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DETERMINAÇÃO DE VIABILIDADE CELULAR 001 19/08/2022

1. OBJETIVO

Definir os procedimentos para determinação de viabilidade celular de uma população de levedura em processo fermentativo.

2. MATERIAIS NECESSÁRIOS

− Microscópio óptico;
− Tubos de ensaio de 10 mL ou tubos falcon de 15 mL estéreis;
− Lâminas;
− Lamínulas;
− Câmara de Neubauer;
− Corante azul de metileno;
− Papel toalha;
− Algodão;
− Micropipetas de 100 uL;
− Ponteiras estéreis;
− Pipetas estéreis de 1 mL;
− Óleo de imersão

3. ESCOPO

Destina-se aos alunos e pesquisadores do curso de pós-graduação em Tecnologia Cervejeira do Instituto de Química de
Araraquara, que utilizem do método microscópico para determinação da viabilidade celular de uma população de células de
levedura do processo cervejeiro.

4. PROCEDIMENTOS

4.1 ORIENTAÇÕES GERAIS

− Todos os usuários devem ter conhecimento e apropriação das normas deste procedimento.
− É obrigatório o uso de jaleco e vestimentas adequadas durante as aulas práticas.
− É essencial conhecer as partes ópticas e mecânicas dos microscópios.
− Antes de manusear o microscópio lavar e secar bem as mãos.
− O óleo de imersão deve ter contato apenas com objetiva 100X. Uma vez utilizado o óleo de imersão na objetiva de
100X, jamais retornar para as outras objetivas, pois o óleo suja as lentes e interfere na visualização.
− Após o uso da objetiva de 100X com óleo de imersão, realizar limpeza seguindo a orientação do responsável.

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− Para manter o microscópio seguro, cobrir com a capa após o uso.

Figura 1. Partes do Microscópio Óptico.

4.2 PREPARO DA AMOSTRA

− Homogeneizar a amostra de levedura;

− Deve-se diluir adequadamente a amostra com água destilada, de modo que o número de células seja adequado para
a faixa de maior precisão da metodologia. Assim, rotule os tubos de ensaio de diluição seguindo as diluições de 10 -1
a 10-6;
− No tubo 10-1 adicionar 4,5 mL de água destilada e 0,5 mL da amostra de levedura, descartar a ponteira e homogeneizar
a solução;
− Retirar uma alíquota de 0,5 mL do tubo 10-1 para o tubo 10-2, diluir com 4,5 mL de água destilada, descartar a ponteira
e homogeneizar a solução;
− Repetir a operação de forma a terminar a sequência de tubos da diluição seriada.

4.3 OBSERVAÇÃO DA AMOSTRA

− Transferir 1 mL da amostra diluída para tubo de ensaio;

− Transferir 1 ml da solução de azul de metileno para o tubo de ensaio que contém 1 mL da amostra diluída e
homogeneizar;
− Preparar a câmara de Neubauer, cobrindo a superfície espelhada com uma lamínula;
− Transferir um volume suficiente da solução de amostra com corante para cobrir a área da câmara de Neubauer;

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− Colocar a lâmina sobre a platina, segurando-a com uma das mãos e abrindo a presilha com a outra. Colocar a amostra
o mais centralizado possível em relação ao feixe de luz;
− Girar o revólver, encaixando a objetiva de menor aumento (4X ou 10X). Sempre usar da menor para a maior;
− Acender a luz do microscópio (acionar o interruptor e em seguida o regulador de intensidade) e centralizar o material
na platina utilizando o charriot. Fazer isso olhando lateralmente, pois facilita a operação;
− Movimentar o macrométrico, levantar a platina até o ponto máximo, sem que a lâmina encoste na objetiva;
− Olhar através das oculares e, utilizando o macrométrico, descer lentamente a platina até que se possa visualizar o
material a ser analisado;
− Acertar o ponto exato do foco com o micrométrico;
− Corrigir a intensidade de luz e abertura do diafragma para evitar ofuscamento e permitir a percepção de profundidade
de campo e o contraste desejados;
− Girar o revólver para passar para a próxima objetiva de maior aumento, lembrando sempre de regular a intensidade
de luz e a abertura do diafragma, bem como de corrigir a focalização com o micrométrico. Não utilizar o macrométrico
para a focalização a partir desta etapa, somente o micrométrico;
− Realize a observação nas objetivas de 10X e 40X;
− Para utilizar a objetiva de 100X é imprescindível o uso do óleo de imersão sobre a lâmina: girar o revólver de modo a
deixar a lâmina entre as objetivas de 40X e 100X. Encostar o conta-gotas contendo o óleo de imersão na lâmina,
exatamente sobre a amostra. Não é necessário apertar o bulbo do conta gotas. Uma pequena gota de óleo é suficiente
para a observação;
− Atentamente, girar o revólver para encaixar a objetiva de 100X e ajustar o foco com o micrométrico;
− Contar utilizando a objetiva de imersão (100X), as células presentes nos quatro retículos centrais dos 25 quadrículos.
A contagem utilizando a objetiva de imersão (100X) permite uma observação mais precisa das células da levedura
quanto a sua estrutura celular.

4.4 DETERMINAÇÃO DA VIABILIDADE CELULAR

− A partir da contagem do número de células viáveis e de células não viáveis, aplicar as equações abaixo para
determinar a viabilidade celular, em porcentagem, e a população de leveduras, em células/mL.
𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑣𝑖á𝑣𝑒𝑖𝑠
% 𝑉𝑖𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 = × 100
𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠(𝑣𝑖á𝑣𝑒𝑖𝑠+𝑛ã𝑜 𝑣𝑖á𝑣𝑒𝑖𝑠)

𝑃𝑜𝑝𝑢𝑙𝑎çã𝑜 𝑑𝑒 𝐿𝑒𝑣𝑒𝑑𝑢𝑟𝑎𝑠 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑐é𝑙. 𝑣𝑖á𝑣𝑒𝑖𝑠 × 4000

𝑃𝑜𝑝𝑢𝑙𝑎çã𝑜 𝐿𝑒𝑣𝑒𝑑𝑢𝑟𝑎 = × 1000 × 𝐷𝑖𝑙𝑢𝑖çã𝑜
𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑡í𝑐𝑢𝑙𝑜𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑑𝑜𝑠
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5. REFERÊNCIAS

BARONY, F. J. D. A.; GUERRA, L. D. L.; SOARES, M. A. Microbiologia: Roteiros de práticas, desafios e possibilidades
para o cumprimento do ementário em uma Escola Técnica Federal. [s.l.] Synapse Editora, 2021.

Precisando Comprar um Micróscópio Óptico? Saiba Mais, 4 maio 2016. Disponível em:
<https://www.splabor.com.br/blog/microscopio-estereoscopio/aprendendo-mais-aspectos-importantes-sobre-microscopio-
optico-denominacao-suas-respectivas-partes-manuseio-e-limpeza/>. Acesso em: 12 set. 2023

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