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Macrófagos derivados de monócitos orquestram múltiplas interações

de tipos celulares para reparar lesões hepáticas necróticas em modelos de doen

Dechun Feng,…, George Kunos, Bin Gao

J Clin Invest. 2023;133(15):e166954. https://doi.org/10.1172/JCI166954.

Artigo de Pesquisa Gastroenterologia Hepatologia

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O Jornal de Investigação Clínica ARTIGO DE PESQUISA

Macrófagos derivados de monócitos orquestram múltiplas

interações de tipos celulares para reparar lesões hepáticas
necróticas em modelos de doenças
Dechun Feng,1 Xiaogang Xiang,1 Yukun Guan,1 Adrien Guillot,1,2 Hongkun Lu,1 Chingwen Chang,3,4 Yong He,1 Hua Wang,1
Hongna Pan,1 Cynthia Ju,5 Sean P. Colgan,6 Frank Tacke,2 Xin Wei Wang,3,4 George Kunos,7 e Bin Gao1
1
Laboratório de Doenças Hepáticas, Instituto Nacional de Abuso de Álcool e Alcoolismo (NIAAA), NIH, Bethesda, Maryland, EUA. 2 Departamento de Hepatologia e Gastroenterologia, Charité Universitätsmedizin Laboratório de
3
Berlim, Berlim, Alemanha. Carcinogênese Humana e 4 Programa de Câncer de Fígado, Centro de Pesquisa do Câncer, Instituto Nacional do Câncer, NIH, Bethesda, Maryland, EUA. 5 Departamento de

Anestesiologia, Cuidados Intensivos e Medicina da Dor, McGovern Medical School, University of Texas Health Science Center em Houston, Houston, Texas, EUA. 6 Departamento de Medicina, Faculdade de Medicina,

Campus Médico Anschutz da Universidade do Colorado, Aurora, Colorado, EUA. 7 Laboratório de Estudos Fisiológicos, NIAAA, NIH, Bethesda, Maryland, EUA.

O fígado pode regenerar-se completamente após a ressecção parcial e os seus mecanismos subjacentes têm sido extensivamente estudados.
O fígado também pode regenerar-se rapidamente após uma lesão, com a maioria dos estudos focando na proliferação de hepatócitos;
entretanto, a forma como as lesões necróticas hepáticas durante doenças hepáticas agudas ou crônicas são eliminadas e reparadas
permanece obscura. Aqui, demonstramos que macrófagos derivados de monócitos (MoMFs) foram rapidamente recrutados e
encapsulados em áreas necróticas durante lesão hepática imunomediada e que esse recurso foi essencial no reparo de lesões necróticas.
No estágio inicial da lesão, a infiltração de MoMFs ativou o eixo Jagged1/notch homolog protein 2 (JAG1/NOTCH2) para induzir a morte celular –
hepatócitos resistentes do fator de transcrição SRY-box 9+ (SOX9+ ) próximos às lesões necróticas, que atuaram como uma barreira
contra lesões adicionais. Posteriormente, o ambiente necrótico (hipóxia e células mortas) induziu um agrupamento de MoMFs positivos
para complemento 1q (C1q+ ) que promoveram a remoção necrótica e o reparo do fígado, enquanto os MoMFs Pdgfb+ ativaram células
estreladas hepáticas (HSCs) para expressar ÿ-actina do músculo liso e induzir um forte sinal de contração (YAP, pMLC) para espremer e
finalmente eliminar as lesões necróticas. Em conclusão, os MoMFs desempenham um papel fundamental na reparação das lesões
necróticas, não apenas pela remoção de tecidos necróticos, mas também pela indução de hepatócitos resistentes à morte celular para
formar uma cápsula perinecrótica e pela ativação de HSCs que expressam actina do músculo liso ÿ para facilitar a lesão necrótica. resolução.

Introdução os hepatócitos adjacentes às lesões necróticas estão protegidos de novas lesões?

O fígado tem uma forte capacidade de regeneração após perda ou lesão tecidual. Como as células mortas e os detritos são removidos das lesões necróticas? Como
A hepatectomia parcial de dois terços (HPx) em roedores tem sido amplamente as lesões necróticas são eliminadas? Fazer

utilizada como modelo para estudar os mecanismos de regeneração do fígado (1).
Estudos utilizando o modelo PHx identificaram um grande número de fatores de
crescimento e citocinas e seus sinais a jusante que promovem a proliferação de
hepatócitos (1–3). A regeneração hepática também foi estudada em uma ampla
variedade de modelos de lesão hepática aguda associados a lesões necróticas
hepáticas (2–5), que não são observadas no modelo PHx. Além disso, lesões
necróticas hepáticas são frequentemente observadas em doenças hepáticas
humanas, como hepatite viral, doença hepática associada ao álcool, doença
hepática gordurosa não alcoólica, doença hepática autoimune e lesão hepática
induzida por drogas (4, 5). Embora as lesões necróticas do fígado tenham sido
caracterizadas há quase 8 décadas (6), a forma como são eliminadas e reparadas
permanece em grande parte desconhecida. Por exemplo, como
Nota de autoria: DF e XX contribuíram igualmente para este trabalho.
Conflito de interesses: Os autores declararam que não existe conflito de interesses.
Direitos autorais: © 2023, Feng et al. Este é um artigo de acesso aberto publicado sob os termos
da Licença Internacional Creative Commons Atribuição 4.0.
Enviado: 28 de novembro de 2022; Aceito: 15 de junho de 2023; Publicado: 1º de agosto de 2023.
Informações de referência: J Clin Invest. 2023;133(15):e166954.
https://doi.org/10.1172/JCI166954.
hepatócitos ou células progenitoras do fígado (LPCs) migram dentro das lesões
necróticas para reparar as lesões?
A inflamação desempenha papéis importantes não apenas na contribuição
para a lesão hepática, mas também na promoção do reparo e resolução da fibrose
(3). Assim, no presente estudo, utilizamos um modelo bem estabelecido de lesão
hepática aguda imunomediada induzida por conca-navalina A (ConA) (7) para
estudar a resolução de lesões necróticas e seu reparo por células inflamatórias. A
injeção de ConA, um mitógeno de células T, ativa rapidamente as células T e
subsequentemente ativa outros tipos de células imunológicas (células NKT,
neutrófilos, células de Kupffer) que liberam uma variedade de citocinas pró-
inflamatórias (TNF-ÿ, IFN-ÿ, IL- 4, IL-5, etc.), causando necrose hepática que se
manifesta em lesões necróticas maciças (8, 9). Após a injeção de uma dose não
letal de ConA, ocorre necrose hepática substancial, que é rapidamente resolvida
em poucos dias. A proliferação maciça de hepatócitos é observada e provavelmente
desempenha um papel importante na reparação do fígado no modelo ConA (10).
No entanto, a forma como as lesões necróticas são resolvidas neste modelo
permanece desconhecida. Para começar a responder a esta questão, realizamos
coloração de imunofluorescência multiplex usando uma variedade de marcadores
de células imunes e marcadores de células não parenquimatosas, que revelaram
que macrófagos derivados de monócitos

1
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ARTIGO DE PESQUISA O Jornal de Investigação Clínica

2 J Clin Invest. 2023;133(15):e166954 https://doi.org/10.1172/JCI166954

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O Jornal de Investigação Clínica
Figura 1. MoMFs e aHSCs são os principais tipos de células que
encapsulam lesões necróticas após lesão hepática induzida por ConA.
Camundongos C57BL/6 foram tratados com 12 mg/kg de ConA. Amostras de fígado
foram coletadas 24, 48, 72 e 96 horas após o tratamento com ConA. (A) Secções de
fígado foram coradas com anticorpo CD45 e H&E. Imagens representativas são mostradas (n doi.org/10.1172/JCI166954DS1)
= 5). (B e C)
A coloração imunofluorescente multiplex de vários marcadores celulares foi
realizada em cortes de fígado com lesões necróticas. Imagens representativas são
mostradas em B (n = 5). A quantificação do número de cada tipo de célula identificado
nas áreas fronteiriças (indicadas por linhas tracejadas) das regiões necróticas é
mostrada em C. O número e a porcentagem de cada tipo de células são representados
como médias ± DP (n = 5). N, área necrótica.
(MoMFs) são o principal tipo de célula que circunda a área necrótica
durante a resolução da necrose hepática. O papel dos MoMFs na reparação
de lesões necróticas do fígado foi investigado através do estabelecimento
de subconjuntos de MoMFs com base em seus perfis únicos de expressão
gênica, conforme revelado pelo sequenciamento unicelular.
O fígado normal contém um grande número de macrófagos residentes
chamados células de Kupffer e um número muito menor de MoMFs infiltrantes.
A infiltração intra-hepática significativa de MoMFs ocorre em quase todos os
modelos de lesão hepática através da interação entre o ligante 2 de quimiocina
com motivo CC (CCL2) e seu receptor, CCR2 (11). Tanto as células de Kupffer
quanto os MoMFs infiltrantes foram caracterizados não apenas como células
pró-inflamatórias, mas também como tendo um papel fundamental na reparação
tecidual, dependendo do estágio da lesão e do processo de recuperação (11–
13). Por exemplo, a depleção de macrófagos hepáticos antes da injeção de
paracetamol (APAP) ou a inibição do recrutamento de MoMF logo após o APAP
reduziu a lesão hepática induzida por APAP, enquanto a depleção de
macrófagos após a injeção de APAP acelerou a lesão hepática (14–16). Da
mesma forma, a depleção de macrófagos hepáticos antes da injeção de ConA
diminuiu a lesão hepática induzida por ConA (17), enquanto sua depleção
após a injeção de ConA exacerbou a lesão hepática, como demonstrado no
presente estudo. O bloqueio do recrutamento de MoMF também exacerbou
acentuadamente a lesão hepática induzida por ConA (18, 19). Considerando
que a maioria dos estudos anteriores se concentrou nas funções
imunorreguladoras e fagocíticas de MoMFs infiltrados na lesão e reparo
hepático, aqui demonstramos que na lesão hepática imunomediada induzida
por ConA, os MoMFs desempenham um papel fundamental, não apenas na
necrose fagocitária tecidos, mas também na orquestração da indução de
hepatócitos do fator de transcrição 9+ SRY-box (SOX9+) e na ativação de
células estreladas hepáticas (HSCs) para promover a resolução e reparo de
lesões necróticas. Identificamos 2 clusters desses MoMFs por sequenciamento
de RNA unicelular (scRNA), um expressando complemento 1q (C1q) e outro
expressando Pdg-fb. Análises posteriores revelaram que os MoMFs C1q+
expressam vários genes relacionados à fagocitose e digestão de proteínas e,
portanto, desempenham um papel importante na remoção de tecidos necróticos,
enquanto os MoMFs Pdg-fb+ promovem a ativação e contração de HSCs que
circundam as áreas necróticas e contribuem para a eliminação de
lesões necróticas.
Resultados
Os MoMFs são agregados e encapsulam as lesões necróticas após lesão
hepática imunomediada. Para estudar os mecanismos pelos quais as lesões
necróticas são resolvidas após lesão hepática aguda utilizamos o modelo
de lesão hepática aguda imunomediada induzida por ConA no qual danos
maciços ao tecido hepático incluindo necrose de hepatócitos
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desenvolve dentro de 24 horas após a injeção de ConA, resultando em
rápida elevação da transaminase sanguínea (ALT) (Figura 1A suplementar;
material suplementar disponível online com este artigo; https://
e grandes lesões necróticas (Figura 1A).
Essas lesões são gradualmente reduzidas a tamanhos menores em 96
horas (Figura 1A) e eventualmente desaparecem em 7 dias.
Durante o desenvolvimento da lesão e sua resolução gradual, notamos
também agregação de células não parenquimatosas ou inflamatórias ao
redor das áreas necróticas, que separaram os hepatócitos não danificados
das áreas necróticas, como demonstrado pela coloração H&E (Figura 1A).
Análises de imunocoloração revelaram que muitas dessas células agregadas
eram células imunes CD45+, formando uma estrutura “em forma de anel”
que se tornou mais espessa durante a resolução da lesão necrótica (Figura
1A).
Estudos adicionais utilizando coloração de imunofluorescência multiplex
com diferentes marcadores celulares revelaram três tipos principais de
células ao redor das lesões necróticas. Conforme ilustrado na Figura 1, B e
C, e na Figura Suplementar 1B, MoMFs (IBA1 + CLEC4F– : IBA1, um
marcador geral de macrófagos; CLEC4F, um marcador de células de
Kupffer) foram detectados já 24 horas após a injeção de ConA e agregaram
abundância -dantemente em momentos posteriores. O transplante de
experimentos de medula óssea GFP (Figura 1C suplementar) revelou um
grande número de células GFP + derivadas da medula óssea depositadas
na área fronteiriça, apoiando ainda mais que a maioria das células IBA1 +
ao redor das áreas necróticas são MoMFs derivados da medula óssea. HSCs ativados
(Desmin+ ÿ-SMA+ ) e neutrófilos (MPO+ ) foram detectados principalmente
em momentos tardios (aproximadamente 72-96 horas após a injeção de
ConA) (Figura 1, B e C). Células Kupffer duplamente positivas IBA1 +
CLEC4F + foram detectadas principalmente em regiões parenquimatosas
não danificadas, mas poucas células Kupffer foram detectadas dentro de
áreas necróticas e suas regiões limítrofes (Figura 1B e Figura Suplementar
1B), sugerindo que as células Kupffer originalmente localizadas nas áreas
necróticas são provavelmente destruídas e as novas células de Kupffer não
migram para as áreas necróticas, o que está de acordo com um estudo
anterior que demonstra que as células de Kupffer não migram (20). O
número de células de Kupffer em áreas não danificadas permaneceu
estável durante a lesão hepática induzida por ConA (Figura 1D suplementar).
Além disso, também observamos a proliferação de células Ki67+ IBA1+
CLEC4F+ Kupffer em áreas não danificadas (Figura Suplementar 1E).
Finalmente, embora não migrem após a lesão, as células de Kupffer (IBA1+
Clec4F+ ) demonstraram desempenhar um papel importante no início da
lesão hepática induzida por ConA, produzindo uma variedade de citocinas
pró-inflamatórias (17, 21). Para definir melhor as funções das células de
Kupffer, isolamos células de Kupffer do fígado tratado com ConA e
realizamos análise de PCR quantitativa com transcrição reversa (RT-qPCR)
e descobrimos que vários dos marcadores relacionados à ativação e
fagocitose das células de Kupffer foram reguladas positivamente 6 horas
após a injeção de ConA, mas permaneceram inalteradas durante o estágio
de reparo posterior, 48 a 72 horas após a injeção de ConA (Figura 1F suplementar).
Para definir os mecanismos subjacentes ao recrutamento de MoMFs,
realizamos vários experimentos usando o modelo ConA em camundongos
Ccr2–/–, Cx3cr1–/– e Ccl2Hep–/– (Figura 2 suplementar, AD). Nossos
dados revelaram que nos estágios iniciais da lesão, os hepatócitos que
circundam as lesões necróticas produzem a quimiocina CCL2 do MoMF,
que induziu o acúmulo de MoMF via CCR2 e não o receptor 1 da quimiocina
com motivo C-X3-C (CX3CR1) (ver detalhado resulta na Figura Suplementar
2, A – D). Curiosamente, a exclusão de
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Figura 2. A sinalização JAG1 derivada de MoMF é necessária para a geração de hepatócitos SOX9+ nos estágios iniciais do reparo hepático após lesão. (A) Coloração
imunofluorescente representativa de SOX9 e ÿ-catenina de tecidos hepáticos de camundongos tratados com ConA (48 horas após o tratamento, n = 4). As setas vermelhas
indicam hepatócitos SOX9+ no fígado lesionado por ConA; setas amarelas indicam hepatócitos normais. A ÿ-catenina mostra a membrana dos hepatócitos. Os tamanhos médios
dos hepatócitos foram quantificados com base na coloração com ÿ-catenina. (B) Os ratos foram tratados com ConA durante 24 horas, seguido de injeção de lipossomas de
clodronato ou lipossomas de controle. Amostras de fígado foram coletadas 48 horas após o tratamento com ConA. A dupla coloração SOX9 e IBA1 foi realizada nessas amostras (n = 5).
(C) Os ratos foram tratados com ConA durante 48 horas, seguido de coloração de tecidos hepáticos com anticorpos JAG1 e SOX9 (n = 5). (D) Camundongos CCR2-RFP
heterozigotos (CCR2+ MoMFs são marcados com RFP) foram tratados com ConA. As MNCs hepáticas foram isoladas e submetidas a análises de citometria de fluxo de JAG1 e RFP (n = 5).
(E) Camundongos knockout Notch1 e Notch2 específicos para hepatócitos e WT foram tratados com ConA por 48 horas. A proteína SOX9 nos tecidos do fígado foi corada e o
número de hepatócitos SOX9+ foi quantificado (n = 6). Imagens representativas são mostradas em A, B, C e E. Os valores em A, B, D e E são representados como médias ± DP.
A significância estatística foi avaliada usando o teste t de Student bicaudal para comparação de 2 grupos (B) e ANOVA unidirecional seguido pelo teste post hoc de Tukey para
múltiplos grupos (A e E). ***P < 0,001. As linhas tracejadas indicam os limites das áreas necróticas.

4 J Clin Invest. 2023;133(15):e166954 https://doi.org/10.1172/JCI166954

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Ccr2 reduziu acentuadamente o número de MoMFs sem afetar o número de
células Kupffer (Figura 2C suplementar). Além disso, detectamos altos níveis de
expressão de NF-ÿB ativado (coloração nuclear p65), que é conhecido por
regular positivamente o CCL2 (22) e que pode contribuir para a produção de
CCL2, nos hepatócitos que circundam a área da borda necrótica (Figura
Suplementar 2E ).
MoMFs desencadeiam a formação de um SOX9 + resistente à morte celular
camada de hepatócitos encapsulando as áreas necróticas através do JAG1 /
Via NOTCH2 em momentos iniciais. Para definir se LPCs/
células-tronco contribuem para o reparo de lesões necróticas, realizamos
imunocoloração com anticorpo SOX9. SOX9 é um marcador para LPCs e células
epiteliais biliares, mas não é expresso em hepatócitos maduros (23),
desempenhando um papel crítico no controle da especificação de hepatoblastos
para células do ducto biliar (BDCs) através da ativação da proteína homóloga de
entalhe (NOTCH) (24 , 25). Nossos experimentos de imunocoloração detectaram
apenas coloração positiva para SOX9 em BDCs no fígado normal; no entanto,
nos fígados de camundongos tratados com ConA, BDCs e pequenos hepatócitos
ao redor de áreas necróticas coraram positivamente com SOX9, com efeitos de
pico ocorrendo 48 e 72 horas após a injeção de ConA (Figura 2A e Figura
Suplementar 3A). Usando vários marcadores de hepatócitos e LPC/BDC,
demonstramos que essas células SOX9+ se assemelham a hepatócitos em vez
de progenitoras/
CDBs; assim, doravante nos referimos a essas células como hepatócitos SOX9
+ (ver resultados detalhados na Figura Suplementar 3, B – F).
Curiosamente, um grande número de hepatócitos IBA1 + CLEC4F- MoMFs
e SOX9 + foram coagregados em torno das áreas necróticas (Figura 3B
suplementar). Para determinar se os MoMFs contribuem para a indução de
hepatócitos SOX9 +, realizamos a depleção de macrófagos usando lipossomas
contendo clodronato 8 horas após a injeção de ConA. De fato, a depleção de
macrófagos reduziu notavelmente o número de células SOX9+ (Figura 2B). Os
lipossomas contendo clodronato esgotaram todas as células IBA1 +, incluindo
células de Kupffer e MoMFs (Figura 2B), bem como monócitos circulantes, sem
reduzir os neutrófilos (Figura 4A suplementar). Para definir melhor o papel dos
MoMFs na indução de hepatócitos SOX9 +, usamos camundongos Ccr2–/– ,
que são deficientes no receptor de recrutamento MoMF CCR2 e reduziram
acentuadamente a agregação de MoMF nas bordas necróticas (Figura 2
suplementar). Conforme ilustrado na Figura Suplementar 4B, o número de
hepatócitos SOX9 + foi reduzido em 90% em camundongos Ccr2 –/– em
comparação com camundongos WT. Em contraste, camundongos Cx3cr1 –/– ,
que apresentavam agregação MoMF semelhante nas bordas necróticas (Figura
2 suplementar), apresentavam números de SOX9 +
hepatócitos semelhantes aos de camundongos controle após injeção de ConA
(Figura 4B suplementar).
Para explorar as possíveis vias de sinalização que controlam a expressão
de SOX9, purificamos CD45 + CD11b + CCR2 + Ly6G – MoMFs e quantificamos
os níveis de mRNA de vários fatores envolvidos na regulação da expressão
de SOX9. Entre eles, a expressão de Jagged1 (JAG1) foi significativamente
regulada positivamente após o tratamento com ConA (Figura 5A suplementar).
JAG1, uma proteína de superfície celular que interage com receptores NOTCH
de locus neurogênicos, foi implicada na especificação de linhagem de LPCs/
BDCs, promovendo a expressão de SOX9 através da ativação de NOTCH de
maneira de contato célula-célula
(26). A expressão de mRNA de genes alvo NOTCH, como Hes1
e Hes5 , bem como Sox9, no fígado também foram significativamente regulados
positivamente pelo tratamento com ConA (Figura 5B suplementar). A coloração
imuno-histoquímica visualizou forte expressão de JAG1 em
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células imunológicas ao redor da área necrótica e adjacentes ao SOX9 +
hepatócitos em camundongos tratados com ConA, enquanto coloração JAG1
muito fraca foi detectada em fígados normais ou em áreas não danificadas
(incluindo células de Kupffer) dos fígados de camundongos tratados com ConA
(Figura 2C), sugerindo que JAG1 é altamente regulado positivamente em
MoMFs, mas não em Células de Kupffer após injeção de ConA. Além disso, em
camundongos heterozigotos CCR2 GFP, a expressão de JAG1 foi localizada em CCR2+
MoMFs e aumentou significativamente após a injeção de ConA (Figura 2D).
Além disso, análises citométricas de fluxo revelaram que o JAG1 estava
localizado principalmente em MoMFs, mas não em células T, células B, células
NK ou neutrófilos antes ou após a injeção de ConA (Figura 6 suplementar).
Curiosamente, o número de MoMFs JAG1+ foi elevado no fígado, mas não no
baço, 24 a 72 horas após a injeção de ConA, e essas células expressaram vários
macrófagos/
marcadores de monócitos (Figura Suplementar 6).
Em seguida, exploramos o papel da sinalização JAG1 / NOTCH na indução
de hepatócitos SOX9 + usando camundongos com deleção específica de
hepatócitos de Notchs, os genes que codificam receptores para JAG1 (Notch1Hep
–/– e Notch2Hep –/–). Conforme ilustrado na Figura 2E, o número de hepatócitos
SOX9 + foi marcadamente reduzido em camundongos Notch2Hep –/– , mas não
em camundongos Notch1Hep –/– em comparação com camundongos de
controle. Números reduzidos de hepatócitos SOX9 + também foram observados
em camundongos tratados com o inibidor de sinalização NOTCH dibenzazepina
(DBZ) ou após a ablação de JAG1 + MoMF por tratamento com intermedilisina
(ILY) (Figura 7, A e B suplementar). Estes dados sugerem que o JAG1 derivado
do MoMF promove a geração de hepatócitos SOX9 + através da ativação do
NOTCH.
Os hepatócitos SOX9+ são derivados de hepatócitos maduros e limitam a
lesão hepática ativando a sinalização de sobrevivência sem contribuir para a
proliferação de hepatócitos. Em seguida, realizamos experimentos de
rastreamento de destino celular para determinar a origem dos hepatócitos SOX9
+ usando camundongos repórteres Sox9 CreERTRosa26-EYFP, nos quais
aproximadamente 70% dos BDCs/LPCs CK19 + e algumas células periportais
foram marcadas com EYFP (Figura Suplementar 8 , A e B). Descobrimos que
todas as células SOX9 + eram negativas para EYFP em camundongos repórteres
Sox9 CreERTRosa26-EYFP após injeção de ConA (Figura 8C suplementar).
Também utilizamos camundongos repórteres AAV-TBG-Cre + Rosa-EYFP, nos
quais mais de 96% de hepatócitos, mas nenhuma outra célula do fígado, foi
marcada com EYFP (Figura Suplementar 9, A e B) (27, 28). Neste caso, todos
os hepatócitos SOX9 + foram positivos para EYFP em camundongos repórteres
AAV-TBG-Cre + Rosa-EYFP após injeção de ConA (Figura 9C suplementar).
Coletivamente, nossos dados sugerem que os hepatócitos SOX9+ são derivados
de hepatócitos maduros, mas não de LPCs/BDCs.
Estudos anteriores relataram que os hepatócitos SOX9+ localizados na
área periportal tinham maior potencial regenerativo em comparação com os
hepatócitos em outras partes do fígado (29, 30). Para nossa surpresa, no modelo
ConA, a maioria dos hepatócitos em proliferação foi detectada em regiões
parenquimatosas não danificadas onde os hepatócitos não expressavam SOX9,
enquanto nenhuma proliferação de hepatócitos SOX9+ foi detectada como
demonstrado pela coloração BrdU (Figura 3A) e coloração Ki67 (Figura
Suplementar 10), sugerindo que SOX9–
mas não os hepatócitos SOX9 + proliferam para substituir os hepatócitos mortos
durante a lesão induzida por ConA. Além disso, nem hepatócitos nem LPCs
foram detectados nas áreas necróticas durante a resolução da lesão hepática,
como mostrado na Figura 1B, sugerindo que a proliferação de hepatócitos
SOX9– não penetra na parede celular SOX9+ para substituir as áreas de necrose
e que a proliferação de hepatócitos SOX9–
5
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Figura 3. Evidência da resistência dos hepatócitos SOX9+ à morte celular.
(A) camundongos C57BL/6 foram tratados com ConA por 48 e 72 horas; O BrdU foi
administrado 2 horas antes do sacrifício. Coloração dupla BrdU e SOX9 de
tecidos hepáticos (ver imagens representativas à esquerda) (n = 4). As
porcentagens de hepatócitos BrdU+ foram quantificadas (direita). (B)
camundongos WT e Sox9Hep–/– foram tratados com ConA por tempos diferentes; O
BrdU foi administrado 2 horas antes do sacrifício. É mostrada a coloração
representativa de tecidos hepáticos com SOX9, H&E e BrdU (n = 4–5). As setas
indicam BDCs SOX9+. (C) Porcentagens de área necrótica e porcentagens de hepatócitos Brdu+ de àBmembrana
Os níveis séricos de ALT foram analisados (n = 3–4). (E) Camundongos C57BL/6
foram tratados com ConA por 48 horas. Coloração SOX9 e pSTAT3 de seções
seriadas de tecidos do fígado. Imagens representativas são mostradas (n = 5). (F)
Camundongos WT, Sox9Hep–/– e Notch2Hep–/– foram tratados com ConA por 48
horas. O pSTAT3 foi corado para os tecidos do fígado (n = 5). (G) As porcentagens
de hepatócitos pSTAT3+ de F foram quantificadas (n = 5). As linhas tracejadas
indicam os limites ou áreas limítrofes das regiões necróticas. Os valores em A, C, D e
G são representados como médias ± DP. A significância estatística foi avaliada pelo
teste t de Student bicaudal para comparação de 2 grupos (A, C, D e G). **P < 0,01; ***P < 0,001.
os hepatócitos provavelmente expandem as regiões parenquimatosas para comprimir
as lesões necróticas.
Para definir melhor o papel do SOX9 nos hepatócitos na lesão hepática
imunomediada, excluímos o Sox9 nos hepatócitos apenas pela injeção de AAV8-
TBG-Cre em camundongos Sox9fl / fl (Sox9Hep –/–).
Hepatócitos SOX9 + foram observados ao redor das lesões necróticas em
camundongos WT, mas não em camundongos Sox9Hep –/– (Figura 3B). A coloração
H&E e o ensaio de incorporação de BrdU demonstraram que os camundongos
Sox9Hep –/– apresentavam áreas necróticas muito maiores e prejudicavam a
proliferação de hepatócitos Brdu + do que os camundongos WT após a injeção de
ConA (Figura 3, B e C). Consistente com as áreas necróticas maiores, os
camundongos Sox9Hep –/– apresentaram níveis mais elevados de ALT sérica
(Figura 3D) e uma taxa de mortalidade mais alta em comparação com camundongos
WT após injeção de ConA (Figura 11A suplementar). Foi interessante notar que os
camundongos WT apresentaram níveis máximos de ALT 8 horas após a injeção de
ConA, enquanto os camundongos Sox9Hep–/– apresentaram níveis muito mais
altos e elevação prolongada de ALT (Figura 3D), sugerindo que os hepatócitos
deapós
SOX9+ desempenham um papel importante na prevenção. o fígado contra danos adicionais Ccr2areduziu
Para entender os mecanismos subjacentes pelos quais o SOX9 promove a
sobrevivência celular, verificamos as proteínas antiapoptóticas, como STAT3 e BCL-
xL. Descobrimos que a maioria das células SOX9 + que encapsulam áreas
necróticas foram coradas positivamente com pSTAT3 (Figura 3E) e a deleção de
Sox9 ou Notch2 em hepatócitos aboliu a coloração de pSTAT3 (Figura 3, F e G). Da
mesma forma, forte coloração BCL-xL foi detectada e sobreposta às áreas coradas
com SOX9, e a deleção de Sox9 ou Notch2 em hepatócitos reduziu a coloração BCL-
xL (Figura 11, B e C suplementar). Além disso, o tratamento com o inibidor de
sinalização Notch DBZ em camundongos tratados com ConA reduziu a proliferação
de hepatócitos, aumentou a área necrótica, exacerbou a elevação sérica de ALT e
reduziu a expressão de pSTAT3 e BCL-xL (Figura 12 suplementar, A – C).
A ablação de células JAG1 + mediada por ILY , que reduziu a expressão de SOX9
(Figura 7B suplementar), também reduziu acentuadamente a expressão de pSTAT3
e BCL-xL em pequenos hepatócitos ao redor de áreas necróticas (Figura 12C
suplementar).
aHSCs encapsulam as áreas necróticas com forte ativação do sinal de
contração celular durante a fase de resolução. MoMFs e HSCs são as duas principais
populações celulares que compõem a estrutura em forma de anel durante a fase de
resolução (aproximadamente 72 a 96 horas após a injeção de ConA; Figura 1, B e
C), que também foi caracterizada
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por forte coloração de ÿ-SMA e aumento da incorporação de BrdU em HSCs desmin
+ (Figura 4, A e B), sugerindo que o acúmulo de MoMF pode estar associado à
proliferação e ativação de HSC. Curiosamente, os aHSCs também expressaram
altos níveis de YAP nuclear e cadeia leve de miosina fosforilada (pMLC) (Figura 4C),
dois sinais-chave para a contração das células musculares lisas (31, 32). Para
entender melhor os mecanismos subjacentes à contração de HSC, examinamos a
expressão da enzima conversora de endotelina-1 (ECE1), uma metaloprotease
ligada foram quantificadas. (D)
(33) que converte proteoliticamente a grande endotelina-1 (ET-1)
em ET-1 ativa, um fator chave para induzir a contração de HSC pela ativação de
pMLC (32). Como ilustrado na Figura 4D, foi detectada forte expressão da proteína
ECE1 nas áreas fronteiriças necróticas que se sobrepõem aos MoMFs IBA +,
especialmente nos últimos momentos (96 horas). A coloração de ET-1 foi detectável
em células sinusóides do fígado em camundongos ingênuos; no entanto, no fígado
de camundongos tratados com ConA, a coloração com ET-1 foi estendida para incluir
áreas necróticas (Figura 13 suplementar).
Os MoMFs desempenham um papel importante na indução da formação de
uma camada aHSC e promovem a resolução da área necrótica. Para determinar se
a expansão e ativação de HSCs eram dependentes de MoMFs, esgotamos os
MoMFs com lipossomas contendo clodronato 48 horas após a injeção de ConA e
realizamos imunocoloração. Conforme ilustrado na Figura 5A e na Figura
Suplementar 14A, a depleção de IBA1 + MoMFs por clodronato foi associada a uma
perda quase completa de HSCs ÿ-SMA + desmina + ativadas sem afetar HSCs
quiescentes (ÿ-SMA– desmin + ) (Figura 5A). Além disso, a resolução do dano
hepático e o início da regeneração hepática foram significativamente retardados
pelo tratamento com clodronato, como evidenciado por áreas necróticas maiores,
redução da proliferação de hepatócitos (BrdU+ ), mas aumento da morte de
hepatócitos (TUNEL+ ) em comparação com o lipossoma de controle. tratamento
(Figura 5, B – D). Como os lipossomas contendo clodronato esgotaram as células
de Kupffer e os MoMFs (como mostrado na Figura 2B), usamos camundongos
Ccr2–/– que reduziram acentuadamente os MoMFs sem afetar as células de Kupffer
(como mostrado na Figura Suplementar 2C) para definir melhor o papel dos MoMFs
na indução da ativação de ÿSMA + HSCs. Nossos dados revelaram que a deleção
injeçãoacentuadamente
de ConA. o número de HSCs ÿ-SMA+, enquanto a deleção
de Cx3cr1 não os afetou
(Figura Suplementar 14B). Tomados em conjunto, todos estes dados sugerem que
a estrutura em forma de anel composta por MoMFs e HSCs é essencial para a
reparação eficiente do fígado após lesão aguda.
Identificação de 2 grupos de populações MoMF associadas à necrose por
scRNA-Seq, incluindo MoMFs C1q+ e MoMFs Pdgfb+ .
Perguntamos então se os MoMFs na estrutura em forma de anel têm múltiplos
subconjuntos que podem desempenhar papéis diferentes na facilitação do reparo de
lesões hepáticas, por isso realizamos scRNA-Seq concentrando-nos em macrófagos.
MoMFs (CD45 + CD11b + Ccr2 + Ly6G– ) foram separados do fígado 0, 48 e 72
horas após a injeção de ConA (Figura 15 suplementar), e essas células foram
analisadas por scRNA-Seq.
Detectamos 13.451 genes expressos em 1.106 células de MoMFs de fígado de
camundongo ingênuo e 17.361 genes em 8.541 células e 16.302 genes em 3.575
células de MoMFs de fígado de camundongo 48 e 72 horas após a injeção de ConA,
respectivamente (Figura 6A e Figura Suplementar 16A). Identificamos 11 clusters
usando 30 componentes principais (PCs) sob resolução de 0,3. A maioria das
células são MoMFs (cluster 0 a cluster 6) com alguma contaminação por outras
células do sistema imunológico (cluster 7 a 10; células T, células NK,
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Figura 4. aHSCs agregam-se nas áreas limítrofes de necrose no estágio final de
recuperação de lesões vivas. (A e B) Camundongos C57BL/6 foram tratados com
ConA. O BrdU foi administrado 2 horas antes do sacrifício. Os tecidos hepáticos foram
coletados e corados com desmina/ÿ-SMA e desmina/BrdU. Imagens representativas
são mostradas em A (n = 4). A quantificação de aHSCs e HSCs em proliferação na área
não lesada, dentro da área necrótica e na área fronteiriça em A é mostrada em B.
(C) Os tecidos hepáticos de camundongos tratados com ConA foram corados com
desmina/YAP/ÿ-SMA ou desmina/PMLC. Imagens representativas de coloração
tripla ou dupla são mostradas (n = 5). Foi realizada a quantificação das porcentagens
de YAP+ Desmin+ e pMLC+ Desmin+ nas áreas limítrofes. (D)
Os tecidos hepáticos de camundongos tratados com ConA foram corados com IBA1/
ECE1 (n = 4–5). As linhas tracejadas indicam as áreas limítrofes das regiões
necróticas. Foi realizada quantificação de células ECE1+ IBA1+ /total IBA1+ em áreas fronteiriças.
Os valores em B – D são representados como médias ± DP. A significância estatística
foi avaliada usando ANOVA unidirecional seguida pelo teste post hoc de Tukey para
múltiplos grupos (B – D). **P < 0,01; ***P < 0,001.
Células NKT, células linfóides inatas [ILCs] e neutrófilos, etc.)
(Figura Suplementar 16, B e C). De particular interesse foram 2 clusters MoMF que
foram aumentados pelo tratamento ConA, nomeadamente MoMFs C1q + (cluster 2)
e MoMFs Pdgfb + (cluster 4) (Figura 6B e Figura Suplementar 16, D e E).
C1q é bem conhecido por desempenhar um papel fundamental na remoção de
células mortas (34). As células C1q+ do cluster 2 também expressaram altos níveis
de vários genes relacionados à depuração de células mortas e detritos, como catep-
sina B (Ctsb), legumaína (Lgmn) e apolipoproteína E (Apoe) (Figura 6B). A expressão
de proteínas codificadas por esses genes em IBA1+
Os MoMFs nas áreas de borda necrótica foram verificados por dupla coloração
imunofluorescente, enquanto a expressão dessas proteínas nas células IBA1 +
Kupffer em áreas não danificadas foi baixa (Figura 6C).
Entre os genes do cluster 4, o Pdgfb codifica o PDGFb, um fator de crescimento
e ativador bem caracterizado para HSCs (35). Cluster 4 Pdgfb+ MoMFs também
expressam níveis moderados de C1qa, C1qb e C1qc (Figura 6B). A coloração de
dupla imunofluorescência revelou que a maioria das células PDGFb+ eram IBA1+
MoMFs localizadas em estruturas semelhantes a anéis perinecroticos, enquanto
poucas células PDGFb+ IBA+ Kupffer foram detectadas em áreas não danificadas
(Figura 6D).
Estudos anteriores relataram várias populações de MoMFs, incluindo macrófagos
associados a lipídios (LAMs) (36), macrófagos associados à esteatohepatite não
alcoólica (NAMs) (37) e macrófagos associados a cicatrizes (SAMs) (38), que
compartilham certos características, como expressão de Cd9, Trem2 e Osteopontina
(Spp1). Curiosamente, os MoMFs C1q + (cluster 2) expressaram alguns, mas não
todos os genes de assinatura destas populações de macrófagos (Figura 16F
suplementar). Por exemplo, NAMs/LAMs tinham mais genes de assinatura
sobrepostos com MoMFs C1q+ do que SAMs; no entanto, os MoMFs C1q + não
possuem vários genes de assinatura NAM / LAM (Cd9, Cd36, Fabp4, Mmp12, H2Ab1)
e não possuem vários genes de assinatura SAM (Il1b, Cxcr4, Pdgfb, Vegfa, Hes1)
(Figura 16F suplementar).
MoMFs C1q + reprogramados por hipóxia promovem a eliminação de células
mortas e a resolução de lesões hepáticas. Os MoMFs C1q+ do cluster 2 localizados
em estruturas semelhantes a anéis expressam complementos e proteinases, como
C1q e Ctsb. Para testar como as proteínas codificadas por esses genes contribuem
para a recuperação de danos hepáticos, usamos camundongos C1q–/– e inibidor de
Ctsb. Em comparação com camundongos WT, camundongos C1q–/– ou
camundongos WT tratados com um inibidor de Ctsb (CA-074 Me) apresentaram
resolução retardada de necrose, conforme refletido pelas maiores áreas necróticas
detectadas nesses camundongos em comparação com aqueles em WT tratados
com veículo camundongos (Figura 7, A e B). O tratamento com CA-074 Me atrasou ainda mais o reparo
Os MoMFs
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em camundongos C1q–/– , com as maiores áreas necróticas em comparação com as
de todos os outros grupos (Figura 7, A e B).
Como as áreas necróticas estão fortemente associadas à hipóxia, levantamos a
hipótese de que a hipóxia desempenha um papel na indução da formação do
aglomerado de MoMFs C1q + . De fato, a hipóxia em MoMFs, bem como em outras
células na área necrótica, foi visualizada pela sonda hipóxi, e o HIF1ÿ foi fortemente
ativado nesses MoMFs IBA1+ em áreas de borda necrótica, mas não em células
IBA1+ Kupffer em áreas não danificadas, conforme detectado por imunocoloração
(Figura 7C).
A expressão de CTSB e ECE1, 2 alvos bem conhecidos de HIF1ÿ (39, 40) foi
significativamente reduzida em IBA1 + MoMFs de camundongos Hifa-knockout
específicos de células mieloides (Hif1amye–/–) em comparação com aqueles de
camundongos WT após tratamento com ConA (Figura 7D).
A expressão de C1q e LGMN, que não são alvos diretos de HIF1ÿ, também foi
marcadamente reduzida em MoMFs de Hif1amye–/–
ratos (Figura 7D). A expressão de MAFB, um fator de transcrição que é um regulador
a montante de C1q (41), foi marcadamente reduzida em MoMFs de camundongos
Hif1amye –/– (Figura 7D).
Para avaliar se a hipóxia é suficiente para induzir a mudança fenotípica dos
MoMFs, tratamos macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) in vitro com um
indutor de HIF, CoCl2 (100 ÿM) (42) e/ou hepatócitos mortos para imitar um ambiente
necrótico. Como mostrado na Figura Suplementar 17, o tratamento com CoCl2
sozinho regulou positivamente a maioria dos genes de assinatura dos clusters 2 e
4, enquanto a adição de hepatócitos mortos em BMDMs tratados com CoCl2 regulou
ainda mais os níveis de expressão de vários genes, incluindo C1qa, C1qb e C1qc. O
tratamento apenas com hepatócitos mortos também regulou positivamente vários
genes em BMDMs.
MoMFs de camundongos Hif1amye–/– reduziram a expressão de vários genes
relacionados à depuração de células mortas, o que pode afetar a função de fagocitose
dos MoMFs. Consequentemente, os MoMFs do fígado isolados de camundongos
Hif1amye –/– tratados com ConA apresentaram fagocitose prejudicada em
comparação com aqueles de camundongos WT (Figura 7E). Finalmente, camundongos
Hif1amye –/– apresentaram resolução tardia da necrose em comparação com
camundongos WT após tratamento com ConA (Figura 7F). Coletivamente, esses
dados sugerem que os MoMFs C1q + acionados por hipóxia facilitam a remoção de
células mortas e promovem o reparo de lesões hepáticas.
PDGFB derivado de MoMFs em área necrótica promove ativação e contração
de HSC, acelerando assim a resolução da lesão hepática. Sabe-se que o PDGF que
atua via PDGFR ativa HSCs (35). Os dados acima mostram que o PDGFB é expresso
em níveis elevados em MoMFs que circundam as áreas necróticas. Curiosamente,
o receptor PDGFB PDGFR também foi detectado em níveis elevados em HSCs na
mesma zona perinecrótica (Figura 18A suplementar).
Para determinar a contribuição do PDGFB derivado do MoMF no HSC
ativação, geramos camundongos knockout para Pdgfb específicos para células
mielóides (Pdgfbmye –/–) e camundongos knockout para receptor PDGF específicos
para HSC (PdgfraHSC –/–) . Conforme ilustrado na Figura 8A, o número de HSCs ÿ-
SMA+ ativados que se sobrepuseram ao IBA1+
Os MoMFs na área perinecrótica foram significativamente menores nos camundongos
Pdgfbmye –/– e PdgfraHSC –/– do que nos camundongos WT no estágio tardio do
reparo da lesão hepática. O número total de HSCs desmina + também foi menor em
ambos os camundongos knockout do que em camundongos WT (Figura 18B
suplementar). Finalmente, o número de HSCs em proliferação Desmin + BrdU + foi
muito menor em camundongos Pdgfbmye –/– e PdgfraHSC –/– do que em
camundongos WT (Figura 8B). Em contraste, o número de IBA1+ CLEC4F–
doáreas
nas fígadofronteiriças foram comparáveis em WT, Pdgfbmye–/–,
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Figura 5. A depleção de MoMFs após a lesão elimina a agregação de HSC e
agrava a lesão hepática induzida por ConA. Camundongos C57BL/6 foram tratados
com ConA. O lipossoma de clodronato ou o lipossoma de controlo foram administrados
a estes ratinhos 24, 48 e 72 horas após as injecções de ConA. Os ratos foram
sacrificados 96 horas após a injeção de ConA. O BrdU foi administrado 2 horas antes do sacrifício.
Os tecidos hepáticos foram corados com IBA desmina e ÿ-SMA (A, n = 4), H&E (B,
n = 5-8), BrdU (C, n = 6) e TUNEL (D, n = 6). As setas indicam hepatócitos
TUNEL+. Imagens representativas são mostradas. As linhas tracejadas indicam as
áreas limítrofes das regiões necróticas. Os valores são representados como médias
± DP. A significância estatística foi avaliada usando o teste t de Student bicaudal
para comparação de dois grupos (A – D). **P < 0,01; ***P < 0,001.
e camundongos PdgfraHSC –/– , e o número de células IBA1 + CLEC4F +
Kupffer em áreas não danificadas também foi comparável em todos os 3
grupos (Figura 19 suplementar). Além disso, avaliamos a eficiência da
resolução do dano hepático e dos sinais de contração do HSC nesses
camundongos após o tratamento com ConA. As áreas necróticas eram muito
maior em camundongos Pdgfbmye–/– e PdgfraHSC–/– do que em
camundongos WT após tratamento com ConA (Figura 8C). Além disso, a
imunocoloração dos sinais de contração YAP e pMLC foi muito mais fraca
em camundongos Pdgfbmye –/– e PdgfraHSC –/– do que em irmãos de
ninhada WT após tratamento com ConA (Figura 20 suplementar).
Finalmente, determinamos se a indução de MoMFs pdgfb + foi devida à
hipóxia por imunocoloração de PDGFÿ em camundongos WT e Hif1amye
–/– tratados com ConA. Conforme ilustrado na Figura Suplementar 21, a
expressão reduzida de PDGFÿ foi encontrada em MoMFs de camundongos
Hif1amye –/– , o que é consistente com vários relatos de que PDGFÿ é
regulado positivamente por hipóxia (43, 44). Estes dados sugerem que a
hipóxia promove o recrutamento de MoMFs na zona perinecrótica,
ÿB HSC.
desempenhando assim um papel fundamental na indução da ativação/contração de estimulada por padrões moleculares associados ao perigo (DAMPs) (46)
Agregação de MoMFs IBA1+, hepatócitos SOX9+ e ÿSMA+
HSCs ao redor de lesões necróticas também são detectadas em outros
modelos de lesão hepática. Para determinar se a interação de MoMFs, SOX9+
hepatócitos e aHSCs também se aplicam a outros modelos de lesão
hepática, realizamos análises imuno-histoquímicas de IBA1, SOX9 e ÿ-SMA
em vários modelos de lesão hepática induzida por infecção por Klebsiella
pneumoniae (KP) , isquemia/reperfusão (I/R ) ou toxinas hepáticas
(tetracloreto de carbono [CCl4 ] e APAP). Conforme ilustrado na Figura
Suplementar 22, foi detectada agregação significativa de IBA+ MoMFs,
hepatócitos SOX9+ e ÿ-SMA+ HSCs ao redor das áreas necróticas do fígado
no modelo de infecção KP e no modelo I/R. No entanto, tal agregação foi
menos evidente nos modelos CCl4 e APAP, nos quais macrófagos IBA1+ e
HSCs ÿSMA+ foram encontrados dentro da área necrótica. Macrófagos
IBA1+ /células Kupffer também foram detectados em áreas não lesionadas
dos modelos CCl4 e APAP.
Coletivamente, a interação de MoMFs, hepatócitos SOX9+ e aHSCs
provavelmente também desempenha um papel importante na promoção da
resolução de lesões hepáticas necróticas em modelos KP ou I/R, enquanto
o reparo de lesões hepáticas induzido por hepatotoxina direta (como CCl4 ,
APAP) usa um mecanismo diferente devido à lesão dominante dos
hepatócitos nestes modelos de lesão induzida por drogas (9). Estas
hepatotoxinas em si não são tóxicas; em vez disso, seus metabólitos gerados
através do CYP2E1 promoveram lesão de hepatócitos. Os CYP2E1s são
expressos principalmente em hepatócitos próximos à veia central, resultando
em necrose ao redor da veia central. Em contraste, os hepatócitos próximos
à área portal, que expressam níveis muito baixos de CYP2E1, são resistentes
à lesão hepática induzida por APAP (45). Assim, não são necessários
hepatócitos SOX9 + resistentes à morte celular para prevenir lesões adicionais.
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Discussão
Lesões necróticas do fígado podem desenvolver-se em resposta a uma
variedade de insultos patológicos, mas os mecanismos celulares envolvidos
na sua resolução e reparação permanecem em grande parte desconhecidos.
Pesquisas nas últimas três décadas revelaram que os macrófagos são
altamente adaptáveis em sua capacidade de responder a uma variedade de
ameaças ao organismo, diferenciando-se em subconjuntos com perfis
únicos de expressão gênica, exercendo múltiplas funções, incluindo a
promoção do reparo de lesões hepáticas ( 11 –13, 20). No presente estudo,
descobrimos que os MoMFs são rapidamente recrutados para as lesões
necróticas após lesão hepática aguda imunomediada. Caracterizamos ainda
as mudanças dinâmicas dos MoMFs e suas interações com vários outros
tipos de células nas lesões necróticas do fígado e identificamos pelo menos
três papéis específicos desempenhados pelos MoMFs na resolução de
lesões necróticas, que estão resumidos em um modelo de trabalho na Figura 9.
O primeiro papel reparador dos MoMFs neste modelo de lesão é induzir
uma parede de hepatócitos SOX9 + resistentes à morte celular que
encapsulam as lesões necróticas, protegendo assim os hepatócitos não
danificados de lesões adicionais. Na fase inicial da lesão hepática, os MoMFs
agregam-se rapidamente ao longo do perímetro das áreas necróticas. Este
rápido recrutamento depende da interação do CCL2 derivado de hepatócitos
com o macrófago CCR2 porque a deleção específica do fígado de Ccl2 ou a
deleção global de seu receptor Ccr2 reduziu marcadamente o recrutamento
de hepatócitos SOX9 + .
Os papéis importantes do CCL2/CCR2 na proteção contra lesão hepática
induzida por ConA foram previamente bem documentados (18, 19).
Curiosamente, apenas os hepatócitos ao redor do perímetro da área necrótica
expressam altos níveis de CCL2, o que pode ser devido à ativação de NF-
liberados pelo tecido necrótico. De fato, a ativação do NF-ÿB, que regula
positivamente o CCL2 (22), é detectada em níveis mais elevados nos
hepatócitos perinecróticos em comparação com os hepatócitos em áreas
não danificadas. Além disso, o importante papel dos MoMFs na indução de
hepatócitos SOX9+ é fortemente apoiado pela noção de que o número de
hepatócitos SOX9+ foi marcadamente reduzido após a depleção de
macrófagos ou em camundongos Ccr2–/– . SOX9 é expresso principalmente
em células ductulares biliares e LPCs, mas não em hepatócitos maduros
(23), desempenhando um papel crítico no controle da especificação de
hepatoblastos para BDCs através da ativação de NOTCH (24, 25). No
presente estudo, descobrimos que a sinalização NOTCH ativada pelo seu
ligante JAG1 também está envolvida na indução de SOX9+
hepatócitos no modelo de lesão hepática ConA.
As características e funções dos hepatócitos SOX9+ foram investigadas
em nosso estudo, o que sugere que os hepatócitos SOX9+ desempenham
um papel importante na proteção contra lesão hepática imunomediada, mas
não contribuem para a regeneração hepática. Primeiro, descobrimos que os
hepatócitos SOX9 + em torno das regiões necróticas não proliferaram,
enquanto os hepatócitos SOX9- em áreas não danificadas proliferaram,
indicando que os hepatócitos SOX9 + não contribuem para a expansão dos
hepatócitos neste modelo de lesão hepática induzida por ConA. Em segundo
lugar, descobrimos que os hepatócitos SOX9 + expressaram altos níveis de
STAT3 ativado e sua proteína antiapoptótica BCL-xL a jusante. Estudos
anteriores indicaram que a sinalização NOTCH e seu alvo a jusante Hes5
promovem a ativação de STAT3, facilitando a formação de complexos entre
JAK2 e STAT3 (47). Isto é consistente com a nossa observação de altos
níveis de NOTCH e pSTAT3 em hepatócitos SOX9+.
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Figura 6. scRNA-Seq identifica 2 grupos de MoMFs associados à
necrose: MoMFs C1q+ e Pdgfb+ . (A e B) MoMFs de fígado foram isolados de
camundongos tratados com ConA (pontos de tempo de 0, 48 e 72 horas). Estas
células foram submetidas à plataforma 10x Genomics Chromium para scRNA-Seq.
Gráficos t-SNE de células virgens (1.106 células), ConA 48 horas após a injeção
(ConA48) (8.541 células) e ConA 72 horas após a injeção (3.575 células) são
mostrados em A. Mapa de calor dos genes de assinatura de macrófagos C1q+
( cluster 2) e macrófagos Pdgfb+ (cluster 4) são mostrados em B. (C e D)
camundongos C57BL/6 foram tratados com ConA por 48 ou 72 horas. Os tecidos
hepáticos foram duplamente corados com C1Q/IBA1, CTSB/IBA1, LGMN/IBA1
e APOE/IBA1 (C, n = 5) e PDGFB/IBA1 (D, n = 5). As linhas tracejadas indicam
as áreas limítrofes das regiões necróticas. As setas indicam células IBA+ com expressão degenes de assinatura C1q+ MoMF . Finalmente, esta população C1q+ MoMF
Imagens representativas e quantificação são mostradas. Os valores em C e D são
representados como médias ± DP. A significância estatística foi avaliada usando
o teste t de Student bicaudal para comparação de 2 grupos (C e D). ***P < 0,001.
Terceiro, a resistência à apoptose de hepatócitos SOX9 + foi ainda confirmada pelo
nosso achado de lesão hepática prolongada em camundongos Sox9Hep –/– após
injeção de ConA. O efeito protetor do SOX9 é provavelmente mediado pela indução
de pSTAT3 e BCL2, uma vez que os hepatócitos SOX9+ expressam níveis mais
elevados de pSTAT3 e BCL-2 do que os hepatócitos SOX9–, o que está de acordo
com um relatório anterior de que LPCs SOX9+ são resistentes à indução de citocinas.
apoptose (48). Resumindo, os macrófagos que se infiltram rapidamente expressam
altos níveis de JAG1 para induzir hepatócitos SOX9 + que formam uma cápsula
“semelhante a uma concha” que envolve as lesões necróticas, protegendo assim
contra lesões adicionais.
O segundo papel reparador importante dos MoMFs na lesão hepática induzida
por ConA é remover os tecidos necróticos para ajudar a resolver as lesões. A
fagocitose é a principal função dos macrófagos, por isso espera-se que os MoMFs
desempenhem um papel crítico na eliminação das células necróticas, uma vez que
a sua depleção atrasou marcadamente a resolução da lesão necrótica. Utilizando
scRNA-Seq, identificamos um cluster de macrófagos C1q+ que expressam diversos
genes relacionados à remoção de tecidos necróticos, como C1q, Cts, Lgmn e Ftl1.
C1q pode atuar como uma molécula de ponte que se liga às células apoptóticas e
promove sua fagocitose pelos macrófagos (49). As catepsinas (CTS) codificadas
pelos genes Cts pertencem a uma família de proteinases localizadas nos lisossomos
e são consideradas muito importantes na degradação tanto das proteínas
intracelulares quanto da matriz extracelular (50). LGMN, codificada por Lgmn, é
outra proteinase lisossomal que pode ativar catepsinas, degradar a matriz extracelular
e promover a eliminação de células apoptóticas (51). Curiosamente, análises de
coloração imunofluorescente demonstraram que os macrófagos C1q+ estavam
localizados principalmente nas margens das lesões necróticas e coexpressavam
C1Q, CTS e LGMN. A deleção genética de C1q e/ou inibição da STC atrasou
acentuadamente a resolução da necrose hepática, sugerindo um papel importante
dos macrófagos C1q+ na remoção de tecidos necróticos e na promoção da reparação
hepática. Além disso, exploramos como C1q+
macrófagos são induzidos durante lesão hepática aguda. Porque C1q+
Se os macrófagos estiverem localizados no meio hipóxico das áreas ao redor das
lesões necróticas, levantamos a hipótese de que a hipóxia desempenha um papel
na indução de macrófagos C1q + . Esta hipótese é de fato apoiada por nossos
dados que demonstram que Hydroxyprobe e HIF1ÿ
estão marcadamente elevados em MoMFs localizados em áreas perinecróticas e
que a deleção de Hif1a aboliu a expressão de C1q e atrasou a resolução da lesão
necrótica. Embora C1q esteja marcadamente reduzido em camundongos Hif1amye
–/– , a análise de sequência não identificou ligação a HIF1ÿ
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locais no promotor C1q , sugerindo que C1q não é um alvo direto do HIF1ÿ. Além
disso, nossos dados de scRNA revelaram que C1q+
macrófagos expressam MAFB, um fator chave de transcrição que controla a
expressão de C1q (41), e a expressão de MAFB foi marcadamente diminuída em
MoMFs em camundongos Hif1amye–/– , sugerindo que HIF1ÿ
controla a expressão de C1q induzindo MAFB em MoMFs. Além disso, experimentos
in vitro também apoiam um papel do ambiente necrótico (hipóxia e necrose) na
indução de macrófagos C1q+ , já que o tratamento in vitro de macrófagos com um
indutor HIF1 (CoCl2 ) e hepatócitos mortos regulou positivamente a maioria dos
PDGFB.
expressa alguns, mas não todos, genes de assinatura de várias populações de
macrófagos previamente relatadas, tais como LAMs (36), NAMs (37) e SAMs (38).
Estas diferenças são provavelmente devidas à plasticidade dos macrófagos que lhes
permite reagir a diferentes microambientes. No
No modelo de lesão hepática induzida por ConA que utilizamos neste estudo,
ocorreu necrose maciça para gerar grandes quantidades de tecidos necróticos em
lesões necróticas. Os MoMFs C1q+ expressam muitos genes de assinatura que
desempenham um papel crucial na promoção da depuração de tecidos necróticos,
mas carecem de vários genes de assinatura associados ao metabolismo lipídico
(Cd36, Fabl4) que são observados em NAMs/LAMs de doença hepática gordurosa
e não possuem genes associados à fibrose ( Il1b, Cxcr4, Pdgfb, Vegfa, Hes1) que
são observados em SAMs de fígados cirróticos. Também é notado
É provável que a hipóxia e o HIF2 tenham demonstrado reprogramar macrófagos
hepáticos em respostas hepáticas agudas ao APAP (52). Coletivamente, a hipóxia
associada à necrose ativa o eixo HIF1ÿ/MAFB/C1q em MoMFs, resultando no
acúmulo de MoMFs C1q+ com forte atividade fagocítica para remover tecidos
necróticos.
O terceiro importante papel reparador dos MoMFs se manifesta nos estágios
posteriores da lesão hepática, quando eles ativam HSCs ÿ-SMA + que comprimem
a cápsula das lesões necróticas para facilitar sua eliminação. As análises scRNA-
Seq e imuno-histoquímica identificaram um cluster de MoMFs Pdgfb + que são
agregados e colocalizados com HSCs ÿ-SMA + no perímetro necrótico. Os MoMFs
Pdgfb + são críticos para a formação de HSCs ÿ-SMA + , pois o nocaute de Pdgfb
em MoMFs ou seu receptor Pdgfrb em HSCs aboliu a proliferação e ativação de
HSC. Uma função importante das HSCs ÿ-SMA+ é comprimir a cápsula das lesões
necróticas, eliminando-as em última análise. Primeiro, durante a resolução da lesão
necrótica, não foram detectados hepatócitos ou LPCs dentro das áreas necróticas,
enquanto a proliferação de hepatócitos foi evidente em regiões parenquimatosas
não danificadas, sugerindo que os hepatócitos em regiões não danificadas proliferam
e se expandem, com o resultado de comprimir as lesões necróticas. Em segundo
lugar, fortes sinais de contração (como YAP e pMLC) (31, 32) foram detectados em
HSCs ÿ-SMA+ localizadas nas áreas perinecróticas. Terceiro, o ECE1 foi detectado
em níveis elevados em MoMFs perinecróticos, especialmente em momentos tardios
da lesão. ECE1 é uma loendopeptidase metálica ligada à membrana que cliva a
ET-1 em peptídeos biologicamente ativos que desempenham um papel fundamental
na indução da contração de HSC (32, 33). Tomados em conjunto, estes dados
mostram que os MoMFs não apenas produzem PDGFb para ativar HSCs, mas
também expressam ECE1 que cliva ET-1 na forma ativa, o que provavelmente
desempenha um papel fundamental na promoção da contração de ÿ-SMA + HSC e
subsequente eliminação de lesões necróticas .
Foi demonstrado que as células de Kupffer, macrófagos residentes no fígado,
desempenham um papel importante no início da lesão hepática induzida por ConA,
produzindo uma variedade de citocinas pró-inflamatórias, como depleção de
Células de Kupffer antes da injeção de ConA diminuíram o fígado induzido por ConA
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Figura 7. A hipóxia desencadeia a reprogramação de MoMFs em áreas
necróticas, contribuindo para os estágios finais da resolução da lesão hepática.
(A e B) Camundongos WT e C1q–/– foram tratados com ConA, seguido de tratamento
com PBS ou CA-074 Me 48 e 72 horas após a injeção de ConA. Os tecidos do fígado foram
coletados 96 horas após a injeção de ConA. A coloração representativa de H&E do tecido
hepático é mostrada (A, n = 4-7). A quantificação da área necrótica é mostrada em B. (C)
Camundongos C57BL/6 foram tratados com ConA por 72 horas. Os tecidos do fígado
foram coletados para coloração com sonda IBA1/hipóxia e coloração dupla com HIF1ÿ/IBA1.
Imagens representativas são mostradas (n = 5). (D) Camundongos WT e Hif1amye–/– foram
tratados com ConA por 72 horas. Os tecidos do fígado foram coletados para dupla
coloração com vários anticorpos, conforme indicado (n = 5). A quantificação da percentagem
de células positivas é mostrada. (E) MoMFs de camundongos tratados com ConA foram
isolados para ensaio de absorção de esferas (n = 6–7). (F) Camundongos WT e
Hif1amye–/– foram tratados com ConA por 96 horas. Os tecidos hepáticos foram
coletados para coloração H&E, e a quantificação das áreas necróticas é mostrada à direita
(n = 4). As linhas tracejadas indicam os limites das áreas necróticas. Os valores em B, D,
E e F são representados como médias ± DP. A significância estatística foi avaliada usando
o teste t de Student bicaudal para comparação de 2 grupos (D – F) e ANOVA unidirecional
seguido pelo teste post hoc de Tukey para múltiplos grupos (B). **P < 0,01; ***P < 0,001.
lesão (17, 21). No entanto, as funções das células de Kupffer após a lesão não
foram bem estudadas. Nossos estudos atuais sugerem que as células de Kupffer
desempenham um papel menos importante na promoção da resolução de lesões
necróticas do que os MoMFs infiltrantes. Nas áreas necróticas, as células de
Kupffer foram perdidas após a lesão, provavelmente devido à morte celular,
enquanto nas áreas não danificadas, as células de Kupffer não migram e não
sofrem alterações hipóxicas semelhantes às dos MoMFs, que são rapidamente
recrutadas para bordas necróticas. De facto, a indução da maioria dos genes e
proteínas de assinatura MoMF não foi observada em células Kupffer, como
demonstrado por imunocoloração e análise RT-qPCR. No entanto, como células
fagocíticas profissionais, as células de Kupffer ainda podem contribuir para a
remoção de tecidos necróticos vazados das áreas necróticas após a injeção de
ConA, o que exigirá mais estudos para confirmação. Além disso, demonstrou-se
que tanto a proliferação de células de Kupffer como a diferenciação de MoMF
contribuem para a restauração das células de Kupffer em vários modelos de
lesão hepática (53–55). Também observamos proliferação substancial de células
de Kupffer em áreas não danificadas após a injeção de ConA, o que
provavelmente contribui para a restauração das células de Kupffer perdidas em
áreas necróticas neste modelo de lesão hepática aguda. Futuros experimentos
de rastreamento de linhagem são necessários para esclarecer se os MoMFs
também contribuem para a restauração das células de Kupffer no modelo de lesão hepática induzida por ConA.
Em resumo, aqui demonstramos que os MoMFs desempenham um papel
fundamental na reparação de lesões necróticas hepáticas em um modelo de
lesão hepática induzida por ConA, orquestrando a indução sequencial de
múltiplos tipos de células com perfis únicos de expressão gênica, incluindo
hepatócitos SOX9 + e aHSCs. Curiosamente, também observamos agregação
semelhante de MoMFs, hepatócitos SOX9+ e aHSCs em modelos de lesão
hepática induzida por infecção bacteriana ou isquemia/reperfusão, sugerindo que
tal interação desempenha um papel importante na promoção do reparo de lesões
necróticas hepáticas nesses modelos. Estudos futuros para identificar os papéis
complexos dos MoMFs na reparação de lesões necróticas hepáticas podem
ajudar no desenho de melhores terapias baseadas em macrófagos para o
tratamento de doenças hepáticas. Na verdade, tais terapias foram testadas para
o tratamento de doenças hepáticas tanto em modelos pré-clínicos como em pacientes superfície
(13, 56, 57).
com anticorpo monoclonal conjugado com fluorocromo durante 30 minutos em gelo.
Métodos
Cepas de ratos. C57BL/6J (catálogo 000664), Sox9-CreERT2 (catálogo 018829), Sox9fl/ fl
(catálogo 013106), Notch1fl/ fl (catálogo 007181), Notch2fl/ fl (catálogo 010525), Ccr2RFP
(catálogo 017586), Ccl2RFPfl/ FL
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(catálogo 016849), Pdgfbfl/ fl (catálogo 017622), Pdgfrafl/ fl (catálogo 006492), LysMcre
(catálogo 018956), CD11cCre (catálogo 008068), C1qa–/– (catálogo 031675), AlbCre (catálogo
003574) e ROSA -Os ratos repórter EYFP (catálogo 006148) foram obtidos do Laboratório
Jackson. Hif1ÿfl/ fl
camundongos foram descritos anteriormente (52). Os camundongos LratCre foram fornecidos
por Robert F. Schwabe (Columbia University, Nova York, Nova York, EUA) (58). Camundongos
ihCD59 foram descritos anteriormente (59). Todos os ratos utilizados neste estudo eram
machos de 6 a 10 semanas de idade.
Modelo de lesão hepática induzida por ConA. ConA (Sigma-Aldrich) foi dissolvido em
PBS e injetado iv através da veia da cauda na dose de 12 mg/
kg. O soro de camundongo foi obtido em momentos diferentes após a injeção de ConA. DBZ
(Tocris Bioscience) dissolvido em DMSO foi suspenso em PBS contendo 0,5% (p/v) de
hidroxipropilmetilcelulose (Metho-cel E4M) (Sigma-Aldrich) e 0,01% de Tween 80 (Sigma-
Aldrich).
DBZ foi injetado 8 e 24 horas após o tratamento com ConA na dose de 30 ÿmol/kg de peso
corporal. As atividades de ALT foram determinadas usando um sistema analisador químico
IDEXX (IDEXX Laboratories). BrdU (50 mg/kg de peso corporal) foi administrado por injeção
ip 2 horas antes do sacrifício. As áreas necróticas foram quantificadas pelo ImageJ (NIH) (60).
Tratamento de ratos. Em alguns camundongos tratados com ConA, 5 mg/kg de CA-074
Me (um inibidor específico da catepsina B) (Selleck Chemicals, diluído em 5% de DMSO
contendo PBS) ou veículo foram administrados por injeções ip diariamente e antes do
sacrifício.
Depleção de macrófagos. Para esgotar os macrófagos do fígado, os camundongos
receberam 150 ÿL de lipossomas de clodronato ou lipossomas de controle (FormuMax
Scientific) diariamente por injeções intravenosas.
Rastreamento do destino celular e nocaute de genes específicos de hepatócitos. Para
rastrear BDCs/LPCs, cruzamos camundongos Sox9-CreERT2 com ROSA-EYFP
ratos repórteres. Para obter a recombinação Cre-LoxP, os camundongos foram injetados ip
com tamoxifeno (catálogo T5648, Sigma-Aldrich) (dissolvido em óleo de milho na concentração
de 10 mg/ml) a 50 mg/kg de peso corporal a cada 3 dias por 3 vezes. . Os ratos foram utilizados
para experimentos 1 semana após a última injeção para garantir a eliminação do tamoxifeno.
Para marcar apenas os hepatócitos, camundongos repórteres ROSA-EYFP foram infectados
com AAV8-TBG-Cre (1,3 x 1011 cópias do genoma por camundongo, Penn Vector Core,
Filadélfia, Pensilvânia, EUA) por injeção intravenosa. Os ratos foram tratados com ConA 10
dias após a injeção de AAV8-Tbg-Cre. Para especificamente eliminar genes em hepatócitos,
camundongos floxed (Sox9, Notch1, Notch2) foram infectados com AAV8-TBG-Cre e foram
tratados com ConA 10 dias após a injeção de AAV8-TBG-Cre.
Isolamento de células mononucleares hepáticas. Os fígados de camundongo foram
removidos e prensados através de um filtro de células de 70 ÿm. As células do fígado foram
suspensas em PBS e centrifugadas a 50g por 5 minutos. Os sobrenadantes contendo células
mononucleares (MNCs) foram coletados, lavados em PBS e ressuspensos em meio Percoll a
40% (GE Healthcare).
A suspensão de células foi suavemente sobreposta em Percoll a 70% e foi centrifugada
durante 30 minutos a 750g. As MNCs foram coletadas da interfase, lavadas duas vezes em
PBS, contadas e ressuspensas em PBS para ensaios de citometria de fluxo.
Análise por citometria de fluxo. A suspensão unicelular de MNCs de fígado ou baço foi
lavada em PBS contendo 1% de albumina de soro bovino. As células foram coradas à
Os anticorpos utilizados foram anti-CD3 (clone 145-2C11), anti-CD19 (clone 1D3), anti-NK1.1
(clone PK136), anti-Ly6G (clone 1A8-Ly6g), anti-CD11b (clone M1/70 ), anti-CD11c (clone
N418), anti-CD80 (clone 16-10A1), anti-CD86 (clone GL1), anti-MHC-II (clone M5/114.15.2),
anti-JAG1 (clone HMJ1-29 ),
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ARTIGO DE PESQUISA O Jornal de Investigação Clínica

Figura 8. O PDGFB derivado de células mieloides promove a proliferação e ativação de HSC. Camundongos WT, Pdgfbmye–/– e PdgfraHSC–/– foram tratados com
ConA por 72 ou 96 horas. O BrdU foi administrado 2 horas antes do sacrifício. Os tecidos do fígado foram corados com (A) IBA1 e ÿ-SMA (n = 4), (B) BrdU e desmina (n = 4) e (C)
H&E (n = 4). Os números de aHSCs e BrdU+ HSCs na borda das áreas necróticas foram quantificados e são mostrados à direita. As linhas tracejadas indicam as áreas
limítrofes das regiões necróticas. Os valores em A – C são representados como médias ± DP. A significância estatística foi avaliada usando ANOVA unidirecional seguida
pelo teste post hoc de Tukey para múltiplos grupos (A – C). **P < 0,01; ***P < 0,001.

anti-CD115 (clone AFS98), anti-Ly6C (clone HK1.4), anti-F4/80 (clone BM8),
anti-MERTK (clone DS5MMER), anti-CD209 (clone LWC06) e anti-CD206
(clone MR6F3) (eBiociência); anti-CX-3CR1 (clone SA011F11), ant-CCR5
(clone HM-CCR5), anti-CD64 (clone X54-5/7.1), anti-CD36 (clone HM36), anti-
TIM4 (clone RMT4-
54), anti-CD9 (clone MZ3), anti-CLEC-2 (clone 7D9/CLEC-2) e anti-CCR2
(clone SA203G11) (BioLegend); e anti-LAP-TGF-ÿ
(clone TW7-16B4) (BD Biosciences). As amostras foram adquiridas em um
citômetro de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences) ou citômetro de fluxo
Cytoflex (Beckman Coulter), e os dados foram analisados usando o software
FlowJo, versão 7.6.5 (TreeStar).
Enriquecimento de células JAG1+ . As MNCs hepáticas foram incubadas
com anticorpo JAG marcado com PE (clone HMJ1-29, eBioscience) durante
30 minutos em gelo. Esferas magnéticas anti-PE (Miltenyi Biotec) foram
adicionadas às células coradas. As células JAG1+ foram enriquecidas usando
coluna LS (Miltenyi Biotec).
scRNA-Seq. As amostras de fígado foram homogeneizadas com um
Dissociador MACS suave (Miltenyi), filtradas através de filtros celulares de 70
ÿm e depois centrifugadas a 400g através de um gradiente de densidade
Percoll (40% e 70%). As células imunes foram coletadas e classificadas com
BD FACSMelody para isolar CD45+CD11b+Ccr2+Ly6G–
MoMFs do fígado.

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Figura 9. Modelo que descreve as alterações dinâmicas dos MoMFs e sua interação com outras células, promovendo a resolução da lesão necrótica hepática. O
fígado tem grande capacidade de reparar e eliminar lesões necróticas após lesão hepática aguda imunomediada. No estágio inicial da lesão hepática, os MoMFs JAG1 +, que
são induzidos por CCL2 derivado de hepatócitos, ajudam a construir paredes de hepatócitos SOX9 + resistentes à morte celular para encapsular as áreas necróticas e
subsequentemente proteger os hepatócitos não danificados de lesões adicionais. Na fase posterior, o ambiente necrótico (hipóxia e hepatócitos mortos) induz MoMFs C1q+ e Pdgfb+
MoMFs para encapsular as lesões necróticas. Os MoMFs C1q+ desempenham um papel importante na remoção de células mortas e tecidos necróticos, enquanto os MoMFs Pdgfb+
induzem a ativação de HSCs ÿ-SMA+ que comprimem a cápsula das lesões necróticas para facilitar sua eliminação. Os hepatócitos em áreas não danificadas proliferam e se expandem,
o que pode ajudar ainda mais a contrair a cápsula das lesões necróticas. DHGNA, doença hepática gordurosa não alcoólica.

Os MoMFs classificados de fígados de camundongos foram lavados duas vezes com
PBS. A concentração e viabilidade celular foram avaliadas utilizando o contador de células de
fluorescência dupla LUNA-FL (Logos Biosystems). Os MoMFs classificados foram carregados nas
pistas de acordo com o Guia do Usuário de Célula Única 10x Genomics 3ÿ com uma única pista de
captura por amostra visando a recuperação de 6.000 células por pista. O particionamento celular
foi concluído com sucesso com consistência de emulsão uniforme e a PCR de transcrição reversa
foi realizada durante a noite. Todas as etapas subsequentes de preparação da biblioteca e controle
de qualidade foram realizadas usando o kit 10 × Chromium Next GEM Single Cell 3 ÿ de acordo com
as instruções do fabricante. O sequenciamento foi realizado em um Illumina NextSeq 500 no National
Cancer Institute Center for Cancer Research Genomics Core (Bethesda, Maryland, EUA). Todas
as amostras tiveram excelente rendimento de sequenciamento. As leituras de RNA das bases Q30
estavam acima de 86%. Os arquivos FASTQ e o processamento de dados foram realizados usando
O pacote Seurat (versão 4.0) foi usado para analisar ainda mais os dados do scRNA-
Seq (61). Depois de remover células moribundas com genes mitocondriais elevados,
dupletos e células de baixa qualidade, 13.222 células que expressaram mais de 500
contagens de identificadores moleculares únicos (UMI) foram utilizadas para análise
posterior. As contagens de UMI para cada gene foram normalizadas e genes altamente
variáveis foram identificados através da função SCTransform usando parâmetros padrão
(62). Os dados foram integrados à função Integra-grateData do pacote Seurat. Os
primeiros 30 PCs e resolução 0,3 foram utilizados para o clustering através das funções
FindNeighbors e FindClus-ters. A expressão gênica diferencial foi avaliada usando a
função FindMarker. Os gráficos t-SNE, gráficos de violino, gráficos de pontos, gráficos de
características e mapas de calor foram gerados por R.

o pipeline 10x Genomics CellRanger (versão 6.0.0). As leituras sequenciadas foram alinhadas à
sequência de referência do mouse 10x Genomics (refdata-gex-mm10-2020-A).
Coloração imuno-histoquímica no fígado. Após a recuperação do epítopo induzida
pelo calor em tampão citrato (pH 6,0), as secções embebidas em parafina foram coradas
com anticorpos primários conforme listado na Tabela Suplementar 1 e visualizadas por
DAB ou AEC. Para coloração com pSTAT3, as secções foram coradas após recuperação
de epítopos induzida por calor em EDTA 1 mM (pH 8,0).

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A coloração de BrdU foi determinada por imunocoloração com o kit de detecção BrdU In-Situ Estatisticas. Os resultados são expressos como médias ± DP. Todas as análises estatísticas

(catálogo 551321, BD Biosciences) foram realizadas utilizando o software GraphPad Prism (versão 7.0a). Para comparar os valores

Coloração por imunofluorescência. Os ratos foram perfundidos com PFA a 4%; os tecidos obtidos entre os dois grupos foi realizado o teste t de Student .
foram obtidos e fixados em PFA a 4% por mais 2 horas e imersos em sacarose a 30% por 2 dias. Os dados de múltiplos grupos foram comparados com ANOVA unidirecional seguido pelo pós-teste

Os tecidos foram embebidos em composto OCT e seccionados (10 ÿm). As seções foram coradas de Tukey, conforme apropriado. P < 0,05 foi considerado significativo.

com anticorpos primários listados na Tabela Suplementar 1. Anticorpos secundários marcados Aprovação do estudo. Os cuidados e experimentos com animais foram
com fluorescência (CST) foram usados para visualizar os anticorpos primários. As imagens foram conduzidos de acordo com as diretrizes e protocolos aprovados pelo Comitê de
obtidas utilizando um microscópio confocal LSM 710 (Zeiss). Cuidados e Uso de Animais da NIAAA. Todos os animais foram tratados de acordo

com as diretrizes do NIH.

Disponibilidade de dados. Os dados do scRNA-Seq foram depositados no banco de dados

Visualização de hipóxia. A hipóxia tecidual foi visualizada pelo kit Hypoxy-probe Biotin de Gene Expression Omnibus do NCBI (GEO GSE229498). Os valores para todos os pontos de dados

acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, os ratos foram tratados com 60 mg/kg encontrados nos gráficos podem ser encontrados no arquivo de valores de dados de suporte.

(ip) de pimonidazol HCl. Os tecidos foram coletados 1 hora depois e corados com o anticorpo

fornecido no kit. Contribuições do autor

Coloração de imunofluorescência multiplex. A coloração de imunofluorescência multiplex
com mais de 3 marcadores foi realizada conforme descrito anteriormente (63). As imagens
adquiridas foram processadas e analisadas usando Image J FIJI (60) e o plugin FIJI HyperStackReg
V5.682, Ilastik (versão 1.3.3post3) (64) e CellProfiler (versão 4.2.4) (65) para contagem e
quantificação de células como descrito anteriormente (66, 67) (Figura Suplementar 23).
Coloração TUNEL. A coloração TUNEL nas secções do fígado foi realizada utilizando o Kit
de Detecção de Apoptose In Situ ApopTag Peroxidase (catálogo S7100, Sigma-Aldrich) de acordo
com as instruções do fabricante.
Ensaio de fagocitose. O ensaio de fagocitose foi realizado utilizando um kit da
Cayman Chemical. Resumidamente, após coloração com marcador de superfície, os
MoMFs foram incubados com esferas de látex marcadas com FITC durante 30
minutos a 37°C. Após a lavagem, as células foram analisadas por citometria de fluxo.
RT-qPCR. O ARN total foi purificado a partir de MoMFs ou tecidos hepáticos utilizando o
Reagente TRIzol (Thermo Fisher Scientific) de acordo com as instruções do fabricante. Os RNAs
(1 ÿg do total) foram transcritos reversamente em cDNA usando um kit de transcrição reversa de
cDNA de alta capacidade (Thermo Fisher Scientific). Os níveis de expressão de mRNA foram
medidos por RT-qPCR usando um sistema ABI7500 RT-PCR (Applied Biosystems). O 18S rRNA
DF e XX projetaram e realizaram a maioria dos experimentos com
modelos de camundongos e escreveram o artigo. YG conduziu alguns
experimentos com modelos de camundongos e analisou os dados do
scRNA-Seq. AG ajudou a realizar os experimentos de coloração
imunofluorescente multiplex e a quantificar as imagens. CC e XWW
realizaram experimentos de scRNA-Seq e analisaram dados de scRNA-
Seq. HL, YH, HW e HP conduziram algumas colorações imunofluorescentes
e experimentos com modelos de camundongos. CJ, SPC, FT e GK
ajudaram na análise dos dados, forneceram informações intelectuais
relevantes e editaram o manuscrito. BG obteve financiamento,
supervisionou todo o projeto e escreveu o artigo. Todos os autores aprovaram o manu
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo programa intramural do NIAAA, NIH (para
BG). Os autores agradecem a Robert F. Schwabe (Columbia University,
Nova York, Nova York, EUA) por fornecer camundongos LratCre .
Os autores agradecem ao Single Cell Analysis Facility (SCAF), NCI, NIH,
por fornecer serviços de sequenciamento unicelular.

foi usado como gene de controle doméstico. Endereço para correspondência: Bin Gao, Laboratory of Liver Diseas-es,
NIAAA/NIH, 5625 Fishers Lane, Bethesda, Maryland 20892, EUA. E-mail:
Primers usados para RT-qPCR estão listados na Tabela Suplementar 2. bgao@mail.nih.gov.

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