendo essa sensibilidade variável em
função da temperatura. Assim, não se multiplicam em meios contendo 2% de NaCl, quando
mantidos a 30o.C ou 35o.C A 4o.C, são sensíveis a 1% de NaCl. São também bastante
sensíveis ao pH ácido e à desidratação.
Características da doença.
3.7.1.1 Aflatoxinas
Dentre as micotoxinas, tem sido dado maior atenção às aflatoxinas, devido a sua
propriedade marcadamente hepatocarcinogênica e altamente toxigênica, existem 4 tipos de
aflatoxina, a B1 e B2, e a G1 e G2. Outros efeitos biológicos destas micotoxinas no
organismo são: teratogênia, atividade mutagênica, aberrações cromossomiais e
imunorreatividade. Sendo que a ação das mesmas pode alterar devido ao quadro nutricional,
principalmente se o indivíduo estiver em dificiência protéica.
Fungos produtores: por algum tempo jungou-se que o Aspergillus flavus fosse o único
fungo que produzia aflatoxina, mas sabe-se atualmente que existem mais espécies de
Aspergillus e mesmo outros gêneros produtores tais como; A.parasiticus (predominante em
países tropicais, é considerado um dos mais ativos), A.niger, A. oryzae, A.wentii, A. ostianum,
3.7.1.4 Fumonisinas
Um novo grupo de micotoxinas, isolado em 1988. Atualmente, existem 6 membros
distintos a FB1, FB2, FB3, FB4, FA1, FA2. Estas toxinas são produzidas por fungos do
gênero Fusarium principalmente F. moniliforme Sheldon, F. proliferatum Nuremberg e F.
subglutians.
Sua ocorrência em alimentos, principalmente em milho, tem sido relacionada a
doenças fatais em animais, em humanos seu efeito tóxico mais comum é o câncer de esôfago.
3.8.2.1 Hepatite A
O vírus da hepatite A é um vírus RNA de fita simples, pertencente ao grupo dos
enterovírus. A hepatite A, anteriomente denominada hepatite infecciosa, transmite-se pela via
fecal – oral, sendo a água e os alimentos contaminados os principais veículos durante as
epidemias. Entre os alimentos merecem destaque os moluscos bivaldes, que podem
contaminar-se durante seu cultivo em águas contaminadas. O consumo de moluscos crus tem
sido incriminado em diversos casos de hepatite A, assim como saladas cruas. Na hepatite, o
vírus atinge a mucosa intestinal e passa para o fígado pela via sanguínea do sistema porta. As
lesões hepáticas consistem em necrose celular do parênquima hepático, proliferação nas
células de kupfer, com acúmulo de macrófagos, linfócitos e leucócitos não áreas de necrose.
O período de incubação varia de dois e seis meses. Os pacientes mantêm sua capacidade
infectante durante um período de duas a três semanas antes do aparecimento de icterícia
(acúmulo de bilirrubina no sangue, responsável pela coloração amarelada da pele dos
doentes), e duas semanas após a regressão deste sintoma. O vírus da hepatite A tem elevada
resistência ao calor, suportando temperaturas de 60o.C por meia hora.
4.2 PROCEDIMENTOS:
1- Descontaminação e descarte de resíduos contaminados
i) Submeter todo o material à esterilização em autoclave a 121o.C, por 30 minutos
observando-se os seguintes cuidados:
1. Afrouxar as tampas de todos os frascos com tampa de rosca
2. Adicionar água ou solução detergente aos estojos de descarte de pipetas, para
amolecer os resíduos e facilitar a posterior remoção.
2- Lavagem
1- Usar detergentes aniônicos, com compostos alcalinos; em casos
especiais utilizar agentes mais fortes como solução sulfocrômica, constituída de
ácido sulfúrico e dicromato de potássio, e a solução alcoólica 1N de hidróxido de
sódio.
4- Esterilização
1- Não trabalhar com autoclaves excessivamente cheias.
2- As pipetas deverão ser esterilizadas em autoclaves.
3- As tampas dos tubos de ensaio deverão ser afrouxadas durante a
esterilização e após o término, deverão ser completamente fechadas.
4- Na esterilização de vidraria vazia em autoclaves é recondável liberar
o vapor imediatamente após o término do tempo de esterilização.
Caso tenha sido utilizada mais de uma placa por diluição (duplicata ou triplicata),
considerar como número de colônias a média aritmética da contagem obtida em cada uma das
placas duplicata ou triplicata (exemplo 2). Usar notação exponencial e apenas uma casa
decimal depois da vírgula, na apresentação dos resultados.
Procedimentos
Análise de alimentos em geral (ABNT, 1991, VANDERZANT, SPLITTOESSER eds.,
1992)
a)Preparação das amostras e diluições seriadas: Seguir os procedimentos descritos no
item de Recepção e preparação das amostras para a análise.
GORGAUD, L. Microbiologia prática. Editora Edgard Blucher Ltda, São Paulo, 1975.
Terra adorada,
Entre outras mil,
És tu, Brasil,
Ó Pátria amada!
Dos filhos deste solo és mãe gentil,
Pátria amada, Brasil!