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09/04/2023, 22:55 CASCA DO COCO VERDE: FONTE DE TANINO PARA CONTROLE DE COLIFORMES

Temos de fazer o melhor


que podemos. Esta é a

nossa sagrada
responsabilidade humana.
Albert Einstein

ISSN 1678-0701 · Volume XX, Número 82 · Março-Maio/2023

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Artigos
27/11/2016 (Nº 58) CASCA DO COCO VERDE: FONTE DE TANINO PARA CONTROLE
DE COLIFORMES
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CASCA DO COCO VERDE: FONTE DE TANINO PARA CONTROLE DE


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09/04/2023, 22:55 CASCA DO COCO VERDE: FONTE DE TANINO PARA CONTROLE DE COLIFORMES

COLIFORMES

Genoilson de Brito Alves1


Pedro Luiz Rodrigues Silva2
Milena Gonçalves de Oliveira3
Caroline Costa de Oliveira3
Gabriela Thais Gonçalves3
1 Biólogo, Mestre em Imunologia, Professor nos Cursos de Química e Meio Ambiente
(alvesgbio@gmail.com)
2 Engenheiro, Mestre em Físico-química, Professor do Curso de Química (pluiz@fei.edu.br)

,3 Técnicas em Química (milena.mgo@gmail.com; carolineborgs@gmail.com;


goncalvesbi@hotmail.com)
CEETEPS – Centro Estadual de Educação Tecnológica Paula Souza, ETEC Júlio de Mesquita

RESUMO
A utilização da casca de Cocos nucifera L., in natura para extração de agente ativo,
proporciona uma metodologia viável e econômica. A coleta para extração, evita o
descarte inadequado em vias públicas e reduz o volume deste resíduo sólido em
lixões e aterros, tornando-se uma alternativa sustentável. Em nosso cotidiano
estamos constantemente expostos a microrganismos, alguns com grande potencial
patogênico. A busca por novas formulações, para controle microbiano, pode amenizar
a disseminação de infecções por estes patógenos. Profissionais na área de saúde,
podem ser vetores de microrganismos devido a fixação destes nas vestimentas
utilizadas. O emprego de taninos como agente antimicrobiano, mostrou-se eficiente
no controle de bactérias Escherichia coli. A bactéria E. coli é uma importante bactéria
para os parâmetros de qualidade ambientais em diversos setores, como indústria
alimentícia, saneamento e recursos hídricos e para área de saúde. No ramo têxtil os
microrganismos formam camadas que muitas vezes levam ao descarte da matéria
prima ou do produto final.

Palavras-chave: Microrganismos, Cocos nucifera L., Tanino, Escherichia coli.

ABSTRACT
The use of Cocos nucifera L., in natura for active agent extraction, provides a viable
and economic methodology. The collection for extraction, avoid improper disposal on
public roads and reduces the volume of solid waste in dumps and landfills, making it a
sustainable alternative. In our daily lives we are constantly exposed to
microorganisms, some with great potential pathogenic. The search for new
formulations for microbial control, can mitigate the spread of infection by these
pathogens. Professionals in health care, can be vectors of microorganisms due to
fixing these in used clothing. The use of tannins as an antimicrobial agent, was
effective in the control of bacteria Escherichia coli. The bacterium E. coli is important
bacterium to environmental quality standards in various industries such as food
industry, sanitation and water resources and health. In the textile industry the
microorganisms forming layers which often lead to the disposal of the raw material or
the final product.

Keywords: Microorganisms, Cocos nucifera L., Tannin, Escherichia coli.

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INTRODUÇÃO
Estima-se que o Brasil possui uma área plantada de 100 mil hectares de
coqueiro-anão, destinados à produção do fruto verde para o consumo da água de
coco. As cascas geradas por este agronegócio representam de 80% a 85% do peso
bruto do fruto, e cerca de 70% de todo lixo gerado nas praias brasileiras (ROSA et al.,
2001). O aumento na produção e no consumo da água de coco, tem gerado cerca de
6,7 milhões de toneladas de casca/ano, gerando um sério problema ambiental,
sobretudo para as grandes cidades, dado que cerca de 80% a 85% do peso bruto do
coco verde é considerado lixo (MACHADO; DAMM; JUNIOR, 2009).
Normalmente este material gerado é conduzido para aterros, podendo
gerar gases do efeito estufa, entre outros, durante sua decomposição. Os taninos
podem ser extraídos da casca de várias espécies florestais, sendo amplamente
distribuído entre as plantas, e na casca de algumas espécies, sua concentração pode
atingir até 40%, favorecendo assim a sua exploração comercial (PASTORE JÚNIOR,
1977). Historicamente, os taninos foram utilizados para curtir couro, atualmente são
aplicados em produtos farmacêuticos, corante corporal, na fabricação de plásticos,
fungicidas, bebidas, velas e panelas de barro, às quais dão a coloração preta e são
também responsáveis pela sua impermeabilização (RAYGORODSKY, 2005). Os
extratos tanantes vegetais também possuem utilidades como floculantes /
coagulantes, como agentes de suspensão, dispersantes e fluidificantes para lama de
perfuração e como adesivos para a indústria da madeira (TANAC, 2006).
O mecanismo de ação antimicrobiano dos taninos explica-se por três
hipóteses: 1) os taninos poderiam inibir enzimas bacterianas e fúngicas e/ou se
complexar com os substratos dessas enzimas; 2) ação dos taninos sobre as
membranas celulares dos microrganismos, modificando seu metabolismo; 3) na
formação de complexos com íons metálicos, diminuindo a disponibilidade de íons
essenciais para o metabolismo microbiano (SCALBERT, 1991).
Taninos são compostos secundários, que podem variar em concentração nos
tecidos vegetais, dependendo da idade e tamanho da planta, da parte coletada, da
época ou, ainda, do local de coleta (TEIXEIRA et al., 1990; SIMÓN et al., 1999;
LARCHER, 2000).
Os taninos hidrolisáveis compreendem os taninos gálicos e os taninos
elágicos. Os primeiros decompõem-se em ácido gálico e açucares, quando
submetidos a reações de hidrólise, enquanto o segundo forma ácido elágico e
açúcares sob as mesmas condições (PIZZI, 1983).
Os taninos condensados (figura 1) são formados por unidades de
flavonóide (flavan 3-4 diol e flavan 3-ol) em vários graus de condensação (dependem
do tipo e da origem do tanino), não sofrem hidrolise e se precipitam com formaldeído
e ácido clorídrico, segundo a reação de Stiasny (WISSING, 1955).

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a) flavan 3-4 diol

b) flavan 3-ol

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Figura 1 - Estrutura de taninos condensados (FERREIRA, 2004).

Os taninos condensados constituem mais de 90% da produção mundial de


taninos comerciais ultrapassando a marca de 350.000 toneladas/ ano
(GUANGCHENG et al., 1991). A oferta de matéria prima através de descarte e as
possibilidades de aplicação científica e industrial, tornam a exploração do tanino uma
alternativa viável e econômica, além de ser uma proposta sustentável para minimizar
os impactos e gerar renda em diversas localidades costeira.

MATERIAL E MÉTODOS

Coleta e Preparação do Material

As cascas de Cocos nucifera L. foram coletadas em uma lanchonete localizada


na rua Presidente Carlos de Campos, centro de Santo André. Após a coleta,
trituramos as amostras e separamos as fibras do pó da casca e este último fora
colocado em estufa a 60ºC até atingir peso constante.

Extração de tanino

Há várias metodologias para a determinação de teor de taninos. Utilizou-se


uma adaptação da metodologia, que trata da determinação do teor de taninos em
base seca, proposta por TRUGILLHO et al. (1997).

Extração em Água Quente

Preparou-se 10g de amostra composta que foi colocada em erlenmeyer de 500


mL, sendo adicionados 250 mL de água destilada. A amostra foi submetida à extração
em água quente, em manta aquecedora com condensador de refluxo com o objetivo
de promover a condensação do vapor d’água no interior do erlenmeyer mantendo,
assim, o volume inicial de água e evitando perda excessiva de produtos nos
extrativos por volatilização e arraste pelo vapor d’água. Foi realizada a extração por 2
horas de fervura. O extrato obtido foi posto em Becker de 500 mL e coberto com
papel alumínio, para evitar contaminação e perda por volatilização do material. Após
as extrações, realizou-se secagem da fração sólida (fibra + pó) em estufa a 65°C até
atingir peso constante. A partir do peso inicial da amostra e do peso seco após
extração foi possível determinar o teor de extrativos totais em água quente que foi
usada a seguinte equação:

TEA = Pi – Pfx 100


Pf
Onde:
TEA é o teor de extrativos em água quente, em porcentagem;
Pi é o peso inicial da amostra (10g) e;
Pf é o peso seca em estufa, após as extrações em grama.

Determinação do Conteúdo em Taninos Condensados

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Para a determinação do conteúdo em taninos condensados foi utilizada a


metodologia apresentada por DOAT (1978).
O método consiste em se retirar uma amostra de 50 ml do extrato total, a qual
é adicionado 5 ml de formaldeído P.A e 2,5 ml de ácido clorídrico concentrado,
deixando-se descansar por um período de 24 horas. À reação do formaldeído com o
tanino produz a polimerização através de pontes metilênicas que ocorrem nos sítios
reativos das moléculas do flavonoide, principalmente nos anéis aromáticos, tendo
como produto um precipitado polimérico (PIZZI & MITTAL, 1994). Assim, o precipitado
foi filtrado em papel de filtro quantitativo com auxílio de bomba à vácuo, posto para
secagem em estufa a 65°C até atingir peso constante, e pesado, obtendo-se assim o
número de Stiasny. Para obter a porcentagem de taninos condensados na solução é
preciso determinar primeiramente o teor de sólidos totais presentes no extrato.
O teor de sólidos totais foi determinado por:
TST = PS x 100
PU

Onde,
TST é o teor de sólidos totais, em porcentagem;
PS é o peso da alíquota seca;
PU é o peso inicial da alíquota.

A determinação do teor de sólidos totais presentes no extrato deu-se pela


pesagem de uma amostra de 100mL de extrato e obtenção do peso após secagem.
Com base no teor de sólidos totais e no número de Stiasny, foi possível determinar o
teor de taninos condensados no extrato. Em seguida, obteve-se o teor de taninos
condensados em base seca.
Assim, o teor de taninos condensados foi calculado da seguinte maneira:

TTC = Nº STIASNY x 100


TST

Onde, TTC é o teor de taninos condensados na solução, dado em percentagem,


N° STIASNY é o peso de tanino condensado na solução em gramas;
O teor de taninos condensados, base a casca seca, foi determinada por:

TCC (%) = TEA x TTC


100

Em que,
TCC é o teor de taninos condensados na casca, dado em percentagem;
TEA é o teor de extrativo totais em água quente, em percentagem e;
TTC é o teor de taninos condensados na solução.

Aplicação do tanino em tecidos

É necessário o tratamento do tecido para que esse adquira caráter catiônico


para que seja possível a fixação de taninos aniônicos. Dessa forma, é necessária a
aplicação do sal quartenário de amônio no tecido com o objetivo de oferecer a ele
caráter catiônico para que possa haver afinidade entre o composto e o material a ser
protegido contra microrganismos e os taninos.
Foram pesados 0,5g de tecido e realizou-se o “cozimento” do mesmo por 10
minutos em água a 60ºC. Posteriormente, foi pesada a mesma massa de sal
quartenário de amônio que havia sido cozinhada de tecido, metade de sulfato de
ódi 4 d l ã t t A b tâ i f dil íd 100 L d á

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sódio e 4g. de solução tanante. As substâncias foram diluídas em 100mL de água.


Após o “cozimento”, o tecido foi colocado na solução de amônio à 60ºC durante 10
minutos. Em seguida, foi submetida à solução de tanino mais sulfato de sódio que
atua como fixador, por 15 minutos à 80ºC. O tecido foi lavado em água por 3 minutos
à 60º e por 3 minutos em água fria.

Análise microbiológica

O teste de sensibilidade dos microrganismos em relação ao tanino foi realizado


a partir de meios de cultura e contagem do número de células em câmara de
Neubauer, citados por TORTORA (2004).

Isolamento de Escherichia coli

Para termos a confirmação da espécie das bactérias utilizamos ágar


MacConkey onde isolamos as colônias de coloração rosa e com produção de gás,
que é característico de E. coli A produção de gás com estufamento do meio é
indicativo de fermentação da lactose presente no meio. As amostras foram
centrifugadas a 2000 rpm durante 5 minutos. Descartamos o sobrenadante e o pellet
foi condicionado em caldo nutriente.

Contagem em câmara de Neubauer

Pipetamos 50µL da amostra original em 150 µL de meio. A amostra diluída foi


pipetada em dois campos da câmara de Neubauer onde executamos a contagem das
bactérias e submetemos à contagem a fórmula: número de células X diluição X
volume final X 104. Após a contagem separamos 1.3X106 células bacterianas de E.
coli para os procedimentos experimentais.

Avaliação do papel inibidor do tanino em culturas de Escherichia coli in vitro

Pipetamos 1.3X106 bactérias E. coli em poços da placa de ELISA em um


volume de 50µL, mais 50µL de meio de cultura em cada poço e 100µL de extrato da
casca de Cocos nucifera L. com concentração tânica de 0,72 g/L e em diferentes
diluições de 0,371 g/L, 0,185 g/L e 0,092 g/L para obtermos os parâmetros: 1:1, 1:2 e
1:4.

Avaliação do papel inibidor do tanino fixado em tecido de algodão

A fim de testar o real efeito antimicrobiano dos taninos, foram fixados em


tecidos amostras tânicas comerciais de ácido tânico - tanino hidrolisável e WEIBULL
BLACK - extrato da mimosa puro e natural com alto teor de taninos condensados
desenvolvido pela TANAC S.A., usado para controle experimental.
Outras porções de tecidos foram testadas com extratos tânicos de Cocos
nucifera L., fixados e um pedaço de tecido sem proteção, para controle.
Todas as amostras de tecidos foram sobrepostas em meios de cultura ágar
nutriente com número de células inoculadas quantificadas em Câmara. As placas
foram mantidas em estufa a 38°C por 48 horas.

Análise estatística

A análise estatística foi obtida através do teste One-way ANOVA, seguido por
áli d T t d B f i T d áli t tí ti f li d

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análise do Teste de Bonferroni. Todas as análises estatísticas foram realizadas


através do Software GraphPad 5. Os asteriscos acima das linhas representam as
diferenças significantes entre as barras indicadas com *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A extração de taninos da casca de cocos nucifera L., em água quente é


eficiente devido à solubilidade das substâncias em solventes polares, porém, o
desenvolvimento das extrações dessa maneira torna difícil a obtenção de uma
solução tânica totalmente pura, pois diversos componentes constituintes da matéria
prima também são solúveis em água.
Deste modo, uma extração com 10,87 gramas de casca, foi possível obter
concentração de sólidos totais em água de 32 g/L e de taninos de 0,72 g/L.
Ao desenvolver a metodologia de extração de taninos em água quente, é possível
observar que esta é economicamente viável por utilizar um solvente de baixo custo,
além disso, o tempo de extração é favorável, diminuindo custos e resíduos que
poderiam causar danos ao meio ambiente.

Testes microbiológicos in vitro


Para Verificarmos a eficácia do tanino como agente antimicrobiano, foram
realizados ensaios in vitro. Utilizamos bactérias Escherichia coli, por ser a bactéria
padrão entre os coliformes fecais, portanto, alvo de pesquisas em diversas análises
ambientais. Realizamos um ensaio desafiando 1.3X106 bactérias com diferentes
concentrações de tanino.
As bactérias foram cultivadas em estufa por 48h em meio de cultura
MacConkey, à 36ºC. Pipetamos 1.3X106 bactérias em poços da placa de ELISA e
incubamos por uma hora com caldo nutriente, tanino puro e com as proporções de
tanino: caldo nutriente obtendo as diluições 1:1, 1:2, 1:4. Observamos que a
concentração de tanino influencia diretamente na proliferação bacteriana.
Após a incubação as amostras foram transferidas para placas de Petri
contendo meio de cultura e condicionadas à 36ºC por 48h. Após o tempo de cultura
mensuramos o diâmetro do crescimento microbiano na placa e comparamos com o
controle (Figura 2).

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Figura 2. Inibição bacteriana pela concentração de tanino. Os asteriscos acima das linhas
representam as diferenças significantes entre as barras indicadas com (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001).

Com base nos resultados obtidos, a presença de tanino na cultura restringiu a


proliferação bacteriana quando comparados com o controle. Verificamos que mesmo
a menor concentração testada ainda apresentou diferença estatística em relação ao
controle.
A solução tanante proveniente do extrato de Cocos nucifera L. mostrou-se
muito eficiente, uma vez que a mesma estava em concentração e grau de pureza
relativamente baixo. Desta forma podemos inferir que a utilização de uma solução
mais concentrada desencadeará um controle maior sobre a proliferação bacteriana.

Efeito antimicrobiano dos taninos aplicados em tecidos.

A avaliação da ação inibitória dos taninos em tecidos foi analisada a partir da


comparação entre tecidos com diferentes tipos de taninos em meio de cultura
expostos a Escherichia coli.

Tabela 1. Relação do tempo extração e fixação nos tecidos.

Tecido Dias antes Dias Horas Halos


da antes antes (mm)
Aplicação dos dos
no Tecido Testes Testes

1 --- --- --- 0

2 11 19 192 0

3 18 19 24 0,5

4 1 2 24 3,6

5 --- --- 144 9

6 --- --- 144 21

*Tecido 5 se trata do Ácido Tânico - tanino hidrolisável. Tecido 6 do WEIBULL BLACK - produto cedido
pela empresa TANAC S A com grande concentração de taninos condensados

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pela empresa TANAC S.A. com grande concentração de taninos condensados.

A partir da análise realizada e dos dados da tabela 1, é possível demonstrar


que a solução tânica foi mais eficiente quando aplicada recentemente aos tecidos, e
ainda quando esta é extraída pouco tempo antes de sua aplicação no tecido, ou seja,
a eficiência se dá pelo tempo de extração e fixação no tecido.
No tecido com extrato tânico obtido da casca de Cocos nucifera L. uma
semana antes da fixação e duas antes do teste (tecido 2), não houve halos de
resistência, enquanto que no tecido em que foi aplicada a mesma solução, porém um
dia antes do início do teste (tecido 3), observamos um pequeno halo de inibição de
0,5 mm (além da área de contato do tecido).
Em outro tecido (tecido 4), foi aplicada uma solução tânica extraída da casca
dois dias antes do teste e fixada no dia anterior, e neste foi possível mensurar um
halo de inibição de 3,6 mm (Figura 3).
Os tecidos com as amostras tânicas comerciais mostraram grande resistência frente
a proliferação de E. coli. Os halos de inibição de 9 e 21mm, da amostra de tanino
condensado da TANAC e ácido tânico (hidrolisável), respectivamente (Figura4).

Figura 3. Antibiograma com extratos aplicados em tecidos

Figura 4. Medida dos Halos de inibição formados com tecidos. Os asteriscos acima das
linhas representam as diferenças significantes entre as barras indicadas com (*p<0,05, **p<0,01,
***p<0,001).

REFÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

DOAT, J. LesTaninsdansles bois Tropicaux. Revue Bois etFlorêtdes Tropiques.


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FERREIRA E S Utili ã d lif ói d ã d d i

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FERREIRA, E. S. Utilização dos polifenóis para produção de adesivos para


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MACHADO, K. C.; DAMM, D. D.; JUNIOR, C. C. M. F. Reaproveitamento


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PASTORE JUNIOR, F. Produção de adesivos à base de tanino. Comunicação


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Ilustrações: Silvana Santos

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