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Teriogenologia 92 (2017) 149e155

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Teriogenologia
página inicial da revista: www.theriojournal.com

Um método otimizado para armazenamento criogênico de esperma de

Xenopus para maximizar a eficácia da pesquisa usando rãs geneticamente alteradas
Ester Pérola a, Sean Morrow b
, Anna Nobre
b
, Adelaide Lerebours
c
, Marko Horb
a
,
*
Mateus Guille b, c,
a
Recurso Nacional Xenopus, 7 MBL Street, Woods Hole, MA, 02543, EUA b
Centro Europeu de Recursos Xenopus, Instituto de Ciências Biomédicas e Biomoleculares, Universidade de Portsmouth, Portsmouth, PO1 2DT, Reino Unido
c
Escola de Ciências Biológicas, Universidade de Portsmouth, Portsmouth, PO1 2DY, Reino Unido

informações do artigo abstrato

Historia do artigo: O armazenamento criogénico de esperma de Xenopus geneticamente alterado melhora a relação custo-eficácia e o bem-
Recebido em 5 de julho de 2016 estar animal associados à sua utilização em investigação; atualmente é rotina para X. tropicalis, mas não confiável para
Recebido em formato revisado
X. laevis. Aqui comparamos diretamente os três protocolos publicados para congelamento-descongelamento de
26 de outubro de 2016
espermatozóides de Xenopus e determinamos se a temperatura de armazenamento do esperma, o método de maceração
Aceito em 4 de janeiro de 2017
dos testículos e atrasos nos protocolos de congelamento afetam a fertilização bem-sucedida e o desenvolvimento do
Disponível on-line em 17 de janeiro de 2017
embrião em X. laevis. Concluímos que o protocolo é robusto e que a variabilidade observada nas taxas de fertilização se
deve a diferenças entre os indivíduos. Mostramos que os embriões produzidos a partir do esperma congelado e
Palavras-chave:
Xenopo
descongelado são normais e que os adultos em que se desenvolvem são reprodutivamente indistinguíveis de outros na
Esperma colónia. Isto abre o caminho para a utilização de esperma criopreservado para distribuir linhas dominantes geneticamente
Criopreservação alteradas (GA), potencialmente poupando o stress induzido pela viagem aos sapos machos, reduzindo o seu número
Centros de estoque utilizado e tornando as experiências com Xenopus mais rentáveis.
Linhas geneticamente alteradas © 2017 Os Autores. Publicado pela Elsevier Inc. Este é um artigo de acesso aberto sob a licença CC BY (http://
3Rs
creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

1. Introdução
O armazenamento criogénico de células germinativas ou embriões de organismos
modelo vertebrados geneticamente alterados tem um papel fundamental para tornar a
utilização destes modelos rentável e eficiente. Também melhora o bem-estar animal,
reduzindo o número de animais mantidos em centros de armazenamento e laboratórios
[1e3]. Para os anfíbios, que estão sob grande ameaça na natureza [4e7], o armazenamento
criogênico também pode ter um papel na preservação da diversidade genética de
espécies ameaçadas [8].
As rãs com garras das espécies Xenopus laevis e Xenopus tropicalis são
indiscutivelmente os organismos modelo vertebrados mais versáteis; eles são amplamente
utilizados para biologia celular básica e de desenvolvimento [9] e, mais recentemente,
para o estudo de doenças genéticas humanas [10,11].
Juntamente com os métodos tradicionais usados em Xenopus, por exemplo: explantes
[12e15], knockdowns de morfos [16e20], extratos bioquímicos [21e24] e telas de ganho
ou perda de função [25], linhas geneticamente alteradas têm sido feitas há 20 anos
[26e29] .
* Autor correspondente. Centro Europeu de Recursos Xenopus, Instituto de Ciências Biomédicas e
Biomoleculares, Universidade de Portsmouth, Portsmouth, PO1 2DT, Reino Unido.
Estas incluem não apenas linhas transgênicas, mas também aquelas produzidas a partir
de triagens de mutação direta [30,31] e, mais recentemente, por edição do genoma
[32e38]. Embora a maior parte do uso de Xenopus como organismo modelo genético
tradicional tenha sido confinado ao sapo diplóide e de geração curta, Xenopus tropicalis,
a edição genética é tão eficiente que pode ser aplicada com sucesso ao alotetraplóide
Xenopus laevis [37e40], que por razões de robustez e história são mais amplamente
utilizadas.
Ambas as espécies modelo de Xenopus têm a vantagem de vidas reprodutivamente
ativas muito longas, estendendo-se por mais de uma década [41], portanto, não é
essencial manter as linhagens congeladas para evitar a deriva genética geracional [42].
No entanto, manter um grande número de linhagens de Xenopus é dispendioso devido
aos requisitos de espaço e criação e indesejável devido ao custo para o bem-estar
animal de manter um número de rãs em cativeiro durante períodos muito longos. Nos
centros de armazenamento europeus e norte-americanos mantemos mais de 200 linhas
transgénicas e ainda mais mutantes, que são duplicadas em cada centro para garantir a
sua segurança [43]; esses números estão aumentando significativamente à medida que
as primeiras linhagens editadas por genes começam a chegar. Por estas razões, os
centros de recursos têm armazenado esperma criogenicamente e, embora isto tenha
sido bem sucedido para X. tropicalis, os resultados com X. laevis têm sido muito mais
inconsistentes e actualmente não corremos o risco de armazenar o X. laevis.

Endereço de e-mail: matthew.guille@port.ac.uk (M. Guille).

http://dx.doi.org/10.1016/j.theriogenology.2017.01.007 0093-691X/© 2017

Os Autores. Publicado pela Elsevier Inc. Este é um artigo de acesso aberto sob a licença CC BY (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).
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150 E. Pearl et al. / Teriogenologia 92 (2017) 149e155
linhas criogenicamente. Estudos recentes sobre danos aos espermatozóides durante
a criopreservação [44] mostraram que amostras de X. laevis sofrem muito mais
danos à membrana plasmática do que aquelas de X. tropicalis e esta é uma razão
provável para a diferença.
Existem três métodos principais para criopreservação de espermatozóides de
Xenopus: Sargent e Mohun [45], Mansour et al. [46] e o do site do laboratório Harland
[47]. O método de Mansour e colaboradores utilizou solução salina inibidora da
motilidade como crioprotetor e congelamento em vapor de nitrogênio líquido; Sargent
e Mohun usaram um crioprotetor à base de sacarose e gema de ovo e congelamento
em banho de etanol com gelo seco e o método do laboratório Harland novamente
usou um crioprotetor à base de sacarose e gema de ovo, mas com congelamento
lento em uma caixa de isopor colocada em um freezer a 80C . O objetivo deste
estudo foi comparar esses métodos usando os mesmos espermatozóides e óvulos,
uma vez que a qualidade destes pode influenciar enormemente os resultados, e então
testar o efeito de uma série de parâmetros na capacidade de fertilização do esperma
congelado-descongelado. Finalmente, usamos esses dados para desenvolver um
método robusto que pode ser adotado por toda a comunidade de pesquisa do Xenopus.
2. Materiais e métodos
2.1. Manutenção de sapos
Todo o trabalho envolvendo animais foi aprovado pela AWERB ou IACUC local,
conforme apropriado, e no Reino Unido foi realizado de acordo com a legislação
relevante do Ministério do Interior. X. laevis adultos, não consanguíneos, foram
mantidos a 18°C em água recirculada com uma troca diária de 10%.
Eles foram alimentados pelo menos duas vezes ao dia com pellets de truta com alto
teor de proteína Horizon XP. Os ovos foram produzidos conforme descrito na Ref.
[48]. Resumidamente, isto implica uma injeção de 500-800U de Gonadotrofina
Coriônica Humana (HCG) em uma rã fêmea sexualmente madura na noite anterior à
necessidade dos ovos. No dia seguinte, a rã fêmea recebe uma massagem suave no
abdômen para incentivá-la a botar ovos. X. tropicalis nigerianos adultos e não
consanguíneos foram mantidos de forma semelhante, mas a 24,5°C.
Os experimentos de criopreservação de espermatozoides foram realizados em X.
tropicalis usando o método Harland, e em X. laevis usando os métodos Sar-gent e
Mohun, Mansour e Harland (veja abaixo detalhes de cada método).
2.2. Masceração e homogeneização dos testículos
Testículos frescos dos mesmos machos que foram criopreservados foram
armazenados para uso como controles a 4C em 1 solução salina de Barth modificada
(MBS: NaCl 88 mM, CaCl2 0,41 mM, MgSO4 0,82 mM, HEPES 10 mM, Ca(NO3)2
0,41 mM , 2,4 mM de NaHCO3); não encontramos nenhuma evidência de que esse
armazenamento por até uma semana, que é padrão na maioria dos laboratórios de
Xenopus, tenha alterado os resultados da fertilização. Foram utilizados dois métodos
diferentes de dissociação de testículos. A homogeneização foi realizada esmagando
os testículos em um tubo de microcentrífuga com pilão de plástico (método EXRC). A
mascaração dos testículos foi realizada rasgando-os com dois pares de pinças
(método NXR).
O efeito do método de dissociação testicular na taxa de fertilização foi
testado. Após a dissociação dos testículos, a amostra não é purificada e, portanto,
contém outros tipos de células além de espermatozoides, mas a amostra dissociada
é chamada de esperma. Para passar rapidamente dos testículos dissociados para o
processo de congelamento, a concentração de espermatozóides em cada amostra
não foi quantificada.
2.3. Método de criopreservação de esperma Sargent e Mohun
Este método foi publicado em 2005 [45]. Cada testículo foi mastigado rasgando-
o com uma pinça em 500 mL L15 gelado com glutaMAX, a solução crioprotetora
gelada foi adicionada e a solução resultante foi dividida uniformemente entre 4
criotubos. Diferente
em Sargent e Mohun [45], as amostras foram congeladas em criotubos para permitir
o armazenamento em nitrogênio líquido (número de catálogo científico dos EUA
1405e9302). O procedimento de congelamento utilizado foi o aparelho improvisado
mencionado por Sargent e Mohun [45]. Esta consistia em uma caixa plástica com um
porta-tubos preenchido com 300 mL de etanol e uma barra de agitação magnética,
colocada dentro de uma caixa maior contendo gelo seco e etanol, que foi montada
em uma placa de agitação e deixada atingir temperatura constante. A temperatura
diminuiu 30°C em 3 min.
Após 10 min no suporte de tubos na caixa central, as amostras foram transferidas
para o freezer a 80°C ou para um Dewar de nitrogênio líquido para armazenamento.
O descongelamento foi realizado de forma diferente do método publicado (veja a
seção do método de descongelamento de esperma abaixo), que foi descongelado a
30°C por <10s.
2.4. Método de criopreservação de esperma de Mansour
Este método foi publicado em 2009 [46]. O crioprotetor utilizado foi o soro
fisiológico inibidor da motilidade (MIS), o mais eficaz dos testados por Mansour et al.
[46], consistindo em NaCl 150 mM, KCl 3 mM, Mg2SO4 1 mM, CaCl2 1 mM e Tris 20
mM pH 8 com 5% de DMSO e sacarose 73 mM. Cada testículo foi macerado rasgando-
o com uma pinça em 500 mL de MIS gelado, e o macerado resultante foi dividido
igualmente entre 4 criotubos. As amostras foram congeladas em criotubos por 10 min
suspensos 10 cm acima da superfície do nitrogênio líquido, utilizando um rack
improvisado feito de clipes de papel dobrados. A temperatura diminuiu 60°C em 3
min. As amostras foram então transferidas para o freezer a 80°C ou para um Dewar
de nitrogênio líquido para armazenamento. O descongelamento foi realizado de forma
diferente do método publicado (veja a seção do método de descongelamento de
espermatozoides abaixo), que ocorreu em temperatura ambiente por 40s.
2.5. Método de criopreservação de esperma Harland
O método Harland utiliza um crioprotetor semelhante ao método Sargent, a
principal diferença é que possui metade da concentração de NaHCO3 e sacarose do
crioprotetor. Cada testículo foi mascerado rasgando-o com uma pinça em 500 mL L15
gelado com glutamina, a solução crioprotetora gelada foi adicionada e a solução
resultante foi dividida uniformemente entre 4 criotubos. As amostras foram congeladas
colocando alíquotas em suportes de tubos em uma caixa de isopor em temperatura
ambiente, que foi então colocada no freezer a 80°C. Após 24 horas a 80°C, os
espermatozoides foram armazenados em racks a 80°C ou transferidos para um Dewar
de nitrogênio líquido. O descongelamento foi realizado de forma diferente do método
publicado (consulte a seção do método de descongelamento de esperma abaixo).
2.6. Método de descongelamento de esperma
Os óvulos foram extraídos de rãs fêmeas por meio de massagem suave antes de descongelar
os espermatozoides. Os óvulos foram extraídos antes do descongelamento dos espermatozoides,
uma vez que os espermatozoides móveis ativados têm uma “meia-vida de motilidade” de 2 minutos [49].
Na prática, o descongelamento do esperma armazenado em 80°C ou em nitrogênio
líquido demorou mais do que qualquer protocolo publicado sugeria. Todo o
descongelamento dos espermatozoides, independentemente do método de
congelamento, envolveu 40 segundos em banho-maria a 37°C. Dois a três volumes
de Ringers Modificados de Marc 0,1: NaCl 0,1 M, KCl 2 mM, MgSO4 1 mM, CaCl2 2
mM, HEPES 5 mM pH 7,5, EDTA 0,1 mM (MMR) foram adicionados ao esperma
assim que cerca de metade do o esperma congelado havia descongelado. Isto foi
então pipetado para cima e para baixo suavemente usando uma pipeta de transferência descartável
O esperma foi então aplicado aos óvulos imediatamente, todo o gelo desapareceu da
solução; um mínimo de 50 ovos foram usados para cada amostra.
2.7. Cultura de embriões
As taxas de fertilização foram avaliadas em NF3 (4 células), embriões que
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haviam dividido foram contados como fertilizados. Os embriões foram cultivados a embriões anormais foram coletados em NF32 (estágio 32 de Nieuwkoop e Faber)
18°C em placas de Petri de 90 mm em 0,1 MMR contendo gentamicina (50 mg/ (50).
ml) a uma densidade de 100 embriões ou menos por placa. Os embriões foram
transferidos para placas de petri limpas com 0,1 MMR fresco todos os dias.
O número de embriões vivos foi contado diariamente, assim como o número de 2.8. Hibridização in situ de montagem completa
embriões anormais. Os embriões que se desviaram das imagens mostradas na
tabela normal de desenvolvimento de Xenopus foram classificados como anormais. Todas as sondas foram obtidas do acervo do EXRC e do
Fotografias representativas de normal e O método seguido foi o de Broadbent e Read [51].

A 100

80

60

Percentagem
40
% fertilizada
20 % normal em NF32
0
ocserf

ocserf

ocserf

ocserf

ocserf

ocserf

ocserf

ocserf

ocserf
sadalegnoc

sadalegnoc

sadalegnoc

sadalegnoc

sadalegnoc

sadalegnoc

sadalegnoc

sadalegnoc

sadalegnoc
ABCDE FGH I

B 100
90
80
70
60
50
40
Percentagem

% fertilizada
30
20 % normal em NF32
10
0
ocserf

ocserf

ocserf

ocserf

ocserf

ocserf

ocserf

ocserf

ocserf

ocserf
sadalegnoc

sadalegnoc

sadalegnoc

sadalegnoc

sadalegnoc

sadalegnoc

sadalegnoc

sadalegnoc

sadalegnoc

sadalegnoc

ABCDE FGH I J.

100
** ***
90
80
70
60
50
fresco
40
congeladas
30
20
10
0
X. laevis X. tropicalis X. laevis X. tropicalis

% fertilizada % normal em NF32

Figura 1. A preservação criogênica do esperma de X. laevis é menos eficaz e consistente do que a do esperma de X. tropicalis. Testes dos indivíduos X. tropicalis (A) e X . laevis (B) eram
foram utilizados frescos ou congelados e descongelados pelo método Harland para fertilizar ovos de uma única fêmea de conhecida boa qualidade. AI no eixo X refere-se a amostras de esperma,
cada uma de um homem diferente. O experimento foi repetido usando três rãs fêmeas, para eliminar isso como uma possível fonte de variabilidade, são mostrados dados de uma única fêmea.
Os ovos que se dividiram foram contados como fertilizados e os embriões morfologicamente normais foram contados em NF32. C) Os valores médios dos experimentos acima são mostrados
para X. laevis e X. tropicalis ± SEM. Há um efeito significativo da espécie na percentagem de fertilização (**: p ¼ 0,002) e na percentagem de embriões normais em NF32 (***: p ¼ 0,0003), quer
tenha sido utilizado esperma fresco ou congelado.
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2.9. análise estatística normalmente em NF32 (Fig. 1C).

Todos os experimentos utilizaram um mínimo de 3 réplicas para espermatozoides e 2
para óvulos, mais de 50 embriões foram utilizados como réplicas biológicas.
As análises estatísticas foram realizadas usando R 3.0 [52]. Os efeitos da espécie, método
(Mansour, Harland e Sargent), tempo, técnica (homogeneização ou masceração), atraso
pós-descongelamento, atraso na maceração, divisão dos testículos e crioarmazenamento
na % de fertilidade, % de desenvolvimento normal e % de sobrevivência para NF32 foram
testados usando modelos lineares (anova.lm). A normalidade dos resíduos foi verificada
por meio do teste de normalidade de Shapiro-Wilk. Os dados foram transformados em
Arcsin quando necessário. As diferenças entre os 3 métodos de criopreservação na% de
fertilização foram avaliadas usando o método de contraste [53] com a função Esticon em
R (pacote DoBy) [54].
3. Resultados
3.1. A criopreservação de espermatozoides é bem-sucedida em X. tropicalis,
mas inconsistente em X. laevis
Para comparar a recuperação de espermatozoides congelados para X. laevis e X.
tropicalis, nós os testamos sistematicamente. Um testículo não mascerado de cada sapo
macho foi armazenado a 4°C em 1 MBS e o outro criopreservado como 4 alíquotas usando
o método laboratorial Harland e armazenado a 80°C. Após armazenamento por 2 dias, as
amostras de esperma descongeladas e resfriadas equivalentes a 0,25 testículos foram
usadas para fertilizar uma única ninhada de ovos que foi colocada em duas placas de
Petri separadas. As taxas de fertilização e o desenvolvimento bem-sucedido até o estágio
de cauda foram registrados. Para X. tropicalis, todas as amostras de esperma,
independentemente de serem frescas ou congeladas, produziram taxas de fertilização
mais altas (p = 0,002) e números de embriões NF32 normais (p = 0,0003) do que para X.
laevis com a taxa de menor sucesso. sendo 5% (1/9; o restante foi >15%) e média de
38% (fig. 1A, C). A situação em X. laevis, no entanto, foi muito diferente, com uma
proporção significativa de amostras de esperma congeladas (3/10) não conseguindo
produzir embriões suficientes que se desenvolvessem para NF32 para recuperar uma
linhagem (Fig. 1B). No geral, a pior recuperação do esperma de X. laevis foi refletida por
uma média de 16% dos embriões em desenvolvimento
* fresco ou congelado (Fig. 3D). Esses metamorfos foram então autorizados a crescer até a
3.2. Os métodos Harland ou Mansour são os mais bem-sucedidos para a recuperação
de espermatozoides viáveis após armazenamento de longo prazo em nitrogênio
líquido.
Como descobrimos que os espermatozoides de X. laevis congelados e descongelados
preparados pelo método Harland eram inconsistentes na produção de embriões,
comparamos os três métodos atuais de criopreservação.
Testes de 9 machos foram mantidos refrigerados ou congelados em nitrogênio líquido, três
para cada método. A sua capacidade de fertilizar duas ninhadas mistas de ovos foi testada
tanto fresca como após 2 dias de criopreservação para garantir que o macho era fértil e
que o procedimento de criopreservação tinha sido bem sucedido. Amostras criopreservadas
foram então recuperadas após 3 e 13 meses, novamente sua capacidade de fertilizar
ninhadas de ovos de 2 fêmeas foi testada. Não houve diferença entre os métodos de
criopreservação de Harland e Mansour (p = 0,82), com taxas médias de fertilização de 80
a 90% alcançadas e nenhum efeito do tempo de criopreservação para todos os métodos (p
= 0,13). O método Sargent foi significativamente menos eficaz que o método Harland (p =
0,04) e o método Mansour (p = 0,03), com apenas 60% dos embriões fertilizados (fig. 2).
Após 13 meses, o método Harland forneceu as maiores taxas médias de fertilização (Fig.
2) e adotamos isso para os experimentos seguintes, uma vez que requer equipamento
menos especializado que o método Mansour e não há diferença significativa na sua
eficácia.
3.3. X. laevis derivado de esperma congelado desenvolve-se normalmente
Para que a criopreservação seja usada rotineiramente, é essencial que o esperma
recuperado possa produzir descendentes que se desenvolvam normalmente e possam,
por sua vez, procriar. Portanto, testamos se os embriões produzidos com espermatozóides
descongelados e congelados por 3 meses usando cada um dos três métodos tinham
fenótipos normais em NF32. Todos os métodos produziram mais de 90% de embriões
fenotipicamente normais em NF32 (a porcentagem mostrada é de embriões sobreviventes
não originais, óvulos fertilizados; Fig. 3A e B). Também testamos se um conjunto restrito
de genes marcadores para somitos, precursores hepáticos, sangue e músculo cardíaco
era normalmente expresso em embriões derivados de esperma congelado (Fig. 3C); eles
foram expressos normalmente. Finalmente, cultivamos embriões até a metamorfose (NF59)
e os pesamos para testar se havia um efeito de longo prazo da criopreservação no sucesso
do desenvolvimento; não houve diferença entre as massas de metamorfos de esperma

100
* idade adulta e usados junto com outros Xenopus no EXRC para a produção rotineira de
embriões em um experimento cego; não houve diferença observada entre o uso desses
90
adultos (n = 18) e quaisquer outros em termos de sucesso reprodutivo, mesmo quando
80 foram utilizados pares com ambas as rãs derivadas de esperma congelado.

70

60
Fresco
Ferlização

50
2 dias
40 3 meses
13 meses 3.4. O armazenamento em nitrogênio líquido ou a 80°C é igualmente eficaz para a
30
criopreservação de espermatozoides de X. laevis
20

10 Em seguida, tentamos otimizar o procedimento de criopreservação de Harland. A

0 primeira variável que testamos foi o efeito das condições de armazenamento nas taxas de
Mansour Harland Sargento fertilização com esperma criopreservado. Alíquotas de amostras de esperma idênticas
Método de criopreservação
preparadas de três rãs usando o método Harland foram armazenadas em nitrogênio líquido
ou a 80°C. As amostras foram testadas frescas e depois de 2 dias de criopreservação para
Figura 2. Os métodos de Mansour e Harland são os mais eficazes para a criopreservação
a longo prazo do esperma de X. laevis. O esperma de três sapos machos separados foi garantir que os espermatozoides estavam inicialmente ativos e que a criopreservação foi
testado fresco em óvulos de duas fêmeas de boa qualidade conhecida ou foi testado bem-sucedida. A sua atividade foi então comparada após 12 e 24 semanas. Não houve
após criopreservação pelos métodos mostrados. Os espermatozoides foram recuperados efeito do método (p ¼ 0,08) e do tempo de criopreservação (p ¼ 0,45) na porcentagem de
após 2 dias, 3 meses ou 13 meses e as taxas de fertilização foram registradas. Médias ±
fertilização (fig. 4).
SEM são mostradas. Não há diferença significativa entre os métodos de Mansour e
Harland (p ¼ 0,82). Há diferença significativa entre os métodos Harland e Sargent (*: p ¼
0,04) e entre os métodos Mansour e Sargent (*: p ¼ 0,03).
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E. Pearl et al. / Teriogenologia 92 (2017) 149e155 153

Figura 3. Embriões de esperma congelado desenvolvem-se normalmente. A) Os óvulos foram fertilizados utilizando esperma congelado pelos métodos mostrados e armazenados em LN2 durante 3 meses, o número
de embriões normais e anormais foi pontuado em NF32, as percentagens de embriões normais são expressas como uma % dos embriões sobreviventes em NF32. Médias ± SEM são mostradas. B) Exemplo de
embriões normais, à esquerda, e anormais, à direita, fertilizados com espermatozóides criopreservados. C) Os embriões produzidos utilizando esperma fresco ou congelado (método Harland) foram fixados em NF32 e
12 de cada analisados quanto à expressão dos marcadores mostrados pela hibridização in situ. D) Uma vez que os embriões se desenvolveram até a metamorfose, eles foram pesados. Médias ± SEM são mostradas.

3.5. O método de maceração não afeta a atividade dos espermatozoides congelados
e descongelados
Em seguida, testamos se os métodos de maceração afetavam as taxas de fertilização
que poderiam ser alcançadas usando as amostras de esperma criopreservadas produzidas.
Comparamos a homogeneização dos testículos em um tubo de microcentrífuga com um pilão
de plástico (método EXRC) ou a separação dos testículos com dois pares de pinças (método
NXR) (Fig. S1).
A escolha da técnica de maceração não teve efeito na taxa de fertilização (p = 0,86) ou no
desenvolvimento normal para NF32 (p = 0,34).
em rãs, um testículo foi macerado e congelado em 4 alíquotas de 250 mL e o outro foi
congelado em 8 alíquotas de 125 mL. Após 13 meses de armazenamento em nitrogênio
líquido, estes foram descongelados e utilizados para fertilizar ovos de 2 fêmeas diferentes
(Fig. S2). O fato de um testículo ter sido dividido em 4 ou 8 não afetou o sucesso da
fertilização (p = 0,12), sugerindo que estamos usando um excesso de espermatozoides
mesmo quando dividimos um testículo em 8.
3.7. Atrasos no congelamento e descongelamento não afetam as taxas de fertilização

Testamos se um atraso, seja entre a maceração dos testículos e o congelamento, ou

3.6. A divisão dos espermatozoides em 8, em vez de 4, alíquotas para
criopreservação não inibe as taxas de fertilização ou o desenvolvimento subsequente
Artigos anteriores descreveram a divisão de cada testículo em 4e5 amostras (Sargent e
Mohun) ou 8 (Mansour et al.), então testamos diretamente se isso tinha algum efeito na
atividade espermática. Para cada um dos 3
entre o descongelamento dos espermatozoides e sua adição aos óvulos, influenciava as
taxas de fertilização e o desenvolvimento normal, conforme avaliado no NF32 (Fig. S3 ) .
Atrasos de até 20 minutos antes do congelamento não tiveram efeito na fertilização (p = 0,18)
ou na sobrevivência dos embriões ao NF32 (p = 0,95). Atrasos de até 20 minutos entre o
descongelamento do esperma e sua adição aos óvulos não tiveram efeito na fertilização (p =
0,06) ou na sobrevivência dos embriões ao NF32 (p = 0,56). Finalmente, mantivemos
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154 E. Pearl et al. / Teriogenologia 92 (2017) 149e155
100
90
80
70
Controle Fresco 2 dias
60 nitrogênio líquido 2 dias
nitrogênio líquido 12 semanas
Percentual
50 nitrogênio líquido 24 semanas
-80 2 dias
40 -80 12 semanas
-80 24 semanas
30
20
10
0
Figura 4. Não há diferença na atividade espermática entre espermatozoides criopreservados
armazenados em nitrogênio líquido e espermatozoides criopreservados armazenados a
-80°C. Os óvulos foram fertilizados com esperma congelado pelo método Harland e
armazenados em LN2 ou a 80°C por 2 dias, 12 semanas ou 24 semanas. Médias ± SEM são
mostradas. O método de armazenamento não afeta a fertilidade (p = 0,08), nem o tempo armazenadouma
testículos macerados em 1 ou 0,1 MBS por até 20 minutos antes da fertilização para testar
se a ativação prolongada afetou a atividade espermática (Fig. S4). Não houve efeito
significativo na taxa de fertilização (p = 0,88) ou na sobrevivência normal ao NF32 (p = 0,18).
4. Discussão
A recuperação do esperma de X. laevis da criopreservação é inconsistente. Aqui
mostramos que isso não se deve a pequenas diferenças na replicação técnica. Testámos
os parâmetros que podem ser alterados, deliberada ou acidentalmente, no método de
congelamento e descongelamento e mostramos que a sua variação não tem qualquer efeito
significativo nas taxas de fertilização ou na sobrevivência de espécies normais.
embriões para NF32. Tendo eliminado estas razões técnicas como subjacentes à
variabilidade observada, concluímos que a variação se deve em grande parte a diferenças
entre animais individuais; um exemplo pode ser visto na Fig. S1 , onde uma fração
incomumente pequena de embriões se desenvolve normalmente para NF32. Isto está bem
documentado em outras espécies [55,56]. Durante o curso deste estudo, indivíduos que
forneceram amostras de esperma tão pobres que não poderíamos garantir a recuperação
de linhagens GA Xenopus laevis da criopreservação pararam de ocorrer; propomos que isto
se deve ao aumento da saúde das nossas colónias.
Um resultado inesperado, de que deixar os espermatozoides por 20 minutos em
temperatura ambiente não afetou as taxas de fertilização, mesmo quando a incubação foi
em 0,1 MBS (isto é, esperma ativado), sugere que os espermatozoides de X. laevis retêm a
capacidade de fertilizar sob condições ideais, mesmo quando eles apresentam danos
significativos à membrana plasmática e ao DNA [44]. A falta de efeito de ativação no estado
dos espermatozoides congelados e descongelados está de acordo com Morrow et al. [44].
Os adultos derivados de espermatozóides de X. laevis congelados e descongelados
são indistinguíveis em termos de produção de embriões de outros numa grande colónia de
reprodução e isto pode dar à comunidade confiança para armazenar linhas GA X. laevis
como esperma congelado. O método detalhado de criopreservação de esperma é fornecido
na Tabela Suplementar 1 e também estará disponível como um documento ativo
constantemente atualizado com quaisquer melhorias no EXRC (https://xenopusresource.org/ )
e NXR (http://www.mbl.edu/xenopus/) sites. O estudo aqui publicado deixa claro que o
método é muito robusto e
que nenhuma etapa é, por exemplo, crítica em termos de tempo. Isto, aliado ao facto de os
espermatozoides poderem ser armazenados durante longos períodos a 80ºC, facilidade a
que qualquer laboratório terá acesso, significa que este método pode ser amplamente
adoptado.
Isto tem implicações importantes para a comunidade de investigação do Xenopus;
para linhagens transgênicas dominantes, será possível enviar alíquotas de esperma
congelado, em vez de machos vivos, para laboratórios que necessitam dessa linhagem.
Como podem ser retiradas 16 alíquotas de esperma de cada macho, será possível para um
laboratório que utilize uma linha regularmente não manter os animais, mas manter vários
equivalentes masculinos de esperma como alíquotas no congelador. Isto reduzirá os custos
para os utilizadores de Xenopus, reduzirá o número de machos necessários (muitas vezes
um macho transgénico é morto para produzir espermatozóides para uma ou duas
experiências devido à instabilidade do esperma dentro dos testículos dissecados, em vez
de 16 experiências) e diminuirá o estresse da viagem ao qual os homens podem estar
expostos. Juntos, estes são uma contribuição significativa para os 3Rs [57].
Reconhecimentos
Somos muito gratos a Colin Sharpe por sugerir melhorias no manuscrito. SM foi
apoiado por uma bolsa NERC CASE (NE/018867/1). O EXRC é apoiado pelo Wellcome
Trust (101480/Z), BBSRC (BB/K019988/1) e NC3Rs (NC/P001009/1). O NXR é apoiado por
(p =doação
0,45). do NIH (P40 OD010997).
Apêndice A. Dados suplementares
Dados suplementares relacionados a este artigo podem ser encontrados em http://
dx.doi.org/10.1016/j.theriogenology.2017.01.007 .
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