Guia - Protocolos Contaminação Petróleo UFRN

Autores: Liana de Figueiredo Mendes1, Marina Gomes Viana1, Mauro Sergio Pinheiro Lima1,
Simone Almeida Gavilan2, Fúlvio Aurélio de Morais Freire3, Sergio Maia Queiroz Lima4, Carlos
Eduardo Rocha Duarte Alencar3, Helenice Vital5, Patrícia Pinheiro Beck Eichler5, Renato
da Silva Carreira6, Rivelino Martins Cavalcante7, Adrian Pereira da Silva8, Clara de Souza
Melo8, Gabriel Dutra Teixeira8, Luanna Tereza Barbosa Andrade8, Lucas Paiva8, Luís Phelipe
Rodrigues da Fonseca Campos e Silva Filho8, Salu Coelho8, Lígia Moreira da Rocha1.
1 Universidade Federal do Rio Grande do Norte/UFRN, Depto. Ecologia, Laboratório do Oceano - LOC.
2 Universidade Federal do Rio Grande do Norte/UFRN, Depto. de Morfologia, Laboratório de Morfofisiologia de Vertebrados - LABMORVE
3 Universidade Federal do Rio Grande do Norte/UFRN - Laboratório de Biologia, Ecologia e Evolução de Crustáceos - LABEEC
4 Universidade Federal do Rio Grande do Norte/UFRN, Depto. de Zoologia e Evolução, Laboratório de Sistemática e Evolução - LISE
5 Universidade Federal do Rio Grande do Norte/UFRN, Depto. de Geologia, Laboratório de Geologia e Geofísica Marinha e Monitoramento
Ambiental - GGEMMA.
6 Pontifícia Universidade Católica do Rio de Janeiro (PUC-Rio), Depto. de Química, Laboratório de Estudos Marinhos e Ambientais - LabMAM
7 Universidade Federal do Ceará/UFC - Instituto de Ciências do Mar/LABOMAR, Laboratório de Avaliação de Contaminantes Orgânicos - LACOr
8 Bolsista na Universidade Federal do Rio Grande do Norte/UFRN.
1ª edição
RN Editora
NATAL/RN
2022
ISBN: 978-65-996489-6-0
Coordenação Técnica: Liana de Figueiredo Mendes
Projeto Gráfico: Terceirize projetos gráficos e editoriais
Editora: RN Editora
Fotos: Alex Barbosa de Moraes, APC Cabo de São Roque, Carlos Eduardo Rocha
Duarte Alencar, Gabriel Dutra, Gleyciane Katielle Cortês Ferreira, Helenice Vital,
Liana de Figueiredo Mendes, Lígia Moreira da Rocha, Luísa Medeiros, Mauro
Sergio Pinheiro Lima, Otoniel Santana, Patrícia Pinheiro Beck Eichler, Pedro
Paulo de Andrade Santos, PCCB/UERN, Renato da Silva Carreira.
Fotos da capa: Mauro Sérgio Pinheiro Lima, Liana de Figueiredo Mendes
Revisão ABNT: Rúbia Kátia Azevedo Montenegro
Catalogação da Publicação na Fonte.

Érica Simony F. de Melo Guerra – Bibliotecário CRB/15-296
G943 Guia para avaliação de contaminação por petróleo na biota marinha e sedimentos./ Liana
de Figueiredo Mendes...[et al.], Universidade Federal do Rio Grande do Norte,
Projeto INCT AmbTropic. Natal/RN: RN Editora, 2022.
133 p.: il.
ISBN: 978-65-996489-6-0
1. Meio ambiente – Contaminação - Petróleo. 2. Poluição marinha – Petróleo. 3.

Contaminação – Petróleo - Avaliação. I. Mendes, Liana de Figueiredo. II. Viana, Marina
Gomes. III. Lima, Mauro Sergio Pinheiro. IV. Rocha, Ligia Moreira da. V. Gavilan,
Simone Almeida. VI. Freire, Fulvio Aurelio de Morais. Freire. VII. Lima, Sergio Maia
Queiroz. VIII. Alencar, Carlos Eduardo Rocha Duarte. IX. Vital, Helenice. X. Eichler,
Patricia Pinheiro Beck. XI. Carreira, Renato da Silva. XII. Cavalcante, Rivelino Martins.
XIII. Silva, Adrian Pereira da. XIV. Melo, Clara de Souza. XV. Teixeira, Gabriel Dutra.
XVI. Andrade, Luanna Tereza Barbosa. XVII. Paiva, Lucas. XVIII. Silva Filho, Luís
Phelipe Rodrigues da Fonseca Campos e. XIX. Coelho, Salu. XX. Universidade Federal
do Rio Grande do Norte. XXI. Projeto INCT AmbTropic.
CDU 504.054:665.6/.7
“Este trabalho foi realizado no âmbito do
inctAmbTropic Fase II (Processo CNPq
465634/2014-1) vinculado à Ação emergencial ao
combate do derrame de óleo de 2019 do MCTI.”
SUMÁRIO
APRESENTAÇÃO ............................................................................. 7
CAPÍTULO 1
IMPACTOS POR PETRÓLEO E AMBIENTES MARINHOS............... 11
Principais hidrocarbonetos de petróleo................................................. 13
Impactos do Petróleo ........................................................................... 16
Estuários e manguezais........................................................................ 21
Praias Arenosas.................................................................................... 24
Ambientes recifais................................................................................ 26
CAPÍTULO 2
METODOLOGIA DE TRABALHO.................................................... 31
Registro das localizações impactadas com petróleo.............................. 31
Descontaminação prévia do material para coleta em campo................ 35
Protocolo de segurança em campo....................................................... 37
Procedimento de coleta das amostras .................................................. 38
CAPÍTULO 3
ANÁLISES MACROSCÓPICAS E MICROSCÓPICAS DE
AMOSTRAS BIOLÓGICAS.............................................................. 51
Avaliação Morfológica Externa................................................... 51
Biometria básica e pesagem....................................................... 52
Avaliação morfológica interna de peixes.................................... 56
Análise de conteúdo gastrointestinal em peixes ........................ 56
Análise Histopatológica............................................................. 58
CAPÍTULO 4
ANÁLISE DE SEDIMENTOS............................................................ 63
Análises granulométricas, mineralógicas e quantificação de
carbonato e de matéria orgânica (MO) ..................................... 63
Análise de microfósseis foraminíferos........................................ 66
CAPÍTULO 5
ANÁLISE QUÍMICA DE CONTAMINANTES ................................... 69
Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) e
elementos traço ........................................................................ 69
Análise para detecção hidrocarbonetos policíclicos
aromáticos (HPAs)..................................................................... 70
Determinação de mercúrio total (HgT)...................................... 75
Determinação de cádmio (Cd), cobre (Cu), prata (Ag),
selênio (Se) e vanádio (V)........................................................... 76
Análise química de sedimentos................................................... 76
CAPÍTULO 6
ASSIMETRIA FLUTUANTE - ANÁLISE INDIRETA........................... 85
Armazenamento, tratamento e padronização das amostras
para os procedimentos de Morfometria Geométrica................... 88
Conceitos básicos em Morfometria Geométrica......................... 93
Assimetria Flutuante da Forma e análise estatística................. 100
CONSIDERAÇÕES FINAIS............................................................ 108

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................ 112
ANEXO 1 - Materiais e equipamentos necessários para
coleta da biota ............................................................................ 125
ANEXO 2 - Organismos bioindicadores de contaminação
por petróleo.................................................................................. 126
ANEXO 3 - Protocolo de coleta e processamento das
amostras biológicas e de sedimento.............................................. 129
ANEXO 4 - Modelo de declaração para envio aéreo de
amostras biológicas...................................................................... 130
ANEXO 5 - Escala Bernet et al. (1999)......................................... 131
APRESENTAÇÃO
No iní�cio de setembro de 2019 manchas de petróleo cru che-

garam na costa tropical do Brasil, em quatro meses 3.000 dos 8.000
km do litoral brasileiro foram atingidos. Desastres com petróleo
são comuns em ambientes marinhos e, quando o petróleo atinge a
zona costeira, os efeitos deletérios recaem sobre a multiplicidade
de formas de vida e de ecossistemas ali existentes, como estuários
e manguezais, praias arenosas e ambientes recifais.
O petróleo é constituí�do por milhares de compostos quí�micos
sendo os hidrocarbonetos policí�clicos aromáticos (HPAs) os mais
tóxicos. Na ocorrência de acidentes com petróleo em ambientes ma-
rinhos é necessária uma visão ampla e integrada acerca do alcance
do desastre, com enfoque no ní�vel da contaminação dos ecossiste-
mas e de organismos marinhos. É� essencial seguir um protocolo de
análise de contaminantes por petróleo, considerando os diversos
habitats e o posicionamento dos organismos na cadeia trófica a fim
de compreender a dimensão da contaminação e agilizar ações efi-
cazes na condução de investigações a curto, médio e longo prazo.
Este guia descreve os procedimentos de coleta em campo,
seleção de amostras (organismos e sedimentos), materiais e mé-
todos necessários para avaliar as respostas ambientais frente à
contaminação por petróleo em habitats costeiros. As descrições
são seguidas de ilustrações como imagens dos ecossistemas, orga-
nismos, materiais utilizados e procedimentos laboratoriais. O guia
tem como objetivo auxiliar no desenvolvimento de condutas e pro-
cedimentos aplicáveis às possí�veis situações semelhantes futuras.
Ações imediatas e eficazes auxiliam na mitigação e recuperação dos
impactos provocados pelo petróleo, contribuindo para conservação
e remediação ambiental.
7
O Guia está estruturado em nove seções. No Capítulo 1 é apre-
sentado um resumo sobre o desastre com petróleo ocorrido na costa
do Brasil em 2019, os prejuí�zos conhecidos que o petróleo e seus de-
rivados causam na biota, além das caracterí�sticas gerais de ambientes
costeiros acometidos como praias arenosas, estuários, manguezais e
ambientes recifais. O Capítulo 2 apresenta protocolos metodológi-
cos necessários ao desenvolvimento do trabalho de campo em situ-
ações de acidente com petróleo, como procedimentos básicos para
preparo de material, coleta, acondicionamento das amostras bioló-
gicas e de sedimentos e procedimentos de envio das mesmas, caso
seja necessário. O Capítulos 3 descreve análises macroscópicas e
microscópicas, respectivamente. No primeiro caso, as análises focam
na descrição morfológica do organismo e no exame da situação geral
do indiví�duo, como inspeção inicial visual externa, biometria e ava-
liação de órgãos. Em seguida são abordadas análises histopatológi-
cas com o objetivo de verificar alterações patológicas que possam ter
sido provocadas pela contaminação. No Capítulo 4 são apresentadas
análises de sedimentos, envolvendo granulometria, matéria orgânica
e micro fósseis. Já no Capítulo 5 são descritos procedimentos para
avaliação quí�mica de contaminantes como hidrocarbonetos policí�cli-
cos aromáticos (HPAs) e elementos-traço como mercúrio total (HgT)
cádmio (Cd), cobre (Cu), prata (Ag), selênio (Se) e vanádio (V) em
amostras biológicas e sedimentos. No Capítulo 6 é abordado o estu-
do de assimetria flutuante como uma análise indireta para avaliar o
estresse na biota marinha. Por fim, seguem Considerações Finais,
Referências Bibliográficas e Anexos.
Este trabalho foi elaborado a partir da experiência acumula-
da de pesquisas conduzidas na Universidade Federal do Rio Gran-
de do Norte (UFRN) com apoio da Pró-reitoria de Pesquisa (Pro-
pesq/UFRN) e do Projeto INCT em Ambientes Marinhos Tropicais
8
– AmbTropic – fase II (Processo CNPq: 465634/2014-1, vigência
23/11/2016 a 30/11/2022, GT 4.0) no litoral do estado do Rio
Grande do Norte, após desastre socioambiental ocorrido com der-
ramamento de petróleo em 2019. Na UFRN, o Laboratório do Ocea-
no (LOC), Laboratório de Morfofisiologia de Vertebrados (LABMOR-
VE), Laboratório de Biologia, Ecologia e Evolução de Crustáceos
(LABEEC), Laboratório de Sistemática e Evolução (LISE) e Labora-
tório de Geologia e Geofí�sica Marinha e Monitoramento Ambiental
(GGEMMA) participaram na elaboração deste guia. Colaboraram
ainda o Laboratório de Estudos Marinhos e Ambientais (LabMAM)
da Pontifí�cia Universidade Católica do Rio de Janeiro (PUC-Rio),
Laboratório de Avaliação de Contaminantes Orgânicos-LACOr/LA-
BOMAR da Universidade Federal do Ceará/UFC e Laboratório de
Recifes de Corais e Mudanças Globais da Universidade Federal da
Bahia, na Coordenação do Projeto INCT em Ambientes Marinhos
Tropicais – AmbTropic – fase II e apoio financeiro.
9
CAPÍTULO I
IMPACTOS
POR PETRÓLEO
E AMBIENTES
MARINHOS
IMPACTOS POR PETRÓLEO E
1
AMBIENTES MARINHOS
O
petróleo que acometeu a costa do Brasil no segundo semes-
tre de 2019 se dispersou por 3.600 km do litoral brasileiro,
alcançando 1009 praias,130 municí�pios e 11 estados, do
Maranhão ao Rio de Janeiro (IBAMA, 2020). Os maiores aportes de
petróleo foram observados na região Nordeste e em menor quanti-
dade em dois estados do sudeste do paí�s, além de alguns registros
na costa Amazônica (Figura 1.1). Este evento é considerado o mais
extenso e grave de contaminação registrado na história do Brasil,
bacia do oceano Atlântico Sul e regiões costeiras tropicais do mun-
do (Campelo et al., 2021; Soares et al., 2022). Foram retiradas das
praias brasileiras 5,38 mil toneladas de petróleo (UOL, 2021).
Figura 1.1: Mapa dos pontos de encalhe de petróleo em 2019

Fonte: https://www.inctambtropicii.org/mapadooleo
Guia para Avaliação de Contaminação por

Petróleo na Biota Marinha e Sedimentos
11 CAPÍTULO 1
Impactos por petróleo e ambientes marinhos
Ao longo dos meses do desastre, o IBAMA (Instituto Brasilei-
ro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis) registrou
159 ocorrências de animais oleados. Encalharam mortos 112 indiví�-
duos, incluindo cetáceos, aves e tartarugas marinhas (IBAMA, 2020).
No litoral do Rio Grande do Norte foram contabilizados 15 animais
oleados, com 14 tartarugas e uma ave (IDEMA, 2020). Estima-se que
o quantitativo de vertebrados encalhados tenha sido maior, uma vez
que existe a possibilidade de ocorrências de encalhes em locais de
difí�cil acesso e estes não são registrados, além da situação de que
nem todas as carcaças chegam às praias. Ainda vale ressaltar que tais
ocorrências indicam apenas aquelas registradas para alguns grupos
de vertebrados e desconsideram a biodiversidade real impactada pe-
los compostos quí�micos na água (e.g. fito e zooplâncton) ou habitats
submersos recobertos pela decantação do petróleo, sugerindo assim
impacto muito maior do que o estimado.
O primeiro registro oficial da ocorrência de petróleo na costa do
Rio Grande do Norte durante o desastre de 2019 ocorreu no dia 07 de
setembro, quando pelotas de petróleo foram registradas na praia da
via Costeira, municí�pio de Natal e praias do municí�pio de Baí�a Formo-
sa. Ao todo 43 praias do estado foram oleadas e os municí�pios mais
atingidos foram Ní�sia Floresta e Tibau do Sul, com remoção de 31 e
3 toneladas de resí�duos das praias, respectivamente (IDEMA, 2020)
(Figura 1.2). Ambos municí�pios fazem parte da Á� rea de Proteção Am-
biental Estadual Bonfim Guaraí�ra (APABG), área protegida terrestre
com faixa costeira1. Foi a partir da experiência acumulada de pesqui-
sas conduzidas pela UFRN2 e parceiros, no pós desastre de 2019, que
se verificou a necessidade de criar uma publicação que orientasse as
atividades de equipes interdisciplinares no caso de novas ocorrências.
1 Até o momento a área marinha contígua à APABG está em processo de avaliação no ICMBio com vis-
tas à criação de nova APA marinha, devido à riqueza da biodiversidade marinha existente na região
2 Apoio da Propesq/UFRN e do Projeto INCT em Ambientes Marinhos Tropicais – AmbTropic –
fase II (Processo CNPq: 465634/2014-1, vigência 23/11/2016 a 30/11/2022, GT 4.0)

12 CAPÍTULO 1
b
a c
Figura 1.2: Litoral sul do Rio Grande do Norte atingido pelo petróleo
do desastre de 2019. Petróleo ao longo da linha d’água - Praia de
Camurupim (a), folhas do mangue recobertas pelo petróleo (b) e
mancha de petróleo recobrindo parte das formações recifais areníticas
e vegetação de praia (c). Município de Nísia Floresta. Fotos: autor
desconhecido (a), Luísa Medeiros (b) e (c).
Principais hidrocarbonetos de petróleo

O petróleo ou óleo bruto é um lí�quido viscoso preto-amarela-
do de ocorrência natural, encontrado no subsolo e formado a partir
de processos geológicos. É� matéria-prima para a produção de com-
bustí�veis e de insumos diversos (plásticos, produtos de limpeza e
até alimentos) (Wang e Stout, 2006). Os hidrocarbonetos consti-
tuem de 90 a 95 % da composição elementar quí�mica do petróleo,
representados especialmente pelas classes quí�micas de hidrocar-
bonetos alifáticos (cí�clicos ou não-aromáticos) e hidrocarbonetos
aromáticos (metilados e não-metilados). Dessa forma, os hidrocar-
bonetos presentes no petróleo podem ser denominados de hidro-
carbonetos de petróleo. Na Figura 1.3 pode-se observar o perfil quí�-
mico do óleo que aportou na praia da região leste do Ceará, no mês

13 CAPÍTULO 1
de setembro de 2019, o qual foi analisado através de cromatografia
bidimensional, fruto da parceria entre o Labomar/UFC e o Instituto
de Oceanografia de Woods Hole, EUA (Reddy et al., 2021).
Figura 1.3: Cromatograma GCxGC-FID-2D (a) e cromatograma

GCxGC-FID-2D do óleo recolhido na praia de Canoa Quebrada
(leste do Ceará) (b). Fonte: REDDY et al., 2021.
Seguindo o que é reportado na literatura e atestado no cro-

matograma GCxGC-FID (2D-GC), pode-se ratificar que o petróleo é
constituí�do por várias classes quí�micas de hidrocarbonetos de pe-
tróleo, entre as quais se destacam os hidrocarbonetos policí�clicos
aromáticos (HPAs) e os hidrocarbonetos alifáticos (HAs), além de
uma classe particular conhecida como compostos orgânicos voláteis
(COVs) (Wang e Stout, 2006). Segundo Reyes et al. (2014) as classes
dos HPAs, dos HAs e os biomarcadores (hopanos e esteranos) repre-
sentam os principais indicadores geoquí�micos usados na petrologia
para fornecer informações sobre a fonte de matéria orgânica, carac-
terí�sticas paleoambientais, grau de evolução térmica, identificação
de óleo e relação rocha-óleo, óleo-óleo e rocha-rocha.
Os HPAs e os HAs também podem ser usados na abordagem de
marcadores moleculares de atividades naturais – uma vez que ocor-
rem de forma natural – e antropogênicas, quando são usados em ativi-
dades humanas. Neste último caso, tornam-se indicadores dessas ati-
vidades (Eganhouse, 1997; Stogiannidis e Laane, 2014; Nelson et al.,

14 CAPÍTULO 1
2016) e de derramamentos de petróleo como o ocorrido no Brasil. Os
HPAs compõem uma classe de contaminantes orgânicos que contêm
dois ou mais anéis aromáticos fundidos e se destacam como um dos
principais marcadores moleculares na distinção de fontes naturais ou
antropogênicas, de fontes petrogênicas ou pirogênicas. Em áreas com
acidentes de derramamento de petróleo, os HPAs predominantes ou
com concentração significativa serão denominados de HPAs petrogê-
nicos (HPAs de baixa massa molecular), enquanto em áreas com au-
sência de derramamento serão predominantes os HPAs pirogênicos
(HPAs com alta massa molecular) (Stogiannidis e Laane, 2014). Outras
“ferramentas” quí�micas para a distinção de aporte de petróleo são o
Í�ndice Pirolí�tico e Razões de Diagnósticos, as quais atestam ou descar-
tam a evidência de derramamento de petróleo na região em estudo
(Venkatesan, 1988; Stogiannidis e Laane, 2014).
Os HAs possuem como uma das principais caracterí�sticas a bai-
xa polaridade, sendo constituí�dos pelos compostos: alcanos e ciclo-
alcanos (cadeia normal e ramificada), alcenos e cicloalcenos (cadeia
normal e ramificada), alcinos, terpanos, hopanos, esteranos e outros
(Nelson et al., 2016). Por apresentarem caracterí�sticas associáveis ao
seu aporte, os HAs tornaram-se uma das mais importantes classes de
marcadores moleculares utilizados para elucidar a origem (natural
ou antrópica) da matéria orgânica sedimentar encontrada em com-
partimentos ambientais, tais como sedimentos (Reddy et al., 2000).
A Mistura Complexa Não Resolvida (MCNR) consiste em um
conjunto de hidrocarbonetos de cadeia aberta ramificada e hidrocar-
bonetos de cadeia cí�clica que não são resolvidos por técnicas croma-
tográficas monodimensionais (1D-GC), sendo evidenciada em croma-
togramas onde é possí�vel observar uma elevação anormal da linha de
base (Wang e Stout, 2006). A MCNR é extraí�da com os hidrocarbonetos
alifáticos e, por ser uma feição caracterí�stica em amostras com suspeita

15 CAPÍTULO 1
de impacto ambiental – e quando é encontrada em sedimentos acima
de 10 µg/g –, torna-se uma das principais ferramentas geoquí�micas
para evidenciar a presença de resí�duos de petróleo no meio ambiente
(Reddy et al., 2000; Wang e Stout, 2006; Farrington e Quinn, 2015).
Impactos do Petróleo
O petróleo é constituí�do por inúmeros compostos e apresen-
ta hidrocarbonetos policí�clicos aromáticos (HPAs), uma classe de
compostos que se destaca por serem ubí�quos, persistentes, bioa-
cumularem e terem alto potencial carcinogênico (Manoli e Samara,
1999). Desta maneira são diversos seus efeitos deletérios. Estes po-
dem ocorrer, por exemplo, pela ação fí�sica como o sufocamento de
organismos e sombreamento de habitats, por modificação quí�mica
de habitat (devido à diminuição do pH e do oxigênio dissolvido) e
diminuição da disponibilidade de alimentos pela redução das po-
pulações por ação tóxica (Hoffman et al. 2005). Organismos que ti-
veram contato direto com o petróleo e não morreram incorporarão
os contaminantes por meio das membranas e tecidos (Cedre, 2007;
Albers, 1995), podendo haver prejuí�zos no metabolismo celular e ati-
vidades diárias indispensáveis aos seres vivos (Buskey et al., 2016;
Barroso, 2010). Sabe-se que HPAs de quatro, cinco e seis anéis aro-
máticos têm maior potencial carcinogênico, ampliado em função da
exposição à radiação ultravioleta solar (Ren et al., 1994; Arfsten et
al., 1996), desencadeando mutações e malformações no desenvolvi-
mento, além de formação de tumores e câncer (Santodonato, 1981;
Varanasi, 1989).
A partir do momento que o petróleo atinge o meio ambiente,
passa a sofrer alterações da sua composição original decorrente do in-
temperismo causado por processos fí�sicos, quí�micos e biológicos. Tais
alterações dependem do tipo de petróleo e das condições ambientais

16 CAPÍTULO 1
e uma sistematização desses processos pode ser encontrada em Far-
rington et al. (2021). Com o passar do tempo o petróleo se fragmenta:
uma parte afunda em solo marinho, outra se mescla à areia e a outros
tipos de substratos inconsolidados (Lopes et al., 2007; ITOFP, 2011;
Soares et al., 2020). Á� reas com fragmentos de petróleo ainda estão
sendo registradas após dois anos (2021) do desastre. É� o caso da Praia
de Itacimirim, municí�pio de Camaçari/BA (CPBA, 2021), quando em
junho de 2021 foi identificada a presença de petróleo em estruturas
rochosas na área de arrebentação. Trata-se do mesmo petróleo que
atingiu as praias em 2019 segundo análises conduzidas pela Univer-
sidade Federal da Bahia (UFBA) em colaboração com o IBAMA (UOL,
2021). No RN ainda são registrados fragmentos em rochas e na areia
da Praia de Tabatinga, Búzios, Pirangi e Cotovelo (Figura 1.4), locais
turí�sticos onde também ocorrem atividades de pesca artesanal de sub-
sistência, ao sul da capital Natal.
A permanência do poluente e seu poder de dano sugere o alcan-
ce da contaminação. Alguns autores mencionam que o petróleo não se
acumula ao longo da cadeia trófica nos ecossistemas aquáticos (apud
McElroy et al., 1989; Broman et al., 1990). No entanto, trabalhos mais
recentes (Hoffman et al, 2005) demonstram que, dependendo do tá-
xon, o grau de acumulação dos derivados do petróleo pode ocorrer de
forma distinta uma vez que estes contaminantes ficam biodisponí�veis
no ambiente por longo perí�odo. Assim, podem ser magnificados ao
longo da cadeia trófica até os ní�veis mais elevados (Lopes et al., 2007),
o que significa a contaminação de predadores de topo, incluindo as es-
pécies de peixes de grande porte de importância comercial.
A bioacumulação de hidrocarbonetos geralmente é inver-
samente relacionada à capacidade do organismo de metabolizar o
contaminante. Moluscos bivalves têm a capacidade de oxigenação
de função mista (MFO) mal desenvolvida, acumulando hidrocarbo-

17 CAPÍTULO 1
netos rapidamente. Assim a depuração será lenta caso estes sejam
expostos cronicamente a tais contaminantes. Por outro lado, peixes
e alguns crustáceos possuem um sistema MFO mais desenvolvido e
são capazes de metabolizar hidrocarbonetos, acumulando apenas
em áreas altamente poluí�das, situação que não exclui a bioacumula-
ção de elementos-traço mencionados anteriormente. Além disso, a
solubilidade, a biodisponibilidade e o tempo de exposição são fatores
que definirão o potencial de toxicidade dos hidrocarbonetos para os
organismos marinhos (Alford et al., 2015).
b c d
Figura 1.4: Ocorrências de fragmentos de petróleo bruto, no início de
novembro de 2021. Praia de Cotovelo (a), pelotas na Praia de Búzios (b)
e coleta de amostras (c) e visitantes com pés manchados na Praia de
Cotovelo (d). Foto: Liana Mendes (a, c e d) e PCCB/UERN (b).
O material encalhado na costa brasileira apresentou hidro-

carbonetos leves, aumentando a probabilidade de efeitos negativos
para organismos e ecossistemas costeiros (Lourenço et al., 2020). As
caracterí�sticas quí�micas e fí�sicas do petróleo derramado, somadas à

18 CAPÍTULO 1
limpeza pouco eficaz dos locais atingidos, infiltração e fragmentação
do óleo (como observado em monitoramento in situ), conferem um
alto potencial de impactos decorrentes do acidente aqui considera-
do. Desta forma, o petróleo não removido liberará lentamente com-
postos tóxicos no ambiente, ameaçando a integridade dos ecossiste-
mas a médio e longo prazo. A curto e médio prazo as partí�culas de
petróleo podem ser acumuladas nas brânquias, tecidos epiteliais e
membranas danificando os mesmos e impedindo as trocas gasosas.
Também podem causar efeitos tóxicos em organismos filtradores,
tornando-os incapazes de se alimentar, ou causando a morte rápida
de organismos devido à ingestão direta, ou promover efeitos a médio
e longo prazo como prejudicar taxa de crescimento e reprodução, e
causar prejuí�zos na formação do coração nos primeiros estágios de
vida de peixes (Mendes et al., 2021).
Vale ressaltar que do ponto de vista humano as populações vul-
neráveis ao derramamento de petróleo são diversas. De acordo com
Sandifer et al. (2021) o impacto inicial atinge os trabalhadores dire-
tamente relacionados ao derramamento e aqueles que farão a limpe-
za, seguidos pela população que depende diretamente dos recursos
naturais atingidos, depois a população em geral que mora na área
atingida ou nos arredores. Neste caso, crianças, idosos e grávidas
moradoras das comunidades afetadas diretamente são especialmen-
te vulneráveis, assim como a população com doenças crônicas ou que
enfrentam disparidades socioeconômicas. Os autores destacam ain-
da que os impactos psicológicos e de saúde fí�sica acontecem indivi-
dualmente, já os impactos econômicos envolvem tanto o ní�vel indivi-
dual como comunitário. Por fim, os impactos sociais (como aumento
de conflitos e deslocamento forçado do território) e culturais (como
perda de identidade, tradições e senso de segurança) acontecem no
ní�vel comunitário. Sousa et al., 2022 mapeou 500 empreendimentos

19 CAPÍTULO 1
que depende de AMP’s e a maioria das empresas (34,4%) estava en-
volvida no setor alimentar, relacionado com a economia oceânica e,
portanto, altamente vulnerável a derrames de petróleo.
No caso do desastre com petróleo em 2019 na costa Brasilei-
ra, atividades econômicas como a pesca artesanal (Figura 1.5) e tu-
rismo foram especialmente afetados (Mesquita e Quinamo, 2020).
Um dos impactos diretos na pesca é a queda brusca na venda do
pescado devido ao baixo consumo, associado ao medo de conta-
minação, ou indiretamente pela queda das demandas do turismo
devido ao baixo movimento nos estabelecimentos como pousadas,
bares, barracas de praia e restaurantes.
Figura 1.5: Pesca artesanal com tarrafa em estuário no

litoral sul do RN. Foto: Mauro Lima.
Outros aspectos do impacto nas comunidades litorâneas refe-

rem-se ao aumento da insegurança alimentar, como a contaminação
por ingestão de alimento com metais (e.g. mercúrio e cádmio), con-
taminação orgânica por contato direto com o petróleo, aumento da
taxa de problemas psicológicos relacionados ao evento, impacto em
serviços culturais como pesca e turismo, com a destruição de áreas
usadas historicamente para trabalho ou lazer (Mendes et al., 2021).

20 CAPÍTULO 1
Estima-se que 60 mil pescadores necessitaram de auxí�lio do governo
por terem suas atividades interrompidas/comprometidas e a renda
prejudicada pelo desastre ambiental (Pacheco, 2019; G1, 2019).
De maneira geral, desastres com petróleo atingem severamente
o modo de vida das populações litorâneas tradicionais, cuja própria
identidade está atrelada ao ambiente costeiro marinho. É� fundamen-
tal haver celeridade na obtenção de informações e prontidão para que
sejam tomadas providências adequadas considerando a extensão dos
impactos socioambientais na zona costeira, lembrando que parte das
respostas necessárias incluem o amparo social às populações afetadas.
A seguir são descritos os ecossistemas costeiros potencialmen-
te afetados pelo derramamento de petróleo, utilizando como exem-
plos locais no litoral do Rio Grande do Norte cujas áreas foram aco-
metidas pelo petróleo de 2019.
Estuários e manguezais
As regiões estuarinas e manguezais são áreas de transição en-
tre corpos d’água doce continentais e águas salgadas do ambiente
marinho, caracterizadas pelo baixo hidrodinamismo, acúmulo de
sedimentos trazidos pelos rios e alta influência das marés. Embora
nem todo estuário abrigue um manguezal, todo manguezal se situa
no estuário de um rio. Para que se estabeleça um manguezal são ne-
cessárias condições especí�ficas de volume e deposição de sedimen-
to. Esses ambientes estuarinos onde se concentram os manguezais
acumulam mais matéria orgânica, permitindo um ecossistema mais
rico intimamente associado ao terrestre e marinho. No caso de der-
ramamento, os derivados do petróleo podem ser dispersos a partir
da linha de costa em direção ao continente via estuários e mangue-
zais, auxiliado pela movimentação das marés baixas e dispersão de
animais (Figura 1.6).

21 CAPÍTULO 1
a
b c
Figura 1.6: Manguezais nos municípios de Baía Formosa (a) e Nísia Floresta
(b). Detalhe do tronco de mangue com manchas de petróleo (dois anos
após desastre de 2019) e molusco gastrópode (Littoraria angulifera) com
a concha impregnada por petróleo (c). Fotos: Mauro Lima.
A vegetação peculiar dos mangues com raí�zes aéreas (pneuma-

tóforos) e o baixo hidrodinamismo facilitam a aderência e estagnação
do petróleo nesses ecossistemas (Alves, 2001), ratificando sua vulne-
rabilidade. Estuários e manguezais são ainda reconhecidas áreas de
alimentação e berçário para muitas espécies marinhas. Sua ictiofau-
na é diversa ocorrendo também espécies de água doce, migratórias
marinhas e exclusivas (Blaber e Barletta, 2016). Algumas espécies
possuem importância na bioacumulação de derivados do petróleo
devido seus hábitos alimentares como tainhas (Famí�lia Mugillidae)
que são iliófagas3 e sardinhas (Famí�lias Clupeidae e Engraulidae)
que, em geral, se alimentam de plâncton ou pequenos organismos
(Carvalho Filho, 1999; Fischer e Pereira, 2011) (Figura 1.7). Na re-
gião semiárida os estuários podem ser hipersalinos e são berçários
de peixes recifais com destaque na importância da conservação des-
tes ambientes para pesca (Sales et al., 2016).
3 Iliófagos são peixes que ingerem substrato formado por lodo ou areia, nos quais podem ser
encontrados organismos microscópicos de superfície, matéria coprogênica e diversos detritos de
origem planctônica, macroflora, de fauna nectônica e bentônica, detritos orgânico e inorgânicos.

22 CAPÍTULO 1
a b
Figura 1.7: Tainha (Mugil curema) (a) e sardinhas (Harengula sp.) (b) em
ambiente natural no NE brasileiro. Fotos: Liana Mendes.
Além dos peixes, as regiões estuarinas são ricas e abundantes em

moluscos e crustáceos. Os moluscos bivalves filtradores são conhecidos
por serem bons indicadores ambientais de concentração de contaminan-
tes e metais. Sururus (Famí�lia Mytilidae), mariscos (Famí�lia Veneridae)
e ostras (Famí�lia Ostreidae) tendem a absorver substâncias quí�micas e
metais em seus tecidos (Galvão et al., 2009). São invertebrados comuns
nos estuários, em bancos de lama e raí�zes do mangue e têm capacida-
de de oxigenação de função mista (MFO) acumulando hidrocarbonetos
rapidamente. Crustáceos decápodes, como caranguejos e camarões, são
animais bentônicos de hábito alimentar generalista e também acumu-
lam compostos quí�micos (Silva et al., 2018) (Figura 1.8).
a b
c d
Figura 1.8: Mariscos (Anomalocardia flexuosa) (a); sururus (Mytella strigata) (b);
caranguejo uçá (Ucides cordatus) (c) e camarão (Xiphopenaeus kroyeri) (d).
Fotos: Lígia Rocha (a e b), Carlos Eduardo Alencar (c) e Alex Moraes (d).

23 CAPÍTULO 1
Importante destacar que tanto invertebrados (e.g. moluscos e
crustáceos) como peixes têm grande importância na pesca de sub-
sistência de comunidades que vivem próximas aos mangues e estu-
ários (Silva e Martins, 2017; Mendes et al., 2021).
Praias Arenosas
As praias arenosas marcam a transição entre o continente e o am-
biente marinho (Figura 1.9). São zonas em que ocorrem múltiplos pro-
cessos fí�sico-quí�micos com alta instabilidade do substrato e alto hidro-
dinamismo com diversas espécies marinhas e terrestres. A maioria dos
organismos bentônicos que utilizam a areia para garantir abrigo são
principalmente crustáceos, moluscos e anelí�deos (Mclachlan e Brown,
2006; Matthews-Cascon e Lotufo, 2006; Santos e Ferreira, 2019).
a b
c d
Figura 1.9: Praias do litoral do RN com diferente hidrodinâmica. Praia tipo
arenosa reflexiva com forte ação de correntes, ondas e vento (Praia
de Búzios) (a); praia arenosa abrigada com baixo hidrodinamismo e
próxima à desembocadura do Rio Pirangi (b); praia arenosa com baixo
hidrodinamismo e presença de recifes (Barra de Tabatinga) (c) e praia
com presença de mancha de petróleo um ano após o evento (Praia do
Giz) (d). Municípios de Nísia Floresta e Tibau do Sul. Fotos: Mauro Lima.

24 CAPÍTULO 1
A zona de arrebentação em praias arenosas é uma importante
área para peixes por ser rasa e favorecer a segurança e alimentação no
desenvolvimento de indiví�duos jovens (Gaelzer e Zalmon, 2003; Paiva
Filho e Toscano, 1987). Este ecótono atrai diversas espécies que com-
põem grupos funcionais diversos com amplo espectro trófico como
organismos residentes e migratórios como raias, tubarões, xaréus, ba-
gres, camurupins, robalos, tainhas, sardinhas e pescadas. Assim como
os bagres, muitas destas espécies também utilizam os estuários (Ga-
elzer e Zalmon, 2003) e estão na base da cadeia dos consumidores,
alimentando-se de microalgas, detritos e organismos bentônicos e que
frequentemente são capturadas pela pesca artesanal (Figura 1.10).
a c
Figura 1.10: Peixes que habitam estuários e zonas de arrebentação
de praias. Tainhas (Mugil curema) (a), sardinhas (Harengula sp.) (b) e
bagre (Sciades herzbergii) (c). Fotos: Mauro Lima (a e b) e Wikipédia, a
enciclopédia livre (c).

25 CAPÍTULO 1
Parte da ictiofauna das praias arenosas possui estreita rela-
ção com os estuários e muitas destas espécies passam alguma fase
de vida transitando entre tais áreas onde reproduzem, desovam e
buscam alimentação (Gaelzer et al., 2007). No desastre com petró-
leo em 2019 as praias foram ambientes diretamente impactados
pela ocorrência deste contaminante. A análise de peixes e outros
organismos que vivem nestas áreas é fundamental tanto pela re-
levância ecológica como pela importância social, uma vez que são
comercializadas pelas comunidades ribeirinhas e utilizadas para
consumo humano (Soares et al. 2020; Magris e Giarrizzo, 2020).
Ambientes recifais
Os ambientes recifais apresentam alta diversidade biológica
devido à complexidade estrutural, fornecendo alimento e abrigo
para inúmeros organismos marinhos (Connel, 1978). Diante dessa
importância ecológica, o risco da contaminação por petróleo atin-
ge não só o crescimento e reprodução de espécies bentônicas, mas
se desdobra também nas cadeias tróficas das comunidades depen-
dentes dos recifes (Blackburn et al., 2014).
No Brasil os recifes são diversos em composição e contam
com um alto número de espécies endêmicas, e em muitas regiões
são caracterizados pela presença predominante de macroalgas na
cobertura de substrato (Figura 1.11). Apresentam considerável
abundância de peixes herbí�voros como cirurgiões (acanturí�deos),
donzelas (pomacentrí�deos) e budiões (scarí�deos), além daqueles
que se alimentam de invertebrados como as xiras e cocorocas (ha-
emulí�deos) (Feitosa e Ferreira, 2014, Laborel-Denguen et al., 2019;
Zilberberg, Abrantes e Marques, 2016; Ferreira et al., 2004).

26 CAPÍTULO 1
Figura 1.11: Recifes de Rio do Fogo na Área de Proteção
Ambiental dos Recifes de Corais (APARC), RN. Foto: Liana Mendes.
Tais caracterí�sticas reforçam a necessidade de estudos apro-

fundados e individualizados para entender como a contaminação
pelos compostos quí�micos do petróleo influenciam e ameaçam tais
ecossistemas que, conforme mencionado, podem ser distintos ao
longo da costa brasileira (Laborel-Denguen et al.,2019; Zilberberg,
Abrantes e Marques, 2016). Por exemplo, os recifes submersos de
Pirangi (litoral sul do RN) apresentam cobertura expressiva de
esponjas (Figura. 1.12) (Mendes e Grimaldi, 2020) e ainda não se
sabe como o petróleo foi absorvido nestes habitats.
Figura 1.12: Recifes de Pirangi com alta cobertura de esponjas.

Foto: Liana Mendes.

27 CAPÍTULO 1
Para análises da contaminação por petróleo são recomen-
dados táxons de peixes recifais residentes e adultos, com hábi-
tos e estratégias alimentares distintos como vermelhos (lutja-
ní�deos), garoupas (serraní�deos), budiões (escarí�deos) e xiras
(hemulí�deos) (Figura 1.13).
a b
c d
Figura 1.13: Peixes recifais. Vermelhos (Lutjanus alexandrei) (a), garoupa
gato (Epinephelus adscensionis) (b), Budião batata (Sparisoma axillare)
(c) e xiras (Haemulon aurolineatum) (d). Fotos: Liana Mendes.
Investigação de espécies com diferentes hábitos alimentares

amplia o entendimento acerca das possibilidades de entrada de
compostos quí�micos nas cadeias tróficas. Dentre os peixes citados
alguns são considerados nobres para pesca (Ferreira et al., 1998),
reforçando a relevância para a economia local, além da importân-
cia ecológica.
Peixes recifais como vermelhos, budiões e xiras exibem distintos
hábitos alimentares o que pode deixá-los mais ou menos vulneráveis
aos contaminantes. Tais peixes conectam diversos ecossistemas (e.g. re-
cifes, bancos de algas, fanerógamas, rodolitos de algas calcárias - Figura
1.14) por meio de processos ecológicos e assentamento larval, além de
se alimentarem e se reproduzirem em diferentes ecossistemas afetados

28 CAPÍTULO 1
pelo desastre de óleo (Beyer et al., 2016; Costa et al., 2020; Soares et al.,
2020; Magris e Tommaso, 2020; Sissini et al., 2020).
Figura 1.14: Fundo de rodolitos (algas calcárias) na praia de Pirangi do

Norte/Parnamirim, com mututuca (Myrichthys oscellatus) se deslocando.
Foto: Liana Mendes.
Destaca-se a ocorrência do habitat conhecido como restinga

marinha, considerada um tipo de substrato marinho com extensa
área de cobertura, formada por areia, cascalho e rochas com baixa
complexidade topográfica, porém ainda pouco estudada embora
represente um importante habitat para espécies de interesse co-
mercial (Batista et al., 2016). Este habitat está distribuí�do em toda
a área de estudo, ocorrendo também na porção norte da plataforma
continental do Rio Grande do Norte (Vital et al., 2010).
Por fim, são mencionados os foraminí�feros bentônicos, orga-
nismos indicadores de impactos e utilizados no monitoramento de
áreas preservadas. Podem ser encontrados em praias arenosas, es-
tuários e mangues, zonas recifais e pertencem à infauna de áreas
inconsolidadas. São microrganismos protistas utilizados para pros-
pecção de petróleo e como parâmetro de avaliação dos impactos
ambientais, cuja mortalidade pode gerar o desequilí�brio geral na
vida marinha (Eichler e Barker, 2020).

29 CAPÍTULO 1
CAPÍTULO II
METODOLOGIA
DE TRABALHO
METODOLOGIA DE TRABALHO
2
Registro das localizações
impactadas com petróleo
N
o caso de derramamento de petróleo no litoral é importante
ressaltar que cada ocorrência deve ser imediatamente infor-
mada aos órgãos fiscalizadores nas diferentes esferas de po-
der (federal, estadual e municipal), seguindo as orientações do Plano
Nacional de Contingência (PNC4) para Incidentes de Poluição por Ó� leo
em Á� guas sob Jurisdição Nacional. Este Plano fixa responsabilidades,
estabelece estrutura organizacional e define diretrizes, procedimentos
e ações. Tem o objetivo de permitir a atuação coordenada de órgãos da
administração pública e entidades públicas e privadas para ampliar a
capacidade de resposta em incidentes de poluição por óleo que pos-
sam afetar as águas sob jurisdição nacional, além de minimizar danos
ambientais e evitar prejuí�zos para a saúde pública (Decreto nº 8.127,
de 22 de outubro de 2013). A Lei Federal nº 9966/2000 complementa
a legislação, dispondo sobre a prevenção, o controle e a fiscalização da
poluição causada por lançamento de óleo e outras substâncias nocivas
ou perigosas em águas sob jurisdição nacional.
4 Para maiores informações, acesse: http://www.ibama.gov.br/emergencias-ambientais/petroleo-e-

-derivados/pnc.

31 CAPÍTULO 2
Metodologia de trabalho
A localização das áreas acometidas deve ser registrada cor-
retamente. É� fundamental que todo registro de derramamento ve-
nha acompanhado não apenas de data e hora do avistamento, mas
também do nome da localidade (e.g. Praia de Pirangi, estuário do
Rio Potengi, etc.), municí�pio, estado e, se possí�vel, das coordenadas
geográficas. Caso as imagens recebidas não estejam acompanhadas
inicialmente das informações, é estratégico solicitar imediatamen-
te ao informante, aumentando assim a precisão da informação. Este
conjunto de dados sobre o derramamento será fundamental para
sistematização das informações e gestão da crise, especialmente
em eventos de ampla extensão espacial. Em 2019, quando todo o
Brasil compartilhou fotos e ví�deos de todos os Estados do nordeste,
o fato de faltarem localizações e datas adicionou dificuldade para a
gestão pública no gerenciamento da crise, que necessitou de dias/
semanas para poder validar e acompanhar os locais impactados.
Alguns aplicativos de “smartphone” dão a possibilidade de
registro georreferenciado da localização do usuário. Ferramentas
de georreferenciamento podem ser facilmente utilizadas e per-
mitem maior precisão na localização da ocorrência registrada em
foto, contribuindo para a eficiência na resposta, evitando a busca
do local em praias extensas (Figura 2.1). A partir do registro preci-
so da localização, os resultados poderão ser interpretados se des-
dobrando em estratégias de ação mais eficientes como respostas
aos danos causados. Dois outros aplicativos para registro de resí�-
duos nas praias estão disponí�veis gratuitamente nas plataformas
digitais: “Mar Limpo” criado pela Oceânica – Pesquisa, Educação e
Conservação em parceria com a Criadora de Mundos e “Timestamp
Camera Free” (Figura 2.2).

32 CAPÍTULO 2
a b
Figura 2.1: Registros públicos da presença do petróleo no litoral do Rio

Grande do Norte durante o desastre com petróleo na costa do Brasil em
2019. Imagens obtidas com aplicativo com dados de geolocalização
e autoria, permitindo o registro espacial, temporal e informações
adicionais. Praia com petróleo e informações adicionadas (a) e de
mancha de petróleo na areia (b). Fotos: APC Cabo de São Roque.
a b
Figura 2.2: Aplicativos para “smartphones” disponíveis gratuitamente
na internet permitem o registro de resíduos nas praias com informação
sobre a localização (satélite), data e hora. Aplicativos Mar Limpo (a) e
Timestamp Camera Free (b).

33 CAPÍTULO 2
Registros sistematizados pelo IBAMA indicaram 80 localida-
des afetadas no litoral do Rio Grande do Norte em 2019, incluin-
do ocorrência nas Á� reas de Proteção Ambiental Bonfim Guaraí�ras
(APABG) e Recifes de Corais (APARC). Considerando as localidades
e quantidades de petróleo nas praias, estuários, mangues, áreas re-
cifais (e.g. áreas de proteção ambiental), além do impacto na pesca
artesanal, decidiu-se focar o monitoramento de sedimentos e pes-
cado em quatro municí�pios: Ní�sia Floresta, Tibau do Sul, Baí�a For-
mosa e Maxaranguape (Figura 2.3). Os procedimentos utilizados
para o monitoramento nestes municí�pios serviram como base para
a elaboração deste guia.
Figura 2.3: Mapa com registro de encalhe de petróleo no litoral

do Rio Grande do Norte (pontos vermelhos) e indicação das
localidades de coleta de amostras da biota e de sedimento no
monitoramento pós desastre (em amarelo). Ilustração: Mauro Lima
(a partir de dados do IBAMA, 2020).

34 CAPÍTULO 2
Descontaminação prévia do material
para coleta em campo
É� fundamental assegurar que as amostras não sejam contami-
nadas por derivados de petróleo durante sua manipulação, quando
se avalia a contaminação do pescado e sedimentos por HPA. Assim,
não podem ser usados materiais plásticos como luvas de látex e re-
cipientes plásticos. Durante todo o procedimento, a manipulação
de materiais e amostras deverá ser realizada com luvas nitrí�licas e
todo o material de campo que for entrar em contato com a amostra
(espátulas, reservatórios de alumí�nio, papel alumí�nio, vidrarias)
deverá ser descontaminado. Materiais e equipamentos necessários
para coleta da biota estão listados no Anexo 1.
Reservatórios de alumí�nio, papel alumí�nio, potes de vidro,
colheres ou espátulas deverão ser lavados com detergente Extran,
seguidos de enxágue abundante com água torneira e enxágue final
com água destilada (3 vezes). Os materiais deverão ser secos (em
bancada protegido da poeira ou na estufa, a 100 °C) e escolher uma
de duas opções: (i) usar uma pequena quantidade de solvente (di-
clorometano ou hexano) na parte interna, que entrará em contato
com a amostra; ou (ii) colocar em mufla a 450 °C por 4 horas. Após
esfriar, acondicionar os materiais em recipientes secos e protegido
de poeira. A descontaminação do material tem validade por até 30
dias. Após esse perí�odo, o procedimento deverá ser repetido, exce-
to a lavagem com água (Figura 2.4).

35 CAPÍTULO 2
a b
Figura 2.4: Material de coleta de amostras (para análise de HPA) sendo
preparado em laboratório. Lavagem dos reservatórios de alumínio (a) e
secagem em estufa (b). Fotos Mauro Lima.
As espátulas e colheres deverão chegar em campo envolvi-

das em papel alumí�nio descontaminado antes da utilização em
cada coleta de amostra. Outra alternativa é lavar o material de
coleta com água do local em abundância e utilizando solvente
orgânico antes e entre as coletas. Vale ressaltar que todo o resí�-
duo orgânico e inorgânico, sólido ou lí�quido gerado em campo
deverá ser apropriadamente recolhido, acondicionado e retor-
nado ao laboratório (Figura 2.5).
a b
Figura 2.5: Materiais estéreis, isolados em papel alumínio, prontos
para acondicionamento de amostras para análise de HPA (a). Luvas
e máscara com filtro químico utilizadas para coleta de amostra de
petróleo (b). Fotos: Mauro Lima.

36 CAPÍTULO 2
Protocolo de segurança em campo
A segurança dos pesquisadores em campo é fundamental e
deve ser planejada principalmente no caso de contato com petró-
leo. O documento NBR 9898 (ABNT, 1987) dispõe sobre as regras
de segurança em coleta de amostras de água, sedimentos e orga-
nismos aquáticos; o item 4.7 lista elementos importantes sobre a
segurança pessoal em campo e de procedimentos para não con-
taminar o material amostrado e proteger os profissionais envol-
vidos nas coletas em campo. É� necessária a preparação prévia de
caixa de primeiros-socorros acompanhada de livreto explicativo no
material de campo, assim como a utilização de equipamentos de
proteção individual (EPI), como roupas com proteção UVA/UVB,
proteção solar, luvas nitrí�licas (para evitar contaminação pessoal e
das amostras), máscaras respiratórias com filtro quí�mico, macacão
Tyvek, óculos de proteção e calçado impermeável. Alguns procedi-
mentos de segurança devem ser seguidos, como:
• Considerar a utilização de EPIs em todas as fases de desenvolvi-
mento do trabalho, especí�ficos para cada local, desde o campo
ao laboratório;
• Levar nas mãos apenas o material necessário ao coletar amos-
tras em locais de difí�cil acesso, pois há sempre risco de quedas;
• Evitar, sempre que possí�vel, o contato direto com a água;
• Em caso do petróleo entrar em contato direto com a pele, passar
óleo de cozinha, azeite ou outros produtos contendo glicerina
e lanolina removendo o excesso e imediatamente lavar o local
com água corrente e sabão. Nunca usar solventes (acetona, ál-
cool, removedor) ou combustí�veis (querosene ou gasolina) para
remoção, uma vez que esses produtos podem ser absorvidos e
causar lesões. Eventuais lesões de pele devem ser tratadas por

37 CAPÍTULO 2
serviços médicos especializados orientados pelo Centro de As-
sistência Toxicológica (Ceatox) do estado5.
Procedimento de coleta das amostras

Uma vez considerada a segurança da equipe e tratados os
materiais a serem utilizados em campo, a coleta das amostras de
pescados deve ser planejada considerando a dinâmica das comuni-
dades de pesca artesanal e a coleta de sedimentos deverá ser reali-
zada durante a baixa-mar. As informações das amostras devem ter
referências do local, data, tipo de amostra, número, projeto e aná-
lise especí�fica, que devem seguir uma cadeia de custódia definida
antes da coleta.
• PLANEJAMENTO DA COLETA DE PESCADOS:

PEIXES E INVERTEBRADOS
É� necessário investigar espécies com diferentes hábitos de
vida, com distintos hábitos alimentares por exemplo, permitindo
avaliar as possibilidades de entrada de compostos quí�micos em di-
versos ní�veis da cadeia trófica. No Anexo 2 estão listados organis-
mos recomendados para servir como biomonitores de contamina-
ção por petróleo, utilizados nas pesquisas conduzidas no RN.
Após definidas as espécies a serem utilizadas, a coleta de
pescados, peixes e invertebrados comerciais nas diferentes loca-
lidades atingidas deve adequar-se ao ritmo das comunidades lo-
cais. É� preciso entrar em contato com os pescadores e sincronizar
o recebimento de recebimento do pescado e processamento dos
organismos frescos, considerando informações como perí�odos do
dia, calendário lunar e sazonalidade de ocorrência das espécies. As
5 No Rio Grande do Norte o atendimento pode ser realizado pelo telefone 0800 281 7005 (das
7 h às 18 h) e pelos Whatsapps 24 h (84) 98125-1247 ou (84) 98803-4140.

38 CAPÍTULO 2
comunidades litorâneas possuem hábitos e tradições muitas vezes
distintos quanto ao uso das áreas de pesca e tempo adequado para
pescar cada tipo de pescado. Assim, é imprescindí�vel consultar pes-
cadores locais de forma a otimizar tempo e recursos.
A aquisição do pescado poderá ser realizada de duas formas:
Direta: Através de campanhas de coleta em campo, utilizan-
do-se petrechos de pesca como redes, linhas e anzóis, puçás, covos,
caça-sub e mergulho, conduzidos por pesquisadores e técnicos.
Indireta: Aquisição de pescado em peixaria ou encomendado
aos pescadores. Pode ser estabelecido um acordo financeiro com
os pescadores para encomenda e repasse dos exemplares ao pes-
quisador. A encomenda pode ser mais vantajosa tanto para quem
pesca como quem pesquisa, minimizando tempo e recursos no pro-
cesso de aquisição do pescado. Devem ser acertados previamente
quantidades e valores a serem pagos. Os pescadores também de-
vem ser orientados a não colocarem os pescados mergulhados em
gelo ou dentro de sacos plásticos. O conhecimento ecológico local
dos pescadores orientará as áreas e o uso de petrechos mais efi-
cientes, como redes de pesca, covos, linha de mão e coleta manu-
al para peixes e invertebrados. Isso garantirá a integridade fí�sica e
morfológica dos indiví�duos comprados (Figuras 2.6).
a b
Figura 2.6: Peixes e invertebrados obtidos por meio de pesca e catação.

Peixes e camarão capturados com rede tresmalho (arrasto de praia)
(a) e mariscos, ostras e sururus encomendados a marisqueiro local (b).
Fotos: Marina Viana (a) e Mauro (b) Lima.

39 CAPÍTULO 2
Dentre as espécies planejadas para coleta, aquelas sem inte-
resse comercial, capturadas acidentalmente durante as pescarias,
podem ser adquiridas sem ou com baixo custo. Entretanto, algumas
vezes é necessário encomendar uma pesca direcionada a estas es-
pécies. Nestes casos é necessária adequada valorização do serviço
do pescador e uma negociação justa.
No caso de invertebrados não comerciais, como os porí�feros
e cnidários, a coleta poderá ser realizada por meio de mergulho
autônomo ou livre utilizando técnicas de coleta manual através de
raspagem com o auxí�lio de espátulas de inox, tesouras, pegadores
ou facas (Projeto MAArE - Monitoramento Ambiental da Reserva
Biológica Marinha de Arvoredo e Entorno - MAARE 2017).
• COLETA DE AMOSTRAS BIOLÓGICAS

Exemplares de invertebrados como mariscos, caranguejos e
ostras deverão ser manuseados sempre com a utilização de luvas. É�
importante manter um tamanho padrão para a coleta de indiví�duos
da mesma espécie, considerando sempre o ciclo de vida do organis-
mo, e estes devem ser bem lavados com água do local. As amostras
de peixes também seguem os mesmos procedimentos citados aci-
ma. Todos os organismos deverão ser embrulhados em papel alu-
mí�nio previamente esterilizados e depois acondicionados em sacos
plásticos individuais, devidamente etiquetados (Figura 2.7).
Os organismos deverão ser recolhidos no momento de aqui-
sição com pescadores, avaliados e acondicionados em recipientes
térmicos com gelo em gel reutilizável, considerando que espécimes
coletados por pescadores muitas vezes vêm em caixas plásticas ou
térmicas (e.g. isopor).

40 CAPÍTULO 2
a
b c
Figura 2.7: Preparo e acondicionamento de organismos utilizando
material estéril. Tainha (Mugil curema) (a), caranguejo (Ucides cordatus)
(b) e amostras de tecidos e organismos devidamente etiquetados e
acondicionados para envio para laboratório de análises químicas (c).
Fotos: Mauro Lima (a, c) e Marina Viana (b).
No caso da coleta ativa tem-se controle dos procedimentos

padrões mencionados acima para captura dos organismos em seu
ambiente natural. Os organismos deverão ser embrulhados com
papel alumí�nio e depositados diretamente em recipientes anterior-
mente preparados, como os do tipo “quentinha” de alumí�nio.
Durante os trabalhos de campo deverá ser preenchida uma
Planilha de Campo com informações como código e identificação
da amostra, data e hora, profundidade, latitude e longitude, aná-
lises a serem realizadas, armazenamento das amostras (freezer,
temperatura ambiente, geladeira, álcool) e comentários (observa-
ções adicionais se necessárias). Imediatamente após a obtenção do
material biológico (peixes e invertebrados) deve-se realizar uma
inspeção visual geral dos indiví�duos checando a presença ou não
de óleo na região externa do corpo. É� importante registrar todas as
informações das condições do local de coleta e da amostra biológi-
ca em Planilha de Campo diminuindo riscos de lacunas de informa-
ções relevantes nesta fase (Anexo 3).

41 CAPÍTULO 2
Caso as amostras tenham presença visí�vel de petróleo, devem
ser armazenados de acordo com as especificações para cada espé-
cie e mantidas em depósito exclusivo, sem a retirada de tecido ou
ví�sceras. O material deve ser levado ao laboratório, o quanto antes,
para avaliação macroscópica.
• COLETA DE SEDIMENTOS E
PROCEDIMENTOS ASSOCIADOS
Para a coleta de sedimento superficial poderão ser utiliza-
das dragas, tubos de alumí�nio/inox, colheres de alumí�nio e/ou es-
pátulas previamente descontaminados (ver procedimentos para
descontaminação antes da coleta e descontaminação em campo).
Quando for utilizada draga/pegadores de fundo, os sedimentos
para análise deverão ser retirados da parte central do material co-
letado. Quando utilizadas colheres e espátulas, deverá ser coletada
sempre a camada mais superficial de sedimento (cerca de 1 cm).
Em cada região de amostragem, deverão ser coletados sedimentos
em três pontos, com distância de 1 a 5 metros entre si, preferencial-
mente na margem do manguezal e linha de faixa do mesolitoral de
praia arenosa (Figura 2.8).
a b
Figura 2.8. Coleta de sedimento para análise de HPA 1 ano após o

desastre. Amostragem de sedimentos em manguezal (a) e em praia
arenosa (b). Fotos: Mauro Lima.

42 CAPÍTULO 2
O material sedimentar deverá ser coletado em cada ponto es-
tabelecido e na ordem apresentada para as seguintes análises:
Orgânicos (HPA): aproximadamente 100 g de sedimentos
deverão ser coletados utilizando equipamentos de alu-
mí�nio ou inox e depois armazenados em reservatórios
de alumí�nio ou frascos de vidro descontaminados. De-
pois de fechados os recipientes de vidro deverão ser en-
voltos em papel alumí�nio para evitar a ação da luz sobre
as amostras e, posteriormente, acondicionados em sa-
cos plásticos bem fechados com identificação.
Granulometria: os sedimentos podem ser coletados com au-
xí�lio de colher (não precisa ser descontaminada) e pos-
teriormente deverão ser armazenados em sacos plásti-
cos ou frascos devidamente etiquetados.
As amostras deverão ser refrigeradas em campo e mantidas
em freezer no laboratório até o momento de análise.
• COLETA DE SEDIMENTO EM FUNDOS

LAMOSOS OU EM RECIFES
A coleta de sedimento em fundos lamosos ou em recifes de
corais podem ser feitas com pegador de fundo Van Veen ou manu-
almente por meio de mergulho cientí�fico, pois muitas vezes as es-
truturas recifais impedem a coleta de sedimento com pegador de
fundo (Figura 2.9).
As coletas para determinar o ambiente de ocorrência de mi-
crofósseis foraminí�feros e sua dinâmica com parâmetros ambien-
tais necessitam de 2 sacos plásticos (pequeno, 100 ml e grande 300
ml) e um pote plástico (100 ml) para 3 diferentes amostras do mes-
mo ponto. Estes devem ser enumerados nos pontos de coleta com
as canetas de marcador permanente. A ficha de campo deve conter

43 CAPÍTULO 2
os dados ambientais de salinidade, temperatura, oxigênio e outras
informações referentes a água e tipo de fundo que estão sendo me-
didos no momento das coletas na interface sedimento-água. Quanto
maior o número de variáveis ambientais medidas no momento das
coletas, melhor será para a observação de padrões e distinção de
ambientes habitados pelas espécies indicadoras de foraminí�feros.
a b
Figura 2.9: Formas de coleta de sedimentos. Pegador de fundo Van

Veen (a) e coleta de testemunho por mergulhador científico (b)
(Pirangi, RN, 2013 e 2019). Fotos: Patrícia Eichler.
• COLETA DE MICROFÓSSEIS
FORAMINÍFEROS (POTE PLÁSTICO)
A coleta de sedimento para a análise de foraminí�feros neces-
sita de cerca de 50 g (metade do pote). A coleta deve ser realizada
na camada superficial do sedimento que foi coletado pela draga.
O primeiro centí�metro é o ideal. Raspa-se o sedimento superficial
com a espátula e este é depositado dentro do pote. Adicionar ao
pote o corante Rosa de bengala diluí�do em álcool (1 grama para 1
litro de álcool 70 %), fechar a tampa e sacudir vigorosamente para
misturar o corante ao sedimento coletado (Figura 2.10). O corante
vai colorir os tecidos dos indiví�duos que estão vivos distinguindo
os dos mortos.

44 CAPÍTULO 2
a
b c
Figura 2.10: Sedimento depositado na bandeja (a) e pote com
sedimento (b). Corante rosa de bengala e álcool sendo adicionado ao
pote (c) (Pirangi 2013, 2014 e 2019). Fotos: Patrícia Eichler.
• COLETA DE MATERIAL PARA GRANULOMETRIA)

Para a análise granulométrica serão necessários cerca de 100 g
de sedimentos. Com uma colher deve-se retirar uma quantidade de
sedimento (aproximadamente 1/4 do saco) e fechar a boca do saco
com o barbante. Já para a análise de matéria orgânica (MO) serão
necessários 5 g de sedimento. A amostra deverá ser colocada no saco
plástico pequeno, fechada com barbante e mantida no gelo até o de-
sembarque e, posteriormente, congelada até a análise.
• CUSTÓDIA, TRANSPORTE E
ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS
Todas as amostras deverão ser acondicionadas e devida-
mente identificadas com etiquetas à prova d’água ou canetas
permanentes, exibindo objetivamente as seguintes informações
(Figura 2.11):

45 CAPÍTULO 2
• Data
• Local de coleta
• Número da Amostra
• Espécie ou nome comum
• Identificação do projeto e/ou responsável pela coleta
• Tipo de análise (se for o caso)
a b
Figura 2.11: Etiqueta de identificação (papel vegetal) dos sacos de
amostras escritas a nanquim e acondicionada em saco plástico (a) e
exemplares de budião (Sparisoma sp.) com identificação (para análise
de HPA) (b). Fotos: Marina Viana.
Para análise de HPAs as amostras (fragmentos de tecidos) de-

vem ser alocadas em recipientes de vidro ou reservatórios de alu-
mí�nio (tipo “quentinhas”). O material acondicionado em vidro deve
ser envolto em papel alumí�nio, evitando reações desencadeadas pela
ação luminosa. É� importante que os recipientes de armazenamen-
to sejam previamente descontaminados — por tratamento térmico
(450 ºC/8 horas) ou com solvente (e.g. diclorometano), sempre após
lavagem em água destilada e detergente neutro — e que as amostras
não tenham contato direto com nenhum tipo de material plástico.
O acondicionamento das amostras para transporte entre o
campo e o laboratório deverá ser realizado em baixas temperatu-
ras, sem congelamento, mantendo as caracterí�sticas fí�sico-quí�micas
dos tecidos para não acarretar prejuí�zos para as análises de HPA.
Para este transporte deverão ser utilizadas caixas térmicas com gelo

46 CAPÍTULO 2
mantendo a temperatura baixa, garantindo a preservação do mate-
rial biológico. As amostras deverão ser processadas no laboratório e
mantidas congeladas em freezer.
No caso de envio das amostras já processadas para análise em
outra instituição, as mesmas deverão ser encaminhadas congela-
das. Para longas distâncias, o envio pode ser realizado em caixas
de isopor ou térmicas com gelo seco suficiente para manter a baixa
temperatura por tempo sempre maior do que o previsto, garantin-
do sua conservação no caso de atrasos. Um padrão único de cus-
tódia das amostras deverá registrar os envios e ser compartilhado
entre todas as instituições envolvidas.
Para o envio como carga aérea, existem detalhes obrigatórios
para transporte com gelo seco (classificado como artigo perigoso UN
1845), embora não estejam explicitamente indicados pelas compa-
nhias aéreas. Serão indicados abaixo o acondicionamento adequado
do material, indicação de gelo seco em padrão internacional e docu-
mentação necessária. No entanto, para qualquer envio é fundamen-
tal verificar junto às empresas de aviação eventuais atualizações do
protocolo de envio, evitando surpresas desagradáveis no atendimen-
to de cargas no aeroporto. Seguem as orientações básicas:
a) Todo contêiner com gelo seco deve conter um adesivo pa-
drão internacional “Dry Ice” com a quantidade de gelo in-
dicada. O adesivo é um losango com 7 cm de comprimento
de cada lado. Vale ressaltar que as dimensões de 7 cm se
referem ao losango e não ao tamanho total do adesivo, que
geralmente é maior. No balcão de embarque o atendente
medirá os lados do losango (e não do adesivo!) para confe-
rir se está no padrão internacional (Figura 2.12).
b) É� preferí�vel utilizar gelo seco em escamas porque dura
mais que gás. Cabe lembrar que independente da forma,

47 CAPÍTULO 2
ao colocar o gelo seco não se pode vedar totalmente o con-
têiner por risco de segurança. É� necessário permitir que o
gás gerado tenha alguma saí�da.
c) Sugere-se adicionar gelo suficiente para 24 horas mesmo
para voos diretos e curtos, pois eventualidades são frequen-
tes e este procedimento evita o risco da perda de amostras.
d) Todo contêiner individual deve ser acompanhado de Des-
tinatário e Remetente claramente identificados. O ideal é
que os nomes do destinatário e remetente sejam adesivos
ou impressos cobertos por saco plástico fixado no contê-
iner, de maneira a proteger o papel da umidade criada pela
saí�da do gelo seco.
e) Todo contêiner deve ser acompanhado de declaração sobre
o material/conteúdo a ser transportado e o risco existen-
te (modelo em Anexo 4). No caso do pescado e sedimentos
amostrados, a declaração deve indicar que não há risco en-
volvido. Esta declaração também deve ser envolvida em saco
plástico pelo mesmo motivo descrito no item anterior e afixa-
da no contêiner. Uma outra cópia deverá acompanhar a docu-
mentação do envio, e ficará com os funcionários da aviação.
f) Os limites de horário para despacho no terminal de cargas
do aeroporto dependem do horário do voo escolhido e de-
vem ser verificados com a empresa de aviação. Ao chegar
no terminal é necessário preencher um formulário digi-
tal nos terminais disponí�veis antes do despacho. Deve-se
chegar com antecedência, considerando o tempo de fila
para preenchimento do formulário nos terminais digitais
e atendimento no balcão.
g) Por fim, sugere-se ainda considerar a contratação de em-
presas especializadas no transporte de cargas aéreas que

48 CAPÍTULO 2
certamente estarão atualizadas com relação aos procedi-
mentos. Estas podem recolher o material diretamente no
laboratório e também contratar empresas parceiras no
outro estado para o transporte do aeroporto ao laborató-
rio de análise. Contratá-las pode otimizar tempo no deslo-
camento das equipes entre laboratórios e aeroportos.
Figura 2.12 Dois diferentes modelos de adesivo disponíveis na

internet utilizados no transporte aéreo de amostras congeladas em
depósitos com gelo seco, de acordo com o padrão internacional
(losango de 7 cm de lado indicando UN1845, com espaço para
indicar quantidade de gelo a ser transportada). As empresas aéreas
não disponibilizam este adesivo.

49 CAPÍTULO 2
CAPÍTULO III
ANÁLISES
MACROSCÓPICAS
E MICROSCÓPICAS
DE AMOSTRAS
BIOLÓGICAS
ANÁLISES MACROSCÓPICAS
3
E MICROSCÓPICAS DE
AMOSTRAS BIOLÓGICAS
Avaliação Morfológica Externa
A
avaliação macroscópica dos organismos deverá ser reali-
zada em laboratório a partir da análise morfológica cor-
poral dos organismos, verificando a presença ou não de
petróleo cru, dedicando especial atenção para as mucosas oculares
e cavidade oral. Somente após a realização desta etapa procede-se a
realização da biometria, que é especí�fica para cada grupo taxonômi-
co. Deverão ser utilizados equipamentos como lupas, paquí�metros
digitais, pinças, cabos e lâminas de bisturis, rotulador, lacres plásti-
cos numerados, formol 10 %, tesouras de ponta fina, recipientes de
vidro e os materiais de alumí�nios descritos no tópico anterior.
Para cada grupo de organismos analisados é preciso exami-
nar diferentes aspectos. No caso da investigação de organismos
bentônicos sésseis como corais e porí�feros, inicialmente deverá ser
verificada a presença ou resquí�cios de óleo sobre os animais e pos-
teriormente estes deverão ser devidamente acondicionados (con-
forme tópicos anteriores) e submetidos às análises quí�micas. Para
peixes, moluscos e crustáceos a presença de resquí�cios de óleo de-
verá ser examinada na parte externa e interna, incluindo cavidade
CAPÍTULO 3
51 Análises macroscópicas e microscópicas
de amostras biológicas
oral, urogenital e brânquias (Figura 3.1). O exame macroscópico do
tecido branquial deverá verificar tanto a presença ou não de óleo
como o estado do tecido (Bernardi et al., 2013). Deverão ser anali-
sadas possí�veis alterações morfológicas causadas pela substância
e/ou existência de patologias.
a b
Figura 3.1: Exame visual da cavidade oral (a) e brânquias (b).
Fotos: Lígia Rocha.
Biometria básica e pesagem

A biometria deverá ser conduzida obtendo medidas morfo-
lógicas especí�ficas para cada espécie. O peso e tamanho dos orga-
nismos, taxa de crescimento e outros aspectos são também fato-
res que influenciam na acumulação de metais pelos organismos
(Bendati, 1999).
O tempo de processamento das amostras (e.g. peixes) em la-
boratório deve considerar manter o material em recipientes refri-
gerados, mas não congelados e sem contato direto com gelo até o
fim do processamento total. Já mariscos e crustáceos que são mais
resistentes (e.g. ostras e caranguejos) podem ser mantidos vivos
por maior perí�odo em local aberto. Deve-se lembrar de manter em
locais esterilizados e isolados de objetos plásticos aqueles exem-
plares destinados à análise de HPA.
CAPÍTULO 3
É� necessário o estabelecimento prévio de um protocolo de
biometria com materiais e equipamentos para o registro de medi-
das e observações necessárias a futuras comparações e análises. Os
espécimes coletados deverão ser pesados, medidos, identificados
até o ní�vel taxonômico mais especí�fico, etiquetados e catalogados. A
biometria necessitará de materiais para medição como fita métrica,
paquí�metro ou ictiômetro. A pesagem com balanças deverá ter pre-
cisão de 1 g, pelo menos.
A biometria das amostras deverá seguir o registro das variáveis
descritas em planilha de campo (Anexo 3) considerando que cada gru-
po de organismos possui um protocolo especí�fico descrito a seguir:
• PEIXES:
Os peixes podem ser medidos com auxí�lio de ictiômetro ou
fita métrica em centí�metros (cm) registrando o comprimento total
(Ct) e comprimento padrão (Cp). O peso total por indiví�duo será
obtido através de balança com precisão de 1 g (Figura 3.2).
a c
Figura 3.2: Biometria de peixes em laboratório (a). Comprimento total (Ct)
e Comprimento padrão em centímetros (Cp) (b) e pesagem total em
gramas (c) de exemplar de ariocó - Lutjanus synagris. Fotos: Mauro Lima.
CAPÍTULO 3
• INVERTEBRADOS:
a) Bivalves:
A biometria de invertebrados bivalves (e.g. Crassostrea rhi-
zophorae, Anomalocardia flexuosa e Mytella strigata) deverá con-
templar o comprimento e altura da concha (milí�metros) seguindo
os métodos de Seed (1976) (Figura 3.3).
Figura 3.3: Biometria de concha de bivalve (Anomalocardia

flexuosa), comprimento da valva (Cv) e altura da valva (Av).
Foto: Mauro Lima.
b) Crustáceos:
Para crustáceos deve-se registrar peso total e se o indiví�duo
está em muda. Em cada grupo de Decapoda existe um protocolo
diferente listado a seguir
• Caranguejos - registrar o peso total (balança de preci-
são de 0,01 g) e medidas corporais básicas como com-
primento, largura, altura do cefalotórax (Ivo et al., 1999)
(Figura 3.4);
CAPÍTULO 3
Figura 3.4: Caranguejo (Ucides cordatus). Medidas biométricas: largura
da carapaça (Lc) e comprimento da carapaça (Cc). Foto: Mauro Lima.
• Camarões - Registrar peso total e posteriormente medir o

comprimento total (ct) e comprimento do cefalotórax (cc)
(figura 3.5).
Figura 3.5: Biometria de camarão, comprimento total (ct) e

comprimento do cefalotórax (cc). Modificado de Holthuis (1980).
Foto: Mauro Lima.
CAPÍTULO 3
Avaliação morfológica interna de peixes
A etapa seguinte de avaliação morfológica consiste em análi-
ses especí�ficas de órgãos que serão removidos após incisão longitu-
dinal na região ventral do indiví�duo. Na dissecação deve-se utilizar
materiais cirúrgicos limpos. Durante a avaliação deve-se verificar
indí�cios de resí�duos de contaminantes na cavidade interna do ani-
mal. A análise do sistema digestório inclui a avaliação de conteúdo
no esôfago, estômago e intestino (Figura 3.6). Deve-se avaliar o es-
tado de repleção do estômago, o sexo e estágio de maturação gona-
dal macroscópico, segundo Vazzoler (1996).
a c
Figura 3.6: Inspeção interna de espécime de peixe: cavidade
abdominal (a), vísceras (b) e musculatura com indícios de
contaminação (c). Pontos pretos na musculatura e material escuro nas
vísceras deverão ser registrados. Fotos: Lígia Rocha.
Análise de conteúdo gastrointestinal em peixes

Nesta análise são avaliados o esôfago, estômago e intestinos
dos peixes. O trato gastrointestinal removido é separado por ór-
gãos para medição e pesagem. Os órgãos deverão ser etiquetados e
acondicionados em álcool 70 % para estudos posteriores.
CAPÍTULO 3
Com o auxí�lio de um estereoscópico deverão ser identificados
os grupos taxonômicos encontrados na dieta dos organismos coleta-
dos, além da busca ativa por vestí�gios de petróleo (Figura 3.7). Quan-
tifica-se a porcentagem de ocorrência e de volume dos itens do con-
teúdo estomacal, segundo metodologia proposta por Hyslop (1980).
Determina-se o Í�ndice de Repleção Estomacal (IR), que é dado
pela razão entre o peso do estômago e o peso total do peixe.
IR = 100 (WE / WT)

sendo: IR = Índice de Repleção Estomacal; WE = massa total do conteúdo estomacal
em gramas e WT = massa total do peixe em gramas
É� medido o comprimento intestinal (Li) para cálculo do Quo-

ciente intestinal (QI). As medidas deverão ser realizadas utilizan-
do-se paquí�metro. A caracterização dos itens alimentares (análise
quantitativa) deverá ser realizada a partir de análise conjunta de
dois métodos: Método Volumétrico (Hyslop, 1980) e o Método de
Frequência de Ocorrência (Herran, 1988). Também poderá ser ana-
lisado o Í�ndice de Importância Alimentar (IAi) descrito por Kawa-
kami e Vazzoler (1980), em que:
IAi = Fi × Vi/ ∑(Fi × Vi);

onde i = número de itens alimentares, Fi = Frequência de Ocorrência (%) de cada item
e Vi = Volume (%) de cada item.
Baseado no IAi, os itens encontrados serão classificados de

acordo com Rosecchi e Nouaze (1987):
FOI > 50 % - item principal;
25 < FOI < 50 % - item secundário
CAPÍTULO 3
Figura 3.7 Visualização em microscópio de porções do trato
gastrointestinal e conteúdo estomacal. Fragmento do intestino (ariocó -
Lutjanus synagris) com presença de pontos escuros (A); parede interna
do esôfago com camadas escuras (setas brancas) no tecido (ariocó -
Lutjanus synagris) (B, C); fragmento escuro junto ao conteúdo alimentar
no estômago (bagre - Sciades herzbergii) (D). Fotos: Gabriel Dutra.
Análise Histopatológica
Alterações morfológicas podem auxiliar em investigações da
toxicidade de compostos quí�micos e na observação de efeitos agu-
dos e crônicos em ambientes poluí�dos ou contaminados. Assim,
deve-se realizar análises histológicas de alguns tecidos (Lupi et
al., 2007). O tecido do trato gastrointestinal dos peixes deverá ser
submetido a análise histopatológica sendo então fixado em for-
mol a 10 %. Posteriormente o tecido será submetido ao tratamen-
to histológico (Tolosa et al., 2005) para a produção de lâminas que
serão analisadas por meio de microscópio óptico. A morfometria
das estruturas visualizadas será analisada utilizando programas
especí�ficos. Esta é uma ferramenta bastante eficaz em identificar
CAPÍTULO 3
efeitos tóxicos que possam afetar tecidos animais e a histopatolo-
gia mostra a resposta biológica de tecidos que foram expostos à
agressão e estresse (Lins et al., 2010).
Para avaliação histopatológica os tecidos biológicos deverão
ser removidos em autólise mí�nima, ou seja, em poucas horas após o
óbito. O material removido deverá ser etiquetado e fixado em solu-
ção aquosa de formaldeí�do a 10 % (Figura 3.8).
a b
c d
Figura 3.8: Remoção de órgão internos para análises histopatológicas e
de estágio de maturação gonadal (a), acondicionamento em solução
aquosa e formol (b), tecido muscular (c) e acondicionamento das
amostras por local (d). Fotos: Mauro Lima.
O processamento histológico será iniciado a partir da etapa de

desidratação dos tecidos por meio de banhos de soluções gradativas
e crescentes de etanol (etanol em concentração de 70 % até álcool
absoluto). Em seguida, os fragmentos serão diafanizados utilizando
CAPÍTULO 3
o xilol como substância intermediária para depois realizar a impreg-
nação com parafina.
Em todas as etapas, os tecidos biológicos deverão permanecer
submersos durante 1 hora em cada banho ou de acordo com adap-
tações de métodos dependente do tipo e tamanho do tecido. Após
a impregnação, inicia-se a etapa de inclusão na qual os fragmen-
tos teciduais são adicionados em um molde de bloco e infiltrados
com parafina lí�quida. Após formação do bloco, o material deverá
ser seccionado no micrótomo (Leica RM 2235) em espessura de 5
µm. Os cortes deverão ser submetidos ao método de coloração de
rotina por Hematoxilina-Eosina (H.E.) (Tolosa et al., 2005) e, quan-
do necessário, pela coloração de ácido periódico-Schiff (PAS) com
hematoxilina férrica (Tolosa et al., 2003) (Figura 3.9).
Figura 3.9: Etapas do processamento histológico - preparação dos

tecidos: desidratação com etanol (A), inclusão em parafina (B),
Microtomia (C) e Coloração (D). Fotos: Gleyciane Ferreira.
Para a análise das lâminas histológicas confeccionadas utili-

za-se microscópio de luz. É� recomendável a realização de micro-
fotografias em microscópio óptico com câmera digital acoplada
(Figura 3.10).
CAPÍTULO 3
Figura 3.10: Microfotografia em corte transversal de trato gastrointestinal
de tainha (Mugil curema). Visão geral das camadas que compõem o
intestino (A), camada mucosa (1), camada submucosa (2), camada
muscular (aumento em 10 x) (3). Vilosidade Intestinal (aumento 40x) (B),
Camada muscular e Serosa (aumento 10 x) (C). Fotos: Pedro Santos.
Examinadas visualmente em momento anterior, as brânquias

deverão ser objeto para produção de lâminas. A avaliação minucio-
sa histológica do tecido branquial poderá comprovar possí�veis le-
sões a serem ordenadas segundo o grau de severidade, de acordo
com a escala sugerida por Bernet et al. (1999) (Anexo 5).
A análise histopatológica nas brânquias e fí�gado de peixes
podem resultar em dados utilizados na pesquisa de poluentes quí�-
micos. Vários estudos sugerem que a investigação histopatológica
aumenta a credibilidade do diagnóstico envolvendo impactos em
sistemas aquáticos (Sweidan et al., 2015).
CAPÍTULO 3
CAPÍTULO IV
ANÁLISE DE
SEDIMENTOS
62
ANÁLISE DE SEDIMENTOS
4
Análises granulométricas, mineralógicas e
quantificação de carbonato e de matéria
orgânica (MO)
O
s sedimentos coletados deverão ser lavados sucessivamen-
te com água destilada utilizando-se centrí�fuga ou baldes
para retirada do conteúdo de sal. Em geral três sessões de
lavagens são suficientes para a remoção total dos sais. Após esta
etapa, os sedimentos deverão ser secos em placas aquecedoras sob
temperatura média de 60 ºC ou em estufa de secagem e esteriliza-
ção por aproximadamente 24 horas, com temperatura controlada
de 60 ºC. Posteriormente, o material deverá ser quarteado para as
análises de matéria orgânica (MO, 10 g), granulometria (50 g) e de
CaCO3 (10 g), constituindo o peso inicial. Para a análise de CaCO3, as
amostras deverão ser tratadas com ácido clorí�drico (HCl) diluí�do a
10 % para eliminar o CaCO3; posteriormente deverão ser lavadas e
secas em placas a 60 ºC, sendo feita nova pesagem para mensurar a
massa de carbonato perdida (Figura 4.1).
Para a análise granulométrica, a matéria orgânica das amos-
tras é eliminada utilizando peróxido de hidrogênio (H2O2) diluí�do
em água destilada (100 ml de H2O2 para 900 ml de água destila-
da). Após este procedimento, as amostras deverão ser lavadas e
posteriormente secas em placas a 60 ºC. Eliminada a MO, a análise

63 CAPÍTULO 4
Análise de sedimentos
granulométrica deverá ser realizada através da sequência de penei-
ras com aberturas de malha de 2 mm, 1 mm, 0,500 mm, 0,250 mm,
0,125 mm e 0,62 mm, e uma base seguindo metodologia descrita
por Folk (1968), colocadas no agitador de peneiras RO-TAP por 10
minutos na frequência de cinco vpm (voltas por minuto). Após o
tempo estipulado, os sedimentos retidos nas peneiras deverão ser
retirados por escovas de cerdas grossas e agulhas de seringas e de-
positados separadamente em placas de metal enumeradas de acor-
do com a ordem das peneiras.
Para a análise de MO, cada amostra deverá ser depositada
em cadinhos de porcelana e colocados na MUFLA Modelo F2-DM
Monofásico inicialmente a 300 ºC por 20 - 30 minutos e posterior-
mente a 600 ºC por 5 horas. Os cadinhos deverão ser retirados
com pinça e colocados na estufa em temperatura ambiente. Após
este procedimento, deve-se fazer nova pesagem das amostras
para mensurar a massa de M.O perdida (Frazão, 2003; Eichler et
al., 2007; Souza et al., 2010).
A identificação mineralógica dos sedimentos deverá ser rea-
lizada com auxí�lio de lupa binocular, com luz refletida de 45° e luz
transmitida, marca Zeiss (modelo Stemi SV-11), e aumento máximo
de 40 vezes. Uma câmera digital acoplada à lupa deverá ser utilizada
para a captura de imagens microscópicas. Análises quantitativas são
estimadas através de comparação visual com tabelas padrões de por-
centagem dos constituintes minerais e.g. (Terry e Chilingar, 1955).
A descrição textural, referente aos parâmetros arredonda-
mento e esfericidade dos grãos, deverá ser feita a partir da compa-
ração direta com as escalas padronizadas vigentes e atualizadas de
esfericidade e arredondamento, tais como Powers (1953) e adapta-
ções de Diasa(2004).

64 CAPÍTULO 4
a b
d e
f g
Figura 4.1: Análise de sedimentos em laboratórios da UFRN: lavagem

para retirada dos sais (a), quantificação do carbonato (b) e (c),
quantificação da matéria orgânica (d) e (e), análises granulométricas
(f) e análises mineralógicas (g). Fotos: Helenice Vital.

65 CAPÍTULO 4
Análise de microfósseis foraminíferos
Deve-se peneirar o sedimento em laboratório em via úmida
com peneiras sucessivas de 0,500 e 0,062 mm e, posteriormente,
colocar em papel filtro e secar em estufa a 60 ºC (Figura 4.2). Os fo-
raminí�feros deverão ser triados e identificados em microscópio bi-
nocular e transferidos com pincel para lâminas especiais de fundo
preto (Ruiz et al., 2005; Eichler et al., 2007; Laut et al., 2009; Souza
et al., 2010; Eichler et al., 2014).
a
b b
Figura 4.2: Processamento das amostras com peneiramento úmido (a), triagem
e identificação de espécies em lupa binocular (b). Fotos Patrícia Eichler.
Os foraminí�feros triados e identificados em diferentes espé-

cies, em microscópio binocular, deverão ser fotografados em mi-
croscópio eletrônico de varredura (MEV) para comprovação de es-
pécies e ilustração de artigos (Figura 4.3).
Os mapas de contorno deverão ser confeccionados no pro-
grama Surfer 9 e Arcgis, baseados nas tabelas de frequência relati-
va das espécies de foraminí�feros dominantes e variáveis ambien-
tais disponí�veis.

66 CAPÍTULO 4
a b
Figura 4.3: Análises em microscópio binocular e lâminas (a) e
Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) (b). Fotos: Patrícia Eichler.
Para avaliar os foraminí�feros, deverão ser utilizadas análises

univariadas (diversidade, dominância e equitatividade) aplicadas
aos dados. Estas permitem analisar cada variável separadamente
para uma ou mais amostras independentes. Já as multivariadas (PCA,
CLUSTER e BIOENV) deverão ser aplicadas para múltiplas variáveis
dependentes e/ou independentes, estabelecendo ou não relações de
causa/efeito entre os grupos. Para as análises univariadas são deter-
minados í�ndices de diversidade (H´), equitatividade (J´) de Shannon-
-Wiener, e dominância de Simpson, utilizados nos trabalhos de Ei-
chler et al. (2008), Laut et al. (2009), Mahiques et al. (2009) e Souza
et al. (2010). As análises multivariadas são baseadas no critério de
Jolliffe (2002), onde a análise de PCA se baseia na matriz de dados
dos Componentes Principais usando a Correlação da Matriz. Análises
de CLUSTER em Modo Q (Distância Euclidiana) define agrupamen-
tos de espécies em comum nas estações, baseando-se na matriz de
dados de frequência absoluta de espécies de foraminí�feros e de da-
dos ambientais, confeccionados no programa Primer 6 (Eichler et al.,
2007; Eichler et al., 2008; Laut et al., 2009; Souza et al., 2010). A aná-
lise de BIOENV (Spearman) identifica as variáveis ambientais mais
importantes para a formação dos grupos fauní�sticos pela correlação
entre dados bióticos e abióticos (de Léo, 2003).

67 CAPÍTULO 4
CAPÍTULO V
ANÁLISE
QUÍMICA DE
CONTAMINANTES
68
ANÁLISE QUÍMICA DE
5
CONTAMINANTES
Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos

(HPAs) e elementos traço
O petróleo é uma mistura complexa de centenas ou milhares
de compostos orgânicos com predomí�nio de hidrocarbonetos que
apresentam propriedades quí�micas e fí�sico-quí�micas diversas. Em
relação aos efeitos ambientais da contaminação por petróleo e de-
rivados, há particular interesse em relação aos hidrocarbonetos
policí�clicos aromáticos (HPAs) contendo entre 2 e 6 anéis benzê-
nicos fundidos. Isso ocorre em função da ubiquidade dos HPAs nos
diversos compartimentos ambientais - função das inúmeras fontes
petrogênicas e pirolí�ticas, a relativa persistência e consequente
maior exposição ambiental a esses compostos, e da maior toxici-
dade biológica, gerando impactos associados a problemas ontoge-
néticos, danos no DNA e uma série de irregularidades fisiológicas
em organismos marinhos (Neff, 2002; Honda e Suzuki, 2020). Além
dos compostos orgânicos, no petróleo também há metais e semi-
metais que podem comprometer a qualidade ambiental (Dasuki et
al., 2015). A composição e distribuição relativa dos diversos HPAs
e elementos traço encontrados no petróleo depende do tipo e do
processo de maturação da matéria orgânica que ocorre em cada re-
servatório que acumula óleo e gás (Patin, 1999)

69 CAPÍTULO 5
Análise química de contaminantes
Nesse sentido, se faz necessária a análise principalmente da
concentração de hidrocarbonetos policí�clicos aromáticos (HPAs) e
outros elementos como mercúrio, cádmio (Cd), cobre (Cu), prata
(Ag), selênio (Se) e vanádio (V) em biota marinha de áreas sob der-
ramamento. Tais análises devem ser realizadas a partir das amos-
tras de tecidos (hepático, renal e/ou muscular), mencionadas na
etapa de análise macroscópica deste Guia e referenciadas em Bashir
e Alhemmali (2015), Kojadinovic e Potier (2007).
Análise para detecção hidrocarbonetos

policíclicos aromáticos (HPAs)
A determinação de hidrocarbonetos policí�clicos aromáticos
(HPAs) envolve três etapas: extração, purificação e análise instru-
mental. Aqui, serão apresentados dois procedimentos diferentes
para as duas etapas iniciais (extração e purificação), a depender do
organismo e do tecido a ser analisado, sendo que a análise instru-
mental em ambos os casos será realizada através de cromatografia
em fase gasosa acoplada a espectrometria de massas.
As amostras de pescados devem ser preparadas para determi-
nação de HPAs em ambiente limpo e descontaminado para resí�duos
de óleo e de plásticos, preferencialmente dentro de capelas (Figura
5.1). O músculo do peixe é retirado na região abaixo da nadadeira
dorsal (Figura 5.2), enquanto moluscos são agrupados (de 5 a 10
indiví�duos, dependendo do tamanho) e homogeneizados para fazer
uma amostra composta (Figura 5.3). Desta maneira, existirão dois
tipos de amostras, uma composta por um único indiví�duo (ex. um
peixe de tamanho médio ou grande) e outra composta por mais de
um indiví�duo (ex. grupos de invertebrados - sururus).

70 CAPÍTULO 5
Figura 5.1. Visão geral da bancada para
sub-amostragem de tecidos biológicos para
determinação de HPAs. Foto: Renato Carreira.
Figura 5.2. Músculo de peixe Figura 5.3. Liquidificador (copo

rebatido para remoção de amostra vidro e lâmina de aço) para
e posterior análise química (HPAs). homogeneizar amostras compostas
Foto: Renato Carreira. de tecidos de mexilhão para
determinação de HPAs. Foto:
Wellington Guedes.

71 CAPÍTULO 5
No caso de amostras de músculo de peixes e de crustáceos,
a extração/purificação segue o método QuEChERS (acrônimo de
Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe). Há diversas confi-
gurações já propostas para o método QuEChERS (e.g., Ramalhosa
et al., 2009), sendo desenvolvido um protocolo especí�fico para o
projeto (Minguita, 2021), que consiste em extrair 2 g amostras
(peso úmido) com 2 mL de água e 4 mL da mistura de solventes
(acetona, acetato de etila e isoctano), seguido de purificação com
uso de 500 mg de Z-sep+ e, em seguida, por uma coluna de sí�lica
e alumina, com eluição com diclorometano em ambos os casos. O
volume do extrato purificado é reduzido a 300 µL e analisado por
GC-MS (ver detalhes abaixo). A Figura 5.4 ilustra algumas dessas
etapas do método QuEChERS.
Figura 5.4. Algumas etapas do método QuEChERS: adição de solvente em

tubos de teflon (na base amarela) contendo a amostra (a), centrifugação
após extração por agitação (b), aspecto do extrato após purificação com
Z-sep (c) e redução do volume do extrato para análise por GC-MS (d).
Ver texto para descrição detalhada. Fotos: Otoniel Santana.

72 CAPÍTULO 5
No caso de amostras com teor mais elevado de gordura, tais
como tecido de mexilhões e fí�gado, a extração é feita seguindo pro-
tocolo EPA3540C, da agência ambiental americana. Amostra com
cerca de 0,2-03 g de amostra úmida, homogeneizada com 10 g de
sulfato de sódio, são extraí�das por 8 h em aparelho Soxhlet (Figura
5.5) com mistura de diclorometano:hexano (1:1), após adição de
100 ng de p-terfenil-d14 como padrão sub-rogado. O extrato bru-
to é purificado em coluna de sí�lica-alumina e depois injetado em
cromatógrafo lí�quido acoplado a um detector de UV/Visí�vel equi-
pado com uma coluna (Phenogel 10 μ, 100 A, 22,5 x 250 mm, Phe-
nomenex, EUA) e uma pré-coluna (Phenomenex 286039-8, Pheno-
gel 03B-2090K0 Guard 10 μL, 50 x 7,8 mm) conectados em série.
A fração contendo HPAs é recolhida por volta de 30 min, seguindo
monitoramento pelo detector de UV-Vis em 254 nm. Na fração final
é adicionado mix de padrão interno (naftaleno-d8, acenafteno-d10,
fenantreno-d10, criseno-d12 e perileno-d12), cada um em concentra-
ção fixa igual a 100 ng mL-1, para quantificação.
Figura 5.5. Bateria de aparelhos Soxhlet, utilizada na extração de HPAs

em biota. Foto: Renato Carreira

73 CAPÍTULO 5
A análise instrumental para os HPAs extraí�dos pelos dois pro-
cedimentos descritos acima segue o protocolo EPA-8270E, que tem
como base a cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrome-
tria de massas (Figura 5.5). As condições instrumentais estão lista-
das na Tabela 5.1. A calibração do equipamento é feita com curva de
analí�tica com 12 concentrações (0,50; 1,0; 2,0; 5,0; 10; 20; 50; 100;
200; 400; 1000 e 2000 ng mL-1) de solução contendo os compostos
controlados pelo método (ver listagem abaixo). Em cada solução da
curva de calibração há ainda os padrões internos deuterados (naf-
taleno-d8, acenafteno-d10, fenantreno-d10, criseno-d12 e perileno-d12),
cada um em concentração fixa igual a 100 ng mL-1.
Figura 5.6. Cromatógrafo em fase gasosa com detector de massas (GC-MS)

utilizado na determinação de HPAs em pescados. Foto: Wellington Guedes.
São quantificados os 16 HPAs prioritários da agência ambien-

tal americana (naftaleno, acenaftileno, acenafteno, fluoreno, fenan-
treno, antraceno, fluoranteno, pireno, benzo(a)antraceno, criseno,
benzo(b)fluoranteno, benzo(k)fluoranteno, benzo(a)pireno, inde-
no (1,2,3-c, d) pireno, dibenzo(a,h)antraceno, benzo(ghi)perile-
no), assim como os compostos parentais dibenzotiofeno, perileno,
benzo(e)pireno, benzo(c)fenantreno. Também são identificados os
seguintes HPAs alquilados: C1 a C4-naftalenos; C1 a C3-fluorenos,

74 CAPÍTULO 5
C1 a C4-dibenzotiofenos, C1 a C4-(fenantrenos + antracenos), C1 a
C2-pirenos e C1 a C2-crisenos. No total, o método identifica e quan-
tifica 41 HPAs individuais.
Tabela 5.1. Condições instrumentais para determinação de HPAs individuais.
EM - Finnigan modelo ISQ
Equipamento
GC – Finnigan modelo TraceGC
Coluna J&W DB-5msMSD (30 m, 0,25 mm de DI e 0,25 m de filme)
50 °C durante 5 min
Programa de 50 °C min-1 até 80 °C
temperatura 6 °C min-1até 280 °C durante 20 min
12 °C min-1 até 305 °C durante 10 min
Gás de arraste hélio a 1,2 mL min-1
Volume de Injeção 1L
Independente do protocolo, são adotados critérios de controle

e de qualidade das análises, incluindo: branco de método e amostra
certificada a cada batelada de 12 amostras, estimativa de precisão
(melhor que 20%) e de exatidão usando material de referência certifi-
cado (NIST 2974a ou similar) e recuperação entre 60 e 120 % do pa-
drão sub-rogado. Os limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ)
variam de acordo com o protocolo: para QuEChERS, LDs entre 0,38 e
7,45 ng g-1 e LQ entre 1,13 e 15,2 ng g-1; para Soxhlet e GPC, a metodo-
logia é mais sensí�vel, com LDs entre 0,1 e 0,3 ng g-1 e LQ de 2,0 ng g-1.
Determinação de mercúrio total (HgT)

Serão utilizadas alí�quotas de aproximadamente 0,1 gramas
de tecidos hepático, muscular e renal secos. Os tecidos serão sub-
metidos a 1mL de peróxido de hidrogênio e 5mL de solução mista
de ácido sulfúrico e ácido ní�trico na proporção de 1:1. O extrato
resultante da digestão será aquecido a 60 °C por duas horas e foi
adicionado 5 mL de permanganato de potássio (Malm et al., 1989;
Bastos et al., 1998).

75 CAPÍTULO 5
A determinação de mercúrio total (HgT) será realizada em
equipamento de Espectrometria de Absorção Atômica com geração
de vapor frio (modelo FIMS 400, Perkin Elmer) utilizando uma varia-
ção do método proposto por Malm et al. (1989) e Bastos et al. (1998).
As análises serão certificadas com a utilização de materiais certifica-
dos DOLT-5 e DORM-2 do National Research Council of Canada (NRC)
e de material de referência interno do MAQUA (MIR), além da utiliza-
ção de brancos e réplicas em todas as baterias analisadas.
Determinação de cádmio (Cd), cobre (Cu),

prata (Ag), selênio (Se) e vanádio (V)
Alí�quotas de aproximadamente 0,1 grama (peso seco) de teci-
do muscular, renal e hepático serão digeridas com adição de 2 mL de
ácido ní�trico (65 %) por 12 horas em temperatura ambiente segui-
das por 2 horas em banho-maria a 60 °C em sistema fechado (Deaker
e Maher, 1997). As concentrações serão determinadas por Espectro-
metria de Absorção Atômica com Atomização Eletrotérmica (equipa-
mento ZEEnit 650P, Analytik Jena). O modificador quí�mico emprega-
do será o paládio (Pd(NO₃)₂ / HNO₃ 15 %, Merck). As análises serão
certificadas com a utilização de material de referência DOLT-5 do NRC
(National Research Council of Canada) para todos os elementos, além
da utilização de brancos e réplicas em todas as baterias analisadas.
Análise química de sedimentos

Os sedimentos deverão ser submetidos a procedimento de
extração e quantificação baseados nos métodos da USEPA6 SW-846
6 http://www.epa.gov - SW846 on-line, method 8100 polynuclear aromatic hydrocarbons

http://www.epa.gov - SW846 on-line. method 3550C ultrasonic extraction
http://www.epa.gov - SW846 on-line. method 3610B alumina cleanup
http://www.epa.gov - SW846 on-line. method 3630C silica gel cleanup
http://www.epa.gov - SW846 on-line. method 8015D nonhalogenated organics using GC/FID

76 CAPÍTULO 5
(http://www.epa.gov/sw846 on-line): EPA-3540C (extrator So-
xhlet) EPA-3550C (extração por ultrassom), clean-up por sí�lica gel/
alumina (EPA-3630C e EPA-3610B) e quantificação por cromato-
grafia usando CG-EM para hidrocarbonetos policí�clicos aromáticos
(HPAs) (EPA-8100) e CG-DIC para hidrocarbonetos alifáticos (HAs)
e mistura complexa não resolvida (MCNR) (EPA-8015D). Entretan-
to, uma otimização do processo foi realizada e adicionado um rí�gi-
do controle de qualidade analí�tico para avaliar a eficiência de extra-
ção dos analitos investigados por meio de ensaios de recuperação
usando adição de padrões surrogates (Cavalcante et al., 2008).
Quanto aos reagentes que devem ser utilizados, os solventes
hexano e diclorometano (DCM) devem ser de alta pureza para cro-
matografia. Os padrões utilizados para a construção da curva de
calibração serão a partir de uma solução de n-alcanos (série ho-
móloga n-C10 a n-C38, incluindo os alcanos isoprenóides: pristano
e fitano) e dos 16 hidrocarbonetos policí�clicos aromáticos (HPAs)
prioritários da USEPA acrescentado de outros (Tabela 5.2).
Os padrões internos (PI) e surrogates (PS) dos HAs (n-C16-d34,
n-C30-d62, n-C20-d42) e dos HPAs (p-Terphenyl-d14, 1,4-dichloroben-
zene-d4, naftaleno-d8, acenafteno-d10, fenantreno-d10, perileno-d12 e
criseno-d12) devem possuir pureza acima de 98 %. A sí�lica (70-230
mesh) e alumina utilizados devem apresentar alta pureza. Tanto os
adsorventes (sí�lica e alumina) quanto o Na2SO4 serão ativados em
estufa por 24 h, a 250 °C.

77 CAPÍTULO 5
Tabela 5.2. Hidrocarbonetos de petróleo analisados em sedimentos
HPAs HAs
1,4-Dichlorobenzene-d4 (PS) n-C10
Naphthalene-d8 (PS) n-C11
Naphthalene n-C12
C1-Methyl Naphthalene n-C13
C2-Dimethyl Naphthalene n-C14
C3-Trimethyl Naphthalene n-C15
C4-Tetramethyl Naphthalene n-C16
2-Methylnaphthalene n-C17
1-Methylnaphthalene pristane
Acenaphthylene n-C18
Acenaphthalene-d10 (PS) phytane
Acenaphthene n-C19
Fluorene n-C20
C1-Methyl Fluorene n-C21
C2-Dimethyl Fluorene n-C22
Série homóloga dos alcanos:
C3-Trimethyl Fluorene n-C10 a n-C38 n-C23
Dibenzothiophene n-C24
C1- Methyl Dibenzothiophene n-C25
C2- Dimethyl Dibenzothiophene n-C26
C3- Trimethyl Dibenzothiophene n-C27
Phenanthrene-d10 (PS) n-C28
Phenanthrene n-C29
C1-Methyl Phenanthrene n-C30
C2-Dimethyl Phenanthrene n-C31
C3-Trimethyl Phenanthrene n-C32
C4-Tetramethyl Phenanthrene n-C33
Anthracene n-C34
C1- Phenanthrene- anthracene n-C35
C2- Phenanthrene- anthracene n-C36
Fluoranthene n-C37
Pyrene n-C38
C1- Fluoranthene- pyrene
C2- Fluoranthene- pyrene
p-Terphenyl-d14 (PI)
Benz[a]antrhracene
Chrysene-d12 (PS)
Chrysene
C1-Methyl Chrysene
C2-Dimethyl Chrysene
C2-Trimethyl Chrysene
Benzo[k]fluoranthene
Benzo[b]fluoranthene
Benzo[e]pyrene (BeP)
Benzo[a]pyrene
Perylene-d12 (PS)
Perylene (PER)
Indeno[1,2,3-c,d]pyrene
Dibenz[a,h]anthracene
Benzo[g,h,i]perylene

78 CAPÍTULO 5
• PROCESSO DE EXTRAÇÃO
Devido à complexidade da matriz ambiental e diferença das
propriedades fí�sico-quí�micas dos hidrocarbonetos de petróleo, a
escolha da fase extratora e do sistema de purificação será baseada
na constante eluotrópica (ε°), í�ndice de polaridade (P°) e proprie-
dades fí�sico-quí�micas dos hidrocarbonetos estudados.
A partir de 15 g de areia/sedimento (liofilizado e passados
em peneiras com abertura de 2 mm, para a retirada do material
grosseiro), serão adicionados 50μL da mistura de padrão surrogate
e a extração ocorrerá com auxí�lio de sonicação ou extrator Soxhlet,
conforme métodos da EPA-3540C ou EPA-3550C7.
A mistura extratora será selecionada por faixa decrescente
de P°, primeiramente 25mL de DCM, 25 mL de hexano e por fim
25 mL de uma mistura DCM e hexano (1:1 v/v). Os extratos serão
recolhidos em tubos de Falcon (vidro) e centrifugados a 2000 rpm
por 20 min. O sobrenadante será recolhido em balão de fundo re-
dondo de 150 mL e rotaevaporado até aproximadamente 1 mL,
para a etapa de clean-up.
• ETAPA DE CLEAN UP
Antes da construção da coluna de clean-up (purificação), a
sí�lica gel e a alumina serão ativadas em estufa a 200 °C por 12 h.
A coluna de clean-up será preparada a partir da solução de 8g de
sí�lica gel, seguida de 2 g de alumina em hexano. Em seguida será
colocado 1 cm de Na2SO4, conforme método USEPA (EPA-3630C
e EPA-3610B). Lavar a coluna de clean-up preparada com 10 mL
de hexano, sem deixar que a mesma se esvazie, para evitar cami-
nhos preferenciais.
7 http://www.epa.gov - SW846 on-line. method 3550C ultrasonic extraction

79 CAPÍTULO 5
Após a adição dos extratos, oriundos da etapa de extração na
coluna de clean-up, deverá ocorrer a eluição dos hidrocarbonetos.
As misturas eluentes serão: 20 mL de hexano para a fração dos
HAs, denominado de Fração 1 (F1), e em seguida 30 mL de hexano
e DCM (3:2 v/v) para a fração dos HPAs (F2). Os extratos F1 e F2
serão pré-concentrados para 1mL usando fluxo de N2 e em seguida
adicionado 10 μL dos padrões internos respectivos a cada fração, e
finalmente estando prontos para serem quantificados por croma-
tografia gasosa.
• DETERMINAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO
Para a etapa de determinação: a fração F1, contendo os HAs e
MCNR, será usada CG-DIC e a F2, contendo os HPAs, será por meio
de CG-EM, conforme condições similares às da Tabela 5.3. Todos
os analitos de interesse, bem como seus respectivos PS e PI serão
determinados pelo tempo de eluição pré-estabelecido de cada um
deles. Em adição a determinação de HPAs, a identidades dos com-
postos serão confirmadas pelo uso da biblioteca National Institute
of Standards and Technology ou similares.
Tabela 5.3 - Condições de operação do CG-DIC e CG-EM.

CG-DIC CG-EM
Coluna Fase tipo DB-5 (30 m x 0,32 mm x 0,25 µm)
Fase Móvel (Gás de arraste) Nitrogênio Hélio
Vazão na coluna 1,3 mL/min 1,3 mL/min
Temperatura do injetor 280 °C 300 °C
Detector DIC EM
Temperatura do detector 300 °C 300 °C
Temperatura da interface - 300 °C
Temperatura inicial 50 °C 50 °C
Volume de injeção 1 µL 1 µL
Modo de injeção Splitless Splitless
Modo de detecção (EM) - SIM

80 CAPÍTULO 5
Para a etapa de quantificação serão calculados os fatores de
resposta relativos (FRR), conforme equação abaixo.
FRR= Ac / Api x Cpi / Cc
Onde:
Ac (área) e Cc (concentração) = do analito de interesse
Api (área) e Cpi (concentração) = do padrão interno usado
• CONTROLE DE QUALIDADE
Todas as etapas realizadas em laboratório serão acompa-
nhadas por procedimentos criteriosos de controle de qualidade.
Ensaios de recuperação usando adição de padrões surrogates, se-
rão realizados para avaliar a eficiência de extração dos analitos de
investigados. A fim de eliminar problemas de contaminação, serão
analisados brancos (Br) da etapa de extração (1Br/7 amostras) e
também da coluna cromatográfica (1Br/15 injeções).
A limpeza de vidrarias deve ser um dos focos na preparação
do material usado em todas as etapas de determinação dos hidro-
carbonetos de interesse. Primeiramente, as vidrarias serão deixa-
das em banho de detergente (extran a 20 %v/v) por pelo menos
4 horas, sendo em seguida abundantemente enxaguada em água
corrente, água de alta pureza, e então colocada em banho de ácido
ní�trico (HNO3 a 5 %v/v) por 4 horas. Em seguida, as vidrarias se-
rão novamente enxaguadas em água corrente, água de alta pureza
e deverão ser mantidas em estufa a 450 °C por um perí�odo de no
mí�nimo 4 horas.
A quantificação dos hidrocarbonetos será realizada usando
uma curva de calibração de 7 pontos pelo método do padrão in-
terno. Baseado na curva de calibração será verificado as principais
figuras de mérito analí�ticas como: linearidade, precisão, limite de
detecção e quantificação. A eficiência do método de extração dos

81 CAPÍTULO 5
compostos do sedimento será avaliada através do estudo de recu-
peração de padrões surrogates, relacionando-se a quantidade de
padrão adicionado no iní�cio do procedimento com a quantidade
extraí�da e quantificada ao término do processo (IUPAC, 2002).
• AVALIAÇÃO AMBIENTAL
Para fortalecer as evidências de impactos nas áreas avaliadas,
serão confirmados se os ní�veis de HPAs presentes são oriundos de
atividades petrogênicas, através do uso de razões de diagnóstico
(Tabela 5. 4) (STogiannidis e Laane, 2015; Wang et al., 1999).
A MCNR, a qual é extraí�da com os HAs, é certamente uma
das principais evidências geoquí�micas da contaminação por pe-
tróleo (Reddy et al., 2000). Nesse sentido, serão usados os ní�veis
da MCNR (>10 µg/g), bem como o í�ndice preferencial de carbono
(IPC) e í�ndices relativos entre carbonos í�mpares e pares para con-
firmar a contaminação por petróleo, aumentando assim as evi-
dências (Tabela 5.4).

82 CAPÍTULO 5
Tabela 5.4. Razões e índices de diagnósticos
Razões de diagnósticos Limites Indicador
Pri /Phy ≈1 Contaminação por óleo
Pri/n-C17 >1 Óleo cru recente
Phy/n-C18 >1 Óleo cru recente
>1 Naturais
CPI
HAs <1 Contaminação petróleo
MCNR >10 µg/g Contaminação petróleo
HRP (Hidrocarbonetos Resolvidos do
Petróleo)
TPH (hidrocarbonetos totais de
petróleo)
<1 Pirogênico
LMW/HMW
>1 Petrogênico
>1 Pirogênico
Fl/Py
<1 Petrogênico
< 10 Pirogênico
Phe/Ant
> 15 Petrogênico
HPAs
> 0.5 Combustão
BaA/Cry
< 0.25 Contaminação por petróleo
<0.01 Produtos refinados leves
Índice pirogênico <0.03 Produtos refinados pesados
(∑HPAs 3-6 aneis/∑5-HPAs-alquilados) <0.05 Óleos / cru pesados
>0.05 Materiais pirogênicos
Fonte: Reddy et al. (2000); Stogiannidis; Laane (2015); Wang et al. (1999).

83 CAPÍTULO 5
CAPÍTULO VI
ASSIMETRIA
FLUTUANTE,
ANÁLISE INDIRETA
84
ASSIMETRIA FLUTUANTE
6
- ANÁLISE INDIRETA
O
ní�vel de alterações morfológicas em uma determinada po-
pulação é uma forma de examinar a qualidade ambiental e
a instabilidade no desenvolvimento dos indiví�duos (Weller
e Ganzhorn, 2004; Beasley et al., 2013). Um indicador desta insta-
bilidade é o estudo de Assimetria Flutuante (AF), capaz de medir
e analisar os pequenos desvios aleatórios da simetria bilateral de
organismos, identificadas a partir de baixos ní�veis de assimetria do
indiví�duo (Palmer e Strobecke 1986; Palmer, 1994). Esta é conside-
rada uma técnica eficaz para detecção de estresse ambiental.
Conforme já foi mencionado, o petróleo possui em sua compo-
sição elementos (e.g. HPAs) que, quando liberados na água, podem
gerar perturbações no equilí�brio do ecossistema (Lopes, 2007).
Assim, uma das formas de avaliar a presença dessas perturbações
no ambiente pode ser realizada a partir da análise da mudança no
ní�vel de desenvolvimento de espécies diferentes, uma vez que or-
ganismos bilaterais simétricos, por exemplo, deveriam se desenvol-
ver de forma idêntica em ambos lados corporais (Hoog et al., 2001
apud Sanseverino e Nessimian, 2008).
A Assimetria Flutuante pode ser utilizada por meio da medição
de caracterí�sticas, discretas e/ou contí�nuas, de ambos lados dos indi-
ví�duos de uma mesma espécie. Isso determinará se ocorreu alguma

85 CAPÍTULO 6
Assimetria flutuante, análise indireta
modificação no seu desenvolvimento já que, as prováveis assime-
trias, possivelmente ocasionadas pelo estresse do meio externo (Sil-
va et al., 2007), indicariam se houve um impacto naquele ambiente.
Pela presença de HPAs encontrados no óleo e/ou presentes na água,
os processos de Biomagnificação e Bioacumulação dos compostos
podem se revelar no ní�vel de flutuação assimétrica das populações.
O estudo da AF foi utilizado em outros desastres com petróleo
ao redor do mundo, como o derrame de óleo que ocorreu no Golfo do
México (EUA) em 2010, conhecido também por “Deepwater Horizon
Oil Spill”. Isso porque algumas espécies de peixes localizadas em re-
giões que foram atingidas pelo óleo, podem apresentar um valor de
AF maior no perí�odo pós-desastre do que no perí�odo pré-desastre,
em alguma das medidas de cada um dos peixes utilizados no estudo
(Michaelsen et al., 2015). Mesmo assim, a AF como ferramenta indi-
reta de avaliação ambiental não é muito propagada em estudos de
avaliação de impacto por derrame de petróleo no ambiente marinho.
As técnicas de Assimetria Flutuante compõem uma ferramen-
ta útil e promissora, como também, uma alternativa aos métodos
tradicionais de avaliação da saúde ambiental (e do bem-estar dos
organismos), inclusive em casos de derrame de petróleo nos oce-
anos. São também uma forma mais simples e de baixo custo de
detectar possí�veis estresses corporais, apresentados em forma de
anomalias ou assimetrias (e.g. flutuantes), nas populações naturais
(Leary e Allendorf, 1989). A Assimetria Flutuante pode ser calcula-
da pela soma das diferenças entre o lado direito e o lado esquerdo
de cada indiví�duo e, posteriormente, essa soma deve ser dividida
pelo tamanho da amostra. Assim, caso algum fator de estresse am-
biental esteja impactando no desenvolvimento dos organismos, as
variações individuais serão detectadas através de uma investigação
estatí�stica com base nos desvios em torno da média populacional.

86 CAPÍTULO 6
Geralmente essa variação descrita anteriormente é representa-
da pelo uso de uma Análise de Variância de efeitos mistos com duas
vias (ANOVA two-way mixed effects), relacionadas a variação indivi-
dual (efeito randômico) e um efeito fixo (lados corporais) (Palmer
e Strobecke, 1986). Historicamente, estudos de Assimetria Flutuan-
te foram preconizados pelos de morfometria tradicional (Palmer e
Strobecke, 1986; Palmer, 1994). Entretanto, nas últimas décadas as
técnicas de morfometria geométrica têm com sucesso incorporado a
investigação a ní�vel de estudo da forma corporal (Klingenbeg et al.,
2012, 2015; Zelditch et al., 2012). Umas das técnicas mais populares
e de fácil acesso, para representação geométrica e estudo da variação
da forma corporal, se baseia no uso de marcos anatômicos.
De acordo com Rohlf e Marcus (1993), as marcações corpo-
rais do tipo marco anatômico, se transformadas em coordenadas
bidimensionais ou tridimensionais, são mais precisas para investi-
gação das estruturas corporais. Em adição, esses autores destacam
que a técnica de marcos anatômicos como parte da visualização da
variação geométrica, além de facilitar na observação na mudança
geométrica da forma corporal, facilita observar se houve variação
da estrutura corporal em relação a outra.
Neste capí�tulo é apresentada uma sí�ntese dos processos e
etapas mais importantes para a realização da investigação de AF
por uma técnica de morfometria geométrica a partir dos concei-
tos de objeto simétrico (e simetria pareada para estruturas que não
compartilham o mesmo eixo central), e marcos anatômicos (land-
marks) em duas dimensões de acordo com o procedimento de Su-
perimposição de Procrustes. Para uma utilização compreensiva do
tema, recomenda-se a leitura de materiais especializados de base
teórica, como Monteiro e Reis (1999) e Klingenberg et al. (2012,
2015) e Zelditch et al. (2012).

87 CAPÍTULO 6
Nos tópicos a seguir, apresentamos os procedimentos para
armazenamento, tratamento e padronização das amostras nos es-
tudos de Morfometria Geométrica, os conceitos introdutórios na
investigação da forma corporal por técnica de morfometria geomé-
trica por marcos anatômicos e a avaliação da AF da forma corporal
por morfometria geométrica e análises estatí�sticas.
Armazenamento, tratamento e padronização

das amostras para os procedimentos de
Morfometria Geométrica
Os espécimes deverão ter a superfí�cie corporal, ou estrutura
corporal de interesse intactas. Portanto, exemplares com ferimen-
tos que danifiquem total, parcial ou em locais de alguma região ou
área da estrutura corporal de interesse não deverão ser incluí�dos
na investigação (Alencar et al., 2014; Lima-Filho et al., 2017).
Nos organismos que têm total, parcial, ou a estrutura de inte-
resse desprovida de formação esquelética de qualquer natureza (e.g.
endo ou exoesqueleto) deve-se tomar precauções para preservação
e/ou conservação do material, mantendo-o livre de deformações cor-
porais. Isto porque em animais de endoesqueleto que irão ser inves-
tigados a partir de estruturas corporais compostas de tecido mole, a
conservação em freezer, ou em álcool (e.g. 70 % ou 100 %), ou outro
lí�quido de fixação ou conservante - sem o devido cuidado necessário
- poderá provocar alterações no formato do corpo (Lee, 1982; Mar-
tinez et al., 2012; Berbel-Filho et al., 2013). O mesmo se aplica para
animais de exoesqueleto que a estrutura de interesse é composta
majoritariamente por tecidos moles ou, no caso de um organismo
que tem calcificação, ou ní�vel de esclerotização do seu exoesqueleto,
menos notável (e.g. como nos camarões Peneí�deos - ver Moraes A et
al., (2021); e Carí�deos - ver Moraes S et al., (2020).

88 CAPÍTULO 6
Para evitar a deformação do corpo, ou estrutura corporal de
interesse, no perí�odo de armazenamento até o uso para a captura
das fotos - como no caso dos peixes e camarões - os exemplares de-
verão ser resfriados em bandeja plana, sem empilhamento, em po-
sição lateral para todos os espécimes após o congelamento deverão
ser transportados e armazenados em sacos plásticos (Figura 6.1).
Nos indiví�duos com exoesqueleto ou estrutura mineralizada, e.g.
caranguejos, sururus e mariscos (bivalves), a etapa de resfriamento
e congelamento poderá ser diretamente em sacos individualizados
devido às estruturas serem rí�gidas (Alencar et al., 2014; Lane-Me-
deiros et al., 2021). Porém deve-se evitar peso sobre as amostras
para evitar a quebra do exoesqueleto ou estrutura mineralizada.
a b
c
Figura 6.1: Armazenamento dos
exemplares para posterior extração de
tecido mole: ariocó (Lutjanus synagris)
sem empilhamento e devidamente
identificados para congelamento (a),
após congelamento (b), organização
de caranguejos (Ucides cordatus)
individualizados, com etiqueta (c) e
remoção de tecidos internos de bivalve
(análise de HPA) e separação das valvas
de bivalves para as análises de Assimetria
Flutuante (d). Fotos: Mauro Lima.
d

89 CAPÍTULO 6
A coleta de dados da forma corporal pelo procedimento de
marcos anatômicos será iniciada através da captura de registros fo-
tográficos dos espécimes. Portanto, os procedimentos fotográficos
precisam ser padronizados em dois principais aspectos, tanto em
relação ao observador (pesquisador que está realizando o procedi-
mento), quanto em relação ao dispositivo de captura (equipamento
fotográfico; lente fotográfica).
Neste ponto atentamos para o cuidado com os seguintes as-
pectos em relação ao observador: (a) apresentar conhecimento da
anatomia básica da espécie-alvo, (b) apresentar conceitos básicos
de arquitetura corporal animal e simetria corporal, (c) estabelecer
previamente o plano de visualização da estrutura corporal de in-
teresse e, (d) estabelecer previamente quais serão os marcos ana-
tômicos de representação da estrutura corporal de interesse e sua
relação com o objetivo de estudo (ver marcos anatômicos no item
seguinte “Conceitos básicos em Morfometria Geométrica”). Em re-
lação ao dispositivo de captura devemos tomar os seguintes cuida-
dos: (e) estabelecer um padrão de uso de distância do dispositivo
em relação ao espécime, de iluminação local, e uso de fundo de con-
traste, (f) identificar cada uma das fotos no seu campo de imagem
com placas (e. g. etiquetas) de identificação, (g) dispor de um re-
ferencial de tamanho linear (e. g. papel milimetrado ou escala co-
nhecida) em cada foto e, (h) identificar em quadro de imagem (no
dispositivo fotográfico ou no computador) se a estrutura corporal
de interesse apresenta-se visualmente clara e com estruturas ana-
tômicas (incluindo seus marcos anatômicos; item seguinte Concei-
tos básicos em Morfometria Geométrica) bem definidos (Figura 6.2).
Os detalhes mencionados anteriormente deverão ser siste-
matizados em sequências de fotos-teste realizadas extensivamen-
te para padronização do uso do dispositivo e, dos outros aspectos

90 CAPÍTULO 6
mencionados anteriormente como iluminação, e representação
da estrutura no quadro de imagem. Ainda sobre a representação
da estrutura no quadro de imagem, sugerimos que cada foto seja
capturada com: (i) a estrutura de interesse no centro do quadro de
imagem (dispositivos amadores/profissionais atuais possuem gra-
des de divisão na tela integrada), (j) evitar o uso de zoom digital e,
se necessário, apenas uso de zoom analógico.
Por fim, quanto ao interesse investigativo da variação corpo-
ral, as fotos deverão refletir a diversidade estrutural do organismo
e o objetivo de investigação. Por isso, em organismos bilaterais em
que a estrutura de interesse compartilha o eixo central do corpo
(conceito de objeto simétrico (Klingenberg et al., 2002); - como é
o caso da carapaça do caranguejo - uma padronização, por parte
do pesquisador, deverá ser feita para posicionar o organismo em
relação à lente do dispositivo fotográfico (Molina et al., 2018; La-
ne-Medeiros et al., 2021) de forma que os lados esquerdo e direi-
to sejam representados sem viés de posicionamento. Nos casos de
organismos bilaterais em que as estruturas a serem fotografadas
não compartilham o eixo central, mas possuem repetições bilate-
rais (conceito de simetria pareada; Klingenberg & Mcintyre 1998),
como o lado esquerdo e direito dos peixes ou valvas de um molus-
co bivalve em vista lateral, uma padronização do posicionamento
da estrutura deverá ser adotada. Dessa forma, tanto a estrutura do
lado esquerdo, quanto do lado direito deverão estar posicionadas
sem viés (exemplos em Accioly et al., 2013; Alencar et al., 2014; Mo-
lina et al., 2018; Moraes S et al., 2020).
As estruturas corporais de interesse podem ter elementos
estruturais, anexos ou apêndices que dificultem a visualização no
campo de imagem. Como por exemplo, a identificação da estrutura
corporal central de um peixe e as bases de inserção das nadadei-

91 CAPÍTULO 6
ras, ou mesmo, a marcação de ligação entre músculos e valvas de
um molusco bivalve ou, as comissuras (pontos de junção) laterais e
transversais da carapaça de um caranguejo e sua cobertura de cer-
das. Nestes e em outros casos similares, é importante lembrar que
a estrutura de interesse esteja com visualização ní�tida nas imagens
capturadas. Deve-se não apenas registrar o organismo por uma
foto, mas a estrutura corporal de interesse deverá estar com suas
estruturas corporais destacadas e visí�veis para sua identificação na
etapa de digitalização dos marcos anatômicos. Logo, algumas ações
poderão ser tomadas para aprimorar a visualização no campo de
imagem, como por exemplo, nos peixes, as nadadeiras poderão es-
tar dispostas completamente estendidas com o auxí�lio de alfinetes
e usar planos de fundos que sejam contrastantes com o espectro
de cores do animal. No caso dos animais de formação mineralizada
ou exoesqueletal, como por exemplo, a carapaça dos caranguejos, a
região das comissuras poderá ser escovada com o uso de escovas de
limpeza para remoção das cerdas (Figura 6.2).
Portanto, para um bom registro fotográfico do espécime a
ser avaliado via morfometria geométrica por marcos anatômicos
será necessário atentar para detalhes: (1) de qualidade da imagem
(foco, iluminação, posicionamento, enquadramento), (2) de pa-
dronização (distância da lente ao objeto, identificação do material,
indicação de referencial de tamanho, indicação de usuários fami-
liarizados com os dispositivos de imagem e com o material a ser
trabalhado) e (3) de representação da estrutura e identificação dos
marcos anatômicos.

92 CAPÍTULO 6
a b
b
a
d
c d
Figura 6.2: Procedimento fotográfico padronizado com altura fixa da
câmera, sobre a mesa estativa (a), controle de iluminação nas áreas de
marcos anatômicos (b), foto final de exemplar de ariocó (Lutjanus synagris)
para marcação do pontos (c) e preparação de exemplar de caranguejo
(Ucides cordatus) em bandeja com substrato maleável, para estabilizar o
espécime e proporcionar contraste de cor (d). Fotos: Mauro Lima
Conceitos básicos em Morfometria Geométrica

As análises morfométricas geométricas propostas neste guia
baseiam-se na definição de Forma (‘Shape’), Formato (‘Form’) e todas
as suas configurações geométricas, exceto escala, posição e orienta-
ção (Klingenberg et al., 2012, Zelditch et al. 2012) utilizando os mar-
cos anatômicos (landmarks) para extração da informação da forma
através da Superimposição de Procrustes (Dryden e Mardia, 1998).
Na morfometria geométrica, os conceitos biológicos de for-
ma e tamanho são distintos dos conceitos de uso comum para

93 CAPÍTULO 6
os Biólogos e demais profissionais interessados na área. Assim,
precisamos formalmente discutir como estes conceitos são com-
preendidos nas técnicas de morfometria geométrica. O conceito
de Forma (‘Shape’) se refere às informações geométricas de uma
estrutura quando removidos os indesejados aspectos de tamanho,
posição e orientação, permitindo descrever, apenas, semelhança
da forma geométrica (Kendall, 1977; Klingenberg, 2013, 2016). Já
o conceito de Formato (‘Form’) se refere às informações geomé-
tricas de uma estrutura quando Forma e Tamanho compõem a es-
trutura corporal analisada (Klingenberg, 2016). Ainda, de acordo
com Klingenberg (2016), o conceito de Tamanho se refere a todas
as informações escalares da estrutura, assinalando dimensão e
escala geral de um objeto.
As informações de Forma, Formato e Tamanho são obtidas
através do uso técnico e conceitual de marcos anatômicos, ou seu
termo mais popular na lí�ngua inglesa, Landmarks (Monteiro e Reis,
1999). Os marcos anatômicos são pontos morfológicos que podem
ser localizados homologamente, com relativa precisão, em cada es-
pécime sob estudo, e que representam a forma do organismo ou
parte corporal do organismo (Dryden e Mardia, 1998; Klingenberg,
2010) (Figura 6.3). Note que o termo ‘homologia’, neste caso, se re-
fere à possibilidade de marcação equivalente dos marcos anatômi-
cos, um-a-um, em todos os espécimes de um estudo ‘em um mesmo
ponto anatômico’ - ou mais tecnicamente - em um mesmo loci ana-
tômico (Zelditch et al., 2012).
Pela relevante função que os marcos anatômicos desempe-
nham nas análises de morfometria geométrica é preciso entender
conceitualmente sua função. De acordo com Zelditch et al. (2012),
os marcos anatômicos (landmarks) devem prover uma representa-
ção compreensiva da morfologia e de seus atributos de significância

94 CAPÍTULO 6
biológica para cada investigação em questão. Por exemplo, em um
estudo de avaliação eco-evolutiva sobre dimorfismo sexual, marcos
anatômicos devem ser selecionados levando em consideração atri-
butos da morfologia que estejam relacionados com algum evento
comportamental sexual (agonismo, corte e cópula, display sexual),
ou relacionado a possí�veis associações histológicas/fisiológicas
do desenvolvimento dos caracteres sexuais secundários de forma
a compreender as variações morfológicas que forem oriundas de
seleção sexual/seleção natural (ver Alencar et al., 2014). Já em um
estudo taxonômico, os landmarks selecionados sob o critério men-
cionado anteriormente poderão não representar de forma compre-
ensiva a distinção entre espécies e, por isso, uma nova configuração
de landmarks pode ser necessária. Neste caso apresentado, mon-
tar uma configuração de marcos anatômicos a partir das chaves de
identificação das espécies em avaliação e/ou representar de forma
generalizada a estrutura de interesse pode ser mais compreensivo
(Lane-MedeiroS et al., 2021). A escolha dos landmarks deverá ser
compreensiva ao objetivo de investigação, ao passo que deverá ser
também representativa da forma corporal para permitir uma ava-
liação mais ampla do que o evidente pela inspeção visual (Zelditch
et al., 2012) (Figura 6.3).
A escolha dos marcos anatômicos deverá seguir seis princi-
pais critérios: homologia anatômica (loci anatômico), representati-
vidade morfológica, repetibilidade, confiabilidade, impossibilidade
de troca de posição relativa entre landmarks e, exclusivamente no
caso de investigação em duas dimensões, landmarks devem ser dis-
postos no mesmo plano anatômico (para uma compreensiva revisão
sobre os critérios ver Zelditch et al., 2012).
Marcos anatômicos podem ser classificados em três catego-
rias (Bookstein, 1991). De acordo com a tipologia de landmarks

95 CAPÍTULO 6
proposta por Bookstein, landmarks do tipo I consistem em pontos
de localização aos quais podemos identificar o encontro de estru-
turas oriundas de várias direções (Bookstein, 1991; Zelditch et al.,
2012), como por exemplo, a justaposição de tecidos ósseos, à base
inserção das nadadeiras de um peixe, ou as comissuras (pontos
de junção) laterais ou transversais do dorso da carapaça de um
caranguejo (ver exemplos em Alencar et al., 2014; Lima-Filho et
al., 2017; Moraes A et al., 2021) (Figura 6.3). Landmarks do tipo
II consistem em pontos de localização aos quais não conseguimos
identificar pelo menos uma das direções (Bookstein, 1991; Zel-
ditch et al., 2012), como por exemplo as curvaturas máximas ou
mí�nimas de uma estrutura (espinhos, protuberâncias, cristas e
vale de ornamentos corporais; ver Moraes S et al., 2020; Lane-Me-
deiros et al., 2021) (Figura 6.3). Landmarks do tipo III não con-
sistem em landmarks reais e, por isso, geralmente são chamados
de Semilandmarks. O tipo III representa as variações corporais
extremas a partir de um ponto de referência (Bookstein 1991, Zel-
ditch et al., 2012), como por exemplo, a margem da carapaça de
um camarão, a margem de uma valva de um bivalve e pontos ao
longo da margem ventral e dorsal de um peixe (ver exemplo em
Lane-Medeiros et al., 2021; Moraes A et al., 2021) (Figura 6.3). O
conjunto de landmarks em um espécime é chamado de configura-
ção de landmarks (Zelditch et al., 2012).
Nas avaliações conduzidas e reportadas neste guia foram ava-
liadas estruturas corporais utilizando configurações de landmarks
de acordo com dois conceitos em relação a sua simetria corporal. O
primeiro é o conceito de objeto simétrico (Klingenberg et al., 2002;
Klingenberg, 2015), neste caso, simétrico bilateral. Estruturas ou
regiões corporais de interesse sob este conceito se referem aos
quais os marcos anatômicos são correspondentes em cada ‘lado’

96 CAPÍTULO 6
corporal e marcos anatômicos que delimitam a região (ou eixo)
compartilhado entre os ‘lados’. Em outras palavras, marcos anatô-
micos homólogos na sua respectiva simetria e marcos anatômicos
compartilhados por ambos os planos simétricos (Svriama e Klin-
genberg, 2011). Por exemplo, a região dorsal da carapaça de caran-
guejos e siris é uma estrutura que representa um objeto simétrico
(Figura 6.3a). Em cada ‘lado’, marcos anatômicos correspondentes
podem ser homologamente digitalizados em espinhos, curvatu-
ras, cristas e encontro de regiões teciduais e, no seu plano central,
é possí�vel indicar marcos anatômicos que representam o eixo de
compartilhamento entre os ‘lados’, como por exemplo encontros
teciduais, o vale central entre os espinhos submesiais e encontros
de comissuras transversais (ver exemplo em Alencar et al., 2014;
Lane-Medeiros et al., 2021).
Outras espécies poderão ter a estrutura de interesse avaliadas
considerando o conceito de simetria pareada (‘matching symmetry’,
ver detalhes em Klingenberg e Mcintre, 1998; Klingenberg, 2015).
Estruturas ou regiões corporais sob este conceito se referem a es-
truturas que são simétricas bilaterais, porém que não compartilham
o mesmo eixo entre os ‘lados’ na visualização adotada (na forma de
captura da imagem) (Figura 6.3b). Em outras palavras, simetria pa-
reada é relacionada aos pares de estruturas que apresentam imagens
espelhadas separadas fisicamente (Svriama e Klingenberg, 2011),
não apresentando um plano simétrico compartilhado. Por exemplo,
as estruturas corporais da lateral de um peixe são as mesmas no
outro lado do peixe, porém no campo de visualização lateral não é
possí�vel identificar os marcos anatômicos correspondentes e a vista
lateral oposta (ver exemplos em Molina et al., 2018; Moraes S et al.,
2020). Atente para o fato de que, neste caso, biologicamente, o peixe
tem um eixo compartilhado em relação a sua lateralidade (esquerdo

97 CAPÍTULO 6
e direito), mas não é possí�vel representar em uma visualização la-
teral em duas dimensões os dois ‘lados’, de forma conjunta (em um
mesmo plano de imagem). Logo, o conceito de objeto simétrico não
se aplica no exemplo da visualização lateral para organismos que têm
conspí�cua compressão lateral, como camarões e peixes (ver exemplo
em Moraes A et al., (2021); objeto simétrico e simetria pareada apli-
cados em um mesmo estudo em Molina et al., (2018).
Na investigação de Assimetria Flutuante é importante captu-
rar a imagem da lateral dos organismos bilaterais, tanto do lado
esquerdo, como do lado direito, já que esta técnica tem como prin-
cí�pio a observação das variações corporais aleatórias que ocorrem
em cada estrutura correspondente do seu plano simétrico. Tanto no
plano corporal analisado via conceitos de objeto simétrico, quanto
de simetria pareada, a escolha dos landmarks deverá levar em con-
sideração a representação da estrutura e a identificação dos marcos
anatômicos correspondentes em cada plano simétrico (Figura 6.3).
As configurações de landmarks de cada espécime podem ser
analisadas conjuntamente em uma investigação de morfometria
geométrica, sem prejuí�zo de perda da informação da forma corpo-
ral, em razão do princí�pio matemático proporcionado pela Supe-
rimposição de Procrustes.
De maneira resumida, a Superimposição de Procrustes é um
procedimento que não altera a forma do objeto de estudo, pois
usa três etapas que não interferem na variação da configuração
de landmarks (ou seja, não alteram a forma). A primeira etapa,
chamada de centralização, posiciona todas as configurações de
landmarks no ponto de origem do espaço cartesiano (coordena-
das X e Y como 0,0), unindo todas as configurações pelo seu cen-
tro de dispersão em relação aos landmarks (centróide). Para isso,
ele subtrai os valores das coordenadas X e Y de cada landmark a

98 CAPÍTULO 6
partir do valor respectivo de seu centróide. A segunda etapa, cha-
mada escalonamento, remove a informação de escala do objeto
realizando uma divisão entre os valores das coordenadas de cada
landmark pelo tamanho do centróide de cada configuração. Por
fim, a terceira etapa, chamada de rotação, elimina os efeitos de
translação das configurações de landmarks de forma a minimi-
zar a distância da soma dos quadrados das distâncias entre land-
marks correspondentes das configurações de landmarks (Montei-
ro e Reis 1999; Klingenberg et al., 2012; Zelditch et al., 2012). Em
sí�ntese, as informações de Forma, Formato e Tamanho resultantes
representam as configurações geométricas da estrutura corporal
de investigação, exceto as informações indesejadas de posição, es-
cala e orientação (Figura 6.3 - Ajuste de Procrustes).
Figura 6.3: Exemplo de configurações de marcos anatômicos

(landmarks) e ajuste da Superimposição Generalizada de Procrustes
nas representações de forma corporal seguindo os conceitos de (a)
objeto simétrico e (b) simetria pareada utilizando, respectivamente
como exemplo, a vista dorsal da carapaça e a vista lateral externa
do quelípodo de siris do gênero Callinectes Stimpson, 1860. Marcos
anatômicos do eixo compartilhados entre os lados preenchidos de
preto (para objeto simétrico). Marco anatômico do tipo I - círculo
vazado, Tipo II - círculo azul, Tipo III (Semilandmark) - círculo vermelho.
No ajuste de Procrustes à direita da imagem, círculos preenchidos
e nuvem de pontos dispersa ao longo de cada círculo preenchido
correspondem, respectivamente, a média da configuração de marcos
anatômicos e sua configuração residual.

99 CAPÍTULO 6
Assimetria Flutuante da Forma e análise
estatística
Na análise da forma assimétrica por morfometria geométri-
ca, três tipos de assimetria precisam ser levados em consideração,
cada um com sua interpretação biológica a partir das distribuições
das diferenças entre os antí�meros esquerdo e direito de uma estru-
tura morfológica bilateral. São elas: Antissimetria, Assimetria Dire-
cional e Assimetria Flutuante.
Em sí�ntese, Antissimetria é o resultado da inconsistência as-
simétrica populacional dos indiví�duos terem um perfil corporal
‘mais destro’ ou ‘mais sinistro’; Assimetria Direcional é a tendên-
cia de uma estrutura ter seu viés de desenvolvimento a um dos la-
dos (esquerdo ou direito); Assimetria flutuante consiste na iden-
tificação de desvios aleatórios, no fenótipo bilateral esperado, a
partir de perturbações genéticas e ambientais. Antissimetria e
Assimetria Direcional são desvios que ocorrem a partir de conjun-
tos genéticos, logo, a Assimetria flutuante é a variação assimétri-
ca que nos interessa como diagnóstico ambiental nos indiví�duos
(Llopis-Belenguer et al., 2015; Savriama e Gerber, 2018). Na prá-
tica, a Assimetria flutuante consiste na investigação da variação
bilateral interna ao indiví�duo, ou seja, as variações assimétricas
correspondentes entre os seus antí�meros.
Para a investigação de Assimetria Flutuante por Morfometria
geométrica deverá ser usado uma ANOVA Procrustes de dois fato-
res (Klingenberg, 2015), uma extensão da ANOVA de dois fatores
convencionais para dados de Forma (Klingenberg et al., 2002). A
ANOVA Procrustes apresenta três fatores de variação: o primeiro
corresponde aos efeitos principais de variação individual na Forma
(fator randômico), o segundo se refere aos efeitos de reflexão na

100 CAPÍTULO 6
média dos antí�meros (fator fixo que contabiliza a Assimetria Dire-
cional) e, por fim, o terceiro - que avalia a interação entre o fator
individual e a reflexão (Indiví�duos vs. ‘Lado’) - estimativa de Assi-
metria Flutuante (JOJIC et al., 2011).
As formas corporais, seja por objeto simétrico ou simetria pa-
reada, deverão ser digitalizadas através da captura de imagens por
dispositivo fotográfico. Todas as imagens de todos os espécimes
deverão ser capturadas utilizando uma câmera digital cujas carac-
terí�sticas deverão ser registradas (e.g. Canon G11 PowerShot 10.0
megapixels; resolução máxima 3648 x 2736 pixels), fixada e nive-
lada em estativo (e.g. AT674F), utilizando posição e distância do
objeto padronizada (e.g. 250 mm), a partir dos maiores espécimes
coletados na investigação de cada espécie. Não é recomendado o
uso de zoom óptico e digital para evitar distorção nas imagens. Para
todas as capturas de imagens, as estruturas corporais deverão ser
posicionadas no plano central (vertical e horizontal) do quadro de
imagem adotando todas as recomendações listadas anteriormente
(ver item Armazenamento, tratamento e padronização das amos-
tras para os procedimentos de Morfometria Geométrica). Além dis-
so, em todas as imagens deverá ser inserida uma régua graduada
em milí�metros para futuro escalonamento dos pixels em função do
tamanho em milí�metros.
O software tpsUtil (Rohlf, 2008) deverá ser utilizado para or-
denar as imagens capturadas de uma mesma estrutura corporal
em um mesmo arquivo no formato TPS. Em adição, o software tps-
Dig2 (Rohlf, 2006) deverá ser utilizado para digitalizar os marcos
anatômicos (landmarks) em cada imagem. Deverão ser definidos
landmarks baseados inteiramente nos conceitos de landmarks do
tipo I e II de acordo com Bookstein (1982, 1991). Semilandmarks
aproximados de landmarks verdadeiros poderão ser usados para

101 CAPÍTULO 6
representar regiões corporais que representam curvas homólogas
entre os espécimes (Gunz e Mitteroecker, 2013; Macleod, 2015; Mo-
raes A et al., 2021). Ainda de acordo com os autores mencionados
anteriormente, a estimativa de curvas homólogas deverá seguir o
procedimento de reamostragem por números iguais de semiland-
marks equidistantes.
As configurações de landmarks para cada estrutura corporal
deverão ser submetidas a uma Análise Generalizada de Superim-
posição de Procrustes (GPA) (Dryden e Mardia, 1998) com as fo-
tos originais e refletidas (para objeto simétrico) e com elementos
da esquerda e direita (para simetria pareada) (detalhes em Klin-
genberg et al., 2002; Zelditch et al., 2012). A análise Generalizada
de Procrustes é um procedimento que retira as informações não
relacionadas a variação da forma corporal devido a posição, escala
e rotação dos espécimes (Rohlf e Slice, 1990) gerando coordenadas
de Procrustes (Formato) e tamanho de centróide (Tamanho). Além
disso, nos casos de objeto simétrico, o ajuste gera dois componen-
tes de variação da forma: o componente simétrico e o assimétrico.
Considerando o objetivo de estudo envolver variações assimétricas
flutuantes na forma corporal da espécie, os procedimentos estatí�s-
ticos seguintes deverão ser realizados somente com o componente
assimétrico (detalhes em Klingenberg et al., 2002).
Nos casos de simetria pareada, os elementos dos antí�meros
esquerdo e direito deverão ser submetidos a uma ANOVA Procrus-
tes para cálculo dos valores individuais assimétricos. Em ambos os
casos, há a separação da variação entre as médias das configurações
de landmarks dos antí�meros/‘lados’ (variação entre indiví�duos) e
a diferença entre as configurações dos lados (variação interna aos
indiví�duos) (Klingenberg et al., 2002; Klingenberg, 2015; Savriama
e Gerber, 2018).

102 CAPÍTULO 6
Medida de erro ocorre em qualquer estudo biológico, seja
por origem natural dos dados, ou de acordo com os procedimentos
usados para captura dos dados (oriundos dos equipamentos e da
experiência pessoal de cada pesquisador). Entretanto, de acordo
com Graham et al. (2010), o erro de medição traz consequências
na investigação assimétrica, acentuando as variâncias e, isso pode
causar uma associação incorreta na distribuição da assimetria.
No estudo morfométrico geométrico, cada pesquisador adota
as funções de usuário do dispositivo de captura de imagem e de
digitalização dos marcos anatômicos. No caso das investigações
discutidas neste guia, um pesquisador deverá ser designado para
executar as atividades de captura de informações da forma corpo-
ral para uma dada espécie. E, em alguns casos, devido ao volume de
espécimes e logí�stica de execução, mais de um pesquisador poderá
analisar uma mesma espécie. Portanto, procedimentos prévios de
padronização da distância ao objeto para evitar distorções laterais
em relação ao dispositivo fotográfico, e separadamente, testes de
medida de erro de captura das fotos e posicionamento dos land-
marks deverão ser realizados (Alencar et al., 2014).
Para os testes de medida de erro, cada pesquisador deverá
realizar duas sequências de fotos em um mesmo conjunto de es-
pécimes, da espécie ao qual ficou designado. Cada sequência de
fotos deverá ser realizada em momentos distintos, promovendo
a ação de reposicionar o espécime em relação ao dispositivo de
imagem em ocasiões distintas (Medida de erro em relação ao po-
sicionamento do animal e captura da foto). Em seguida, cada foto
capturada nas sequências de fotos deverá ser duplicada no com-
putador. A duplicação da foto promove ao pesquisador a ação de
digitalizar os marcos anatômicos em momentos distintos a par-
tir da foto de cada sequência (Medida de erro na digitalização dos

103 CAPÍTULO 6
marcos anatômicos). Após esse processo, os dados de coordenadas
de Procrustes (dados de Formato oriundos dos marcos anatômi-
cos) deverão ser investigados através de uma análise de variância
de Procrustes (ANOVA Procrustes; Klingenberg e Mcintyre, 1998;
Klingenberg et al., 2002).
De acordo com Klingenberg (2015), uma importante função
da ANOVA Procrustes é permitir, de forma simples, a investigação
de possí�veis efeitos de medida de erro nas estimativas de assime-
tria flutuante pois, se as coordenadas de landmarks forem digita-
lizadas múltiplas vezes, o efeito residual da ANOVA Procrustes in-
dicará a variação existente entre as mensurações replicadas. Para
isso, deverá ser analisada de forma comparativa a variação média
dos quadrados (‘mean square’) nos fatores de teste de medida de
erro (Posicionamento do animal e digitalização de landmarks) em
relação a variação individual que contabiliza a assimetria flutuante
(interação individual vs. antí�mero/lado) e, em relação a um fator
externo (neste caso, variação geográfica entre populações). Ainda
de acordo com Klingenberg (2015), essa avaliação é possí�vel, em
sí�ntese, por dois fatores: (1) os cálculos algébricos do procedimen-
to de Superimposição de Procrustes são baseados nos pressupos-
tos do cálculo de desvios das somas dos quadrados (e portanto, po-
dendo ser diretamente comparados com os processos de cálculo da
soma dos quadrados de uma ANOVA convencional) e, (2) o cálculo
de variação da soma dos quadrados da ANOVA Procrustes é similar
ao cálculo da ANOVA convencional, com a distinção de que a dife-
rença dos quadrados das coordenadas de marcos anatômicos são
somadas as todas as coordenadas de todos os marcos anatômicos
(ver revisão em Klingenberg, 2015).
A média dos quadrados (‘mean square’) poderá ser obtida di-
retamente pela razão entre a soma dos quadrados (‘sum square’)

104 CAPÍTULO 6
de Procrustes pelo seu respectivo grau de liberdade no respectivo
efeito (Klingenberg, 2015). Valores de média dos quadrados meno-
res nos fatores de medida de erro em relação à variação individu-
al e fatores externos indicam relevante acurácia em cada etapa do
processo e a necessidade de apenas uma foto por espécime (Jojic et
al., 2011). Dessa forma, a magnitude de assimetria flutuante é maior
que a magnitude de erro de medida. Portanto, podemos considerar
que a quantidade de variação de medida de erro é suficientemente
menor de forma que ela pode ser negligenciável (Klingenberg, 2015).
Para as espécies que contaram com mais de um pesquisador reali-
zando a investigação, o mesmo procedimento deverá ser realizado
com os mesmos espécimes (Medida de erro entre pesquisadores). Na
comparação do valor de média dos quadrados entre pesquisadores, o
critério adotado anteriormente deverá ser compreendido como uma
fonte de variação incapaz, significativamente, de influenciar na inves-
tigação de variação da forma assimétrica flutuante.
Tamanho corporal poderá ser um componente relacionado ao
ní�vel de Assimetria flutuante em um organismo. Para avaliar esta
correlação, uma regressão multivariada (agrupada entre gênero
sexual e populações) das coordenadas de Procrustes (Formato) no
tamanho de centróide (Tamanho) deverão ser usadas para analisar
a variação de forma pelo efeito alométrico (Drake e Klingenberg,
2008). A porcentagem de predição alométrica na variação de for-
ma também deverá ser calculada como uma parte da porcentagem
da variação total da forma a qual o modelo de regressão contabili-
zou, computado por meio da métrica de Procrustes (Goodall 1991;
Klingenberg e Mcintyre, 1998). A significância estatí�stica das re-
gressões alométricas deverá ser testada por meio de um teste de
permutações contra a hipótese nula de independência alométrica
(Good, 2000).

105 CAPÍTULO 6
Por fim, valores de Assimetria Flutuante da forma (‘Shape FA
scores’), tamanho (tamanho do centróide) e valores de HPA (dire-
tos e relacionados) deverão ser analisados através de regressões
do tipo II (Warton et al., 2006). Superimposição de Procrustes,
ANOVA Procrustes e Regressão Multivariada Forma vs. Tamanho
será realizado através de procedimentos incorporados no sof-
tware MorphoJ (Klingenberg, 2011). Regressões entre Assimetria
Flutuante da forma e co-variáveis (valores de HPA) deverão ser
realizadas pelos procedimentos descritos em Warton et al. (2006)
pelo uso do pacote estatí�stico smatr (Warton et al., 2012) no sof-
tware R (R Core Team, 2014).

106 CAPÍTULO 6
CONSIDERAÇÕES
FINAIS
107
CONSIDERAÇÕES FINAIS
O
ambiente marinho envolve uma ampla gama de ecossis-
temas altamente complexos nos quais as flutuações na
abundância e diversidade de espécies são caracterí�sticas
de sua dinâmica. O ambiente marinho também apresenta a capa-
cidade de recuperação frente a perturbações causadas por fenô-
menos naturais, o que potencialmente pode ocorrer em casos de
derramamento e desastres com petróleo. No entanto, nos diferen-
tes acidentes com petróleo ocorridos pelo mundo, verifica-se sé-
ria falta de conhecimento básico sobre as condições prévias (ba-
seline) ambientais, socioeconômicas e de saúde da população, de
maneira que se possa comparar às condições pós acidente. Assim,
considera-se fundamental que sejam estabelecidos sistemas que
investiguem e monitorem as condições ambientais e socioeconô-
micas envolvidas, tanto para estabelecimento de baseline quanto
para avaliações após derramamentos.
Desastres com petróleo em áreas marinhas causam sérios
impactos, considerando os efeitos fí�sicos e quí�micos associados.
A intensidade dos danos pós evento depende diretamente do tipo
e quantidade de petróleo presente, da sensibilidade dos organis-
mos e ambientes afetados, das condições ambientais no perí�odo.
Há que se considerar ainda que, ao longo do tempo, as caracte-
rí�sticas do petróleo mudam e, portanto, os impactos associados

108 CONSIDERAÇÕES FINAIS
também, incluindo efeitos cumulativos em locais nos quais derra-
mamentos são frequentes.
Com relação à biodiversidade as pesquisas de monitoramen-
to devem considerar ampla gama de organismos analisados, ava-
liando o grau de contaminação e o caminho dos contaminantes na
cadeia trófica ao longo do tempo para cada ecossistema afetado. A
investigação deve considerar não apenas a presença de contami-
nantes externa ou internamente, mas seu desdobramento nos in-
diví�duos e populações ao longo do tempo. Dessa forma é possí�vel
compreender processos fisiológicos associados à contaminação,
a exemplo da pesquisa conduzida recentemente com lí�quidos bi-
liares de organismos marinhos da região onde ocorreu o acidente
no golfo do México (Pulster et al., 2021) há mais de 10 anos. Tais
pesquisas indicam, de maneira mais refinada, os impactos reais
experimentados pela biodiversidade.
Conhecer a origem do desastre também é fundamental, para
que se estabeleça rapidamente um plano de ação mais eficaz na
contingência, além do acionamento de ferramentas legais que pro-
í�bam e mitiguem eventos semelhantes que possam ocorrer. Após
investigações sobre o desastre na costa brasileira, a Polí�cia Federal
(PF) concluiu em dezembro de 2021 que o responsável foi um navio
petroleiro grego. O mesmo será indiciado pela prática dos crimes
de poluição, descumprimento de obrigação ambiental e dano a uni-
dades de conservação. Os custos arcados pelos poderes públicos fe-
deral, estadual e municipal para a limpeza de praias e oceano foram
estimados em mais de R$ 188 milhões, sendo este valor inicial e
mí�nimo para o dano ambiental causado (G1, 2021).
Apesar deste guia não tratar de protocolos de monitoramento
dos impactos do derramamento do petróleo na população, deve-se
ressaltar que o desastre de 2019 apresentou todas as caracterí�sticas

de impactos humanos em derramamento de petróleo sumarizados
por Sandifer e colaboradores (2021) no caso Deep Horizon no Golfo
do México: desde impactos psicológicos e de saúde fí�sica em ní�vel in-
dividual, passando pelos econômicos, considerado ní�vel misto indivi-
dual-comunitário, aos impactos sociais e culturais de toda coletivida-
de. O nordeste do Brasil é um destino turí�stico muito procurado por
brasileiros e estrangeiros e o desastre de petróleo em 2019 prejudi-
cou diretamente a visitação da região e o consumo de pescado. Além
dos impactos diretos na biota e nos ambientes costeiro-marinhos,
a queda de 50 % nas vendas de frutos do mar provocou impactos
sérios na geração de renda das comunidades pesqueiras, que já são
social e ambientalmente vulneráveis e tiveram sua subsistência, se-
gurança alimentar e modo de vida prejudicados (Estevo et al., 2021).
Cabe ainda ressaltar que o sistema de monitoramento neces-
sário para se conhecer as condições prévias e pós desastre deverá
considerar a padronização da execução das ações, incluindo o avan-
ço do conhecimento em diferentes áreas ligadas ao tema da conta-
minação por petróleo. Este guia surgiu justamente da necessidade
imediata de sistematizar diferentes procedimentos e protocolos de
monitoramento biológico e de sedimentos a serem compartilhados
entre diferentes equipes de pesquisa em múltiplos estados brasi-
leiros. Este foi um esforço conjunto para registrar e compreender a
magnitude do pior desastre envolvendo petróleo ocorrido em todo
Atlântico Sul. Espera-se que constitua uma ferramenta útil para
orientar a participação de novas equipes de pesquisa e, assim, tor-
nar mais ágil a resposta no estabelecimento do monitoramento e
coleta de dados em condições semelhantes ao ocorrido.

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ANEXOS
124
ANEXO 1 - Materiais e equipamentos necessários para
coleta da biota
Material de campo Justificativa
Caixas térmicas Acondicionamento e transporte de peixes e invertebrados
Sacos plásticos Acondicionamento e transporte de peixes e invertebrados
Potes plásticos Acondicionamento e transporte de peixes e invertebrados
Potes vidros Acondicionamento e transporte de peixes e invertebrados
Acondicionamento e transporte de amostras biológicas sem
Gelo em esfera reutilizável
formar agua de degelo
Paquímetro digital Biometria de peixes e invertebrados
Máscara N95 EPI
Reservatório de alumínio (tipo Acondicionamento de peixes e invertebrados para análise
alimentício) de HPA
Espátula de inox Manipulação de peixes e invertebrados para análise de HPA
Bandeja metálica (inox ou
Manipulação de peixes e invertebrados para análise de HPA
alumínio) tipo assadeira
Detergente Extran MA02
Esterilização de reservatórios e materiais em alumínio
Neutro - Merck
Luva nitrílica sem talco Manipulação de peixes e invertebrados para análise de HPA
Cabo bisturi (N 4) de inox Dissecação de peixes e invertebrados
Lâminas de bisturi (Caixa com
Dissecação de peixes e invertebrados
100 lâminas)
Tesoura cirúrgica (reta/fina) 17cm Dissecação de peixes e invertebrados
Pinça ponta fina Dissecação de peixes e invertebrados
Formol PA 1000 ml Fixação e preservação de amostras, peixes e invertebrados
Álcool absoluto 95 1000 ml Fixação e preservação de peixes e invertebrados
Xilol Análise histopatológica
Entelan Análise histopatológica
Corantes Histológicos Análise histopatológica
Parafina Análise histopatológica
Lâminas e Lamínulas Análise histopatológica
Papel vegetal Etiquetagem de indivíduos e amostras
Lacre plástico numerado Etiquetagem de indivíduos e amostras
Caneta nanquim Etiquetagem de indivíduos e amostras
Equipamento de Laboratório
Mufla Esterilização de reservatórios e materiais em alumínio
Estufa Esterilização de reservatórios e materiais em alumínio
Balança Biometria de peixes e invertebrados
Freezer Acondicionamento e transporte de peixes e invertebrados
Capela Preparação soluções
Micrótomo Análise histopatológica
Banho maria Análise histopatológica
Lâminas e lamínulas Análise histopatológica
Microscópio Análise histopatológica
Estereomicroscópio Análise histopatológica e macroscópica
Máquina fotográfica Digital Análise de assimetria flutuante

125 ANEXOS
ANEXO 2 - Organismos bioindicadores de
contaminação por petróleo
Organismos recomendados como bioindicadores de contami-

nação por petróleo, com exemplo de táxons utilizados nas avaliações
do Rio Grande do Norte. Os grupos mencionados genericamente
(sp.) apresentam sistemática indefinida (complexo de espécies ou
espécie nova). Algumas espécies têm importância alimentar para
as populações litorâneas, mas não apresentam importância econô-
mica (comercial) sendo indicada em cada táxon.
Nome popular: marisco

Nome científico: Anomalocardia flexuosa
(Linnaeus, 1767)
Dieta e hábitos: Filtradores / vivem em
estuários
Importância comercial: SIM
Importância alimentar: SIM
Foto: Mauro Lima
Nome popular: ostra

Nome científico: Crassostrea rhizophorae
(Guilding, 1828)
Dieta e hábitos: Filtradores suspensívoros –
vive em mangues
Foto: Mauro Lima
Nome popular: sururu

Nome científico: Mytella strigata
(Hanley, 1843)
Dieta e hábitos: Filtradores / vive em
mangues
Foto: Mauro Lima

126 ANEXOS
Nomes populares: camarão sete-barbas
Nomes científicos: Xiphopenaeus kroyeri
(Heller, 1862)
Dieta e hábitos: Matéria orgânica, quando
jovens alimentam-se de moluscos,
poliquetas e anfípodas – onívoros / marinhos,
vivem em fundos lamosos ou arenosos
Foto: Mauro Lima
Nomes populares: caranguejo-uçá

Nome científico: Ucides cordatus
(Linnaeus, 1763)
Dieta e hábitos: Peixes, frutas, pequenos
moluscos e crustáceos – onívoros / vivem
sobre o biofilme nos mangues
Foto: Mauro Lima
Nome popular: curimã, tainha

Nome científico: Mugil curema
(Valenciennes, 1836)
Dieta e hábitos: Detritos e algas
filamentosas – detritívoros, iliófagos /
vivem em estuários e mar
Foto: Mauro Lima
Nome popular: bagre

Nome científico: Sciades herzbergii
(Bloch, 1794) (foto prancha), Cathorops
spixii (Agassiz, 1829)
Dieta e hábitos: Pequenos peixes,
crustáceos, poliquetas, detritos e algas
filamentosas – onívoro generalista / vivem
em praias arenosas e estuários
Importância comercial: NÃO
Foto: Mauro Lima

127 ANEXOS
Nome popular: sardinha cascuda
Nome científico: Harengula sp.
(Valenciennes, 1847)
Dieta e hábitos: plâncton, pequenos
crustáceos – plantófagos / vivem em praias,
mangues e estuários, ilhas e recifes
Foto: Alfredo Carvalho Filho em
https://www.fishbase.se/search.php
Nome popular: ariocó, vermelho

Nome científico: Lutjanus synagris
(Linnaeus, 1758)
Dieta e hábitos: peixes e invertebrados
bentônicos – carnívoros / vivem em recifes
Foto: Mauro Lima
Nome popular: budião

Nomes científicos: Sparisoma axillare
(Steindachner, 1878) (foto prancha), S.
frondosum (Agassiz, 1831), S. amplum
(Ranzani, 1841)
Dieta e hábitos: Algas e invertebrados
bentônicos – herbívoros, onívoros / vivem
em recifes
Foto: Mauro Lima
Nome popular: xira-branca

Nome científico: Haemulon aurolineatum
(Cuvier, 1830)
Dieta e hábitos: Invertebrados bentônicos,
peixes e algumas algas – invertívoros /
vive em recifes, alimentação noturna
Importância alimentar: NÃO
Foto: Mauro Lima
Nome popular: piraúna

Nome científico: Epinephelus adscensionis
(Osbeck, 1756)
Dieta e hábitos: Peixes, cefalópodes e
crustáceos – carnívoros / vivem em recifes
Foto: NOAA\NMFS\Mississippi Laboratory

128 ANEXOS
maturação
Estágio de
ANEXO 3 - Protocolo de coleta
e processamento das amostras
Sexo
biológicas e de sedimento
(cm)
ct
Dados necessários para regis-
tro das amostras (biota e sedimen-
(cm)
cz
to) por ordem de código (cód.), data
Ambientes costeiros
e hora, respectivas coordenadas ge-
de origem
ográficas (latitude e longitude - lat
e long) preferencialmente padroni-
zadas para o sistema UTM e datum
Preservação
SIRGAS 2000 com zona especí�fica de
trabalho (e.g. litoral oriental do RN
utiliza-se a zona 25M). Para amos-
Análise
tras biológicas: identificação precisa

das espécies utilizadas e as destina-
n
ção para o tipo de análise como será

preservado o material (freezer, álco-
Espécie
ol ou formol) e dados especí�ficos do

exemplar como tamanhos (peixes
Hora
- cz = comprimento zoológico e ct
= comprimento total), sexo e está-
Data
dio de maturação gonadal de peixes

segundo Vazzoler (1996) ou outra
Long
referência especí�fica para o grupo

Lat
taxonômico trabalhado.
Local
Cód.

129 ANEXOS
ANEXO 4 - Modelo de declaração para envio
aéreo de amostras biológicas

130 ANEXOS
ANEXO 5 - Escala Bernet et al. (1999)

131 ANEXOS
132 ANEXOS
133

Guia - Protocolos Contaminação Petróleo UFRN

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Autores: Liana de Figueiredo Mendes1, Marina Gomes Viana1, Mauro Sergio Pinheiro Lima1,

Projeto Gráfico: Terceirize projetos gráficos e editoriais

Fotos da capa: Mauro Sérgio Pinheiro Lima, Liana de Figueiredo Mendes

Revisão ABNT: Rúbia Kátia Azevedo Montenegro

Catalogação da Publicação na Fonte.

133 p.: il.

1. Meio ambiente – Contaminação - Petróleo. 2. Poluição marinha – Petróleo. 3.

CONSIDERAÇÕES FINAIS............................................................ 108

No iní�cio de setembro de 2019 manchas de petróleo cru che-

Figura 1.1: Mapa dos pontos de encalhe de petróleo em 2019

Guia para Avaliação de Contaminação por

Guia para Avaliação de Contaminação por

Principais hidrocarbonetos de petróleo

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Figura 1.3: Cromatograma GCxGC-FID-2D (a) e cromatograma

Seguindo o que é reportado na literatura e atestado no cro-

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Guia para Avaliação de Contaminação por

O material encalhado na costa brasileira apresentou hidro-

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Figura 1.5: Pesca artesanal com tarrafa em estuário no

Outros aspectos do impacto nas comunidades litorâneas refe-

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A vegetação peculiar dos mangues com raí�zes aéreas (pneuma-

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Além dos peixes, as regiões estuarinas são ricas e abundantes em

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Tais caracterí�sticas reforçam a necessidade de estudos apro-

Figura 1.12: Recifes de Pirangi com alta cobertura de esponjas.

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Investigação de espécies com diferentes hábitos alimentares

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Figura 1.14: Fundo de rodolitos (algas calcárias) na praia de Pirangi do

Destaca-se a ocorrência do habitat conhecido como restinga

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4 Para maiores informações, acesse: http://www.ibama.gov.br/emergencias-ambientais/petroleo-e-

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Figura 2.1: Registros públicos da presença do petróleo no litoral do Rio

Guia para Avaliação de Contaminação por

Figura 2.3: Mapa com registro de encalhe de petróleo no litoral

Guia para Avaliação de Contaminação por

Guia para Avaliação de Contaminação por

As espátulas e colheres deverão chegar em campo envolvi-

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Guia para Avaliação de Contaminação por

Procedimento de coleta das amostras

• PLANEJAMENTO DA COLETA DE PESCADOS:

Guia para Avaliação de Contaminação por

Figura 2.6: Peixes e invertebrados obtidos por meio de pesca e catação.

Guia para Avaliação de Contaminação por

• COLETA DE AMOSTRAS BIOLÓGICAS

Guia para Avaliação de Contaminação por

No caso da coleta ativa tem-se controle dos procedimentos

Guia para Avaliação de Contaminação por

Figura 2.8. Coleta de sedimento para análise de HPA 1 ano após o