UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS - DIURNO
Carlos Henrique Brigido da Silva Filho

ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE LEVEDURAS Saccharomyces

cerevisiae DE FRUTOS DE Citrus × limonia COM CAPACIDADE DE
FERMENTAÇÃO DE MOSTO CERVEJEIRO

Florianópolis
2019
 2

Carlos Henrique Brigido da Silva Filho

ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE LEVEDURAS Saccharomyces

cerevisiae DE FRUTOS DE Citrus × limonia COM CAPACIDADE DE
FERMENTAÇÃO DE MOSTO CERVEJEIRO

Trabalho Conclusão do Curso de Graduação em

Ciências Biológicas - Diurno do Centro de Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Santa
Catarina como requisito para a obtenção do Título
de Bacharel em Ciências Biológicas.

Orientadora: Dra. Gabriela Muller

Florianópolis
2019
3
 4

CARLOS HENRIQUE BRIGIDO DA SILVA FILHO

Isolamento e identificação de leveduras Saccharomyces cerevisiae de frutos

de Citrus × limonia com capacidade de fermentação de mosto cervejeiro

Este Trabalho de Conclusão de Curso foi julgado adequado para obtenção do Título de
Bacharelado em Ciências Biológicas e aprovado em sua forma final pelo Curso de Ciências
Biológicas.

Florianópolis, 22 de novembro de 2019.

_________________________________
Prof. Dr. Carlos Zanetti
Coordenador do Curso de Ciências Biológicas

Banca Examinadora:
________________________________
Dra. Gabriela Müller
Presidente
Orientadora externa

________________________________
Prof. Dr. Rubens T. D. Duarte
Membro titular
Universidade Federal de Santa Catarina

________________________________
Prof. Dr. Alexandre Verzani Nogueira
Membro titular
Universidade Federal de Santa Catarina
 5

Dedico este trabalho à minha mãe Paulina, meu pai Carlos e

minha irmã Fernanda, amo muito vocês!
 6

AGRADECIMENTOS

Primeiramente agradeço aos meus pais Paulina e Carlos por todo carinho, amor, ensinamentos
e incentivo que me deram ao longo de toda minha trajetória. Muito do que sou hoje devo à
vocês.

Agradeço à minha irmã e melhor amiga Fernanda pelo seu amor incondicional, conselhos, apoio
e por ser uma excelente referência de força e dedicação.

À minha namorada Francielle pelo amor e paciência.

Agradeço à Gabriela Müller pela orientação deste trabalho, sapiência e todo conhecimento
transmitido, além da amizade e experiências incríveis no universo cervejeiro.

Agradeço à Marina Müller pela amizade e oportunidades na Levteck Tecnologia Viva que
possibilitou o desenvolvimento deste trabalho.

Aos amigos da Biologia: Otávio, Felipe, Geisel, Fernando e Gabi pelos inúmeros momentos de
felicidade durante o curso, seja nas festinhas ou nos momentos de estudo, levarei vocês para a
vida.

Às capivaras Mariana, Jéssica, Matheus, Johanna, Adriana e muitos outros colegas de trabalho
da Levteck pelo incentivo, ajuda e companherismo, vocês são demais.

Àos amigos Guilherme, Paulo, Corvo, Amanda, Anderson pelos conselhos e apoio durante esta
caminhada.

Àos meus tios e primos por todo carinho, incentivo e ajuda durante estes anos.

À todos que um dia foram meus professores, a mais linda e importante profissão de todas.

Por fim à todos que de certa forma me ajudaram a concluir este sonho.
 7

"Era um homem sábio aquele que inventou a

cerveja."

Platão
 8

RESUMO

O mercado brasileiro de cervejas e encontra em pleno crescimento. O Brasil terminou o

primeiro semestre de 2019 com mais de 1000 cervejarias em operação. Boa parte dos insumos
para a fermentação de cervejas é importado, incluindo as diversas linhagens de leveduras do
gênero Saccharomyces spp..É de grande interesse do mercado cervejeiro explorar a diversidade
de leveduras, buscando selecionar e desenvolver novas linhagens que confiram propriedades
organolépticas diferenciadas às cervejas, proporcionando uma maior variedade de sabores e
aromas e promovendo o desenvolvimento de novas tecnologias e produtos nacionais. Assim,
este trabalho tem como objetivo isolar leveduras Saccharomyces cerevisiae a partir de frutos
de Citrus spp. e determinar a capacidade de fermentação do mosto cervejeiro pelos isolados
para utilização na produção de cervejas artesanais. Com o uso dos meios comerciais
TeckLev#03 e TeckLev#06 nas etapas de isolamento foram obtidos 27 isolados a partir do
mosto cervejeiro inoculado com frutos de limão-galego sendo que apenas 2 isolados não
apresentaram capacidade de atenuar o mosto cervejeiro. Análises molecurares determinaram
que a amostra dos isolados era composta majoritariamente pela espécies Meyerozyma caribbica
(74,56%) e o restante pertence à espécie Saccharomyces cerevisiae (25,44%). As duas espécies
obtidas possuaem distinta capacidade de crescimento em meio hipersalino descritas na
literatura, sendo possivel selecionar possiveis cepas pertencentes ao gênero Saccharomyces
spp. Apenas 4 cepas não apresentaram capacidade de crescimento em meio hipersalino e foram
confirmadas como pertencentes à espécie Saccharomyces cerevisiae através de nova análise
molecular. A obtenção de linhagens com capacidade de produção de cerveja contribuirá para o
desenvolvimento científico e diversificação dos insumos cervejeiros, oferecendo um produto
biotecnológico nacional como alternativa ao fermento importado e conferindo mais
independência e autonomia ao mercado cervejeiro.

Palavras-chave: Isolamento, leveduras, Saccharomyces cerevisie, cerveja artesanal

 9

ABSTRACT

The Brazilian beer market is in full growth. Brazil ended the first half of 2019 with over 1000
breweries in operation. Much of the raw materials for brewing beer is imported, including the
various yeasts strains of the genus Saccharomyces spp. It is in the interest of the brewing market
to explore the diversity of wild yeasts in order to select and develop new strains that confer
differentiated organoleptic properties for beers, providing a greater variety of flavors and
aromas and promoting the development of new technologies and national products. Thus, this
work aims to isolate Saccharomyces cerevisiae yeasts from fruits of Citrus spp. and to
determine the fermentation capacity of the brewer's wort by the isolates for use in the production
of craft beers. With the use of TeckLev # 03 and TeckLev # 06 commercial media in the
isolation stages, 27 isolates were obtained from the brewer's wort inoculated with fruits of lmão-
galego, and only 2 isolates showed no ability to attenuate the brewer's wort. Molecular analyzes
determined that the sample of the isolates was composed mainly by the Meyerozyma caribbica
species (74.56%) and the rest belonged to the species Saccharomyces cerevisiae (25.44%). The
two isolated species possess distinct growth capacity in hypersaline medium described in the
literature, being possible to select possible strains belonging to the genus Saccharomyces spp.
Only 4 strains showed no growth capacity in hypersaline medium and were confirmed as
Saccharomyces cerevisiae species by new molecular analysis. Obtaining lines with brewing
capacity will contribute to the scientific development and diversification of brewing inputs,
offering a national biotechnological product as an alternative to imported yeast and conferring
more independence and autonomy to the brewing market.

Keywords: Isolates, yeast, Saccharomyces cerevisiae, craft beer

 10

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Formação de etanol e gás carbônico apartir do piruvato (NELSON & COX, 2015).
.................................................................................................................................................. 16

Figura 2 - Esquema com as principais vias metabólicas de compostos que participam da

formação de sabores na cerveja produzidos por leveduras. Fonte: (BOKULICH &
BAMFORTH, 2013)................................................................................................................. 17

Figura 3 - Fluxograma básico do processo de produção de cervejas. Fonte: (TOZETTO, 2017)

.................................................................................................................................................. 20

Figura 4 - Curva de crescimento típico durante a fermentação (HELD, 2010). ..................... 22

Figura 5 - Esquema da técnica de carimbo em meios Tecklev#03 e Tecklev#06. .................. 26

Figura 6 - Produção de mosto cervejeiro utilizando equipamento elétrico (Beermática) ....... 27

Figura 7 - Luvas de procedimentos infladas devido a produção de gás carbônico durante da

fermentação do mosto cervejeiro .............................................................................................. 31

Figura 8 – Imagem representativa das placas de Petri com meio de alta concentração salina
(10% NaCl e 5% glicose) indicando a diferença entre as leituras utilizadas na como tentativa
diferenciação entre as espécies Meyerozyma caribbica e Saccharomyces cerevisiae. ............ 40
 11

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Composição de carboidratos presentes no mosto cervejeiro (STAMBUK et al., 2006)

.................................................................................................................................................. 21

Tabela 2 - Patamares de temperatura por tempo executadas durante a produção do mosto

cervejeiro. ................................................................................................................................. 27

Tabela 3 - Consumo de açúcares do mosto cervejeiro sem lúpulo inoculados com frutos de
Citrus × limonia. ...................................................................................................................... 30

Tabela 4 - Consumo de açúcares após 72 horas de incubação em fermentação de bancada. .. 32

Tabela 5 - Dados de concentração celular (106 células/mL), viabilidade (%), quantidade de

células (109 células) e taxa de inóculo (106 céls/mL/ºP) obtida com a contagem em câmara de
Neubauer dos testes de fermentação em bancada. .................................................................... 34

Tabela 6 - Valores de extrato original (ºP), extrato real (% p/p), extrato aparente (% p/p) e suas
respectivas médias e desvio padrão resultante das quatro produções de mosto. ...................... 36

Tabela 7 - Valores de extrato original (ºP), extrato real (%p/p), extrato aparente (%p/p), álcool
(%v/v) e atenuação aparente (%) obtidos com a produção de cerveja com os isolados........... 37

Tabela 8 - Resultado do ensaio de diagnóstico microbiológico digital para fungos através do

sequenciamento de alto desempenho da região ITS1. .............................................................. 38

Tabela 9 - Resultado do teste de crescimento em meio 10% NaCl e 5% glicose. As leituras

representam: + crescimento positivo; - ausência de crescimento. ............................................ 39

Tabela 10 - Resultado do diagnóstico microbiológico digital para fungos através de

sequenciamento de alto desempenho da região ITS1 dos isolados que apresentaram crescimento
negativo para o meio de alta concentração salina..................................................................... 40

Tabela 11 - Valores de atenuação aparente obtidos pelos isolados nos testes de fermentação em
bancada e na produção de cerveja em comparação com a capacidade atenuativa das principais
leveduras ale comercializadas pela empresa catarinense de fermentos Levteck Tecnologia Viva.
.................................................................................................................................................. 41
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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 13
1.1 Microbiota de frutos ................................................................................................... 14
1.2 Leveduras cervejeiras ................................................................................................. 15
1.3 Compostos secundários de fermentação..................................................................... 17
1.4 Água, malte, lúpulo .................................................................................................... 19
1.5 A produção de cerveja ................................................................................................ 20
1.6 Bioquímica do processo de fermentação de cervejas ................................................. 22
2 OBJETIVOS ............................................................................................................. 24
2.1.1 Objetivo Geral .......................................................................................................... 24
2.1.2 Objetivos Específicos................................................................................................ 24
3 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................... 25
3.1 Coleta dos frutos e isolamento ................................................................................... 25
3.2 Teste de fermentação de mosto cervejeiro e contagem celular .................................. 26
3.2.1 Teste de fermentação em bancada de mosto cervejeiro ............................................. 26
3.2.2 Contagem de células dos testes de fermentação em bancada ..................................... 26
3.2.3 Produção de cerveja utilizando os isolados ................................................................ 27
3.3 Identificação e quantificação molecular dos isolados ................................................ 28
3.4 Seleção dos isolados de Saccharomyces cerevisae por teste de crescimento em meio
com alta concentração salina .................................................................................................... 29
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 30
4.1 Coleta dos frutos, inóculo e isolamento ..................................................................... 30
4.2 Teste de fermentação de mosto cervejeiro e contagem celular .................................. 31
4.2.1 Fermentação em bancada do mosto cervejeiro........................................................... 31
4.2.2 Contagem celular dos testes de fermentação em bancada .......................................... 33
4.2.3 Produção de cerveja utilizando os isolados ................................................................ 35
4.3 Identificação e quantificação molecular dos isolados ................................................ 38
4.4 Seleção dos isolados de Saccharomyces cerevisae por teste de crescimento em meio
com alta concentração salina .................................................................................................... 39
4.5 Comparação dos isolados com cepas comerciais de Saccharomyces cerevisiae ....... 40
5 CONCLUSÃO .......................................................................................................... 41
REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 43
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1 INTRODUÇÃO

O mercado brasileiro de cerveja é considerado o terceiro maior do mundo, atrás apenas

dos Estados Unidos da América e da China e se encontra em pleno crescimento. O setor
cervejeiro nacional produziu em 2016 cerca de 14,1 bilhões de litros de cerveja, o que representa
aproximadamente 1,6% do produto interno bruto (PIB) nacional, deixando evidente sua
importância econômica. (BARTH-HASS, 2016; CERVBRASIL, 2016).
Com a expansão da produção de cerveja artesanal, o Brasil fechou o primeiro semestre
de 2019 com mais de 1000 cervejarias em operação. Nessa soma estão apenas as os
estabelecimentos que têm fabricação própria, portanto, se somadas as cervejarias chamadas
ciganas, aquelas que usam instalações de outras cervejarias para produzir suas cervejas, a
quantidade é bem maior. Estes números fazem parte do Anuário da Cerveja no Brasil em 2018,
divulgado em 23 de janeiro pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA)
que regula o setor (BRASIL, 2019).
A legislação brasileira define cerveja como sendo a bebida obtida pela fermentação
alcoólica do mosto cervejeiro oriundo do malte de cevada, água potável, com adição de lúpulo
e ação da levedura, sendo que parte do malte de cevada poderá ser substituída por adjuntos
cervejeiros, cujo emprego não poderá ser superior a 45 % em relação ao extrato primitivo
(BRASIL, 2009).
Boa parte dos insumos para a fermentação de cervejas é importado, incluindo as
diversas linhagens de leveduras do gênero Saccharomyces spp. Dessa forma, a utilização de
leveduras isoladas em território nacional com potencial para a produção de cerveja torna-se
uma alternativa ao uso de fermento importado, abrindo espaço para o desenvolvimento de
produtos e tecnologias nacionais.
Estudos de metagenômica demonstram que a biodiversidade dos fungos é vasta, no
entanto, muito pouco explorada, sendo as linhagens industriais de leveduras pertencentes a uma
pequena fração desta variedade (LITI et al., 2009; WANG et al., 2012).
Na produção de cervejas, as principais espécies utilizadas são Saccharomyces
cerevisiae e a Saccharomyces pastorianus, a qual se acredita ter variado a partir de um longo
período de domesticação e hibridização entre as espécies Saccharomyces cerevisiae e
Saccharomyces eubayanus (LIBKIND et al., 2011; BING et al., 2014).
A dominância do uso de S. cerevisae ao longos anos limitou a diversificação das
propriedades organolépticas do produto final, portanto, o uso de linhagens diferentes oferece
benefícios como a produção de variados sabores, produção de cervejas com baixo teor alcoólico
 14

e podendo ser utilizadas na criação de novos estilos de cerveja e na releitura de estilos históricos,
ou seja, novas linhagens de leveduras podem diversificar ainda mais os produtos de um setor
naturalmente diverso (CUBILLOS et al, 2019).
Assim, é de grande interesse do mercado cervejeiro explorar a diversidade de
leveduras selvagens, buscando selecionar e desenvolver novas linhagens que confiram
propriedades organolépticas diferenciadas às cervejas, proporcionando uma maior variedade de
sabores e aromas e promovendo o desenvolvimento de novas tecnologias e produtos nacionais.

1.1 Microbiota de frutos

Na natureza grande parte da atividade enzimática necessária para o aproveitamento da

matéria orgânica é realizada por fungos filamentosos, leveduras e bactérias. As diversas partes
das plantas (raízes, caule, folhas, flores, frutos e etc.) constituem um dos substratos mais
abundantes para o desenvolvimento de uma vasta gama de microrganismos (FOKKEMA,
1991).
Particularmente, as leveduras isoladas de frutos geralmente são boas fermentadoras e
assimilam glicose, frutose, sacarose assim como etanol, glicerol (PHAFF; STARMER, 1987).
Os frutos são micro habitats importantes para uma variedade de espécies de leveduras na
natureza, devido à sua alta concentração de açúcares simples, baixo pH e visitas constantes por
insetos vetores. Nestes substratos o desenvolvimento das leveduras envolve diversos processos
bioquímicos e ecológicos, incluindo a deterioração do fruto.
As leveduras estão associadas a processos fermentativos e substratos que contenham
açúcares (hexoses). Entretanto, a habilidade das leveduras em assimilar grande número de
compostos orgânicos, expande a sua capacidade de dispersão e de ocupação dos nichos
ecológicos que contenham estes compostos.
Dentre o vasto grupo de leveduras, os gêneros Candida, Debariomyces,
Hanseniaspora, Hansenula, Sporobolomyces, Kloeckera, Pichia, Metschnikowia,
Saccharomyces, Brettanomyces, Bullera, Torulaspora, Meyerozyma, Rodotorula e
Zygosacharomyces se destacam como potenciais para a utilização em processos fermentativos
e pelo fato da maioria das espécies de leveduras não apresentarem as características
patogênicas, a utilização na indústria se torna mais fácil (CRUZ et al., 2009).
Alguns estudos sobre diversidade de leveduras realizados no Brasil demonstraram que
diferentes habitats como insetos, flores e frutos, apresentam comunidades de leveduras
 15

características, com biótipos diferentes, e até mesmo novas espécies (HAGLER et al., 1993;
LANDELL; VALENTE, 2009).
A cerca da aplicação em processos fermentativos, Pietrowski, Wosiacki e Nogueira
(2011), descrevem que os estudos de biodiversidade e dinâmica populacional dos ecossistemas
fermentativos, bem como a identificação de leveduras selecionadas por interesses diversos,
como produção de enzimas, funções probióticas, produção de aromas, podem revelar cepas com
excelente potencial tecnológico.
Silva, Guerra e Blini (2013), descrevem que os nutrientes que estão disponíveis no
filoplano (superfície foliar) do pequizeiro, em vegetação remanescente do Cerrado, servem de
base para o desenvolvimento de populações de leveduras, pois conseguiram isolar no munícipio
de Três Lagoas-MS diversas espécies de leveduras. Peixoto (2006), analisou a produção de
enzimas amilolíticas a partir de amostras coletadas do solo, pólen e frutos de diversas regiões
do país como: Cerrado, Floresta Amazônica e Mata Atlântica.
Segundo Skinner et al., (1980), a microbiota natural de leveduras dos frutos em geral
é composta pelos gêneros Rhodotorula, Sporobolomyces, Cryptococcus, Torulopsis, Candida,
Pichia, Hansenula, Kloeckera, Hanseniaspora e raramente por Saccharomyces e
Schizosaccharomyces, demonstrado a baixa ocorrência de isolados do gênero Saccharomyces.

1.2 Leveduras cervejeiras

Leveduras são organismos eucariontes pertencentes ao Reino Fungi, estes organismos

possuem um papel relevante na indústria alimentícia, especialmente no setor de panificação e
na produção de bebidas alcoólicas, como vinhos, cervejas e bebidas destiladas (RIBÉREAU-
GAYON, 2006).
A fermentação alcoólica é um processo bioquímico no qual o piruvato é utilizado para
produção de energia em situações de anaerobiose. A via fermentativa regenera a coenzima
NAD+, para isso, a enzima piruvato descarboxilase promove a descarboxilação do piruvato,
formando acetaldeído e liberando CO2. Na sequência, o acetaldeído é reduzido pela enzima
álcool desidrogenase, gerando etanol e regenerando NAD+. Dessa forma, leveduras como
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Saccharomyces cerevisiae são capazes de produzir dois mol de etanol, dois mol de gás
carbônico e dois mol de ATP para cada molécula de glicose (Figura 1).

Figura 1 - Formação de etanol e gás carbônico apartir do piruvato

(NELSON & COX, 2015).

Ainda que os produtos finais desta via metabólica sejam o álcool e o dióxido de carbono,
outros metabólitos são produzidos em menores quantidades, como ésteres, ácidos orgânicos,
álcoois superiores, acetoaldeído e dicetonas vicinais. Estes compostos secundários do processo
fermentativo são determinantes para as características organolépticas da cerveja, influenciando
no sabor e aroma da cerveja finalizada (PEREIRA et al., 2015)
Considerando o tipo de levedura e a sua performance fermentativa, é possível distinguir
três grupos básicos de cervejas, as Ales, Lagers e Lambics, sendo ainda feita referência por
parte de alguns autores a um quarto tipo, as cervejas híbridas, cuja fermentação é mista (BJCP,
2015). As principais diferenças entre as leveduras Ale e Lager estão nas suas habilidades
fermentativas, como o consumo de açúcares do mosto, tolerância à temperatura, capacidade de
floculação e o perfil produção de compostos secundários durante a fermentação
(MEUSSDOERFFER, 2009).
As cervejas Ale, denominadas cervejas de alta fermentação, são produzidas utilizando
cepas de Saccharomyces cerevisiae, em temperaturas mais elevadas, variando entre 15 e 25ºC
(VIDGREN et al., 2010). Neste tipo de cerveja as leveduras permanecem na porção superior
dos fermentadores e são geradas concentrações superiores de ésteres e outros compostos
aromáticos, o que justifica a maior complexidade sensorial do produto final (VIROLI et al.,
2015).
Por outro lado, as cervejas Lager, ou cervejas de baixa fermentação na terminologia
antiga, geralmente tem um perfil sensorial neutro, sendo utilizadas cepas de Saccharomyces
pastorianus, numa faixa de temperaturas mais amenas, variando entre 8ºC e 16ºC (VIDGREN
et al., 2010).
 17

Adicionalmente, existem as cervejas de fermentação espontânea, dotadas de um

acentuado aroma acídico, que são comumente obtidas em barris de madeira utilizando leveduras
do gênero Brettanomyces e bactérias láticas e acéticas existentes no ambiente (BJCP, 2015).

1.3 Compostos secundários de fermentação

Além da produção de etanol e gás carbônico, outros compostos são produzidos pelas
leveduras durante a fermentação do mosto cervejeiro, sendo estes denominados compostos
secundários do processo fermentativo e são determinantes para o sabor e aroma da cerveja
(KUCK, 2008).
A variedade de levedura escolhida, assim como a densidade e composição do mosto, a
temperatura durante da fermentação e sua duração são variáveis que influenciam o metabolismo
de leveduras e assim no teor dos compostos secundários produzidos durante a fermentação
(ESSLINGER, 2009).
Os grupos de compostos secundários que merecem destaque do processo fermentativo
são os ácidos orgânicos, álcoois superiores, ésteres, aldeídos, dicetonas vicinais, compostos
fenólicos e de enxofre, conforme demonstrado na figura 2 (BOKULICH & BAMFORTH,
2013).

Figura 2 - Esquema com as principais vias metabólicas de compostos que participam da

formação de sabores na cerveja produzidos por leveduras. Fonte: (BOKULICH &
BAMFORTH, 2013)
 18

Os ácidos orgânicos são produzidos através da assimilação de compostos nitrogenados,

como aminoácidos, pelas leveduras. Os principais ácidos orgânicos encontrados após a
fermentação são o ácido acético, ácido fórmico, ácido succínico, ácido piroglutâmico e ácido
málico e alguns sais de ácidos como malato, D-lactato, L-lactato e citrato. Estes compostos são
responsáveis por reduzir o pH da bebida após a fermentação e conferem aromas frutados,
amanteigados ou de queijo (REITENBACH, 2016).
A produção de álcoois superiores por leveduras ocorre através da descarboxilação de
ácidos orgânicos da biossíntese de aminoácidos seguida de redução de aldeídos pela
desidrogenase alcoólica. A presença de álcoois superiores confere aroma alcoólico e ou de
solvente à cerveja (HUMIA, 2019).
Os ésteres são os mais importantes compostos aromáticos presentes na cerveja, muitas
vezes determinando seu aroma final. São formados na fermentação pela esterificação de ácidos
graxos pelo etanol e em menores quantidades pela esterificação de álcoois superiores. A cerveja
pode conter até sessenta ésteres diferentes, porém, cerca de seis são determinantes no aroma da
cerveja, como acetato de etila, acetato de isoamila, acetato de isobutila, caproato de etila e β-
fenilacetato, conferindo aromas e sabores florais e frutados à cerveja (KUNZE, 2010).
O acetaldeído é o precursor imediato da síntese do etanol. Quantidades significativas
passam para o mosto fermentado e são reabsorvidas, no final da fermentação. Presente em
excesso proporciona um sabor de amônia na cerveja. A fermentação em altas temperaturas e a
superdosagem de fermento podem ocasionar um aumento no teor de acetaldeído (XU, 2019.;
YANG, 2019.)
Os compostos 2,3-butanodiona (comumente denominado diacetil) e a 2,3-pentanodiona
introduzem na cerveja um aroma e um gosto descritos muitas vezes como idênticos ao da
manteiga. O diacetil bem como a 2,3-pentanodiona são produzidos em grande quantidade nas
fases iniciais da fermentação, a partir de produtos intermediários da biossíntese dos
aminoácidos valina e isoleucina, sendo os compostos intermediários excretados para fora da
célula onde sofrem oxidação para diacetil e 2,3-pentanodiona podendo ser absorvidas
novamente pelas leveduras que as reduzem a 2,3-butanodiol e 2,3-pentanodiol (PIRES, 2015)
A presença de compostos fenólicos, como o 4-vinil-guaiacol e 4-vinil-fenol, são
imprescindíveis para alguns estilos de cervejas, produzindo aromas que lembram cravo e
especiarias. O gene phenolic off-flavor (POF) responsável pela produção destes compostos está
presente em leveduras de alta e baixa fermentação assim como em leveduras selvagens, porém
somente as selvagens e de alta fermentação expressão tal gene, sendo capazes de produzir
 19

compostos fenólicos. A síntese destes compostos é dependente de precursores como o ácido

ferúlico, que são extraídos do malte durante a produção do mosto cervejeiro (LENTZ, 2018;
ESSLINGER, 2009).
O dióxido de enxofre é produzido durante a fermentação primária e atua como um
antioxidante natural, aumentando a estabilidade organoléptica da cerveja finalizada. A síntese
de dióxido de enxofre está relacionada como metabolismo de compostos inorgânicos ou de
aminoácidos com átomos de enxofre em sua estrutura, fornecendo um aroma de ovos podres à
cerveja. Embora o ácido sulfídrico também seja formado durante a fermentação, sua
concentração de percepção é bastante baixa, tornando-se um off-flavor apenas em
concentrações mais elevadas. Além disso, é um composto mais volátil que o dióxido de enxofre,
sendo arrastado junto com o CO2 e outros gases. (WHITE & ZAINASHEFF, 2010; WUTTKE,
2018).

1.4 Água, malte, lúpulo

Compondo a maior parte em massa da cerveja, a água carece de cuidados para seu
emprego na produção de cerveja. A água cervejeira deve ser livre de turbidez, sendo filtrada
anteriormente para remoção de partículas sólidas, ter seu potencial hidrogeniônico (pH)
ajustado, pois este interfere diretamente na atividade enzimática durante a produção do mosto
e ter a concentração de determinados minerais conhecida e ajustada, como Cálcio, Magnésio,
Zinco e Cloretos (KUNZE, 2010).
O processo de malteação da cevada, um cereal de gramíneas do gênero Hordeum sp., da
origem outro insumo cervejeiro, o malte de cevada. A malteação da cevada consiste em três
etapas começando pela maceração dos grãos, que fornece água que possibilita o início da
germinação da cevada, processo que ocorre em caixas com controle de umidade, oxigênio e gás
carbônico e por fim a secagem, que torna o malte estável, possibilitando sua estocagem (COOK,
2013; HUDSON, 1986).
O lúpulo, a inflorescência da planta fêmea de Humulus lupulus, contém substâncias que
conferem aroma e amargor a cerveja, como ácidos e resinas. Cultivado em diversas regiões do
globo, as flores passam por processo de secagem à uma composição de água entre 8 a 12%,
para evitar degradação de suas propriedades (KUNZE, 2010). Além de aroma e amargor,
diversas substâncias presentes no lúpulo fornecem controle microbiológico ao mosto cervejeiro
devido sua ação antimicrobiana (ZANOLI et al, 2008).
 20

1.5 A produção de cerveja

A produção de cerveja pode ser dividido em etapas sequenciais, como demonstra a

figura 3, são elas a moagem dos grãos, mosturação, clarificação, fervura, resfriamento, aeração,
fermentação, maturação, filtração e envase (ALMEIDA; SILVA, 2005).
Essa sequência de etapas envolve muito conhecimento teórico e prático, pois estão
envolvidas diversas reações químicas e bioquímicas, necessitando de um cuidadoso
acompanhamento (MORADO, 2009). O processo fabril pode ser dividido em dois grandes
grupos, denominados de parte quente ou cozinha de brassagem e parte fria também chamada
de adega.

Figura 3 - Fluxograma básico do processo de produção de cervejas.

Fonte: (TOZETTO, 2017)

A produção de cerveja começa com a moagem do malte, este processo consiste na

exposição do endosperma do grão ao meio líquido facilitando a ação enzimática. Uma série de
considerações devem ser levadas em conta durante o processo de moagem, como a correta
pesagem da quantidade de malte calculada durante na formulação da receita assim como a
moagem deve ser feita sem a trituração excessiva do malte, visto que os moinhos de grãos são
calibrados na maioria dos casos para 0,8 mm de distância dos rolos, assim preservando a casca
dos grãos.
 21

Após a moagem, o malte é misturado com água e mantido em temperaturas de atuação

enzimática na degradação do amido, processo denominado mosturação. O principal objetivo
desta etapa é utilizar as enzimas produzidas durante a malteação e presentes no grão de cevada,
como α-amilase e β-amilase, celulases, e α-glicosidases que catalisam a degradação dos
polissacarídeos, como a amilose, amilopectina e a celulose em açúcares fermentáveis
(GUERRA, 2009).
Com a conversão total do amido, o mosto cervejeiro é clarificado através de sua
recirculação pela cama de malte que retém partículas insolúveis, ficando presas nas cascas do
malte (MORADO, 2009).
O mosto então clarificado passa para a fervura à temperatura próxima de 100 ºC, etapa
onde ocorre a adição do lúpulo e importantes alterações na composição do mosto, como a
evaporação de água, desnaturação de enzimas, formação e precipitação de proteínas e
polifenóis, acidificação e aumento da coloração do mosto (KUNZE, 2010).
Após a fervura o mosto é rapidamente resfriado para a temperatura de fermentação
definida para a cerveja com ajuda de trocadores de calor e em seguida oxigenado, a fim de
disponibilizar uma quantidade inicial mínima de oxigênio dissolvido no meio, elemento
importante para a formação de esteróis e ácidos graxos componentes de membrana plasmática
das leveduras, dando início ao processo fermentativo (WHITE & ZAINASHEFF, 2010).
Durante a fermentação ocorre o consumo dos açúcares presentes no mosto pelas
leveduras, processo no qual é gerado álcool, gás carbônico e outros compostos secundários que
contribuem com o aroma e sabor da cerveja finalizada.
Aproximadamente 90% dos sólidos solúveis presentes no mosto cervejeiro são
carboidratos, sendo a glicose, maltose e maltotriose os mais abundantes, como demonstra a
Tabela 1.

Tabela 1 - Composição de carboidratos presentes no mosto cervejeiro (STAMBUK et al.,

2006)
Carboridrato Porcentagem estimada (%)
Glicose, fructose e sacarose 10 - 20
Maltotriose 15 – 20
Maltose 50 - 60

Com o término da fermentação a cerveja passa para a etapa de maturação, que ocorre
em temperaturas próxima à 0ºC para facilitar a sedimentação do fermento e de partículas
insolúveis, sendo importante também para a estabilidade coloidal e sensorial da cerveja
 22

finalizada. É também durante a maturação que alguns compostos secundários de fermentação

são reabsorvidos pelas leveduras, aprimorando o sensorial da cerveja (ESSLINGER, 2009).
Por fim, após a maturação a cerveja já finalizada segue para o seu envase. Na indústria,
juntamente ao envase a cerveja passa por processos de estabilização microbiológica, como a
pasteurização, visando um maior tempo de prateleira.

1.6 Bioquímica do processo de fermentação de cervejas

Uma vez adicionadas as leveduras no mosto oxigenado, tem inicio o processo

fermentativo, que pode ser divido em três fases: adaptativa (lag), exponencial (log) e
estacionária formando uma curva de crescimento similar a ilustrada na figura 4 (HELD, 2010).

Figura 4 - Curva de crescimento típico durante a fermentação (HELD, 2010).

Durante a fase lag, a levedura irá adaptar-se ao meio e iniciar seu ciclo de divisão
celular. Ela utilizará suas reservas de glicogênio como fonte de energia, bem como o oxigênio
presente no mosto, para promover a formação do ergosterol, componente essencial da
membrana celular, e se multiplicar (PUT, 2012).
Na fase exponencial, os açúcares presentes no mosto são utilizados na via
fermentativa, sendo convertidos em etanol e gás carbônico. Na presença de oxigênio,
normalmente prevalece o ciclo respiratório entretanto, em ambientes em que há altas
concentrações de açúcares, como o mosto cervejeiro, ocorre a fermentação, mesmo na presença
de oxigênio, fenômeno chamado de Efeito Crabtree (PRONK et al., 1996).
As leveduras utilizam mais facilmente alguns açúcares do que outros. Por isso,
possuem preferência pelos açúcares mais simples, com a fermentação destes ocorrendo na
seguinte ordem: glicose, frutose, sacarose, maltose e maltotriose (PALMER, 2006).
A capacidade em fermentar os açúcares do mosto cervejeiro é variável entre as
diferentes linhagens de leveduras. Esta característica, específica de cada linhagem, juntamente
a outros fatores como a quantidade e a qualidade dos nutrientes disponíveis no mosto, a
 23

temperatura e o pH do processo determinarão a performace da fermentação, refletindo no teor

alcoólico e nos compostos formados, os quais darão diferentes sabores e aromas à cerveja
(WHITE & ZAINASHEFF, 2010).
Durante a fase estacionária, o crescimento da população cessa, a atividade
fermentativa diminui e as leveduras reabsorvem alguns dos compostos de aroma,
“amadurecendo” e equilibrando o aroma da cerveja (PALMER, 2006).
 24

2 OBJETIVOS

2.1.1 Objetivo Geral

Isolar leveduras Saccharomyces cerevisiae de frutos de Citrus spp. e determinar a

capacidade de fermentação do mosto cervejeiro pelos isolados para utilização na produção de
cervejas artesanais.

2.1.2 Objetivos Específicos

1. Coletar e isolar leveduras de frutos de Citrus spp.;

2. Analisar a capacidade de atenuação dos açúcares do mosto cervejeiro;
3. Produzir cervejas com as cepas isoladas;
4. Identificar, utilizando ferramentas de biologia molecular, as leveduras isoladas;
5. Selecionar cepas de Saccharomyces cerevisiae por testes de exclusão;
 25

3 MATERIAIS E MÉTODOS

Neste trabalho foram utilizados os seguintes meios de cultura: mosto cervejeiro sem
lúpulo (extrato líquido de malte pilsen com densidade de 10 ºbrix produzido por Iomerê, Brasil),
caldo YPD 2% (1% p/v extrato de levedura, 2% p/v peptona bacteriológica; 2% p/v de glicose),
meio de cultura sólido em placas de petri TeckLev#03 (isolamento de leveduras totais) e
TeckLev#06 (isolamento de leveduras não Saccharomyces) produzidos por LevTeck
Tecnologia Viva, Brasil. Todos os meios de cultura passaram por processo de esterilização em
autoclave à 1,1 atm e 121ºC por 20 minutos.
Os ajustes de extrato do mosto foram feitos com auxílio de refratômetro óptico marca
ATC modelo RTC-100. As medições de extrato original(ºP), extrato real (%p/p), extrato
aparente (%p/p), álcool (%v/v), e atenuação aparente (%) foram realizadas em medidor de
álcool e extrato ALEX 500 da austríaca Anton Paar.

3.1 Coleta dos frutos e isolamento

As amostras de frutos foram coletadas no mês de agosto de 2018 nos arredores da

empresa Levteck Tecnologia Viva no bairro Vargem Pequena, Florianópolis, Santa Catarina.
Os frutos foram transportados em saco plástico estéril e levados ao fluxo laminar para serem
inoculados em 500 mL de mosto cervejeiro estéril e sem lúpulo e incubados por cinco dias à
28ºC.
Após período de incubação, foram retirados 50 mL de mosto de cada amostra para
medição do consumo de açúcares em medidor de álcool e extrato digital. Com o resultado
positivo para o consumo dos açúcares do mosto, uma amostra foi retirada após homogenização
para plaqueamento.
A amostra foi diluída até 10.000 vezes em solução salina (NaCl 0,9%) sendo 0,1 mL de
cada diluição utilizadas para plaqueamento em superfície com alça de Drigalski em meio
TeckLev#03 e incubadas em estufa microbiológica à 28ºC por 72 horas.
As colônias que apresentaram características macro morfológicas de Saccharomyces.
cerevisae (bordas arredondadas e colônias circulares e elevadas, coloração bege e ausência de
produção de ácido) foram repicadas na forma de carimbo em placas de TeckLev#03 e
TeckLev#06, como exemplificado na figura 5.
Após 72 horas de incubação foram comparados o crescimento das colônias nos
diferentes meios, sendo selecionadas as colônias que não apresentaram crescimento em meio
 26

TeckLev#06. As colônias selecionadas foram nomeadas com o prefixo LY seguido do número

relativo a sua posição nas placas de carimbo e novamente repicadas em 10 mL de meio YPD
2% líquido para posterior utilização e armazenamento em freezer -80 ºC.

Figura 5 - Esquema da técnica de carimbo em meios Tecklev#03

e Tecklev#06.

3.2 Teste de fermentação de mosto cervejeiro e contagem celular

3.2.1 Teste de fermentação em bancada de mosto cervejeiro

Uma unidade formadora de colônias de cada cepa isolada foram inoculadas em tubos
contendo 10 mL de caldo YPD 2% e incubadas por 72 horas à 28ºC. Após incubação os tubos
foram vertidos em frascos Erlenmeyer contendo 250 mL de mosto cervejeiro sem lúpulo
(Extrato líquido de malte pilsen Iomerê, Brasil) com extrato ajustado para 12º Brix.
Os frascos foram tampados com luvas de procedimento, afim de criar um ambiente
anaeróbio para fermentação. Terminada incubação de 72 horas a 28ºC foi realizada medição
dos parâmetros após fermentação, sendo eles o extrato original (ºP), extrato real (%p/p), extrato
aparente (%p/p), álcool (% v/v) e atenuação aparente (%).

3.2.2 Contagem de células dos testes de fermentação em bancada

Com o término da incubação dos testes de fermentação em bancada foram realizadas

contagem de células em câmera de Neubauer das amostras que apresentaram consumo dos
açucares do mosto.
As amostras foram diluídas 10 vezes para contagem, sendo 5 vezes em solução de ácido
sulfúrico na concentração 7N para desagregação celular e 2 vezes em azul de metileno para
análise de viabilidade celular (SAMI; IKEDA; YABUUCHI, 1994).
 27

3.2.3 Produção de cerveja utilizando os isolados

Para este teste foi produzido mosto cervejeiro puro malte em equipamento elétrico para
produção de cervejas Beermática da empresa catarinense Vitória Beer, de Palhoça, com
capacidade de produção de até 30 litros de mosto cervejeiro (Figura 6)

Figura 6 - Produção de mosto cervejeiro utilizando equipamento elétrico

(Beermática)

O mosto produzido possuia como composição de grãos 85,7% (p/p) de malte Pilsner e
14,3% (p/p) de malte Cara-pils, ambos da maltearia alemã Weyerman, sendo a mostura feita
em rampas de temperatura visando obter um mosto com maior concentração de açúcares
fermentaveis pelas leveduras e com extrato original em 12 ºP (Tabela 2).

Tabela 2 - Patamares de temperatura por tempo executadas durante a produção do mosto

cervejeiro.
Rampa Temperatura (ºC) Tempo (min)
Adição dos grãos 64 -
Beta-amilase 62 45
Alfa-amilase 72 15
Inativação (mash-out) 78 10

Buscando evidênciar o perfil aromático produzido pelas diferentes cepas de leveduras,

optou-se por utilizar o lúpulo alemão Hallertau Magnum (Barth-Haas) no inicio da fervura de
60 minutos, produzindo um mosto com 18 IBU e baixo perfil de aroma e amargor provenientes
do lúpulo.
 28

Como inóculos foram utilizados os testes de fermentação em bancada de mosto cervejeiro

sendo estes inoculado em baldes alimentícios contendo 3 litros do mosto e as fermentações
mantidas na temperatura de 20ºC por 7 dias.
A quantidade de células necessárias para a etapa de fermentação é obtida do produto da
concentração de inóculo (106 céls/mL) pelo volume de mosto (mL) pelo extrato original (ºP)
sendo taxa de inóculo usada de referência para cervejas ales é de 0,75 x 106 céls/mL por mililitro
de mosto, assim, a quantidade de células necessárias para este experimento seria de 27 x 106
céls/mL. (WHITE & ZAINASHEFF, 2010).
Devido a capacidade de produção de 30 litros de mosto do equipamento utilizado, as
produções de cerveja com os isolados foram dividas em quatro bateladas e o mosto de cada
batelada teve seus parâmetros de extrato original, extrato real e extrato aparente mensurados
previamente ao inóculo dos isolados.
Após 7 dias de fermentação os baldes foram encaminhados para maturação à 4ºC por mais
7 dias. Terminada a maturação uma amostra de cada fermentação foi retirada para medição dos
parâmetros após fermentação e envasadas, utilizando 5 g/L de açucar refinado para
refermentação na garrafa em temperatura ambiente.

3.3 Identificação e quantificação molecular dos isolados

As cepas selecionadas foram inoculadas em 10 mL de meio YPD 2% e incubadas à

28ºC por 48 horas. Após crescimento, os tubos foram misturados em um recipiente estéril e
enviadas para análise de Diagnóstico Microbiológico Digital (DMD) realizado pela empresa
Neoprospecta Microbiome Technologies, com sede em Florianópolis, Santa Catarina.
A caracterização genotípica dos isolados selecionados foi realizada por meio do
sequenciamento da região do espaçador interno transcrito (ITS). A região do ITS é uma
sequência que está localizada entre os genes que codificam a subunidade menor (RNAr 16S) e
maior (RNAr 23S) do ribossomo de eucariontes. Em fungos esta região é rica em inserções e
deleções e sofre evolução mais rápida do que outras regiões, e isto a torna uma sequência de
grande importância que permite detectar variações entre gêneros, espécies e, inclusive, dentro
de populações (SCHOCH et al., 2012).
Métodos tradicionais de sequenciamento e identificação utilizados em microbiologia
possuem a capacidade de identificar um micro-organismo por vez (em diferentes níveis
taxonômicos), utilizando etapas de cultura. O DMD foi desenvolvido com o objetivo de romper
 29

esse paradigma, identificando os microrganismos diretamente da amostra por meio de seu

DNA, sem a necessidade de etapa de cultura.
O DMD tem como princípio a utilização do marcadores genéticos para a identificação
de fungos, neste caso a região ITS1, utilizando como base as novas tecnologias de
sequenciamento de DNA de alto desempenho. A metodologia possui duas etapas sendo a
primeira a etapa laboratorial que compreende a extração e purificação do DNA, preparo
molecular da amostra e sequenciamento do DNA seguido das etapas computacionais, que
consistem em análises de bioinformática e a implementação dos dados na plataforma de
visualização utilizada pela empresa.

3.4 Seleção dos isolados de Saccharomyces cerevisae por teste de crescimento em meio
com alta concentração salina

Os testes moleculares identificaram que a amostra de isolados é composta por duas

espécies de leveduras sendo elas Meyerozyma caribbica e Saccharomyces cerevisiae.
Kurtzmann (2011) descreveu que a espécie Meyerozyma caribbica possui capacidade de
crescimento em meio de alta concentração salina (10% NaCl 5% glicose), característica ausente
para espécies de Saccharomyces cerevisiae, como descrita por Vaughan-Martini (2011), assim,
o crescimento em meio com alta concentração salina foi utilizado para selecionar possiveis
espécies de Saccharomyces cerevisiae.
Para a análise da capacidade de crescimento em meio com alta concentração salina as
cepas foram primeiramente inoculadas em meio líquido YPD 2% e incubadas por 48 horas à
28 ºC. Após incubação, uma aliquota de 0,1 mL da suspenção celular foi utilizado para
plaqueamento em superfície utilizando alça de Drigalski em meio sólido com composição de
10% (p/v) de NaCl, 5% (p/v) de glicose, 1% (p/v) de extrato de levedura e 2% (p/v) de peptona
bacteriológica e incubados por 21 dias á 28ºC.
A tolerância à salinidade dos isolados foi considerada negativa (-) com a ausência total
de unidades formadoras de colônias (UFC), e positivo (+) para os isolados que não
apresentaram inibição do crescimento.
Os isolados que não apresentaram capacidade de crescimento em meio com alta
concentração salina passaram por nova análise molecular (DMD) visando a confirmação destas
cepas como pertencentes à espécie Saccharomyces cerevisiae.
 30

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Coleta dos frutos, inóculo e isolamento

Foram coletados 3 frutos de limão-galego com aparência madura e com escoriações na

superfície e inoculados em três frascos Erlenmeyer contendo 500 mL do mosto. Apenas um dos
frascos apresentou características de fermentação (Limão-galego I), como formação de gás
carbônico e espuma, sendo constatado o consumo dos açucares do mosto, como demonstrado
na Tabela 3.

Tabela 3 - Consumo de açúcares do mosto cervejeiro sem lúpulo inoculados com frutos de
Citrus × limonia.
Extrato Extrato
Extrato real Álcool (% Atenuação aparente
Amostra original aparente
(%p/p) v/v) (%)
(°P) (%p/p)
Mosto original 11,21 10,44 10,25 - -
Limão-galego I 8,39 2,66 1,30 3,68 84,55
Limão-galego II 10,96 10,38 10,24 0,38 6,58
Limão-galego III 10,69 10,41 10,34 0,18 3,29

Após as diluições em meio TeckLev#03, foram obitidas um total de 144 colônias com
morfologia compatíveis com as estabelecidas previamente, sendo 26 colônias obtidas na
diluição de 10.000 vezes e 118 colônias obtidas na diluição de 1.000 vezes. As colônias
selecionadas passaram por repique tipo carimbo nos meios TeckLev#03 e TeckLev#06, como
descrito no item 4.1.
Das 144 colônias selecionadas apenas 28 não apresentaram crescimento em meio
TeckLev#06 que contém um inibidor de leveduras cervejeiras, indicando a possibilidade destas
cepas pertencerem à espécie S. cerevesiae. Nenhuma das 28 cepas isoladas apresentaram
produção de ácido e corresponderam a 19,44% do total de cepas isoladas.
A alta prevalência pode se dar pelo fato das condições de isolamento realizadas neste
trabalho serem análogas às da produção de cervejas, onde o mosto cervejeiro exerce pressão
seletiva, já que maltose e maltotriose não se encontram na natureza em altas concentrações e
um metabolismo eficiente destes açúcares impõe vantagens seletivas (GALLONE, 2018).
 31

4.2 Teste de fermentação de mosto cervejeiro e contagem celular

4.2.1 Fermentação em bancada do mosto cervejeiro

A estratégia de utilizar luvas de procedimento e mosto oriundo de extrato facilitou o

processo de triagem das leveduras que apresentaram capacidade fermentativa, sendo uma
estratégia de baixo custo e facilidade de aplicação, como pode ser visto na figura 7.

Figura 7 - Luvas de procedimentos infladas devido a produção de gás

carbônico durante da fermentação do mosto cervejeiro

Na Tabela 4 estão os dados de fermentação em bancada das cepas isoladas, mostrando

os valores obtidos de extrato original (ºP), extrato real (%p/p), extrato aparente (%p/p), álcool
(%v/v) e atenuação aparente (%).
A atenuação aparente demonstra a capacidade de utilização dos açúcares presentes no
mosto cervejeiro pelas cepas isoladas. A eficiência no processo de produção de cervejas está
diretamente relacionada à capacidade das leveduras em fermentar os açúcares do mosto, como
glicose, maltose e maltotriose e também a formação dos compostos de aroma e sabor que
compõe a bebida (STAMBUK et al., 2006).
 32

Tabela 4 - Consumo de açúcares após 72 horas de incubação em fermentação de bancada.

Extrato Extrato Extrato

Álcool Atenuação
Amostra original real aparente
(%) aparente (%)
(°P) (%p/p) (%p/p)
LY#34 12,07 4,52 2,72 4,98 77,47
LY#36 12,59 5,36 3,63 4,80 71,19
LY#38 12,02 5,06 3,40 4,60 71,73
LY#39 11,76 4,19 2,38 4,98 79,73
LY#42 12,79 5,24 3,44 5,02 73,10
LY#43 12,80 5,45 3,69 4,88 71,20
LY#44 12,77 5,43 3,67 4,88 71,24
LY#45 13,08 5,62 3,84 4,98 70,65
LY#48 11,27 4,15 2,45 4,66 78,27
LY#49 12,73 5,72 4,03 4,68 68,32
LY#50 12,41 5,58 3,93 4,56 66,60
LY#51 12,26 5,51 3,88 4,51 65,80
LY#52 12,36 5,55 3,91 4,54 66,33
LY#53 12,19 5,48 3,86 4,48 65,42
LY#54 11,06 4,07 2,40 4,58 78,27
LY#55 10,77 3,19 1,38 4,94 87,17
LY#56 11,00 3,23 1,38 5,06 87,43
LY#57 10,84 3,95 2,30 4,52 78,76
LY#58 12,43 10,85 10,45 1,08 15,90
LY#59 12,24 11,04 10,74 0,82 12,26
LY#61 10,58 3,71 2,08 4,48 80,38
LY#62 11,17 3,47 1,64 5,02 85,31
LY#64 11,17 5,92 4,66 3,46 58,30
LY#98 11,24 4,66 3,08 4,34 72,58
LY#100 10,95 6,62 5,57 2,86 49,10
LY#101 11,03 5,83 4,58 3,42 58,44
LY#105 10,92 5,18 3,80 3,78 65,22
𝑥̅ 11,80 5,60 4,10 4,08 70,45
σ 0,77 1,81 2,16 1,08 17,46
 33

Dois isolados, LY#58 e LY#59 não apresentaram capacidade de fermentação do mosto

cervejeiro, visto que a atenuação aparente dos isolados, 15,90 % e 12,26 % respectivamente,
indicam a incapacidade de utilizar açúcares complexos que se encontram em maior
concentração no mosto, como maltose e maltotriose, e foram descartados dos próximos testes.
Os isolados LY#64, LY#100 e LY#101 apresentaram atenuação aparente inferiores a
60% (58,30; 49,10 e 58,44 respectivamente), no entando apresentaram capacidade de atenuar
cerca de metade dos açúcares do mosto, assim, a baixa capacidade atenuativa destes isolados
pode ser referente ao curto tempo de fermentação utilizado neste teste, mantido em incubação
por três dias.
Do total de 28 cepas, 22 delas (78,57%) apresentaram atenuação aparente superiores a
60%, indicando capacidade de utilização dos açucares presentes no mosto cervejeiro,
principalmente a maltose que compõe a maior parte dos carboidrados do mosto.
Lopes (2016) encontrou uma incidência de 26,47% das cepas isoladas com capacidade
de fermentação de maltose em testes de fermantação de diferentes fontes de carbono, analisando
separadamente a capacidade de utilização de glicose, sacarose e maltose.
Leveduras como a Saccharomyces cerevisiae, possuem uma ordem preferencial na
utilização dos carboidratos, glicose e frutose são os primeiros substratos a serem utilizados pelas
células, seguido de sacarose, maltose e, por fim, a maltotriose.

4.2.2 Contagem celular dos testes de fermentação em bancada

Apenas as cepas LY#58 E LY#59 não apresentaram capacidade de fermentação em

bancada, assim não foram realizadas contagem celular destas cepas. A Tabela 5 possui os
valores de concentração celular (106 células/mL), viabilidade celular (%), quantidade total de
células (109 células) obtidas e a taxa de inóculo (106 células/mL/ºP).
Em relação a viabilidade celular, 15 cepas apresentaram 100% de viabilidade e apenas
as cepas LY#56 (91,76%), LY#36 (92,47%) e LY#42 (94,90%) apresentaram viabilidade
inferior à 95%, valor mínimo para leveduras líquidas indicados para uma fermentação saudável
(WHITE & ZAINASHEFF, 2010).
 34

Tabela 5 - Dados de concentração celular (106 células/mL), viabilidade (%), quantidade de

células (109 células) e taxa de inóculo (106 céls/mL/ºP) obtida com a contagem em câmara de
Neubauer dos testes de fermentação em bancada.

Quantidade de Taxa de inóculo

Concentração Viabilidade
Amostra células obtida
(106 células/mL) (%)
(109 células) (106 céls/mL/ºP)
LY#34 72,0 98,63 18,0 0,50
LY#36 67,5 92,47 16,9 0,47
LY#38 68,5 96,48 17,1 0,47
LY#39 58,5 100 14,6 0,42
LY#42 74,5 94,9 18,6 0,53
LY#43 77,5 100 19,4 0,53
LY#44 54,5 100 13,6 0,39
LY#45 90,5 100 22,6 0,64
LY#48 98,0 98,99 24,5 0,69
LY#49 65,0 100 16,3 0,44
LY#50 68,5 97,86 17,1 0,47
LY#51 71,5 100 17,9 0,50
LY#52 98,0 100 24,5 0,69
LY#53 86,5 100 21,6 0,61
LY#54 156,5 96,9 39,1 1,08
LY#55 121,5 97,59 30,4 0,83
LY#56 78,0 91,76 19,5 0,56
LY#57 150,0 95,54 37,5 1,06
LY#61 37,5 100 9,4 0,25
LY#62 96,5 100 24,1 0,67
LY#64 47,0 100 11,8 0,33
LY#98 48,5 100 12,1 0,33
LY#100 59,0 100 14,8 0,42
LY#101 57,5 100 14,4 0,39
LY#105 63,5 100 15,9 0,44
 35

O estado fisiológio das leveduras é crucial para a fermentação de cervejas, sendo que
fatores que afetem seu crescimento e metabolismo podem facilmente alterar a qualidade
organoléptica da cerveja finalizada. Alterações em parâmetros como a viabilidade e a taxa de
inóculo podem resultar em mudanças significativas nos aromas e sabores finais da cerveja
(GUIDO et al. 2004; VERBELEN et al. 2008).
As cepas LY#54 e LY#61 apresentaram respectivamente a maior e menor
concentração celular após a fermentação em bancada , 157 x 106 e 37,5 x 106 céls/mL
respectivamente. Apenas os isolados LY#54, LY#55 e LY#57 alcançaram taxas de inóculo
superiores ao de referência para cervejas ales, que é de 0,75 x106cel/ml/°P como descrito por
White & Zainasheff (2010).
O fato de poucos isolados alcançarem a quantidade de células necessárias para uma
fermentação de cerveja ale pode ser consequência da propagação ter ocorrido em ambiente
anaeróbio criado com o uso de luvas de procedimento, limitando o fornecimento de oxigênio
para as vias de produção de componentes de membrana celular.

4.2.3 Produção de cerveja utilizando os isolados

Para a produção de cervejas foram utilizados um total 25 cepas diferentes, sendo que
LY#58 e LY#59 foram excluidas por não apresentarem capacidade de fermentação do mosto
cervejeiro em experimento de bancada.
Tendo como extrato original esperado de 12 ºP os valores da média (𝑥̅ ) e desvio padrão
(𝜎) do extrato original (𝑥̅ = 12,17 e σ = 0,33), extrato real (𝑥̅ = 11,40 e σ = 0,27 ) extrato
aparente (𝑥̅ = 11,21 e σ = 0,25) obtidos nas quatro produções de mosto cervejeiro,
demonstrados na Tabela 6, indicam pouca variação entre as bateladas, sendo possível considerar
que todas as cepas foram inoculadas em mosto semelhante.
Na Tabela 7 estão expressos os valores obtidos após a fermentação do mosto cervejeiro
durante o experimento de produção de cerveja com os isolados. O extrato original obtido por
cada isolado após a fermentação apresentou média 𝑥̅ = 11,91±0,93 e evidenciam a pouca
variação entre os mostos utilizados pelos isolados para produção de cerveja.
As cepas LY#101 e LY#55 apresentaram o maior e menor valores tanto de extrato real
(Er = 6,17 e Er = 2,99) quanto para extratato aparente (Ea = 4,68 e Ea = 1,23). A quantidade de
extrato residual na cerveja está relacionado com o corpo da cerveja, pois indica a quantidade de
açúcares, dextrinas e proteínas restantes na cerveja após a fermentação (ESSLINGER, 2009).
 36

Tabela 6 - Valores de extrato original (ºP), extrato real (% p/p), extrato aparente (% p/p) e suas
respectivas médias e desvio padrão resultante das quatro produções de mosto.

Mosto Extrato original (°P) Extrato real (%p/p) Extrato aparente (%p/p)
I 12,64 11,73 11,50
II 11,94 11,21 11,02
III 11,78 11,08 10,90
IV 12,32 11,59 11,40
̅
𝒙 12,17 11,40 11,21
σ 0,33 0,27 0,25

Em relação à produção de álcool pelos isolados, LY#39 e LY#49 apresentaram o maior

valor para este parâmetro (5,98) enquanto LY#101 demonstou a menor capacidade de produção
de álcool (4,16%) .
A eficiência na produção de álcool pode ser prejudicada pela produção excessiva de
compostos secundários como o glicerol, sendo que a produção de glicerol por leveduras
Saccharomyces cerevisiae varia entre as estirpes e a eliminação da produção de glicerol e
redirecionamento das fontes de carbono para a via de produção e etanol pode aumentar sua
produção em até 10% (NEVOIGT, 2008).
Do total de 25 isolados utilizados, 20 cepas apresentaram atenuação aparente superior
a 80%, com LY#64 obtendo o maior valor (88,34%), 3 cepas apresentaram atenuação aparente
entre 70% e 80% e 2 cepas com atenuação entre 60% e 70%, sendo que LY#101 demonstrou o
menor valor de atenuação (62,31%).
Nem todas as linhagens de leveduras são capazes de expressar os genes essenciais ao
transporte e à regulação da fermentação de sacarídeos mais complexos, como a maltose. Uma
vez permanecendo na cerveja produzida, este açúcar residual irá conferir à bebida sabores
atípicos, além da baixa concentração de etanol (STAMBUK et al., 2006).
A capacidade fermentativa do mosto cervejeiro é um parâmetro muito importante para
a produção de cervejas, além da importância econômica em termos de perda de eficiência no
uso de substrato pelas leveduras e baixo teor alcóolico, a incompleta utilização dos açúcares
resultam em cervejas com maior risco de contaminação (PIDDOCKE, 2009).
Como todos isolados apresentaram capacidade de fermentação do mosto cervejeiro
não foi possivel utilizar este critério para separar as cepas entre as duas espécies identificadas
pelo ensaio molecular.
 37

Tabela 7 - Valores de extrato original (ºP), extrato real (%p/p), extrato aparente (%p/p), álcool
(%v/v) e atenuação aparente (%) obtidos com a produção de cerveja com os isolados.
Extrato
Extrato Extrato real Álcool Atenuação aparente
Amostra aparente
original (°P) (%p/p) (%) (%)
(%p/p)
Mosto I 12,64 11,73 11,50 - -
LY#34 12,90 4,03 1,93 5,86 85,07
LY#36 13,16 4,31 2,20 5,86 83,24
LY#38 13,08 4,48 2,43 5,70 81,40
LY#39 12,99 3,94 1,79 5,98 86,20
LY#42 12,97 4,13 2,04 5,84 84,30
LY#43 11,35 3,29 1,37 5,28 87,91
LY#44 12,91 4,09 1,99 5,84 84,58
Mosto II 11,94 11,21 11,02 - -
LY#45 11,50 3,70 1,84 5,10 83,98
LY#48 11,44 3,54 1,66 5,18 85,46
LY#49 13,21 4,18 2,03 5,98 84,61
LY#50 10,80 3,36 1,59 4,84 85,26
LY#51 11,57 3,37 1,42 5,38 87,73
LY#52 11,53 3,56 1,67 5,22 85,53
LY#53 11,50 3,31 1,36 5,36 88,15
Mosto III 11,78 11,08 10,90 - -
LY#54 10,41 3,69 2,09 4,38 79,96
LY#55 10,37 2,99 1,23 5,08 88,17
LY#56 10,36 3,00 1,25 4,78 87,95
LY#57 10,79 3,76 2,09 4,60 80,64
LY#62 10,95 3,14 1,28 5,08 88,30
Mosto IV 12,32 11,59 11,40 - -
LY#61 12,39 5,07 3,32 4,86 73,23
LY#64 12,28 3,51 1,43 5,76 88,34
LY#98 12,29 5,69 4,11 4,38 66,55
LY#100 12,26 4,64 2,81 5,04 77,05
LY#101 12,41 6,17 4,68 4,16 62,31
LY#105 12,29 4,07 2,11 5,42 82,82
̅
𝒙 11,91 3,96 2,07 5,24 82,75
σ 0,93 0,77 0,84 0,52 6,53
 38

4.3 Identificação e quantificação molecular dos isolados

A correta identificação das espécies, além de fundamental para o controle de qualidade

das bebidas, também é de grande importância do ponto de vista taxonômico, ajudando a
compreender as relações filogenéticas entre espécies.
No presente estudo, foram encontradas duas espécies de leveduras identificadas como
Saccharomyces cerevisiae e Meyerozyma caribbica a partir dos frutos de limão-galego (Citrus
× limonia). A espécie Meyerozyma caribbica possui maior abundância dentre os isolados, como
demonstra a Tabela 8.

Tabela 8 - Resultado do ensaio de diagnóstico microbiológico digital para fungos através do

sequenciamento de alto desempenho da região ITS1.
Identificação Número de sequências Proporção na amostra
de DNA (%)
Meyerozyma caribbica 55.624 74,56
Saccharomyces cerevisiae 18.976 25,44

As espécies encontradas estão de acordo com o esperado provindo de frutos. As

espécies do gênero Meyerozyma são leveduras que apresentam capacidade de fermentar glicose,
sacarose, maltose e trealose, sendo encontradas em ambientes variados como solo, flores, frutas,
insetos, cana de açúcar, porém sem muita aplicação biotecnológica. (GRAÇA et al., 2015;
KURTZMAN, 2011; PELLICCIA et al., 2011).
A proporção de 74,56% de Meyerozyma caribbica na amostra sequenciada
corresponde aproximadamente 19 cepas dentro do total de 25 isolados presentes na amostra,
prevalência considerada alta se comparada com outros resultados descritos, como de Saguino
(2018) que isolou e selecionou leveduras autóctones da produção de sidra e encontrou 3 isolados
do gênero Meyerozyma spp. de um total de 8 cepas identificadas correspondendo a 37,5% da
amostra e RUIZ-MOYANO (2016) que encontrou prevalência de 10,3% de cepas de
Meyerozyma caribbica isoladas de frutos de figo (Ficus carica).
A alta capacidade fermentativa de leveduras do gênero Saccharomyces é amplamente
conhecida e essa propriedade ficou evidente pela alta prevalência de Saccharomyces cerevisiae
encontrada neste estudo, sendo que 25,44% correspondem à aproximadamente 6 cepas do total
de 25 presentes na amostra sequenciada.
Vieira (2017) isolou leveduras de casca de limão para a produção de cerveja, sendo
que somente 2,2 % das leveduras isoladas pertenciam ao gênero Saccharomyces. Lopes (2016)
 39

encontrou prevalência de 5,40 % de leveduras Saccharomyces em polpas e sucos de bergamota,

que também pertencente ao gênero Citrus spp. Guimarães (2005) também obteve a prevalência
de 2,0 % das colônias isoladas de uvas pertencentes ao gênero Saccharomyces spp..
Utilizando técnicas bem semelhantes as aplicadas neste estudo, Oliveira (2018),
também utilizando o mosto cervejeiro para inóculo dos frutas cítricas, obteve 4 espécies do
gênero Saccharomyces spp. de um total de 92 isolados, prevalência de 4,34%, no entanto a alta
prevalência de Saccharomyces cerevisiae encontrada neste trabalho pode ser devido à utilização
nas etapas iniciais de isolamento os meios de cultura específicos para leveduras Saccharomyces
cervisiae.
A comparação direta com outros trabalhos de isolamento de leveduras deve ser
considerada as diferenças metodológicas entre os estudos, visto que foram utilizados diferentes
frutos como fonte de isolamento assim como outras as técnicas de coleta, meios de cultura
utilizados, locais de coleta e o período sazonal.

4.4 Seleção dos isolados de Saccharomyces cerevisae por teste de crescimento em meio
com alta concentração salina

Apenas 4 isolados não apresentaram crescimento em meio com alta concentração

salina, demonstrado na Tabela 9, são eles LY#54, LY#98, LY#100 e LY#101 indicando a
possibilidade destas cepas pertencerem ao gênero Saccharomyces spp. visto que o esperado era
de aproximadamente 6 isolados.

Tabela 9 - Resultado do teste de crescimento em meio 10% NaCl e 5% glicose. As leituras

representam: + crescimento positivo; - ausência de crescimento.
10% NaCl 5% 10% NaCl 5%
Isolado Isolado
Glicose Glicose
LY#34 + LY#53 +
LY#36 + LY#54 -
LY#38 + LY#55 +
LY#39 + LY#56 +
LY#42 + LY#57 +
LY#43 + LY#61 +
LY#44 + LY#62 +
LY#45 + LY#64 +
LY#48 + LY#98 -
LY#49 + LY#100 -
LY#50 + LY#101 -
LY#51 + LY#105 +
LY#52 +
 40

Todos os outros isolados apresentaram crescimento, como demonstrado na figura 8,

mesmo que vestigial, ao meio formulado com alta concentração salina e foram tratados como
pertencentes ao gênero Meyerozyma spp.

LY#53 LY#101 LY#98 LY#54

Leitura = + Leitura = - Leitura = - Leitura = -

Figura 8 – Imagem representativa das placas de Petri com meio de alta

concentração salina (10% NaCl e 5% glicose) indicando a diferença entre as
leituras utilizadas na como tentativa diferenciação entre as espécies Meyerozyma
caribbica e Saccharomyces cerevisiae.
O resultado do sequenciamento de alto desempenho (DMD) realizado com os quatro
isolados selecionados pelo meio de alta concentração salina apresentou 100% de afinidade com
a espécie Saccharomyces cerevisiae, como visto na Tabela 10.

Tabela 10 - Resultado do diagnóstico microbiológico digital para fungos através de

sequenciamento de alto desempenho da região ITS1 dos isolados que apresentaram crescimento
negativo para o meio de alta concentração salina.

Identificação Número de sequências de Proporção por amostra

DNA (%)
Saccharomyces cerevisiae 46.129 100,0

4.5 Considerações sobre os isolados de Saccharomyces cerevisiae

As quatro cepas identificadas como Saccharomyces cerevisiae apresentaram valores de

atenuação aparente entre 62 e 80%. Estes valores são semelhantes ao de variedades comumente
utilizadas na produção de cervejas, como por exemplo as leveduras do tipo ale comercializadas
pela catarinense Levteck Tecnologia Viva que possuem de 65% a 83% de capacidade
atenuativa, como demonstrado na Tabela 11.
 41

Tabela 11 - Valores de atenuação aparente obtidos pelos isolados nos testes de fermentação em
bancada e na produção de cerveja em comparação com a capacidade atenuativa das principais
leveduras ale comercializadas pela empresa catarinense de fermentos Levteck Tecnologia Viva.
Atenuação aparente (%) Capacidade
Isolado Cepas comerciais
Bancada Cerveja atenuativa (%)
Abbey ale – TB40 74 – 82
LY#54 78,27 79,96
American ale – TB10 72 – 76
English ale – TB07 70 – 80
LY#98 72,58 66,55
Farmhouse saison – TB11 77 – 83
German ale – TB36 65 - 72
LY#100 49,1 77,05
London ale – TB13 71 - 75

LY#101 58,44 62,31 Weizen ale – TB68 73 - 77

Os quatro isolados podem ser dividos em dois grupos em relação aos valores obtidos
de atenuação aparente, LY#54 e LY#100 (79,96 e 77,05) como leveduras de alta atenuação e
que possívelmente possuem maior facilidade na utilização de açúcares mais complexos como a
maltotriose, podendo ser utilizados na produção de cervejas com baixo corpo e dulçor resídual
(WHITE & ZAINASHEFF, 2010).
Os isolados LY#98 e LY#101 apresentaram menor atenuação aparente (66,55 e
62,31), assim podem ser consideradas leveduras de média a baixa atenuação, assim produzindo
cervejas com maior sensação de corpo e dulçor e que intensificam aromas e sabores maltados
(WHITE & ZAINASHEFF, 2010).
A capacidade dos demais isolados de atenuar mais de 83% do mosto cervejeiro pode
ser relacionado com o fato de algumas espécies como por exemplo Brettanomyces bruxellensis,
Meyerozyma caribbica, Candida fermentati, Pichia anomala, Torulaspora delbrueckii, entre
outras de assimilar dextrinas e celobioses os quais não são utilizados por leveduras
Saccharomyces cerevisiae (BASSO, 2016).

5 CONCLUSÃO

Do total de 144 isolados obtidos com a diluição do mosto inoculado com frutos, 27
isolados não apresentaram capacidade de crescimento em meio seletivo para leveduras não
Saccharomyces, assim, o presente trabalho demonstrou que os meios de cultura TeckLev#03 e
TeckLev#06 comercializados pela empresa catarinense Levteck Tecnologia Viva são
 42

alternativas eficazes para o desenvolvimento de novas técnicas de isolamento de leveduras

voltadas para a fermentação do mosto cervejeiro.
A utilização de meios semelhantes ao mosto cervejeiro para a determinação da
capacidade de fermentação de cervejas também se mostrou uma alternativa de baixo custo e
fácil acesso para a seleção de leveduras, visto que nesre trabalho dois isolados foram
descartados pela sua incapacidade de fermentação do mosto cervejeiro.
Com os testes realizados neste trabalho foi possivel isolar 25 cepas e destas selecionar
4 cepas que pertencem a espécie Saccharomyces cerevisiae, sendo necessário novos ensaios
para caracterizar o perfil fermentativo destes isolados.
Algumas perspectivas deste trabalho incluem testes complementares como:
1. Fermentação em diferentes temperaturas;
2. Tolerância ao estresse osmótico e ao álcool;
3. Análise da produção de H2S
4. Testes de floculação;
5. Avaliação da capacidade dos isolados na produção e sensibilidade a toxinas
killer;
6. Cariotipagem das cepas selecionadas
7. Perfil aromático e análise sensorial do produto final.
A obtenção de linhagens com fenótipos desejáveis para a produção de cervejas
contribuirá para o desenvolvimento científico e tecnológico do setor, oferecendo um produto
biotecnológico nacional como alternativa ao fermento importado e conferindo mais
independência e autonomia ao mercado cervejeiro.
 43

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