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UNIVERSIDADE FEREDAL DO ESPÍRITO SANTO

CENTRO DE CIÊNCIAS ÁGRARIAS E ENGENHARIA
DEPARTAMENTO DE MEDICINA VETERINÁRIA
CURSO DE GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA

GABRIELE ALVES MENENGUCI

EFEITO FITOTERÁPICO IN VITRO DE STRYPHNODENDRON ADSTRINGENS

FRENTE À STREPTOCOCCUS AGALACTIAE

ALEGRE-ES
2019
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GABRIELE ALVES MENENGUCI

EFEITO FITOTERÁPICO IN VITRO DE STRYPHNODENDRON ADSTRINGENS

FRENTE À STREPTOCOCCUS AGALACTIAE

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado

ao Departamento de Medicina Veterinária do
Centro de Ciências Agrárias e Engenharias da
Universidade Federal do Espírito Santo, como
requisito parcial para obtenção do grau de
bacharel em Medicina Veterinária.
Orientador: Prof. Dr. Felipe Berbari Neto

ALEGRE-ES
2019
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GABRIELE ALVES MENENGUCI

EFEITO FITOTERÁPICO IN VITRO DE STRYPHNODENDRON ADSTRINGENS

FRENTE À STREPTOCOCCUS AGALACTIAE

Trabalho de conclusão de curso apresentado à Universidade Federal do Espírito

Santo, como parte das exigências do Curso de Graduação em Medicina Veterinária,
para obtenção do título de Médico Veterinário.

Aprovado em de de

COMISSÃO EXAMINADORA

______________________________________
Prof. Dr. Felipe Berbari Neto
Universidade Federal do Espírito Santo
Orientador

_______________________________________
Dr. Ítalo Câmara de Almeida
Universidade Federal do Espírito Santo
Co-Orientador

_______________________________________
Prof. Dr. Dirlei Molinari Donatele
Universidade Federal do Espírito Santo
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Dedico a todos os meus professores, desde os

que me alfabetizaram até os que me deram
conhecimento do ensino superior, sem vocês
não estaria escrevendo esse trabalho.
Sou grata a todos os animais que até
contribuíram para o meu conhecimento.
A vocês, dedico esse trabalho. Obrigada.
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AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus, por iluminar meu caminho e me dar forças para superar todos
os imprevistos.
Agradeço minha mãe e meu pai, que sempre confiaram em mim e são minha rocha,
meu porto seguro, mesmo longe vocês me impulsionam a continuar, a seguir meus
sonhos, vocês são a minha razão para continuar.
Quero agradecer a minha família, minhas irmãs, que me ajudam de vários modos,
obrigada!
Agradeço a meu melhor amigo, meu irmão de outra mãe, que mesmo longe me ajuda
a continuar, a você Lucas, sou grata.
Quero agradecer meu namorado, por estar comigo nos piores momentos que a
faculdade me proporcionou, que esteve comigo nos meus choros e nas minhas
conquistas e que me ajudou de formas que nem imagina, a você Pedro, sou grata.
Quero agradecer as amigas que a UFES me deu, a vocês Daiana e Rebeca, sou grata.
Meu filho de quatro patas, Chorão, que chegou em um momento inesperado e veio
para ficar em nossas vidas, para dar amor incondicional, obrigada por vir até nós!
Agradeço a todas as pessoas que me ajudaram de alguma forma, até aqui.
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RESUMO

MENENGUCI, GABRIELE. Efeito Fitoterápico in vitro de Stryphnodendron

adstringens frente à Streptococcus agalactiae. Trabalho de Conclusão do Curso
de Graduação em Medicina Veterinária. Centro de Ciências Agrárias e Engenharias,
Departamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal do Espírito Santo,
Alegre, ES, 2019.
A mastite é o processo inflamatório da glândula mamária, e leva a alterações no tecido
mamário e no leite. É uma doença multifatorial, um dos causadores é o Streptococcus
agalactiae, associada a mastite subclínica.
Apesar de vários antimicrobianos estarem disponibilizados no mercado, a resistência
dos microrganismos tem aumentado em decorrência do uso indiscriminado de tais
produtos. A espécie Stryphnodendron adstringens, conhecido como barbatimão
possui dentre diversas propriedades medicinais, atividade antibacteriana, entre
outras. Ademais, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a eficácia do extrato
hidroalcoólico in vitro do fitoterápico Stryphnodendron adstringens em diferentes
concentrações frente a culturas de Streptococcus agalactiae. As linhagens
Streptococcus agalactiae foram cultivadas em caldo nutritivo BHI, incubadas a 37º C
por 18-24h. Foi realizado inóculo bacteriano através do método de turbidez
equivalente a escala McFarland 0,5 (aproximadamente 1x10 8 UFC/mL) e semeadas
na superfície de ágar BHI. Realizou-se a perfuração de orifícios no meio solidificado
com perfurador de 6 mm de diâmetro, onde foram depositados 20 µl do extrato
hidroalcóolico da casca do Stryphnodendron adstringens em suas diferentes
concentrações (50mg/ml; 25mg/ml; 12,5mg/ml; 6,25mg/ml). As placas foram
encubadas em estufa a 37ºC por 48 horas. Tempo necessário para observar variações
de resistência ou não da bactéria. Os ensaios foram realizados em triplicata,
acompanhados de controle positivo com o antibiótico ampicilina e controle negativo
com água destilada + álcool 70% (1:1). Os resultados mostraram que não houve ação
antibacteriana do extrato de Stryphnodendron adstringens frente à Streptococcus
agalactiae, sendo necessário novos estudos, com diferentes metodologias, outras
partes da planta e outras concentrações.

Palavras-chave: Fitoterapia, Antibiograma, Barbatimão, Ação antibiótica.

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ABSTRACT

MENENGUCI, GABRIELE. In vitro herbal effect of Stryphnodendron adstringens

on Streptococcus agalactiae. Graduation Course in Veterinary Medicine. Center for
Agrarian Sciences and Engineering, Department of Veterinary Medicine, Federal
University of Espírito Santo, Alegre, ES, 2019.
Mastitis is the inflammatory process of the mammary gland, and leads to changes in
breast tissue and milk. It is a multifactorial disease, one of the causes is Streptococcus
agalactiae, associated with subclinical mastitis.
Although several antimicrobials are available on the market, resistance to
microorganisms has increased as a result of the indiscriminate use of such products.
The species Stryphnodendron adstringens, known as barbatimão has among several
medicinal properties, antibacterial activity, among others. In addition, the objective of
the present work was to evaluate the efficacy of the in vitro hydroalcoholic extract of
the phytotherapic Stryphnodendron adstringens in different concentrations against
cultures of Streptococcus agalactiae. Streptococcus agalactiae strains were cultured
in BHI nutrient broth, incubated at 37 ° C for 18-24h. Bacterial inoculum was performed
using the turbidity method equivalent to the McFarland 0.5 scale (approximately 1x108
CFU / mL) and seeded on the surface of agar. The holes were drilled in the solidified
medium with a 6 mm diameter drill, where 20 μl of the hydroalcoholic extract of the
bark of Stryphnodendron adstringens were deposited in their different concentrations
(50 mg / ml, 25 mg / ml, 12,5 mg / ml; 6.25mg / ml). Plates were incubated in an oven
at 37 ° C for 48 hours. Time needed to observe variations of resistance or not of
bacteria. The assays were performed in triplicate, followed by positive control with
antibiotic ampicillin and negative control with distilled water + 70% alcohol (1: 1). The
results showed that there was no antibacterial action of the extract of Stryphnodendron
adstringens against Streptococcus agalactiae, being necessary new studies, with
different methodologies, other parts of the plant and other concentrations.

Key words: Phytotherapy, Antibiogram, Barbatimão, Antibiotic action.

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SUMÁRIO

Página

1- INTRODUÇÃO .............................................................................. 9

2- REVISÃO DE LITERATURA.......................................................... 11

2.1- Mastite.......................................................................................... 11

2.1.1- Importância econômica ............................................................. 12

2.1.2-Micro-organismos causadores................................................... 13

2.1.3- Uso de antibiótico e resistência bacteriana................................ 14

2.1.4- Outras possibilidades para o tratamento de mastite................... 15

2.2- Fitoterápicos................................................................................. 15

2.2.1- Stryphnodendron adstringens................................... ................ 16

2.2.1.1- Taninos................................................................................... 17

2.2.1.2- Potencial antibacteriano......................................................... 18

3- Artigo.............................................................................................. 19

4- Referencias.................................................................................... 27

7-ANEXO ......................................................................................... 33
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1 1. INTRODUÇÃO

3 É denominado mastite o processo inflamatório da glândula mamária que possui

4 características de modificar o tecido mamário, causando alterações patológicas nesse
5 tecido, consequentemente gerando modificações físico-químicas no leite. Sendo
6 comum a presença de coágulos, grandes números de leucócitos e modificações de
7 coloração (RADOSTITS, 2000).
8 A mastite uma doença multifatorial, possui vários agentes causadores, como
9 por exemplo o Streptococcus agalactiae, que em sua grande maioria são infecções
10 subclínicas, com importante destaque em rebanhos bovinos leiteiros no Brasil. Há
11 relatos que em cada um caso de mastite clínica exista quarenta casos de mastite
12 subclínica, dentre as subclínicas o S. agalactiae está entre os causadores (SANTOS;
13 FONSECA, 2007).
14 O tratamento da mastite contra S. agalactiae, ainda é feito com a administração
15 de antibióticos, porem frequentemente é empregado de maneira indiscriminada
16 (CASTRO, 2018).
17 Animais que apresentam mamite subclínica por S. agalactiae tornam-se
18 permanentes fontes de risco de infecção para outros animais e podem potencializar a
19 prevalência das infecções dentro dos rebanhos. Assim, encurtar a duração dessas
20 infecções é um importante componente dos programas de controle de mamites
21 (MARQUES, 2006).
22 O uso de plantas medicinais na medicina popular tem mostrado que caule,
23 raízes, folhas, sementes e frutos de plantas têm eficiência na cura de várias doenças,
24 despertando assim grande interesse no estudo científico das mesmas (VEIGA
25 JUNIOR et al., 2005).
26 Stryphnodendron adstringens é uma planta nativa do cerrado brasileiro e tem
27 como nome popular o “barbatimão”. Sua composição é rica em taninos, que são
28 metabólitos secundários primordiais de suas cascas apresentando, entre outras,
29 atividade antimicrobiana e cicatrizante (SOUZA et al., 2007).
30 Suas folhas, cascas possuem propriedades medicinais comprovadas,
31 demonstrado por inúmeros autores como importante agente antimicrobiano, como por
32 exemplo o encontrado por Silva e Oliveira (2013), Pinho et al., (2012) e Gonçalves et
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33 al., (2007). Não possui atividade genotóxica, concluindo que a utilização parece ser
34 segura e com potencial farmacológico (FERREIRA et al., 2013).
35 Diante disto o presente trabalho tem como objetivo avaliar o efeito do
36 Stryphnodendron adstringens em diferentes concentrações contra o Streptococcus
37 agalactiae, a bactéria associada a casos mastite subclínica, em busca de um método
38 alternativo para o tratamento dessa enfermidade.
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66 2. REVISÃO DE LITERATURA

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69 2.1 Mastite

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71 Mastite, ou inflamação da glândula mamária, é uma doença comum e a mais

72 onerosa aos criadores de gado leiteiro em todo o mundo. O estresse e ferimentos
73 físicos também causam a inflamação da glândula mamária, entretanto a infecção por
74 bactérias invasivas são os principais agentes causadores da mastite bovina
75 (TOZZETTI et al., 2008).
76 A etiologia da mastite é complexa e multifatorial tornado necessário a identificação
77 e classificação dos micro-organismos envolvidos na infecção da glândula mamária,
78 para o controle e prevenção assim como para monitoramento do rebanho (RIBEIRO
79 et al., 2003).
80 A mastite subclínica cursa com maior importância epidemiológica por alastrar-se
81 de maneira silenciosa pelo rebanho sem que sejam percebidas alterações
82 macroscópicas à inspeção do úbere ou de sua secreção (BARBALHO; MOTA, 2001).
83 A prevenção e o controle da mastite subclínica devem merecer especial atenção
84 dos produtores de leite, embora sua ocorrência não seja tão evidente como a da
85 mastite clínica, porém pode resultar em prevalência mais alta, acarretando grande
86 ônus para o sistema de produção (MAGALHÃES et al., 2006).
87 Segundo Bradley (2002) no que diz respeito às mastites clínicas, elas são as
88 causas mais comuns de morte entre vacas leiteiras adultas e ressalta a sua gravidade
89 nas questões de bem-estar animal.

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95 2.1.1 Importância econômica

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97 Os resultados da mastite na produção de leite estão diretamente relacionados
98 ao grau de lesão do tecido mamário, levando a uma elevação contagem de células
99 somáticas (CCS) e resultando em elevadas alterações nos constituintes do leite. A
100 queda na produção leiteira se deve a lesão de células epiteliais secretoras da glândula
101 mamária infectada. O que pesa de fato, no caso das mastites subclínicas são os
102 prejuízos pela diminuição da produção ao nível de propriedade e do rendimento da
103 produção na indústria de laticínios (LANGONI, 2013).
104 O grande impacto que a mastite causa sobre a qualidade do leite é de
105 conhecimento mundial e os programas para o seu controle precisam ser vistos como
106 suporte para os programas nacionais de qualidade do leite que necessitam ser
107 listados em medidas preventivas no reconhecimento e no tratamento adequados de
108 animais infectados, sendo este um fator restritivo e que apresenta maior impedimento
109 para ser alcançado, dada a complexa etiologia das mastites, o momento em que se
110 diagnostica cada caso e os aspectos de resistência microbiana (BARKEMA et al.,
111 2006).
112 A mastite é uma doença responsável por grande parte dos descartes em um
113 plantel. Problemas com mastite comprometem a longevidade dos animais, causando
114 muitas vezes o descarte de animais de grande potencial, elevando os custos e
115 acarretando acelerada taxa de reposição do plantel (DEMEU et al., 2011).
116 As medidas de prevenção têm um custo menos oneroso quando comparada a
117 tratamentos curativos, tendo excelente relação custo/benefício, no entanto os
118 proprietários veem tais medidas como trabalhosas e desnecessárias. Os gastos com
119 o tratamento preventivo mostraram, no máximo 9,2% do impacto econômico, o que
120 evidencia vantagem em se investir nessa prática, pois ela irá colaborar
121 substancialmente para uma atenuação da contagem de células somáticas no tanque
122 e, em consequência, reduz o impacto econômico da mastite (DEMEU et al., 2011).
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127 2.1.2 Micro-organismos causadores

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129 Os micro-organismos que causam mastite podem ser divididos em dois grupos,
130 baseando-se na sua origem: patógenos contagiosos e patógenos ambientais. Os
131 patógenos contagiosos são aqueles adaptados à sobrevivência no interior da glândula
132 mamária. Em contraste, os patógenos ambientais são mais bem descritos como
133 invasores oportunistas do úbere, não adaptados a sobreviver no seu interior (WATTS,
134 1988).
135 O S. agalactiae é um dos agentes mais frequentemente isolados em amostras
136 de leite de bovinos com mastite, sendo sua transmissão ocorrendo fundamentalmente
137 nos períodos de ordenha. É considerado um importante patógeno causador de mastite
138 pelo forte efeito na qualidade do leite, com aumento de CCS e por diminuição dos
139 níveis de produção (KEEFE, 2012).
140 A maioria dos casos de mastite por este agente é subclínica, alternando com
141 casos esporádicos de mastite clínica, com alterações macroscópicas do leite, como
142 flocos de pus e leite com aspecto mais aquoso, seguido de queda de produção. Em
143 casos de mastite subclínica há diminuição de 25,2% ao se comparar com a
144 produção de leite de teto homólogo negativo no mesmo animal (DOMINGUES et al.
145 1998).
146 Streptococcus agalactiae é um coco Gram positivo do grupo B, geralmente
147 causa um tipo persistente de infecção de baixo grau e não tem alta taxa de autocura.
148 Quando não identificado funciona como reservatório de infecção, pois esses animais
149 não são selecionados para tratamento, isolamento ou abate. Para um patógeno
150 intramamário como o S. agalactiae, o úbere bovino é reconhecido como um meio de
151 crescimento razoável para o seu crescimento (KEEFE, 2012).
152 Quando se deu o entendimento da importância da higiene e antes que as drogas
153 antibacterianas eficientes estivessem disponíveis, a bactéria Streptococcus agalactiae
154 era o patógeno mais importante para glândula mamária de vacas. A resistência à
155 mastite causada por este agente está sujeita a grande variação individual (PRESTES;
156 LANDIM-ALVARENGA, 2006).

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159 2.1.3 Uso de antibióticos e resistência bacteriana

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161 Em determinadas situações, como o caso de mastites, quando se faz o

162 emprego de antibióticos por via sistêmica ou intramamário, tem-se o inconveniente de
163 descarte de leite, pelo período de carência, além dos custos das aplicações e seleção
164 de organismos mais resistentes a mais de uma classe de antimicrobiano
165 (ANDREOTTI et al., 2004).
166 Os antimicrobianos recomendados para combate à este micro-organismo são:
167 amoxicilina, ampicilina, enrofloxacina, estreptomicina, gentamicina, oxitetraciclina,
168 penicilina, sulfamerazina e tetraciclina (CORAZZA et al., 2010), essas drogas são
169 amplamente empregadas para controle de doenças em humanos, por isso, o consumo
170 de leite com resíduos dessas drogas podem ocasionar o insucesso quanto do
171 emprego dessas em infecções em humanos (NADER FILHO et al., 2007).
172 O tratamento da mastite contra S. agalactiae, ainda é feito com a administração
173 de antibióticos, porém frequentemente é empregado de maneira indiscriminada. Isto,
174 leva a seleção da resistência antibacteriana contra diversos agentes utilizados no
175 mercado: Eritromicina (19,5%), tetraciclina (35,6%), gentamicina (9,3%), clindamicina
176 (20,3%), penicilina (3,4%), amicacina (38,1%) (CARVALHO-CASTRO, 2018).
177 Medicamentos fitoterápicos e homeopáticos, têm sido utilizados, porém nem
178 todas essas opções apresentam respaldo científico acerca da eficácia de ação contra
179 os agentes causadores da enfermidade (CRISAN et al., 1995).
180 A evolução da resistência bacteriana aos antibióticos está relacionada com o
181 aumento do uso dessas drogas em hospitais e na produção animal. Adicionalmente,
182 é difícil afirmar a extensão em que isso ocorre e o impacto da transmissão na atual
183 disseminação da resistência em humanos (FEDORKA-CRAY, et al., 2002).
184 Devido ao alto custo do tratamento padrão, além de despesas com diagnóstico,
185 identificação do agente, medicamento e com o descarte do leite com resíduos vem se
186 buscando novas alternativas para a prevenção e tratamento da mastite (JUNIOR et
187 al, 2007).
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191 2.1.4 Outras possibilidades para tratamento de mastite

192

193 Nas últimas décadas os consumidores têm se preocupado cada vez mais com
194 a saúde, e por consequência com a qualidade e inocuidade dos produtos de origem
195 animal, gerando um aumento significativo das propriedades rurais de produção
196 orgânica, método de produção que busca a auto sustentabilidade, preservando os
197 recursos ambientais. O leite e derivados estão dentre os principais produtos de
198 interesse comercial neste setor. No Brasil a agricultura orgânica apresenta taxas de
199 crescimento de até 30% (WILLER; YUSSEFI, 2007).
200 As propriedades orgânicas devem gerar alimentos de maior qualidade, livre de
201 resíduos de produtos químicos nocivos para humanos, incluindo o uso de
202 antimicrobianos, anti-parasitários, transgênicos, ou qualquer outro fármaco que
203 possua resíduos nocivos à saúde humana, incluindo produtos de uso agropecuário
204 destinados à animais de exploração leiteira (FIGUEIREDO; SOARES, 2012).
205 Devido a tendência de crescimento do setor de produção orgânica, têm-se
206 escolhido em várias situações pelo uso de medicamentos fitoterápicos para o
207 tratamento das mastites (HOLMES et al., 2005).
208 A fitoterapia é uma alternativa importante, e as suas características
209 terapêuticas começam a ganhar cada vez mais espaço no tratamento veterinário,
210 entretanto apesar de relatos de profissionais que apreciam a fitoterapia revelarem alta
211 regularidade de sucessos em tratamentos de mastites, a literatura científica específica
212 sobre o assunto é bastante escassa. Os medicamentos fitoterápicos apresentam um
213 custo baixo e baixa toxicidade, facilidade de administração, onde o medicamento é
214 diluído com a ração ou água, e atuam de forma sistêmica, não contribuindo para a
215 ocorrência de resistência microbiana (MANGIERI et al., 2015).
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217

218 2.2 Fitoterápicos

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220 Uma planta medicinal é toda planta que administrada ao homem ou animal,
221 independente da via deve exercer alguma ação terapêutica, possuir substâncias
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222 ativas que promovam reações no organismo que podem variar da cura ao
223 abrandamento da doença (LOPES et al., 2005).
224 O uso de plantas medicinais na medicina popular tem mostrado que caule, raízes,
225 folhas, sementes e frutos de plantas têm eficiência na cura de várias doenças,
226 despertando assim grande interesse no estudo científico das mesmas (JUNIOR et al.,
227 2005).
228 O tratamento a partir de plantas medicinais é denominado de fitoterapia, e os
229 fitoterápicos são os medicamentos produzidos a partir dessas plantas. Assim sendo,
230 a fitoterapia é caracterizada pelo tratamento com a utilização de plantas medicinais
231 com as diferentes formas farmacêuticas, sem o uso de princípios ativos isolados
232 (SIMÕES; SCHENKEL, 2002).
233 O emprego de fitoterápicos apresenta-se como uma destas formas no combate a
234 mastite, por não apresentar efeito maléfico quanto à presença de resíduos, devido a
235 sua característica de ser biodegradável e pela boa atuação sobre micro-organismos
236 (PEREIRA et al., 2009).
237 Tem sido uma alternativa de baixo custo e de ótimos resultados in vitro contra
238 agentes patogênicos de várias doenças (PEREIRA et al., 2009).
239 Nos últimos anos a procura por produtos orgânicos vem se intensificando, e sua
240 utilização na medicina sendo cada vez mais estimulada pela Organização Mundial da
241 Saúde (SOUZA C. M. et al., 2013).
242 Neste contesto, o Streptococcus agalactiae apresentou crescimento parcialmente
243 reduzidos em testes in vitro com extrato bruto de folhas Cydonia oblonga, revelando
244 um possível efeito inibidor deste extrato (SILVA; OLIVEIRA, 2013).

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247 2.2.1 Stryphnodendron adstringens

248

249 Stryphnodendron adstringens, conhecido como barbatimão é uma espécie

250 nativa do Cerrado e possui diversas propriedades medicinais, como: atividade
251 antibacteriana, contra Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes por exemplo
252 (GOLÇALVES, 2007).
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253 Possui ação antifúngica, combatendo o crescimento de Candida albicans,

254 anticancerígeno, atividade inibitória contra alguns efeitos enzimáticos e biológicos das
255 peçonhas de serpentes botrópicas, contra micro-organismos da cárie dental,
256 propriedade de cicatrização, ação sobre o Trypanosoma cruzi e Leishmania
257 amazonensis, propriedades contra úlceras. Suas folhas e cascas possuem
258 propriedades medicinais comprovadas, mostrado por inúmeros autores como
259 importante agente antimicrobiano. Não possui atividade genotóxica, não causando
260 danos sobre o material genético, concluindo que a utilização parece ser segura e com
261 potencial farmacológico (FERREIRA et al., 2013).

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264 2.2.1.1 Taninos

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266 O extrato de Stryphnodendron adstringens é rico em taninos condensados que

267 tem ação farmacológica geralmente usada na cicatrização de úlceras e ferimentos,
268 assim como está relacionada a processos de regeneração de tecidos da pele.
269 Entretanto, além da atividade cicatrizante, seu extrato possui atividade anti-
270 inflamatória, antimicrobiana, antiulcerogênica e antioxidante. Esta espécie está
271 descrita na Farmacopeia Brasileira e a mesma preconiza o controle de qualidade com
272 dosagem mínima de taninos e polifenóis na ordem de 20%, a sua atividade anti-
273 inflamatória foi confirmada em modelos experimentais de inflamação subaguda e
274 crônica (HERNANDES et al., 2010; ARDISSON et al., 2002).
275 Os taninos são compostos fenólicos que apresentam solubilidade em água,
276 possuem a capacidade de interagir e formar complexos insolúveis com proteínas,
277 alcaloides e gelatinas precipitando-os (SIMÕES et al., 2001).
278 A ação dos taninos resulta na capacidade de complexação com proteínas e do
279 seu poder de sequestrar íons metálicos, principalmente ferro, essenciais ao
280 desenvolvimento de micro-organismos, e possuem elevada atividade antioxidante
281 decorrente da inativação de radicais livres (HERZOG-SOARES et al., 2002).
282 Os taninos agem na cicatrização pelo fato de serem responsáveis por um
283 fenômeno chamado re-epitelização. Essas substâncias possuem a capacidade de
284 promover a proliferação de células epiteliais, e sua migração a partir da periferia das
 18

285 lesões. Esse fenômeno é regulado por genes, fatores de crescimento, integrinas e
286 enzimas do tipo metaloproteinases de matriz (MMPs) (HERNANDES et al., 2010).
287 Além dos taninos, há presença de proantocianidinas, encontradas no extrato
288 bruto de S. adstringens. São compostos polifenólicos que também atuam na
289 regeneração tecidual, favorecendo a formação de uma matriz extracelular mais
290 organizada; a estimulação da formação de fibras colágenas, além de fatores de
291 crescimento e re-epitelização, o uso desse vegetal se expande para a área veterinária
292 com sucesso, tratando feridas em animais de forma satisfatória (PINTO et al., 2015).

293

294

295 2.2.1.2 Potencial antibacteriano

296
297 O potencial antibacteriano do Stryphnodendron adstringens foi avaliada frente
298 a diversas bactérias e por diferentes autores, em estudo identificou-se o potencial de
299 ação antimicrobiológico através da formação de halo de inibição sensível de
300 Stryphnodendron adstringens frente a isolados de Streptococcus pyogenes, Proteus
301 mirabilis, Shigella flexneri, Staphylococcus aureus, Staphylococcus spp. coagulase
302 negativa (IFI), e Staphylococcus epidermidis (ATCC) (GOLÇALVES, 2007).
303 Em uma avaliação de extratos hidroalcólicos obtidos através de folhas de
304 diversas plantas, dentre eles o Stryphnodendron adstringens sobre Escherichia coli e
305 Staphylococcus aureus, esse extrato de folhas do barbatimão demonstrou potencial
306 para inibir o crescimento de Staphylococcus aureus (PINHO et al., 2012).
307 A casca de Stryphnodendron adstringens sobre bactérias causadoras de
308 infecções no trato urinário apresentou ação contra maior número de bactérias, sendo
309 sensíveis ao extrato: Proteus mirabilis, Staphylococcus epidermidis, Enterobacter sp.,
310 Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus sp.,
311 Escherichia coli, BGN-NF (bacilo Gram-negativo não fermentador) , Citrobacter sp.,
312 Enterobacter aggomerans, Pseudomonas aeroginosa, Klebsiella oxytoca (THOMAZI;
313 BERTOLIN; PINTO, 2010).
314

315
 19

316 3. ARTIGO
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326
327
328
329 O presente material será submetido à Revista
330 “Arquivos do Instituto Biológico”
331 (Normas em Anexo)
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342
 20

EFEITO FITOTERÁPICO IN VITRO DE STRYPHNODENDRON ADSTRINGENS

FRENTE À STREPTOCOCCUS AGALACTIAE

Resumo

A mastite é o processo inflamatório da glândula mamária, leva a alterações no tecido mamário

e no leite. É uma doença multifatorial, um dos causadores é o Streptococcus agalactiae,
associada a mastite subclínica. Vários antimicrobianos estão disponíveis no mercado, mas a
resistência dos microrganismos tem aumentado decorrendo do uso indiscriminado desses
produtos. O Stryphnodendron adstringens, conhecido como barbatimão, possui propriedades
medicinais e atividade antibacteriana. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a eficácia do
extrato hidroalcoólico in vitro do fitoterápico Stryphnodendron adstringens em diferentes
concentrações frente a culturas de Streptococcus agalactiae. As linhagens Streptococcus
agalactiae foram cultivadas em caldo nutritivo BHI, incubadas a 37º C por 18-24h. Foi
realizado inóculo bacteriano através do método de turbidez equivalente a escala McFarland 0,5
(aproximadamente 1x108 UFC/mL) e semeadas na superfície de ágar BHI. Realizou-se a
perfuração de orifícios no meio solidificado com perfurador de 6 mm de diâmetro, onde foram
depositados 20 µl do extrato hidroalcóolico da casca do Stryphnodendron adstringens em suas
diferentes concentrações (50mg/ml; 25mg/ml; 12,5mg/ml; 6,25mg/ml). As placas foram
encubadas em estufa a 37ºC por 48 horas, tempo necessário para observar variações de
resistência ou não da bactéria. Os ensaios foram realizados em triplicata, acompanhados de
controle positivo com o antibiótico ampicilina e controle negativo com água destilada + álcool
70% (1:1). Os resultados mostraram que não houve ação antibacteriana do extrato de
Stryphnodendron adstringens frente à Streptococcus agalactiae, sendo necessário novos
estudos, com diferentes metodologias, outras partes da planta e outras concentrações.

Palavras-chave: Fitoterapia, Antibiograma, Barbatimão, Ação antibiótica.

Abstract

Mastitis is the inflammatory process of the mammary gland, leading to changes in breast tissue
and milk. It is a multifactorial disease, one of the causes is Streptococcus agalactiae, associated
with subclinical mastitis. Several antimicrobials are commercially available, but the resistance
 21

of microorganisms has increased as a result of the indiscriminate use of these products.

Stryphnodendron adstringens, known as barbatimão, has medicinal properties and antibacterial
activity. The objective of the present work was to evaluate the efficacy of the in vitro
hydroalcoholic extract of the phytotherapeutic Stryphnodendron adstringens in different
concentrations against cultures of Streptococcus agalactiae. Streptococcus agalactiae strains
were cultured in BHI nutrient broth, incubated at 37 ° C for 18-24h. Bacterial inoculum was
performed using the McFarland 0.5 equivalent scale (approximately 1x108 CFU / mL) turbid
method and seeded on the BHI agar surface. The holes were drilled in the solidified medium
with a 6 mm diameter drill, where 20 μl of the hydroalcoholic extract of the bark of
Stryphnodendron adstringens were deposited in their different concentrations (50 mg / ml, 25
mg / ml, 12,5 mg / ml; 6.25mg / ml). The plates were incubated at 37 ° C for 48 hours, time
required to observe variations of resistance or not of the bacterium. The assays were performed
in triplicate, followed by positive control with antibiotic ampicillin and negative control with
distilled water + 70% alcohol (1: 1). The results showed that there was no antibacterial action
of the extract of Stryphnodendron adstringens against Streptococcus agalactiae, being necessary
new studies, with different methodologies, other parts of the plant and other concentrations.

Key words: Phytotherapy, Antibiogram, Barbatimão, Antibiotic action.

Introdução

Mastite, ou inflamação da glândula mamária, é uma doença comum e a mais onerosa aos
criadores de gado leiteiro em todo o mundo. O estresse e ferimentos físicos também causam a
inflamação da glândula mamária, entretanto a infecção por bactérias invasivas são os principais
agentes causadores da mastite bovina (TOZZETTI et al., 2008).
O S. agalactiae é um dos agentes mais frequentemente isolados em amostras de leite de
bovinos com mastite, sendo sua transmissão ocorrendo fundamentalmente nos períodos de
ordenha. É considerado um importante patógeno causador de mastite pelo forte efeito na
qualidade do leite, com aumento de CCS e por diminuição dos níveis de produção (KEEFE,
2012).
Streptococcus agalactiae é um coco Gram positivo do grupo B, geralmente causa um tipo
persistente de infecção de baixo grau e não tem alta taxa de autocura. Quando não identificado
funciona como reservatório de infecção, pois esses animais não são selecionados para
tratamento, isolamento ou abate. Para um patógeno intramamário como o S. agalactiae, o úbere
 22

bovino é reconhecido como um meio de crescimento razoável para o seu crescimento (KEEFE,
2012).
O tratamento da mastite contra S. agalactiae, é feito com a administração de antibióticos, porem
frequentemente é empregado de maneira indiscriminada. Isto, leva a seleção da resistência
antibacteriana contra diversos agentes utilizados no mercado: Eritromicina (19,5%), tetraciclina
(35,6%), gentamicina (9,3%), clindamicina (20,3%), penicilina (3,4%), amicacina (38,1%)
(CASTRO, 2018).
Devido ao alto custo do tratamento padrão, além de despesas com diagnóstico, identificação do
agente, medicamento e com o descarte do leite com resíduos, vem se buscando novas
alternativas para a prevenção e tratamento da mastite (JUNIOR et al, 2007).
Os medicamentos fitoterápicos têm sido utilizados como forma alternativa para tratamento de
mastite, porém nem todas essas opções apresentam respaldo científico acerca da eficácia de
ação contra os agentes causadores da enfermidade (CRISAN et al., 1995).
O emprego de fitoterápicos apresenta-se como uma destas formas no combate a mastite, por
não apresentar efeito maléfico quanto à presença de resíduos, devido a sua característica de ser
biodegradável e pela boa atuação sobre micro-organismos (PEREIRA et al., 2009).
Os medicamentos fitoterápicos apresentam custo baixo e baixa toxicidade, facilidade de
administração, onde o medicamento é diluído com a ração ou água, e atuam de forma sistêmica,
não contribuindo para a ocorrência de resistência microbiana (MANGIERI et al. 2015).
Stryphnodendron adstringens, conhecido como barbatimão é uma espécie nativa do Cerrado e
possui diversas propriedades medicinais, como: atividade antibacteriana, contra
Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes por exemplo (GOLÇALVES, 2007).
O extrato de Stryphnodendron adstringens é rico em taninos condensados que tem ação
farmacológica geralmente usada na cicatrização de úlceras e ferimentos, assim como está
relacionada a processos de regeneração de tecidos da pele. Entretanto, além da atividade
cicatrizante, seu extrato possui atividade anti-inflamatória, antimicrobiana, antiulcerogênica e
antioxidante. Esta espécie está descrita na Farmacopeia Brasileira e a mesma preconiza o
controle de qualidade com dosagem mínima de taninos e polifenóis na ordem de 20%, a sua
atividade anti-inflamatória foi confirmada em modelos experimentais de inflamação subaguda
e crônica (HERNANDES et al., 2010; ARDISSON et al., 2002).
O potencial antibacteriano do Stryphnodendron adstringens foi avaliada frente a diversas
bactérias e por diferentes autores, em estudo identificou-se o potencial de ação
antimicrobiológico através da formação de halo de inibição sensível de Stryphnodendron
adstringens frente a isolados de Streptococcus pyogenes, Proteus mirabilis, Shigella flexneri,
 23

Staphylococcus aureus, Staphylococcus spp. coagulase negativa (IFI), e Staphylococcus

epidermidis (ATCC) (GOLÇALVES, 2007).
O presente trabalho tem como objetivo avaliar o efeito do Stryphnodendron adstringens
em diferentes concentrações contra o Streptococcus agalactiae, bactéria associada a casos de
mastite subclínica, em busca de um método alternativo para o tratamento dessa enfermidade.

Material e Métodos

O presente trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Inspeção de Produtos de Origem

Animal (LIPOA) do Hospital Veterinário-UFES, em Alegre, ES.
O extrato utilizado foi cedido liofilizado pelo Laboratório de Produção Farmacêutica do
Departamento de Farmácia e Nutrição da UFES- Campus Alegre, sendo posteriormente diluído
em solução hidroalcoólica, com água destilada e álcool 70% na proporção de 1:1 e depois foram
feito as seguintes concentrações: 50mg/ml; 25mg/ml; 12,5mg/ml; 6,25mg/ml.
Foi utilizada cepa ATCC 13813 de Streptococcus agalactiae oriunda de doação da
Empresa de Pesquisa Agropecuária do Estado do Rio de Janeiro – PESAGRO-RJ.
As linhagens Streptococcus agalactiae foram cultivadas em caldo nutritivo (BHI- Brain
Heart Infusion – DIFCO), incubadas a 37º C por 18-24h. Após o cultivo realizou-se duas
replicações do S. agalactiae em meio BHI.
Para a realização do preparo do inóculo bacteriano, uma colônia foi coletada e
transferida para tubos com solução salina estéril NaCl 0,85%, (p/v) até atingir turbidez
equivalente a escala McFarland 0,5 (aproximadamente 1x108 UFC/mL) e semeadas na
superfície de ágar BHI.
Posteriormente procedeu-se a perfuração de orifícios no meio solidificado com
perfurador de 6 mm de diâmetro, nesses orifícios realizou-se a deposição de 20 µl do extrato
hidroalcóolico da casca de Stryphnodendron adstringens em suas diferentes concentrações
(50mg/ml; 25mg/ml; 12,5mg/ml; 6,25mg/ml). As placas foram encubadas em estufa a 37ºC por
48 horas. Os ensaios foram realizados em triplicata, acompanhados de controle positivo com o
antibiótico ampicilina (10 MCG) e controle negativo com água destilada + álcool 70% (1:1).
Após 48 horas encubadas em estufa a 37ºC procedeu-se a análise da formação ou não
de halos de inibição de crescimento, mensurados com paquímetro, objetivando-se a avaliação
do potencial de inibição das diferentes concentrações dos extratos da casca Stryphnodendron
adstringens sobre o crescimento de Streptococcus agalactiae.
 24

A sensibilidade da amostra foi considerada para medidas: Sensível (S), para os poços
que apresentaram ≥ 12mm, Intermediários (I) para resultados parciais entre 8mm e 11mm e
Resistente (R) no qual o raio dos discos apresentava halo menor que 8mm, de acordo com as
diferentes concentrações de extrato a qual foram submetidas (BEZERRA et al, 2009).

Resultados e Discussão

Não houve halo inibitório de crescimento em nenhum dos poços testados com as respectivas
concentrações de S. adstringens, assim sendo o S. agalactiae foi resistente a todas as
concentrações testadas, semelhante ao encontrado por CARVALHO-CASTRO, et al. (2018), que
não observaram ação de inibição do extrato das plantas Lentinula edodes e Euphorbia tirucalli,
frente o S. agalactiae, por meio do método de microdiluição em caldo. Ambos os estudos
usaram concentrações baixas de extrato, podendo esse fato ter levado ao insucesso dos testes.
Ao testarem extrato bruto de folhas de Cydinua oblonga frente à S. agalactiae, SILVA;
OLIVEIRA (2013) encontraram crescimento parcialmente reduzidos em concentrações de 400,
200 e 100 mg/mL, revelando um possível efeito inibidor deste extrato, pelo método de difusão
em ágar com discos de papel filtro embebidos por extrato. Podendo assim a metodologia
empregada e as concentrações do S. adstringens do presente estudo não terem sido suficientes
para inibir o crescimento do S. agalactiae.
O extrato hidroalcoólico da casca do S. adstringens não apresentou eficácia antibiótica
contra a bactéria S. agalactiae, diferente de PINHO et al. (2012), que testaram o extrato
hidroalcoólico da folha do S. adstringens frente o Staphylococcus aureus, pelo método de
difusão em ágar com discos de papel filtro embebidos por extrato em concentração de 50%,
onde está bactéria foi sensível ao extrato testado, e como GONÇALVES et al. (2007), que
encontraram sensibilidade semelhante usando a casca do S. adstringens. Características
intrínsecas do Streptococcus agalactiae, o uso de outra metodologia e partes da planta podem
justificar a não ação antibiótica neste trabalho.
Acredita-se que através dos solventes álcool 70%, possivelmente não se extraíram as
maiores concentrações de taninos pois ARDISSON et al. (2002) testaram propilenoglicol 70%
na formulação do extrato e obtiveram 30,5% de taninos, onde a concentração mínima de taninos
para o uso medicinal é 8%, podendo o extrato hidroalcoólico não ser tão efetivo quando o
glicólico.
 25

Novos estudos com cepas de campo, outras partes da planta, outras formas de extração de
metabólitos, outras concentrações e metodologias diferentes devem ser realizados para tentativa
de obtenção de resultados diferentes.

Conclusão

A atividade antibiótica do extrato hidroalcoólico do Stryphnodendron adstringens em

suas diferentes concentrações testadas não se mostraram eficiente sobre a cepa ATCC 13813
Streptococcus agalactiae.

Agradecimentos

Empresa de Pesquisa Agropecuária do Estado do Rio de Janeiro – PESAGRO-RJ. Agradeço a

todos que contribuíram de alguma forma, obrigada a todas!

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149
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151 PINTO, S. C. et. al. Stryphnodendron adstringens: Clarifying Wound Healing in
152 Streptozotocin-Induced Diabetic Rats. Planta médica, v.81, n.12, p. 1090-1096,
153 2015.
154
155
156 PRESTES, N. C. e LANDIM-ALVARENGA, F. C. Obstetrícia veterinária. Rio de
157 Janeiro: Guanabara koogan, pág. 25-35, 2006.
158
159
 31

160 RADOSTITS, O. M. et al., Clínica Veterinária, 9 ed., Rio de Janeiro: 2000.

161
162
163 RIBEIRO, Marie E. R. et al. Relação entre mastite clínica, subclínica infecciosa e não
164 infecciosa em unidades de produção leiteiras na região sul do Rio Grande do Sul.
165 Revista brasileira de agrociência, v.9, n. 3, p.287-290, jul.-set, 2003.
166
167
168 SANTOS, M. V. e FONSECA, L. F. L. Estratégias para o controle da mastite e
169 melhoria da qualidade do leite. Barueri: Manole, p. 314, 2006.
170
171
172 SILVA, F.G.; OLIVEIRA, G.L. Conhecimento popular e atividade antimicrobiana de
173 Cydonia oblonga Miller (Rosaceae). Revista Brasileira de Plantas Medicinais,
174 Botucatu, v.15, n.1, p.98-103, 2013.
175
176
177 SILVA, F. M.; PAULA, J. E.; ESPINDOLA, L. S. Evaluation of the antifungal
178 potential of Brazilian Cerrado medicinal plants. Mycoses, v. 52, n. 6, p. 511-
179 517,2009.
180
181
182 SIMÕES C. M. O., SCHENKEL, E.P.; A pesquisa e a produção brasileira de
183 medicamentos a partir de plantas medicinais: a necessária interação da indústria
184 com a academia. Revista Brasileira de Farmacognosia, v.12, n.1, p. 35-40, 2002.
185
186
187 SIMÕES, C. M. de O. et al. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 3. ed. Porto
188 Alegre: UFSC, 2001.
189
190
191 SOUZA C. M. P. et al. Utilização de plantas medicinais com atividade antimicrobiana
192 por usuários do Serviço público de Saúde em Campina Grande. Paraíba. Revista
193 Brasileira de Plantas Medicinais, v. 15, p. 188-193, 2013.
194
195
196 SOUZA T. M. et al. Avaliação da atividade anti-séptica de extrato seco de
197 Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville e de preparação cosmética contendo
198 este extrato. Revista Brasileira de Farmacognosia. Braz J. Pharmacogn. 17(1):
199 jan./mar. 2007
 32

200
201
202 THOMAZI, G. O. C; BERTOLIN, A. O.; PINTO, M. D. S. Atividade antimicrobiana
203 in vitro do barbatimão e da mangabeira contra bactérias relacionadas às
204 infecções do trato urinário. In: I Seminário internacional de ciências do ambiente e
205 sustentabilidade na Amazônia, 8, 2010, Manaus. Anais do: I Seminário internacional
206 de ciências do ambiente e sustentabilidade na Amazônia. Manaus: UFAM, 2010.
207
208
209 TOZZETTI, D.S.; BATAIER, M.B.N.; ALMEIDA, L.R. de. Prevenção, controle e
210 tratamento das mastites bovinas – Revisão de Literatura. Revista Científica
211 Eletrônica de Medicina Veterinária, Ano VI, n. 10, 2008.
212
213
214 WATTS, J. L. Etiological agents of bovine mastitis. Veterinary Microbiology, v.16,
215 p. 41-66, 1988.
216
217
218 WILLER H.; YUSSEFI M. The world of organics agriculture: statistics and
219 emerging trends, 2007.
220
221
222
223
224
225
226
227
228
229
230
231
232
233 ANEXO

234 Normas de Submissão para a Revista Arquivos do Instituto Biológico

235
 33

236 Apresentação: os trabalhos deverão ser elaborados em Word (.doc ou .docx), página A4, com
237 margens de 2,5 cm, fonte Times New Roman, tamanho 12, espaço duplo e páginas
238 numeradas em sequência.

239 As linhas deverão ser numeradas de forma contínua, utilizando a ferramenta Layout em
240 Configurar Página.

241 O máximo de páginas será 25 para artigos de revisão, 20 para artigos científicos e 10 para
242 comunicação científica, incluindo tabelas e figuras.

243 Idioma: o trabalho poderá ser redigido em português, inglês ou espanhol. Quando escrito em
244 português, o resumo deverá ter uma versão em inglês. No caso de artigo escrito em inglês ou
245 espanhol deverá ter um resumo em inglês ou espanhol e outro em português.

246 Título: embora breve, deverá indicar com precisão o assunto tratado no artigo, focando a sua
247 finalidade principal.

248 Nome(s) e Endereço(s) do(s) autor(es): Não deve constar do corpo do manuscrito, pois
249 Arquivos do Instituto Biológico segue revisão por pares duplos cega. Essas informações
250 devem ser inseridas no campo específico do sistema online de submissão.

251 Resumo: deverá apresentar concisamente o objetivo do trabalho, material e métodos e

252 conclusões, em um único parágrafo. Não ultrapassar 250 palavras.

253 Palavras-chave: abaixo do resumo e separado por um espaço, citar no máximo cinco
254 palavras-chave, separadas por vírgula. Não utilizar termos que apareçam no título.

255 Abstract: apresentar uma tradução para o inglês do título do trabalho e do resumo. A seguir,
256 relacionar também em inglês (ou espanhol) as mesmas palavras-chave (keywords, palabras-
257 clave) já citadas. Não ultrapassar 250 palavras.

258 Introdução: descrever a natureza e o objetivo do trabalho, sua relação com outras pesquisas
259 no contexto do conhecimento existente e a justificativa da pesquisa feita.

260 Material e Métodos: apresentar descrição breve, porém, suficiente para permitir uma
261 repetição do trabalho. Técnicas e processos já publicados, exceto quando modificados,
262 deverão ser apenas citados. Nomes científicos de espécies, bem como drogas, deverão ser
263 citados de acordo com regras e padrões internacionais.

264 Resultados: apresentá-los acompanhado de tabelas e/ou figuras, quando necessário. As

265 tabelas e figuras devem ser inseridas após as referências.

266 Discussão: discutir os resultados obtidos comparando-os com os de outros trabalhos

267 publicados (resultados e discussão poderão fazer parte de um único item).
 34

268 Tabelas e Figuras: incluir título claro e conciso que possibilite o seu entendimento sem
269 consultas ao texto. As tabelas não deverão conter linhas verticais. No texto, use a palavra
270 abreviada (ex.: Fig. 3). As figuras devem estar no formato jpg (fotos) ou gif (gráficos e
271 esquemas) e com tamanho inferior a 500 Kb. As figuras originais ou com maior resolução
272 poderão ser solicitadas após o aceite. Devem ser enviadas em arquivos individuais e
273 nomeadas de acordo com o número da figura. Exemplos: Fig1.gif, Fig2.jpg.

274 Conclusões: serão citadas em ordem de importância. Poderão constituir um item à parte ou
275 serem incluídas na discussão.

276 Agradecimentos: poderão ser incluídas pessoas ou instituições. No caso de agência de

277 fomento, deve-se incluir o número do processo do financiamento.

278 Referências e citações no texto: Citar apenas as referências estritamente necessárias para
279 a compreensão do trabalho. Recomenda-se em torno de 25 referências para artigos e
280 comunicações científicas. Citações no texto e referências estão diretamente vinculadas.
281 Todos os autores citados devem figurar nas referências. A referência no texto deve seguir o
282 sistema sobrenome do autor e ano de publicação e deverá estar em caixa alta reduzida ou
283 versalete, tal como: 1 autor - Allan (1979) ou (Allan, 1979); 2 autores – Lopes; Macedo (1982)
284 ou (Lopes; Macedo, 1982); mais de 2 autores - Besse et al. (1990) ou (Besse et al., 1990);
285 coincidências de autoria e ano de publicação - (Curi, 1998a), (Curi, 1998b) ou (Curi, 1998a,
286 1998b). As referências deverão ser baseadas na NBR 6023/2002, da Associação Brasileira
287 de Normas Técnicas (ABNT), e estar em ordem alfabética de primeiro autor. A exatidão dos
288 dados nas referências é de responsabilidade dos autores.

289 Seguem exemplos que servirão de diretriz para a formatação e apresentação das
290 referências:

291 a) Artigo de periódico

292 ANDRÉA, M.M. ; PETTINELLII JÚNIOR, A. Efeito de aplicações de pesticidas sobre a

293 biomassa e a respiração de microrganismos de solos. Arquivos do Instituto Biológico, São
294 Paulo, v.67, n.2, p.223-228, 2000.

295 b) Artigo de periódico em meio eletrônico

296 FELÍCIO, J.D.; SANTOS, R. da S.; GONÇALES, E. Componentes químicos de Vitis

297 vinífera (Vitaceae). Arquivos do Instituto Biologico., São Paulo, v.68, n.1, p.47-50, 2001.
298 Disponível em:<http://www.biologico.br/arquivos/v68_1/9>. Acesso em: 5 mar. 2002.

299 c) Dissertações e Teses

 35

300 PERES, T.B. Efeito da aplicação de pesticidas na atividade microbiológica do solo e na

301 dissipação do 14C-Paration Metílico. 2000. 75f. Dissertação (Mestrado em Ciências - Área de
302 Tecnologia Nuclear - Aplicações) - Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares, São Paulo,
303 2000.

304 SIMONI, I.C. Utilização de diferentes linhagens celulares para propagação do vírus da doença
305 infecciosa da bursa. 2001. 77f. Tese (Doutorado em Genética e Biologia Molecular - Área de
306 Microbiologia) - Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 2001.

307 Obs.: A primeira data nas dissertações e teses corresponde ao ano de depósito e a segunda
308 ao ano da defesa.

309 d) Dissertação/Tese em meio eletrônico

310 BATISTA, A.S. Saccharomices cerevisae em milho armazenado e o efeito na redução de

311 aflatoxicoses. 2001. 96p. Dissertação (Mestrado – Microbiologia Agrícola) - Escola Superior
312 de Agricultura "Luiz de Queiroz" Universidade de São Paulo, Piracicaba, 2001. Disponível em:
313 <http://www.teses.usp.br> Acesso em: 28 jun. 2005.

314 e) Livros no todo, folhetos etc.

315 BECKMANN, N. (Ed.). Carbon-13 NMR spectroscopy of biological systems. San Diego:
316 Academic Press, 1995. 334p.

317 f) Parte de livro (capítulo, trecho, fragmento etc.)

318 Capítulo ou parte sem autoria específica – autor da parte é o mesmo autor da obra

319 ALBERTS, B.; BRAY, D.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.; WATSON, J.D. Cell junctions,
320 cell adhesion, and the extracellular matrix. In: ______. Molecular biology of the cell. 3th.ed.
321 New York: Garland Publications, 1994. 1294p. Chap. 19.

322 Parte com autoria específica

323 BANIJAMALI, A. Thyroid function and thyroid drugs. In: FOYE, W.O.; LEMKE, T.L.;
324 WILLIAMS, D.A. (Eds). Principles of medicinal chemistry. 4th. Ed. Philadelphia: Lippincot
325 Williams & Wilkins, 1995. chap.30, p.688-704.