Estudo Dirigido - Análise de Águas e Fluentes

1- Sabendo que o biofilme microbiano é um complexo ecossistema

altamente dinâmico, responda:
a)sua composição;
Biofilme microbiano é um complexo ecossistema microbiano, altamente
dinâ mico que atua de maneira coordenada, aderidas as superfícies bió ticas e/ou
abió ticas (sésseis) ou suspensas em soluçã o (planctô nicas), cujas células podem
ou nã o estar envolvidas por uma matriz de exopolímeros (polissacarídeos,
proteínas, lipídeos), podendo ser formada a partir de uma ú nica ou de mú ltiplas
espécies .
Biofilmes microbianos sã o produzidos por culturas puras de bactérias e por
consó rcios de microrganismos, que podem incluir fungos, protozoá rios e algas.

b)em quais locais há sua formação;

É reconhecida atualmente a multiplicidade de situaçõ es em que os biofilmes
ocorrem. Em camadas de solos e ambientes aquá ticos eles ocorrem
naturalmente. Nos ambientes urbanos, podem estar presentes em sistema de
tubulaçõ es de á gua e esgoto, reservató rios de á gua e edificaçõ es. Basicamente,
em qualquer ambiente que combine a presença de líquido + superfície +
microrganismos, a presença de biofilmes pode ocorrer.
Há também a formaçã o de biofilmes em dispositivos médicos diretamente
ligados ao paciente, até a presença dos mesmos em má quinas ou tubulaçõ es em
contato indireto com o indivíduo. Entre os dispositivos médicos mais afetados
pela ocorrência de biofilmes, temos as pró teses (ortopédicas, cardíacas,
vasculares) e os cateteres (vasculares, uriná rios ou de sistema nervoso).
Os biofilmes podem também produzir variedade de implicaçõ es nosoló gicas no
ser humano e, algumas delas sã o independentes da presença de dispositivos
médicos. Como exemplo, temos a formaçã o de placa bacteriana nos dentes, a
formaçã o de fibrose cística no pulmã o, e a prostatite nas vias uriná rias. Nestes
casos, a superfície de formaçã o dos biofilmes sã o as pró prias estruturas
corporais.

c) objetivo de sua formação;

Os biofilmes possibilitam a criaçã o de microambientes e nichos na ausência de
um ambiente físico estruturado e propiciam melhor condiçã o de sobrevivência
nos ambientes naturais. Protegem contra flutuaçõ es de pH, radiaçã o ultravioleta,
concentraçã o de sais, desidrataçã o, predadores, fagocitose, biocidas e
antimicrobianos. Aumentam a possibilidade de trocas de material genético entre
seus componentes e facilitam o estabelecimento de microconsó rcios,
possibilitando a utilizaçã o de substratos de difícil degradaçã o. Também
aumentam a quantidade de nutrientes disponíveis, através da deposiçã o e
concentraçã o desses na matriz polimérica.
Biofilmes têm sido extensivamente estudados pelo seu papel no ciclo de
nutrientes e controle de poluentes em ambientes aquá ticos, além dos efeitos
benéficos ou prejudiciais à saú de humana.
d)explique a formação dos biofilmes;
A formaçã o do biofilme é afetada pelas características da superfície, pela
cobertura polimérica da á gua, pela presença de materiais particulados, pela
qualidade e concentraçã o de nutrientes do meio circundante e pelas
características da bactéria e do fluido, se houver.
• 1- Formaçã o de filme condicionado – adsorçã o de substâ ncias orgâ nicas a
uma superfície só lida e colonizaçã o inicial por um ú nico tipo bacteriano.
• 2- Associaçã o transiente do microrganismo com a superfície ou com
outros microrganismos. Produçã o de EPS (proteínas, carboidratos e
polissacarídeos) e biosurfactantes. Apêndices externos, como adesinas e
pillus tipo III, facilitam a associaçã o.
• 3- Associaçã o está vel – adesã o firme dos microrganismos à superfície.
Reduçã o da motilidade desses através da inibiçã o do gene da flagelina.
Síntese de exopolissacarídeos e desenvolvimento de camadas compostas
por diferentes microrganismos.
• 4- Maturaçã o – formaçã o e estruturaçã o de microcolô nias. Formaçã o de
poros intersticiais e canais. Síntese de mais exopolissacarídeos. Ocorrem
interaçõ es metabó licas e genéticas entre os microrganismos.
• 5- Dispersã o: expansiva- ocorre a liberaçã o de células do interior das
colô nias apó s a morte celular, ou pela degradaçã o da matriz por liases e a
restauraçã o da motilidade dos microrganismos.

e)quais gêneros mais presentes;

Alcaligenes, Bacillus, Enterobacter, Flavobacterium, Pseudomonas e
Staphylococcus sã o gêneros de bactérias frequentemente encontrados em
biofilmes.

f)fisiologia dos biofilmes;

A formaçã o do biofilme é afetada pelas características da superfície, pela
cobertura polimérica da á gua, pela presença de materiais particulados, pela
qualidade e concentraçã o de nutrientes do meio circundante e pelas
características da bactéria e do fluido, se houver.
Biofilmes microbianos possuem a característica de realizar a biodegradaçã o,
realizando a biocorrosã o de superfícies metá licas e em especial encanamentos e
a biodegradaçã o de rochas, pedras e construçõ es.

g)classificação e metabolismo.
#CLASSIFICAÇÃO:
Os biofilmes podem ser classificados, quanto sua origem, de duas maneiras:
naturais ou sintéticos.
Os naturais sã o formados a partir da aglomeraçã o de microrganismos que estã o
dispostos em uma superfície coberta por á gua e unidos devido à secreçã o de uma
substâ ncia viscosa, como exemplo o limbo. Quando estas superfícies estã o em
contato direto com a á gua e expostas à radiaçã o solar, acarretam aos
microrganismos características que os classificam como fototró ficos ou
fotossintetizante, ou seja, organismos capazes de converter luz em ATP, energia
eletromagnética (luz) em ATP necessá rio para seu desenvolvimento.
Já os sintéticos, sã o feitos a partir de polissacarídeos, como por exemplo, amido
e pectina; ou proteínas, como glú ten e gelatina.
#METABOLISMO:
Os biofilmes mais comuns na natureza sã o heterogêneos, compostos por duas ou
mais espécies, podendo os produtos do metabolismo de uma espécie auxiliar o
crescimento das outras e a adesã o de uma dada espécie fornecer ligantes que
promovem a ligaçã o de outras. Inversamente, a competiçã o pelos nutrientes e a
acumulaçã o de metabó litos tó xicos produzidos pelas espécies colonizadoras
poderã o limitar a diversidade de espécies num biofilme

2- Como podemos classificar as bactérias quanto a sua análise laboratorial?

As bactéricas sã o classificadas quanto à :
Classificação fenotípica;
Inclui características morfoló gicas, coloraçã o; estruturais; nutritivas;
metabó licas; sensibilidade a antibió ticos.
Essa classificaçã o envolve as características das morfologias microscó pica e
macroscó pica das bactérias, sendo a na atualidade, a ferramenta fundamental
para a identificaçã o desse microrganismo.
As bactérias podem ser classificadas por serem capazes de reter o corante GRAM
(Gram-positivas ou gram-negativas) e pela forma dos organismos individuais
(cocos, bacilos, vibriõ es e espirilos). O aspecto macroscó pico das colô nias
bacterianas também pode ser utilizado para a identificaçã o (propriedades
hemolítica em á gar-sangue, pigmentaçã o, tamanho e forma das colô nias). Por
exemplo: Streptococcus pyogenes é uma bactéria gram-positiva que se apresenta
em longas cadeias de cocos e forma colô nias pequenas, brancas, hemolíticas no
á gar-sangue.
Devido essas características macroscó picas e microscó picas serem muito
semelhantes, por isso utilizam-se métodos de classificaçã o mais discriminativos.
Classificaçã o Fenotípicas das Bactérias:
• Morfologia microscó pica
• Morfologia macroscó pica
• Biotipagem
• Sorotipagem
• Padrõ es do antibiograma
• Fagotipagem

- Classificação analítica;
O padrã o cromatográ fico dos componentes dos á cidos micó licos da parede
celular é típico de muitas espécies de micobactérias e vem sendo utilizado para
identificar as espécies mais comumente isoladas. A aná lise dos lipídios totais da
célula também tem provado ser um método ú til para caracterizaçã o de muitas
espécies bacterianas, bem como leveduras. Aná lise das proteínas totais da célula
e enzimas celulares sã o também técnicas que têm sido utilizadas para
caracterizar as bactérias, mais especificamente em nível de subespécies, para
investigaçõ es epidemioló gicas. Embora esses métodos analíticos sejam precisos,
sua execuçã o é trabalhosa, e a instrumentaçã o é de alto custo, sendo realizadas
em laborató rios de referência.
Classificaçã o Analítica das Bactérias:
• Aná lise dos á cidos graxos da parede celular
• Aná lise dos lipídios totais da célula (Maldi-Tof)
• Aná lise das proteínas totais da célula
• Aná lise das enzimas celulares

- Classificação genotípica.
Tem o objetivo de determinar o grau de parentesco entre as moléculas de
DNA das amostras em classificaçã o.
É o método mais preciso de classificaçã o das bactérias. Analisa o material
genético bacteriano.
Esse método envolve:
• Relaçã o entre guanina e citosina;
Métodos mais discriminativos:
• Hibridizaçã o do DNA : relaciona as bactérias isoladas (para determinar se
as espécies isoladas pertencem ao mesmo gênero ou espécie).
Atualmente, é uma técnica empregada com a utilizaçã o de sondas
moleculares espécie-específicas. O DNA isolado do microrganismo é
submetida à sonda. Se ocorrer a ligaçã o, ocorre a identificaçã o do
microrganismo. Ferramenta rá pida, sem a utilizaçã o de cultura de
microrganismos. Importante na identificaçã o de micobactérias e fungos.

Classificaçã o Genotípica das Bactérias:

• Aná lise plasmidial
• Ribotipagem
• Aná lise de fragmentos de DNA cromossomial

3- Determine as metodologias abaixo quanto ao nível de classificação:

a)biotipagem;
Classificaçã o fenotípica.

b)sorotipagem;
Classificaçã o fenotípica.

c)análise dos ácidos graxos da membrana celular (fame);

Classificaçã o analítica.

d)antibiograma;
Classificaçã o fenotípica.
Antibiograma – padrõ es de suscetibilidade a diferentes antibió ticos. Exame feito
apó s o isolamento e a cultura de determinado germe, para verificar quais os
antibió ticos ativos contra ele.

e)ribotipagem;
Classificaçã o genotípica.
O método de ribotipagem por PCR utiliza sequências iniciadoras,
complementares à s sequências conservadas dos genes que codificam as
subunidades 16S e 23S do rRNA, para diferenciar estirpes de bactérias com base
nos polimorfismos da regiã o espaçadora intergénica 16S-23S do operã o do RNA
ribossó mico.

f)fagotipagem;
Classificaçã o fenotípica.
Fagotipagem – suscetibilidade a vírus que infectam bactéria – bacterió fagos,
sendo uma técnica complexa e atualmente tem sido substituída por técnicas
genéticas mais sensíveis.
É um teste para determinar a qual fago (vírus) uma bactéria é suscetível.

g)Maldi-Tof;
Classificaçã o analítica.

h)semeadura e meio de cultura sólido.

Classificaçã o fenotípica.

4- Diferencie inóculo, semeadura, e colônia.

Inóculo sã o os microrganismos introduzidos em um meio de cultura. Os
microrganismos que crescem dentro ou sobre um meio de cultura sã o
denominados de cultura.
Colônia é massa visível de células bacterianas teoricamente originada do
crescimento uma ú nica célula.
A técnica de Semeadura é o método pelo qual se transfere inó culos bacterianos
de um meio de cultura ou material a ser analisado (secreçõ es, alimentos) para
um outro meio de cultura.

5- Explique a técnica de biotipagem.

É uma técnica para determinar se um grupo de microorganismos de um mesmo
género e espécie provém de uma fonte comum ou de fontes distintas.
Utilizam-se marcadores bioquímicos específicos, como por exemplo, a
capacidade de fermentar carboidratos específicos ou a utilizaçã o de diferentes
compostos, como fonte de carbono para o crescimento; presença de protease,
lipases ou nucleases específicas e presença de aminopeptidases. Essas técnicas
sã o referidas como biotipagem.

6- Explique a técnica de sorotipagem.

Técnica para determinar grupo de microrganismos inter-relacionados,
caracterizados por antígenos em comum.
Muitas bactérias possuem antígenos que sã o característicos, e os anticorpos
utilizados para identificar esses antígenos sã o poderosas ferramentas para a sua
identificaçã o, sendo essas técnicas referidas como sorotipagem.
Geralmente, essas técnicas sã o utilizadas para identificar microrganismos que
sã o inertes nos testes bioquímicos, por exemplo, a Escherichia coli sorotipo O157,
responsá vel pela colite hemorrá gica.
7- Explique a importância das técnicas de semeadura por estriação simples
e por esgotamento.
Esgotamento: obter colô nias isoladas, o que permite distinguir os diferentes
micro-organismos em um material ou cultura polimicrobiana através da sua
morfologia colonial.
Estriação: obter o crescimento do micro-organismo no meio de cultura afim de
estocar a bactéria; estudar seu metabolismo em uma prova “bioquímica”; avaliar
sua capacidade de crescimento ou nã o no meio de cultura.

8- Explique a importância da técnica de Fame (ácidos graxos).

Técnica para a determinaçã o e aná lise de á cidos graxos que fazem parte da
parede cellular das bactérias. Caracterizaçã o dos tipos e proporçõ es de á cidos
graxos, presentes nos lipídios de membrana citoplasmá tica e da membrana
externa em bactérias Gram – .
Diferenças relacionadas ao comprimento da cadeia, (10 a 20 C) presença de
insaturaçã o, anéis, cadeias ramificadas ou grupos hidroxilas.

9- Explique a importância das técnicas genotípicas para a classificação

microbiana.
Esse método tem sido importante para a nomenclatura taxonô mica, de modo a
diferenciar os microrganismos em diferentes categorias.

10- Explique a importância da técnica de Maldi-Tof.

A técnica da MALDI-TOF consiste na deposiçã o de uma determinada amostra em
uma matriz capaz de fornecer pró tons (ou H+) para o processo de ionizaçã o dos
componentes da amostra.
MALDI-TOF tem sido utilizada com sucesso na investigaçã o e identificaçã o de
proteínas e peptídeos, na identificaçã o taxonô mica de microorganismos, na
genotipagem e aná lise de polimorfismos no DNA, na investigaçã o de
modificaçõ es pó s-transcricionais no RNA, dentre inú meras outras aplicaçõ es.

11- Explique as etapas da técnica de Maldi-Tof.

A amostra é misturada com uma matriz sobre uma placa de metal condutora.
Depois da cristalizaçã o da matriz junto com a amostra, a placa metá lica é
introduzida no espectrô metro de massas, onde é bombardeada com breves
pulsos de laser. As moléculas dessorvidas e ionizadas sã o aceleradas por meio de
um campo elétrico e entram em um tubo metá lico submetido a vá cuo (tubo de
vô o, por onde as moléculas passam) até atingirem o detector. Os íons com
tamanho menor (m/z) viajam mais rapidamente pelo tubo de vô o do que os de
tamanho maior. Como uma pessoa gorda e uma magra correndo duzentos
metros, chega primeiro quem for mais leve e mais rá pido. Desse modo, os
analitos ou substâ ncias das amostras, separados por TOF formam espectros de
massa (como a impressã o digital dos seres humanos, cada um tem uma
diferente) de acordo com sua razã o m/z (massa/carga) e com picos que indicam
quantidades variá veis de cada substâ ncia analisada (analito). Para a identificaçã o
dos analitos, cada pico é comparado com um banco de dados, arquivo contendo
todas as impressõ es digitais das moléculas.
12- Explique as vantagens da técnica de Maldi-Tof.
Por se tratar de uma técnica de alta sensibilidade e de alto rendimento (uma
amostra pode ser analisada em poucos minutos), novas abordagens vêm sendo
desenvolvidas para atender a necessidade de diagnó sticos rá pidos e precisos
para diversas doenças.