Livro - Métodos para Análise de Alimentos 2 Edição

M
Metodos pam
ATalTse deAlimetos
INCT CIENCIAANMAL
2a Edição
Métodos para Análise de
Alimentos
2 edição
INSTITUTO DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE3

CIENCIA ANIMAL
Organizadores
Edenio Detmann
Luiz Fernando Costa e Silva
Gabriel Cipriano Rocha
Malber Nathan Nobre Palma
João Paulo Pacheco Rodrigues
2021
INCT Ciência Aninmal
Exemplares deste livro podem ser adquiridos na:
Livraria UFV on-line

www.editora.ufv.br
Televendas: (31) 3612-2064/2067
Diagramação e Montagem:
Edson Agostinho Pereira: 31 3612-4623
Ficha catalográfica preparada pela Seção de Catalogação e
Classificação da Biblioteca Central da UFV
Métodos para análise de alimentos/Organizadores Edenio

Detmann... [ et al.]. - 2. ed.-Visconde do Rio Branco,
M593
2021 MG: Suprema, 2021.
350p.:il.;21cm.
ISBN 978-65-995122-2-3
Inclui bibliografia.
1. Nutrição animal. 2. Animais-Alimentos. 3. Alimentos-

Qualidade. I. Detmann, Edenio, 1974-. II. Silva, Luiz
Fernando Costa e, 1985-. 1I. Rocha, Gabriel Cipriano, 1983-.
V. Palma, Malber Nathan Nobre, 1990-. V. Rodrigues, João
Paulo Pacheco, 1988-. VI. Universidade Federal de Viçosa.
Departamento de Zootecnia. VII. Instituto Nacional de
Ciencia e Tecnologia de Ciência Animal (Brasil).
CDD 22. ed. 636.08552
Bibliotecária responsável: Renata de Fátima Alves CRB6/2578
E permitida a reprodugäo parcial desde que citada a fonte.
2
Métodos para Análise de Alimentos-2" Edição

Alimentos
2 ediçãoo
Organizadores
Edenio Detmann Luiz Fernando Costa e Silva
Zootecnista, M.Sc., D.Sc Zootecnista, M.Sc., D.Sc.
Professor Titular, DZO-UFV Research Manager
Pesquisador 1A do CNPq Alltech
Pesquisador do INCT-Ciência Animal
Malber Nathan Nobre Palma Gabriel Cipriano Rocha

Zootecnista, M.Sc., D.Sc Zootecnista, M.Sc., D.Sc
Bolsista PNPDICAPES
Professor Adjunto, DZ0-UFV
DZO-UFV Pesquisador do INCT-Ciência Animal
João Paulo Pacheco Rodrigues

Zootecnista, M.Sc, D.Sc
Professor Adjunto, UNIFESSPA
Pesquisador do INCT-Ciência Animal
2021
3
INCT Cência Animal
"But man does not limit himselfto seeing; he thinks and insists on learning the
meaning of the phenomena whose existence has been revealed to him by
observarion. So. he reasons, compares facts, puts questions on them, and by the
answers which he extracts, test one by another. This sort ofcontrol, by means of
reasoning andfacts, is what constitutes experiment, properly speaking; and it is
the nature of things outside us.
In the philosophic sense, observation shows, and experimemt teaches."
Claude Bernard
(1813-1878)
Métodos para Análise de Alimentos -
2" Edição
Prefácio
(Primeira Edição)
Após um "longo e tenebroso inverno", Conseguimos
disponibilizar a primeira edição dos Métodos para Análise de Alimentos
do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Ciência Animal (INCT
CA).
Durante o estabelecimento do INCT-CA definiu-se como uma
de suas metas prioritárias a criação de uma Rede Nacional de Pesquisa

em Avaliação e Análise de Alimentos. O intuito primário deste ato
calcou sobre a real necessidade de se conhecer como as diferentes
instituições avaliavam os alimentos e como se podería, da melhor forma

de
possível, contrastar ou cotejar com exatidão e precisão os resultados
experimentos obtidos em diferentes instituições.
Em um primeiro momento de avaliações descobrim0s que
estávamos falando línguas bem diferentes e que necessitávamos
estabelecer um idioma comum para que nossa comunicação se tornasse
mais próxima do universal. Assim nasceu a idéia deste manual.
Durante o período em que o mesmo foi elaborado, muitas
avaliações conjuntas foram novamente realizadas, nas quais pudemos
aproximamos mais de um "idioma analítico" comum.

perceber que nos
Contudo, muito ainda precisa ser percorrido.

Parte dos parâmetros analíticos de alimentos presentes neste
manual não pôde ser adequadamente avaliada em ensaios de variação

5
INCT Ciêncio Animal
interlaboratorial. Isto constitui uma meta da Rede de Avaliação de

Alimentos. Assim, algumas decisões que resultaram no estabelecimento
de padrões de procedimentos foram estabelecidas com base em
experimentos conduzidos em uma única instituição ou, em pequenos

pontos, na experiência pessoal de membros do INCT-CA. Contudo, em
um futuro
próximo, desejamos que isto não seja mais do que história, pois
almejamos a avaliação científica/empírica de tudo o quanto aqui se expõe,
além da expansão do domínio de métodos abordados e divulgados.
Desta forma, estabelece-se claramente que esta primeira versão
constitui somente um chamamento usuários da análise de alimentos.
aos
Apliquem os métodos aqui estabelecidos. Identifiquem seus equívocos e

suas deficiências. Comuniquem ao INCT-CA. Identifiquem os métodos
que não foram, mas que deveriam ter sido abordados. Juntos, poderemos
trabalhar para que este manual possa se tornar uma referência de comum
acordo com todos aqueles que necessitem ter a análise de
alimentos como
ferramenta básica para o desenvolvimento de suas atividades de ensino,
pesquisae extensão.
Os Organizadores
6
N
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição
Prefácio
(Segunda Edição)
Após quase dez anos, não sem muito trabalho, conseguimos
disponibilizar a segunda edição do "Métodos para Análise de Alimentos"

do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Ciência Animal (INCT
CA).
Durante esse tempo,1 percebemos os erros cometidos na primeira
edição e tentamos, na medida do possível, corrigi-los e aperfeiçoar as
informações que disponibilizamos anteriormente.

Podemos assumir, sem grande culpa, que esse aperfeiçoamento
não foi fácil. Muitos assumem que o trabalho na área de análise de
alimentos é muitos simples, pois restringe-se ao laboratório. Ledo
engano. Muito foi feito, destacando-se o esforço de muitos estudantes de

graduação e pós-graduação e bolsistas de pós-doutoramento.
Certamente, a perfeição não atingimos. Contudo, coletivamente,
alcançamos algo maior do que o que foi atingido na primeira edição.
Melhorias sempre. A perfeição, infelizmente, nunca será alcançada.
Contudo, esperamos que a nova edição do Métodos para Análise de
Alimentos do INCT-CA venha minimizar as dificuldades que possam
existir nos laboratórios de análise de alimentos para animais das
instituições brasileiras.
Muitos dos métodos com os quais trabalhamos constituem
Nesses casos,
métodos empíricos, os quais definem os resultados per si.
7
N
INCT Ciencia Animal Métodos para Análise de Alimentos -2" Edição
seguir uma
linguagem comum é fundamental para que
conversar entre nós e
possamos
projetar algo maior que a simples soma das Agradecimentos
partes.
Esperamos que a revisão e ampliação da primeira
ediço possa Ao Instituto Nacional de Ciência
abranger algo maior do que fizemos há nove anos. No e
Tecnologia de Ciência
entanto, as críticas
esugestões continuam bem vindas para que, em uma terceira Animal (NCT-CA), pelo suporte financeiro e físico dado para a
edição,
possamos nos
aproximar ainda mais do elaboração dos estudos, das reuniões de trabalho e para a
execução de
objetivo de uma
linguagem
comum. ações que culminaram com a feitura deste manual.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e
Cordialmente, Tecnológico (CNPg), pelo constante apoio financeiro na forma de bolsas

de pesquisa e de
financiamento direto para a realização de ações
pertinentes às informações geradas para feitura deste manual.
Edenio Detmann
Coordenador da Rede de Avaliação de Alimentos A
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais
(FAPEMIG), pelo apoio financeiro na forma de bolsas e de
INCT-CA
financiamento direto para condução de ensaios laboratoriais.
A CAPES, por prover bolsas de estudo
para estudantes de pós-
graduação, bolsas de pós-doutoramento (PNPD) e recursos financeiros,
sem os quais muito do que aqui é apresentado não poderia ter sido
realizado.
Ao Departamento de Zootecnia da Universidade Federal de
Viçosa, por ceder suas instalações para realização de grande parte dos
testes laboratoriais necessários para ajustamento de métodos de análise de
alimentos.
As instituições componentes da Rede de Avaliações de
8 Alimentos do INCT-CA, por aceitarem o desafio e participarem nas ações

9
Métodos para Análise de Alimentos 2"
INCT Ciência Animal
-
Edição
que culminaram nesse manual. Nossos enos nos mostraram a necessidade Codificação INCT-Ciência Animal
de encontrar um caminho conum. Esse foi nosso grande estorço e nossa
grande contribuição. A codificação dos métodos estabelecidos para análise de

Aos pesquisadores ligados ao INCT-CA, por contribuírem para alimentos segue o que foi estabelecido na primeira
edição do Manual. O
a condução de ações pertinentes à elaboraço deste manual. N objetivo principal da mesma é de estabelecer uma linguagem universal
Aos Drs. Luiz Femando Costa e Silva, Gabriel Cipriano Rocha, para todos aqueles que desejarem aplicar fundamentos aqui
Malber Nathan Nobre Palma e João Paulo Pacheco
Rodrigues, que
N os
estabelecidos e, quando necessáio, referencia-los em relatórios e artigos

atuaram como bolsistas de pós-doutoramento CAPES/PNPD ligados cientifico.
diretamente à elaboração da segunda edição deste Manual. A interpretação do código dos métodos de análise de alimentos é
A todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a exposta a seguir.
concretização deste novo esforçn e que, por motivos alheios à nossa
vontade, não foram citados aqui nominalmente. Estrutura do Código: Método X-YYY/Z
Campo X
Muito Obrigado! Estabelece qual a área em que o método específico se enquadra
dentro da análise de alimentos
Código de Area Area

G Métodos de anáises gerais
N Métodos de análises para compostos
nitrogenados
F Métodos de análises para compostos fibrosos
M Métodos deanádises paracompostos minerais
10 11
INCT Cineii Anima Métodos para Análise de Alimentos - 2"
Edição
Campo
Sumário
Estabelece o número do método dentro de cada
área para Capítulo Tema
INCT-CA.
o
Página
1 Obtenção e processamento de amostras 15
Campo Z **************
2 Secagem definitiva e matéria seca. 55

Estabelece qual aversão do método
******** **********
que está sendo exposta

Todos os métodos constantes na Matéria mineral. ******** ************************
65
primeiraediçãodeste Manual foram
identificados nesse campo pelo número "1", Nitrogênio (proteínabruta). *************** *** *** 75
pois constituíam a primeira 97
versão do método em si. Para Frações nitrogenadas proteica e não proteica . *******
aqueles que sofreram alterações, o valor do

107
campo Z foi alterado sequencialmente (vide, quando cabível, seção Gordura bruta..
1 Fibra 127
"Aualizações" em cada Capítulo). *********** ***********************************
8 Amido... ** * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 173
9 Carboidratos não fibrosos e matéria orgânica

185
residual. ************°******
10 Lignina .******************************************************
. 203
231
11 Fibra indigestível. ****************************** *********
249
12 Solução mineral ***************"°***********"**************
259
13 Fóstoroinorgânicototal. ******* *** ****°**
*********
269
14 Cromo..
L. 285
15 Nitrogênio amoniacal em tluidos biológicos..
301
16 Titânio .
Digestibilidade n vitro da maténa seca para
17 * * * * * * * * * ° * * * * * * * * * * * * * *
313
ru ntes .
Protocolos para condução de

ensaios de degradação
18 329
in situ em ruminantes . .
2 13
Métodos para Análise de Alimentos-2" Ediçäão
Capítulo 1
Obtenção e processamento de amostras
Definições básicas em amostrageme inferência em alimentos
A análise de alimentos constitui área relevante no ensino das
Ciências que estudam alimentos, pois fornece ferramentas e subsídios
para vári0s segmentos do controle de qualidade, do processamento e
do armazenamento, além das informações básicas acerca de seu
potencial e efetividade de utilização por animais e humanos.

Nesse ramo do conhecimento so estudados os alimentos; sua
composição química; sua ação no organismo; seu valor nutritivo

(algumas vezes também o valor alimentício); suas propriedades
fisicas, químicas, microbiológicas, sensoriais, toxicológicas; e
também adulterantes, contaminações, fraudes, etc. Assim, a ciência
análise de alimentos relaciona-se com tudo aquilo que, de alguma

forma, éalimento para os seres humanos e animais, desde a produção,
coleta e transporte da matéria-prima, até a venda como alimento
natural ou industrializado. Também é função da análise de alimentos

verificar se o alimento se enquadra nas especificações legais,
detectando a presença de adulterantes e aditivos prejudiciais à saúde.

Em resumo, relaciona-se com todos os diferentes aspectos que
envolvem um alimento, permitindo juízo sobre a qualidade do mesmo.
15
INCT Ciéncia Anima Métodos para Análise de Alimentos-2 Fdição
Em termos inferir
Nesse sentido, os alimentos devem ser submetidos a análises gerais. significa tirar conclusão. Estatisticamente, a
de controle de inferéncia conecta dois elementos chave processo de

qualidade e
composiçâo química, as quais sâo
no
avaliaçäo de
igualmente importantes na contabilização de propriedades nutritivas dados: a

população ea amostra. Segundo definições da ABNT (2010).
particulares. Assim. essas análises represcntam complementos
a populaçãco consiste da totalidade dos itens considerados, ao passo
importantes aos ensaios de alimentação. aos experimentos nutricionais que a amostra corresponde a uma das partes individuais em que uma
(Van Soest. 1967). à indústria sistemas de população é dividida. Assim, em termos gerais. a população constitui
e aos
produção.
Para controlar a qualidade dos alimentos e o todo, sendo a amostra uma fração deste. Para a realizaçio segura do
aceitação dentro de
limites satisfatórios, torna-se importante monitorar as processo de inferència faz-se necessárno que a fração (amostra) seja
características
das matérias-primas. ingredientes, dietas e alimentos um representante fidedigno de todas as caracteristicas do todo. pois
processados.
Isso pode ser feito através da avaliação de todos os alimentos ou isso possibilita que. ao entendermos a fração. podemos concluir (i.e..
ingredientes de um lote específico, o que, no entanto, além de inferir) sobre o todo. Em estatistica, chamamos essa caracteristica de
impraticável. inviabilizaria sua utilização posterior. Assim, o caminho representatividade. Por sua vez, a representatividade. em análise de
factível consiste em selecionar uma porção do produto total e assumir alimentos, é denominada de integridade de analito. a qual. portanto.
que a qualidade da porção selecionada é representativa de todo o lote indica a qualidade da amostra tomada do todo.
(Proctor & Meullenet. 1998). Esse procedimento é denominado de O termo populaçio, em análise de alinentos, não faz muito
amostragem. sentido, u a vez que nem sempre desejamos inferir sobre todo o milho
Assim, por definição, ou tarelo de soja existentes, mas apenas sobre lotes especiticos
a amostragem é o conjunto de operações
com quais obiém, do material estudo, utilizados determinado momento e/ou local. Assim,
os se em uma porção dquiridos ou em
relativamente pequena, de tamanho apropriado para o trabalho no o "todo" em análise de alimentos constitui um conceito populacional
laboratório, mas que ao mesmo tempo represente corretamente todo o mais restrito, sendo denominalo de unidade
de decisão, a qual
conjunto da amostra (Cecchi, 2003). partir do qual uma amostra é coletada e ao qual
representa o ateral a
A resultante do processo de amostrugem de alinentos uma interencia deve ser projetada. A unidade de decisão pode ser
constitui em habilitar o analisla a rcalizar um processo de inleréncin.
17
INCT Cn ii Animal todas para Ariip d Aiimernting
fri
veres,
onstituida por uma carrcta de gråo ou farelo, um silo, a enreçio feal desavisadamente, ohserv.amos resultados
que julgamos nO
total de um animal. um lote de feno, um piquete solb pastejo, cte. Condizentes e.
instintivamente, qualificamos como resultante
os
de
Nesse contexto, o processo de amostragem de alimentos se crros no método de análise
(e.g.. imprecisio do analista.
resume em tomar uma parte da unidade de decisão que preserve a no
"problemas"
cquipamento elou reagentes). Contudo, erro
global de estimaçã0
o
integridade de analito. ou seja. que preserve a earacterística ou representa mais do que isso. pois possun dois
componentes distintos
concentração do objeto de interesse como encontrada na unidade de (Figura 1.). O primeiro componente e. infelizmente.
algumas vezes
decisão. julgado como único, é o erro analitico total.
que representa a soma
Contudo. o conccito de amostra em análise de alimentos de todas asinterferèncias geradas pelo método de análise em sie todos
possui algumas diferenças marcantes em relação ao que ocorre na os elementos envoltos em sua
aplicaçio (e.g.. preparo de reagentes.
estatística. Em muitas situaçõces de análise de dados, as amostras manutenção e operação de
equipamentos; treinamento, pericia e zelo
finitos que, devido tratamento do analista).
produzem conjuntos numéricos após o
matemático/probabilístico. produzem os elementos que suportam a Todavia. o erro global de estimação é também atetado pelo
inferéncia. No entanto, na análise de alimentos a amostragem não é erro total de amostragem (Figura 1.),
qual representa o erro
o
estática como na simples avaliação de dados. O processo de cometido durante qualquer estidio da
reduçào de massa que causa
amostragem em análise de alimentos é dinâmico e formado por desvios na
integridade de analito da amostra avaliada em relaçdo à
diversas instáncias, iniciando-se na unidade de decisão e terminando unidade de decisdo. Com grande
probabiliukade, o erro total de
no momento da análise em si. Cada ctapa é crucial para manutenção amostragem intluencia mais o erro global de estimaçdo do que o erro
de imputar diferentes erros sobre analitico total. Dois
da integridade de analito e passível prineipais moüvos suportam tal atirmativa. Em
o resultado final. primeiro lugar, o erro total de amostragem representa um processo
Quando obtemos um resultado em laboratório, esse vemn
continuo composto por várias etapus, as individualmente, erros
quais,
a
acompanhado de um erro global de estimação, que representa poem ser cometidos e. consequentemente. propagados (Figura l.2).
divergéncia entre o valor da característica ou concentração expresso m segunko lugar, os erus de anwstragem são, em sua grande
amostra e o valor real concernente à unidade de decisdo, Muitas iwr, uegligenciaules e. por isso, polem agir silenciosamente sobre
pcla
J8
INCT Ciência Animal Meodos pra Analise de
Alimentos 2" Ediçio
o ero
global de
estimação. Se um ero analitico ocorrer.
podemos
repetir a anáise. Se um ero de
amostragem ocorrer, na maioria Erro Global de
massiva dos casos, não há retorno,
pois as unidades de decisão ficar:am
Estimação
no
passado e não há como re-amostrá-las.
Dessa forma. o conceito de amostra
representativa em análise
de alimentos é essencial e, em si, Erro Total de Erro Analitico
plural, pois percorre dinamicamente
um
processo longo e melindroso a fim de preservar Amostragem Total
a
integridade de
analito.
A primeira instância do processo de
amostragem resulta na
amostra primária, Erros devidos a Erros não devidos a
qual é
formmada por diferentes incrementos
a
processos de seleção processos de seleção
tomados da unidade decisão de acordo
com um
protocolo
de
amostragem. Por
definição, um incremento é a porção individual de
material coletada por uma
operação de amostragem simples que, emn Figura 1.1. Erro global de estimação e seus
componentes (Adaptado
conjunto, compõem a amostra primária. Por exemplo, em uma carreta de AAFC0, 2015; 2018).
de grãos, o incremento representa cada ponto de amostragem de um
calador de Comumente, a amostra primána possui massa superior
parede dupla. A amostra formada por todos de
ao
os
pontos necessário para envio ao laboratório. Nesse ponto introduzimos dois
amostragem constitui a amostra primária. O mesmo raciocínio é feito conceitos. Primeiro, o de amostra laboratorial, que representa
para pontos de amostragem em uma fatia de um silo ou em amostras o
material enviado e/ou recebido

fecais pontuais (i.e., amostras grab) em um animal em experimento de
ao
pelo laboratório. Essa amostra
normalmente representa uma amostra dividida, indica
metabolismo. a qual um
porção da amostra primária obtida sem nenhum viés. As operações de
divisões de amostras visando à manutenção da

integridade de analito
são normalmente denominadas de
quarteamento.
20
21
INCT Ciência Animal Mélodos para Análise de Alimentos - 2" Edição
A amostra laboratorial nem sempre poOssui características que Resultado da Análise Erro Analitico
a habilitam à análise. Assim, a mesma deve passar por
processamento
físico (i.e., secagem parcial e/ou
moagem) que a adeque para a análise.
Desse processo,
Porção Teste
produzimos a amostra analítica.
A amostra analítica, por sua vez, fornecerá pequenas alíquotas
que serão submetidas à análise Amostra Analítica
em si, asquais são denominadas de
porções teste. No momento em que uma porção teste é selecionada
(e.g., uma alíquota de 200-300 mg da amostra analítica para

avaliação Amostra Laboratorial
da concentração de nitrogênio), o processo de amostragem é
encerrado. Isso evidencia que a
amostragem em si constitui processo 1
contínuo, com múltiplos estádios e que, em cada estádio, erros podem Amostra Primária
ser cometidos os
quais comprometerão a integridade de analito, o
processo de inferência e a confiabilidade dos resultados. Logo, atribuir
Unidade de Decisão
aos erros analíticos a ampla responsabilidade por resultados julgados
como não condizentes pode ser uma atitude não tão racional assim. Figura 1.2. Fluxograma de influência de erros e da realização de
inferência em análise de alimentos (setas azuis indicam a
realização de inferência; setas vermelhas constituem ação
de erros de amostragem, a seta negra indica a
interterência causada por erros na análise em si).
Além das definições de amostra que seguem a dinâmica do
processo de amostragem (Figura 1.2). existem definições adicionais

de amostra que devem fazer parte do vocabulário do analista de
alimentos. São essas: amostra dividida, amostra replicada e
amostra composta. O conceito de amostra dividida foi previamente
22 23
Mélodos para Análise de
INCT Ciencia Animal Alimentos - 2" Edição
n a amostra
discutido. Amostras replicadas significam frações de uma amostra composta. Nesse cas0, OS incrementos (e.g.. pontos
colcta cm uma carreta de
tomadas sob condições comparáveis em qualquer ponto do pucesso farelo) devem ser
equivalentes; ou seja.
devem apresentar o mesmo
de amostragem. Esse conceito é comumente aplicado em duas peso na
formação da amostra
composta
instancias área de
i.C., a amostra primária).
em nossa
atuação. Primeiro, quando envia-se uma
amostra laboratorial, é prudente Contudo, a formação de amostras compostas nem
que uma contra-prova seja sempre
armazenada no local de origem. para os casos de perda da amostra segue esses preceitos. Um
exemplo simples pode ser construído a
laboratorial no transporte ou contestação dos resultados obtidos. Em partir da coleta fecal de ruminantes
experimentos
em de metabolismo.
segundo lugar. quando realizamos repetições em laboratório, Caso procedamos à coleta fecal pontual (i.e. amostras grab, tomadas
em
pressupõe-se que cada porção teste represente uma amostra replicada pequenas frações em momentos especificos). nossa amostra
da amostra analítica. composta deverá ser equivalente à cada coleta (nesse caso,
O conceito adicional final de amostra é o de amostra comumente, a amostra composta será formada por massa iguais de
composta, o qual constitui aquela amostra que, em qualquer instância amostra seca ao ar tomadas em cada tempo de amostragem). Por outro
do processo de amostragem, é obtida pela mistura de amostras antes lado, caso realizemos coletas totais de fezes durante três ou mais dias,
da análise si, objetivos de eficiência analítica a amostra composta será formada por alíquotas proporcionais a cada
em com ampliar a (i.e.,
reduzir custos ou o número de procedimentos analíticos). A dia. Em outras palavras, para os dias de maior exereção, a alíquota
interpretação incorreta do conceito de amostra composta constitui componente da amostra composta deverá ter maior peso na amostra
algumas vezes um comprometimento primordial do processo de final. Isso éé o que denominamos de amostra composta proporcional
inferência, sobretudo quando sua aplicação compromete o conceito de aos seus incrementos.
unidade experimental. Isso não deve ocorrer e atenção deve ser Considerando que a amostragem constitui processo contínuo
dirigida a isso. com múltiplos estádios. os erros se manifestarão de forma plural
Dessa forma, o conceito de amostra composta deve ser durante sua execuç+o. De tornma geral. os erros de amostragem se
aplicado corretamente. Com um raciocínio simples, entendemos que enquadrarão em dois grupos principais: serão ou não causados por
uma amostra primária, ao ser formada por incrementos, compreende processos de seleção de elementos (Figura 1.1).
24
INCT Ci nia Animal
Mctodos para Analise de iunentos c
Por definição, elementos são os componentes indivicduais quc
formam um dado material. podendo ser
Erros devidos|
gràos ou partículas para |a processos de
materiais sólidos. moléculas para materiais
líquidos ou uma mistura
seleção
de ambos para materiais
pastosos. Os materiais podem ser
Erros
classificados como materiais de elementos finitos Erros
ou infinitos. Os Aleatórios Sistemáticos
primeiros são formados por elementos que podem ser identificados e
selecionados individualmente ao acaso, como o caso de lotes de grãos Erro Erro por
integrais ou frutos. Os segundos, por sua vez, sâo formados por fundamental delimitação del
de
elementos que näo podem ser identificados e selecionados incremento
amostragem
individualmente ao acaso, como o caso de farelos, materiais em pó ou Erro por
material líquido, como óleos e outros líquidos (e.g., leite, urina, Erro por extração de
agrupamento incremento
melaço líquido). e segregação
A partir dessas definições, estabelece-se que os erros Erro na
associados a processos de seleção decorrem de equívocos ou ponderação de
incrementos
influências na retirada dos elementos de um material. Esses erros
Figura 1.3. Erros de amostragem devidos a processos de seleção e
podem ocorrer de forma aleatória ou sistemática (Figura 1.3). seus componentes (Adaptado de AAFCO. 2018).
Os emos aleatórios são aqueles que ocomem causas

por
inprevisiveis e que fogem ao controle do analista. Resumidanmente, isso
indica que um ineremento ou porção teste analisada terà uma
L
caracteristica ou valor diterente do incremento ou porção teste anterior
(conceitos adaptadosdeJCGM, 2008; INMETRO, 2014). Cada novo erro
aleatório poderå possuir módulo e/ou direção totalmente diferente do
26 27
1étodos para Análise de
Al1mentes-2 Edi
ometido no ineremento honogeneos. Uma mistura concentrada contendo farelos e grios inteios
ou
ponçåo teste que v poccdeu, Como såo
caractenisticos de cada avaliação, apereepydo do emo aleatório é dada por ou uma
silagem de milho possuem alta heterngeneidade de composição,
medidas de variabilidade (c.g.. variância pois seus clementos variam muito entre si.
amostral). Quanto maior o eo
aleatório, menor será a precisão do Adicionalmente, existe a heterngeneidade de distribuição. a
processo ou da análise.
Por outro lado, os emos sistemáticos qual se origina da distribuição não-aleatóra (embora incorra em erro
se manifestam de forma
constante sobre incrementos, anmostras alcatório) espacial e/ou temporal dos elementos dentro de uma unidade
e porções teste, fazendo com que
todos os resultados obtidos de decisão. A
se
desloquem em mesmo sentido e módulo heterogeneidade de distribuição espacial ocorme, por
em relação à característica ou à concentração real. Esse deslocamento é exemplo, quando transporta-se uma carga de gräos ou farelos em caretas.
também denominado viés. Em boa Com a trepidação durante o transporte, diferentes estratos horizontais são
parte dos casos, os erros sistemáticos
possuem causa conhecida. o que pemite que sejam corigidos com
fomados. Partículas menores e mais densas se concentram na parte
reinamento, boas práticas ou, em último caso, por intermédio de fatores inferior da carga. ao passo que particulas maiores e menos densas
de começão. Contudo, a
questão parece complicada em
ser mais predominam no estrato superior. Com a estratificação horizontal. produz-
amostragem. pois equívocos nos procedimentos dependem imensamente se uma heterogeneidade de distribuição vertical. Por outro lado. a
do fator humano, o
qual nem sempre reconhece a realização de práticas heterogeneidade de distribuição temporal ocome. por exemplo, com o
capazes de incorrer em erros sistemáticos na

formaçãão das diferentes armazenamento de silagem de milho em longos silos trincheira. A
amostras. Quanto maior o erro sistemático, menor será a exatidão na forragem retirada na entrada do silo será diferente daquela retirada no
expressão final de uma característica ou concentração. centro ou na parte posterior. pois foram depositadas em momentos
Os eros aleatórios devido à seleção de elementos ocorrem distintos (i.e., ficaram expostas ao ar por tempos diferentes, foram
basicamente devido à ocorrência de
heterogeneidades no material, as cortadas de campos distintos ou, se cortadas no mesmo campo, foram
quais ocorrem por dois motivos. A
heterogeneidade de composição cortadas em dias distintos).
origina-se de diferenças na composição entre elementos individuais em aleatório apresentado Figura l.3 é o erro
O primeirw emo na
uma unidade de decisão.

Materiais como farelo de soja, por tundamental de amostragem, o qual ocorme devido à heterogeneidade
exemplo,
possuem baixa heterogeneidade de composição, pois seus elementos silo
28
INCT Ciência Animal Alimentos -
2" Edição
O
segundo erro aleatório apresentado na Figura 1.3 é o erro
de composição da unidade de decisâo. Sua descrição quantitativa, dada
por
por intermédio de uma variância amostral, < (AAFCO, 2015; 2018): agrupamento e segregação, o qual decorre da
heterogeneidade de
distribuição dos elementos na unidade de decisão. De fornma
simplificada,
SEFA
HCxd sua
descrição quantitativa é dada por (AAFCO, 2018):
m
em que: s EFA = Variância do erro fundamental de amostragem; HC =

HD
EAS
n
heterogeneidade de composição; dnás = diàmetro máximo dos elementos;
e m= massa do incremento. em que: SEAS =

Vvariância do erro por agrupamento e
segregação;
Pela equação é possível deduzir algumas medidas a serem HD heterogeneidade
=
de distribuição;
e n número de increment0s.
=
adotadas no processo de amostragem em uma unidade de decisão. A aplicabilidade direta a ser retirada da
equação acima é: quanto
Primeiro, quanto maior a heterogeneidade de composição, maior será o maior a heterogeneidade de distribuição, maior deve ser o número de
ero aleatório passível de ocorrer. Para que um controle seja feito, duas- incrementos que comporão a amostra primária.
decisões podem ser tomadas. Primeiro, aumentar a massa de cada Os erros sistemáticos ligados a processos de seleção (Figura 1.3)
incremento na formação da amostra primária. Segundo, reduzir o podem ocorrer em três instâncias distintas, embora não haja pleno consenso
diâmetro dos elementos. Essa segunda medida nem sempre é possível na na literatura. A
primeira instância é denominada de erro na ponderação
prática, pois nem sempre é possível processar mecanicamente o material de incrementos, o qual resulta do uso de incrementos desproporcionais
antes da amostragem. A lógica dessa relação nos diz que seria mais (em massa ou volume) em relação a sua verdadeira importância em umna
adequado amostrar o milho moído em relação ao milho em gro. Se for amostra primária ou composta. A segunda instäncia é denominada de erro
factível, beneficios seriam obtidos em relação à precisão. Contudo, essa por extração de incremento, o qual resulta de remoção imprópria de um
equação nos será muito útil para justificar a aplicação do processamento incremento, resultando em perda de material durante a remoção. Por
mecânico ie., moagem) para formação de amostras analíticas e porções dtümo, temos o erro por delimitação de incremento, que é causado,
teste, o que veremos em um momento posterior deste Capítulo. principalmente, do uso de instnumentos de amostragem inadequados para a
situação em questão. Exemplos podem ser verificados em AAFC0 (2018).
30 31
INCT Cincia Aninat Métodos para Análise de Alimentos 2 Edição
de moinhos indevidamente
Por outro lado. todos os emos de limpos (ou não limpos) entre
amostragem que não cstão uma moagem e
assaciados outra.
a
praxessos de
seleção são de natureza sistenmática (Figura 1.4).
O primeiro desses é o erro de
integridade de analito, o qual resulta de
mudanças de concentração ou em características da amostra durante o Erros não devidos a
processos|
de seleão
processo de amostragem. Na nossa área de atuação a ocomência desse erro CEros sistemáticos)
é comum durante o
processanmento físico da amostra, notadamente durante
a
redução parcial da umidade de amostras. O uso de temperaturas
inadequadas (i.e., excessivamente altas) ou ambientes de secagem Erro por material estranho
inadequados (e.g., algumas vezes secagem em estufa, quando a
amostra/análise demanda liofilização) podem levar a alterações

Erro de recuperaçäo de
ireversíveis na amostra que comprometem a
integridade de analito. Perdas massa
por volatilização ou modificação das características químicas

por reações
não-enzimáicas são as causas mais comuns de
para o erro
integridade de Erro por introdução de
analito. contaminação
O erro
introdução de
por contaminação ocorre devido à
introdução não intencional de contaminantes, os quais podem incorrer em Erro de integridade de
anaito
concentração ou diluição do analito, introdução de materiais indesejados na
introdução de elementos causadores de interferências analíticas
amostra ou
Figura 1.4. Erros de amostragem não devidos a processos de seleção
de uma foma geral. Esse enro se assemelha à
contaminação cruzada em e seus componentes (Adaptado de AAFCO,
2018).
fábricas de rações e decorre, comumente, do uso de instrumentos de
amostragem utilizados sem a devida limpeza, o que carreia elementos de Por sua vez, o chamado erro de recuperação de massa decome
um da perda (mais comunm) ou ganho de massa de uma amostra durante o
processo para o outro. Outra forma comum de
imputar esse erro às
amostras Ocorre durante o
processamento mecânico da amostra com o uso processo de amostragem, afetandoa integridade tinal do analito. Na nossa
32
33
Mélodos para Análise de Alimentos 2"
INCT Cincia Animal -
Edição
area, é mais comumente cometido durante CSColha Como incremento, amOstra

esse erro o pocessamento
sua
primária passará a ter uma alta
mecânico das amostras. Moinhos mal conservados levam à perda de fração de material mofado. Durante o uso da silagem. possivelmente esse
material por trestas durante a moagem, a qual pode comprometer a
pequeno "pedaço" será desprezado. Por que inclui-lo na amostra?
integridade de analito. Por outro lado, processos de moagem mal Um aspecto final dos problemas associados à amostragem foi
principalmente pelo uso de tempo aquém do necessário, com devidamente abordado pela AAFCO (2015: 2018):
conduzidos os denominados
o aproveitamento apenas do material moído nos primeiros minutos, blunders. Esses correspondem a equívocos ou, algumas vezes. acidentes
causarão viés integridade do analito. Lembrem-se: amostras possuem

na que resultam em perda ou comprometimento da informação, os quais
heterogeneidade de composição. 0 fato de uma fração da amostra levar podem ocorrer em qualquer estádio do processo de amostragem (e.g.
mais tempo para moer, indica que na amostra existe uma quebra de frascos, rotulagem incorreta, erTOS de anotação, falhas de
estratificação
física (1.e., uma fração é mais resistente å moagem que outra). equipamento, escolha de métodos incorretos). Os blunders, por sua
Estratificações físicas são, na maioria massiva dos casos, decorrentes de natureza, não podem ser considerados na avaliaço do erro total de
heterogeneidades de composição causadas por características químicas. amostragem, devendo ser prevenidos ao máximo com o devido preparo e
Por fim, temos o erro por material estranho. Durante a retirada atenção do amostrador/analista e com cuidados em todos os procedimentos
de uma amostra é comum encontrarmos materiais estranhos que não Sua ocorência, pode, algumas vezes. comprometer todo o processo,
pertencem naturalmente à unidade de decisão. Esses materiais são levando à necessidade, se possível. de se repetir todo o processo de
normalmente desprezados no uso do material e, de certa forma, não amostragem.

possuem representatividade frente à unidade de decisão como um todo. No Um dos principais comprometimentos gerados pelos blunders
entanto, ao permitir que o mesmo componha, por exemplo, uma amostra ocoTe sobre a integridade de evidencia Essa representa a segurança que
primária, sua participação na amostra será indevida e exagerada, nenhuma evidência tenha sido perdida ou comprometida desde o processo
comprometendo a integridade de analito da mesma. Como exemplo, de amostragem até a obtenção de resultados analíticos. A integridade de
suponhamos que você esteja amostrando um silo trincheira. De frente para evidência possui ampla relação com aspectos éticos ou legais da análise de
a fatia, você se depara com um pequeno nicho de material mofado. Esse alimentos e sua aplicação busca assegurar a integridade da amostra desde
a
pequeno nicho não tem representatividade no silo. Contudo, caso você o numérica do resultado
construção de u a amostra primára até a expressão
34 35
Métodos para Análise de Alimentos -2" Edição
final AARO, 2015). Como resultados Wagner, 2015: Wagner & Ramsey. 2015). O primeiro conhecimento será
os
podem ser usados para
diferentes fins. conceito de acerca das
propriedades do material amostrado quanto à
o
integridade de evidência pode variar em
a ser sua
funão dos mesmos. heterogeneidade (de composição e de distribuição). 0 segundo

Os mateniais avaliados em análise de alimentos para aniais sâo conhecimento é denominado de critérios de qualidade de amostragem,
Cxtremamente plurais em natureza. origem, local e forma de
OS quais demandam do analista conhecimento claro do propósito da
amazenamento e finalidade de aplicação. Usamos forragens, concentrados amostragem e da qualidade necessária dos dados a serem produzidos. Com
e suplementos minerais: avaliamos alimentos ofertados e sobras; avaliamos a junção funcional de ambos conhecimentos. a teoria de amostragem é
digestas e fezes coletadas sob diferentes protocolos; monitoramos matérias aplicada, a qual fomecerá as ferramentas cientificas para realização de uma
primas produtos
e finais: tomamos amostras de sacos, carretas, silos amostragem capaz de preservar a representatividade da amostra. Contudo,
forrageirose graneleiros; etc. Dessa formna, seria

praticamente impossível deve ser ressaltado que a aplicação da teoria de amostragem produzirá
definir procedimentos de amostragem padrão em apenas um efeitos nulos caso o conhecimento sobre a heterogeneidade do material e
Capítulo deste
Manual. Embora sugestões gerais tenham sido Os critérios de qualidade de amostragem não sejam definidos e conhecidos.
apresentadas na primeira
edição do mesmo, o comitê organizador desta nova edição optou por A partir da fusão de todos os aspectos. o analista se tormará apto a definir os
removê-los e deixar a cargo do usuário a busca por protocolos de amostragem adequados (Figura 1.5).
protocolos de
amostragem adequados aos seus objetivos. Sugestões de procedimentos
amostrais podem ser encontrados, por exemplo, em Butolo (2002), FAO Processamento físico de amostras
(2004), SINDIRAÇÕES (2017) e AAFCO (2018), além de trabalhos
científicos
O processamento fisico da amostra constitui a adequação de um
específicos de cada área.
Suporte teórico adicional ao aqui
amostra laboratorial para as análises em si, convertendo-a em amostra
discutido pode ser obtido em FAO (2013) ou no número especial sobre essa
analitica. Como a própria definição diz, essa etapa de processamento deve
temática publicado pelo Journal
of AOAC International (2015; v.98, n.2).
Contudo, restringir-se ao campo tisico, sem promover alterações quínicas na
torna-se imprescindível
destacar que, em qualquer
amostra (ou. pelo menos, com o mínimo de alteração possível), buscando-
situação, a definição de um protocolo de amostragem deverá se bascar em
de aualito frente observado na unidade de
dois conhecimentos básicos de ferramenta
se preservar a integridade ao
e no uso uma (Ramsey &
decisão. O processanento tisico engloba dois gupos distintos de ações, as
36 37
NC7iia Animal Métodos para Análise de Alimentos
- 2" Edição
quais paiem ou nãocomer enm conjunto (e, nonnalhmente, em A desidratação parcial da amostra laboratorial
sequência): possui alguns
desidratação parcial. também denominada de objetivos centrais. Em primeiro Iugar. parte das amostras laboratoriais
"pné-sceagem", e
processamento mecânico. também denominado de possuem teor de umidade elevado, o que facilitaria sua deterioração e.
moagem.
consequentemente, comprometeria a integridade de analito. Esse
pertil de amostras laboratoriais é comumente observado para
Confiabilldade
Representatlvidade forragens in natura, silagens. digestas. material fecal, etc. A
deterioração poderia, ao menos em tese. ser contornada pela
CQA TA PA
manutenço da amostra sob congelamento. Contudo. esse manejo gera
outro inconveniente, que surge da necessidade de contínuos ciclos de
descongelamento e recongelamento a cada vez que alíquotas precisam
Erro
ser tomadas para realização de algum procedimento analítico.
Materiais com teor de umidade inferior a 15%, normalmente, não
necessitam de acondicionamento sob refrigeração, salvo casos
Heterogeneldade especiais. Dessa forma. reduzir o teor de umidade da amostra
laboratorial facilita o manejo e armazenamento nas rotinas
dessas considerações, entende-se que a

laboratoriais. A partir
não constitui procedimento essencial para
PM desidratação parcial um
todos os materiais, pois. por exemplo. grãos, farelos e fenos já

Figura 1.5. Representação sistemática para obtenção de amostras umidade.
representativas (CQA, critérios de qualidade de possuem naturalmente baixo teor de
amostragem; TA, teoria de amostragem; PM, Por outro lado, materiais úmidos não são propícios
ao
propriedades do material amostrado; PA, protocolos de tendem flexíveis e resistentes à

amostragem). Adaptdado de Ramsey & Wagner (2015) e processamento mecânico. pois a ser
Wagner & Ramsey (2015). A direção das selas coloridas existem processos de
moagem por corte ou por impacto. Obviamente,
indicaaumento no critério indicado.
natura, como a moagem criogênica, na qual
moagem de materiais in
38 39
iNCT Ciëncia Anial
material congelado a
baixíssimas temperaturas passa a
adquirir ntegridade de analito em comparação à secagem por frio (Ribeiro et
resistência fisica suficiente para o
processamento mecânico. Contudo, al., 2001; Pelletier et al., 2010;.Jacobs et al.. 2011: Morris et al. 2019).
entende-se que tais casos constituem
exceções nas rotinas Esse comprometimento na integridade de analito ocorre,
laboratoriais. Assim. a
desidratação parcial atribui resistência ffsica normalmente, por duas vias: volatilização e reações não enzimáicas.
que habilita a amostra laboratorial ao
processamento mecânico. A intensidade de volatilização dependerá de duas variáveis principais:
A
desidratação parcial de amostras laboratoriais pode ser concentração de compostos passíveis de volatilização e temperatura
realizada por intermédio de
secagem por frio ou por calor. de secagem. Em ambos os casos haverá uma relação diretamente
Inicialmente, que devemos entender é que
o
o
objetivo é apenas de proporcional com a intensidade do erro de integridade de analito.
reduzir o teor de umidade
do original material a níveis que se Por outro lado. as reaçoes não enzimáticas são diretamente
enquadram nos objetivos descritos anteriormente. Não há, e nem deve mediadas por calor e, comumente, envolvem a junção de compostos
haver,intenção de retirar toda a água do material. O conceito final de aminoacídicos e de carboidratos não estruturais. Os compostos
desidratação parcial é normalmente definido por uma amostra seca resultantes de tais reações são denominados de artefatos. Sua
em
equilíbrio com a umidade relativa do ar ou, simplesmente, resulta perda de integridade de analito devido
formação, em geral, em
amostra seca ao ar
(ASA). A noção clara desse conceito deve ser à alteração química do pertil de compostos nitrogenados (i.e.
preservada para que os procedimentos adotados na
desidratação aminoácidos so transtormados em compostos nitrogenados
parcial sejam aplicados sem equívocos. insolúveis e contabilizados como nitrogênio insolúvel em detergente
A escolha por frio calor
ou
dependerá basicamente dos neutro), aumento de compostos insolúveis (os quais podem acarretar
objetivos da análise final, o que definirá o grau de tolerância ao erro neutro e lignina) e decréscimo da
aumento da fibra em detergente
de integridade de analito, à enzimáticas é
e
disponibilidade de infra-estrutura e
digestibilidade da anmostra. A ocorrência de reações no
equipamentos. maiores que 60°C (Van Soest, 1994),

ampliada sob temperaturas
A secagem por calor é mais simples e
possui menor custo e
sendo este o limite máximo do calor a ser recomendado paraa
maior acessibilidade ao aparato necessário. Contudo, a submissão da
amostra
procedimentos de desidratação parcial.
a calor pOssui maior probabilidade de ocasíonar erro de
40
1
INCT Ciência Aninnal Mélodos para Andlise de Alimentos -2" Edição
As formas de
secagem por calor são tamanho do cristal de gelo formado
variadas, indo desde no interior da amostra. Por sua vez, 0
secagem à sombra em camada delgada até de micro-ondas. tamanho do cristal de gelo é diretamente
o uso
proporcional à temperatura de
Contudo, a forma mais rigorosa e indicada consiste no uso de estufa com congelamento. Logo, congelamentos por intermédio de freezeres
circulação forçada de qual permite o melhor controle das variáveis
ar, a convencionais não propiciam condições
adequadas ao processo de
fisicas envolvidas na redução do teor de umidade. Embora o forno de liofilização, sendo necessários processos mais adequados, como o uso de
micro-ondas seja atrativo, devido à acessibilidade e nitrogênio líquido ou ultra-freezeres. Isso demanda maior custo e,
rapidez, o controle da
temperatura no interior da amostra não é feito como na estufa. Assim, a consequentemente, maior investimento no processo.
secagem parcial por calor recomendada neste Manual baseia-se no uso de Embora a liofolizaço não isente as perdas por volatilização
estufa com circulação forçada de ar. A base física deste processo de (Morris et al., 2019), é improvável que comprometimentos da integridade
secagem consiste em imprimir à amostra temperatura superior à do de analito ocorram por reações não enzimáticas. Logo,
presume-se que a
ambiente, mas inferior à temperatura de ebuliço da água (i.e., 50-60°C). liofilização seja o padrão ouro do processo de desidratação parcial de
Isso causa aumento da excitação das moléculas de água, formando um amostras. Contudo, balizamentos entre a tolerância ao erro de integridade
micro-clima de alta umidade sobre a amostra. Essa umidade é retirada de analito e o custo do processo devem orientar a escolha do método
com o auxilio da corente de ar e, gradativamente, a água migra do interior adequado neste quesito.
para o exterior da anmostra. O ciclo de migração e retirada da água é Uma vez que a desidratação parcial foi executada (ou não,
repetido por tempo suficiente para que o teor de umidade demandado seja dependendo da amostra em si), passamos à segunda etapa do
alcançado. processamento f+sico, o que denominamos de processamento mecânico.
Por outro lado, a secagem por frio trabalha com uma propriedade Os objetivos dessa etapa são claros: reduzir a influencia da
específica da molécula de água que, sob baixíssimas temperaturas e sob heterogeneidade de composição e adequar a superfície específica da
vácuo, é capaz de sublimar, ou seja, migrar diretamente do estado sólido amostra analítica ao processo de análise em si.
para o estado gasoso. Contudo, esse processo, em termos instrumentais, No primeiro caso, temos uma observação clara do objetivo da
exige o congelamento da amostra sob temperaturas muito baixas (40°C). moagem da amostra. Por exemplo, a análise do teor de nitrogênio por
A eficiência do processo de liofilização é inversamente proporcional ao intermédio do método de Kjeldahl não detemina nenhum tamanho de
42 43
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos 2"
-
Edição
partícula em especial. Como a amostra será totalmente digerida por um moagem, realize o quarteamento da amostra, reserve uma
parte moIda a
procedimento ácido. não há necessidade de moagem específica em si. 2 mm e destine outra parte para uma nova
moagemal mm.
Contudo, raciocinemos. O que escolher de Embora haja diversos tipos de
em uma amostra
silagem de moinhos., dois tipos são mais
milho? Meio grão. uma folha e uma parte de uma sabugo? Obviamete utilizados na análise de alimentos para animais. O
primeiro engloba
que não. Com a moagem. a amostra se torna mais homogênea e muito da alguns modelos de equipamentos que são de forma geral denominados de
influência devido à sua heterogeneidade de composição é contornado,o moinhos de facas. Suas principais características são: um conjunto de
que permite a obtenção de porções teste adequadas. lâminas localizadas no rotor central. denominadas de facas:
conjunto um
Por outro lado, há muitas análises que determinam de lâminas localizadas

superfícies na parede da câmara de moagem. denominadas de
específicas para que seus resultados sejam considerados adequados. Por contra-facas; e um mecanismo seletor de tamanho. denominado
exemplo, a análise de fibra em detergente neutro exige que as amostras peneira. Os moinhos de facas desintegram as amostras por corte. uma vez
sejam moidas com peneiras de porosidade de 1 mm. Por outro lado, as que o encontro das facas e contra-facas executam ação similar à de
incubações in situ para ruminantes demandam moagem em peneiras de tesouras. O mesmo foi projetado para materiais macios. como forragens
porosidade de 2 mm. Assim, antes de se executar o processamento e farelos, não sendo indicada a moagem direta de materiais duros. como
mecânico, faz-se necessário um correto planejamento considerando-se oSsos e catilagens.
todo o espectro de análises que serão realizadas. Haverá, normalmente, Por outro lado, os moinhos tipo "bola" são compostos por uma
dois tipos de decisões a serem tomadas. Primeiro, a moagem se baseará câmara de moagem de aço que é deslocada em movimento retilíneo do
naquela análise que define um tamanho de partículas particular. Segundo, vai-e-vem" contendo esfera de aço interior. Com
tipo uma em seu o
caso haja duas exigências distintas, a moagem deve ser executada em movimento, a esfera se choca com a amostra, reduzindo o tamanho de
múltiplos estádios. Suponha que seu espectro envolva análises de fibra Como não há mecanismo seletor, não há
partículas por impacto. como
em detergente neutro, incubações in situe proteína bruta por Kjeldahl. A controlar o tamanho final de moagem. Esse tipo de equipamento é
primeira exige I mm, a segunda 2 mm e a terceira não possui exigências. moagem de
utilizado na moagem de materiais duros, como ossos, ou na
Assim, a primeira instância da moagem será realizada a 2 mm. Após a inicial duros para que
materiais comuns para fragmentação em grão o
término do processo de moagem seja realizado em um moinho de facas.
44 45
Métodos pura Análise de Alimentos -2"
INCT Ciência Animal Edição
Sacos de papel podem ser utilizados

Um detalhe relevante no processo de moagem é direcionado a como
recipientes para
amostras com menor teor de umidade
materiais de alta concentração de gordura. O processo de moagem gera como forragens frescas.
calor, causando a fusão de parte da gordura, que forma placase impede a Forragens colhidas
íntegras (e.g., capins) devem ser previamente
seccionadas em fragmentos de 2a3 cm para otimizar a
moagem em ambos os tipos de moinhos. Assim, materiais com mais de perda de água
durante o processo. Para o caso de amostras fecais, de
10% de extrato etéreo devem ser parcialmente desengordurados para que digesta ou
forragens de alta umidade (e.g., cana-de-açúcar). os recipientes devem

o processamento mecânico seja factível. No caso de grãos de oleaginosas
(eg., caroço de algodão, grão de soja), os mesmos devem ser
ser bandejas, as quais, sugere-se, serem cobertas com filmes plásticos
parcialmente fragmentados em um almofariz e submetidos a um processo (sacolas), que previnem que as amostras fiquem aderidas nas bandejas
de extração intermitente da gordura (e.g., extraço de Soxleth) por seis a para o caso de bandejas de alumínio, previne-se também a
oito horas. Não se deve esquecer de contabilizar a gordura extraída nesse contaminação da amostra).
processo para a correta expressão das concentrações a posteriori.

Procedimentos
Redução do teor de umidade em estufa com circulação forçada de ar 1. Lave os recipientes e deixe secar na estufa a 50-60°C. Se utilizar
(Método G-001/2)
saco de papel deixe-o secar por oito horas. Retire da estufa e espere
entrar em equilíbrio com a umidade relativa do ar. Esse

Aparatos
procedimento é importante para que não haja alteração da tara
-
Balança semi-analítica com preciso de 0,1 a 0,01 g durante o processo de secagem. pois estamos trabalhando com
- Bandejas de plástico ou alumínio
amostras secas em equilibrio com a umidade relativa do ar.
Sacos de papel
Sacos plásticos 2. Pese os recipientes e registre os pesos.
- Estufa com circulação forçada dear
3. Adicione uma amostra em cada recipiente e registre os pesos dos
com as amostras. Para o caso de sacos, o volume de
recipientes
amostra não deve ultrapassar 50% da altura do saco. A secagem em
46 47
NCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos -
2" Edição
bandejas deve ser realizada conm a amostra em camada delgada (i.e., -
Estufa com circulação forçada de ar
altura da amostra no deve ultrapassar cm).2 - Liofilizador
Sistema de congelamento (ultra-freezer ou nitrogênio líquido)

4. Agite os recipientes com as amostras com suavidade, para
uniformemente distribuir as amostras e expor o máximo de área à
Procedimentos
secagem.
1. Lave os recipientes e deixe secar em estufa a 50-60°C. Retire da
5. Coloque os recipientes com as amostras na estufa a 50-60°Ce deixe
estufa e espere entrar em equilíbrio com a umidade relativa do ar.
secar por 24 a 72 horas. Se recipiente utilizado for sacos de papel,
o
este deve ser disposto com inclinação de 45°, perfurado na face 2. Pese os recipientes e registre os peso0s.
superior (3 a 4 furos feitos com um instrumento perfurante)) e
3. Adicione uma amostra em cada recipiente de modo a obter uma
permanecer aberto na estufa para otimizar a perda de umidade da
camada delgada (altura mácima de 1 a 2 cm). Para o caso de
amostra.
forragens colhidas íntegras (e.g., capins) devem ser previamente
6. Retire os recipientes com as amostras da estufa e espere 30 a 40 seccionadas em fragmentos de 2 a 3 cm para otimizar a perda de
minutos para entrar em equilíbrio com a umidade relativa do ar.
água durante o processo.
Pese-os e registre os pesos.
4. Registre os pesos dos recipientes com as amostras.
Redução do teor de umidade por liofilização 5. Agite oS recipientes com as amostras com suavidade, para
(Método G-002/2) uniformemente distribuir as amostras.
com as amostras em ultra-freezer com a

Aparatos 6. Coloque os recipientes
inferior a -40°C e deixe por 8 a 12 horas, de
temperatura igual ou
-
Balança semi-analítica com precisão de 0,1 a 0,01 g de pequenos cristais de gelo. Parao
modo a promover a formação
Recipientes (bandejas)
48 49
INCT Ciencia Animal Métodos para Análise de Alimentos 20 Edição
Seca em
caso do uso de nitrogênio líquido. propiciem um "banho" sobre equilíbrio com a umidade relativa do ar (g); e %ASA =
material de forma a obter o congelamento rápido. percentual de "amostra seca ao ar";
7. Retire a amostra do ultra-freezer

após o congelamento em
ou
Exemplo de cálculo
nitrogênio líquido e coloque imediatamente no liofilizador por, no
mínimo, 24 horas. Considerando a aliquota 1 da tabela a seguir, tem-se o cálculo
da estimativa da "amostra
8. Retire amostras do
seca ao
ar
as liofilizador, espere 40 minutos para entrar em
equilíbrio com a umidade relativa do ar, pese e
registre os pesos. MN=(T+MN)-T=314,71-9,60=305,11g
Cálculo da concentração de "amostra seca ao ar" ASA=(T+ASA) -T=104,63-9,60=95,03 g
Para o cálculo da concentração de amostra ASA 95,03

seca ao ar, use as
6ASA=x100
MN 305,11
x100=31,15%
equações:
MN=(T+MN)-T Alíquota
Item
ASA=(T+ASA)-T Tara (g) 9,60 9,36 9,14

Tara +MN (g) 314.71 385,74 372,10
ASA
MN () 305,11 376,38 362,96
%ASA=TX100
Tara + ASA (g) 104.63 130,03 122,97
ASA (g) 95.03 120.67 113,83

em que: MN =
massa de amOstra em termos de matéria natural (g); T
%ASA 3115 32,06 31,36
= tara ou peso do recipiente utilizado (g); ASA =massa de amostra
%ASA (média) 31,52
50
-
Edição
JOINT COMMITTEE FOR GUIDES IN METROLOGY JCGM.

Literatura Citada
-
JCGM
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52 53
-
Edição
Capítulo 2
Secagem definitiva e matéria seca

Definições básicas
O teor de umidade residual de uma amostra manejada em

laboratório representa a umidade remanescente em um alimento
úmido após sua
desidratação parcial em estufas com ventilação
forçada ou liofilizadores, ou a umidade total de alimentos com
baixo
teor de umidade, como grãos e farelos. Essa umidade érotineiramente
representada, por seu complemento, denominado "amostra seca em

estufa" (ASE), em virtude da maior facilidade dos cálculos posteriores
para quantificação dos teores dos componentes químicos nas
amostras.
Os teores de ASE de alimentos são normalmente obtidos no
Brasil por intermédio da secagem em estufas isentas de ventilação
forçada iguais ou superiores à temperatura de

sob temperaturas
ebulição da água (Silva & Queiroz, 2002). Contudo, diferentes

binômios tempo x temperatura podem conduzir a diferentes
alta de interação com amostras de
resultados, com possibilidade
diferentes origens e composições (Thiex & Richardson, 2003).
54 55
Métodos para Análise de Alimentos -2" Ediçdo
Tabela 2.1. Exemplo teórico da influéncia das variações do teor de
A quantificação da ASE é uma das medidas mais importantes ASE na composição química de alimento volumoso
e utilizadas na análise de alimentos. pois a umidade de um alimento
está relacionada com sua estabilidade. qualidade e composição, Composição Laboratório" Diferencial
Item teórica (% (2-1:%)

afetar embalagem e o processamento dos
podendo a estocagem, a
ASE 89,79 95.00 +5.8
alimentos (Cecchi. 2003).
conhecimento do PB 8.91 8.42 -5,5
Em termos de rotina laboratorial, o correto
EE 3.34 3.16 -5.4

teor de ASE nas amostras se mostra adicionalmente relevante, uma
vez que estas são manejadas na base seca ao ar, ou seja, ainda contendo FDNcp 55 61.25 57.89 -5.
umidade. Desta forma, devido à impossibilidade de manejo de MM 5.57 5.26 -5.6
amostras totalmente secas, o teor de ASE é utilizado para correta CNF3 20,93 25,2 +20,7
dos teores obtidos base na matéria seca (MS) da ASE, "amostra seca em estufa": °B. proteína bruta: EE. extrato etéreo;
expressão com
FDNcp, fibra em detergente neutro corrigida para cinzas e proteína: MM,
amostra. Assim, por constituir denominador comum a todos os demais matéria mineral; CNF, carboidratos não fibrosos. Composição assumida
dos hipoteticamente com base na amostra seca ao ar para uma amostra de silagem
procedimentos laboratoriais, erros cometidos na quantificação
teores de ASE tornam-se vícios ou eros sistemáticos em todas as
de milho. CNF = 100-(PB + EE + FDNcp +
MM). Composição ajustada
para a matéria seca. Os cálculos consideram as diferenças entre dois
laboratórios quanto à estimativa de ASE. Para maiores detalhes, favor
avaliações, propagando-se, desta forma, ao entendimento global de
consultar Souza et al. (2015).
todas as demais características do alimento (Mertens, 2003; Souza et
al., 2015; Tabela 2.1). Observa-se que diferenças entre os teores de ASE se projetam
em magnitudes similares, mas em direções opostas, sobre os
componentes químicos analisados diretamente (Tabela 2.1). Contudo,

os vícios imputados sobre estes componentes são potencializados
sobre o teor do componente estimado por diferença, neste caso
carboidratos não-tibrosos. uma vez que este absorverá todos os erros
associados com os teores dos componentes químicos analisados
56 57
-
Edição
3. Coloque-os em dessecador devidamente preparado (máximo de 20
diretamente em mesma intensidade, mas com direção oposta
(Detmann & Valadares Filho, 2010). unidades por procedimento), a fim de esfriá-los. A
principal função
de um dessecador é
permitir o resfriamento das amostras após o
Secagem em estufa sem ventilação forçada de ar período de secagem sem absorver umidade, via uso de um
(Método G-003/1) dessecante, como a sílica gel. De forma particular, a sílica-gel é
Aparatos sugerida devido ao seu baixo custo, à facilidade de manejo e à

possibilidade de reciclagem e reuso. Assim, o dessecador deve estar
-
Balança analítica com precisâo de 0,0001g

sempre limpo, seco e possuir sílica gel na tonalidade azul escuro
- Dessecador
em seu interior. A área de contato entre o corpo do dessecador e sua
- Pesa-filtros
tampa deve ser levemente lubrificada com graxa de silicone de
-
Estufa sem circulação forçada de ar

forma a permitir um deslizamento adequado e melhorar a vedação
durante o período de resfriamento.
Procedimentos
1. Use balança analítica aferida 4. Após estabilização com a temperatura ambiente (normalmente em
pelo INMETRO, com precisão de
0,0001 g, sobre bancada torno de 30 minutos), pese os recipientes, removendo um de cada
especial de laboratório e em ambiente
climatizado (20-25°C ou de acordo vez do dessecador. As tampas são pesadas em conjunto com os
com as
especificações do
fabricante). Ligue a balança e aguarde 30 minutos para sua recipientes.
estabilização.
5. Adicione aos pesa-filtros aproximadamente 2 gramas da amostra
2. Lave os pesa- filtros deixe seca ao ar (preferencialmente moída em peneira de porosidade 1
e secar em estufa a 105°C por 16 horas
("uma noite"); caso estes estejam limpos, deixe por 2 horas na
mm). Agite os recipientes com as amostras com suavidade paraa
estufa 105°C. Atentar para que os
a
distribuir uniformemente as amostras e o máximo de área à
pesa-filtros permaneçam expor
sempre abertos quando colocados na estufa e com as tampas quando secagem.
no dessecador.
58
59
Métodos para Análise de Alimentos -2"
INCT Ciencia Animal
Edição
Exemplo de cálculo
6. Leve os pesa-filtros com amostras e pesos conhecidos à estufa a
105°C por 16 horas ou "uma noite" com a tampa aberta.

Considerando a aliquota 1 da tabela abaixo, têm-se o cálculo
7. permanência na estufa, coloque os conjuntos pesa-filtro + da estimativa da "amostra seca em estufa":
Após a
amostra novamente no dessecador e aguarde a estabilização com a
Durante a
temperatura ambiente, pese e registre os pesos. ASA=(PF+ASA)-PF=36,0057-33,9467=2,0590 g
dessecador e a pesagem os pesa-filtros devem
permanência no
permanecer fechados. ASE=(PF+ASE)-PF=35,9195-33,9467=1,9728 g
ASE 1,9728
Cálculo da concentração de "amostra seca em estufa"
%ASE=CAXL0
ASA 2.0590x100-95,81%
Para o cálculo da concentração de "amostra seca em estufa",
use as equações: Aliquota

Item
ASA=(PF+ASA)-PF 32.6543
PF (g) 33,9467 34,1165
PF+ASA (g) 36,0057 36,1062 34.5888
ASE=(PF+ASE)-PF
PE+ ASE () 35,9195 36,0244 34.5090
ASE ASA (g) 2,0590 1,9897 1.9345
%ASE=c
ASA
x100
ASE (g) 1.9728 1,9079 1.8547
PF peso do pesa %ASE 95,81 95,89 95.87

em que: ASA = massa de amostra seca ao ar (g); =
filtro (g); ASE = massa de "amostra seca em estufa" (g); %ASE =

%ASE (média) 95,86
percentual de "amostra seca em estufa".
60 61
INCT Ciencia Animal Métodos para Análise de Alimentos -
2" Edição
Cálculo da concentração de matéria seca Considerando-se as médias de %ASA (Capítulo 1) e de %ASE
obtidas nos exemplos, temos:
O cálculo da
concentração da matéria seca (MS) é realizado
considerando-se o número de etapas envolvidas na
secagem das amostras. %ASAX%ASE 31,52x95,86
Para amostras com baixo teor de
6MS= 100
= 30,22%
umidade, como é o caso de 100
grãos. farelos e fenos, a umidade é avaliada somente por intermédio
da ASE. Logo, o teor de MS Literatura Citada
corresponde ao teor de ASE; ou seja:
CECCHI, H.M. Fundamentos teóricos e práticos em anáise de alimentos.
%MS=%ASE 2 ed. Campinas: Editora da Unicamp, 2003. 207p.
em que: %MS
DETMANN, E.; VALADARES FILHO, S.C. On the estimation of non-
=
percentual de matéria seca; %ASE =
percentual de
"amostra seca em estufa".
fibrous carbohydrates in feeds and diets. Arquivo Brasileiro de Medicina
Veterináriae Zootecnia, v.62, p.980-984, 2010.
Amostras com alto teor de MERTENS, DR. Challenges in measuring insoluble dietary fiber. Journal
umidade, como é o caso de of Animal Science, v.81, p.3233-3249, 2003.
silagens, forragens frescas, etc., a umidade do material é retirada em,
SILVA, D.J.; QUEIROZ, A.C. Análise de Alimentos. Métodos químicos e
ao menos, dois procedimentos de secagem
ventilaço (estufa com biológicos. 3 ed. Viçosa: Editora UFV, 2002. 235p.
forçada ou liofilizador e estufa sem ventilação forçada). Logo, o teor SOUZA, M.A.; DETMANN, E.; VALADARES FILHO, S.C.; FRANCO,
M.O.; ROCHA, G.C.; CABRAL, L.S. Estudo colaborativo para avaliação
de MS é dado
pela ponderação dos resultados obtidos nos dos teores de matéria seca em alimentos. Revista Brasileira da Saúdee
Produção Animal, v.16, p. 617-631, 2015.
procedimentos sequenciais de secagem, ou seja:
THIEX, N.; RICHARDSON, C.R. Challenges in measuring moisture content
of feeds. Journal of Animal Science, v.81, p.3255-3266, 2003.
%ASAx%ASE
6MS=-
100
em que: %MS percentual de matéria seca; %ASA percentual de

=
=
"amostra seca ao ar" (ver

Capítulo 1); %ASE percentual de "amostra =
seca em estufa".
62
63
Alimentos -20 Ediç
lição
Capítulo 3
Matéria mineral
A matéria mineral (MM), ou cinzas, é constituída
pelo resíduo
inorgânic0 obtido após a
queima ou
ignição da matéria orgânica,a
qual é convertida em CO2, H20, SO2, N02, etc; e eliminada em
conjunto com as substâncias voláteis
decompostas pelo calor
(Harbers, 1998). O método consiste basicamente na
incineração do
alimento altas temperaturas por
em
temp0 suficiente para que ocorra
combustão total da matéria orgânica (Silva &
Queiroz, 2002; Cecchi,
2003).
Sendo a matéria seca total do alimento formada
pelas frações
orgânica e inorgânica, o teor de MM em alimentos constitui estimador
indireto do conteúdo de
componentes organicosS totais.
Adicionalmente, o conhecimento do teor de MM se faz necessário
para se conhecer a proporção dos componentes quantificados por
diferença em alimentos, como o extrativo não nitrogenado, os

carboidratos não-fibrosos e a matéria orgânica residual (ver Capítulo
9)
64
6
INCT Cíncia Animal Métodos para Análise de Alinentos 2"
- Edição
Atualizações Método da queima em mufla

(Método M-001/2)
O método anterior (M-001/1) foi modificado no tocante a dois
aspectos. Primeiro, devido à possibilidade de volatização de minerais Aparatos

(e.g.. Na. K. Mn. Zn) e. consequentemente, subestimação da MM
-
Balança analítica com precisão de 0,0001g

(Rowan et al. 1982: Thiex et al., 2012), procedeu-se à redução da
- Dessecador
temperatura de ignição e ajustamento do tempo total de queima.

-
Cadinhos de porcelana (abertura mínima sugerida de 18-20 cms)

Adicionalmente. a busca por maior eficiência no processo de
quantificação demandou a padronização qualitativa do resíduo obtido.
-
Forno mufla com temperatura controlada

Assim. o resíduo considerado adequado após ignição deve se
apresentar claro, sem indicações claras de retenção de carbono

Procedimentos
residual (Thiex et al., 2012). Nesse sentido, caso o material apresente
se com colaração cinza escuro ou enegrecido após o primeiro período 1. Use balança analítica aferida pelo INMETRO, com precisão de
de queima, introduziu-se etapa adicional que envolve a aeração do 0,0001 g, sobre bancada especial de laboratório e em ambiente
ambiente (i.e., entrada de oxigênio) interno da mufla, seguida de um climatizado (20-25°C ou de acordo com as especificações do
segundo período de queima, o qual espera-se auxiliar na eliminação fabricante). Ligue a balança e aguarde 30 minutos para sua
dos resíduos de matéria orgânica. Este procedimento constitui uma estabilização.
adaptação das sugestões apresentadas por Thiex et al. (2012).
2. Lave os cadinhos de porcelana e os deixe secar em estufa a 105°C
por 16 horas ("uma noite"). Caso os cadinhos de porcelana sejam
novos ou não sejam utilizados exclusivamente para avaliação de
MM é recomendável que os nmesmos passem por procedimento de
incineração previamente ao seu uso (ver passos 6a 8).
66 67
INCT Ciicia Animal Métodos para Análise de Alimentos 2*
-
Edigão
3. Coloque-os em dessecador devidamente preparado (máximo de 20 que se garanta resíduo mensurável de acordo com a sensibilidade
unidades por procedimento). a fim de esfriá-los. A analítica.
principal função
de um dessecador é permitir o resfriamento das amostras
após o 6. Acondicione os cadinhos contendo as amostras mufla.
periodo de secagem sem absorver umidade, via uso de um na Após ligar
dessecante. sílica De forma
o
equipamento, aguarde que o mesmo alcance a temperatura de
como a gel. particular, a sílica-gel é
550°C. E desejável uma rampa de
aquecimento de I hora para que
sugerida devido ao seu baixo custo, à facilidade de manejo e à
a temperatura de ignição seja alcançada.
sempre limpo, seco e possuir sílica gel na tonalidade azul escuro 7. Proceda à queima por 3 horas a 550°C. Após este termpo, desligue a
em seu interior. A área de contato entre o corpo do dessecador e sua mufla e deixe que a mesma resfrie fechada. A temperatura de retirada
tampa deve ser levemente lubrificada com graxa de silicone de deve estar entre 150 e 200°C.
forma a pernmitir um deslizamento adequado e melhorar a vedação
durante o período de resfriamento. 8. Caso os resíduos após ignição estejam claros, coloque os cadinhos de
porcelana no dessecador, deixe estabilizar com a temperatura

4. Após estabilização com a
temperatura ambiente (normalmente em ambiente. Siga as instruções gerais de uso do desseacador descritas no
tormo de 30 minutos), pese os cadinhos, removendo-0S um de cada passo 3. Pese e registre os pesos.
vez do dessecador, mantendo-o fechado entre as remoções dos
9. Em caso de resíduos cinza escuro ou enegrecidos, mantenha a porta da
recipientes.
mufla aberta por alguns minutos para garantir um suprimento de ar
5. Adicione nos cadinhos aproximadamente 2 gramas de amostra seca freseo e repita o procedimento de queima por 3 horas. Deixe resfriar
ao ar (preferencialmente moída em peneira de porosidade I mm). mova-os para o dessecador e pese como descrito nos passos 7 e 8.
A de amostra pode variar da sensibilidade
massa em função
analítica. Materiais com alto teor de minerais podem ser avaliados
com menor massa de amostra, ao passo que materiais com baixo
teor de minerais deverão avaliados maiores

ser com alíquotas para
69
A

INCT Ciência Animal Alimentos -
2" Edição
Cálculo da concentração de matéria mineral

MM 0,1100
Para o cálculo da concentração de matéria mineral, siga as
oMIMASA=ACAX100=02X100=5,25%
cquações
%MMMs /%MM ASA100 95,36
5,25
x100=5,48%
%ASE
MM=(CAD+MM)-CAAD
MM Alíquota
96MMASAASA100 Item 2
CAD() 36,6347 37,5441 37,7170
96MMMs= %%ASE
%MMMs %MMASAx100 CAD ASA (g) 38,7285 39,9254 39,7216
ASA (9) 2,0938 2,3813 2,0046
em que: MM = massa de matéria mineral (g); CAD =peso do cadinho CAD+MM (g) 36,7447 37,6701 37,8223
base
MM (g) 0,1100 0,1260 0,1053
(g); oMMASA =
percentual de matéria mineral com na amostra
%MMASA 5,25 5,29 5,25
seca ao ar; ASA = massa de amostra seca ao ar (g); 6MMus =
base matéria seca; %ASE

oASE 95,86
percentual de matéria mineral
=
com na
ToMMMs 5,48 5,52 5,48

percentual de ""amostra seca em estufa".
TOMMMs (média) 5,49
Exemplo de cálculo
tem-se o cálculo
Considerando a aliquota 1 da tabela a seguir,
da estimativa da matéria mineral:
ASA=(CAD +ASA)-CAD=38,7285-36,63472,0938 g
MM=(CAD+MM)-CAD=36,7447-36,6347=0,1100 g 71
70
INCT Ciência Animal Mélodos para Análise de
Alimentos 2" Edição
Cálculo da concentração de matéria orgânica Literatura Citada
Por
definição, o teor de matéria orgânica (MO) de um CECCHI, H.M. Fundamentos teóricos e
2 ed. práticos em análise de alimentos.
alimento corresponde ao Campinas:Editora da Unicamp. 2003.
207p.
complemento da porção inorgânica deste, a HARBERS, L.H. Ash
qual representada pela MM; logo:
é analysis. In: NIELSEN S.S. (Ed.). Food analysis. 2
ed. West Lafayette: Aspen Publishers. 1998. p.141-150.
ROWAN, C.A.; ZAJICEK. O.T.: CALABRESE. E.J. Dry
for the determination of sodium and
ashing vegetables
%MOMS=100-6MMMs potassium by atomic absorption
spectrometry. Analytical Chemistry. v.52. p. 149-151. 1982.
em que: TMOMs percentual de matéria orgâânica com base
=
na SILVA, D.J.: QUEIROZ. A.C. Análise de alimentos. Métodos
quimicos e
matéria seca; %MMns percentual de matéria mineral com base

=
biológicos. 3 ed.
Viçosa: Editora UFV, 2002. 235p.
na
THIEX, N.; NOVOTNY. L.: CRAWFORD. A. Determination of ash in
matéria seca.
animal feed: AOAC official method 942.05 revisited. Journal of AOAC
Para o caso do valor médio obtido International, v.95. p.1392-1397, 2012.
previamente, tem-se:
Literatura Adicional
%MOMS 100-%MMMS=100-5,49-94,51%
SOUZA, M.A.; DETMANN. E.: BATISTA. E.D: FRANCO. M.O.
VALADARES FILHO. s.C.: PINA. D.S.: ROCHA. G.C. Estudo
colaborativo para avaliação dos teores de matéria mineral em alimentos.
Revista Brasileira de Saúde e Produção Animal, v.18. p.62-75, 2017.
12 73
NUT Cncia Animal Mélodos para Análise de Alimentos 2" Edição
Capítulo 4
Nitrogênio (proteína bruta)

Definiçoes básicas
A nutrição proteica de animais de produção deve ser baseada

no
provimento de aminoácidos (i.e.. proteína) em quantidades
suficientes proporções adequadas no intestino delgado de forma
e em
a suprir a demanda destes compostos para síntese e para renovação de

tecidos n0 organismo animal. Assim,aplicação dos conceitos de
a
nutrição proteica envolve simultaneamentea definição de

parâmetros
químicos (i.e., concentração e composição da proteína dos alimentos)
e biológicos
(i.e., eficiência dos eventos de absorção e utilização
metabólica). Considerando-se as características químicas da nutrição
proteica, define-se por questões lógicas que as avaliações dos
alimentos devem ser centradas sobre a quantificação das
concentrações e proporções dos aminoácidos, principalmente
daqueles considerados essenciais aos animais (Detmann et al., 2014).
Os métodos analiticos para avaliação de aminoácidos em
alimentos são relativamente recentes, tendo sido consolidados nas
últimas décadas do século XX. No entanto, apesar da evolução
apresentada pela química instrumental, tais métodos possuem ainda
75
NCT Ciencia Animal Mélodos para Análise de Alimentos -
2" Edição
difusão limitada devido à complexidade e ao alto custo. Assim, A PB
permanece atualmente como forma modal de
avaliação
considerando-se tais limitações, faz-se necessária a utilização de proteica aplicada às diferentes espécies animais. Isso se dá
métodos alternativos, os quais. mesmo não produzindo informações principalmente em virtude de sua simplicidade conceitual e da
perfeitamente refinadas frente àquelas demandadas para a aplicação praticidade e rapidez na obtenção de estimativas em laboratório
dos principios de nutrição proteica. podem produzir resultados com
(Detmann et al., 2014). No conceito PB possui limitações
entanto, o
maior rapidez e menor custo para tomar possível a inserção de um

que devem compreendidas para o estabelecimento de limites para
ser
alimento em um sistema de produção. sua aplicaço em sistemas de alimentação animal. Em primeiro

lugar
Uma das principais características químicas que distingue os embora a correlação original (quanto mais proteína mais N) seja
compostos proteicos de carboidratos e lipídeos é a presença de um quimicamente perfeita, sua forma inversa (quanto mais N mais
grupamento amino ligado ao carbono oa dos aminoácidos. Em outras proteína) não sustenta a perfeição na associação. A presença de N
palavras, define-se a presença obrigatória do elemento nitrogênio (N) constitui propriedade química comum a diversos compostos orgânicos
nas cadeias peptídicas. Dessa forma, pode se afirmar que há uma e inorgânicos. Desta forma, embora todas as proteínas possuam N em
correlaço forte e positiva entre a concentração proteica e a sua composição, nem todo N presente na amostra se origina de
concentração de N em alimentos. Com base na forma reversa desta compostos proteicos.

foram estabelecidos da avaliaço proteica de A avaliação da concentração de N é modalmente realizada
correlação os princípios
à
alimentos no século XIX, nos quais a concentração de N poderia ser pelo método de Kjeldahl, o qual é amplamente utilizado devido sua
utilizada como preditor da concentração proteica. Assim, procede-se simplicidade e baixo custo. Este método foi desenvolvido por Johann
à quantificação da concentração de N, a qual permite expressar a Kjeldahl, na Dinamarca em 1883, quando estudava proteína em grãos
diversos
concentração de proteína na forma de equivalentes proteicos, os quais (Pomeranz & Meloan, 1978). O método original sofreu
de
são comumente conhecidos como proteína bruta (PB). O conceito de aperfeiçoamentos, possuindo atualmente diversas variações
PB foi incorporado àos pressupostos de composição de alimentos procedimentos (Windham, 1998; Silva & Queiroz, 2002; Faithfull,
de forma geral, este se
previamente estabelecidos pelo sistema de avaliaão proximal de 2003; Chang, 1998; Buftler, 2017). Contudo,
Weende.
76 11
CTCineid Animal Métodos para Análise de Alimentos 2"
-
Edição
baseia cm tres etapas analiticas distintas: digestão, destilaçãooe Atualizações
titulação.
As atualizações estabelecidas para
A digestão baseia-se no aquecimento da amostra com ácido a avaliação do N total
envolveram basicamente a
otimização no uso de
sulfürico até que os compostos orgânicos sejam oxidados. 0 reagentes, o
que
nitrogênio da proteina (orgânico) é retido na forma de sulfato de

permite redução de custos e de resíduos produzidos. Especificamente
os trabalhos conduzidos por Rodrigues et al. (2018) e Costa et al.
amônia (inorgânico). que constitui substância estável em meio ácido.
(2019) visaram a avaliação de ajustes na quantidade e concentração de
porém não facilmente quantificável. Nessa etapa utiliza-se uma
reagentes nas etapas de destilação e titulação do método de Kjeldahl.
mistura digestora. composta de um sal (sulfato de sódio ou de
Adicionalmente. a etapa de digestão foi avaliada por Silva et al.
potássio). com a finalidade de elevar o ponto de ebulição do ácido
(2016), cuja principal contribuição consistiu em verificar efeitos
sulfúrico permitindo a decomposição da matéria orgânica, e um
negativos do excesso de cobre sobre a quantiticação do N total em
catalizador metálico que aumen' :0 poder de oxidação do meio (Silva
tecidos animais. Reconhecidamente. o método de Kjldahl possui
& Queiroz. 2002: Thiex et al.. 2002). Em seguida, adiciona-se
hidróxido de sódio concentrado e aquece-se para a liberação da
limitações inerentes associadas à liberação do N associado a estruturas
amônia em solução de ácido bórico, formando borato ácido de amônio,
orgânicas heterocíclicas (Simmone et al.. 1997; Etheridge et al., 1998).
Alguns compostos nitrogenados heterociclicos podem ser formados a
que constiui composto nitrogenado de fácil volatilização, mas
partir de reações não-enzimáticas envolvendo creatina, aminoácidos

facilmente mensurável. 0 borato de amônia formado é titulado com
livres e monossacarideos. A digestão pode ser tornar ainda mais dificil
uma solução padronizada de ácido clorídrico, permitindo, assim, a
quando amostras com alto teor de gordura são aquecidas (Johansson
mensuração do N oriundo da amostra (Silva & Queiroz, 2002) e a
l1998). lons cobre ferro podem atuar
&Jigerstad, 1996; Skog. et al., e
expressão da proteína da amostra na forma de equivalentes proteicos.
como catalizadores de reaçöes para formação de compostos como
quais são precursores de compostos

pirazinas e piridinas, as
al.. 1981; Jügerstad et al.. 1998).

heterocíelicos (Parihar et
de radicais livres (o que ocorre com a

Adicionalmente, a liberaqão
meio de digestão) pode inerementar a formação de
adição de cobre ao 79
18
-
Edição
compostos nitrogenados heterocíclicos (Johansson & Jägerstad, Reagentes

1996). Assim, a redução de cobre melhora a recuperação do N a partir -
Acido sulfúrico (H2SO4) concentrado P.A.

de amostras de origem animal. sem comprometer a recuperação em -
Ácido clorídrico (HCI) 37% P.A.

outros tipos de amostras e conm impacto mínimo sobre o tempo de
Acido bórico (H,BO,) P.A.
digestão (Silva et al.. 2016). -
Carbonato de sódio (NaCO;) anidro P.A.

-
Hidróxido de sódio (NaOH) em escamas ou

micropérolas P.A.
Método de Kjeldahl
(Método N-001/2)
Sulfato de sódio (Na,SO.) potássio (KSO) P.A.
ou
Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4. 5H:0) P.A.

Aparatos Verde de bromocresol P.A.
Vermelho de metila P.A.
-
Conjunto para digesto e destilação -
bloco digestor e destilador por

Álcool etílico (CH,CH:OH) anidro P.A. (etanol absoluto)
arraste de vapor
- Capela com exaustão
Soluções
Balança analítica com precisão de 0,0001 g
- Tubos de digestão em borossilicato com orla
Solução-padrão de ácido clorídrico a 0.005 N
Dilua 0,414 mL (4,14 mL) de HC1 37% P.A. em balão volumétrico
Bureta de 50 mL com graduação de 0,1 mL
de 1 L (10 L), contendo em média 500 mL (5 L) de água destilada.
Erlenmeyers de 250 mL
Deixe esfriar, complete o volume e homogenize a solução.
- Pipetas
Balões voluméiricos
Solução-padrão de ácido clorídricoa 0,02 N
Bicos depapagaio com reservatório - Dilua 1.66 mL (16,6 mL) de HCl 37% P.A. em balão volumétrico de
Erlenmeyer de 4 L
IL (10 L), contendo em média 500 mL (5 L) de água destilada.
Deixe esfriar, complete o volume e homogenize a solução.
80
INCT Ctência Anima Métodos para Análise de Alimentos 2"
-
Edição
Solução-padrão de ácido clorídrico a 0,05 N Em um pote de polietileno adicione o sal (sulfato de sódio ou
Dilua 4.14 mL (41.4 mL) de HCI 37% P.A. em balão volumétrico de potássio) eo catalizador metálico (sulfato de cobre) na
1L
proporção de
(10 L). contendo em média 500 mL (5 L) de
água 20 para 1,
destilada. respectivamente (i.e., para cada 1000 g de sulfato de sódio
Deixe esfriar, complete volume
o e
homogenize a solução. ou
potássio use 50 g de sulfato de cobre). Misture até a completa
homogeneização. O material deve ser armazenado em pote com
Solução alcoólica de vermelho de metila (1 g/L)
Em
tampa.
-
um balão de 100 mL com cerca de 60 mL de álcool etílico

absoluto, dissolva 0,l g de vermelho de metila. Complete o volume Solução de ácido bórico (20 g/L)
com etanol e
homogenize a solução. -
Dissolva em um balão volumétrico de 1 L (10 L), contendo cerca de

500 mL (5 L) de água destilada, 20 g (200 g) de ácido bórico P.A.
Solução alcoólica de verde de bromocresol (1 g/L)
Adicione 12,5 mL (125 mL) da solução alcoólica de vermelho de
-
Em um balão de 100 mL com cerca de 60 mL de álcool etílico

metila e 6 mL (60 mL) da solução alcoólica de verde de bromocresol.
absoluto, dissolva 0,1 g de verde de bromocresol. Complete o
Agite até a completa solubilização e complete o volume com água
volume com etanol e
homogenize a soluço.
destilada.
Solução de hidróxido de sódio (400 g/L)

Padronização da solução-padrão de ácido clorídrico
-
Em frasco erlenmeyer de 4 L adicione 2 L de água destilada.

Adicione 1600 g de NaOH P.A. Devido à natureza volátil do ácido clorídrico concentrado e a
Agite a solução e adicione mais 1L
de água destilada. Agite até erros na mensuração do volume exato de ácido no preparo das
a completa solubilizaço. Deixe em
repouso até que resfrie e então complete o volume para 4 L. soluçöes, desvios da normalidade esperada do ácido diluído ocorrerão.
Dessa forma, a cada partida de ácido preparada, há necessidade
Mistura digestora (catalítica) cometidos de forma evitar que os
imperiosa de conhecer os erros a
Em separado, peneire (peneira com porosidade de 1 mm) o sulfato mesmos se propaguem para a quantificação do N presente na amostra.
de sódio ou potássio P.A. e o sulfato de cobre
pentahidratado P.A.
82 3 83
INCT Ciência Animnal
Esse processo é conhecido como
padronização das soluções de ácido Acido cloridrico 0,02N
clorídrico.
Os
procedimentos são os mesmos descritos anteriormente,
apenas
Acido cloridrico 0,005 N modificando-se a concentração da solução de carbonato de sódio
Acondicione o carbonato de sódio P.A. em (1,06 g/L). A titulação é feita
como ácido clorídrico 0.02N.
-
placa de petri e mantenha

em estufa não ventilada a 105°C por 4 horas. Retire e acondicione Acido clorídrico 0,05 N
em dessecador até o resfriamento. Os
procedimentos
-
são os mesmos descritos anteriormente.

Após oresfriamento, pese 0,.265 g de carbonato de sódio P.A. e apenas
modificando-se a
concentração da solução de carbonato de sódio
transfira para um balão volumétrico de 1000 mL
contendo 2,65 g/L). A titulação é feita com o ácido cloridrico 0,05 N.
aproximadamente 500 mL de água destilada. Agite até a
completa
solubilização. Complete o volume e homogenize. Embora a
padronização de uma solução de ácido clorídrico
Usando uma pipeta volumétrica, transfira 20 mL desta possa ser feita com qualquer uma das soluções de carbonato de sódio,
solução de
carbonato de sódio em um
erlenmeyer de 250 mL e adicione cinco sugere-se o uso de soluções específicas para cada ácido a fim de
gotas de solução alcoólica de verde de bromocresol. facilitar os cálculos e

interpretações. Nesse sentido, usando-se as
Titule com a solução de ácido clorídrico 0,005 N até a viragem (de soluções específicas para cada concentração de ácido clorídrico. o
azul para amarelo). cálculo da normalidade verdadeira da solução de ácido clorídrico é
dado por:
Aqueça erlenmeyer até a ebulição a fim de eliminar o CO
dissolvido no meio. Caso haja o retorno à coloração azul, continue Vc x Nc
Nv:=
a titulaço até a coloração amarela. Repita essa operação até que a Va
coloração amarela seja permanente.
Nv
Aconselha-se que ao menos três alíquotas sejam feitas. O resultado fNe
final (volume de ácido demandado na titulação) será dado pela normalidade verdadeira da solução de ácido clorídrico:
em que: Nv =
média das alíquotas avaliadas.

carbonato de sódio (no cas0 deste
Ve = volume da solução de
84 85
-
Edição
procedimento 20 mlL): Nc = normalidade da solução de carbonato de Procedimentos
sódio (no caso deste procedimento, as soluções específicas de 1. Use
carbonato de sódio possuem
balança analítica aferida pelo INMETRO. com precisão de 0.0001
a normalidade esperada da solução de
g, sobre bancada especial de laboratório e em ambiente climatizado
ácido clorídrico, ou seja. 0.005: 0.02 0.05 N.
e
respectivamente): Va
(20-25°C ou de acordo com as especificações do fabricante). Ligue a
= volume da solução de ácido clorídrico gasto titulação da solução
na
balança e aguarde 30 minutos para sua estabilização.
de carbonato de sódio (mL); f= fator de correção da normalidade do
ácido cloridrico (i.e. fator multiplicativo que converte a normalidade 2. Lave os tubos de digestão e deixe secar em estufa não ventilada.
esperada normalidade verdadeira); e Ne normalidade esperada

em =
3. Pese de 150 a 300 mg de amostra seca ao ar e acondiciene em tubo de

da solução ácido clorídrico (i.e., a normalidade que se espera obter
de
ensaio devidamente identificado. A massa de amostra varia em função
ao preparar a solução: 0,005; 0,02 ou 0,05 N). do teor de N da mesma. Materiais com baixo teor de N deverão ser
avaliados com alíquotas de maior massa (mais próximo a 300 mg). ao
Exemplo de cálculo
passo que materiais com alto teor de N poderão ser avaliados
Considerando um volume médio da solução de ácido utilizando-se alíquotas de menor massa (mais próximo a 150 mg).
clorídrico (0,02 N) gasto na titulação da solução de carbonato de sódio

4. Adicione 2 gramas da mistura digestora e 5 ml de ácido sulfúrico
de 21,3 mL, têm-se:
P.A. concentrado.
Vcx Nc 5. Coloque os tubos em bloco digestor e aqueça lentamente até atingir

Nv= 20 x 0,0L 0.0188N
Va 21,3 a temperatura de 400°C. Mantenha nesta temperatura até que aa
translúcida. A coloração poderá variar de verde a

solução fique
Nv 0,0188 azul. O bloco digestor deve permanecer em capela com o exaustor
fNe 0,02
= 0,939
ligado durante toda a digestão.
S1
86
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos 20 Edição
6. Retire os tubos e os deixe esfriar no interior da capela. de ácido clorídrico a ser utilizada (0,005; 0,02 ou 0,05N) será
escolhida ponderando-se os aspectos de sensibilidade analítica e

7. Quando a temperatura dos tubos estiver abaixo de 100°C, adicione
de praticidade dos procedimentos. Soluções mais diluídas de ácido
uma pequena porção de água destilada (aproximadamente 10 mL)
clorídrico devem ser usadas em materiais com baixo teor de N
e homogenize para evitar ou minimizar a cristalinização da solução.
(e.g., fluidos biológicos, efluentes) para que se garanta
Caso a cristalização se manifeste na forma de uma placa sólida, entre amostras.
sensibilidade analítica e poder de discriminaço
deve-se adicionar mais uma pequena porção de água destilada clorídrico devem ser
Soluções mais concentradas de ácido
(aproximadamente 10 mL) e utilizar um agitador (vortex) a fim de alta concentraço de N
utilizadas se avaliar materiais com
para
que os cristais formados se dissolvam antes da etapa de destilação.
glutenose), pois tomam mais práticos os
(e.g, carcaças,
volume de ácido utilizado e
8. Adicione em erlenmeyer de 250 mL, 10 mL de solução de ácido procedimentos devido ao menor
final de titulação
bórico (20 g/L). Adapte o erlenmeyer ao conjunto de destilação para evitam problemas de identi"icação do ponto
com grande volume de
receber toda a amônia destilada de modo que a saída do destilador devido à diluição excessiva do indicador
destilação. Tempos
titulação deve o c o r r e r logo após
a
de ácido bórico. ácido. A
esteja imersa na solução
procedimentos podem permitir
a
muito longos entre esses
tubo digerida conjunto de

9. Transfira o digestor com a amostra para o
perda de nitrogênio por volatilização.
destilação e adicione 25 mL de solução de hidróxido de sódio (400 g/L).
dois tubos em "branco" (sem amostra) passando
12. Faça ao menos
10. Destile por mantendo o terminal do condensador titulação) com o

arraste, (digestão, destilação e
por todos os processos
até que toda a amônia seja Tubos em

mergulhado na solução receptora e eliminar interferências.
objetivo de quantificar
liberada. O volume total do destilado deve ser de 100 mL. O avaliados em todas as partidas de digestão.
"branco" devem ser
volume final de destilação deve ser constante entre alíquotas.
11. Retire o erlenmeyer e titule com a solução de ácido clorídrico até

a mudança de cor do indicador (verde para rosa claro). A solução
89
88
INCT Ciência Animal Alimentos -2" Edição
em que: BNus
Cálculo da concentração de nitrogênio percentual de nitrogênio com base na matéria seca:
=
%ASE =
percentual de "amostra seca em estufa": %PBvs percentual =
Utilize uma das duas equações abaixo: de proteína bruta com base na
matéria seca; fc fator de conversäo da
=
concentração de nitrogénio em equivalentes proteicos, sendo

%NASA (V-B)
x Ne x fx 14x 100 recomendado o valor de 6.38 para leite e derivados e 6.25 para os
ASA
demais materiais.
96NASA (V-B)
x Nvx 14 x 100
ASA Exemplo de cálculo
em que: GNASA percentual de nitrogênio com base na amostra seca

= Considerando a aliquota 1 na tabela a seguir, têm-se os
ao ar; V = volume da solução de ácido clorídrico utilizado na cálculos para estimativa da proteína bruta:
titulação
(mL); B = volume de ácido clorídrico utilizado na titulação do
"branco" (mL); Ne = normalidade esperada da solução de ácido (V- B) x Ne x fx 14 x 100
%N ASA ASA
clorídrico;f= fator de correção da normalidade do áido clorídrico
Nv = normalidade verdadeira do ácido clorídrico; ASA = massa de
(9,4-0,1) x 0,02 x 0,939 x 14x 100
amostra seca ao ar (mg). 6N ASA 251,6
- = 0,97%
Proceda à correção da amostra para umidade residual e a

conversão em equivalentes proteicos:
%NASA 100g5 86
0,97
%NMs/%ASE 100 1,01%
=
95.86
6NMS 6N ASA 100

%ASE
%PBMs =
%NMs X fc =
1,01 x 6,25 =
6,31%
%PBMs %NMs XfcC
90 91
INCT Ciência Aninal
Métodos para Análise de. imentos -2" Edição
Alíquota
Item Literatura Citada
3
ASA (mg
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INCT Cincia Animnal
2" Edição
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95
94
INCT Ciência Anima Métodos para Análise de Alimentos
-2" Fdiçd
Capítulo5
Frações nitrogenadas proteica e não proteica

Uma das alternativas aplicáveis ao aprimoramento fornecido

pelo conceito de proteína bruta (PB) reside sobre seu fracionamento,
ou seja, sobre o entendimento dos diversos compostos nitrogenados
agrupados como PB (e.g., Krishnamoorthy et al., 1982: Sniffen et al..
1992). Uma das formas de fracionamento da PB com provável
aplicação na alimentação de animais não ruminantes e com aplicação

consistente na nutrição de animais ruminantes consiste da separação
entre compostos nitrogenados proteicos (NP) e não proteicos (NNP).
Em termos teóricos, a separação dos compostos nitrogenados não
proteicos permitiria a eliminação dos vieses causados pela

incorporação de componentes, como ácidos nucléicos e outros,
inclusos como proteína bruta (PB).

As avaliações laboratoriais mais comuns da proteína
verdadeira (PV) de um alimento, constituída essencialmente pelo NP,

se baseiam na precipitação da fração proteica por intermédio da ação
de um ácido, sendo os mais conmuns o ácido wolfrâmico ou tunguístico
(AT) e o ácido tricloroacético (TCA: Licitra et al., 1996). Neste caso,
96
97
INCT Cincii Animal Métodos para Análise de
Alimentos -2" Ediçio
o meio ácido é utilizado para reduzir o pH da solução, de forma que ressaltar que os alimentos normalmente utilizados
alimentaçao
na
as proteinas solúveis da amostra atinjam ponto isoelétrico, animal não possuem
seu
concentrações relevantes de pequenos peptideos.
precipitando-se (Malafaia & Vicira. 1997). tornando pequena a
diferença entre as estimativas obtidas com ATe o
conceito analítico de NP baseado TCA. Isto

O na precipitação de o
representa importante vantagem prática. pois o TCA
proteina em meio ácido apresenta pequena divergência em rel. ão ao apresenta custo inferior. Presenças significativas de pequenos
conceito teórico de proteína verdadeira. Em termos de nutrição peptídeos somente seriam
esperadas em alguns alimentos de origem
animal. um aminoácido livre passível de absorço no intestino delgado animal, como farinha de carne e ossos e farinha de peixe. por exemplo,
constitui NP. Contudo, quimicamente, os agentes precipitantes nos quais a utilização do AT poderia acarretar em estimativas mais
normalmente empregados não alcançam tal discernimento. A exatas do teor de NP em comparação à utilização do TCA.
precipitação do NP será resultante das propriedades químicas dos
diferentes agentes precipitantes, as quais determinam a forma como Atualizações

estes interagem com as cadeias polipeptídicas, que por sua vez é
Nenhuma atualizaço direta foi realizada sobre os métodos
definida em função do perfil de aminoácidos. De forma geral, o TCA
aplicados à separação entre NP e NNP. Apenas ressalta-se que as
écapaz de precipitar cadeias peptídicas superiores a 10 aminoácidos,
modificações introduzidas por intermédio do método N-001/2 devem
ao passo que o AT precipita cadeias peptídicas superiores a 3
ser aplicadas aqui.
aminoácidos (Licitra et al., 1996). Assim, devido à ação peculiar dos
reagentes, aminoácidos livres e pequenos peptídeos são mensurados
como NNP, gerando pequena divergência entre o conceito teórico e o
conceito analítico de PV.

Dadas as características dos agentes precipitantes, a precipitação
de NP como AT seria mais eficiente em relação àquela obtida com o
TCA, pois a divergência entre o conceito teórico e as estimativas de

NP obtidas analiticamente seria minimizada. Contudo, há de se
98
99
Método do ácido tricloroacético (TCA) Solução de ácido tricloroacético (10 g/L)
(Método N-002/2) Em um balão de 100
mL com cerca de 60 mL de água, dissolvalg
de TCA P.A. Complete o volume e
Aparatos
homogenize a solução.
Após o preparo, as soluções de TCA devem ser transferidas
-

para recipientes adequados e mantidas sob refrigeração.
- Becker
- Funil raiado
Procedimentos
-
Papel filtro quantitativo, livre de cinzas e de filtração rápida

1. Use balança analítica aferida pelo INMETRO, com precisão de
-
Tubos de digestão macro Kjeldahl em borossilicato
0,0001 g, sobre bancada especial de laboratório e em ambiente
-
Conjunto para digestão e destilação -
bloco digestor e destilador por

climatizado (20-25°C ou de acordo com as especificações do
arraste de vapor
fabricante). Ligue a balança e aguarde 30 minutos para sua
-
Bureta de 50 mL com graduação de 0,1 mL ou inferior

- Erlenmeyer de 250 mL estabilização.
Balões volumétricos 2. Acondicione aproximadamente 0,5 g de amostra seca ao ar
(preferencialmente moída em peneira de porosidade l mm) em um

Reagente becker de 100 mL.
- Acido tricloroacético (CClCoOH) P.A.

3. Adicione 50 mL de água destilada.
Soluções 4. Agite levemente e deixe em repouso por 30 minutos.
Solução de ácido tricloroacético (100 g/L) 5. Adicione 10 mL de solução de TCA 100 g/L e agite levemente.
Em um balão de 100 mL com cerca de 60 mL de água, dissolva 10 g
6. Deixe em repouso por 30 minutos.
de TCA P.A. Complete o volume e homogenize a solução.
100 101
INCT Ciencia Animal Métodos para Anlise de Alimentos -
2" Edição
7. Filtre em papel filtro quantitativo livre de cinzas (ashless) colocado
funil raiado
%NNP %NMS-%NITLAMSx
ONMs
100 =100- %NPN
em e
previamente umedecido com água destilada.
8. Lave sequencialmente com solução de
TCA 10 g/Le água destilada. em que: ONPN =
percentual de nitrogênio proteico com base no
nitrogênio total da amostra; %NITCAMs = percentual de nitrogênio

9. Transfira o papel filtro com o resíduo para um tubo macro Kjeldahl. insolúvel em ácido tricloroacético com base na matéria seca; %Nus =
10.Submeta à digestão, destilação e titulação, como descrito para o percentual de nitrogênio total da amostra com base na matéria seca; e
ONNPN = percentual de nitrogênio não proteico com base no
método N-001/2, considerando as sugestões a seguir. Primeiro,
devido à análise de N realizada nitrogênio total da amostra.
ser com o papel filtro em conjunto
com a amostra, sugere-se que as quantidades de ácido sulfúrico e
mistura digestora adicionadas para a digestão sejam dobradas. Método do ácido wolfrâmico ou tunguístico
Segundo, para evitar interferências, o "branco" deve ser realizado (Método N-003/2)
com papel filtro. O percentual de N deve ser calculado como

Aparatos
descrito para o método N-001/2. Este percentual representa o NP
da amostra. Para a correta avaliação, análises do teor total de N do Balança analítica com precisão de 0,0001 g
material devem ser conduzidas em paralelo. Becker

- Funil raiado
Medidor de pH
Cálculo da concentração de nitrogênio proteico e não-proteico
- Papel filtro quantitativo, livre de cinzas e de tilração rápida
O nitrogênio insolúvel após o tratamento com ácido Tubos de digestão macro Kjeldahl em borossilicato
tricloroacético é considerado de origem proteica; assim: - Conjunto para digestão e destilação - bloco digestor e destilador por
arraste de vapor
6NPN ONITCAMSx
%NMs
100 Bureta de 50 mL com graduação de 0.1 mL ou inferior
Erlenmeyer de 250 mlL

102 103
2" Edição
4. Deixe repouso por 30 minutos

em (20-25°C).
Reagentes
5. Ajuste a solução para pH 2,0 adicionando ácido sulfúrico 0.5 M
Tungstato de sódio (Na.04W) P.A. (monitorar com medidor de pH).
- Ácido sulfúrico (H;SO,) concentrado P.A.
6. Deixe em repouso por uma noite em temperatura ambiente.
Soluções
7. Filtre em papel filtro quantitativo livre de cinzas (ashless) colocado
Solução de tungstato de sódio (100 g/L)
em funil raiado e previamente umedecido com água destilada.
Em um balão de 100 mL com cerca de 60 mL de água, dissolva 10 g
de tungstato de sódio P.A. Complete o volume e homogenize a 8. Lave o precipitado com água destilada.
solução. 9. Transfira o papel filtro com o resíduo para um tubo macro Kjeldahl.
Acido sulfúrico (0,5M) 10.Submeta à digestão, destilação e titulação considerando as

-
Em um balão volumétrico de 1000 mL contendo 300-500 mL de

recomendações feitas no método N-O02/2.
água destilada, adicione 30 mL de ácido sulfúrico P.A. Homogeneíze
e complete o volume com água destilada.
-
Amostras de baixo teor proteico (menos de 20% de proteína bruta)

Procedimentos
1. Proceda de forma similar às amostras com alto teor proteico,
Amostras de alto teor proteico (mais de 20% de protena bruta) utilizando 5 mL de solução de tungstato de sódio (100 g/L).
1. Acondicione 0,5 g de amostra seca ao ar (preferencialmente moída

O cálculo das concentrações de compostos nitrogenados
em peneira de porosidade 1 mm) em um becker.
proteicos e não proteicos é realizada de forma similar ao descrito no
2. Adicione 50 mL de água destilada. método N-002/2.
3. Adicione 8 mL de solução de tungstato de sódio (100 g/L).

104 105
Métodos para Análise de Alimentos -2"
INCT Ciência Animal Edição
Literatura Citada Capítulo 6

KRISHNAMOORTHY, U.; MUSCATO, T.V.: SNIFFEN, C.J.; Van
SOEST, P.J. Nitrogen fractions in selected feedstuffs. Journal of Dairy Gordura bruta
Science, v.65, p.217-225, 1982.
LICITRA, G.; HERNANDEZ, T.M.; Van SOEST, P.J. Standardization of Definições básicas
procedures for nitrogen fractionation of ruminant feeds. Aninmal Feed
Science and Technology, v.57, p.347-358, 1996.
A gordura bruta constitui conceito analítico que envolve as
MALAFAIA, P.A.M.; VIEIRA, R.A.M. Técnicas de determinação e
substâncias apolares insolúveis em água, mas solúveis em solventes
avaliação dos compostos nitrogenados em alimentos para ruminantes In:
SIMPOSIO INTERNACIONAL DE DIGESTIBILIDADE EM orgânicos, denominados extratores (e.g. éter etlico, éter de petróleo.
RUMINANTES, Lavras, 1997. Anais... Lavras: FAEPE, 1997. p.29-54.
clorofórmio, benzeno, etc). De forma geral, o conhecimento do teor de
SNIFFEN, CJ.; O'CONNOR, J.D.; Van SOEST, P.J.; FOX, D.G.;
RUSSELL, J.B. A net carbohydrate and protein system for evaluating gordura é relevante na análise de alimentos e na nutrição animal, pois
cattle diets: ILCarbobydrate and protein availability. Journal of Animal
Science, p.3562-3577, 1992. constitui a fração de maior energia dos alimentos, podendo fornecer,
em média, 2,25 vezes mais energia que os carboidratos (Silva &
Queiroz, 2002).
Contudo, como ressaltado acima, o resíduo analiticamente
obtido é, na verdade, uma fração heterogênea, constituída por uma
fração graxa (e.g., galactolipídeos, triglicerídeos) e por uma fração não

graxa, formada por todos os demais compostos apolares que possam
ser extraídos pelo solvente, como esteróis, pigmentos, vitaminas
lipossolúveis, ceras, etc. (Barbosa et al.. 2017). Por isso, o resíduo

extraído é corretamente denominado de gordura bruta em função da
divergência entre o conceito analíitico e o conceito bioquímico de
lipídeos (Silva et al., 2011).
A avaliação quantitativa de lipídeos em alimentos constitui

107
106
INCT CiCneia Animal Métodos para Análise de Alimentos - 2" Ediçio
procedimento importante para avaliações nutricionais

processamento de alimentos/rações. pois altos teores de gordura podem
e de
H avaliação da concentração de EE em amostras sólidas (e.g.. extrações
continuas, semi-contínuas), os quais, entre outros aspectos, distinguem-
demandar ações específicas para seu processamento/armmazenamento, se entre si pela forma como o extrator interage com a amostra.
uma vez que esta fração mostra-se bastante susceptível à deterioração O método de Goldfish utilizado para quantificação de EE
por racindez hidrolítica e/ou oxidativa. Por outro lado, a concentração consiste de um processo de extração continuo no qual o solvente em
de gordura nas dietas ofertadas a animais numinantes possui caráter ebulição é condensado e flui por gotejamento continuamente sobre a
restritivo i.e. com limites máximos de incluso), haja vista a baixa amostra (Xiao, 2010; Jiang et al., 2014). Este método apresenta tres
capacidade oxidativa do ambiente rnuminal, a qual restringe a produção etapas distintas: extração, remoço e quantificação. Na primeira etapa.
do alimento propriamente dita.
de energia a partir de compostos altamente reduzidos, e os efeitos procede-se à extração da fração apolar
deletérios passíveis de ocorrer no rúmen devido a dietas excessivas em Sequencialmente, realiza-se a remoção do solvente por evaporação
material graxo. (normalmente essa etapa é denominada de reciclagem). com posterior

de compostos apolares extraída. Este
No entanto, torna-se importante ressaltar que a gordura bruta avaliação gravimétrica da massa
Contudo, o mesmo
constitui uma entidade analítica definida pelo método em si (Palmiquist método foi predominante no Brasil por muitos anos.
de alternativas
encontra-se atualmente em desuso devido ao surgimento
& Jenkins, 2003). Portanto, quaisquer alterações em termos de métodos
mais eficientes em termos, principalmente, de capacidade operacional.
ou procedimentos dentro de um mesmo método irão implicar na
ainda faz parte do portifólio deste Manual, embora as
quantificação de entidades diferentes. Logo, a correta

O mesmo
método de
recomendações gerais sejam de sua substituição pelo
descrição/aplicação do método e de seus respectivos procedimentos faz-
entidade mensurada Randall.
se necessária para a identificaço adequada da e
de Soxtec ou método
O método de Randall (também chamado
para o cotejamento adequado de resultados.
do teor de EE, constitui
Entre os extratores utilizados para quantificação, os éteres são de submersão), também utilizado para avaliação
alimentos à base de came. O método
acrônimo comum de extrato « eo método previamente aplicado para
considerados modais, o que atribui o
alternativa ao antigo método de extração
foi inicialmente proposto como
(EE) ao resíduo de gordura bruta obtido (i.e., resíduo extraído por éter). baixíssima capacidade
Por outro lado, existem diversos métodos de extração distintos para semi-contínua de Sonhlet devido à sua
109
108
INCT CiCncia Animal Métodos para Análise de Alimentos -2" Edição
operacional. Contudo. atualmente, o método de Randall é tannbém Nenhuma atualização foi proposta para o método de Goldfish,
recomendado para quantificação do teor de gordura bruta em rações, pois, comopreviamente indicado, o mesmo encontra-se em desuso
grãos e forragens (Thiex et al., 2003a). devido a limitações de sua capacidade
operacional e, em alguns casos.
O método de Randall também constitui método de extração menor interação do solvente com os
compostos apolares. Esses
contínua, mas difere parcialmente do método de Goldfish na forma aspectos são melhor explorados pela aplicação do método de Randall.
como o solvente orgânico interage com a amostra. Durante parte da O método de Randall foi devidamente avaliado para amostras
extração, a amostra encontra-se submersa no solvente, aumentando o de forragens e amostras fecais pelo grupo do INCT Ciência Animal
contato do solvente com os compostos apolares e, consequentemente, a (Barbosa et al., 2017). Contudo, avaliações adicionais foram
taxa de extração dos mesmos. Portanto, existe uma etapa adicional em conduzidas visando a adequação dos tempos das etapas de submersão
relação ao método de Goldfish, no qual a amostra é imersa no solvente e gotejamento (Oliveira et al.. 2018).
em ebuliçao, o que acelera otimiza o processo de extração de Um método de hidrólise ácida foi incluído como preparatório
compostos apolares. para análise de EE para o caso de amostras ricas em sabões de cálcio,
Nesse sentido, o método de submersão diminui os quais são utilizados como fontes de gordura protegida para animais
consideravelmente o tempo de extração necessário para concluir a ruminantes, podendo também ser formados no intestino de animais de
análise. Esse aumento na taxa de extração é desejável na busca de produção, processo acentuado quando ocorme inclusão de gordura nas
tempos de anáise menores e maior capacidade operacional (Thiex et al., dietas. Os sabões de cálcio são insolúveis em éter. Portanto, a presença
2003b). Entre os métodos aplicados para a quantificação de EE significativa desses compostos na amostra pode levar à subestimação
atualmente, o método de Randall é considerado modal. A maioria dos do teor de gordura bruta caso os mesmos não sejam hidrolisados
equipamentos produzidos atualmente é baseada nesse método. Cabe previamente aos procedimentos de extração, principalmente em
ressaltar que os equipamentos produzidos para realização da extração amostras fecais. Cabe ressaltar que, como o EE é definido pelo
de Randall podem ser usados na extração de Goldfish (basta omitir a método, a inclusão de hidrólise ácida deve ser considerada como uma
etapa de imersão). Contudo, o contrário não se faz verdadeiro.
modificação do método de extração subsequente. Assim, sugere-se,
Atualizações caso o conjunto de amostras seja oriunda de um ensaio de digestão
110 111
INCT CiRcia Animal
(i.e.. ofertado. sobras, digesta e material fecal), que a hidrólise seja
Procedimentos
aplicada a todas as amostras, visando o uso de uma entidade única no
. Use balança analítica aferida pelo INMETRO.
cômputo dos coeficientes de digestibilidade aparente. O método de com precisão de
hidrólise ácida aqui proposto é composto de adaptação do método 0,0001 g, sobre bancada especial de laboratório e em ambiente
adotado climatizado (20-25°C ou de acordo com as especificações do

pelo Instituto Adolfo Lutz (1AL, 2008), com modificações
sugeridas por Rodrigues et al. (2017). fabricante). Ligue a balança e aguarde 30 minutos para sua
estabilização.
Método de Goldfish
2. Pese aproximadamente 2 gramas de amostra seca ao ar
(Método G-004/1) (preferencialmente moída em peneira de porosidade mm) emn
cartucho de celulose ou em papel de filtro qualitativo. Neste último

Aparatos
caso, uma folha de papel filtro é utilizada para receber a amostra e
outra é utilizada como envoltório, produzindo-se um cartucho.
- Dessecador
Ressalta-se que a massa de amostra pode variar em função da
-
Estufa sem circulação forçada de ar sensibilidade analítica. Materiais com alto teor de EE podem ser
-
Aparelho para extração de gordura tipo Goldfisch equipado com

avaliados com menor massa de amostra. ao passo que materiais
suporte para cartuchos de vidro e tubos coletores de éter
com baixo teor de EE deverão ser avaliados com maiores alíquotas
-
Copos próprios para extração de gordura (seguir especificação do

para que se garanta residuo mensurável de acordo com a
equipamento) sensibilidade analítica.

-Cartucho
extratorde celulose ou de papel filtro qualitativo 80 g/m?
3. Numere os copos, lave-os e seque-os por 16 horas ("uma noite") em
Reagente estufa a 105°C.
Eter de petróleo P.A. (benzina)

4. dessecador devidamente preparado (máximo de 20
Coloque-os em
unidades por procedinmento), a fin de estriá-los. A principal função

112
13
INCT Ciêneia Animal Métodos para Análise de Alimentos 2"
-
Ediçäo
de um dessecador é permitir o restriamento das amostras após 8.
o Adicione cerca de 50 a 100 mL de éter de
petróleo em cada copo.
periodo de secagem sem absorver umidade, via uso de um
Oéter não deve entrar em contato direto com o cartucho. A
dessecante. como a sílica gel. De forma particular, a sílica-gel quantidade de éter poderá variar de acordo com o tamanho do copo
sugerida devido ao seu baixo custo, à facilidade de manejo e à de extração (veja as
especificações de seu equipamento).
possibilidade de reciclagem e reuso. Assim, o dessecador de. estar
sempre limpo, secoe possuir sílica gel na tonalidade azul escuro 9. Acopleo copo no extrator.
em seu interior. A área de contato entre o corpo do dessecador e sua 10. Inicie o
aquecimento e a circulação de água no condensador.
tampa deve ser levemente lubrificada com graxa de silicone de
forma a permitir um deslizamento adequado e melhorar

11.Após se iniciar a ebulição do éter, verifique se não há vazamento
a vedação
durante o período de resfriamento. deste durante sua ebulição e condensação.
5. 12. Extraia por 4 horas taxa de condensação

Após estabilizaço com a temperatura ambiente (normalmente em com de 5 a 6 gotas por
torno de 30 minutos), pese os copos, removendo-os um de cada vez segundo. Verifique se as gotas estão passando por dentro dos
do dessecador, mantendo-o fechado entre dos cartuchos.
as remoções
recipientes. 13. Após a extração, proceda à retirada do éter pelo esquema de
6. Acondicione cartuchos reciclagem característico de cada equipamento até que uma

os em seus
respectivos copos e mantenha-
os em estufa não ventilada 105°C por 2 horas. Se camada delgada (aproximadamente 1 mm) de éter permaneça no
a a extração não
imediatamente após fundo do copo.
Ocorrer este procedimento de secagem,
mantenha os cartuchos dentro de seus respectivos copos em
14. Coloque os copos em estufa não ventilada a 105°C por 30 minutos
dessecador.
para terminar a evaporação do éter. Cuidado, se os copos forem
7. colocados na estufa com excess0 de éter poderá ocorrer
Acople os cartuchos no extrator.
explosão.
114
115
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos -
2" Edição
a
15. Acondicione enm dessecador até que ocora equilfbrio com
Exemplo de cálculo
proceda à Siga as instruções

temperatura ambiente e pesagem.
A diferença Considerando a aliquota I na tabela abaixo, têm-se os cálculos
gerais de uso do dessecador descritas nos passos 4 e 5.
peso da para estimativa da gordura bruta ou extrato etéreo:
entre este último peso e o do copo vazio corresponde ao
gordura bruta extraída.

EE (copo+EE)-copo=115,6822-115,6318=0,0504 g
Cálculo da concentração de gordura bruta
EE 0,0504
%EEasaASA 100 2,0038 x 100 2,52%
Para o cálculo da gordura bruta ou extrato etéreo, utilize
sequencialmente as equações:
2,52
%EEMs %EEAS
%ASE
100 =
95,86x
100 2,62%
EE=(copo+EE)-copo
Alíquota
EE
6EEASAA ASAx100 Item 3
ASA (g) 2,0038 2,0363 2.0010
6EEASA 100 Copo (g) 115.6318 147,0963 109.1055
%EEMS9%ASE Copo+EE (g) 115,6822 147,1469 109,1554
0,0504 0.0506 0,0499

massa do copo de
EE ()
em que: EE = massa de extrato etéreo (g); copo =
2,52 2.48 249

extrato etéreo base na T%EEASA
extração (g); %EEASA =
percentual de com
T%ASE 95,86
amostra seca ao ar; ASA = massa de amostra seca ao ar (g); %EEMs =
T%EEMs 2,62 2,59 2,60

extrato etéreo com base na matéria seca; %ASE =
percentual de
%EEMs (média) 2,60
116 17
m
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos
- 2" Edição
Método de Randall . Pesc
aproximadamente 2 gramas de amostra seca ao ar
para equipamentos Gerhardt Soxtherm 2000., Tecnal TE-044,
(preferencialmente moída em peneira de porosidade I mm) em
Marconi MA491/6 ou similares) cartucho de celulose
papel de filtro qualitativo. Neste último
ou em
(Método G-005/2) caso, folha de papel filtro é utilizada

uma
para receber a amostra e
outra é utilizada como
Aparatos envoltório, produzindo-se um cartucho.
Ressalta-se que a massa de amostra pode variar em
função da
Balança analítica com precisão de 0,0001g sensibilidade analítica. Materiais com alto teor de EE podem ser
- Dessecador
avaliados com menor massa de amostra, ao
passo que materiais
Estufa sem circulação forçada de ar com baixo teor de EE deverão ser avaliados com maiores alíquotas
-
Aparelho para extração de gordura tipo Randall, equipado com para que garanta resíduo mensurável
se
de acordo com a
suporte para cartuchos de vidro e tubos coletores de éter sensibilidade analítica.
-
Copos próprios para extração de gordura (seguir especificação do

3. Numere
equipamento)
os copos, lave-os e seque-os por 16 horas ("uma noite") em
estufa a 105°C.
-Cartucho
exrator de celulose ou papel filtro qualitativo 80 g/m?
4. Coloque-os em dessecador devidamente preparado (máximo de 20
Reagente
unidades por procedimento), a fim de esfriá-los. A
principal função
Eter de petróleo P.A. (benzina) de um dessecador é
permitir o restriamento das amostras após o
Procedimentos período de secagem sem absorver umidade, via uso de um
dessecante, como a sílica gel. De forma particular, a sílica-gel é

1. Use balança analítica
aferidapelo INMETRO, com precisão de 0,0001 sugerida devido ao seu baixo custo, à facilidade de manejo e à
(20-25°C ou de acordo com as especificações do fabricante). Ligue a
sempre lumpo, seco e possuir sílica gel na tonalidade azul escuro
em seu interior. A área de contato entre o corpo do dessecador e sua
118 119
INCTCn a Anima Métndos para Análise de Alimmentos 2" Fdiçin
tampa deve ser leve ente lubrificada com graxa de silicone de 10. Após se inicar a ebulição do éter. verifique se não ha vazamento
forma a pemitir um deslizamento adequado e melhorar a vedaçâo deste durante sua ebulição e condensação
durante o período de resfriamento.
11.Mantenha os cartuchos submersos no solvente em ebulição por 20
5. Após estabilização com a temperatura ambiente (nomalmente em minutos.
tormo de 30 minutos). pese os copos, removendo-os um de cada vez

12. Suspenda os cartuchos (ou reduza o volume de éter: isso dependerá da
do dessecador. mantendo-o fechado entre as remoções dos
marca e modelo do cquipamento)e extraa por 80 minutos com taxa
recipientes.
de condensação mínima de 3 a 5 gotas por segundo. Assegure-se que
6. Acondicione os cartuchos em seus respectivos copos e mantenha-os as gotas estão passando por dentro dos cartuchos.
em estufa não ventilada a 105°C por 2 horas. Se a extração não

13. Após a extração, prnceda à retirada do éter pelo esquema de reciclagem
ocorrer imediatamente após este procedimento de secagem,
característico de cada equipunento até que uma camada delgala
mantenha os cartuchos dentro de seus respectivos copos em
(aproximadamente I mm) de cter pemaneça no tundo do copo.
dessecador.
14.Coloque os copos em estufa no ventilauda a l05°C por 30 minutos

7. Adicione éter de petróleo em cada copo. . quantidade deve ser
para teminar a evaporação do éter. Cuidado, se os copos forem
suficiente para permiir a realização da extração na fase de
colocados ma estufa com excesso de éter poderá ocorrer explosão.
submersãoe pode variar em funço do equipamento.
15. Acondicione em desseeador té que ocora cyulbrio com a
8. Coloque os cartuchos no local indicado no equipamento (i.e.,

lemperatura ambiente prucela à pesagem. Siga as instruções gerais
e
suporte) e acople o copo no extrator. Posicione os cartuchos

de uso do dessecador deseritas nos passos 4 e 5, A diterença entre este
imersos no éter.
iltimo peso e o do copo vazio cornesponde iao peso da gordura
9. Inicie o aquecimento e a circulação de água no condensador. extraida.
120 121
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de limentos-2" Edição
Em capela, adicione água destilada ao frasco erlenmeyer

1000 ml de
-
Os cálculos da concentração de EE são realizados de forma

similar ao descrito no método G-004/1. de 2000 mL. Com cuidado, acrescente 500 mL de ácido clorídrico
P.A. Aguarde o resfriamento.
Hidrólise ácida pré-extração de gordura
(Método G-006/1) Procedimentos
Aparatos 1. Use balança analítica aferida pelo INMETRO. com precisão de
0,0001 g, sobre bancadaespecial de laboratórioe em ambiente

Chapa aquecedora ou banho de areia
fabricante). Ligue a balança e aguarde 30 minutos para sua
-
Capela com exaustão estabilização.

-
Frascos erlenmeyer 250 mL 4 de amostra seca ao ar

2. Pese aproximadamente gramnas
Frasco erlenmeyer 2000 mL de I mm)
(preferencialmente moída em peneira porosidade e
Vidros de relógio acondicone em frasco erlenmeyer de 250 mL.

-
Papel de filtro qualitativo 80 g/m

3. Em adicione sobre a amostra 40 mL da solução de ácido
-
Béqueres 500 mL capela,

- Funis raiados clorídrico 1:2 e cubra com o vidro de relógio.
Papel indicador de pH coberto com o vidro de

4. Coloque o erlenmeyer com a amostra e
relógio sobre a chapa aquecedora ou banho de areia, que deverá

Reagente
estar no interior da capela.
Acido clorídrico (HCI) 37% P.A.
a 120°C. Aguarde
Solução
5. Aqueça o equipamento até a temperatura de 110
minutos.
até a ebulição. Mantenha nessas condições por 30
Solução de ácido clorídrico 1:2
122 123
Mtodos para Análise de Almentos2" Ediçio
INCTCcna Animal
banho de arcia Literatura Citada

o. Retie os erlennmeyers da chapa aquccedora ou e
deixe esfriar no interior da capela. BARBOSA. M.M DETMANN. E. VALADARES FILHO. SC

DETMANN. K.S.C. FRANCO. M0: BATISTA, E.D.; ROCHA, G.C.
7, Filtre o conteúdo em papel de filro qualitativo 80 g/hn' com o Fvaluation of methods for the quantification of ether extract contents in
forage and cattle feces. Anais da Academia Brasileira de Ciencias.
auxilio de funil raiado e de um béquer de 500 ml que receberá o
v.89. p.1295-1303. 2017.
descartado. Lave interior do erlenmeyer
sobrenadante a ser o com
INSTITUTO ADOLFO LUTZ - IAL. Métodos fisico-químicos para
análise de alimentos. 4 ed. So Paulo: Instituto Adolfo Lut/, 2008.
água destilada quente (temperatura igual ou superior a 90 °C) para
1020p
garantir a transferência quantitativa do resíduo para o papel de safety: food analysis
JIANG. B.: TSAO. R.: LI. Y.: MLAO. M. Food
technologies/techniques. In: Van ALFEN. N.K. (Ed.) Enclyclopedia of
filtro. 2 ed. Amsterdan: Elsevier. 2014, p.273
agriculture and food systems.
288.
8. Proceda à lavagem do resíduo retido no papel de filtro com água
SILVA. D.J.: QUEROZ, A.C. Análise de alimentos.
Métodos quimicos e
destilada quente (temperatura igual ou superior a 90°C). Monitore biológicos. 3 ed. Viçosa: Editora UFV, 2002. 235p.
DETMANN,
o pH constantemente com o papel indicador. A lavagem deve ser SILVA. P.T.: DETMANN, E.: VALADARES FILHO. S.C.:
L.E.: COSTA.
K.S.C.: BARROS. L.V.: MARTINS, S.C.V.; MORAIS,
conduzida até a neutralização (i.e., pH = 7,0). in feeds and cattle
V.A.C. Evaluation of total and non-tatty ether extract
feces two analytical methods. Animal Feed Science and
using
2011.
9. Retire o papel contendo o resíduo e acondicione sobre um vidro de Technology. v.163. p.111-17,
J.P.P.: GARCIA.
OLIVEIRA. A.C.R.: DETMANN. E.: RODRIGUES.
relógio. Conduza à estufa sem ventilação forçada (105°C) por 16 Efcitos dos tempos de
A.M.M.: TEIXEIRA. I.C.: RODRIGUES. A.N.
bruta pelo método
horas ("uma noite"). imersão e de gotejamento sobre a estimativa de gordura
Randall. In: SIMPOSIO DE INTEGRAÇÃO ACADEMICA, 2018.
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2018. Disponivel em
Anais... Viçosa: UFV.
10. Acondicione o material em cartuchos de celulose ou confeccione
https://www.3.dti.utv.br/sia/vicosa/2013/trabalhos/
cartucho com papel de filtro qualitativo 80 g/m. JENKINS T.C. Challenges with fats and fatty
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PALMQUIST, D.L.:
methods. Journal of Animal Science. v.81. p.3250-3254, 2003.
11. Proceda à extração da gordura conforme o método G-005/2. FONTES, M.M.S.:
RODRIGUES, J.P.P.: PAULA, R.M; RENNO, L.N.;
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M.l. Short-term etfects ot soybean oil supplementation
Os cálculos da concentração de EE são realizados de forma MARCONDES,
on pertormanee, digestion,
and metabolisnm in dairy cows fed sugarcane-
2017.
similar ao previamente descrito. based diets. Journal of Dairy Science, v. 100. p.4435-4447,
125
124
INCT Ciencia Animal Métodos para Análise de Alimentos -
20 Edição
THIEX, N.; ANDERSON, S.; GILDEMEISTER, B. Crude fat, hexanes
extraction, in feed, cereal grain, and forage (Randal/Soxtec/Submersion Capítulo 7
method): collaborative study. Journal of AOAC International, v.86,
p.899-908, 2003a.
THIEX, N.; ANDERSON, S.; GILDEMEISTER, B. Crude fat, diethyl ether Fibra
extraction, in feed, cereal grain, and forage (Randall/Soxtec/Submersion
method): collaborative study. Journal of AOAC International, v.86, 7.1. Fibra insolúvel em detergentes neutroe ácido
p.888-898, 2003b.
XIAO, L. Evaluation of extraction methods for recovery of fatty acids Definiçoes básicas
from marine products. 121f. Dissertação de Mestrado, University of
Bergen, Noruega, 2010.
Embora o termo fibra seja de uso comum no vocabulário
associado nutrição animal, a definição exata de seu significado
constitui processo extremamente complexo em virtude da necessidade

de se compatibilizar aspectos nutricionais e analític0s. Em termos
gerais, a fibra constitui um termo exclusivamente nutricional que

compreende os compostos indigestíveis ou de lenta digestão que
ocupam espaço no trato gastrintestinal dos animais (Undersander et

al., 1993). Sob um ponto de vista químico, estes componentes
constituem mistura de celulose, hemicelulose, lignina, pectina e ate

mesmo outros compostos como proteína, lipídeos, minerais e alguns
carboidratos não fibrosos indigestíveis (Detmann, 2010).

estabelece-
A partir desta definição nutricional geral de fibra,
verdadeiramente mensurada
se a premissa que esta somente pode ser
1993). Contudo, embora
pelo animal (Undersander et al.,
nutricionalmente embasada, definição anteriormente apresentada
demandam
representa empecilho primário aos nutricionistas, os quais
127
126
-2" Edição
vias práticas e rotineiras para mensuração da fibra dos alimentos com dctergente neutro (DN). com digestibilidade verdadeira alta e
o objetivo de aplicação ao desenvolvimento ou construção de dictas aproximadamente constante entre alimentos. da fração insolúvel em
que suportem o nível de produção planejado para determinado sistema DN, com digestibilidade menor e variável entre alimentos (Huhtanen
(Detmann. 2010). et al., 2006). Contudo, embora o conceito aparente ser simples. a
Em termos teóricos, os métodos laboratoriais para análise de Cxtração em DN mostra-se totalmente complexa. com alto nivel de
fibra em alimentos deveriam ser desenvolvidos para se ajustarem a um possíveis interferèncias, o que demanda alta complexidade na soluço
conceito nutricional e não o contrário. Contudo, torna-se praticamente de DN.
impossível que algum método baseado em mensurações laboratoriais Por outro lado. a extração em detergente ácido (DA) mostra
químicas ou enzimáticas possa reproduzir todos os efeitos nutricionais se mais simples e com menor número de interferências advindas de
da fibra no animal (Mertens, 2003). Assim, embora a fibra da dieta outros compostos presentes na matriz orgânica dos alimentos (Van
devesse ser definida por conceitos nutricionais (e não analíticos), esta Soest & Robertson. 1985). Contudo. o resíduo obtido a partir da
constitui na práica uma mensuração empírica que é definida pelo extração em DA não se associa a nenhum conceito nutricionalmente
método de análise em si. válido de fibra (Van Soest. 1994). Assim, a extração em DA deve ser
Os métodos de análise denominados fibra insolúvel em vista principalmente como um passo preparatório para redução das
detergente neutro (FDN) e fibra insolúvel em detergente ácido (FDA) interferências sobre a quantificação posterior da concentração de
foram originalmente desenvolvidos por P.J. Van Soest na década de lignina em alimentos ou dietas.
1960 e estão baseados na recuperação do resíduo fibroso insolúvel em
meio neutro ou ácido, empregando-se extração em meio aquoso Atualizaçõdes
mediada por calor e pela ação de um detergente aniônico (lauril sulfato
Essencialmente, as aualizações aqui adotadas centram-se
de sódio) ou catiônico (brometo de cetil trimetilamônio), sobre três pontos. Primeiro, sobre omissõies de descrições da primeira
respectivamente (Van Soest& Robertson, 1985). anteriormente
edição: segundo, sobre modificações dos métodos
A FDN constitui aproximação química à fibra insolúvel do de cadinhos
adotados; e, terceiro, sobre o retorno efetivo do uso
alimento/dieta e permite a separação entre a porção solúvel em

filtrantes como referdncia para análise. principalmente, de FDN.
128 129
2" Edição
Durante a feitura da
primeira edição deste Manual, já havia por proeminentes são observados sobre os valores de FDN, cuja extração é
parte da AOAC International (AOAC) um método oficial de análise de mais complexa e, assim, mais susceptível a interferências nas mudanças
FDN, o qual se baseava no uso de extrator de fibras e cadinhos filtrantes de parâmetros físico-químicos da
extração.
(Mertens, 2002). No entanto, a análise de alimentos em Zootecnia vivia o Deve ser ressaltado que as análises laboratoriais de fibra
momento dos filter bags e seu instrumental de análise (i.e., autoclaves e aplicadas atualmente em Zootecnia são categorizadas como métodos do
analisadores de fibras), cujaprincipal bandeira residia sobre o aumento tipo I de acordo com o Codex Alimentarius. Logo, os métodos permitem
de praticidade e capacidade operacional na análise de fibras. Dessa
forma, acessar um determinado valor que é definido pelo método em si (Codex
o comite
organizador da primeira edição deste Manual baseou suas Alimentarius Commission, 2018). Uma vez que não existem padrões ou
recomendações focando tais métodos, embora mantivesse seu referências prmárias para este tipo de método, esses não podem ser
conhecimento sobre os métodos tradicionais de análises de fibras. validados quanto a sua exatidão, ou seja. quanto à sua capacidade de
Contudo, durante e após elaboração
a da primeira edição deste produzir resultados convergentes ao "valor real" para a entidade analítica
Manual, novas evidências foram levantadas em trabalhos científicos que em questão. Assim, para se minimizar erros sistemáticos entre
levaram o comitê organizador a reavaliar suas
prioridades. Assim, a maior laboratórios, os métodos ditos empíricos (i.e. métodos tipo I) devem ser
modificação a ser adotada nesta nova edição é a introdução de métodos
seguidos exatamente como descrito nos protocolos padrões, pois mesmo
de análise de FDN (e, por conseguinte, FDA) baseados no uso de a menor variação nos procedimentos pode acarretar na mensuração de
cadinhos filtrantes ao invés de filter bags, os quais são considerados como uma entidade analítica distinta da originalmente proposta (Mertens,
referências intermacionais (Mertens, 2002; Barbosa et al., 2015; Silva et 2003).
al., 2018). Considerando as colocações do parigrafo anterior, faz-se
Embora não haja dúvida de que o uso de filter bags aumente a extremamente completa descrição dos procedimentos usados
necessário a
método especítico seja
praticidade eacapacidade operacional do método, evidências tem sido para análise dos compostos fibrosos. Caso um
método ser
apresentadas de que sua utilização pode incorrer em vícios e erros sobre seguido, sua referenciação deve ser adequada. No caso de um
o processo de quantificação de componentes fibrosos (Gomes et al., 2011; seguido, mas com alguma modificação, mesmo que mínima, esta deve
Barbosa et al., 2015; Silva et al., 2018). Nornmalmente, os problemas mais
130 131
INCT Concia Animal Métodos para Análise de Alimentos 2" Ediin
ser plenamente descrita para que os resultados, caso necessário, sejam Alguns detalhes adicionais devem ser irisados para avaliação
interpretáveis e passíveis de cotejamento inter-experimental não viesado. adcquada dos conteúdos de fibra em alimentos, principalmente FDN. Em
O uso de filter bags pode restringir a circulação de extrator pela primeiro lugar, as partículas devem ser padronizadas a partir de moagem
amostra e comprometer a extração daquilo que seria solúvel em com peneira de porosidade I mm (Mertens, 2002: Valente et al.. 2011a).
detergente neutro, principalmente com alinmentos concentrados (Barbosa Tamanhos de partículas superiores propiciam menor superticie especifica
et al. 2015). Contudo, o método de extração com flter bags pode ser da porção teste. comprometendo o acesso da solução de detergente e
considerado rústico e preciso e. portanto, útil para o cotejamento intra- também da a-amilase termoestável (Valente et al.. 201 la).
experimental (Mertens. 1999; Silva et al, 2018). O principal ponto para Os resultados obtidos no Brasil sob as mesmas condições de
garantir essas características reside sobre o uso de sistemas pressurizados extração indicam que tanto filter bags F57 (Ankom®) como aqueles
de extração. O uso de equipamentos não pressurizados compromete a confeccionados com tecido não-tecido (TNT, 100 g/m) propiciam
qualidade e a precisão dos resultados (Silva et al., 2018), um possível resultados similares de FDN e FDA (Casali et al. 2009: Valente et al.
reflexo do acúmulo de bolhas no interior dos filter bags (Gomes et al., 2011a). Adiferença básica entre ambos reside sobre a menor resistência
a danos fisicos exibida pelos filter bags de TNT (Valente et al. 2011b),
o
2011), o que compromete ahomogeneidade de contato entre o extratore
o material a ser extraído. A pressurização amplia a temperatura de que detemina que não haja reutilização dos mesmos.
Amostras com alto teor de gordura (i.e., extrato etéreo maior que
ebulição do extrator e, consequentemente, evita a formação de bolhas no
interior dos filter bags. A maioria dos equipamentos nacionais para 10%, com base na matéria seca) não apresentarão extração adequada do
Isso se dá pela tendência de
extrações com filter bags opera sob condições não pressurizadas, não material solúvel em detergente neutro.
levando à migração
sendo recomendada a sua
utilização formação de uma solução bifásica durante a extração,
sua ação na fase
do detergente neutro paraa fase apolare comprometendo
Valente et al., 2011c). Assim, tais
polar (Van Soest & Robertson, 1985;
7Este é o motivo pelo qual a descrição do método inclui uma marca à
comercial de equipamentos, cujos modelos operam sob pressurização. Não
amostras devem ser parcialmente desengorduradas previamente
de forma a reduzir sua
há compromisso algum do comitê organizador deste Manual com a empresa
extração com acetona ou éter de petróleo
citada. Apenas priorizou-se a adequação do processo de extração à
necessidade de um ambiente físico-químico específico que é propiciado por
tais equipamentos.
133
132
INCT Ciencia Animal
2° Edição
concentração de extrato etéreo para aquém de 10% com base na matéria
A utilização de
a-amilase termoestável
Seca.
obrigatória para a
Embora o método referência da AOAC
avaliação de FDN independentemente do instrumental de
(Mertens, 2002) inclua a análise.
aquecimento em meio neutro promove a gelatinização do amido
utilização de sulfito de sódio na análise de FDN, o comitê organizador do presente
na amostra (Hall, 2007), o qual, em não sendo retirado, inflaria o valor do
presente Manual não recomenda utilização. Em teoria, a principal
sua
precipitado superestimaria a concentração de FDN (Valente et al.
função do sulfito de sódio seria reduzir a
contaminação proteica do 2011c). Contudo, tona-se importante ressaltar que o uso de a-amilase
resíduo insolúvel em detergente neutro por agir na
clivagem de ligações termoestável é passo constituinte do método, não cabendo ao analista
bissulfidicas (Van Soest & Robertson, 1985). Contudo, o sulfito
pode aplicar seletivamente sua utilização
apresentar ações de clivagem de ligações fenólicas, reduzindo a função em da natureza da amostra.
Portanto, a mesma deve ser utilizada em toda e qualquer amostra visando
concentração de lignina no resíduo insolúvel e, consequentemente. à homogeneidade de
subestimando a
aplicação do método empírico.
concentração de FDN (Van Soest et al., 1991: Gomes et Existem divergências na literatura quanto à forma de utilização
al., 2012). Há de se ressaltar que, embora possa reduzir a
contaminação da a-amilase termoestável na análise de FDN. O método oficial da
AOAC
proteica sobre a FDN, o sulfito de sódio não é capaz de anulá-la
inclui um processo de padronização de atividade da enzima, a qual é
completanmente (Gomes al., 2012). Somando-se a isso o fato da
et
utilizada em duas instâncias: durante extração durante o processo de
a e
solubilização de lignina, entende-se que a utilização do sulfito de sódio é
filtração (Mertens, 2002). Em trabalho conduzido pelo grupo de pesquisa
controversa e capaz de gerar mais prejuízos do que benefícios. Logo, na gerenciado pelo comitê organizador deste Manual, verificou-se que a
necessidade de correção para contaminação proteica, o presente Manual segunda adição de a-amilase (i.e., durante a filtração) no modifica o
sugere a quantificação direta da proteína associada à fibra e seu desconto valor do resíduo insolúvel em detergente neutro (Barbosa et al., 2015),
de forma aritmética. Para o caso de estudos que possuam interesse direto não sendo, assim, aqui recomendada.
no valor da proteína associada à fibra ou da concentração de lignina (por Adicionalmente, não há aqui recomendação para um processo de
análise sequencial), o sulfito de sódio não deve ser utilizado (Van Soest padronização para a atividade enzimática. Isso se dá pelo fato de o método
et al., 1991).
se basear no uso de enzimas industriais, cuja padrão de atividade faz parte
das caracteristicas do produto (Gomes et al., 2014). Logo. o procedimento
134 135
2" Edição
analítico se toma menos laborioso e rápido. A enzima sugerida -
Aparelho analisador de fibras Ankom ou Ankom ou
produzida pelo Bacillus licheniformis e comercialmente encontrada como AnkomDELTA ou autoclave

Termamyl 2X ou Lyquozime Supra 2.2.X. A diferença entre ambas -
Erlenmeyers (4 e 10 L)
consiste basicamente do nível de atividade do produto ofertado n0 Coletores universais autoclaváveis
mercado, que é de 240 e 300 KNU/g, respectivamente. Ambas são Panela de alumínio
igualmente efetivas (Gomes et al, 2014), sendo que a segunda tende a -
Bandejas de alumínio
substituir comercialmente a primeira devido à sua maior atividade" -
Fogão ou fogareiro
7.1.1. Métodos para fibras utilizando filter bags Reagentes

FDN utilizando analisador de fibras - Método F-001/2 -
Sulfato láurico de sódio (NaCHas5O.) P.A.

FDN utilizando autoclave - Método F-002/2 Etilenodiamino tetra-acético (EDTA) sal dissódico
FDA utilizando analisador de fibras - Método F-003/2 (CioH1aNOs.2Na.2H:0) didratado P.A. ou EDTA ácido
FDA utilizando autoclave - Método F-004/2 (CoHNOs) P.A. e hidróxido de sódio (NaOH) P.A.
-
Tetraborato de sódio (Na.B.0.10H:0) decahidratado P.A.

Aparatos -
Fosfato de sódio dibásico anidro (Na-HPOs) ou heptahidratado

Balança analítica com precisão de 0,0001 g (NaoHPO4.7H20) P.A.
- Dessecador -
Trietilenoglicol (CsH1sO:) P.A.

-
Estufa com circulação forçada de ar
-
-amilase termo-estável (Lyquozime Supra 2.2.X, Novozymes,

-
Estufa sem circulação forçada de ar Araucária, PR, Brasil)
Sacos FS7 (Ankom®) ou de tecido não tecido (TNT, 100 g/m) - Åcido sulfúrico (H:S0s) concentrado P.A.
- Seladora - Brometo de cetil trimetilamônio (CH4:BrN) P.A. (cetremide ou CTAB)
- Acetona (C.HO) P.A.

KNU significa kilo novo units e representa a quantidade de a-amilase que,
Detergente neutro comercial
sob condições padrões(pH 7,1;37°C), dextriniza 5,26 g de amido.
136 137
INCT Ciência Aninal Métodos para Análise de Alimentos -
2" Edição
Soluções Solução de detergente ácido
I
-
Em Erlenmeyer de 10 L, adicione 4 L de água destilada previamente

Solução de detergente neutro comercial
Em aquecida. Adicione 200 g de CTAB P.A. e agite levemente. Adicione
Erlenmeyer de 4 L, adicione 1 L de água destilada e 80 mLde
lentamente 277 mL de ácido sulfúrico concentrado P.A.
detergente neutro comercial. Agite até a completa homogeneização Agite atéé a
solubilização e complete o volume com água destilada.

Procedimentos
Solução de detergente neutro
-
Em Erlenmeyer de 10 L, adicione 4 L de água destilada previamente Use

balança analítica aferida pelo INMETRO, com precisãoo
aquecida. Adicione 300 g de sulfato 1áurico de sódio P.A., 186,1 g de 0,0001 g, sobre bancada especial de laboratório e em ambiente
de EDTA sal dissódico P.A. (ou 146,1 g de EDTA ácido P.A. e 40 g climatizado (20-25°C ou de acordo com as especificações do
de hidróxido de sódio P.A.), 68,1 g de tetraborato de sódio fabricante). Ligue a balança e aguarde 30 minutos para sua
decahidratado P.A., 45,6 g de fosfato de sódio dibásico anidro P.A. estabilização.

(ou 81,54 g de fosfato de sódio dibásico heptahidratado P.A.) e 100
Preparação dos filter bags
mL de trietilenoglicol P.A. Agite até a completa solubilização.
Complete o volume com água destilada. O pH final da solução deve 1. Identifique os filter bags com marcador permanente.
estar entre 6,95 e 7,05. Caso o pH final esteja abaixo de 6,50 ou 2. Acondicione os filter bags em panela de alumínio e adicione a solução
acima de 7,50, descarte a solução. Para pH final de de detergente neutro comercial em volume suficiente para cobrir todo o
6,50spH<6,95, ajuste para a faixa ideal com adição de pequenas material.
3. Leve fogão fogareiro aqueça. A solução deve

porções de hidróxido de sódio. Para pH final de 7,05<pHS7,50 o recipiente ao ou e
ser mantida em ebulição por 15 minutos.

ajuste para a faixa ideal gotejando ácido clorídrico concentrado.
água corrente até a total retirada do
Sob temperaturas ambientes baixas pode haver precipitação 4. Lave os filter bags com
parcial na solução armazenada. Nesses casos, aqueça levemente detergente.

a solução e agite para a ressolubulização antes do uso.
138 139
INCT Ciência Animal Métodos paru Análise de Alimentos -
2" Edição
5. Seque os filter bags em bandejas (canmada delgada sem
16.Acondicione osfilter bags individualmente em coletores universais
sobreposição), sequencialmente, em estufa com circulação forçada
autoclaváveis e adicione solução de detergente neutro à
de ar a 55°C por 24 horas e em estufa não ventilada a 105°C por 2
temperatura ambiente. A relação detergente:amostra deve ser de,
horas. aproximadamente, 100 mL/g.
6. Acondicione os filter bags em dessecador (máximo de 20 unidades
2. Adicione a-amilase termoestável (Lyquozime Supra 2.2.X) na
por procedimento) e aguarde o equilbrio com a temperatura
proporção de 500 uL/amostra.
ambiente.
7. Pese os filter bagse registre o peso. Esse será o peso da tara. analisador de fibras Ankom ou
3. Aqueça a solução em aparelho
8. Acondicione as amostras nos filter bags seguindo-se a relação de 20 AnkomLT autoclave à temperatura de 105°Ce
Ankom20 ou ou
mg de matéria seca por centímetro quadrado de superfície. Sacos F57 mantenha por 1 hora. O tempo de extraço é contabilizado após
aproximadamente 36 cm2 de superfície. Assim, seriam a temperatura ser atingida.

possuem
necessários 720 mg de matéria seca ou, aproximadamente, 800 mg de
amostra seca ao ar. O mesmo raciocínio é seguido para os filter bags 4. Lave os filter bags com água destilada quente (temperatura >90°C)
até a completa retirada da solução de detergente.
confeccionados com TNT, cujas dimensões sugeridas são de 4,0 x 4,5
As amostras devem ser obrigatoriamente processadas em

recipiente e cubra-os com acetona.
cm. 5. Adicione os filter bags em um
moinho de facas com peneira de porosidade de 1 mm. Agite por 3 a 5 minutos.
bandejas (camada delgada

sem
6. Seque os filter bags em
Extração sequencialmente, em estufa com circulação forçada

sobreposição),
analisador de fibras estufa não ventilada a 105°C por 2
la.Acondicione os filter bags em aparelho de ar a 55°C por 24 horas e em
AnkomIA adicione soluço de

Ankom2 ou Ankom ou e
horas.
neutro à temperatura ambiente. A relação
detergente
detergente:amostra deve ser de, aproximadamente, 100 mL/g; ou
141
140
INCT Ciência Animal Métodos ari Ari dicuo
en
Acondicione os filter bags em dessecador (máximo de 20 unidades jue. m:1s Sa d fibra insoluvel detergente neutro ou ácido
em
por procedimento) e aguarde o equilibrio com a temperatura (gFB = tara ou peso do filter bag (g): %FaSA percentual de fibra
=
insolúvel em detergente neutro ou ácido com base na amostra

ambiente. seca ao
ar; ASA massa de amostra seca ao ar (g): %Fus = percentual de

8. Pese os filter bags e registre o peso. fibra insolúvel em detergente neutro ou ácido com base na matéria
seca, e %ASE = percentual de "amostra seca em estufa".
A avaliação da FDA deve ser realizada sequencialmente à
FDN repetindo-se os procedimentos 1 8, substituindo-se Exemplo de cálculo

a a solução
de detergente neutro por solução de detergente ácido e omitindo-sea
Considerando a alíquota 1 da tabela a seguir, têm-se os
adição de a-amilase termoestável.
cálculos para as estimativas de fibra insolúvel em detergente neutro e
em detergente ácido:
Cálculo da coucentração de fibra
Para o cálculo da concentração de fibra, utilize as equações: FDN=(FB+FDN)-FB=0,7055-0,4041=0,3014 g
FDN 0,3014
F=(FB+F-FB 96FDNASA ASA x100=
0.703319x100=42,86%
F
%F ASA ASA x100
o6FDNASA100q586
%FDNMs9/6ASE 4281O0-44,71%
/%F ASA 100 FDA=(FB+FDA)-FB=0,5440-0,4041=0,1399 g
6 Fus 90ASE
FDA 0,1399
%FDAASA ASAx100= 0,7033
x100=19,89%
143
142
2" Edição
7.1.2. Métodos para fibras utilizando

6FDAMs 96FDAASA100-a5.86
%ASE
19,89
95.86 *LO0=20,75%
cadinhos filtrantes
FDN utilizando extrator de fibras -
Método F-012/1
FDN utilizando autoclave Método F-013/1
Alíquota -
Item 2
FDA utilizando extrator de fibras -
Método F-014/1
FB (g) FDA utilizando autoclave Método F-015/1
0,4041 0,5410 0,4130
-
ASA (g) 0,7033 0,8168 0,7311

FB+FDN (g) 0.7055 0,8994 0,7332
Aparatos
FB+FDA (g) 0,5440 0,6865 0,5541 Balança analítica com precisão de 0.0001 g
FDN (g) 0,3014 0,3584 0,3202 - Dessecador
FDA ) 0,1399 0,1455 0,1411 Estufa com circulação forçada de ar

T6FDNASA 42,86 43,88 43,80 Estufa sem circulação forçada dear
oFDAASA 19,89 17,81 19,30 Cadinhos filtrantes em borossilicato com porosidade grossa (40-60
%ASE 95,86 um) e 50 mL de capacidade
oFDNMs 44,71 45,77 45,69 Aparelho extratorde fibras Marconi MA450 ou similar ou autoclave
%FDAMs 20,75 18,5 20,13
-
Béqueres 600 mL forma alta

%FDNMs (média) 45,39
-
Erlenmeyers (4 e 10 L)
-Coletores universais autoclaváveis
oFDAMs (média) 19,82
- Forno mufla
Bomba de vácuo acoplada, em linha, a um kitassato e a um suporte

para cadinhos filtrantes
-
Pissetas de 500 ml em polietileno
144 45
- Edição
Reagentes Procedimentos
Sulfato láurico de sódio (NaC12H2sSO,) P.A. Use balança analítica aferida pelo INMETRO. com precisão
- Etilenodiamino de
tetra-acético (EDTA) sal dissódico 0,0001 g, sobre bancada especial de laboratório e em ambiente
(CioH1N0s.2Na.2H.0) diidratado P.A. ou EDTA ácido climatizado (20-25°C ou de acordo com as
especificações do
(C1oH1N:Os) P.A. e hidróxido de sódio (NaOH) P.A. fabricante). Ligue a balança e aguarde 30 minutos para sua
-
Tetraborato de sódio (NaB,07.10H0) decahidratado P.A. estabilização.

Fosfato de sódio dibásico anidro (Na2HPO.) heptahidratado
-
ou
Preparação dos cadinhos
(NaHPO.7H:0) P.A.
-
Trietilenoglicol (CsH10.) P.A. 1 Acondicione os cadinhos filtrantes em formo mufla. Aqueça

-
d-amilase termo-estável (Lyquozime Supra 2.2.X, Novozymes, lentamente a mufla até atingir a temperatura de 500°C e mantenha
Araucária, PR, Brasil) sob esta condição por 2 horas.
Acido sulfúrico (H2SO4) concentrado P.A. 2. Desligue a mufla e aguarde seu resfiriamento, o qual deve ocomer.
Brometo de cetil trimetilamônio (C9H42BrN) P.A. (cetremide ou preferencialmente, com o equipamento fechado.
CTAB) 3. Retire os cadinhos da mufla, lave-os com um jato de água em
-
Acetona (C3H0) P.A. sentido contrário ao da filtração (da base para o topo) e deixe-os
secar na bancada ou em estufa com ventilação forçada.
Soluções 4. Avalie a capacidade filtrante dos cadinhos submetendo-os a0
seguinte teste: acondicione os eadinhos no suporte para filtração,

As soluções de detergente neutro e dcido são produzidas como
mas sem acionar a bomba de vácuo. Adicione 50 mL de água
descrito anteriormente.
destilada e mensure o tempo necessário para a água fluir pelo
cadinho apenas por gravidade. O tempo ideal deve ser de 180+60
segundos. Cadinhos que se enquadrarem nessa característica estão

seja menor que 120
aptos para análise. Caso o tempo de filtração
146 147
Edição
-
segundos, o cadinho deve ser descartado. CasO

o tempo
seja 2. Adicione aos coletores universais ou aos
béqueres a solução de
superior a 240
segundos, o cadinho deve ser submetido a um detergente neutro à temperatura ambiente. A relação
processo de limpeza, cuja descrição pode ser encontrada em
detergente:amostra deve ser de, aproximadamente, 100 mL/g.
Mertens (2002). Após a
limpeza, refaça o teste e verifique seo
cadinho obedece às 3. Adicione a-amilase termoestável
especificações para análise. Caso não isso não (Lyquozi e Supra 2.2.X) na
ocorra, o mesmo deve ser descartado. proporção de 500 uL/amostra.
5. Os cadinhos que
passarem pelo teste de filtração devem ser 4a. Acondicione os coletores universais vedados em autoclave,
aqueça
acondicionados em estufa não-ventilada a 105°C
por 16 horas. à temperatura de 105°C e mantenha
por 1 hora. O tempo de
6. Retire os cadinhos da estufa, acondicione em dessecador (máximo extração é contabilizado após a temperatura ser atingida.
de 20 unidades por
procedimento) e aguarde o equilibrio com a
LD
temperatura ambiente. 4b.Acondicione béqueres no extrator de fibra, acione o
os
7. Pese os cadinhos e registre o peso. Esse será o peso da tara.

aquecimento e aguarde a ebulição da solução. Regule a temperatura
e mantenha ebulição moderada por 1 hora. Durante o processo
em
de extração é comum que haja aderência de partículas nas

Extração paredes
do béquer. Assim, a cada 15-20 minutos, com o auxílio de uma
1. Pese, aproximadamente, 0,8 a 1,0 g de amostra seca ao ar e pisseta, lave as paredes internas do béquer com solução de
acondicione nos coletores universais, para o uso de autoclave, ou detergente neutro de foma a trazer as partículas aderidas de volta
nos béqueres (600 mL), para o uso de extrator de fibras. para a soluço em ebulição. O tempo de extração é contabilizado
Normalmente, alíquotas menores (próximas a 0,8 g) são usadas para após a ebulição ser atingida.
o método com autoclave devido ao volume reduzido dos coletores
universais (ver 5. Após o tempo de extração, desligue os equipamentos. Os passos
relação detergente:amostra no passo 2). As
amostras devem que seguem não devem ser executados após o resfriamento das
obrigatoriamente processadas em moinho
ser
de facas com peneira de alíquotas. Assim, a operacionalização do método deve levar em

porosidade de 1 mm.
148 149
-
Edição
conta a capacidade de condução do processo de filtração sem o 10. Retire os cadinhos, acondicione em dessecador (máximo de 20
resfriamento das alíquotas. unidades por procedimento) e
aguarde o
equilibrio com a
temperatura ambiente.
6. Acople o cadinho no suporte de filtração. Com o auxílio de água
destilada quente (temperatura > 90°C), transfira gradativamente o 11. Pese cadinhos
os e registre o peso.
conteúdo do béquer ou coletor universal para o cadinho. Durante a
transferência, o vácuo deve estar desligado. Caso o volume do A avaliação da FDA deve, preferencialmente, ser realizada
cadinho seja atingido, pare a transferência e acione o vácuo para sequencialmente à FDN. Os procedimentos são essencialmente os
drenagem da solução. Após a drenagem, desligue o vácuo e mesmos, mas considerando-se os detalhes descritos abaixo.
continue a transferência. Repita esse procedimento até a Para de
o caso
extração em autoclave, insira o cadinho contendo
transferência quantitativa do béquer ou coletor para o cadinho. o resíduo da FDN coletor universal. Adicione sobre
no o cadinho a
solução de detergente ácido na mesma proporço recomendada para a

7. Com o vácuo desligado, lave o resíduo com água destilada quente
extração em detergente neutro (100 mL/g). Considere o peso da ASA e
(temperatura 90°C). Acione o vácuo e drene. Repita esse
não do resíduo de FDN. Feche o coletor e extraia como descrito
procedimento até que o material drenado não apresente mais
anteriormente. Lembre-se de que não se adiciona a-amilase para extração
espuma (monitore pelo que é drenado para o kitassato).
com detergente ácido. Após o témino da extração, abra o coletor,
8. Com o vácuo desligado, direcione um jato de acetona usando uma suspenda o cadinho sobre o mesmo e lave seu exterior com água destilada
pisseta sobre o resíduo de forma a revolvê-lo. Acione o vácuo e quente (temperatura >90°C), coletando a água da lavagem junto ao
drene. Repita esse procedimento por três vezes. líquido contido no coletor. Acople o cadinho no suporte de filtração e faça
a transferência quantitativa. Essa lavagem visa recolher algum resíduo
9. Leve os cadinhos com o resíduo à estufa não ventilada a 105°C por
sólido que porventura tenha sido deslocado para o exterior do cadinho
16 horas.
durante a extração.
150 151
INCT Ciência Aninnal Mélodos para Análise de Alimentos - 2"
Edição
Para o caso do uso de extrator de fibra, acondicione o cadinho duas causas distintas:
contaminação por erros de procedimento e
contendo o residuo insolúvel detergente
em neutro no interior do
béquer contaminação inerente ao método (Detmann & Valadares Filho,
e adicione a solução de detergente scido. Ao final do período de exiração, 2010). No primeiro caso, a contaminação surge por execução indevida
erga o cadinho com o auxílio de uma pinça e lave seu exterior com água ou por omissão de passos do procedimento. Um exemplo claro seria a
destilada quente (temperatura 290°C), recolhendo a água no interior do omissão da a-amilase na avaliação de FDN, o que levaria o amido
béquer. O objetivo é o mesmo descito anteriormente.
gelatinizadoa contaminare superestimar o resíduo fibroso insolúvel.
Para o caso de extrações de FDA não sequenciais (o que pode No segundo caso, os contaminantes são inerentes ao método
ser vantajoso para aqueles que simplesmente almejam acessar a mesmo que todos os procedimentos sejam acuradamente realizados.
lignina), o processo de extração é similar ao descrito para FDN, apenas Entre contaminantes, destacam-se dos compostos
esses as frações
substituindo-se a solução de detergente neutro por solução de
nitrogenados insolúveis em detergente neutro e em detergente ácido,
detergente ácido e omitindo-se o uso da a-amilase.
conhecidas como proteína insolúvel em detergente neutro (PIDN) e
proteína insolúvel em detergente ácido (PIDA), respectivamente.
Cálculo da concentração de fibra Conceitualmente, a contaminação proteica constitui a maior fonte de
contaminação das análises de resíduos insolúveis no sistema
Os cálculos são realizados como descrito no item 7.1.1, apenas
substituindo-se o peso do filter bag pelo peso do cadinho filtrante.
detergente e sua presença leva à superestimação dos teores de FDN
e FDA nos alimentOs.
Como discutido anteriormente neste Capítulo, o sulfito de

1.2. Proteina insolúvel em detergentes neutro e ácido
sódio tem sido recomendado de forma particular na avaliação da FDN
Definiçoes básicas com o intuito de reduzir a contaminação proteica sobre o resíduo
insolúvel. Contudo, de forma controversa, o mesmo promove

Todas as análises gravimétricas de resíduos fibrosos estão
solubilização de lignina (Gomes et al., 2012), indicando ser dúbia a
sujeitos à interferência por contaminantes. Por sua vez, os
decisão de sua utilização. Assim, a quantificação direta da
contaminantes associados aos resíduos fibrosos podem ocorrer por
7.3
Veja mais detalhes no Capítulo 9.
152 I53
INCT Ciencia Animal Ediçao
consideração sobre o resíduo Atualizações

contaminação proteica peimite sua
fibroso sem o inconveniente da ação sobre outros macrocomyponentes

As duas principais atualizações aqui adotadas são indiretas. A
da fibra insolúvel.
primeira decorre das modificações realizadas a partir do método N-001/2.
Por outro lado. a avaliação da disponibilidade dos compostos
o qual define a quantificação química do nitrogênio associado à fibra. A
nitrogenados dos alimentos tem recebido atenção especial em
segunda envolve a amostragem de resíduos a partir de cadinhos filtrantes,
devido à elevada associação destes com a matriz
condições tropicais originalmente não utilizados na versão anterior deste Manual. Os
orgânica da parede celular vegetal; associação essa que interfere sobree procedimentos descritos a seguir são comuns para os resíduos insolúveis
a a acessibilidade a estes compostos por parte dos microrganismos
em detergente neutro e ácido. Logo, um único procedimento de
ruminais (Henriques, et al., 2007). A separação da PIDN da PB dos
amostragem é descrito, o qual é aplicado ao material obtido após a devida
alimentos amplia o entendimento nutricional funcional dos compostos
extração com detergente.
nitrogenados, pois permite a identificação de duas frações distintas: a
primeira, formada pela proteína solúvel em detergente neutro, com PIDN Método N-004/2
digestibilidade verdadeira elevada e constante entre alimentos; e a PIDA-Método N-005/2
segunda, formada pela PIDN, com digestibilidade verdadeira reduzida
e variável entre alimentos. Por outro lado, a PIDA, embora um Aparatos
componente da FDA e, portanto, englobando limitações nutricionais
Balança analítica com precisão de 0.0001 g
semelhantes, tem sido utilizada como elemento preditor de
-
Tubos de digestão em borossilicato com orla

disponibilidade proteica por alguns sistemas nutricionais. Dessa
Tesoura
forma, as frações PIDN e PIDA podem ser funcionalmente utilizadas
-Espátula metálica
sendo, em muitos casos, consideradas mais do que meros
Espátula com ponta de silicone
contaminantes, justificando, uma vez mais, a importância de sua
Dessecador
quantificação.
154 55
2" Edição
Procedimentos utilizada para avaliação da PIDN ou PIDA. Use dessecador para
1. Use balança analítica aferida pelo INMETR0, com precisão de realização das pesagens. A alíquota de fibra não deve ser pesada
0.0001g. sobre bancada especial de laboratório e em ambiente diretamente.
climatizado (20-25°C ou de acordo com as especificações do 3b.Retorne o cadinho filtrante para a estufa não ventilada a 105°C por
fabricante). Ligue a balança e aguarde 30 minutos para sua 2 horas e pese novamente, obtendo por diferença a amostra de
estabilização. resíduo utilizada para avaliação da PIDN ou PIDA. Use dessecador
2a. Com cuidado, corte uma das arestas do filter bag contendo o
para realização das pesagens. A alíquota de fibra näão deve ser
pesada diretamente.
resíduo fibroso. A aresta deve permanecer ainda ligada ao filter
bag. Com o auxílio de uma espátula metálica, retire de 50 a 200 mg 4. Proceda à avaliação do teor de nitrogênio por intermédio do método
do resíduo da FDN ou FDA e coloque em tubo de ensaio para N-001/2.
digestão devidamente identificado. Antes de fazer o corte,
movimente o filter bag ainda fechado para que a amostra se

Cálculo da concentração de proteína însolúvel em detergente
solte do tecido.
neutro
2b.Com o auxílio de uma espátula com ponta de silicone, retire de 50

Para o cálculo da contaminação do resíduo insolúvel em
a 200 mg do resíduo da FDN ou FDA do interior do cadinho
detergente neutro, utilize as equações:
filtrante e coloque em tubo de ensaio para digestão devidamente
identificado. Espátulas metálicas não devem ser utilizadas para
(V-B)xNexfx14x100
amostragem em cadinhos filtrantes devido à possibilidade de %NIDNFDN FDN
danos à malha filtrante.
3a. Retorne ofilter bag para a estufa não ventilada a 105°C por 2 horas 6PIDN FDN=%NIDNFDNX6,25
e pese novamente, obtendo por diferença a amostra de resíduo
156 157
INCT Ciência Animnal Métodos para Análise de Alimentos -
2" Edição
em que: em que: GNIDNFDN =

percentual de nitrogênio insolúvel em Exemplo de cálculo
detergente neutro com base na FDN; V = volume da solução de ácitlo
clorídrico utilizado na titulação (mL); B = volume de ácido clorídrico Considerando a

aliquota 1 da tabela a seguir, têm-se os
utilizado titulação do "branco" cálculos para as estimativas de proteína insolúvel

na (mL); Ne = normalidadeesperada em
detergente
da solução de ácido clonídrico; f= fator de correção da normalidade
neutro (Lembrete: para estimar a proteína insolúvel em
detergente
do ácido clorídrico; e FDN alíquota de FDN utilizada para avaliação
= ácido, deve-se proceder os mesmos cálculos somente substituindo
NIDN pelo NIDA, a PIDN pela PIDA e FDN
(mg). a
pela FDA):
Em função das demandas do estudo, a concentração de PIDN
pode ser expressa em outras bases utilizando-se as equações: (V-B) x Ne xfx14 x 100
6NIDNFDN FDN
(4,1-0,2) x 0,02 x 0,956 x 14 x 100
%PIDNFDNX%FDNMs
6PIDNMs= 100
200,2
= 0,52%
6PIDNMSx100
%6PIDNpB6PBMS %PIDNFDN=%NIDNFDNX6,25=0,52x6,25=3,26%
em que: %PIDNMs =
percentual de proteína insolúvel em detergente Considerando-se as médias de concentrações expressas na
neutro com base na matéria seca; %FDNMs = percentual de fibra tabela, fazemos a modificação das bases para expressão da PIDN:
insolúvel em detergente neutro com base na matéria seca; %PIDNPB =
6PIDNMs 6PIDNFDNX%FDNMs
percentual de proteína insolúvel em detergente neutro com base na 3,26x45,39
=1,48%
proteína bruta; %PBus = percentual de proteína bruta com base na 00 100
matéria seca.
%PIDNpsO6PIDNMS1001 x100=21,99%
1,48
As mesmas equações são utilizadas para os cálculos
relacionados à PIDA
6PBMs 6,7
158 159
2" Edição
Alíquota 7.3. Cinzas insolúveis em detergentes neutro e ácido
Item 3
FDN (mg 200.2 199,7 200.0 Definições básicas

V (mL) 4,1 4,0 4,2
B (mL) 0,2 As cinzas insolúveis em detergente neutro (CIDN) e ácid
Ne 0,02 (CIDA) constituem a contaminação mineral residual sobre os resíduos
f 0,956 insolúveis em detergente neutro ácido,

e
respectivamente. Sua
NIDNFDx 0,52 0,51 0,54 presença causa superestimaço dos teores de FDN e de FDA em
%PIDNFDN 3,26 3,18 3,35 alimentos e outros materiais. Embora tenda a ser menor que a
TOPIDNFDN (média) 3,26 contaminação proteica em muitos materiais, alimentos e outras

T%FDNMs amostras sujeitas contaminação solo
45,39 a com podem exibir níveis
TOPIDNMs 1,48 elevados de cinzas insolúveis, como é o caso de forragens e fezes de
T%PBMs ruminantes sob pastejo. A correção para cinzas constitui rotina do

6,73
método de análises de FDN adotado pela AOAC (Mertens, 2002).
T%PIDNPB 21,99
Atualizaçõöes
Somente duas atualizações são relevadas aqui. Primeiro,a
inclusão da avaliação de resíduos oriundos do uso de cadinhos
filtrantes, os quais não foram contemplados na primeira edição deste
Manual. Segundo, ajustes tempoe temperatura de queima
no
adaptando-se os protocolos definidos pela AOAC (Mertens, 2002).
7.4
160 Veja mais detalhes no Capítulo 9.
161
-
Edição
CIDN Método M-002/2 fechado para que a amostra se solte do tecido. Retorne o filter
CIDA -Método M-003/2 bag para a estufa não ventilada105°C por 2 horas e pese
a
novamente, obtendo por diferença a amostra de resíduo utilizada

Aparatos
para avaliação da CIDN ou CIDA. Use dessecador para realização
das pesagens'", A alíquota de fibra não deve ser pesada
-

- Dessecador diretamente. Acondicione os cadinhos contendo as alíquotas no
Cadinho de porcelana interior da mufla.

2b.Acondicione os cadinhos filtrantes contendo os resíduos de FDN ou
-
Forno mufla com temperatura controlada
FDA no interior da mufla. Os pesos do cadinho e cadinho mais resíduo
foram obtidos durante os processos de quantificação da FDN ou FDA
Procedimentos
3. Ligue a mufla e, aguarde que a mesma alcance temperatura de
500°C. E desejável uma rampa de
aquecimento de 1 hora para que
a de
temperatura ignição seja alcançada.
fabricante). Ligue a balança e aguarde 30 minutos para sua 4. Proceda à queima por 3 horas a 500°C. Após este tempo, desligue a
estabilização. mufla e deixe que a mesma resfrie fechada. A temperatura de retirada

deve estar entre 150 e 200°C.
2a. Prepare e obtenha a tara dos cadinhos de porcelana como descrito
no método M-001/2. Com cuidado, corte uma das arestas do filter
Nesse passo, ao invés de se queimaruma alíquota, é possível queimar todo
bag contendo o resíduo fibroso. A aresta deve permanecer ainda
ofilter bag contendo o resíduo. Assim, não seria necessário abrí-lo para
ligada ao filter bag. Com o auxilio de uma espátula metálica, retire obtenção da alíquota. O filter bag fechado é acondicionado no interior do
cadinho. Contudo, faze-se necessária a utilização de "brancos" para
o máximo de resíduo de FDN ou FDA e acondicione no interior do consideração da contribuição de cinzas oriundas dos filter bags. Ao menos
cadinho. Antes de fazer três filter bags de peso conhecido devem ser queimados em branco para
o corte, movimente o filter bag ainda conhecimento da sua contribuição em cinzas (i.e., g cinzas/g de filter bag).
162 163
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos 2" Edição
5. Coloque os cadinhos de porcelana ou os cadinhos filurantes com os
%CIDN.=0lDNpDNX%FDN,s
resíduos minerais em dessecador, deixe estabilizar com a temperatura 100
ambiente. Pese e registre os pesos.

em que: %CIDNMs =
percentual de cinzas insolúveis em detergente
neutro com base na matéria seca; %FDNMs =
percentual de fibra
Cálculo da concentração de cinzas insolúveis em detergente neutroo
insolúvel em detergente neutro com base na matéria seca.
As mesmas equações são utilizadas para os cálculos

Para o cálculo da contaminação do resíduo insolúvel em
relacionados às CIDA
detergente neutro, utilize as equações:
Exemplo de cálculo
CIDN=(CAD+CIDN)-CAD
Considerando a aliquota 1 da tabela abaixo, têm-se os cálculos
CIDN da estimativa de cinzas insolúveis em detergente neuro (Lembrete:
%CIDNFDN=DX100
para estimar as cinzas insolúveis em detergente ácido, deve-se
proceder aos mesmos cálculos somente substituindo as CIDN pelas

em que: CIDN = massa de cinzas insolúveis em detergente neutro (g)
CAD = peso do cadinho de porcelana ou cadinho filtrante (g): CIDA e a FDN pela FDA)5;
%CIDNFDN = percentual de cinzas insolúveis em detergente neutro
com base na fibra insolúvel em detergente neutro; e FDN = massa de CIDN=(CAD+CIDN)-CAD=25,8880-25,8786=0,0094 g

fibra insolúvel em detergente neutro retirada do filter bag para
CIDN 0,0094
avaliação das CIDN (g) ou o resíduo total de FDN retido no cadinho %CIDNFDN X100= x100=4,75%
0,1980
filtrante (g).
Em função das demandas do estudo, a concentração de CIDN
V6
Os cálculos aqui se referem ao uso de alíquotas extraídas de filter bags.
pode ser expressa com base na matéria seca usando-se a equação:
Para o caso de cadinhos filtrantes, o peso da FDN ou FDA corresponde ao
resíduo integral retido sobre a malha filtrante, o qual foi devidamente
mensurado durante as avaliações de FDN ou FDA.
164 165
INCT Ciencia Animal Métodos para Análise de Alimentos 2"
-
Edição
7.4. Cálculo da fibra insolúvel corrigida para cinzas e proteína

Alíquota
Item Para o cálculo da fibra insolúvel em detergente neutro corigida
3
CAD (g) para cinzas e proteína (FDNcp), use uma das duas equações abaixo
25,8786 24,3287 25,3679
FDN (g) 0,1980 0,2000 0,1990
CAD CIDN (g) 25,8880 24,3379 25,3771
6FDNcpMS=%FDNMs-(%PIDNMs+%CIDNMs)
CIDN (g) 0,0094 0,0092 0,0092
6FDNcpMS=%FDNMsX (100-6PIDNFDN-%CIDNFDN)
TCIDNFDN 4,75 4,60 4,62
100
CIDNFDN (média) 4,66
%FDNMs 45,39 em que: %FDNcpMs = percentual de fibra insolúvel em detergente neutro
TCIDNMS 2,11 comgida para cinzas e proteína com base na matéria seca; %FDNMs =
percentual de fibra insolúvel em detergente neutro com base na matéria

Considerando-se as médias de concentrações
seca; %PIDNMs = percentual de proteína insolúvel em detergente neutro
expressas na
tabela, fazemos a modificação das bases para com base na matéria seca, %CIDNMS = percentual de cinzas insolúveis
expressão da CIDN:
em detergente neutro com base na matérna seca; %PIDNEDN= percentual
de proteina insolúvel em detergente neutro com base na fibra insolúvel
%CIDNMs %CIDN FDNx%FDNMS
100
4,66x45,39
=2,11% em detergente neutro; %CIDNFDN = percentual de cinzas insolúveis em
100
detergente neutro com base na fibra insolúvel em detergente neutro.
Para o cálculo da fibra insolúvel em detergente ácido comigida
para cinzas e proteína (FDAcp), utilize as mesmas equações, apenas
substituindo a FDN pela FDA, a PIDN pela PIDA e as CIDN pelas CIDA
166 167
INCT Ciência Animal Mélodos para Análise de Alimentos -
2" Edição
Exemplo de cálculo Literatura Citada
BARBOSA, M.M.; DETMANN, E.; ROCHA, G.C.: FRANCO, M.O.

Considerando as médias das concentrações de FDN, PIDN e
VALADARES FILHO, S.C. Evaluation of laboratory procedures to
fazemos: the neutral detergent fiber content in forage, concentrate, and
quantify
CIDN expressas anteriormente, ruminant feces. Journal of AOAC International, v.98, p.883-889, 2015.
CASALI, A.0.; DETMANN, E; VALADARES FILHO, S.C.; PEREIRA, J.C.
6FDNcpMS6FDNus-(%PIDNMs+6ClIDNMs)
CUNHA, M.; DETMANN, K.S.C.; PAULINO, M.F. Estimação de teores de
componentes fibrosos em alimentos para ruminantes em sacos de diferentes
tecidos. Revista Brasileira de Zootecnia, v.38, p.130-138, 2009.
%FDNcPMS= 45,39- (1,48+2,11)=41,809% CODEX ALIMENTARIUS COMISSION. Procedural manual. 26th ed.
Rome: Food and Agriculture Organization ofthe United Nations, 2018. 253p.
DETMANN, E. Fibra na nutrição de novilhas leiteiras. In: PEREIRA, E.S.;
ou PIMENTEL, P.G.; QUEIROZ, A.C. (Eds.) Novilhas leiteiras. Fortaleza:
Graphiti, 2010. p.253-302.
(100-6PIDNFDN-6CIDNFDN) DETMANN, E.; VALADARES FILHO, S.C. On the estinmation of non-
6FDNcpMS=6FDNMsX 100 fibrous carbohydrates in feeds and diets. Arquivo Brasileiro de

Medicina Veterinária e Zootecnia, v.62, n.4, p. 980-984, 2010.
GOMES, D.IL.: DETMANN, E; VALENTE, TNP; VALADARES FILHO0,

(100-3,26-4,66)
=45,39x0,9208=41,80% S.C.; QUEIROZ, A.C. Avaliação laboratorial de compostos f+brosos em
6FDNcpMS=45,39x 100 alimentos e fezes bovinas sob diferentes ambientes físicos. Arquivo
Brasileirode MedicinaVeterinária e Zootecnia, v.63, p.522-525, 2011.
GOMES, D.I; DETMANN, E.; VALADARES FILHO0, S.C.; MEZZOMO, R.;
conduzirão ao
Como pôde ser percebido, as duas equações SOUZA, N.KP.; QUEIR0Z, A.C.: DETMANN, K.S.c. Evaluation of
sodium sulfite and protein comection in analyses of fibrous compounds in
resultado, bastando utilizar as bases corretas no processo. A
mesmo
tropical forages. Revista Brasileira de Zootecnia, v.41, p.225-231, 2012.
valor
segunda forma é, de certo modo, mais informativa, pois o
GOMES, D.I; SAMPAIO, C.B.; DETMANN, E.; VALADARES FILHO,
0,9208, indica que 92,08% do S.C.; MEZzOMO, R.; REGADAS FILHO, J.G.L. Uilização de enzimas
intermediário produzido, nesse caso
industriais na avaliação da fibra insolúvel em detergente neutro em
resíduo analisado como FDN era formado por seus principais amostras com alto teor de amido. Semina. Cièncias Agrárias, v.35,
p.2629-2642, 2014.
macrocomponentes (i.e., celulose, hemicelulose e lignina). O restante, ou
HALL, M. B. Methodological challenges in carbohydrate analyses. Revista
cerca de 7,92% corresponderiam à contaminação inerente ao método. Brasileira de Zootecnia, v.36. p.359-367, 2007 (Suplemento).
168 169
INCT Ciencia Animal
Métodos para Análise de Alimentos 2" FAicio
HENRIQUES. L.T.: DETMANN. E.: QUEIROZ. A.C.: VALADARES
FILHO. .C.: LEA0. M.I.: PAULINO, M.F. Fraçöes dos
VALENTE, TN.P.. DETMANN. E.
compostos PAULINO. M.F.: FIGUETRAS, VALADARES FILHO, S.C.
nitrogenados associados à parede celular em forragens tropicais. Arquivo JF: SOUZA. MA. Simulation of
variations in the composition samples in the evaluation of neutral
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17
170
étodos para Análise de Alimentos
INCT Ciencia Anima -2" Ediçao
Capítulo 8
Y Amido
Definiçoes hásicas
Principal carboidrato de reserva dos cereais e das gramíneas
forrageiras (Van Soest, 1994), o amido pode compor de 70 a 80% dos
grãos usados para alimentação animal (Silva et al.. 2019). Protegido

inicialmente por uma camada fibrosa dos grãos (pericarpo). o amido se
concentra no endosperma, o qual é dividido em aleurona e endosperma
amiláceo. Por sua vez, o endosperma amiláceo é subdividido em
endosperma vítreo e farináceo. As células do endosperma amiláceo são

constituídas por uma parede celular fina, granulos de amido embebidos
em uma matriz proteica e por corpos proteicos de conformação estérica
(García-Lara et al., 2019).

Recentemente, a avaliação de amido tem ganhado destaque nos
sistemas de análises de alimentos, passando a ser considerada
juntamente com proteína bruta. gordura bruta, matéria nmineral e tibra)
como a quinta entidade diretamente analisada em sistemas proximais

de análise de alimentos (ver Capitulo 9). Sua separação dos
carboidratos não fibrosos (Tebbe et al., 2017; White et al., 2017). gerou
o novo conceito de tração calculada por diferença chamada de matéria
organica residual (MOR).

172 173
Métodos para Análise de Alim1entos2" Ediçio
Em termos de nutrição de uminantes, a separaçåv do amido existência de passos mais eficientes,
método original foi modificado
o
dos carboidratos não-tibrosos (CNF) nmostra-se cxlremamente e validado

por Silva et al. (2019). Nesse
processo. diferentes matrizes
funcional. haja vista que a MOR. composta basicamente por fibra
orgânicas foram avaliadas. garantindo a robustez do método não só
solúvel. possui padrão de fermentação distinto. Assim, o entendimento
para alimentos, mas também para digestas e fezes, suportando
em separado propicia melhor antecipação dos efeitos da dicta sobre o
avaliação mais ampla não somente para a
concentração de amido nos
padrão de fermentação ruminal (e seus efeitos indiretos sobre saúde e alimentos, mas também para
avaliações mais
complexas envolvendo
desempenho animal) e sobre a eficiência energética da dieta em si (e.g., digestão total e parcial. Algumas modificações em termos de preparo
Corona et al. 2006: Shen et al.. 2018). Por outro lado, para nutrição de de soluçöes foram introduzidas a
partir do trabalho de Cooper et al.
animais não-ruminantes. a separaço propicia a avaliação funcional da (1970) para reduzir custos e aumentar sua facilidade de aplicaço.
principal fonte energética para a produção animal (i.e., amido) e as
fontes de polissacarídeos não-amiláceos solúveis (PNAS), os quais Método da hidrólise enzimática

interferem efetivamente nos eventos de digestão e absorço no (Método G-007/1)
intestino delgado (e.g.. Rojas-Bonzi et al., 2020; Zurak et al., 2020)
Aparatos
Por muitos anos, a anáise de amido se baseou na liberação de
açucares solúveis a partir da hidrólise ácida dos polissacarídeos -
Balança analítica com preciso de 0,0001g

presentes nos alimentos. Contudo, esse tipo de análise não é capaz de -Tubos de ensaio com tampas rosqueáveis (30 mL)
diferenciar acuradamente monossacarídeos liberados a partir de Béquer (500 mL)
amostras complexas como alimentos (Hall & Mertens, 2017). Pipetas (100 uL. 500 uL. I mL. 10 mL)
Considerando-se a inacurácia de métodos baseados em hidrólises
Balão volumétrico (1 L)
ácidas, métodos de natureza enzimática seriam mais específicos em - Funis raiados
termos das moléculas alvo a serem avaliadas (i.e., amido). Papel de tiltro qualitativo (80 g/m)
O método aqui adotado deriva-se do método descrito por Zinn -
Tubos de ensaio (10 e 30 mL)
(1990). Contudo, devido a problemas na robustez do método e na -
Frasco âmbar (1 L)
175
174
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos -2" Edição
- Bolas de vidro
heptahidratado. Homogeneíze até a solubilização e complete o
- Banho-maria
volume com água destilada.
-
Banho de gelo
Espectrofotômetro UV/visível Solução tampão
Em balão volumétrico de 1 L, contendo, aproximadamente, 500 mL
-
Agitador de tubos (vórtex)

de água destilada, adicione 9,91 g de acetato de sódio e 7,27 mL. de
Reagentes ácido acético glacial. Homogeneíze até a solubilização e complete o
Toluol (CoHCH:) P.A. volume com água destilada.
Sulfato de zinco heptahidratado (ZnSOs.7H20) P.A.

Solução de o-toluidina
-
Acetato de sódio anidro (CaHaNaO) P.A. - Em balão volumétrico de 1 L, contendo, aproximadamente, 500 mL
-
Acido acético glacial (C>H.O») P.A.

de ácido acético glacial, adicione 1,5g de tiouréia e homogeneíze até
-Tiouréia(CSN H,) P.A.
a dissolução. Em seguida, adicione 60 mL de o-toluidina e
o-toluidina (CH%CoHLNH:) P.A. (fona líquida; densidade 1,008 glL homogeneize. Complete o volume com ácido acético glacial.
pureza >99,5%)
- Para armazenamento, a solução deve ser mantida em frasco âmbar.
D-glicose anidra P.A. Devido à dificuldade de aquisiço dos reagentes, essa solução pode
-
-amilase termo-estável (Lyquozime Supra 2.2.X, Novozymes,

Araucária, PR, Brasil) 2 ser substituída pela solução de o-toluidina 0,6 M Sigma T1 199.
Armiloglugosidade (AMG 300L, Novozymes, Araucária, PR, Brasil) Procedimentos
Soluções 1. Use balanç: analítica aferida pelo INMETRO, com precisão de

Solução de zinco 15%
-
Em balão volumétrico de 1 L, contendo, aproximadamente, 500 mL

de água destilada, adicione 267,18 g de sulfato de zinco
176 177
INCT Ciencia Animal
-
Edição
fabricante). Ligue a balança e aguarde 30 minutos para sua 6. Remova os tubos do banho de gelo e adicione 9.5 mL da
estabilização. solução
lampão e 0.5 mlL de
amiloglucosidade, agite gentilmente. Incube
2. Pese 0.50. 100. 150. 200 e 250 mg de em banho-maria a 39°C por 2 horas (agite gentilmente
D-glicose em tubos de ensaio de a cada 30
30 mL com tampa rosqueável. Três aspectos devem ser relevados nesse
minutos).
passo. Primeiro, os valores acima descritos se referemD-glicose pura.
a 7. Remova os tubos do banho-maria e mantenha-os em banho de gelo
Logo. a quantidade deD-glicose a ser pesada deve ser ponderada para a
por 10 minutos.
pureza do produto adquirido. Segundo, os valores acima apresentam
8. Remova os tubos do banho de
tolerância de #0,2 mg (ex: o padrão de 50 mg pode variar de 49,8 a 50,2 gelo e adicione 2 mL da solução de
g de D-glicose pura). Contudo, no momento dos cálculos, o valor real zinco 15%. Agite os tubos em vórtex e mantenha em repouso em
pesado deve ser utilizado. Terceiro, os padrões devem ser analisados temperatura ambiente por 10 minutos.
concomitantemente às alíquotas de amostras. 9. Utilizando funis e papel de filtro qualitativo (30 g/m), filtre o
3. conteúdo em tubos de ensaio de 30 mL.

Pese, aproximadamente, 250 mg de amostra seca ao ar de amostra
(processada em moinho com peneira de porosidade I mm) em tubo 10. Pipete I mL do filtrado em tubos de ensaio de 10 mL e adicione 5
de ensaio de 30 mL com tampa rosqueável. mL de água destilada. Agite os tubos manualmente.
4. Adicione aos tubos 10 mL de água destilada, 0,5 mL de a-amilase 11. Pipete 100 uL da solução diluída em
tubos de ensaio de 10 mL e
termoestávele uma gota de toluol. Agite gentilmente os tubos e adicione 4 mL da solução de o-toluidina. Cubra os tubos com bolas
incube-os em banho-maria a 90°C por 2 horas (agite gentilmente a de vidro incube-os
e em banho-maria a 100°C por 10 minutos.
cada 30 minutos).
12. Remova os tubos do banho-maria e mantenha-os em banho de gelo
5. Remova os tubos do banho-maria e mantenha-os banho de
em gelo por 5 minutos.
por 10 minutos.
178 179
13. Remova os tubos do banho de gelo e mantenha-os sobre a bancada
em
até que: B =
fator de conversão de
o equilíbrio com a temperatura ambiente. absorbância em massa
por
intcrmédio da Lei de Lambert-Beer (/g): P quantidade de
=
14. Leia as absorbââncias 630

glicose no
a nm em
espectrofotômetro UV/visível. padrão i (g); Ai =
absorbância no padrão i: G
quantidade de glicose
=
Utilize o padrão de 0 mg de glicose obtida

para ajustar o "zero" do a
partir da amostra
(g); AA =absorbância para a amostra: e
equipamento. Leia os demais padrões em sequência e então as %GASA =
Concentração de glicose com base na amostra seca ao ar.
amostras em análise. Devido à característica viscosa da
solução
final contendo o-toluidina, recomenda-se E desejável que G esteja entre
que cada padrão ou 0,050 e 0,200 g. Quanto mais
amostra seja lida em uma cubeta individual e limpa. Para próximo à mélia, maior a confiabilidade da leitura. Leituras no
facilitar os procedimentos e reduzir os custos, o uso de cubetas extremo superior (0,200-0,250
g) possuem baixa confiabilidade.
de acrílico é recomendado: Leituras no extremo inferior (0-0,050 g), além da baixa
confiabilidade, poderão sofrer interferências significativas do
ruído do equipamento. A G
Cálculo da concentração de amido pode ser ajustada pelo analista
variando-se a
alíquota de ASA usada.
Extrapolações (i.e., G >
Utilize sequencialmente as equações abaixo: 0,250 mg) não são toleradas.
B2(PxA Proceda à correção da amostra para umidade residual e à

EP conversão em equivalente amido:
%&ASA x100
%GMs/6ASE
%AMs = %GMs X 0,9
G
%G ASA ASA 100
180 181
INCT Ciência Aninmal
2" Edição
em que: Gws percentual de glicose com base na matéria seca; %ASE

=
percentual de "amostra B= (PxA,) (0,000x0,000)+...+(0,250x0,448)

=
seca em estuta"; %AMs =
percentual de
0,0002+...+0,2502
A8) -1,795
equivalente amido com base na maténia seca.
O coeficiente 0.9 é empregado pelo fato de haver a perda de

AA 0,300
uma molécula de água quando ocorre a ligação a entre duas moléculas
de
1.79510,1671g
glicose para formar a molécula de amido. Tal ligação implica, em
média. na perda de 10% do peso quando da conversão de glicose em
G 0,1671
equivalente amido. 9/%G ASAASA
oG ASA ASA x100= 0,257100=65,00%
Exemplo de cálculo
%GASA 10029.32
65,00
MS0ASEX0Ua 25 X100=72,78%
Alíquota (ASA): 0,2517 g
oASE: 89.32% %AMS=%GMsX0,9=72,78x0,9=65,50%
Absorbância: 0,300
Literatura Citada
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TEBBE, A.W.; FAULKNER, M.J.; WEISS, W.P. Effect of partitioning the Contudo, a avaliação quantitativa de um alimento deve se basear
nonfiber carbohydrate fraction and neutral detergent fiber method on
digestibility of carbohydrates by dairy cows. Journal of Dairy Science,
na
pressuposição de que sua composiço centesimal é inteiramente
v.100. p.6218-6228, 2017. conhecida. Portanto, a união dos compostos químicos definidos acima em
Van SOEST, P.J. Nutritional ecology of the ruminant. 2 ed. Ithaca: Cornell uma avaliação quantitativa de alimento somente pode ser realizada se,e
University Press, 1994. 476p.
somente se, sua soma produzisse a composição total do alimento. Isto
WHITE, R.R.; ROMAN-GARCIA, Y.; FIRKINS, J.L; VANDEHAAR,
MJ.; ARMENTANO, L.E.; WEISS, w.P.; MCGILL, T.GARNETT, obviamente não é verificado. A partir disso, um quinto grupo químico foi
R.HANIGAN, M.D. Evaluation of the National Research Council (2001)
estabelecido, o qual deveria compreender todas as características
dairy model and derivation of new prediction equations. 1. Digestibility
offiber, fat, protein, and nonfiber carbohydrate. Journal of Dairy químicas que não fossem contempladas nos demais gupos. Este novo
Science, v.100, p.3591-3610, 2017.
grupo de compostos químicos seria estimado como
ZINN, R. Influence of flake density on the comparative feeding value of
steam-flaked corn for feedlot cattle. Journal of Animal Science, v.68,
ENN = 100 - MM - PB - EE - FB
p.767-775, 1990. (1)
ZURAK, D.; KLJAK, K.; GRBE`A, D. The composition of floury and
vitreous endosperm affects starch digestibility kinetics of the whole maize em que ENN é o extrativo não nitrogenado. Todos os termos são
kernel. Journal of Cereal Science, v.95, p. 103079, 2020.
expressos como percentual da matéria seca (MS).
184 185
INCT Cincia Animnal Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição
De um ponto de vista teórico, o ENN deveria compreender dos compostos fibrosos, constitui a principal limitação funcional para
todos os compostos não nitrogenados, não gordurosos e não fibrosos utilização da FB e do ENN na nutrição de ruminantes.
do alimento e deveria apresentar alta digestibilidade (pois conteria A partir do desenvolvimento do conceito analitico de fibra
amido, açúcares. etc). Adicionalmente, como o ENN é calculado por insolúvel em detergente neutro (FDN) por P.J. Van Soest na década de
diferença (Equação 1), a soma dos cinco grupos de compost 1960, novas perspectivas foram geradas para a avaliação quantitativa de
químicos resultaria no alimento total (100%), fazendo com que a alimentos e dietas para animais ruminantes. A FDN representa uma
suposição básica para avaliação quantitativa fosse suprida. aproximação química da fibra insolúvel em meio aquoso (como o rúmen)
Ao contrário do ENN, a FB deveria representar ou mensurar e coresponde à porção do alimento que efetivamente causa efeito de
o material indigestível dos alimentos, notoriamente para animais não enchimento no rúmen ou em outros segmentos do trato gastrintest1nal
ruminantes. O conceito analítico FB foi baseado em características (Detmann, 2010). A FDN é formada basicamente por celulose.
químicas da digestão (extração em ácido, simulando as condições hemicelulose e lignina e sua utilização elimina grande parte das distorções
estomacais, seguida por extração em base, simulando as condições de causadas pela solubilização de compostos fibrosos durante a análise por
intestino delgado) (Detmann, 2010). No entanto, a extração ácido-base intermédio do conceito de FB.
causa a solubilização de hemicelulose e de lignina solúvel em álcali (Van A substituição da FB pela FDN representa uma opção lógica na
Soest, 1994). Portanto, a FB é teoricamente formada por celulose, lignina nutrição de animais numinantes, pois confere entendimento nutricional
insolúvel em álcali e por resíduos de hemicelulose. Assim, grande parte da mais concreto e amplo de alimentos e dietas. Contudo, a alteração do
hemicelulose e da lignina seria incluída no ENN". A partir disso, o ENN, conceito analitico aplicado à avaliação da fração fibrosa do alimento
o qual deveria representar a fração facilmente digerível dos carboidratos, obviamente demanda a modificação da interpretação do grupode
passa a apresentar digestibilidade baixa e altamente variável entre compostos químicos calculado "por diferença". Assim, quando utilizada
alimentos (Detmann, 2010). Este aspecto, em conjunto com a subestimação a FDN, o conceito de ENN não deve ser utilizado, pois este deve somente
ser associado ao uso do conceito analitico de FB.

Inicialmente, o novo gupo de compostos calculado "por
Na prática, devido às interações entre os componentes da parede celular e denominado de carboidratos não estruturais (Sniffen et
à ação dos reagentes/condições de extração, uma pequena porção de celulose diferença" foi
pode também compor o ENN.
187
186
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição
al.. 1992). Contudo. uma inconsistência teórica foi observada com esta
Torna-se importante ressaltar que a equação (3)) pode ser
nomenclatura. pois a pectina (um composto fibroso solúvel com papel
encontrada com outro formato na literatura, no qual o EE é substituído
estrutural na planta) seria classificada como não estrutural.
pelos ácidos graxos de cadeia longa (AGCL: i.e., ácidos graxos com
Posteriormente. essa nomenclatura foi alterada para carboidratos não
cadeias maiores que quatro carbonos; Tebbe et al.. 2017: NASEM.
fibrosos (CNF; Mertens,1997). 2021). O uso de AGCL possui a vantagem inerente de deslocar a
Neste contexto, o novo grup0 de compostos quimicos seria
fração não-graxa do EE para a MOR. Isso é vantajoso. pois
estimado como:
componentes como o glicerol possuem potencial de contribuição
CNF = 100 - MM- PB - E E FDN
energética parecido com os demais componentes da MOR (e.g..
(2); açucares solúveis, fibra solúvel), mas inferior aos lipídeos. Isso
Em sistemas mais recentes de avaliação quantitativa de aumenta a exatidão dainterpretação energética dos alimentos/dietas.
alimentos, o amido contido nos alimentos passou a ser (ao lado de Contudo, a avaliação direta de AGCLpossui base cromatográfica
MM, PB, EE e FDN) a quinta entidade diretamente analisada (Tebbe (Sukhija & Palmiquist, 1988; Weiss & Wyatt, 2003), sendo de difícil
et al., 2017; White et al., 2017; NASEM, 2021). Dessa forma um novo acesso como análise de rotina na maioria dos laboratórios de análise
de alimentos no Brasil. Desta forma, embora ciente do maior vício
componente calculado por diferença é definido pela separação entre
causado pelo uso do EE, o comitê organizador deste Manual optou por
amido e os demais componentes do CNF, o qual passa a ser formado
essencialmente por fibra solúvel em detergente neutro e outros
sua manutenção para estimação dos componentes calculados por
Esse diferença devido à maior acessibilidade de análise.
componentes minoritários como açúcares e ácidos orgânicos.
Em termos de nutrição de ruminantes, a separação do amido
passa a ser denominado de matéria orgânica residual (MOR; Tebbe et
dos CNF mostra-se extremamente funcional,
al., 2017), sendo definido por: haja vista que a MOR
composta basicamente por fibra solúvel, possui padrão de fermentação
MOR = 100 MM- PB - EE - A - FDN distinto. Assim, o entendimento em separado propicia melhor
(3)
antecipação dos efeitos da dieta sobre o padrão de fermentação ruminal
em que A éa concentração de amido como percentual da MS.
(e seus efeitos indiretos sobre saúde e desempenho animal) e sobre a
188 189
INCT Ciência Animal Mélodos para Análise de Alimentos 2"
-
Edição
eficiência energética da dieta em si. Por outro lado. para nutriçâo de CNF =100 MM- EE - FDN -
(PB PBu +U) (4):

animais não-ruminantes. a separação propicia a avaliação funcional da
MOR =
100 MM EE A - FDN (PB PBu +U)
-
-
(5):
-
principal fonte energética para a produção animal (i.e., amido) e as
fontes de polissacarídeos não-amiláceos solúveis (PNAS), os quais em que: PBu = teor de PB oriunda da ureia (ou mistura ureia e sulfato de
interferem efetivamente nos eventos de digestão e absorção no amônio); e Ué o teor de ureia. Todos os termos são expressos como o
da MS.
intestino delgado.
Em situações em que ureia no é utilizada percebe-se facilmente
Contudo. um problema básico se ergue a partir da utilização
que as equações (4) e (5) convergirão exatamente para aquilo queé
das equações (2) e (3). Como os CNF e a MOR são calculados por
exposto nas equações (2)e (3), respectivamente.
diferença. estes irão englobar todos os erros associados às estimativas
Sob um ponto de vista analítico, os principais vícios associados
dos componentes químicos que são analisados diretamente.
às estimativas dos teores de CNF e MOR estão associados com problemas
Equívoco característico observado quando ureia é incluída
sobre as estimativas do teor de FDN. Em geral, estes problemas são
em concentrados ou dietas. A despeito do fato de a PB da ureia ser
causados pela presença de contaminantes no resíduo insolúvel em
estabelecida com base nos pressupostos do método de Kjeldahl (PB =
detergente neutro, os quais podem ser resultantes de eros nos

Nx 6,25), o elevado teor de nitrogênio da uréia faz com que seu
procedimentos de análise ou de contaminações inerentes ao método
conteúdo em PB seja maior que sua própria massa (45% Nx 6,25 =
analítico em si. Para todos os casos ocorrerá superestimação dos teores de

281,25% PB). Esse excesso de PB pode ser potencialmente
FDNe subestimação dos teores de CNF e MOR.
transformado em massa real de PB a partir da assimilação do
Torna-se importante ressaltar que a FDN constitui um método
nitrogênio na forma de proteína microbiana no rúmen. Contudo, este analíitico do tipo I de acordo com o Codex Alimentarius, ou seja, o
excesso não existe no concentrado ou na dieta e implicará em
resultado obtido é definido pelo método em si (Codex Alimentarius
subestimação do conteúdo de CNF e de MOR. Assim, em situações
Comission, 2018). Assim, todo e qualquer método do tipo I (algumas
nas quais ureia (ou misturas como ureia e sulfato de amônio) é
utilizada em concentrados ou na dieta, correção deve ser adotada para 92

Considerando apenas a discussão deste Capítulo, esse raciocínio é também
aplicado às análises de EE e MM, pois também constituem entidades
evitar a subestimação do teor de CNF (Hall, 2000), a qual é dada por: analíticas obtidas por métodos do tipo I.
191
190
Mitodos para Análise de linmentos diin
vezes denominados de métodos empieos) deve ser seguido
rigorosamente em todas as suas etapas metodológicas (Metens, 2003). que levam à superestimação da fibra.
Seundo-se tal raciocinio, o tecor de
FDN somente
pois qualquer desvio ou modificação arbitrária
procedimentosnos pode ser
adequadamente ohtido considerando-se
implicará na definição de uma nova entidade analítica não Contaminação pela proteína (PTDN) pelas cinzas (CIDN) e
comparável insolúveis em
com aquela que deveria ser
produzida pela aplicação do nmétodo original. detergente neutro (Dctmann et al. 2008. Detmann. 2010).
No entanto,
Os equívocos de
procedimentos laboratoriais mais comuns irão
as
recomendações com relação às corTeções a serem
superestimar o teor de FDN principalmente por contaminação por amido
rcalizadas sobre os teores de FDN são
algumas vezes controversas e nem
elou influência da Sempre seguem um

padrão. AS formas
gordura sobre a ação do detergente neutro (Detmann, comigidas de FDN com relação
aos contaminantes descritos previamente são:
2010: Valente et al.2011). No primeiro caso, a utilização de uma a-
amilase termoestável deve vista
ser como
procedimento obrigatório na FDNp = FDN - PIDDN
análise de FDN (6)
(Mertens, 2002; Valente et al., 2011). Por outro lado, se
FDNc = FDN - CIDN
amostras com alto de (7):
teor gordura são submetidas à extração com
detergente eutro, pode formação de duas diferentes fases,

ocorrer a FDNcp =
FDN- (PIDN+CIDN) (8):
formadas por compostos polares e apolares. Neste caso, pode ocorrer a em que: FDNp FDN
corrigida para proteína: FDNc FDN corrigida
=
=
migração do detergente para a fase apolar, que é formada pela gordura. para cinzas; e FDNcp FDN corrigida para cinzas e proteina. Todos
=
Assim, a ação do detergente neutro se torna limitada na fase polar e o teor Os termos são expressos como % da MS.
de FDN será superestimado. Amostras com teores de EE superior a A FDNp (Equação 6) foi
10% sugerida por Hall (2000) para que se
(com base na MS) devem ser parcialmente desengorduradas antes de procedesse à estimação dos CNF. incluindo-se dietas nas quais uréia for
serem submetidas à extração utilizada. Contudo, uma inconsistência químicaé observada devido ao fato
com detergente neutro (Mertens, 2002;
Valente et al., 2011). de as CIDN serem parte da MM. Assim, a omissão da começão para cinzas
Resíduos fibrosos mensurados levará a uma dupla suburação das CIDN na estimação dos teores de CNF.
gravimetricamente, como a FDON,
estão sujeitos a contaminantes indesejados, porém inerentes ao método, Paura ilustrar tal fato. a equação (2) pode ser reeserita utlizando-se
Os quais englobam, de forma daas pressuposições: L. a FDN possui obrigatoriamente contaminação por
geral, compostos nitrogenados e minerais,
192 193
Métodospara Análise de Alimentos2 Ediçin
minerais além contaminação por pnoteina: e 2. a MM do alinmentodicta
Por outro lado, no método oficial para análise de FDN adotado
pode ser fracionada em duas pongöces. uma solível e outra insolivel em
pela Association of Official Analytical Chemists (AOAC: Mertens, 2002)
detergente neutro. A partir disso. utilizando-se as cquaçöes (2) e (6). faz-se:
Somente a correção para cin7as foi con iderada
(FDNc: Equação 7).
Pressupondo-se que a PB de um alimento pode fracionada
CNF 100-(CSDN + CIDN) -PB -EE -FDNp (9a): ser em uma
porção solúvel e outra insolúvel em detergente neutro e utilizando-se as

CNF =
100-(CSDN +CIDN) -
PB -
EE -
(FDNcp +CIDN) (96): cquações (2) e (7). faz-se:
em que CSDN são as cinzas solúveis em detergente neutro (% da MS).

CNF =100 MM -(PSDN + PIDN)
Reagrupando-se os termos da equação (9b):
EE - FDNc (10a):
CNF =
100 MM PSDN PIDN EE (FDNcp + PIDN)(10b):
- -
-
CNF 100-CSDN CIDN -PB -EE - FDNCp - CIDN (9c)

CNF = 100 CSDN 2 x CIDN-PB -
EE- FDNcp (9d) 2 CNF =
100 MM PSDN 2 x PIDN -
EE - FDNcp (10c):
em que PSDN é a proteína solúvel em detergente neutro (% da MS).

Assim. se a correção para cinzas não for considerada, o teor Desta forma, a utilização da FDNc implicará subestimação dos
de CNF apresentará vício negativo equivalente ao teor de CIDN. A CNF pois haverá dupla subtração da fração PIDN. Analogamente. a
mesma demonstração pode ser feita utilizando-se a equação (3) e a demonstração apresentada da equação (10) é tacilmente aplicada à
MOR (Tabela 9.1). equação (3)eà MOR (Tabela 9.1)
A utilização da FDNp foi sugerida pelo NRC (2001) em No método adotado pela AOAC não se considera o fato de a
procedimento para se estimar o teor energético de alimentos e dietas para proteína ser o principal contaminante da ibra mensurada
bovinos. Contudo, mais uma vez se observa inconsistência nutricional gravimetricamente (Van Soest, 1994). A despeito da inclusão de sulfito
(além da questão da subestimação dos CNF), pois cinzas não produzem de sódio na solução de detergente (Mertens, 2002), deve ser ressaltado
da FDN que este composto químico não remove toda a proteina contaminante.
energia (Detmann et al., 2008). ILogo, a correta utilização em
Adicionalmente, o sulfito pode extrair parte da ligninae de outros

modelos de produção de energia deve obrigatoriamente considerar a
componentes da fibra insolivel (Van Soest et al., 1991; Gomes et al.,
correção concomitante para CIDN.
195
194
-
Edição
2012) e sua utilização não tem sido recomendada no Brasil (Gomes et al.
2007; Tebbe et al., 2017). Portanto, a
FDNcp (Equação 8) deve
2012; Detmann et al.. 2016). ser
usada no processo de estimação dos CNFe da MOR.
Tabela 9.1- Exemplo teórico da estimação dos teores de CNF eMOR Considerando-se os
argumentos até aqui apresentados, na
utilizando-se diferentes aproximações para a FDN
avaliação de concentrados ou dietas contendo ureia os CNF e a MOR
Item devem, portanto, ser estimados como:
Teor
MM 5,0
PB 21,5 CNF 100 MM EE FDNcp (PB PBu + U)
-
-
-
(11);
-
-
EE 3,8
Amido 48,5 MOR =
100 MM- EE -A FDNcp (PB PBu + U) (12):
-
-
-
FDN 20,3
PIDN 3,4 Quando a ureia não for utilizada, as equações (11) e (12)
CIDN 1,5
FDNc2 convergirão para:
18,8
FDNp2 16,9 CNF 100 MM - EE - FDNcp - PB
FDNcp? 15,4 (13);
Estimativa Vício MOR = 100 M M - EE -A - FDNcp - PB
CNF (usando FDN) 49,4 -4,9 (PIDN + (14):
MOR (usando FDN) 0,9 CIDN) Deve ser novamente enfatizado que a não consideração da
CNF (usando FDNc) 50,9
3,4 (PIDN) ureia causará subestimação dos CNF e da MOR (Tabela 9.2). Por
MOR (usando FDNc) 2,4
CNF (usando FDNp) 52,8 Outro lado, quando a correção para o teor de ureia é aplicada, verifica-
-1,5 (CIDN)
MOR (usando FDNp) 4,3 se que a soma dos grupos de compostos químicos não produz 100%
CNF (usando FDNcp) 54,3
MOR (usando FDNcp) 5,8 (Tabela 9.2; MM + PB + EE+FDNcp + CNF = 103,2%). Contudo,
o da MS.2cepindicam coreções para cinzas e proteína, respectivamente.
isto não deve ser visto como vício, mas somente como um reflexo do
Em adição, a ausência de correções para cinzas e proteína entendimento mais correto da dieta avaliada.
poderá acaretar em distorções sobre os coeficientes de digestibilidade

da FDN e dos CNF ou MOR em ensaios com animais (Chizotti et al.,
196 197
INCT Ciência Anima Métodos ara Análise de Alimentos 2"
- Ediçio
Tabela 9.2 - Exemplo teórico do processo de estimação dos teores de DETMANN, E.: VALADARE FILHO. S.C.: PINA. D.S.; HENRIQUES.
CNF e MOR em uma dieta contendo ureia L.T. PAULINO. M.F. MAGALH K.A.: SILVA. P.A.
CHIZZOTTI. M.L. Prediction of the energy value of cattle diets based on
Item Teor chemical composition of the feeds under
tropical conditions. Animal
MM 6,0 Feed Science and Technology. v.143. p. 124-147. 2008.
PB 13,2 DETMANN, E.; SILVA. T.E. ; VALADARES FILHO. S.C.: SAMPAIO.
Ureia:Sulfato de amônio (9:1) (U0) 2,0 C.B.; PALMA, M.N.N. Prediction of the energy value of cattle diets
PBu2 5,2 based on the chemical composition of feeds. In: VALADARES FILHO:
EE 2,6 S.C.; COSTA E SILVA, L.F.: GIONBELLI. M.P.: ROTTA. P.P.:
Amido 28,2 MARCONDES, M.I.; CHIZZOTTI, M.L.: PRADOS. L.F. (Org.).
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requirements of zebu and crossbred cattle BR-CORTE.
FDNcp 40,5
3ed.Viçosa: DZO-UFV. 2016. p.85-118.
Estimativa Vício
CNF (não se considerando a ureia) 37,7 -3,2 (PBuu GOMES, D.I.; DETMANN, E.; VALADARES FILHO. S.C.: MEZzOMO.
R., SOUZA, N.K.P.; QUEIROZ, A.C.; DETMANN, K.S.C. Evaluation
MOR (não se considerando a ureia) 9,5 U of sodium sulfite and
CNF (considerando a ureia) 40,9 protein correction in analyses of fibrous compounds
in tropical forages. Revista Brasileira de Zootecnia. v.41. p 225-231.
MOR (considerando a ureia) 12,7 2012.
% da MS. 2 Assumindo-se 260% de PB na mistura uréia:sulfato de amônio.
HALL, M.B. Neutral detergent-soluble carbohydrates. Nutritional
relevance and analysis. Gainesville: University of Florida. 2000. 76p.
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dairy cows. Journal of Dairy Science, v.80. p. 1463-148 1. 1997.
CHIZZOTTI, M.L.; VALADARES FILHO, S.C.; VALADARES, R.F.D.;
MERTENS, D.R. Gravimetric determination of amylase treated neutral
CHIZZOTTI, F.HM.; MARCONDES, M.I.; FONSECA, M.A.
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Consumo, digestibilidade e excreção de uréiae derivados de purinas em
vacas de diferentes níveis de produção de leite. Revista Brasileira de collaborative study. Journal of AOAC International, v. 85, p.1217-
1240, 2002.
Zootecnia, v.36, p.138-146, 2007.
MERTENS, D.R. Challenges in measuring insoluble dietary fiber. Journal
CODEX ALIMENTARIUS COMISSION. Procedural manual. 26th ed.
of Animal Science, v.81. p.3233-3249, 2003.
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Graphiti, 2010. p.253-302. MEDICINE - NASEM. Nutrient requirements of dairy cattle. 8 ed.
Washington: National Academies Press, 2021. 365p. (prepublication

copy)
199
198
- Edição
SNIFFEN. C.J.: O'CONNOR. A.C.: VAN SOEST. P.J.: FOX. D.G.:
RUSSELL. J.B. A net carbohydrate and protein systemfor evaluating Literatura Adicional
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DETMANN, E.; VALADARES FILHO. S.C. On the estimation of non-
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TEBBE, A.W.: FAULKNER. M.J.; WEISS, W.P. Efect of partitioning the
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VALENTE, T.N..: DETMANN, E. VALADARES FILHO, S.C.;
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WEISS, W.P.; WYATT, D.J. Effect of dietary fat and vitamin e on a-
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M.J.; ARMENTANO, LE.; WEISs, W.P.; MCGILL, T.; GARNETT, R.;
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dairy model and derivation of new prediction equations. 1. Digestibility
of fiber, fat, protein, and nonfiber carbohydrate. Journal of Dairy
Science, v.100, p.3591-3610, 2017.
200 201
Métodos para Análise de Alimentos 2" Ediçio
Capítulo 10
Lignina
Definiçies básicas
Dos componentes da parede celular, a lignina. polímero de

subunidades aromáticas derivadas do ácido shiquímico. é o
componente mais reconhecido por limitar a digestão dos
polissacarídeos fibrosos no númen (Van Soest. 1994). No entanto, na
planta, a lignina exerce papel de proteção sobre os componentes
polissacarídeos da parede celular. promovendo rigidez e resistência
fisica, bem como tornando a parede hidrofQbica e impermeável (Jung
& Allen, 1995).
Neste contexto, os carboidratos fibrosos das plantas

forrageiras nem sempre são acessados pelos microrganismos ruminais
devido à presença de compostos fenólicos, como a lignina, que
formam barreira fisica para a ação dos. sistemas enzimáticos
microbianos (Dehority, 1993). Assim, o grau de lignificação em tono
da celulose 6é mais relacionado com a redução da digestibilidade do
que a concentração total de lignina da planta (Dehority & Johnson.
1961).
202 203
Existem diferentes métodos empregados na avaliação de
rcmanescentes são oxidadas e clivadas (Van Soest. 1994). Neste
lignina. porém nenhum atende plenamente à expectativa nutricional,
sentido, oxidação por permanganato de potássio constitui método
a
relacionando o teor de lignina ao processo digestivo do animal. Há
para avaliação gravimétrica do teor de lignina (Van Soest &
divergencias significativas nos resultados obtidos em laboratórios para
Robertson, 1985).
todos os métodos aplicados (Gomes et al., 2011).
O método de lignina Klason difere analiticamente do método
Todos os métodos praticados para avaliação do teor de lignina
da hidrólise ácida na sequência com que a concentração do ácido
baseados no isolamento dos componentes químicos apresentam sulfúrico e a
temperatura de extração são utilizadas, o causa
que
limitações no tocante aos processos analíticos, de forma que os
efeitos diferentes hidrólise dos
somatórios das partes são sempre contraditórios em uma mesma
na
polissacarídeos (Hatfield al.. et
1994). Contudo, há de se ressaltar que no método de lignina Klason

amostra. Portanto, a afirmação sobre qual método representa melhor a
não se utiliza detergente
catiônico (brometo de cetil trimelamônio;
quantidade de lignina da amostra e qual estabelece melhor a
CTAB) como adjuvante, o qual proporciona a limpeza prévia do
associação com os fenômenos biológicos do processo de degradação
material que será submetido à hidrolise ácida. Assim,
ruminal permanece ainda indefinida (Gomes et al.,
detergente o
2011). ácido é responsável pela obtenção de resíduo aproximadamente livre
O método de lignina em ácido sulfúrico com extração prévia da interferência proteica (Van Soest & Robertson,
1985), promovendo
com detergente ácido (método da hidrólise ácida), adotado como
solubilização de grande parte da proteína associada à parede celular
padrão por alguns sistemas nutricionais (eg. NRC, 2001), tipicamente
(Van Soest, 1994). Portanto, embora o método de Klason apresente
subestima os teores de lignina devido à solubilização parcial da mesma
fortes correlações com a degradação ruminal da fibra, sua
na solução de detergente ácido (Van Soest, 1994). Nesse método, a
contaminação proteica excessiva equer correções para expressão
perda de lignina particularmente em gramíneas pode chegar a 50%
mais adequada dos valores obtidos em laboratório (Gomes et al.,
(Lowry et al., 1994).
2011).
A lignina também é suscetível à
oxidação, a qual aumenta com Deve ser ressaltado que nenhum dos métodos aqui descritos
a
presença de duplas ligações insaturadas e, por apresentar natureza
para análise de lignina leva em consideraçãoa interferência da cutina
fenólica, é facilmente oxidada por uma quinona. As duplas ligações sobre as avaliações realizadas. Para a maioria das amostras, a
204
205
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos - 2" E.dição
contribuição da cutina sobre os resíduos avaliados pode ser

Método da hidrólise ácida
Contudo, suposição pode não ser
considerada desprezível. essa
(Método F-005/2)
de materiais, como, por
adequada para alguns tipos específicos
exemplo. palma forrageira e torta/farelo de mamona. Aparatos
Nesse caso. para evitar a influência da cutina sobre a -

estimativa de lignina, o método da oxidação em permanganato deve
Balança semi-analítica com precisão de 0,1 a 0.01 g
ser preferido (assim, a influência da cutina será contabilizado em - Dessecador
conjunto com a estimativa de celulose). Caso a quantificação da cutina -

seja necessária, isso poderá ser realizado pela aplicação sequencial dos Cadinhos filtrantes borossilicato porosidade
-
em com grossa (40-60

métodos da hidrólise em ácido e oxidação em permanganato (i.e., um) e S0 mL de capacidade
hidrólise seguida da oxidação ou oxidação seguida da hidrólise). As -
Coletores universais autoclaváveis (100-120 mL)

descrições analíticas aqui apresentadas permitem essa realização, mas
Bastões de vidro
uma representação esquemática informativa deste tipo de - Forno mufla
procedimento pode ser obtida em Van Soest (1994). Bomba de vácuo acoplada, em linha, a
-
um kitassato e a um
suporte
Atualizaçõões
Geladeira
- Termômetro
As atualizações apresentadas nesta edição envolvem apenas
pequenas correções no preparo e concentração dos reagentes e em Proveta de borossilicato
polietileno 2 L
-
ou
alguns procedimentos e a incorporação dos métodos F-014/1 e F

015/1
Reagente
como procedimentos para obtenção do resíduo insolúvel em
Acido sulfúrico (H;SO,) concentrado P.A.
detergente ácido a ser utilizado nos métodos da hidrólise ácida e
OXidação em permanganato de potássio.
206 207
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de limentos -2" Edição
Solução Recomenda-se o resfriamento da proveta com a água em geladeira

Acido sulfúrico (12 M ou 720 g/kg ou 72% p/p)" ou freezer antes dos demais passos.
Características da solução -
Acondicione a proveta em um recipiente contendo água e gelo. Isso
Gravidade específica = 1,634 minimiza o impacto do aquecimento.

- Massa final em 2 L = 3268 g (2x 1634)
-
Adicione lentamente o ácido sulfúrico em porções de 50 a 100 mLe

Preparo e aferição de 2 L de solução agite levemente com um bastão de vidro. Não deve haver fervura. A
fervura é evitada não se adicionando grandes quantidades de ácido
1. Acido sulfúrico necessário
de uma única vez. Após 4 ou 5 adições de pequenas quantidades de
- 2353 g de ácido sulfúrico P.A. anidro
ácido a reação se torna menos violenta e maiores quantidades podem
2. Água destilada necessária ser adicionadas. Continue a adição do ácido até o volume
aproximado de 1900 mL.

2353
A=3268-
Cubra a proveta e deixe resfriar em água corrente (cerca de 30
T00 minutos).
em que: A = quantidade de água destilada para o preparo de 2 L de -
Com cuidado, retire a proveta da águae seque seu exterior com papel
solução (g ou mL); P = pureza do ácido sulfúrico concentrado (%).
toalha.
3. Preparo do ácido
Acondicione a proveta sobre a balança semi-analítica e adicione
lentamente ácido sulfúrico até o peso total da solução atingir 3268 g
-
Adicione a água destilada na quantidade estimada em uma proveta (não se esqueça de contabilizar a tara).
de 2 L. O peso da proveta deve ser previamente conhecido.
Retire a proveta da balança e homogeneíze a solução com um bastão
de vidro.
0 Essas especificações dizem respeito à solução sob temperatura de 20°C.
208 209
-
Edição
-
Meça temperatura. A temperatura final de atferição dever ser de

a
20+0.5°C. Caso a temperatura esteja acima deste patamar, mantenha Procedimentos

solução 1. Use
a em geladeira e monitore constantemente a temperatura. balança analítica aferida pelo INMETRO, com
precisão de
Antes de cada mensuração de temperatura é necessário 0,0001 g, sobre bancada especial de laboratório e
em ambiente
homogeneizar a solução com bastão de vidro. climatizado (20-25°C ou de acordo com as

especificações do
fabricante). Ligue a
balança e
aguarde 30 minutos para sua
Assim que a temperatura atingir
patamar adequado, proceda àà
o
estabilização.
aferição e, caso necessário, corrija a solução.
2. Extraia as amostras em
detergente ácido seguindo o método F-014/1
4. Aferição da solução ou F-015/1. A análise de lignina pelo método da hidrólise se inicia
Confira o volume final da solução a 20+0,5°C. O volume final a partir da obtenção do resíduo insolúvel em detergente ácido em
aceitável deve estar entre 1995 e 2005 mL. cadinho filtrante.
Para o caso de volumes inferiores 1995 mL, ficou 3. Acondicione cadinho filtrante contendo
a a solução o o resíduo insolúvel em
demasiadamente concentrada. Assim, para cada 3 mL abaixo de detergente ádcido em coletor universal e adicione pequena porção da
2000 mL, retire 5 mL da solução e adicione 8 mL de água. solução de ácido sulfúrico de forma a apenas umedecer o resíduo.
Homogeneíze o conteúdo com auxílio de bastão de vidro com o
Para o caso de volumes superiores a 2005 mL, a solução ficou
objetivo de quebrar todos os grumos e permitir que o ácido entre
demasiadanmente diluída. Assim, para cada 1 mL acima de 2000 mL em contato com todas as partículas da amostra até que esta adquira
retire 9 mL da solução e adicione 8 mL de ácido sulfúrico
consistência pastosa. Mantenha o bastão de vidro dentro do cadinho
concentrado.
(deve ser usado um bastão para cada alíquota).
4. Adicione solução de ácido sulfúrico até atingir-se metade da altura

interna do cadinho. Proceda à homogeneizaço do material após 30
minutos. Caso necessário, adicione mais ácido para assegurar o
210 211
-
Edição
nível equivalente à metade da altura interna do cadinho. Mantenha
T0.Pese os cadinhose registre o peso. Esse resíduo obtido é composto
nessas condições por mais 2,5 horas.
por lignina e contaminantes minerais (i.e., sílica)"
5. Com cuidado, retireo cadinho do coletor universal e o acople no
suporte de filtração. Acione o vácuo e drene todo o ácido sulfúrico. 11.Acondicioneos cadinhos filtrantes contendo os resíduos no interior
da mufla.
6. Inicie o processo de lavagem com água destilada quente

12.Ligue a mufla e, aguarde que a mesma alcance a temperatura de
(temperatura 2 90°C). Inicie pelo bastão de vidro, tomando o
550°C. E desejável uma rampa de aquecimento de I hora para que
cuidado para que todos os resíduos aderidos ao bastão sejam retidos
a
temperatura de ignição seja alcançada.
no interior do cadinho. Em seguida, lave o exterior do cadinho de
forma a remover todo o ácido aderido na vidraria. 13.Proceda à queima por 3 horas a 550°C. Após este tempo, desligue a
mufla e deixe que a mesma resfrie fechada. A temperatura de retirada

7. Proceda à lavagem interna do cadinho. Com o vácuo desligado, deve estar entre 150e 200°C.
lave as paredes internas e o resíduo com água destilada quente
(temperatura > 90°C). Cuide para que não transborde. Acione o 14.Coloque os cadinhos filtrantes com os resíduos minerais em
vácuo drene.
dessecador (máximo de 20 unidades por procedimento), deixe
e Repita essa operação até que todo o ácido seja
estabilizar com a temperatura ambiente. Pese e registre os pesos.
removido.
15.A massa de lignina é calculada pela perda de peso do resíduo após

8. Leve os cadinhos como resíduo à estufa não ventilada a 105°C por
a incineração.
16 horas.
9. Retire os cadinhos, acondicione em dessecador (máximo de 20

unidades por procedimento) e aguarde o equilíbrio com a
0Esse resíduo é também composto por cutina. A descrição do método
pressupõe que a contribuição da cutina seja desprezível. Veja mais detalhes
nas definições básicas no início do Capítulo.
212 213
INCT Ciência Animal Métodos paru Análise de Alimentos -2" Edição
Para obtenção adequada dos resultados, realize o

Exemplo de cálculo
procedimento de forma que a temperatura do ácido esteja
próxima a 20°C. Considerando a alíquota I da tabela a seguir, têm-se os
cálculos da concentração de lignina:
Cálculo da concentração de lignina (método da hidrólise ácida)
LIG=(CAD+RES)-(CAD+RM)=40,4313-40.4074=0.0239 g
Para o cálculo da concentração de lignina, utilize as equações:
LIG 0,0239
LIG=(CAD+RES)-(CAD+RM) 6LIGASA ASA x100: =
0,8006
x100=2,99%
LIG
6LIGASA SA X100
o/LIGASAx100 a586
o LIaMs= .ASE X100
4,99
ocx100=3,11%
96LIGASAx100
%LIGMS9%ASE Item
Alíquota
ASA (g) 0.8006 0,8255

em que: LIG= massa de lignina (g); CAD =peso do cadinho filtrante
CAD+RES () 40.4313 35,5684
(g; RES massa do resíduo composto obtido após extração com
CAD+RM (g) 40.4074 35,5433
ácido sulfúrico (g); RM = massa do resíduo mineral obtido após a
LIG (g) 0,0239 0,0251
incineração (g); %LIGASA = percentual de lignina com base na amostra
oLIGASA 2.99 3,04
seca ao ar; ASA = massa de amostra seca ao ar (g)s, LIGMs =
%ASE 95,86
percentual de lignina com base na matéria seca; %ASE = percentual
%LIGMs 3,11 3,17
de "amostra seca em estufa".
%LIGMs (média) 3,14
10 Esse valor é mensurado previamente à extração com detergente ácido.

214 215
Métodos para Análise de Alimentos
-2" Ediçio
Método da oxidação em permanganato
(Método F-006/2) Acctato de potássio (C>HKO:) P.A.
-
Alcool butílico terciário (CaH,OH) P.A.

Aparatos Acido oxálico diidratado (C>H201.2H:0) P.A.
-
Álcool etílico (C2HOH) anidro P.A. (etanol absoluto)

-
Acido clorídrico (HCI) concentrado P.A.

- Dessecador
Acetona (C.H.0) P.A.
-Cadinhos filtrantes em borossilicato com porosidade grossa (40-60 Soluções

um) e 50 mL de capacidade
Bandejas de polietileno Solução de permanganato de potássio

- Bastões de vidro -
Em balão volumérico de 1 L contendo de 400 mL de

cerca
água
-
Bomba de vácuo acoplada, em linha, a um kitassato e a um suporte destilada, dissolva 50 g de permanganato de potássio. Complete o
para cadinhos filtrantes volume com água destilada. Transfira e armazene em frasco âmbar.
Balões volumétricos 1L
Solução tampão
-
Pissetas de polietileno 500 mL

-
Em balão volumétrico de 1 L contendo 100 mL de água destilada,

-
Fraco âmbar para armazenamento de soluções

dissolva 6,0 g de nitrato férrico hidratado e 0,.15 g de nitrato de prata.
-
Proveta de 1000 ou 2000 mL

Adicione 500 mL de ácido acético glacial e 5,0 g de acetato de
potássio P.A. Agite até a solubilização. Complete o volume com
Reagentes
álcool butílico terciário. Tampe o balão e homogeneíze a solução.
-
Permanganato de potássio (KMnO.) P.A.

Solução de etanol 95%
Nitrato de prata (AgNO;) P.A. - Em balão volumétrico de 1 L. adicione 50 mlL de etanol absoluto.
Nitrato férrico hidratado [Fe(NO:)».9H:0] P.A.
Complete o volume com água destilada e homogeneíze.
-
Ácido acético (C;H,Oz) glacial P.A.

217
216
2" Edição
Solução de etanol 80% vh
Procedimentos
- Em balão volumétrico de 1 L. misture 155 mL de água destilada e
1. Use balança analítica aferida
845 mL de solução de etanol 95% ou 200 mL de água destilada e pelo INMETRO, com precisão de
800 mL de etanol absoluto. Homogeneíze.
climatizado (20-25°C ou de acordo com as
especificações do
Solução de desmineralização fabricante). Ligue a balança e

aguarde 30 minutos para sua
Em balão volumétrico de1 L, adicione 700 mL de solução de etanol estabilização.

95% e dilua 50 g de ácido oxálico diidratado. Em capela, adicione
2. Extraia as amostras em detergente ácido
seguindo o método F-014/1
lentamente 50 mL de ácido clorídrico concentrado. Complete o ou F-015/1. A análise de lignina pelo método da
oxidação se inicia
volume com água destilada e homogeneíze.
a partir da obtenção do resíduo insolúvel em detergente ácido em
cadinho filtrante.
Solução combinada de permanganato e tampão (2:1)
Em proveta, misture solução de permanganato 3. Acondicione cadinhos filtrantes contendo
uma a e a solução os os resíduos insolúveis
tampão na razão de 2:1 v/v. Esta mistura deve ser realizada em detergente ácido em bandeja de polietileno com uma lâmina de
imediatamente antes de seu uso e na quantidade necessária para a água destilada de 2 a 3 cm.
análise. A sobra de solução deve ser descartada. A solução deve
4. Adicione
apresentar coloração de vermelha a purpúra e não deve conter
aproximadamente 30 mL de solução combinada de
permanganato e tampão (2:1), nmantendo o nível da solução nos
precipitado, pois este dificulta a filtração.
cadinhos filtrantes em cerca de 50o da altura interma, cobrindo toda
a amostra.
5. Homogeneíze com bastões de vidro de 30 em 30 minutos.

6. Após 2 horas, acople o cadinho no suporte de filtração. Acione o
vácuo e drene toda a solução de permanganato.

218
219
7. Transfira os cadinhos filtrantes com os resíduos para uma bandecja
13. Pesc os cadinhos e registre
limpa. com lâmina de água similar à descrita anteriormente. o
peso. A massa de lignina é dada pela
diferença entre a massa de resíduo insolúvel
Adicione 30 mL da solução de desmineralização. em
detergente ácido e
a massa do resíduo após o tratamento acima descrito.
8. Após 30 minutos, acople o cadinho no suporte de filtração. Acione
o vácuo e drene toda a solução de desmineralização. O resíduo deve Cálculo da concentração de lignina (método da oxidação)
apresentar coloração clara (i.e., amarelo claro ou branco). Caso isso
Para o cálculo da concentração de
filtre novamente após lignina, utilize as equações
não seja observado, repita o procedimento 7 e
15 minutos.
LIG=(CAD+FDA)-(CAD+RES)
9. Com o vácuo desligado, direcione um jato de solução de etanol 80% LIG
%LIGASA ASAx100
usando uma pisseta sobre o resíduo de forma a revolvê-lo. Acione
o vácuo e drene. Repita esse procedimento três vezes.
10. Com o vácuo desligado, direcione um jato de acetona usando uma

LIGASAx100
%LIGMs 9%ASE
pisseta sobre o resíduo de forma a revolvê-lo. Acione o vácuo e em que: LIG =
massa de lignina
(g); CAD =peso do cadinho filtrante (g):
drene. Repita esse procedimento três vezes. FDA =
massa do resíduo de fibra em
detergente ácido (g); RES =massa do
resíduo composto obtido após
11. Leve os cadinhos com o resíduo a estufa não ventilada a 105°C por extração com permanganato de potássio (g):
TOLIGASA percentual de lignina com base na amostra seca ao ASA
=
16 horas. ar, =
massa de amostra seca ao ar (g): LIGns percentual de lignina com base

=
12. Retire os cadinhos, acondicione em dessecador (máximo de 20 na matéria seca; %ASE =

percentmal de "amostra seca em estufa".
unidades por procedimento) e aguarde o equilíbrio com a
Exemplo de cálculo
Considerando a
alíquota 1 da tabela a
seguir, têm-se os
cálculos da concentração de lignina:

220 221
LIG=(CAD+FDA)-(CAD+RES)=38.1752-38,1460=0,0292 g Balança semi-analítica com precisão de 0,1 a 0,01 g

- Dessecador
LIG 0,0292
%LIGASA=ASA X100 0 , 8 1 4 5 0 0 = 3 , 5 9 %
Cadinhos filtrantes em borossilicato com porosidade grossa (40-60

um) e 50 mL de capacidade
3,59
%LIGMs %ASEx100aox100=3,75% -
Coletores universais autoclaváveis (100-120 mL)
- Bastões de vidro
- Forno mufla
Alíquota
Bomba de vácuo acoplada, em linha, a um kitassato e a um suporte
Item 1 2
ASA (g) 0,8145 0,8807
- Geladeira
CAD+FDA () 38,1752 39,0521
- Termômetro
CAD+RES (g) 38,1460 39,0200
- Proveta de borossilicato ou polietileno 2 L
LIG (g) 0,0292 0,0321
- Banho-maria
oLIGASA 3,59 3,64
- Autoclave
oASE 95,86
%LIGMs 3,75 3,80
Reagente
oLIGMs (média) 3,78
- Acido sulfúrico (H2SOA) concentrado P.A.
Solução
Lignina Klason
Acido sulfirico (12 M ou 720 g/kg ou 72% p/p)
(Método F-007/2)
método F-005/2.
Prepare a solução como descrito no
Aparatos

223
222
Mélodos para Análise de limentos 2"
-
Edição
Procedimentos
procedimento até a transferência quantitativa do resíduo do coletor
1. Adicione 250 a 350 mg de amostra em coletor universal para o cadinho. A transferência deve ser realizada com o
autoclavável com capacidade de 100 a 120 mL. As amostras material ainda morno após a
autoclavagem.
devem ser processadas enm moinho com peneira com
7. Com o vácuo desligado, lave resíduo
o com água destilada quente
porosidade de 1 mm.
(temperatura2 90°C). Acione o vácuo e drene. Repita esse
2. Adicione 3 mL da solução de ácido sulfúrico sobre a amostra e procedimento por trê vezes.
homogeneíze com auxílio de bastão de vidro.

8. Leve os cadinhos com o resíduo a estufa não ventilada a 105°C por
3. Transfira os potes para banho-maria previamente aquecido a 30°C, 16 horas.
onde permanecerão por 1 hora. Homogeneíze o material após 30

9. Retire os cadinhos, acondicione em dessecador (máximo de 20
minutos com bastão de vidro. unidades por procedimento) e aguarde o equilibrio com a
4. Retire os coletores do banho-maria e adicione 80 mL de água
destilada. 10. Pese os cadinhos e registre o peso.
125°C. 11. Acondicione cadinhos filtrantes contendo resíduo no interior

por 1 hora
o
5. Vede os coletores e autoclave os mesmos a os
da mufla.
6. cadinho filtrante previamente conhecido no
Acople o com peso
destilada quente 12. Ligue a mufla e, aguarde que a mesma alcance a temperatura de
suporte de filtração. Com o auxílio de água
550°C. E desejável uma rampa de aquecimento de 1 hora para que
conteúdo do
(temperatura 90°C), transfira gradativamente o
vácuo a temperatura de ignição seja alcançada.

coletor universal para o cadinho. Durante a transferência, o
deve estar desligado. Caso o volume do cadinho seja atingido, pare
a transferência e acione o vácuo para drenagem da solução. Após a

drenagem, desligue o vácuo e continue a transferência. Repita esse
225
224
2" Edição
13. Proceda à queima por 3 horas a 55O°C. Após este tempo, desligue a
mufla e deixe que a mesma resfrie fechada. A temperatura de retirada Cálculo da

concentração de lignina Klason
deve estar entre 150 e 200°C.
Para o cálculo da concentração de lignina. utilize as
equações:
14. Coloque os cadinhos filtrantes com o resíduo mineral em
dessecador
deixe estabilizar com a
tenmperatura ambiente. Pese e registre os %RESASA= (CAD+RES)-CAD
ASA
x100
pesos.
A lignina Klason apresenta valores mais elevados de 9/6RESASAx100

6RESMs /%ASE
contaminação proteica em
comparação as demais métodos aqui
descritos, (CAD+RM)-CAD
uma vez que o material não passa por tratamento com %RMASA ASA x100
detergente catiónico, responsável por retirar grande parte da
%RMMs 6RM ASAx100

contaminação proteica. Caso haja interesse ou necessidade de
%ASE
correção para contaminação proteica, aumente o número de alíquotas
analisadas. Ao final do passo 10, retire
algumas alíquotas que serão %LKMSNC=%RESMs-%RMMs
destinadas à avaliação da proteína associada ao resíduo os seguindo-se
%PCLIG=%PLRES /%%RESMS
procedimentos descritos para o método N-004/2.
LKMSNC
%LKMsc=%LKusNCX-(100-%PCLuG
100
em que: CAD =
peso do cadinho tiltrante (g): RES =massa do resíduo
após a extração ácida: %RESasA =
percentual de resíduo obtido após
o tratamento com ácido sultúrico com base na amostra seca ao ar; ASA
massa de amostra (g): %RESns
seca ao ar =
percentual de resídu0
226 227
INCT Ciencia Animal
Métodos para Análise de Alimnentos 2"
-
Edição
obtido após o tratamento com ácido sulfúrico com base na matéria
seca: %ASE =
percentual de "amostra seca em estufa"; RM = massa RM ASA (CAD+RM)-CAD
ASA
x100=
38,1759-38,1546
-x100=8,38% 0,2541
do resíduo mineral (g): GRMASA =
percentual de resíduo mineral
obtido após incineração em mufla com base na amostra seca ao ar; %RM ASA100 gs,86
%RMMs 9/%ASE 8,38
x100=8,74%
%RMMs percentual de resíduo mineral obtido após incineração em
mufla com base na matéria seca; %LKmsNc = percentual de lignina

%LKMSNC=%RESMs-% RMus = 22,25 8,74 13,51%
Klason não corrigida para proteína com base na matéria seca, %PCus
= percentual de proteína bruta contaminante presente na lignina;
Alíquota
6PCRES =
percentual de proteína bruta contaminante presente no Item
resíduo obtido após o tratamento com ácido sulfúrico; %LKMsc =

ASA () 0.2541 0.2369
percentual de lignina Klason corrigida para proteína com base na CAD (g) 38.1546 42.5231
matéria seca. CAD+RES(g) 38.2088 42.5717
CAD+RM (g) 38.1759 42.5430
Exemplo de cálculo
RES (g) 0.0542 0,0486
RM (g) 0.0213 0,0199
Considerando a alíquota 1 da tabela a seguir, têm-se os
cáleulos da concentração de lignina:

%RESASA 21.33 20.51
%RMASA 8,38 8.40
%ASE
%RESASA= (CAD+RES)-CADan38,2088-38,15*0x 100 =21,33% 95,36
-x100=
ASA 0,2541 oRESMS 22,25 21.40
6RMMs 8.74 8,76
%RESMs=F o6RESASAx100 q5,86

%ASE
21,33
x100=22,25% oLKMsNC
%LKMSNc (média)
13.51
13,08
12.64
04
Valor obtido pela avaliação do resíduo conforme o método N-004/2.
229
228
Métodos para Análise de Alimentos 2" Fdicão
Literatura Citada
Capítulo 11
DEHORITY. B.A. Microbial ecology of cell wall fermentation. In: JUNG
H.G.: BUXTON. D.R.: HATIFIELD. R.D.: RALPH. J. (Eds.) Forage cell
wall structure and digestibility. Madison: Ameriea Socicty of Fibra indigestível
Agronomy. 1993. P.425-453.
DEHORITY. B.A.: JOHNSON. R.R. Effect of particle size upon the in vitro Definições básicas
cellulose digestibility of forages by rumen bacteria. Journal of Dairy
Science. v.44. p.2242-2249. 1961.
A estimação da digestibilidade dietética tem como ponto
GOMES D.I.: DETMANN. E. VALADARES FILHO, S.C.:
FUKUSHIMA. R.S.: SOUZA. M.A.: VALENTE, T.N.P.; PAULINO inicial a
obtenção de seu complemento, a indigestibilidade aparente.
M.F.: QUEIROZ. A.C. Evaluation of lignin contents in tropical forages
Neste contexto, a excreção fecal constitui a característica básica de
using different analytical methods and their correlations with degradation
of insoluble fiber.Animal Feed Science and Technology, v.168, p.206- indigestibilidade de um alimento ou dieta, uma vez que representa, ao
222. 2011.
menos aparentemente. a porção ingerida não aproveitada durante a
HATIFIELD. R.D.: JUNG. H.G.: RALPH, J.; BUXTON, D.R.; WEIMER,
P.J. Comparison of the insoluble residues produced by the Klason lignin passagem pelo trato gastrintestinal (Detmann et al., 200-4). Contudo.
detergent lignin procedures. Journal of Agriculture and Food
and acid devido à dificuldade de realização de coleta total de fezes em animais
Chemistry, v.65. p.51-58. 1994.
de grande porte. como bovinos, téenicas indiretas com o uso de
JUNG. H.G.: ALLEN, M.S. Characteristics of plant cell walls affecting
intake and digestibility forages by ruminants. Journal of Animal indicadores são recomendadas.
Science, v.73, p.2774-2790, 1995.
Os indicadores internos comumente utilizados em ensaio com
LOWRY, J.B.; CONLAN, A.C.; SHLINK, A.C.; McsWEENEY, C.S. Acid
ruminantes compreendem os residuos indigestiveis dos alimentos,
detergent dispersible lignin in tropical grasses. Journal of Science and
Food Agriculture, v.65, p.41-49, 1994.
sendo comumente representados pelas frações quimicas tibra em
NATIONAL RESEARCH COUNCIL - NRC. Nutrient requirements of
dairy cattie. 7 ed. Washington, D.C.: Academic Press, 2001. 381p. detergente neutro indigestível (FDNi) e tibra em detergente ácido
indigestível (FDAi) (Detmann et al., 2004: Valente et al.. 2011a).
SOEST, P.J.
VanUniversity Nutritional ecology of the ruminant. 2 ed. Ithaca: Cornell
Press, 1994. 476p. As estimativas de produção fecal são obtidas por intermédio
Van SOEST, P.J.; ROBERTSON, J.B. Analysis of forages and fibrous de relaçao de causa e eteito entre alinmento/dieta e os eventos
foods. Ithaca: Cornell University, 1985. 202p.
ligestivos do trato gastrintestinal (Detmanu et al., 2007). A base para
utilização destes reside sobre o fato de que, à medida que o alinento

231
230
Métodos para Andlise de Alimentos-2
Ediçdo
transita pelo trato gastrintestinal, a concentração do indicador aumenta
Algumas modificações foram também realizadas com relação
progressivamente pela remoção de outros componentes por digestão e à adaptação e manejo dos animais doadores e manejo dos filter bags
absorção.
A verificação das características ideais de indicadores deve
pós-incubação. Essas adaptações
constituem proposta de
centrar-se sobre questöes relacionadas à recuperação desses após
padronização de métodos de análise de alimentos
utilizando animais
(direta ou indiretamente) por parte do comitê
submissão aos eventos do trato gastrintestinal, a qual, em termos organizador. Maiores
detalhes podem ser obtidos nos Capítulos 17 e 18 deste Manual.
teóricos, constitui caracteristica inerente ao indicador (Detmann et al.,
Adicionalmente, algumas dúvidas recorrentes são
2007). Contudo, influências indiretas dos métodos utilizados para
apresentadas ao comitê organizador, as quais serão brevemente
estimação de sua concentração podem causar desvios aparentes de
discutidas neste tópico. A primeira reside sobre o
recuperação (Valente et al., 2011a).
tipo de filter bag a
ser utilizado. Os resultados obtidos no Brasil
sob as mesmas condições
Adicionalmente, a importância de se obter estimativas de
de incubação indicam que tanto filter bags F57
(Ankom®) como
coeficientes de digestibilidade de forma eficiente reside no fato de que
aqueles confeccionados com tecido não-tecido (TNT, 100 g/m)
estas estimativas constituem aspecto básico para se quantificar o valor
propiciam resultados similares de FDNi e FDAi (Valente et al., 201la:
energético dos alimentos ou dietas, permitindo o balanceamento
2011b). Há duas diferenças básicas entre ambos para procedimentos
adequado de dietas que propiciem o atendimento das demandas de de incubação in situ de tempo único, como os aqui recomendados.
mantença e produção dos animais (Detmann et al., 2016). Primeiro, os filter bags confeccionados com TNT possuem menor
resistência a danos fisicos (Valente et al., 201la), o que determina que
Atualizações não haja reutilização dos mesmos. Em segundo lugar, os filter bags
F57 possuem menor taxa de troca de material entre seu ambiente
O principal grupo de atualizações deriva-se das modificações
interior e o exterior do ambiente de incubação. Isso acarreta taxa de
realizadas sobre os métodos F-001/2, F-002/2, F-003/2 e F-004/2, os
degradação do substrato mais lenta e, consequentemente, demanda
quais servem de base para os processos de extração química aqui
maiores tempos de incubação para estimação da fração indigestível
utilizados.
(Valente et al., 2011b). Contudo, o tempo de incubação aqui adotado
233
232
INCT Cincia Animal
Métodos para Análise de Almmentos2 Edici
protocolo cstabelecido para as dos resultados (Silva et al. 2018). possível reflexo acúmulo de
já contempla tal diferença. sendo o
robustez parao uso de ambos bolhas no interior dos filter hags (CGomes et al. 201),
maiores demandas de tempo. garantindo o que
os tipos de filter bags. compromete a homogeneidade de contato entre o extratoreomaterial
análises de FDN demandarem partículas moídas 1 ser extraído. A pressurização amplia a temperatura de ebulição do
Apesar de as
em peneira de porosidade mm. as avaliações de FDNi e FDAi são Cxtrator e, consequentemente, evita a formação de bolhas no interior
peneiras de porosidade 2 dos filter hags. A maioria dos equipamentos nacionais para extraçöes
realizadas com partículas processadas em
mm. Este é o padrão para avaliações in situ (favor consultar o Capítulo com filler bags opera sob condições não pressurizadas, não sendo
FDAi, de partículas com recomendada a sua utilização

18). Contudo, nas avaliações de FDNi e o uso
menor superficie específica não compromete a extração pelas soluções Questionamentos são também direcionados ao fato de haver
de detergente. Embora possuam base analítica comum, a extração ou não diferenças entre animais quanto ao valor de FDNi ou FDAi
de FDN, por exemplo, é obtido. Nutricionalmente. animais são incapazes de causar tal
possui objetivos distintos. A extração
há muitas interferências oriundas diferença, uma vez que a dimensio da fração indigestívelé
complexa sob a ótica química, pois
de outros compostos do alimento. A avaliação no material incubado característica inerente ao alimento utilizado. 0 que ocore são
diferenças entre animais quanto à taxa de degradação do material, o

por 288 horas no nímen consiste basicamente de um processo de
muito que afeta o tempo critico necessário de incubação para se estimar a
limpeza para remoção de debris microbianos, sendo, portanto,
mais simples quimicamente. Esta é razão pelo qual não há necessidade fração indigestível (Sampaio et al. 2014). Essas variações advem de
de a-amilase para análise de FDNi ou de extração sequencial para características inerentes aos animais em si, como, por exemplo,
análise de FDAi, pois, por exemplo, amido e pectina já foram peculiaridades no seu microbioma ruminal. Os efeitos destas variaçõöes
na estimação da tração indigestivel são conrolados pelo fornecimento
degradados durante a permanência da amostra no rúmen.
de dieta adequada e pela adoção de tempo adequado de incubação.
No entanto, similarmente ao recomendado para o uso de filier
bags nas análises de FDN e FDA, aqui também há necessidade dese A utilizaço de ovinos como animais doadores mostra-se uma
conduzir a extração utilizando-se sistemas pressurizados. O uso de dúvicla recormente sobre os protocolos de avaliação de trações
indigestíveis. Ovinos não devem ser utilizados para tais

equipamentos não pressurizados compromete a qualidade e a preciso
235
234
procedimentos por duas razões básicas. Primeiro, devido ao pequeno
volume do rúmen, há drástica redução no número de sacos incubados Aparelho analisador de fibras Ankom20 ou
Ankom20 ou
por animal, comprometendo capacidade operacional

a do método. Em AnkomELIA ou autoclave
segundo lugar, ovinos apresentam taxa de degradação mais lenta em
-
Erlenmeyers (4 e 10L)
comparação a bovinos, exigindo tempos de incubação extremamente
-
Coletores universais autoclaváveis

-
Panela de alumínio
longos para estimação da fração indigestível (Reis et al., 2017). Logo,
considerando que a fração indigestível é uma característica do
-
Bandejas de alumínio
alimento, sua avaliação é mais vantajosa utilizando-se bovinos como Fogão ou fogareiro
Sacos de filó
animais doadores.
-
Corrente com peso na ponta

FDNi utilizando analisador de fibras - F-008/2 Bovino fistulado no rúmen
FDNi utilizando autoclave - F-009/2 Lavadora tipo "tanquinho"
FDAi utilizando analisador de fibras - F-010/2
FDAi utilizando autoclave - F-011/2

Reagentes
-
Sulfato láurico de sódio

(NaC12H2sS04) P.A.
Aparatos - Etilenodiamino
tetra-acético (EDTA) sal dissódico
Balança analítica com precisão de 0,0001 g CioH14N2Os.2Na.2H;O) diidratado P.A. ou EDTA ácido
- Dessecador CioHisN 0s) P.A. e hidróxido de sódio (NaOH) P.A.
Tetraborato de sódio
Estufa com circulação forçada de ar (NazB,O7.10H0) decahidratado P.A.
-
Fosfato de sódio dibásico anidro

(Na,HPO) ou
heptahidratado
Sacos F57 (Ankom®) ou de tecido não tecido (TNT, 100 g/m) (Na-HPO4.7H,0) P.A.
Seladora Trietilenoglicol (CsH1404) P.A.
-
Acido sulfúrico (H2SO.) concentrado P.A.

Brometo de cetil trimetilamônio (C9HBrN) P.A.
(cetremide ou CTAB)
236 237
-
Edição
- Acetona (C:H.O) P.A. Sob temperaturas ambientes baixas pode haver precipitaço
- Detergente neutro comercial parcial na solução armazenada. Nesses casos, aqueça levemente
a solução e agite para a ressobulização antes do uso.
Soluções
Solução de detergente ácido
Solução de detergente neutro comercial Em
- Em Erlenmeyer de 4 L. adicione 1 L de água destilada e 80 mL de
Erlenmeyer de 10 Ladicione 4 L de água destilada previamente
aquecida. Adicione 200 g de CTAB P.A. e agite levemente. Adicione
detergente neutro comercial. Agite até a completa homogeneização lentamente 277 mL de ácido sulfúrico concentrado P.A. Agite até a
e complete o volume com água destilada. solubilização e complete o volume com água destilada.
Solução de detergente neutro Procedimentos

- Em Erlenmeyer de 10 L adicione 4 L de água destilada previamente
186,1 g Use balança analítica aferida pelo INMETRO, cOm precisão de

aquecida. Adicione 300 g de sulfato láurico de sódio P.A.,
de EDTA sal dissódico P.A. (ou 146,1 g de EDTA ácido

P.A. e 40 g 0,0001 g, sobre bancada especial de laboratório e em ambiente climatizado
tetraborato de sódio (20-25°C ou de acordo com as especificações do fabricante). Ligue a
de hidróxido de sódio P.A.), 68,1 g de
P.A. balança e aguarde 30 minutos para sua estabilização.
decahidratado P.A., 45,6 g de fosfato de sódio dibásico anidro
P.A.) e 100
(ou 81,54 g de fosfato de sódio dibásico heptahidratado Preparação dos filter bags
mL de trietilenoglicol P.A. Agite até a completa solubilização.
1. Identifique os filter bags com marcador pemanente.
final da solução deve
Completeo volume com água destilada. O pH
estar entre 6,95 e 7,05. Caso o pH final esteja abaixo de 6,50 ou 2. Acondicione os filter bags em panela de aumínio e adicione a solução
Para pH final de volume suficiente para cobrir todo o
acima de 7,50, descarte a soluço. de detergente neutro comercial em
faixa ideal com adição de pequenas
6,50spHc6,95, ajuste para a material.
Para pH final de 7,05<pHs7,50

porçoes de hidróxido de sódio.
faixa ideal gotejando ácido clorídrico concentrado.
ajuste para a 239
238
Métodos para Análise de Alimentos 2" Edição
3. Leve o recipiente ao fogão ou fogareiroe aqueça. A solução deve
Adaptaçãoe dieta do animal(is) doador(es)
O(s) animal(is) doador(es) deve(m) ser adaptados à dieta basal

4. Lave os filter bags com água corente até a total retirada do
por, no mínimo, 14 dias antes da incubação e nesta ser mantido até a
detergente.
retirada do material do rúmen.
5. Seque os filter bags em bandejas (camada delgada sem A dieta basal deve ser formada por volumoso e concentrado
sobreposição) sequencialmente em estufa com circulação forçada na proporção de 80:20, com base da matéria seca, e conter 12% de
de ar a 55°C por 24 horas e em estufa não ventilada a 105°C por 2 proteína bruta, também com base na matéria seca. A suplementação
horas. mineral deve ser realizada ad libitum, mantendo-se também água
disponível em abundância.
por procedimento) e aguarde o equil+brio com a temperatura

Incubação
ambiente.
1. Acondicione os filter bags em sacos de filó, os quais devem ser
7. Pese os filter bags e registre o peso. Esse será o peso da tara. fechados. Fixe os sacos de filó a uma corrente com um peso na
ponta. Introduza o saco de filó com o peso no rúmen do animal
8. Acondicione as amostras nos filter bags seguindo-se a relação de 20
doador, onde deve permanecer por 288 horas.
mg de matéria seca por centímetro quadrado de superfície. Sacos F57
possuem aproximadamente 36 cm2 de superfície. Assim, seriam 2. Retire os filter bags do rúmen e lave-os bem em água corrente até a
necessários 720 mg de matéria seca ou, aproximadamente, 800 mg de retirada do excesso de material aderido à superfície externa.
amostra seca ao ar. O mesmo raciocínio é seguido para os filter bags Sugere-se que, durante a lavagem, os filter bags sejam pressionados
confeccionados com TNT, cujas dimensões sugeridas são de 4,0 x 4,5 levemente com as mãos para auxiliar a retirada de material solúvel.
cm. As amostras devem ser obrigatoriamente processadas em
3. Acondicione os filter bags em lavadora tipo "tanquinho". Encha-a
moinho de facas com peneira de porosidade de 2 mm.
com água limpa e, usando regulagem para "lavagem delicada",
240 241
INCT Cência Animal Métodos para Análise de Alimentos 2" Edição
água após a lavagem. Este

por I minuto. Drene manter por I hora. O tempo de extração é contabilizado após a
a
acione a lavadora
deve ser realizado por, no mínimo, cinco vezes.

temperatura ser atingida.
procedimento
4. Após os ciclos de lavagem. pressione gentilmente osfilter bags para 3. Lave os filter bags com água destilada quente (temperatura> 90°C)
retirada do excesso de água (que deve estar límpida). até a completa retirada da solução de detergente.
detergente não ocorra de imediato, seque os 4. Adicione os filter bags em um recipiente e cubra-os com acetona.
5. Caso a extração com
filter bags em bandejas (camada delgada sem sobreposição) em Agite por 3 a 5 minutos.
estufa com circulação forçada de ar a 55°C por 24 horas.

5. Seque os filter bags em bandejas (camada delgada sem
sobreposição) sequencialmente em estufa com circulação forçada

Extração
de ar a 55°C por 24 horas e em estufa não ventilada a 105°C por 2
la. Acondicione os filter bags em aparelho analisador de fibras
horas.
Ankom220 ou Ankom2000 ou AnkomDELTA e adicione solução de
detergente neutro à temperatura ambiente. A relação
por procedimento) e aguarde o equilíbrio com a temperatura
detergente:amostra deve ser de, aproximadamente, 100 mL/g de
ambiente.
amostra seca ao ar, ou
7. Pese os filter bags e registre o peso.

lb. Acondicione os filter bags individualmente em coletores
universais autoclaváveis e adicione solução de detergente neutro à
A avaliação da FDAi pode ser realizada diretamente, sem
temperatura ambiente. A relação detergente:amostra deve ser de, análise sequencial à FDNi (normalmente, somente um dos compostos
aproximadamente, 100 mLg de amostra seca ao ar. utilizado no mesmo estudo), repetindo-se os procedimentos 1 a7
mas substituindo-se a solução de detergente neutro por soluçã de
2. Aquecer a solução em aparelhos analisador de fibras Ankom2 ou
Ankom20 ou AnkomDELTA Ou autoclave à temperatura de 105°C e detergente ácido.
242 243
2" Edição
Cálculo da concentração de FDNi e FDAi
dclergente neutro indigestível com base na matéria seca:. FDAi =
massa de fibra em detergente ácido indigestível (g): %FDAiasA =
Para o cálculo da concentração de FDNi e FDAi, utilize as
percentual de fibra em detergente ácido indigestível com base na
equações: %FDAims
amostra seca ao ar; =percentual de fibra em detergente
ácido indigestível com base na matéria seca; e %ASE = percentual de
FDNi=(FB+FDNi)-FB
"amostra seca em estufa".
FDNi
%6FDNiASAASA x100 Exemplo de cálculo
Considerando alíquota 1 da tabela a seguir, têm-se os cálculos

%FDN ASAx100
%FDNiMs %ASE da concentração de FDNi:
FDAi=(FB-+FDAi)-FB FDNi=(FB+FDNi)-FB=0,6161-0,5003=0,1158 g
FDAi %FDN ASA100 0,1158

%FDAiASA ASA x100 6FDNiMs9/%ASE 0,8058x100=14,37%
%FDAiMs %FDAIASAx100 /6FDN ASAx100g.86

14,37
%ASE
Y6FDNiMS/%ASE x100=14,99%
em que: FDNi = massa de fibra em detergente neutro indigestível (g);
FB =
peso do filter bag (g); ASA =massa de amostra seca ao ar
(g)
OFDNiASA = percentual de fibra em detergente neutro indigestível
com base na amostra seca ao ar; %FDNiMs = percentual de fibra em
244 245
-
Edição
Alíquota GOMES, D.I.; DETMANN, E.; VALENTE, T.N.P.; VALADARES FILHO,
Item 1 S.C.; QUEIROZ, A.C. Avaliação laboratorial de compostos fibrosos em
alimentos e fezes bovinas sob diferentes ambientes físicos.
ASA (g) 0.8058 0.8038 0,8031 Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.63. Arquivo
p.522-525, 2011.
FB (g) 0.5003 0.5651 0,4671 REIS, M.J., SANTOS, S.A., PRATES, L.L.; DETMANN, E.; CARVALHO.
G.G.P.; SANTOS, A.C.S.; RUFINO, L.M.A.; MARIZ, L.D.; NERLA, F.;
FB+FDNi(g) 0.6161 0,6763 0,5795 COSTA, Comparingsheepandcattle toquantify internalmarkers
FDNi (g) 0.1158 0,1112 intropical feeds using in situ ruminal incubation. Animal Feed Science
0,1124 and Technology, v.232, p. 139-147, 2017.
ToFDNiASA 143 13,83 14,00 SAMPAI0, C.B.; GOMES, D.I.; REGADAS FILHO, J.G.L.; DETMANN,
%ASE 95,86 E.; VALADARES FILHO, S.C. Variations among animals when
estimating the undegradable fraction of fiber in forage samples. Semina.
T%FDNiMs 14,99 14,43 14,60 Ciencias Agrárias, v.35, p.2739-2748, 2014.
%FDNins (média) 14,67 SILVA, R.S.T.; FERNANDES, A.M.; GOMES, R.S.; BENDIA, L.C.R.;
SILVA, LC.; VIEIRA, R.A.M. On the specificity of different methods
for neutral detergent fiber and related problems. Animal Feed Science
and Technology,v.240, p.128-144, 2018.
Literatura Citada
VALENTE, TN.P.; DETMANN, E.; VALADARES FILHO, S.C.; CUNHA,
M.; QUEIROZ, A.C.; SAMPAIO, C.B. In situ estimation of indigestible
DETMANN, E.; VALADARES FILHO, S.C.; PAULINO, M.F.; contents in cattle feed and feces using bags made from different
ZERVOUDAKIS, J.T.; CABRAL, LS. Avaliação da técnica dos compounds
textiles. Revista Brasileira de Zootecnia, v.40, p.666-675, 201la.
indicadores na estimação do por ruminantes
consumo em pastejo. VALENTE, TN.P.; DETMANN, E.: QUEIROZ, A.C.; VALADARES
Cadernos Técnicos de Veterinária e Zootecnia, v.46, p.40-57, 2004.
DETMANN, E.; SOUZA, A.L.; GARCIA, R.; VALADARES FILHO, S.C.; FILHO, S.C.; GOMES,
of
DI; FIGUEIRAS, J.F. Evaluation of ruminal
CABRAL, L.S.; ZERVOUDAKIS, J.T. Avaliação do vício de tempo degradation profiles forages using bags made from different textiles.
Revista Brasileira de Zootecnia, v.40, p.2565-2573, 2011b.
longo de indicadores internos em ensaio de digestão com ruminantes.
Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.59, p.182-
188, 2007. Literatura Adicional
DETMANN, E.; SILVA, T.E. ; VALADARES FILHO, S.C.; SAMPAIO,
C.B.; PALMA, M.N.N. Prediction of the energy value of cattle diets CASALI, A.O.; DETMANN, E.; VALADARES FILHO, S.C.; PEREIRA, J.C.
based on the chemical composition of feeds. In: VALADARES HENRIQUES, L.T; FREITAS, S.G.; PAULINO, M.F. Influência do tempo
FILHO;
S.C.; COSTA E SILVA, L.F.; GIONBELLI, M.P.; ROTTA, P.P.; de incubação e do tamanho de partículas sobre os teores de compostos
MARCONDES, M.I.; CHIZZOTTI, M.L.; PRADOS, L.F. (Org) indigestíveis am alimentos e fezes bovinas obtidos por procedimentos in situ.
Nutrient requirements of zebu and crossbred cattle BR-CORTE. Revista Brasileira de Zootecnia, v.37, p.335-342, 2008.
3ed.Viçosa: DZO-UFV, 2016. p.85-118.
246 247
- Edição
sOUZA. M.A.: DETMANN. E.: ROCHA. G.C.: FRANCO, M.O.
BATISTA. E.D.: VALADARES FILHO. S.C.; BERCHIELLI, T.T
Collaborative study to evaluate the indigestible neutral detergent fiber and Capitulo 12
indigestible acid detergent fiber contents in feeds by in situ procedure.
Semina. Cieências Agrárias, v.37. p.2589-2600, 2016.
Solução mineral
As cinzas isoladas por intermédio da queima em mufla, embora

indicadores do total de minerais presentes nos alimentos, não constituem
indicação acurada da concentração de minerais individuais. Além das

perdas por volatização e interações sobre a conformação química dos
minerais, contaminações indesejadas podem ocorrer no interior da mufla
(Baker et al., 1964; Issac & Jones Jr.. 1972). Assim. para se conhecer a
concentração de minerais específicos de determinada amostra é
necessário transformar a matéria mineral em solução mineral e. em
seguida, analisá-los individualmente.

Para quantificação da concentração de um elemento em uma
amostra de alimento, deve-se primeiro destruir a matriz orgânica que
forma a estrutura dessa amostra. Essa remoção pode ser conduzida
pela oxidação dos compostos orgânicos do alimento utilizando ácidos

(Gomes & Oliveira, 2011). Neste contexto, constitui procedimento
comum a utilização conjunta dos ácidos nítrico (HNO:) e perclórico
(HCIO4).
Em geral, a preparação da solução mineral por digestão ácida
possui algunmas vantagens em relação ao isolamento dos minerais apenas
48 249
-2" Edição
por queima (incineração). Entre essas, destaca-se. principalmente, a menor
4:1 entre os ácidos nítrico
perclórico e pode ser aplicada a diversas
e
possibilidade de perda por volatilização devido à menor temperatura de

matrizesorgânicas, com exceção de ossos e cartilagens. A segunda
digestão (200°C). Em contrapartida, este procedimento denmanda
(M-004/3) pode ser aplicada a qualquer matriz orgânica, incluindo
instalações especiais para eliminação dos vapores ácidos, além do perigo
OSSOS e cartilagens. Em tese. o método M-004/3 poderia ser a única
de manuseio do ácido perclórico, que, quando aquecido, torma-se um
Versão a ser
aplicada. Contudo. geralmente. o ácido perclórico
desidratante-oxidante (Silva & Queiroz, 2002).
apresenta maior custo. Logo. quando ossos e cartilagens não fazem
parte do escopo de amostras a ser analisado. o método M-004/2 reduz
Atualizações custo de
O análise, sem que haja comprometimento sobre a
A versão anterior do método de produção de solução mineral recuperação de minerais.
se baseava na digesto ácida em duas etapas (i.e., nítrica e
posteriormente perclórica). Contudo, em função dos trabalhos de Digestäo nitro-perclórica

Palma et al. (2015) e Rocha et al. (2015), evidenciou-se que os ácidos (Método M-004/2)
Aplicávela matrizes orgânicas, com exceção de ossos e
podem ser previamente misturados e adicionados em conjunto sobre a
amostra, o que reduz o número de etapas, aumenta a praticidade e cartilagens

reduz o tempo de análise.
Aparatos
Adicionalmente, o método original (M-004/1) baseava-se no
uso de uma razão única entre os ácidos nítrico e perclórico (4:1), a
-
Balança analítica com precisão de 0.0001g

qual era considerada adequada para todos os tipos de matrizes
-

orgânicas. Contudo, Palma et al. (2015) verificaram que matrizes de Balões volumétricos de 25, 50 ou 100 mL
maior
-
Balöes volumétricos de 1000 mL

rigidez, como ossose cartilagens, demandariam maior
proporção de ácido perclórico para liberação otimizada dos minerais a Funis raiados
Frasco de vidro âmbar para armazenamento de solução
serem analisados. Assim, o método M-004/1 foi desmembrado e
- Bloco digestor
atualizado em duas versões, primeira (M-004/2) mantém
a a relação
250 251
Tubos de digestão em borossilicato com orla

Homogeneíze e complete o volume com água ácido nítrico.
- Potes de polietileno com tampa rosqueável
Homogeneíze, aguarde estabilizar e transfira a solução para um
frasco âmbar.
Reagentes
Procedimentos
- Ácido clorídrico (HCI) 37% P.A.
- Ácido perclórico (HC10,) 70% P.A. 1. Use balança analítica aferida pelo INMETRO, com precisão de
- Ácido nítrico (HNO:) 65% P.A. 0,0001 g, sobre bancada especial de laboratório e em ambiente
Soluções fabricante). Ligue a balança e aguarde 30 minutos para sua
Solução de ácido clorídrico (200 mL/L) estabilização.

Em capela, em um balão de 1000 mL com cerca de 200 mL de água
2. Lave toda a vidraria exclusiva para minerais (tubos, funis, balões
destilada, adicione 200 mL do ácido clorídrico. Complete o volume
volumétricos, etc.), usando solução de ácido cloríidrico (200 mL/L)
com água destilada e homogeneíze a solução. ou solução de ácido nítrico (100 mLL), em seguida, enxágue bem
com água destilada. Sugere-se que a vidraria possa seja mantida

Solução de ácido nítrico (HNO3 100mLL)
com das soluções ácidas por uma noite.
-
Em capela, em um balo de 1000 mL com cerca de 200 mL de água

destilada, adicione 100 mL do ácido nítrico. Complete o volume com 3. Pese aproximadamente 200 mg de amostra seca ao ar e coloque no
água destilada e homogeneíze a solução. tubo devidamente identificado.
Solução nitro-perclórica 4:1 4. Em capela, adicione 5 mL da solução nitro-perclórica e deixe em

Emcapela, em um balão de 1000 mL, adicione cerca de 200 mL de
repouso durante 30 minutos.
ácido nítrico. Em seguida, adicione 250 mL de ácido perclórico.
252 253
2" Edição
5. Acondicione tubos bloco
os em digestor e aqueça lentamente até
8.
atingir a temperatura de 200°C. O bloco digestor deve permanecer Complete o volume do balo com água destilada.
em capela com o exaustor ligado durante toda a digestão. O 9. Transfira a
solução mineral para potes de
polietileno devidamente
aquecimento no início deverá ser lento, até que cesse a formação de limpos. Realize a
lavagem do frasco no momento da transferência
espuma. sendo aumentado em seguida. para haver ebulição e com um pouco da solução mineral. Adicione cerca de 5 a 10 mL da
desprendimento de gases com coloração marrom-avermelhada. solução no frasco, tampe e agite. Descarte este material e então
Aguarde até a solução tormar-se clara e cessar o desprendimento de acondicione a solução a ser armazenada. Amazene a
soluço em
vapor de coloração marrom. Jamais permita que o aquecimento se geladeira até o momento da leitura.
prolongue até secar completamente, pois, nessas condições, poderá

Recomendações adicionais
ocorrer explosão. Caso o volume alcance aproximadamente 1 mLe
1. Use somente água destilada ou desmineralizada e
ainda estiver ocorrendo o desprendimento de vapor marrom, retire vidrarias exclusivas
tubos do bloco, para análise de minerais para evitar contaminação com minerais de
os mantendo-os, contudo, no interior da capela.
outros procedimentos.
Aguardeo resfriamento até a temperatura ambiente, adicione 5 mIL
da mistura nitro-preclórica e reinicie o aquecimento no bloco. 2. Embora não haja nada que indique que há deterioração da solução
mineral, recomenda-se o armazenamento da mesma sob refrigeração
6. Retire os tubos e os deixe-os esfriar interior da
no capela.
(4°C).
7. Proceda à transferência
quantitativa do material para balão
3. Durante feitura da
a solução, use um balão limpo para cada solução.
volumétrico de 25, 50 ou 100 mL. Utilize papel de filtro
Não reutilize balões entre soluções sem a devida limpeza.
quantitativo, livre de cinzas e de filtração rápida. O volume do balão
a ser utilizado irá depender da concentração do(s) mineral(is) de
interesse e da sensibilidade analítica do método de quantificação ba

ser utilizado posteriormente.
255
254
Digestão nitro-perclórica
(Método M-004/3)
Soluçies
Aplicável a todas as matrizes orgânicas, incluindo ossos e Solução de ácido clorídrico (200 m/L)
Em capela, em um balão de 1000 mL
cartilagens com cerca de 200 mL de água
destilada, adicione 200 mL do ácido clorídrico. Complete o volume
Aparatos com água destilada e homogeneíze a solução.
Balançaanalítica com precisão de 0,0001g Solução de ácido nítrico (100 mL/L)

Papel filtro quantitativo, livre de cinzas e de filtração rápida Em
-
capela, em um balão de I000 mL com cerca de 200 mL de água

Balões volumétricos de 25, 50 ou 100 mL destilada, adicione 100 mL do ácido nítrico. Complete o volume com
Baloes volumétricos de 1000 mL água destilada e homogeneíze a solução.
-Funis raiados
Frasco de vidro âmbar para armazenamento de Solução nitro-perclórica 2:1
solução
-
Bloco digestor
-
Em capela, em um balão de 1000 mL. adicione cerca de 200 mL de

ácido nítrico. Em seguida, adicione 333 mL de ácido
Tubos de digestão em borossilicato com orla perclórico.
Potes de Homogeneíze e complete o volume com água ácido nítrico.
-
polietileno
-
Capela com exaustão Homogeneíze, aguarde estabilizar e transtira a solução para um

frasco âmbar.
Reagentes
Procedimentos
Ácido clorídrico (HCI)
P.A. 1. Siga todos os procedimentos definidos para o método M 004/2,
Ácido perclórico (HCI0. 70%) P.A.
substituindo, contudo, a mistura ácida de 4:1 por 2:1.
Acido nítrico (HNO; 65%) P.A.
256 257
Literatura Citada
Capítulo 13
BAKER. D.E.: GORSLINE. G.W.: SMITH. C.B.: THOMAS, W.I.: GRUBE,
W.E.: RAGLAND. J.L. Technique for Rapid Analyses of Corn leaves for
eleven elements. Agronomy Journal. v.56. p.133-136, 1964. Fósforo inorgânico total
GOMES. J.c.: OLIVEIRA. G.F. Análises fisico-químicas de alimentos.
Viçosa: Editora UFV. 2011. 303p Definições básicas
ISAAC, R.A.: JONES Jr.. J.B. Effects of various dry ashing temperatures on
the determination of 13 nutrient elements in five plant tissues A avaliação direta de fósforo em amostras convertidas em solução
Communications in Soil Science and Plant Analysis, v.3, 261-269,
1972. mineral pode ser realizada com base em reações coloriméticas. Uma
SILVA, D.J.: QUEIROZ, A.C. Análise de Alimentos. Métodos químicos e alternativa consiste em colocar o fósforo presente na soluço mineral em
biológicos. 3 ed. Viçosa: Editora UFV, 2002. 235p.
contato com molibdato de amônio, produzindo amônio fosfomolibdato.
PALMA. M.NN: ROCHA, G.C.; VALADARES FILHO, S.C.;
Este composto é reduzido na presença da vitamina C (ácido ascórbico).
DETMANN, E. Evaluation of acid digestion procedures to estimate
mineral contents in materials from animal trials. Asian-Australasian formando óxidos coloidais proporcionais à concentração de fósforo na
Journal of Animal Science, v. 28, p. 1624-1628, 2015.
ROCHA, G.C.; PALMA, MN.N. DETMANN, E.; VALADARES FILHO,
solução. O excesso de molibdato de amônio não reage com a vitamina C.
S.C.. Evaluation of acid digestion techniques to estimate chromium A quantidade de fósforo é quantificada medindo-se a intensidade
contents in cattle feces. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.50, p.92-
de cor azul, que é produzida pela formação dos óxidos coloidais reduzidos
95, 2015.
de molibdato. A intensidade da cor desenvolvida pelo fosfomolibdato
depende da acidez e da temperatura da solução. sendo estável em solução
ácida (Silva& Queiroz, 2002).
Atualizaçõöes
Nenhuma atualização direta foi realizada sobre o método aplicado
à quantificação do fósforo inorgânico total. Apenas ressalta-se que as
259
258
intermédio dos métodos M-004/2 e M-

modificações introduzidas por Soluções
004/3 devem ser aplicadas aqui.
Solução de ácido ascórbico (40 g/L)
4 g de vitamina C balão de 100 mL e complete o

Coloque em um
Método do Fósforo-Molibdato
volume com água destilada ou desmineralizada.
(Método M-008/2)
A validade da solução é de 60 minutos. Assim, aconselha-se que esta
Aparatos solução seja preparada somente no momento no qual as análises
serão realizadas.
- Balões volumétricos de 50, 100 e 1000 mL
Béqueres de 200 e 500 mL Solução ácida de molibdato

Espectrofotômetro UV/Visível
Solução A
- Funis raiados
- Em béquer de 500 mL, pese 1 g de carbonato de bismuto, adicione
- Bastões de vidro
destilada desmineralizada e, cuidadosamente,
200 mL de água ou
- Pipetas graduadas
138 mL de ácido sulfúrico concentrado.
Homogeneíze com um bastão de vidro e deixe em repouso por 30

Reagentes
minutos.
- Acido sulfúrico (HS0.) concentrado P.A.
- Carbonato de bismuto [(Bi0),CO;] P.A. Solução B
Molibdato de amônio tetraidratado [(NH:)%Mo;034.4H;0] P.A. Em béquer de 200 mL, adicione 20 g de molibdato de amônio e 150
Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4) P.A. mL de água destilada ou desmineralizada. Agite com basto de vidro
até a solubilização.
Vitamina CP.A. (ácido ascórbico)
261
260
Solução final Tabela 13.1 - Esquema para preparação dos padrões de fósforo
duas balão de 1000 mLe complete o volume

-Junte as soluções em um
com água destilada ou desmineralizada. Concentrações (ppm)

Solução(mlL 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
Solução padrão de fósforo (solução estoque 1000 ppm) Solução de trabalho 3 4
Em um balão volumétrico de 1000 ml, pese 4,39 g de fosfato de Solução ácida de molibdato 5 5 5 5 5
potássio monobásico P.A. e complete o volume com água destilada. Adicionar água destilada ou desmineralizada a 2/3 e agitar
A massa de KH;PO; deverá ser ajustada para a pureza do reagente. Solução de ácido ascórbico (40 g/L) 2 2 2
Alternativamente, padrões minerais podem ser adquiridos Agua 9.s.p. 50 mL e agitar
diretamente na forma de ampolas para serem diluídos em OBS: Aguarde 5 minutos após se completar o volume para que haja
quantidades específicas de água. O uso destes padrões é interessante, estabilidade da coloração azul.
pois os mesmos reduzem o risco de erro devido à necessidade de

Procedimentos
pesagem de massas pequenas e exatas para produço da solução
estoque. 1. Lave toda a vidraria exclusiva para minerais (tubos, funis, balões
volumétricos, pipeta etc.), usando solução de ácido cloridrico (200

Solução de trabalho
mL/L) ou solução de ácido nítrico (100 mL/L), em seguida,
Emum balão de 1000 mL, adicione 10 mL da solução estoque (1000
enxágue bem com água destülada. Detalhes sobre estas soluções
ppm) e complete o volume com água destilada ou desmineralizada.
podem ser encontrados no Capítulo 12.
Soluções padrões 2. Veja preparo de solução mineral no capítulo 12.

-
Utilize balões de 50 mL e estabeleça os padrões conforme indicado

na Tabela 13.1. 3. Transtira uma alíquota da solução mineral a ser analisada para
balões de 50 mL já contendo 5 mL da solução ácida de molibdato
de amonio e2 mL de solução de ácido ascórbico. Para a maioria dos
262 263
materiais, alíquotas de I mL são suficientes. No entanto,
esta poderá
Cálculo da concentração de fósforo
Materiais
variar em função da concentração de fóstoro na amostra.
com teores baixos de fósforo exigirão alíquotas maiores. Torna-se

Utilize sequencialmente as equações abaixo:
importante ressaltar que a concentração da solução de leitura deve
estar entre 0.2 e 0.8 ppm. Isso é facilmente perceptível a olho nu B xA)
comparando-se a intensidade da coloração azul da solução de leitura
com os padrões (que devem ser os primeiros a serem produzidos).

AA
[Pls
4. Acrescente 20 mL de água destilada. Homogeneíze e complete o
volume com água destilada ou desmineralizada. Esta solução
VBSL VBSM
utilizada para avaliação da concentração de fósforo na amostra é (PlAsa-[Plst ASM ASA
denominada "solução de leitura"
em que: ß =fator de conversão de absorbância em concentração por

5. Agite a solução levemente e deixe em repouso por 5 minutos.
intermédio da Lei de Lambert-Beer ((ppm): Pi = concentração de
6. Ajuste o espectrofotômetro para o comprimento de onda de 725 nm. fósforo no padrão i (ppm); Ai = absorbância no padrão i: Plst =
concentração de fósforo na solução de leitura (ppm); AA =
7. Proceda à calibração do aparelho, inserindo o "branco" (0 ppm) e absorbância para a amostra: [P]asA = concentração de fósforo com
ajustando a absorbância para zero (A=0). Insira os demais padrões base na amostra seca ao ar (ppm): VBSL = volume do balão usado no
e obtenha as absorbâncias. preparo da solução de leitura (no caso dos procedimentos aqui
descritos este volume será fixado em 50 mL); ASL: alíquota de
8. Insira as soluções de leitura e obtenha as respectivas absorbäncias.
solução mineral usada no preparo da solução de leitura (mL); VBSM
-OBS: O tempo entre o preparo da solução de ácido ascórbico e a volume do balão volumétrico usado para o preparo da solução
leitura não deve ultrapassar 60 minutos. mineral (mL); ASA = massa de amostra seca ao ar usada no preparo
E
da solução mineral (g).
264 265

E
desejável que [P]st. esteja entre 0,2 e 0,8 ppm. Quanto -2" Edição
mais próximo à média, maior a confiabilidade da leitura.
Leituras
Balão volumétrico usadono
preparo da solução mineral: 100 mL.
no extremo
superior (0,8-1,0 ppm) possuem baixa confiabilidade. Absorbância da solução de leitura: 0.204
Leituras no extremo inferior (0-0,2
ppm), além da baixa
Padrão (ppm) Absorbancia
confiabilidade, poderão sofrer interferências significativas do
ruído do 0,0 0.000
equipamento. A [PlsL pode ser ajustada pelo analista
0,2 0.094
variando-se a alíquota de solução mineral usada
para o preparo
0,4 0.201
da solução de leitura.
Extrapolações (i.e., [Plsu > 1,0 ppm) não são 0,6 0.312
toleradas.
0,8 0416
Proceda à correção da concentração 1,0 0.539

para a umidade residual:
PlMs PlASA
X 100
100 R
B2PxA
A_0.0x0,000)+.+(1,0x0,539) 0.5265
%ASE (0,0)2++(1,0)2
em que: P]Ms =
concentração de fósoforo com base na matéria seca AA 0,204
(ppm); %ASE =
percentual de "amostra seca em estufa". Pls 0,5265 =0,3875 ppm
Exemplo de cálculo VBSL VBSM 50 100

v
PlASA=[PlsXASMASA .38/5 5*0,2692 =1439,5 ppm
Alíquota usada no preparo da solução mineral (amostra seca ao
ar): 0,2692 g. PlaSA100 9586x100=1501,7ppm>0,150%
PlMs90ASE
1439,5
o ASE: 95,86%.
Alíquota de solução mineral usada na produção da solução de
leitura: 5 mL.
266 267
INCT Cíência Animal Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição
Literatura citada
Capítulo 14
SILVA. D.J.: QUEIROZ, A.C. Análise de
Alimentos. Métodos químicos e
3 ed. Viçosa: Editora UFV, 2002. 235p.

biológicos. Cromo
Literatura adicional
de
BRAGA, J.M.: DEFELIPO, B.V. Determinação espectrofotométrica
fósforo em extratos de solos e material vegetal. Revista Ceres, v.21, p.73- Vários elementos químicos, seja na forma de óxido ou de sal.
75, 1974.
podem ser usados como indicadores externos em ensaios de digestão
FISKE, C.A.: SUBBAROW, I. The colorimetric determination of com ruminantes. Entre estes, destacam-se: itérbio, érbio, eurÓpio.
phosphorus. Journal of Biological Chemistry, v.66, p.375, 1925.
cádmio, cobalto, lantânio, ouro, cério, titänio e cromo. Este último
elemento, notadamente sob a forma de sesquióxido de cromo ou óxido
crômico (Cr-03), é o indicador extermo mais utilizado para a
quantificação da excreção fecal de bovinos em confinamento ou a
pasto. Tal peculiaridade se deve ao fato do óxido crômico ser
facilmente adicionado à dieta, ser facilmente analisado e apresentar

baixo custo (Detmann et al., 2004).
Entre as características ideais de um indicador, pode-se
enfatizar a capacidade deste ser completamente recuperado nas fezes
Ou em qualquer segmento do trato grastrintestinal (Owens & Hanson,
1992). A falta dessa característica pode resultar em estimativas
viesadas do fluxo de digesta ou excreção fecal. Em termos teóricos, a
capacidade de recuperação constitui característica inerente ao
indicador (Detmann et al., 2007). Contudo, influências indiretas dos
268 269
-2" Ediço
métodos aplicados para estimar a sua concentração pode resultar em
desvios aparentes de recuperação. Atualizações

Vários métodos para avaliar o teor de cromo em amostras de Os métodos propostos na
primeira edição foram devidamente
fezes podem ser encontrados na literatura. Geralmente, esses métodos avaliados por Souza ct al. (2013). Contudo, em trabalho de avaliação
são baseados na combinação de duas técnicas diferentes. A primeira. da otimização do método M-005/1. Rocha et al. (2015) verificaram
denominada geralmente de abertura, é usada para eliminar a matéria que a relação entre os ácidos nítrico e perclórico poderia ser
orgânica da amostra deixando o cromo em uma forma química modificada de 2:1 para 3:1. sem comprometer exatidão
a e precisão
quantificável. Neste ponto. aplica-se a segunda técnica, que é das estimativas, porém reduzindo o custo das análises. Esta
responsável pela quantificação da concentração em si. modificação foi adotada. Por outro lado. nenhuma modificação foi
A primeira técnica está normalmente baseada na digestão proposta para o método M-006/1.
ácida sob altas temperaturas. A digestão ácida das amostras altera a
valência do de +3
Digestão nitro-perclórica
cromo (sesquióxido) para +6 (dicromato). A partir
(Método M-005/2)
daí. o elemento é facilmente quantificado. Vários ácidos ou
combinações de ácidos podem ser empregados no processo de Aparatos

digestão, sendo mais comuns as misturas de ácidos nítrico e perclórico Balança analítica com precisão de 0.0001 g
(Kimura & Miller, 1957) e de ácidos sulfúrico e perclórico (Fenton & Tubos de
-
digestão em borossilicato com orla

Fenton, 1979). Neste Manual, faculta-se a utilização de um desses Bloco digestor
processos de digestão, ambos acompanhados de quantificação por -

espectrofotometria de absorção atômica, pois ambos fornecem Balões volumétricos
estimativas exatas do teor de cromo fecal (Souza et al., 2013). A - Funis raiados
digestão em ácido fosfórico (Williams et al., 1962)e a quantificação Potes de polietileno

por colorimetria (Kimura & Miller, 1957) não são recomendadas -Espectofotômetro de absor_ão atômica
devido à falta de exatido das estimativas obtidas (Souza et al., 2013).
-
Frasco Erlenmeyer de 2000 mL
270 271

- Pipetas
- 2" Edição
- Capela com exaust ão molibdato de sódio PA (concentração de

lg/L de solução). Agite
com bastão de vidro at a
solubilização
Reagentes
Padroes
- Åcido clorídrico (HCI) 37% P.A.
-
Faça soluções padrões contendo 0. 2. 4, 6. 8 e 10 ppm de cromo a

- Acido nítrico (HNO;) 65% P.A.
partir de uma solução estoque contendo 1000 ppm de cromo. Sugere-
Ácido perclórico (HCI04) 70% P.A. se a
aquisição de padrões ou soluções estoque de cromo comerciais
-
Molibdato de sódio diidratado (Na2MoO4 2H,0) P.A. (eg. Merk 1,09948 Tritisol®).
-
Ressalta-se que pode haver pequenas variações nas concentrações de

Soluções cromo nos padrões (e.g., 0-8 ppm. 0-12 ppm) devido a
Solução de ácido cloridrico (200 m/L) peculiaridades dos equipamentos (faixa de linearidade de
Em um balão de 1000 mL com cerca de 200 mL de água destilada, mensuração de cada equipamento).
dissolva 200 mL de ácido clorídrico P.A. Complete o volume com

Procedimentos
água destilada e homogeneíze a solução.
Solução de ácido nítrico (100 ml) 0,0001 g, sobre bancada especial de laboratório e em ambiente
Em um balão de 1000 mL com cerca de 200 mL de água destilada, climatizado (20-25°C ou de acordo com as especificações do
dissolva 100 mL de ácido nítrico P.A. Complete o volume com água fabricante). Ligue a balança e aguarde 30 minutos para sua
destilada e homogeneíze a solução. estabilização.
2. Lave toda a vidraria exclusiva para minerais, usando solução de

Solução digestora
- Em capela, em um Erlenmeyer, misture cuidadosamente 1200 mL de ácido clorídrico ou solução de ácido nitrico, em seguida, enxágue
bem com água destilada. Veja detalhes no Capítulo 12.
ácido nítrico P.A. e 400 mL de ácido perclórico P.A. (relação entre
os ácidos nítrico e perclórico de 3:1 v:v). Adicione 1,6 g de

273
272
INCT Ciencia Animal
- Edição
3. Pese. aproximadamente. 250 mg de amostra seca ao ar e coloque no
10. Transfira uma
tubo devidamente identificado. alíquota para potes de polietileno devidamente
limpos. Realize a
lavagem do frasco no momento da transferência
4. Adicione 5 mL da solução digestora e deixe em repouso por 30 com um
pouco da solução mineral de cromo. Adicione cerca de 5
minutos. a 10 mL da solução no frasco, tampe e agite. Descarte este material
5. Acondicione os tubos em bloco digestor e aqueça lentamente à e então acondicione a solução a ser armazenada.
temperatura de 200°C. Mantenha aquecido até atingir coloração
11. Armazene a solução em geladeira (4°C) até o
alaranjada e cessar o desprendimento de vapor marrom. Não deixe momento da leitura.
o material secar durante a digestão, pois há risco de explosão. O

12. Após a calibração
volume final deve ficar entre 1 e 2 mL (siga as mesmas com os
padrões, proceda à leitura em
espectrofotômetro de absorção atômica utilizando lâmpada de

recomendações de segurança feitas para o método M-004/2),
cátodo oco para cromo (comprimento de onda de 357.9 nm) e chama
6. Retire os tubos e os deixe esfriar na capela. de acetileno e óxido nitroso.
7. Proceda à transferência quantitativa do material para balão Digestão sulfo-perclórica

volumétrico de 25, 50 ou 100 mL. Uilize funis e papel de filtro (Método M-006/1)
quantitativo, livre de cinzas e de filtração rápida. O volume do balão
Aparatos
a ser utilizado irá depender da concentração de cromo na amostra.
8. Complete o volume do balão com água destilada ou Erlenmeyer de 50 mL em borossilicato com orla
desmineralizada. Erlenmeyer 2000 mlL

- Funis raiados
9. Cubra o balão com tampa ou para-filme e homogeneizar a solução. - Forno mufla com temperatura controlada
Bolas de vidro
275
214
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Nimentos-2" Fdição
- Banho de areia 2. Lave toda a vidraria exclusiva para minerais, usando solução de
filtro quantitativo. livre de cinzas e de filtração rápida de ácido nítrico (100

-
Papel ácido clorídrico (200 m/L) ou solução

Potes de polietileno mL/L), em seguida, enxágue bem com água destilada. Veja
Baloes volumétricos detalhes no Capítulo 12.
- Espectrofotômetro de absorção atômica
- Capela com exaustãão 3. Pese, aproximadamente, 1 g de amostra seca ao ar e coloque em
erlenmeyer de borossilicato de 50 mL devidamente identificado.
Reagentes mutla.
4. Acondicione os erlenmeyers contendo as amostras em
- Ácido sulfúrico (H;SO) concentrado P.A. mantenha por 4 horas.

Aqueça até atingir a temperatura de 600°Ce
Acido perclórico (HCI04) 70% P.A.
mufla e deixe que a mesma resfrie fechada
5. Após este tempo, desligue a
Soluções até se atingir a temperatura ambiente.
Solução de ácidos sulfúrico e perclórico de ácidos sulfúrico

6. Adicione aos Erlenmeyers 15 mL da solução e
- Em capela, em um frasco Erlenmeyer de 200 mL faça uma mistura

perclórico.
de destilada desmineralizada, ácido sulfúrico P.A. e ácido
água ou
perclórico P.A. na razo de 0,75:0,75:1 (v/v/v). 7. Cubra os erlenmeyers com bolas de vidro e leve-os ao banho de
areia para digestão a 300°C até as amostras atingirem coloração
Procedimentos amarelada. Este procedimento deve ser realizado em capela.
1.Use balança analítica aferidapelo INMETRO, com precisão de 0,0001

8. Espere esfriar à temperatura ambiente.
(20-25°C ou de acordo com as especificações do fabricante). Ligue a 9. Proceda à transferência quantitativa do material para balo
balança e aguarde 30 minutos para sua estabilização. volumétrico de 25, 50 ou 100 mL. Utilize funis e papel de filtro
276 277
volume do balão de 68.4% de cromo no óxido crômico não

de filtração rápida. O A suposição do teor
quantitativo, livre de cinzas
e
de cromo na amostra.
deve ser utilizada em nenhuma hipótese. pois os óxidos adquiridos
a ser utilizado irá depender da concentração
comercialmente variam muito quanto ao teor real de cromo. E comum
destilada ou
volume do balão com água 60%. Assim, dose real de cromo
10. Complete o verificar-se teores variando de 55 a a
desmineralizada.
deve ser aferida por experimento e/ou por partida de óxido crômico
balão tampa ou parafilme e homogeneíze

a solução. adquirida.
11. Cubra o com
A abertura das amostras de óxido crômico é feita de forma

devidamente
12. Transfira uma alíquota para potes de polietileno similar às amostras fecais, com as seguintes sugestões:
da transferência
limpos. Realize a lavagem do frasco no momento
de 5 1. Pesar alíquotas de 100 a 150 mg

com um pouco da solução mineral de
cromo. Adicione cerca
a 10 mL da solução no frasco, tampe e agite. Descarte este material 2. Utilizar balões de 100 ou 200 mL
então acondicione a solução a ser armazenada.

e
3. E relativamente comum a necessidade de diluir as soluções minerais
momento da leiura.
antes da leitura na absorção atômica.
13. Armazene a solução em geladeira (4°C) até o
à leitura Cálculo da concentração de cromo

14. Após a calibração com os padrões, proceda em
espectrofotômetro de absorção atômica utilizando lâmpada de

Utilize sequencialmente as equações abaixo:
cátodo oco para cromo (comprimento de onda de 357,9 nm) e chama
de acetileno e ózido nitroso.

B-2(xA)
Procedimentos adicionais
AA
Durante a condução de ensaios de consumo e/ou digestão
amostra(s) do óxido crômico utilizado deve(m) ser reservada(s) para
que a mesma seja aferida quanto ao teor de cromo.
279
278
INCT Ciencia Animal
Métodos para Análise de Alimentos -20 Edição
VBSM
umidade residual:
[CrlASA=[Crls1xFx ASA Proceda à correção da concentração para a
CrlASA 100
em que: B =fator de conversão de absorbância em concentração por CrMs%ASE
intermédio da Lei de Lambert-Beer /ppm); Pi =concentração de base na matéria seca
em que: [Cr]Ms
=
concentração de cromo comn
cromo no padrão i (ppm); Aj = absorbância no padrão i; [Cr]sL =
(ppm): %ASE =
percentual de "amostra seca em estufa"
concentração de cromo na solução de leitura (ppm); AA absorbância
=
para a amostra; [Cr]asA

=
Concentração de cromo com base na amostra
Exemplo de cálculo em uma amostra fecal
seca ao ar (ppm); F = fator de diluição da solução mineral para compor
a solução de leitural4l; VBSM volume do balão volumétrico usado

=
Alíquota usada no preparo da solução mineral (amostra seca ao
para o preparo da solução mineral (mL); ASA massa de amostra

= seca ar): 0,2501 g.
ao ar usada no preparo da solução mineral (g). Balão volumétrico usado no preparo da solução mineral: 50 mL.
o ASE: 90,15%.
É desejável que [Cr]st esteja entre 2 e 8 ppm. Quanto mais de leitura: 1
Diluição da solução mineral para compor solução
a
próximo à média, maior a confiabilidade da leitura. Leituras no

mL em 4 mL de água destilada [F (4+1)/1 5]. = =
extremo superior (8-10 ppm) possuem baixa confiabilidade. Leituras

- Absorbância da solução de leitura: 0,1391
no extremo inferior (0-2 ppm), além da baixa confiabilidade, podero
sofrer interferências significativas do ruído do equipamento. A Padrão (ppm) Absorbância
[Crlst. pode analista variando-se alíquota de 0,0000

ser ajustada pelo a
solução mineral usada para o preparo da solução de leitura 0,0367
4 0,0758
Extrapolaçöes (ie., [Crlst.> 10 ppm) não são toleradas.
6 0,1200
8 0,1644
41
Este fator de diluição é aplicado quando, anteriormente à leitura, há
10 0,1967
necessidade de nova diluição das soluções minerais produzidas por
intermédio dos métodos M-005/2 e M-006/1.
281
280
2XA_(Ox0,0000)+..+(10x0,1967)
=0,0199
E,P (0)2++(10)2 Absorbância da solução de leitura: 0.1644
AA 0,1644
[Cr)s
AA 0,1391
0,01996,9887 ppm [Crsu 0,0199 =8,2598 ppm
VBSM
VBSM 50 Cróxido|CTJsuxr Alíquota
[CrlasA=[CrlsLXFx- ASA =6,9887xS* 0,1391 = 12560,5 ppm 200
Crloxido8,2598x35x
1055
=548043,4 ppm
CrlasA 100 90,15
Cr]Ms %ASE
12560,5- x100=13932,9 ppm1,39%
[Crlóxide=548043,4 ppm >54,80%
OBS: Logo, caso a dose diária de óxido crômico seja de 10 g. então

alguns equipamentos utilizam uma função quadrática (i.e.,
a dose real de cromo seria de 5,48 ge não de 6.84 g (considerando-se
segundo grau) passando pela origem para ajustar a curva padrão (ao
a concentração teórica de 68,4%o de cromo no óxido crômico).
contrário da reta passando pela origem aqui apresentada). Assim, os
resultados de concentração nas soluções podem apresentar valores Referências Bibliográficas
ligeiramente divergentes do método aqui apresentado. DETMANN, E; VALADARES FLHO. S.C.: PAULINO, M.F.
ZERVOUDAKIS, J.T.: CABRAL, LS. Avaliação da técnica dos
indicadores na estimação do consumo por ruminantes em pastejo.
Exemplo de cálculo em uma amostra de óxido crômico
DETMANN, E.; SOUZA, A.L.: GARCIA, R.: VALADARES FILHO, S.C.
-
Alíquota de óxido crômico usada no preparo da solução mineral CABRAL, L.S.; ZERVOUDAKIS, J.T. Avaliação do vício de "tempo
com ruminantes.
(amostra seca ao ar): 0,1055 g. longo" de indicadores internos em ensaio de digestão
Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.59, p.182-
Arquivo
Balão volumétrico usado no preparo da solução mineral: 200 mL 188, 2007
the determination
Diluição da solução mineral para compor a solução de leitura: FENTON, T.W.; FENTON, M. An improved procedure for
feces.Canadian Journal of Animal
of chromic oxide in feed and
0,2 mL. em 6,8 mL de água destilada [F =
(6,8+0,2)/0,2 =35]. Science, v.59, p.631-634, 1979.
283
282
INCT Cncia Animal Mtndos para Análive de Aiimentse 2 Fdict
oxide in
V.L. Improved determination of chromic
KIMURA. F.T.: MILLER. Chemistry. v.5. Capítulo 15
feed and feces. Journal of
Agricultural and Food
cow
p.216-216. 1957.
for appraising
Extermal and intermal markers
OWENS. FN.: HANSON. C.F.
of Science, v.75,
Dairy Nitrogênio amoniacal em fluidos biológicos
site and extent of digestion in ruminants.Journal
p.2605-2617. 1992
FLHO,
DETMANN, E.: VALADARES Definições hásicas
ROCHA. G.C.: PALMA. M.N.N.: chromium
to estimate
S.C. Evaluation of acid digestion techniques
Agropecuária Brasileira, v.50, p.92-
contents in cattle feces Pesquisa amoniacal (N-NH:) tem sido
A concentração de nitrogênio
95. 2015.
D.S.: VALADARES FILHO, S.C.; usada como uma referência qualitativa para entender a adequação do
SOUZA. N.K.P.: DETMANN. E.: PINA.
C.M. Evaluation of
SAMPAI0. C.B.: QUEIROZ, A.C.: VELOSO, atividade microbiana sobre os carboidratos
ambiente ruminal quanto a
different acid digestion and
chromium concentration in cattle feces using
associado
Arquivo Brasileiro de
com
fibrosos (Detmann et al.. 2009). Isto está possivelmente
spectrophotometric quantification techniques.
2013.
Medicina Veterinária e Zootecnia, v.65, p.1472-1482, N-NH: fonte de nitrogenio preferida para o
o fato de o ser a
determination of chromic
WILLIAMS. C.H.: DAVID. D.J.; IISMAA, O. The Por
microrganismos fibrolíticos (Russell, 2002).
outro
crescimento de
oxide in faeces samples by atomic absorption spectrophotometry.
1962. tambén
lado, avaliações qualitativas da produçäo de silagem
se
Journal of Agricultural Science, v.59, p.381-385,
"suco" uma das
baseiam na concentração de N-NH: no como
características para monitoramento de adequado processo
fermentativo (Santos et al.. 2010).
relevâneia do N-NH: na nutrição de

Assim, considerando a
ruminantes e forragicultura, os métodos utilizados para avaliar a sua
concentração em fluidos devem fornecer estimativas exatas.
Marbach (1962), adaptando os procedimentos de

Chaney &
Boletter et al. (1961). propuseram método para a avaliação de N-NH
é baseado reação colorimétrica da

em tluidos biológicos, o qual em
amônia com fenol, formando indofenol. Essa reação é catalisada por
285
284
Mélodos para Análise de Alimentos -
2" Edição
nitroprussiato de sódio, sendo este método amplamente utilizado em
avaliações microbiológicas (e.g.. Thomas & Russell, 2004) e produz Método da reação colorimétrica de indofenol catalisada
estimativas exatas e precisas da
concentração de amônia em fluídos (Método N-006/1)
biológicos (Souza et al., 2013).
Aparatos
Alternativamente. Fenner (1965) estabeleceu as bases teóricas
para avaliação de N-NH3 no líquido ruminal por destilação a vapor, na
-
Tubos de ensaio
- Tubos eppendorf
presença de uma solução de hidróxido de potássio. Esta base foi
Balöes volumétricos de 100 mLe 1000 mL
adaptada para a utilização da destilação de Kjeldahl. O método
-
Potes de polietileno
resultante foi amplamente utilizado em ensaios de
nutrição de
ruminantes (e.g., Detmann et al., 2009). Contudo, sua exatidão Pipetas
pode - Agitador (vortex)
ser
comprometida por problemas associados à liberação de amônia a
Banho-maria
partir de proteína verdadeira e à recuperação incompleta do N
- Espectrofotômetro UV/visível
amoniacal presente na amostra (Souza et al, 2013). - Centrífuga
De forma geral, recomenda-se como método padrão a reação Frascos âmbar para armazenamento de soluções
colorimétrica de indofenol catalisada em função da exatidão das -
Capela com exaustão

estimativas. A destilação de Kjeldahl somente deve ser usada como
alternativa caso o método anterior não possa ser realizado. Contudo os
Reagentes
valores devem ser corrigidos (veja na
descrição método) para que
do
- Fenol cristalizado (ácido fênico, CsH,OH) P.A.
se tornem similares
àqueles produzidos pela reação colorimétrica de - Nitroprussiato de sódio didratado (Na:[Fe(CN)SNO],2H:0) P.A.
indofenol catalisada (Souza et al., 2013).
- Hidróxido de sódio (NaOH) P.A.
Solução de hipoclorito de sódio (NaCIO) 2,5% P.A.

- Cloreto de amônia (NH.CI) P.A.
Ácido tricloroacético (CCl,coOH) P.A.
286 287
Soluções Acido trictoroacético ( 100 g/L)

50
Em balão volumétrico de 100 mL contendo, aproximadamente
Solução A4
cristalizado P.A. e 0,25 g de mL de água destilada, adicione 10 g de ácido tricloroacético P.A.
Em capela. acondicione 50 g de fenol
o volume água destilada.
balão de 1000 mL. Complete Agite até a solubilização e complete o com
nitropussiato de sódio P.A.

em
um frasco Transfira para um recipiente adequado e mantenha sob refrigeração.

volume com água destilada. Transfira a solução para
a
mantenha sob refrigeração. Nessas condições,
âmbar e
Procedimentos
durabilidade da solução é de 60 dias.
Aliquotas para ajuste da curva padrão
Solução B 20 25 L da solução padrão para tubos de
1. Pipetar 0, 5, 10, 15, e
aproximadamente, 500
-
Em balão voumétrico de 1000 mL contendo, ensaio ou tubos eppendorf.

hidróxido de sódio P.A.
mL de água destilada, acondicione 25 g de
2. Adicionar 1,5 mL da solução Ae 1,5 mL da solução B e agite em
e 16,8 mL de solução de hipoclorito

de sódio. Agite até a dissolução.
Transfira
Aguarde resfriar e complete o
volume com água destilada. vortex.
mantenha sob refrigeração. Nessas

a solução para um frasco âmbar e Preparaç ão das amostras
condições, a durabilidade da solução é de 60 dias. de

1. Adicione em tubos de centrífuga 10 mL de amostra de líquido
l mL da solução de ácido tricloroacético (100 g/L).
Solução padrão (estoque) rúmen e
aproximadamente 50
Agite em vórtex e deixe em repouso por 30 minutos em temperatura
-
Em balão volumétrico de 100 mL contendo,

adicione 63 mg de NHCI. Agite até a ambiente.
mL de água destilada,
volume água destilada. Transfira
solubilização complete o com
para um recipiente adequado e mantenha sob refrigeração.
refere líquido ruminal, mas entende-se que os

13O texto aqui se a
outras matrizes, como,
procedimentos descritos são totalmente aplicáveis a
por exemplo, "suco" de silagem.

289
288
- 2" Ediçao
3. Centrifugue a 1000 xg por 10 minutos. Separe o sobrenadante em
potes de polietileno e mantenha sob refrigeraço até o momento da Cálculo da concentração de N amoniacal
análise.
A solução padrão utilizada para fazer padrão de NH.CI
a curva
4. Pipete de 5 a 25 uL de amostra (i.e., sobrenadante) para tubos de (63 mg/100 mL) possui concentração de NH, de, aproximadamente
uma
20 mg/dL. Assim, com a

ensaio ou tubos eppendorf. Se necessário, a amostra pode ser utilização de alíquotas menores. produzem-se
os diferentes
diluída para que o valor obtido na absorbância fique entre as leituras padrões para composição da curva.
da curva padrão. Assim, para o ajuste da curva padrão, utilize a equação abaixo:
5. Adicione 1,5 mL da solução Ae agite em vortex. B-2PxA

6. Adicione 1,5 mL da solução Be agite em vortex. EP
7. Mantenha as alíquotas referentes à curva padrão e às amostras em em que: B fator de conversão de absorbância em concentração por
=
banho-maria a 39°C por 15 minutos. intermédio da Lei de Lambert-Beer /(mg/dL)]}: P;

concentração de
=
NH3 no padrão i (ppm); Aj absorbância no padrão i.

=
8. Ajuste o espectrofotômetro para leitura em comprimento de onda de
630 nm. E desejável que as leituras (i.e., absorbância) das

alíquotas
referentes as amostras encontrem-se entre aqueles verificadas
9. Proceda à calibraço do equipamento inserindo o "branco (padro para os padrões de 4 e 16 mg/dL (veja tabela no exemplo de
0) e ajustando a absorbância para zero. Proceda à leitura das demais cálculo). Quanto mais próximo à média, maior a confiabilidade da
soluções padrão. leitura. Leituras no extremo superior (i.e., acima daquelas
observadas para o padrão 16 mg/dL) possuem baixa
10. Insira as soluções oriundas das amostras e obtenha as respectivas confiabilidade. Leituras no extremo inferior (i.e., inferiores
absorbâncias
àquelas observadas para o padrão 4 mg/dL), além da baixa
confiabilidade, poder+o sofrer interferências significativas do
290 291
INCT Cncia Animal Métodos para Análive de Aiimenters Ediçie
de líquido ruminal usada

ruído do cquipamento. A alíquota volume de líquido de rimen Ino caso deste procedimento a raz o seria
de
efetivamente na análise pode ser ajustada para obtenção de (10+1/10 =
I.1: e FCO = fator para conversão qufmica da NH:
Extrapolações (i.e., leituras acima do em N-NH1. o que é de. aproximadarnente. 0.824

leituras mais confiáveis.
limite superior da curva padrão) não sâo toleradas.

Exemplo de cálculo
A partir da equaçâão anterior, a concentração de nitrogênio

- Aliqnota de líquido de rúmen: 10 uL
amoniacal (N-NHa) nas amostras é dada por:
-Diluiçãocom ácido na coleta: não houve (i.e.. FD =)
AA - Absorbância: 0.372
N-NH3= xFD x FA x FTCA x FCQ
Volume NH.CI (uL) Equivalente NH: (mg/dL) Absorbancia
Concentração de nitrogênio amoniacal (mg/dL); AA 0 0,000

em que: N-NH3 =
absorbância da soluç o relativa à amostra; FD = fator de diluição, 0.267
considerado somente para os casos de haver diluição prévia da amostra 10 0.577

antes de sua análise., FA = fator alíquota, o qual é dado pela razão 12 0,864
entre o maior volume de solução de cloreto de amônia utilizado para 20 6 1.033
produção de padröes (neste caso, segundo os procedimentos aqui 20 396
adotados, esse valor seria de 25 uL) e o volume da alíquota da amostra

usado na análise; FTCA = fator de correção devido ao uso de ácido A) (0 x 0,000) + (20 x 1,396)
a2(P X
tricloroacético, o qual é dado pela razão entre o volume de líquido de Pi 0 + + 202

= 0, 0688
rúmen somado ao volume de solução de ácido tricoloroacético e o
13.2
Essa AA
diluição específica se resere ao uso connum de ácidos puru lixução N-NH= FD x FA x FTC.A x FCQ
do Namoniacal logo após sua coletü. Por exemplo, caso a alíquota de líquido
de rúmenseja de 50 ml., à qual é adicionado mi. de ácido, o FD seria de
(50+1 )/50 = 1,02.
I
292
INCT Cência Animal
Mélodos para Análise

0,372 de
N-NH3 0,0688
25.(10+)
x1 x0X 10
824 =
12,25 mg/d
Alimentos 2" Fdição
Agite até a
complcta solubilização. Aguarde resfriamento
até a
temperatura ambiente e
complete volume com água destilada.
o
Método da destilação em vapor
(Método N-007/2) Solução de ácido tricloroacético (100 g/L)
Em balão volumétrico de i100 mL contendo,
Algumas modificações foram introduzidas nesse método enm mL de
aproximadamente 50
água destilada, adicione 10 g de ácido
tricloroacético P.A.
função das modificações adotadas no método N-O01/2. Agite até a
solubilização e complete o volume com água destilada.
Transfira para um
recipiente adequado e mantenha sob refrigeração.
Aparatos
Solução alcoólica de vermelho de metila (I z/L)
-
Tubos de digestão em borossilicato com orla -
Em um balão de 100 mL com cerca de 60 mL de álcool etílico anidro

Tubos de ensaio para
centrifugação (20 ou 30 mL)
-
(absoluto) dissolva 0.1 g de vermelho de metila. Complete o volume

- Centrifuga
com etanol e
homogenize solução.
a
- Pipetas
Potes de
polietileno Solução alcoólica de verde de bromocresol (1 g/L)
-
Em um balão de 100 mL com cerca de 60 mL de álcool etílico anidro

-
Erlenmeyers de 250 mL e 1000 mL

(absoluto) dissolva 0,1 g de verde de bromocresol. Complete o
-
Destilador por arraste de vapor (destilador de Kjeldahl)

volume com álcool etílico e homogenize a solução.
-
Bureta de 50 mL com graduação de 0,1 mL

Solução de ácido bórico (20 g/L)
Soluções -
Dissolva em um balão de 1 L (10 L). (5 L) de

com cerca de 500 mL
Solução de hidróxido de potássio (2 M) água destilada, 20 g (200 g) de ácido bórico P.A. Adicione 12.5 ml
Em (125 mL) de solução alcoólica de vermelho de metila e 6 mL (60
-
erlenmeyer de 1000 mL contendo, aproximadamente, 500 mL

de água destilada, adicione 132,02 g de hidróxido de potássio P.A. mL) de solução alcoólica de verde de bromocresol. Agite até a
completa solubilização e complete o volume com água destilada.

295
294
Solução-padrão de ácido clorídrico a 0,005 N (0,49 g/L) Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição
Dilua 0,414 mL (4.14
mL) de HCI P.A. em balão volumétrico de
5. Em
1000 mL (10 L). contendo em média
500 mL (5 L) de água destilada.
erlenmeyer de 250 mlL. adicione 10
mL de solução de ácido
Deixe esfriar, bórico (20 g/AL). Adapte
complete
o volume com água destilada e homogeneíze
o
erlenmeyer ao
conjunto de destilação
para receber a amónia destilada.
a
solução. Proceda à padronização da solução conforme descrito no
método N-001/2. 6. Por intermédio do dosador do
destilador de Kjeldahl adicione 10
ml de solução de hidróxido de
potássio (2 M). A razão entre a
Procedimentos
solução de KOH e a amostra deve ser
mantida em 5:1.
1. Lave os tubos de digestãoe os tubos de centrífuga e deixe secar enm 7. Destile por arraste, mantendo o terminal do condensador
estufa nãão ventilada. mergulhado
na
solução receptora de ácido bórico até que toda a amõnia seja
liberada. O volume final do destilado deve ser de 100 mL.
2. Adicione em tubos de centrífuga 10 mL de amostra de líquido de
rúmen e l mL da solução de ácido tricloroacético (100 g/L) 8. Retire o erlenmeyer, e titule com soluço de ácido clorídrico (0.005
Agite em vórtex e deixe em repouso por 30 minutos em

temperatura
N) até a viragem do indicador (verde para rosa claro). A cada
ambiente. bateria de destilação destile ao menos dois tubos em "branco"

contendo 2 mL de água destilada.
3. Centrifugue a 1000 x g por 10 minutos. Separe o sobrenadante em
potes de polietileno e mantenha sob refrigeração até o momento da Cálculo da concentração de N-NH3
análise.
N - N H ( k ) = 5 x 0 , 0 0 5 x f x 1 4 x 1 0 0
xFTCAXFDD
4. Pipete 2 mL de amostra (i.e., sobrenadante) para tubos de digestão
e acople no destilador de
Kjeldahl. em que: N-NH:(K) = concentração de nitrogênio amoniacal obtida pela
destilação de Kjeldahl (mg/dL); V = volume de ácido clorídrico

13O texto refere a líquido ruminal, mas entende-se que os
aqui se
procedimentos descritos são totalmente aplicáveis a outras matrizes, como, utilizado na destilação (mL): B = volume de ácido clorídrico utilizado
por exemplo, "suco" de silagem.
296 291

na
destilação do "braneo*": f = fator de começão da concentração de Alimentos-2 Fdicin
ácido cloridrico obtida com uma solução de Na,CO: (0.005 N;
N-NH,(C)= N-NH,(k)|-[N-NH,(d) N-NH,(k)|-2,11
ver
detalhes no
Capítulo 4): 14 =
peso atômieo do nitrogênio; A = volume R
0,83
da alíquota (mL): FTCA fator de
=
correção devido ao uso de ácido
em
que: N-NH(C) concentração de nitrogênio amoniacal corrigida
=
tricloroacético. o qual é dado pela razão volume de
entre o líquido de (mg/dL): N-NH:(k) =concentração de nitrogènio amoniacal obtida
rúmen somado ao volume de solução de ácido tricloroacético e o
volume de
com a
destilação de Kjeldahl (mg/dL): N-NH(d) nitrogènio
=
líquido de rúmen [no caso deste procedimento a razão seria

amoniacal produzido a partir da deaminação de
de (10+1)/10 =1,1]; e FD fator de
proteina verdadeira
=
diluição, considerado somente (mg/dL): e R recuperação de nitrogènio amoniacal elo método da
=
para os casos de haver diluição prévia da amostra antes de sua destilação de Kjeldahl.
análise154
Literatura Citada
Ajuste da concentração de N-NH3
BOLLETER, W.T.: BUSHMAN,C.J.. TIDWELL. P.W.
determination of ammonia
Spectrophotometrie
as
indophenol. Analitycal Chemistry, v.33,
A concentração de p.592-594, 1961.
nitrogênio amoniacal estimada por
intermédio do método da destilação de CHANEY, A.L.; MARBACH. E.P. Moditied reagents tor determination of
Kjeldahl apresenta viés urea and ammonia.Clinical Chemistry. v.3. p. 130-132, 1962.
causado pela deaminação de
proteína verdadeira e por propiciar DETMANN, E.: PAULINO, M.E.: MANTOVANI. H.C.: VALADARES
recuperação incompleta da amônia presente n0 meio. Assim, os FILHO, S.C.: SAMPAIO, C.B. SOUZA, M.A.: LAZZARINl, I.;
DETMANN, K.S.C. Parameterization of ruminal tibre degradation in
valores obtidos por este método devem low-quality tropical torage using Michaelis-Menten kineties. Livestock
corrigidos para que se ser
Science, v.126. p. l36-146, 2009.
amplie sua exatidão. Essa correção é dada pela equação (Souza et al.,
FENNER, H. Method for determining total volatile bases in rumen fluid by
2013): steam distillation. Journal of Dairy Science, v.48. p.249-251, 1965.
SANTOS, R.D.; PEREIRA, L.G.T.: NEVES, A.L.A.; ARAUJO, G.G.L.:

VOLTOLINI, T.V.; BRANDÃO, L.G.N.; ARAGÃ0, A.S.L.; DÓREA.
J.R.R. Caracteristicas de termentação da silagem de seis variedades de
19 Essa diluição específica se refere ao uso
comum de ácidos
do N amoniacal logo para fixação milho indicadas pra a região semiárida brasileira Arquivo Brasileiro de
após sua coleta. Por exemplo, caso a alíquota de líquido Medicina Veterinária e Zooteenia, v.62, p.1423-1429, 2010.
de rúmen seja de 50 mL, à
qual é adicionado I mL de ácido, o FD seria de
(50+1)/50 = 1,02.
298 299

RUSSELL, J.B. Rumen microbiology and its role in ruminant nutrition.
Ithaca: James B. Russell, 2002. 119p.
sOUZA.N.K.P.; DETMANN. E.: VALADARES FILHO, S.C.: COSTA, Capítulo 16

V.A.C.: PINA, D.S.: GOMES, D.I.: QUEIROZ, A.C.: MANToVANI.
HC. Accuracy of the estimates of ammonia concentration in umen fluid Titânio
using different analytical methods. Arquivo Brasileiro de Medicina
Veterinária e Zootecnia. v.65, p. 1752-1758, 2013.
Definiçoes básicas
THOMAS. S; RUSSELL. J.B. The effect of cellobiose. glucose, and cellulose
on the survival of Fibrobacter succinogenes A3C cultures grown under
Como ressaltado no Capítulo 14, vários elementos
ammonia linmitation. Current Microbiology, v.48, p.219-223, 2004. químicos,
seja na forma de óxido ou de sal, podem ser usados como indicadores
externos em ensaios de digestão com ruminantes. Entre estes,
destacam-se: itérbio, érbio, európio, cádmio, cobalto. lantânio. ouro.
cério, titânio e cromo. Este último elemento, notadamente sob a forma
de sesquióxido de cromo ou óxido crômico (Cr:03). é o indicador
externo mais utilizado para a quantificaço da excreção fecal de

bovinos em confinamento ou a pasto. Tal peculiaridade se deve ao fato
do óxido crômico ser facilmente adicionado à dieta, ser facilmente
analisado e apresentar baixo custo (Detmann et al. 2004).
Contudo, cíticas têm sido dirigidas ao uso do óxido crômico
como indicador devido aos seus potenciais efeitos carcinogênicos
(Mayers et al., 2004), o que, associado ao fato da demanda por técnicas

onerosas de quantificação (i.e., espectrofotometria de absorção
atômica), pode demandar sua substituição como indicador externo em

ensaios de digestão com animais.
O dióxido de titânio (TiO%) constitui alternativa direta ao uso
do óxido crômico, uma vez que permite contornar as restrições acima

301
300
Esse composto tem sido legalmente

adicionado en
descritas. Balöes volumétricos de 50, 100 e 1000 mL
(Titgemeyer et al., 2001), c
alimentos. muitas vezes como corante
Funis raiados
espectrofotometria
possui processo de quantiticação calcado em
Potes de polietileno
acessibilidade.
convencional. de menor custo e maior
Espectofotômetro UV/visível
têm demonstrado a efetividade do dióxido de
Varios autores
Frasco Erlenmeyer de 2000 mL
titânio indicador externo em ensaios de consumo e digestão com
como
Pipetas
bovinos (Titgemeyer et al., 2001: Ferreira et al., 2009), ovinos (Myers Bicos de
-
papagaio (20 mL) com reservatório

et al.. 2006). suínos (Jagger et al., 1992) e aves (Short et al., 1996).
Estudos conduzidos no Brasil demonstram que dióxido de titânio e Reagentes

óxido crômico possuem recuperação e padrão de excreção similares -
Ácido sulfúrico (H:SO.) concentrado P.A.

em ensaios com ruminantes (Sampaio et al., 2011a; 2011b). Acido cloridrico (HC) 37% P.A.
descrito baseia-se na digestão sulfúrica da
O método aqui Sulfato de sódio (Na»SO,) P.A.
inicialmente descritos por
amostra. sendo adaptado dos procedimentos Sulfato de cobre pentahidratado (CusO. 5H:0) P.A.
Short et al. (1996), Myers et al. (2004) Titgemeyer
e et al. (2001). Peróxido de hidrogênio (H:0) 30% v/w P.A.
Digestão sulfúrica Soluçoes

(Método M-007/2) Solução de ácido cloridrico (200 mL/L)
Aparatos
-
Em um balão de 1000 mL com cerca de 200 mL de água destilada.

dissolva 200 ml de ácido clorídrico P.A.. Complete o volume com
-
Balança analítica com preciso de 0,0001l g

água destilada e homogeneize a solução.
- Tubos de digestão macro em borossilicato com orla
- Bloco digestor para tubos macro

302 303
Solução de ácido nítrico (100 mLA) Esses tubos passarão por toda as etapas analíticas descritas abaixo.
de 200 mL de água destilada,

Em balão de 1000 mL com cerca
preparação dos
um
Importante: o dióxido de titânio usado para a
dissolva 100 mL de ácido nítrico P.A. Complete o volume com água indicador usado
padroes deve ser oriundo de alíquotas do
destilada e homogeneíze a solução. durante o ensaio de consumo/digestão.
Mistura digestora (catalítica)

Procedimentos:
porosidade de I mm) o sulfato
-
Em separado, peneire (peneira com

de 0.0001
de sódio P.A. e o sulfato de cobre pentahidratado P.A. Em um pote 1. Use balança analítica aferida pelo INMETRO, com preciso
de laboratório e em ambiente climatizado
catalizador g, sobre bancada especial
de polietileno adicione o sal (sulfato de sódio) e o
de 20 1, (20-25°C ou de acordo com as especificações do fabricante). Ligue a
metálico (sulfato de cobre) na proporção para

respectivamente (i.e., para cada 1000 g de sulfato de sódio use 50 g
completa homogeneização. O de
de sulfato de cobre). Misture até a
2. Lave toda a vidraria exclusiva para minerais, usando solução
material deve ser armazenado em pote com tampa. ácido clorídrico ou solução de ácido nítric0, em seguida, enxágue
destilada. Ver detalhes no Capítulo 12.
bem com água
Padröes
Em tubos de digestão pese 0, 2, 4,6, 8 e 10 mg de dióxido de titânio. aproximadamente, 500 mg de amostra seca ao ar e coloque
no
3. Pese,
Como as quantidades a serem pesadas são muito pequenas, tubo de digestão macro devidamente identificado.
recomenda-se a utilização de pequenos pedaços de papel de filtro
4. Adicione, aproximadamente, 5 g de mistura digestora e 20 mL de
ashless para a pesagemeque o conjunto (papel mais amostra) seja
ácido sulfúrico concentrado.
transferido para os tubos de digestão. Este procedimento visa evitar
perdas de amostra durante a transferência que ocorreriam se a 5. Em capela, acondicione os tubos em bloco digestor e aqueça
amostra fosse pesada em um recipiente e transferida parao tubo de lentamente à temperatura de 400°C. Mantenha aquecido até atingir
ensaio. A tolerância na pesagem deve ser de +0,2 mg. Contudo, no coloração esverdeadae translúcida.
cálculo das concentrações, o valor real pesado deve ser utilizado.
304 305
INCT Ciencia Animal
deixe esfriar na capela. 13. Proceda à leitura em espectrofotômetro ajustado para o

6. Retire os tubos e os
onda de 410 Imediatamente antes da leitura,

30% P.A. e comprimento de nm.
7. Adicione lentamente 10 mL de peróxido de hidrogênio de

com o auxílio de pipeta Pasteur, adicione 3 gotas de peróxido
aguarde resfriar. frasco agite.
hidrogênio 30% P.A. à solução contida no e
balão
8. Proceda à transferência quantitativa do material para
de filtro 14. Proceda à calibração do equipamento inserindo
o padrão 0 mg e
volumétrico de 50 ou 100 mL. Utilize funis e papel

absorbâância para zero. Proceda à leitura das demais
de filtração rápida. O volume do balão ajustando a
quantitativo, livre de cinzas e
da concentração de dióxido de titânio
soluções padrão.
a ser utilizado irá depender
alíquotas em uma mesma
na amostra. Contudo, todos os padrões e
amostras.
15. Proceda à leitura das soluções produzidas com as
transferidos para balões de mesmo volume.
bateria devem ser
Ao contrário do cromo, não há necessidade de ajuste para

9. Complete o volume do balo com água destilada ou
a concentração de titânio no dióxido por duas razões. Primeiro,
desmineralizada.
concentração do composto (dióxido) e não do
porque estima-se a
10. Cubra o balão com tampa ou para-filme e homogeneíze a solução. elemento (titânio). Segundo, porque o próprio composto usado no
ensaio de digestão é usado como padrão.

11. Transfira uma alíquota para potes de polietileno devidamente
limpos. Realize a lavagem do frasco no momento da transferência Cálculo da concentração de titânio

com um pouco da solução mineral de cromo. Adicione cerca de 5
a 10 mL da solução no frasco, tampe e agite. Descarte este material Utilize sequencialmente as equações abaixo
e então acondicione a solução a ser armazenada.
B 2Px A)
12. Armazene a solução em geladeira (4°C) até o momento da leitura. EP
306 307
-2" Ediço
AA Proceda à correção da concentração para a umidade residual:

(TiO2)A
[TiO2lMs
Ti02 ASA 100
%ASE *0
[Ti02lasA (Ti02Ax
ASA
100
concentração de TiO; com base na matéria seca
que: [TIO:]Ms
=
em
em massa de Ti02 (%); %ASE =

em que: B = fator de conversão de absorbância
oriunda da amostra por intermédio da Lei

de Lambert-Beer (/mg); Pi
Exemplo de cálculo em uma amostrafecal1
= valor de TiO^ no padrão i (mg); Aj = absorbância no padrão i;
absorbância
(TiO2)A = massa de Ti0; oriunda da amostra (mg); AA =
- Alíquota fecal (amostra seca ao ar): 500,2 mg.

base na
para a amostra; [Ti02Jasa =
concentração de TiO2 com
- %ASE: 91,80%.
amostra seca ao ar (o); e ASA = massa de amostra seca ao ar (mg).
- Absorbância da solução de leitura: 0,413
mais
E desejável que (TiO2)A esteja entre 2 e8 mg. Quanto Absorbancia
Padrão (mg) Quantidade real (mg)
confiabilidade da leitura. Leituras no
próximo à média, maior a
0 0,000
baixa confiabilidade.
extremo superior (8-10 mg) possuem
0,167
2.2
Leituras no extremo inferior (0-2 mg), além da baixa
4,1 0,330
confiabilidade, poderäo sofrer interferências significativas do
6 5,9 0,499
ruído do equipamento. A (TiOz)A pode ser ajustada pelo analista 8,1 0.678
8
variando-se a alíquota de amostraeo volume do balão utilizados.
10 10,2 0,836
Extrapolações (Ge, (TiO)A > 10 mg) não são toleradas.
PKxA0x 0,000)+... +(10,2 x 0,836)

=0,0826
2P (0)+.+(10,2)2
309
308
Métodos para Análise de Alimentos 2" Edição
SAMPAIO, C.B.; DETMANN, E.: VALENTE. T.N. P.: SOUZA, M.A.:

Evaluation of fecal
VALADARES FILHO, S.C.; PAULINO, M.F.
(TiO),=AA 0,413 =5,00 mg bias of internal and external markers in a
recovering and long term
(TiO2)A 0,0826 digestion assay with cattle. Revista

Brasileira de Zootecnia, v.40, p. 174-
182, 2011a.
T.N.P.; COSTA, V.A.C.
SAMPAIO, C.B.; DETMANN, E.; VALENTE,
5,00 VALADARES FILHO, S.C.; QUEIROZ, A.C.
Fecal excretion patterns
ITiO2lASA (Ti02)A x
ASA x 100 500,2
100= 1,00%
and short term bias of internal and external
markers in a digestion assay
201lb.
with cattle.Revista Brasileira de Zootecnia, v.40, p.657-665,
J.; BOORMAN, K.N.
, 00 SHORT, F.J.; GORTON, P. WISEMAN,
(TiO2]Ms TiOzlAsAx 10091,80

%ASE
X 100 = 1,09% Determination of titanium dioxide added
digestibility studies.
as na
Animal Feed Science and

inert marker in Chicken
Technology, v.59, p.215-
221, 1996.
E.C.; ARMENDARIZ, C . BINDEL. D.J.:
Literatura Citada TITGEMEYER,
titanium dioxide as a
GREENWOOD, R.H.; LOEST, C.A. Evaluation of
v.79. p. 1059-
M.F; digestibility marker for cattle. Journal of Animal Science,
DETMANN, E; VALADARES FILHO, S.C.; PAULINO, 1063, 2001.
técnica dos
ZERVOUDAKIS, J.T.; CABRAL, L.S. Avaliação da
indicadores na estimação do consumo por ruminantes em pastejo.
FERREIRA, M.A.; VALADARES FILHO, S.C.; COSTA e SILVA, L.F.;

NASCIMENTO, F.B.; DETMANN, E.; VALADARES, R.F.D.
estimativa de
Avaliação de indicadores emn estudos com ruminantes:
consumos de concentrado e de silagem de milho por vacas em lactação.
Revista Brasileira de Zootecnia, v.38, p.1574-1580, 2009.
JAGGER, S.; WISEMAN, J.; COLE, D.J.A., CRAIGON, J. Evaluation of

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MYERS, W.D.; LUDDEN, P.A.; NAYIGIHUGU, V.; HESS, B.W. A

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MYERS, W.D.; LUDDEN, P.A.; NAYIGIHUGU, V.; HESS, B.w.

Excretion of titanium
feces of Small
dioxide and chromic oxide in duodenal digesta and
ewes. Ruminantion Research, v.63, p.135-214, 2006.
311
310
INCT Ciencia Animal Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição
Capítulo 17
matéria para
Digestibilidade in vitro da
seca
ruminantes
in vitro foram propostos

Inicialmente, ensaios de digestão
se estimar a in vivo de forragens (Tilley & Terry

digestibilidade
para
de aplicação desse tipo de
1963). Contudo, atualmente, a amplitude
método mostra-se mais ampla, incluindo, principalmente, triagem,
direta de alimentos ou dietas para
discriminação ou comparação
animais ruminantes (Silva et al., 2017).
Os métodos in vitro para avaliação de alimentos/dietas para
ruminantes são categorizados como métodos do tipo I de acordo comn
o Codex Alimentarius. Logo, os métodos permitem acessar um
determinado valor que é definido pelo método em si (Codex
Alimentarius Commission, 2018). Uma vez que não existem padrões
Ou referências primárias para este tipo de método, esses não podem ser
de
validados quanto a sua exatidão, ou seja, quanto à sua capacidade
"valor real" para a entidade
produzir resultados convergentes ao
analítica em questão. Assim,, para se minimizar erros sistemáticos
entre laboratórios, os métodos ditos empíricos (i.e., métodos tipo D
312 313
protocolos padrões, foi construído com base

devem ser seguidos exatamente
como descrito nos Dessa forma, o método aqui proposto
acarretar na 2017: Camacho,
mesmo a menor variação nos procedimentos pode em diversos trabalhos (Machado et al., 2016; Silva et al.,
pois,
envolvendo
entidade analítica distinta da
originalmente
2017; Camacho et al., 2019; Camacho, 2021), alguns destes
mensuração de uma
fomentar método padrão entre os

proposta (Mertens, 2003). diversas instituições, de forma a um
afetada por diversas5 instituições brasileiras. Este método foi

A digestibilidade in vitro pode ser diferentes laboratórios de
instrumental, tipos de recipientes e

devidamente validado quando à repetibilidade e reprodutibilidade por
características do método, como
headspace, trabalho do Camacho (2021). O de incubadoras artificiais, com avaliação coletiva

filter bags, soluções tampão, tipo de gás no
uso
ambiente, despeito das críticas quanto às

analista, fontes de inóculo, adaptação dos animais doadores, moagem a
de filter bags no mesmo
devido à facilidade
da amostra, entre outros (Mould et al., 2005; Hall & Mertens, 2008; estimativas obtidas (Camacho, 2017), foi fomentado
Patra & Yu, 2013; Silva et al., 2017; Camacho et al., 2019;
Castro- de uso e aquisição dos equipamentos.
número
Montoya & Dickhoefer, 2019). Assim, qualquer mudança no
Digestibilidade in vitro da matéria seca usando incubadoras

da anáise
de etapas ou em qualquer parâmetro físico-químico
artificiais (modelos Daisy" Ankom, TE-150 Tecnal ou similares)
resultará em métodos diferentes, os quais não podem ser diretamente
(Método G-008/1)
comparados.
Considerando esses aspectos, um método nacional que Aparatos
permita comparar a digestibilidade in vitro de alimentos/dietas de
-
Balança analítica com preciso de 0,0001 g

ruminantes e que produza resultados reprodutíveis era ainda
Estufa com circulaço forçada dee ar
inexistente. Esse tipo de proposição permitiria a minimização da
variação entre laboratórios e, em um estádio futuro, permitiria a
- Filter bags de tecido não tecido (100 g/m2; 4 x 4,5 cm) ou F57
combinação de resultados a partir de uma visão mais ampla e robusta
(Ankom®)
entre instituições de forma a construir equações para predizer o - Seladora
comportamento in vivo de forma acuradae

precisa. - Dessecador
- Incubadora artificial
314 315
Cilindro de CO
Soluções
Tecido gaze
Solução tampão
- Erlenmeyers
- Em balão volumétrico de 1L (10 L) contendo 0,1 L (1 L) de água
- Baloes volumétricos
de
destilada, adicione 9,80 g (98 g) de NaHCOs, 3,71 g (37.1 g)
- Liquidificador
de NazHPO; diidratado ou 7,00
Na2HPO4 anidro ou 4,65 g (46.5 g)
- Garrafas térmicas
g (70,0 g) de NazHPOs heptaidratado, 0,57 g (5,7 g) de KCl; 0,47 g
Potenciómetro digital
4,7 g) de NaC1; 0,12 g (1,2 g) de MgSOa heptaidratado e 0,05 g (0,5
- Animal doador de inóculo
g) de CaClh diidratado. Agite para dissolução parcial. Adicione 0,8
Lavadora tipo "tanquinho
L (8 L) de água destilada e agite até a completa solubilização.
- Panela de alumínio
Complete o volume do balão para 1 L (10 L). Este procedimento
- Bandejas de alumínio
deve ser realizado, preferencialmente, 24 horas antes da incubação.
-
Fogão ou fogareiro
Solução de ureia
Reagentes - Adicione 5,5 g de ureia em balão volumétrico de 100 ml.
- Bicarbonato de sódio (NaHCOs) P.A. Acrescente, aproximadamente, 70 mL de água destilada e
- Fosfato de sódio dibásico (NazHPO4) P.A. anidro, diidratado ou da

homogeneíze até completa solubilização. Após a estabilização
heptaidratado temperatura com o ambiente, complete o volume. A solução deve ser
Cloreto de potássio (KCI) P.A. armazenada sob refrigeração até o momento da utilização.
- Cloreto de sódio (NaCI) P.A.
Solução de detergente neutro comercial (20 mL/L)
- Sulfato de magnésio (MgSO.) heptaidratado P.A.
-
Em Erlenmeyer de 4 L, adicione 1 L de água destilada e 80 mL de

-
Cloreto de cálcio (CaClh) diidratado P.A.
detergente neutro comercial. Agite até a completa homogeneizaço
Ureia P.A.
-
Detergente neutro comercial

316 317
Métodos para Análise de Alimentos 2" Ediçio
dessecador (máximo de 20 unidades por

Procedimentos
6. Acondicione osfilter hags em
aferida pelo procedimento) e aguarde o equilibrio com a temperatura ambiente.
procedimentos, use balança analítica
Em todos os
especial de
bancada
0.0001 g, sobre peso. Esse será o peso da tara.
INMETRO, com precisão de 7. Pesc os filter bags e registre o
com as
climatizado (20-25°C ou de acordo
laboratório e em ambiente
minutos 8. Pese aproximadamente 500 mg de amostra seca ao ar processada em
Ligue a balança e aguarde 30

especificações do fabricante). acondicione no interior do filter
porosidade de I mm. registre o peso e
para sua estabilização.

bag
9. Sele os filter bags usando seladora e os reserve para posterior incubação.
Preparação dos filter bags
marcador permanente. 10. Para cada jarro da incubadora faz-se necessário o uso de. ao menos
1. Identifique os filter bags com
selados "branco" (i.e.., sem amostra)
adicione a solução dois filter bags em
filter bags em panela de alumínio

e
2. Acondicione os
volume suficiente para cobrir todo

o
de detergente neutro comercial em
Preparação da solução tampão
material.
trasco Erlenmeyr em volume

fogareiro e aqueça. A solução deve 1. Adicione a solução tampão em
3. Leve o recipiente ao fogão ou
suficiente para a realização dos procedimentos.

2. Adicione a solução de ureia à solução de McDougall na proporção

água corrente até a total retirada do
4. Lave os filter bags com
de 5 mL/300 mL. Esta adição é considerada opcional, uma vez

detergente.
que o uso da ureia pode reduzir o poder de discriminação entre
5. Seque filter bags

os bandejas (camada delgada sem
em amostras (ver detalhes em Camacho et al., 2019). Portanto,a
sobreposição) sequencialmente em estufa com circulação forçada decisão de adicionar ou não ureia à solução tampão é o único
de ar a 55°C por 24 horas e em estufa não ventilada a 105°C por 2 passo neste método que depende da decisão do analista.
horas.
319
318
Métodospara Análise de Alimentos -2" Ediçio
silicone ao cilindro de CO;.

3. Acople uma mangueira de mineral deve ser realizada ad libitum, mantendo-se também água
abundância. A prática de aplicação de jejum ao animal

a extremidade livre da mangueira na solução tampão e
disponível em
4. Introduza
anteriormente à coleta não deve ser realizada.
borbulhamento.
libere o C0: propiciando
pH da solução. O
5. Com o potenciómetro digital, monitore o
1. Acione previamente o aquecimento da incubadora (39°C) contendo
valor
borbulhamento com CO: é encerrado quando pH atingir o
o
os jarros vazios em seu interior.
de 6.8.
2. Abra a cânula ruminal e colete porções das partes sólida e líquida
6. Com de estufa ou sala climatizada, aclimatize a solução diferentes pontos do númen e armazene-as em
o uso da digesta em
tampão para a temperatura de 39°C. garrafas térmicas previamente aquecidas (39°C).
7. Este procedimento deve ser realizado anteriormente à coleta do 3. Conduza o material imediatamente ao laboratóri1o.
inóculo ruminal.
4. Usando liquidificador. homogeneize a digesta por,
aproximadamente, 30 segundos.
Coleta e processamento do inóculo ruminal
5. Em frasco filtre digesta homogeneizada através de

Erlenmeyer, a
O inóculo pode ser coletado de um bovino fistulado, sendo,
quatro camadas de gaze. Descarte o material retido na gaze.
contudo, recomendada a produção de inóculo a partir de pool de
mais animais. Adicionalmente, o(6) 6. Mantenhao filtrado (i.e., inóculo) climatizado (39°C) com o uso de
digesta ruminal obtida de três ou
animalis) doador(es) deve(m) ser adaptados à dieta basal por, no garrafas térmicas, estufa ou sala climatizada
mínimo, 14 dias antes da coleta de inóculo.
7. Este procedimento deve ser realizado imediatamente antes do início
A dieta basal deve ser formada por volumoso e concentrado
da incubação
na proporção de 80:20, com base da matéria seca, e conter 12% de
proteina bruta, também com base na matéria seca. A suplementação
320 321
INCT Ciência Anima Métodos para Análise de Alimentos 2" Edição
Encha-a
Procedimento de incubação . Acondicione os filter bags em lavadora tipo "tanquinho".
"lavagem delicada".
com água limpa e. usando regulagem para
da incubadora e acondicione
1. Retire os jarros previamente aquecidos acione a lavadora por I minuto. Drene a água após a lavagem. Este
com
Recomenda-se que cada jarro opere
em seu interior os filter bags. procedimento deve ser realizado por, no mínimo, trës vezes.
20-25 filter bags contendo amostras e dois filter bags em branco.

filter bags para
Após os ciclos de lavagem. pressione gentilmente
os
9.
2. Adicione cada jarro 400 mL do inóculo e 1600 mL da solução deve estar limpida).
a
retirada do excesso de água (que
tampão com o pH devidamente ajustado. sobreposiçio)

bags em bandejas (camada delgada
sem
10. Seque osfilter
CO% headspace de cada forçada de ar a 55°C por
flushing sequencialmente em estufa com circulação
no
3. De forma rápida, faça um com
substituir o atmosférico por dióxido de carbono. estufa não ventilada a 105°C por 16 horas.
jarro de forma a ar
24 horas e em
Tampe os jarros imediatamente. de 20 unidades

11. Acondicione os filter bags em dessecador (máximo
equilibrio a temperatura
incubadora, inicie o mecanismo de rotação
com
4. Acondicione os jarros na por procedimento)
e aguarde o
e feche a porta. Assegure-se de que o aquecimento esteja ambiente.
devidamente ligado e regulado a 39°C

12. Pese os filter bags e registre o peso.
5. Mantenha os jarrOS sob as condições de temperatura e rotação porr

matéria seca
48 horas. Cheque estas condições regularmente durante todo o
Cálculo da digestibilidade in vitro da
processo de incubação.
Inicialmente, caleule o resíduo obtido com os filter bags em
6. Após 48 horas, abra a incubadora e retire os filter bags. branco:
7. Lave-os superficialmente com água limpa e pressione-os

B FgT
gentilmente para retirada de gases.
323
322
de Alimentos-2" Ediçã
Métodos para Análise
ao ar
na amostra seca
de incubação indigestibilidade com base
decorrente do procedimento CIn quc: Uasa
=
contaminação
que: B indigestibilidade
=
em
(g): Uus
=
branco após incubação seca ao ar
dofilter bag
Fs peso
em
(h): ASA =massa de amostra
de matéria seca): da
=
(g (%):DIVMS = digestibilidade in vitro

pré-incubação (g). matéria seca
basc na
T=tara ou peso do filter bag
com
estufa.
(g): e
deve ser
%ASE percentual de
"amostra seca em
demais cálculos
=
a ser usado nos matéria seca (%); e

O valor do "branco" detinidos.
branco foram previamente
obtida nos filter bags em Os demais termos
obtido pela média da contaminação
a contaminação
avaliados no estudo.
Torna-se importante ressaltar que resultados é obrigatório reportar
as
brancos são Na exposição dos

cada procedimento de incubação. Logo, modelo da incubadora
artificial.
é inerente a 1. marca e
o uso de "médias'" seguintes informações:
não sendo possível não de ureia à solução
requeridos a cada procedimento, 3. adição ou
utilizado, e
2. tipo defilter bag de
estimativas
obtidas em outros procedimentos. três fatores afetarão as
tampão. Esses
Calcule o resíduo aparentemente não digerido (sem correção conhecimento é crucial para interpretação
e
digestibilidade e seu
para o branco): de resultados de diferentes ensaios.

avaliação comparativa
U=FA-T
Exemplo de cálculo
resíduo aparentemente não digerido (g de matéria seca);

que: U
=
em
T
após incubação (g);
=
e
a amostra - Amostra (amostra seca ao ar): 0.5129 g.
FA= peso dofilter bag contendo
tara ou peso do filter bag pré-incubação (g). %ASE: 91,809%.
digestibilidade in vitro da matéria
seca:
Calcule da - Peso dofilter bag (tara): 0,41900g
Peso do filter bag+ resíduo: 0.6242 g8
U-B x100
Média da contaminação (branco): 0,0023
6UASAASAJ**
U=FA-T=0,6242-0,4190=0,2052 g
%U ASAx100
6UMs%ASE
%DIVMS=100-6UMs 325
324
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos 2" Ediçio
U-B x 1 0 0 ( 0 , 2 0 5 2 - 0 , 0 0 2 3]]x100=39,56% MACHADO, M. G.; DETMANN,. E.: MANTOVANI. H. C.: VALADARES

96UASAASA
6UASA= 0,5129 FILHO, S. C.; BENTO, C. B. P.: MARCONDES. M. I. ASSUNÇAO, A.
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%U ASA x100
10091,80
6UMs0%ASE MERTENS, D.R. Challenges in measuring
of Animal Science, v.81. p.3233-3249. 2003.
insoluble dietary fiber. Journal
= 100 43, 09 =
56, 91% MOULD, F.L.; KLIEM, K.E.; MORGAN, R.: MAURICIO, R.M. In vitro
%DIVMS=100-%UMs Animal
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327
326
Métodos para Análise de Alimentos- 2" Edição
Capítulo 18
Protocolos para condução de ensaios de

ruminantes
degradação in situ em
principal característica na
A digestibilidade constitui a
(Huhtanen et al., 2006). Sua

definição do valor nutritivo dos alimentos
in vitro in situ.
por métodos in vivo,
e
quantificação pode ser realizada
Entre estes, o método in vivo é considerado padrão. Contudo. sua
demanda grande número de animais e requer grande

aplicação
alimentos para fornecer aos mesmos (Harmon &
quantidade de
adicionais exigidos no
Richards, 1997). Além disso, procedimentos
método in vivo, como coletas fecais, tornam o método mais oneroso e
utilização de outros
laborioso. Estas características fomentam a
métodos, como os métodos in situ e in vitro.

Os métodos in vitro aplicados a animais ruminantes têm por
microbiológicas do
objetivo simular as condições fisicas, químicas e
digestibilidade in vivo
rúmen, relacionando-se com precisão com a
(Huhtanen et al., 1994). Contudo, a desvantagem primária dos

métodos in vitro é a sua franca diferença em relação ao ambiente in
vivo (Mertens, 2005).

329
328
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos 2" Ldiçi
amplamente utilizados para

Por sua vez. os métodos in situ são Nesse sentido, o objetivo deste Capítulo foi definir orientações
degradação runminal (i.e., avaliação do pertil
a avaliação de características da cinética de básicas para protocolos de incuhações in site visando à
2005). Estes vêm sendo adoção desses protocolos

extensão e taxa de degradação: Mertens. de degradação de alimentos em ruminantes. A
da degradação de dificuldades
considerados como referência para a avaliação podc constituir ferramenta útil para se contornar as
diferentes sistemas recomendações aqui estabelecidas

componentes dos alimentos anterior. As
em
alimentos ou destacadas no parágrafo
nutricionais (AFRC. 1993: NRC, 2001; Valadares Filho
et al., 2016). foram construídas a partir de informações apresentadas por
Nocek (1988).
características da cinética de degradação ruminal

Michalet-Doreau & Ould-Bah (1992). Madsen
& Hvelplund (1994).
Contudo, as
influências Weisbjerg (2000). NRC (2001).

obtidas por métodos in situ também sofrem diversas Vanzant et al. (1998). Hvelplund &
advindas de modificações nas diferenças etapas e características que Mertens (2005), Ákerlind et al. (2011). Valente et al.
(201). Machado et
destacand0- Valente te al. (2015). Machado et al. (2016), Assunção (2017)
compõemo protocolo aplicado em determinada condição, al., (2013),
se: granulometria da amostra, porosidade e material dos sacos, relação e Menezes et al. (2017).
amostra:superfície dos sacos, tempos de incubação empregados,

Protocolos para condução de ensaios de degradação in situ para
protocolos de lavagem dos sacos, dieta dos animais, número de
ruminantes
animais utilizados, contaminação microbiana, entre outros.
(Método G-009/1)
Uma breve inspeção de estudos in situ na literatura demonstra a
pluralidade observada nos protocolos aplicados (e.g.. Nocek, 1988; NRC, são descritos de forma direta na Tabela 18.1.
Os protocolos
2001; Mertens, 2005; Trujillo et al, 2010; Seifred et al., 2015; Machado Abaixo são discutidos os fundamentos que levaram à recomendação
et al., 2013; Menezes et al., 2017). Essa variabilidade deveria ser vista dos principais pontos das proposições aqui apresentadas.
como indesejada, uma vez que pode comprometer a reprodutibilidade das
estimativas obtidas e, consequentemente, o cotejamento inter Animais e dieta

experimental. Por outro lado, variações excessivas podem também
baseou
A proposição de composição de dieta se no
comprometer a formação de banco de dados com vistas à construção dee

fornecimento de ua dieta equilibrada, com diversidade da
ferramentas de predição de características in vivo.
331
330
Métodos para Análise de Alimentos - 2" Ediçio
nutricionais que
de alimentos e sem restrições
composição Amostras e sacos
animais
crescimento microbiano (Tabela 18.1). Os
comprometam o
antes do
mínimo, 14 dias A recomendação do tecido náilon com porosidade de 40-60 um
adaptados à dieta basal por,
no
devem ser
buscar alcançar uma às recomendações internacionais de uma foma em geral (Nocek.

início da incubação (Machado et al., 2016) para agrega
ambiente ruminal, necessária à adequada 1988; Michaet-Doureau & Ould-Bah. 1992: Vanzant et al. 1998; NRC.
condição de steady state no
cinética de degradação (Mertens, 2005). 2001). Ressalta-se que tecidos como o tecido não-tecido (100 g/m>) eo
estimação dos parâmetros da
FS7 (Ankom), embora recomendados para avaliação de compostos
A estrutura de dieta proposta visa agregar ao que tem sido
recomendado em estudos recentes na tentativa de padronização de indigestíveis (e.g.. FDN indigestível) em procedimento de incubação de
utilizados para avaliação de pertis de
ensaios de ruminal in vitro no Brasil (Silva et al., 2017; tempo único, não devem ser
digestão
meios
Camacho et al., 2019). Contudo, variações podem ocorrer caso o degradação. Esses tecidos apresentam menor taxa de troca entre os
dietética interno e extemo aos sacos e tendem a subestimar a taxa de degradação

ensaio de degradação seja direcionado a uma condição
(Valente et al., 2011).
específica. Nestes casos, faz-se necessário a devida justificativa para
A moagem das amostras tem o propósito de criar uniformidade no
devida exposição relatório final.
esta alteração e sua no
substrato e o aumento no tamanho de partículas tende a ampliar a
Recomendações quanto ao nível de alimentação dos animais
variabilidade dos resultados. Em termos gerais. a detinição por tamanho
são variáveis literatura, na qual indica-se
utilizados na incubação na
de partículas é preferível em relação a uma abertura de peneira, mas, na
alimentação em nível de mantença (Vanzant et al., 1998), restrita
prática, isto é ditícil de ser operacionalizado (Michalet-Doureau & Ould
acima da mantença (Hvelpund & Weisbjerg, 2000) ou ad libitum
Bah, 1992). Em compilação de dados da literatura Michalet-Doureau &
(Nocek, 1988). Vanzant et al. (1998) indicaram que as influências do
Ould-Bah (1992) recomendaram tamanho de partíiculas no intervalo de
nível de alimentação sobre os resultados de estudos in situ não são tão
1,5 a3,0 mm. Vanzant et al. (1998), tambémem compilação de literatura,
claras. Desta forma, a proposição de alimentação ad libitum aqui
encontraram o valor modal de 20 mm, o qual constituiu sua
apresentada se baseia no fato de isto permitir o fornecimento contínuo
recomendação para procedimentos in siu, sendo esta adotada pelo NRC
de novos substratos e garantir a continuidade do crescimento
(2001). Bsta foi a base dlarecomendação aqui apresentada.
microbiano.
332 333
INCT Ciencia Animal
Métodos para Análise de Alimentos 2" Ediç o
Procedimentos gerais de incubação

podem comprometer a identificação da conformação do perfil (i.e.,
ao número de
animais de modelo sigmóide). De forma
Não há consenso na literatura quanto presença de lag. identificação
da degradação in situ de alimentos (e.g., particular, alimentos produzidos em condições tropicais. notadamente
necessários para avaliação
animais - NRC, 2001; forragens, degradação mais lenta em comparaç o a seus
um animal -
Tomich & Sampaio. 2004; dois possuem

Åkerlind regiðes temperadas. Logo, a localização dos
três animais Mehrez & Ørskov, 1977; Ruiz & Ruiz, 1992; pares produzidos em
determinante para correta

tempos finais de incubação pode
a
et al., 2011). Em trabalho conduzido em condições brasileiras, ser
correta estimação da
avaliou estimativas de parâmetros da cinética de estimaço da assíntota e, consequentemente, a
Assunção (2017) as
degradação de volumosos e concentrados usando de 2 a 5 animais. dimensão das frações insolúvel potencialmente degradável e
Observou-se que, nesse intervalo avaliado, n o há como definir o indegradável.

Assim, os tempos de incubação aqui propostos (Tabela 18. 1) são
número mínimo de animais que minimize as variâncias aleatórias dos
resultantes de investigação conduzida por Assunção (2017) sobre
dados. Contudo, recomendou-se o uso de, no mínimo, três animais, o
alimentos produzidos em condições brasileiras. Uma característica

que propiciou alta probabilidade de obtenção de taxas de degradação
marcante que diferencia essa proposição daquelas constantes na
similares ao obtido com o número máximo de animais avaliado em
literatura é o uso de um alto tempo final (i.e., 240 horas) para a
seu estudo (i.e., cinco). Esta recomendação direcionou os protocolos
avaliação dos perfis de degradação ruminal da FDN de volumosos.
aqui propostos, embora ainda haja ampla lacuna no conhecimento a
Isso se faz necessário em função dos motivos apresentados no
ser preenchida neste quesito em especial.
parágrafo anterior.
Similarmente, não há consenso na literatura quando ao esquema
Os procedimentos de lavagem dos sacos se faz necessário para
ideal de tempos de incubação para a estimação adequada dos
retirada de resíduos oriundos do ambiente ruminal. Contudo, como
parâmetros da cinética de degradação ruminal dos diferentes
alertado por Madsen & Hvelpund (1994), a padronização dos
componentes dos alimentos. Pequeno número de tempos de incubação
procedimentos de lavagem só seria possível com o uso de máquinas
pode comprometer a estimabilidade das características de degradação.
de lavar. Vanzant et al. (1998) afimaram que a remoção de fluido
Por outro lado, poucos tempos no início do
perfil (i.e., tempos iniciais)
ruminal contaminante segue um modelo de difusão simples. Assim,
334
335
INCT Ciência Animal Métodos para Análise de Alimentos 2" Ediçao
e a0
relacionada ao número
de lavagens
mais
Sua remoção estaria
em cada
utilizado do que ao tempo dispendido
volume de água
na
Contudo. o tempo de exposição
e a força dispendidas
lavagem.
perda de
pode ter implicação sobre a
manipulação física dos
sacos
recomendaram, com base em dados

pequenas partículas. Estes autores
sugerido neste
procedimento de lavagem adotado
e
da literatura. o
de lavadora tipo
(Tabela 18.1). A sugestão de
uso
trabalho
e
"tanquinho" se deve à busca por padronização entre procedimentos
ao baixo custo e fácil acesso a este tipo de equipamento.

A disposição dos sacos em ordem reversa em relação aos
retirada simultânea está associada à

tempos de incubação, com
que todos os sacos seriam submetidos

recomendação acima, uma vez
ao mesmo procedimento de lavagem, o que contribuiria para

padronização e aumento da precisão das avaliações.
336 337
INCT Cíência Animal
TI Métodos para Análise de Alimentos 2" Ediça
5
E
i 339
338
alimentos volumosos,
Para estudos da degradação da PB em
à contaminação microbiana. para

faz-se necessária a correção quanto
Machado
a qual recomenda-se a utilização das equações propostas por
et al. (2013). A contaminação por compostos nitrogenados
microbianos não é considerada significativa no estudo da degradação
da PB de alimentos concentrados (Menezes et al., 2017), não sendo.
portanto, necessária.
realizada baseia no fato de a
A recomendação aqui se
microbiano sobre volumosos ser diretamente

contaminação de N
proporcional ao tempo de incubação e inversamente proporcional ao
teor de PB da forragem avaliada. As equações recomendadas para
çorreção da PB degradada são (Machado et al.. 2013):
%C =
79,21 x (1 -e-0,055Sxt) x e-0,0874xPB
(100 6C)
PBR (t) =
PBR(t) x
100
em que: %C = percentagem de contaminação microbiana sobre a
protefna bruta do resíduo: t =

tempo de incubação (h); PB =
concentração de PB na amostra incubada (% MS); PBRe(t) = resíduo
não degradado de PB no tempo t corrigido (g); e PBR() = resíduo não
degradado de PB no tempo t (g).
341
340
os
estatísticas convencionais,
Ao contráio das análises t) xet] (4)
D= A +B x [1
-
(1+2 x
modelos a serem aplicados para interpretação dos perfis de degradação

modelos
def+nidos em planejamento experimental. Os A fração solúvel
podem fração degradada no tempo t (g/100 g):
=
não ser
cm que: D =
obtidos
devem ser adotados em função do comportamento dos dados insolúvel potencialmente degradável (g/100 g):
(g/100 g); B =
fração
dados e não o contrário. latência
no experimento. Modelos são ajustados aos
k = taxa fracional de degradação (h"); t =
tempo (h): L =
O estabelecimento de um modelo único a priori pode gerar taxa fracional de latência (h*"); ei =
parâmetro taxa
discreta (h); u =
Alimentos
interpretação equivocada dos resultados experimentais. tempo-dependente da degradação (h').
frações diferentes dentro do mesmo
diferentes e. algumas vezes,
distintos,
alimento podem apresentar comportamentos de degradação 100
demandando assim modelos diferentes para que os processos sejam
descritos de forma mais verossímil.
Para interpretação dos perfis de degradação da MS e PB, os
modelos devem ser ajustados com base na fração degradada

modelos mais
(comumente denominados de perfis "crescentes"), cujos
comuns são (Figura 18.1):
-( -
D =A+Bx(1 -e-kxt) (1)

Tepo ()
D =A + B x[1-ekx{t-1)1 (2)
Figura 18.1. Comportamento comparativo de pertis de degradaçãoo
seca e proteína
aplicáveis para interpretação da matéria
de primeira ordem; 2, exponencial
D, =A + Bx[1-( euxtue
k-u
(3)
bruta (1, exponencial
de primeira ordem corrigido para latência discreta;
e
3/4, compartimental).
343
342
Métodos para Análise de A/imentox 2 Ediçi
se baseia no fato de
direcionado à fração degradada
O ajuste Caso no processo de ajustamento do modelo (3),
as taxas de
nutricional, 1nesse
essa fração ser mais relevante para interpretação tendam valor. o modelo
que degradação e latência (1.e.. k e u) ao mesmo
interesse
o uso da PB no ambiente ruminal, o
caso. Por exemplo. para indeterminação matemática devido à estrutura de seu
apresentará uma
que indica, entre outros aspectos,

primário é sobre sua degradação, o
será dada pela aplicação da regra de
denominador. A solução
microbiana.
oN disponível para assimilação L'Hôpital sobre o modelo (3). o que resulta no modelo (4).
(1) é denominado de exponencial de primeira

O modelo Para interpretação dos pertis de degradação da FDN, os
de base neperiana. Por sua

ordem e constitui de uma simples função modelos devem ser ajustados com base no resíduo não degradado
modificação de (1) com a inclusão do

vez, o modelo (2) constitui uma
(comumente denominados de pertis "decrescentes"), cujos modelos
parâmetro L que representa a latência discreta. Em outras palavras, um

mais comuns são (Figura 18.2):
hidratação de substrato e a
tempo teórico no qual eventos como a
microbiana antes do início da degradação em si.

colonização ocorrem
R =
Bx e-kxt + I (5)
O modelo (2) assume que todas as limitações para aa
degradação são simultaneamente contornadas ao final da latência

R = B xe-kx(t-L) +[| (6):
discreta. Contudo, tal suposição não considera que as condições para
degradação podem ser atingidas diferentemente (e em tempos
R = B x ( kxeuNt-uxekxt
diferentes) para as diferentes frações do substrato. Assim, para k-u )+l (7):
contornar tal suposição Van Milgen et al. (1991) desenvolveram o
modelo (3), denominado de modelo compartimental, o qual não R = B x (1 +a x t) x e-kxt+I (8):

considera a latência um processo discreto, mas sim representado por
uma taxa. Assim, medida que
substrato passa pelos processos
na o
em que: Ri =resíduo não degradado no tempo t (g/100 g): B fração
preparatórios, o mesmo se torna disponível para os eventos de potencialmente degradável (g/00 g): k = taxa fracional de degradação
(h': t = tempo (h):l = tração indegradável (g/100 g): L = latência

degradação.
344 345
INCT Ciencia Animnal Métodos para Análise de Alimentos 2" Edição
taxa
(h'); e a = parâmetro modelos (1) (4) jamais
taxa fracional de latência anteriormente. Somente ressalta-se que
os a
discreta (h); u =
degradação (h'). interpretação do perfil de degradação da FDN.

tempo-dependente da devem ser usados para
os mesmos contemplam parâmetro

associado à fraçãoo
uma vez que
FDN representa a fibra
solúvel (i.e., fração A). Por definição, a
rúmene o uso de um modelo que

insolúvel em meios aquosos como o
seria um equívoco nutricional.
contemple fração solúvel
detectar-se o desaparecimento aparente

Experimentalmente, é comum
No entanto. essa aparente "fração

de FDN no tempo 0 de incubação.
a ocorrências de eventos indesejados
solúvel" reflete tão somente
perda de partículas pelos sacos de incubação.

como, por exemplo, a
Literatura Citada
variabilidade entre animais e de

Tempo () ASSUNGÇÃO, A.S. Avaliação da
in situ e m bovinos.
protocolos de incubação em estudos de degradação
Federal
51f. Disertação (Mestrado em Zootecnia). Viçosa: Universidade
de degradação
Figura 18.2. Comportamento comparativo de perfis de Viçosa, 2017.
aplicáveis para interpretação da fibra em detergente M.; WEISBJERG, M.: ERIKSSON. T.: TØGERSEN. R.;
ÅKERLIND,
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latência
exponencial de primeira ordem corrigido para analyses and digestion methods. In: VOLDEN, H. (Ed.) NorFor
The -
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De forma ajuste
simples, o direcionado ao resíduo não AGRICULTURAL AND FOOD REsEARCH
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degradado se baseia no fato de que a fibra insolúvel possui capacidade International, 1993. 159p.
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As bases teóricas dos modelos são as mesmas apresentadas
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INCT Ciencia Animal
Métodos para Análise de Alimentos- 2" Fdiçin
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VANZANT, E.S.; COCHRAN, R.C.; TITGEMEYER, EC.
of in situ for ruminant feedstuff evaluation. Journal of
techniques
Animal Science, v.76, p.2717-2729, 1998.
350

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M

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Exemplares deste livro podem ser adquiridos na:

Livraria UFV on-line

Ficha catalográfica preparada pela Seção de Catalogação e

Classificação da Biblioteca Central da UFV

Métodos para análise de alimentos/Organizadores Edenio

1. Nutrição animal. 2. Animais-Alimentos. 3. Alimentos-

CDD 22. ed. 636.08552

Bibliotecária responsável: Renata de Fátima Alves CRB6/2578

E permitida a reprodugäo parcial desde que citada a fonte.

Métodos para Análise de

Malber Nathan Nobre Palma Gabriel Cipriano Rocha

João Paulo Pacheco Rodrigues

de suas metas prioritárias a criação de uma Rede Nacional de Pesquisa

calcou sobre a real necessidade de se conhecer como as diferentes

instituições avaliavam os alimentos e como se podería, da melhor forma

estávamos falando línguas bem diferentes e que necessitávamos

estabelecer um idioma comum para que nossa comunicação se tornasse

mais próxima do universal. Assim nasceu a idéia deste manual.

Durante o período em que o mesmo foi elaborado, muitas

avaliações conjuntas foram novamente realizadas, nas quais pudemos

aproximamos mais de um "idioma analítico" comum.

Contudo, muito ainda precisa ser percorrido.

manual não pôde ser adequadamente avaliada em ensaios de variação

interlaboratorial. Isto constitui uma meta da Rede de Avaliação de

experimentos conduzidos em uma única instituição ou, em pequenos

Apliquem os métodos aqui estabelecidos. Identifiquem seus equívocos e

Métodos para Análise de Alimentos - 2" Edição

disponibilizar a segunda edição do "Métodos para Análise de Alimentos"

edição e tentamos, na medida do possível, corrigi-los e aperfeiçoar as

informações que disponibilizamos anteriormente.

engano. Muito foi feito, destacando-se o esforço de muitos estudantes de

Contudo, esperamos que a nova edição do Métodos para Análise de

Alimentos do INCT-CA venha minimizar as dificuldades que possam

existir nos laboratórios de análise de alimentos para animais das

Muitos dos métodos com os quais trabalhamos constituem

Cordialmente, Tecnológico (CNPg), pelo constante apoio financeiro na forma de bolsas

8 Alimentos do INCT-CA, por aceitarem o desafio e participarem nas ações

grande contribuição. A codificação dos métodos estabelecidos para análise de

estabelecidos e, quando necessáio, referencia-los em relatórios e artigos

dentro da análise de alimentos

Código de Area Area

2 Secagem definitiva e matéria seca. 55

que está sendo exposta

aqueles que sofreram alterações, o valor do

9 Carboidratos não fibrosos e matéria orgânica

Protocolos para condução de

Obtenção e processamento de amostras

Definições básicas em amostrageme inferência em alimentos

A análise de alimentos constitui área relevante no ensino das

Ciências que estudam alimentos, pois fornece ferramentas e subsídios

para vári0s segmentos do controle de qualidade, do processamento e

do armazenamento, além das informações básicas acerca de seu

potencial e efetividade de utilização por animais e humanos.

composição química; sua ação no organismo; seu valor nutritivo

análise de alimentos relaciona-se com tudo aquilo que, de alguma

natural ou industrializado. Também é função da análise de alimentos

detectando a presença de adulterantes e aditivos prejudiciais à saúde.

de controle de inferéncia conecta dois elementos chave processo de

igualmente importantes na contabilização de propriedades nutritivas dados: a

constitui em habilitar o analisla a rcalizar um processo de inleréncin.

material enviado e/ou recebido