Revista Brasileira de Cincias Farmacuticas Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences vol. 39, n. 1, jan./mar.

, 2003

Administrao oral de peptdeos e protenas: II. Aplicao de mtodos de microencapsulao

Catarina Silva1, Antnio Ribeiro2, Domingos Ferreira3, Francisco Veiga1*
Laboratrio de Tecnologia Farmacutica, Faculdade de Farmcia, Universidade de Coimbra, Coimbra, Portugal, 2 Laboratrio de Tecnologia Farmacutica, Instituto Superior da Cincias da Sade do Norte, Gandra, Paredes, Portugal, 3Laboratrio de Tecnologia Farmacutica, Faculdade de Farmcia, Universidade do Porto, Porto, Portugal
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*Correspondncia: F. Veiga Faculdade de Farmcia Universidade de Coimbra 3000 Coimbra Portugal E-mail: fveiga@ci.uc.pt

A escolha de um mtodo de Microencapsulao adequado para promover o aumento da biodisponibilidade oral de frmacos peptdicos depende das caractersticas fsico-qumicas do frmaco a encapsular, das condies operacionais e dos polmeros utilizados. Nesta abordagem feita uma avaliao dos diversos mtodos de Microencapsulao e sua aplicao na administrao oral de peptdeos e protenas. As tcnicas de Microencapsulao que utilizam polmeros de origem natural, no recorrendo a condies drsticas de preparao, so consideradas opes privilegiadas.

Unitermos: Administrao oral Frmacos peptdicos Microencapsulao Polmeros naturais

INTRODUO
Na primeira parte desta reviso (Silva et al., 2002b) foram descritos os obstculos associados administrao oral de peptdeos e protenas, bem como as estratgias possveis a adotar para alcanar esse fim. A administrao oral de frmacos peptdicos limitada, principalmente, pela intensa degradao enzimtica no trato gastro-intestinal (GI) e fraca permeabilidade atravs da mucosa intestinal. Os inconvenientes associados administrao parenteral tm impulsionado o recurso a vias de administrao alternativas. Com o objetivo de aumentar a biodisponibilidade oral de peptdeos e protenas foram desenvolvidas diversas estratgias, nomeadamente, a utilizao de inibidores das enzimas proteolticas (BernkopSchnurch, 1998), promotores da absoro (Fix, 1996), modificao qumica (Bundgaard, 1992) e formulaes farmacuticas especficas, como sistemas particulados (Allemann, Leroux, Gurny, 1998), emulses (Sarciaux,

Acar, Sado, 1995; Trenktrog, Muller, Seifert, 1995), sistemas vetorizados (Carino, Mathiowitz, 1999; Rubinstein et al., 1997; Shah, Shen, 1996) e sistemas bioadesivos (Lehr, 2000; Lueben et al., 1997). A combinao de vrias estratgias, de forma a ultrapassar ambas as barreiras absoro poder ser vantajosa (Bernkop-Schnurch, 1998; Geary, Schlameus, 1993; Hosny et al., 1998; Morishita et al., 1992; Suzuki et al., 1998). Na primeira parte da reviso, foi concludo que a microencapsulao uma alternativa vlida, pelo fato de as micropartculas constiturem sistemas nas quais diferentes estratgias podem ser adaptadas de forma a proteger os frmacos da degradao enzimtica e aumentar a permeabilidade atravs do epitlio intestinal. A estrutura complexa das protenas, responsvel pela sua atividade biolgica, leva a problemas de formulao porque so mltiplos os parmetros que podem causar a sua alterao qumica ou fsica (Chen, 1992). Por isso, na microencapsulao de frmacos peptdicos a es-

C. Silva, A. Ribeiro, D. Ferreira, F. Veiga

colha do mtodo particularmente condicionada pela garantia da estabilidade do material a encapsular. importante conhecer as alternativas disponveis e a sua aplicabilidade na encapsulao dos frmacos peptdicos, conforme ser revisto. Sero, ainda, apresentados exemplos de mtodos de microencapsulao aplicveis administrao oral de frmacos peptdicos. Numa terceira parte desta reviso (Silva et al., 2002a), os conceitos apresentados nas primeira e segunda partes, sero aplicados na administrao oral da insulina, frmaco que devido sua importante ao biolgica e ao seu impacto social, utilizado como referncia.

DEFINIES EM MICROENCAPSULAO
As micropartculas so pequenas partculas slidas e esfricas com tamanho que varia entre 1 e 1000 m (Arshady, 1991; Burgess, Hickey, 1994). Subdividem-se em microcpsulas, sistemas reservatrio contendo a substncia ativa revestida por polmeros de espessuras variveis, que constituem a membrana da cpsula, e em microsferas, sistemas matriciais nos quais o frmaco se encontra uniformemente disperso e/ou dissolvido numa rede polimrica (Giunchedi, Conte, 1995; Kas, Oner, 2000). Pode-se fazer a distino entre microcpsulas polinucleares e mononucleares conforme o ncleo esteja ou no dividido no interior da partcula revestida. As microesferas podem ser homogneas ou heterogneas conforme a substncia ativa se encontre no estado molecular (dissolvido) ou na forma de partculas (suspenso) (Figura 1) (Aftabrouchad, Doelker, 1992).

dois sistemas que, por vezes, so includos na classificao das micropartculas so os lipossomas e as emulses lipdicas, tambm conhecidos por microesferas lipdicas. Porm, estes sistemas no satisfazem a definio pelo fato de no serem slidos: um semi-slido e outro lquido (Burgess, Hickey, 1994). A tecnologia da microencapsulao tem sido utilizada em diversas indstrias, como na agrcola, alimentar, de produtos domsticos, mdica, grfica e cosmtica. Na indstria farmacutica, as aplicaes so muito variadas: mascararamento de sabores ou odores, converso de lquidos em slidos, proteo em relao aos agentes atmosfricos (umidade, luz, calor e/ou oxidao), reduo ou eliminao da irritao gstrica ou efeitos secundrios provocados por alguns frmacos, reduo da volatilidade, administrao de frmacos incompatveis, melhoramento das caractersticas de escoamento de ps, facilitao do manuseio de substncias txicas, auxilio disperso de substncias insolveis em gua em meios aquosos e produo de formas farmacuticas de liberao controlada, sustentada e vetorizada (Burgess, Hickey, 1994; Kas, Oner, 2000). As vantagens mais especficas so: liberao precisa de baixas doses de frmacos potentes, reduo da concentrao do frmaco em outros locais que no os rgos ou tecidos alvo e proteo dos compostos lbeis, antes e depois da administrao, at exercerem a sua ao farmacolgica (Burgess, Hickey, 1994). As nanopartculas tm sido usadas como adjuvantes em vacinas e como formas de liberao para a administrao parenteral de citostticos e antibiticos, administrao oral de corticosterides e peptdeos e em aplicaes oftlmicas (Couvreur, Dubernet, Puisieux, 1995; Kreuter, 1994). O mtodo ideal de microencapsulao deve ser simples, reprodutvel, rpido, fcil de se transpor escala industrial e deve ser pouco dependente das caractersticas de solubilidade do frmaco e polmero (Giunchedi, Conte, 1995).

MTODOS GERAIS DE MICROENCAPSULAO

FIGURA 1 - Modelo da estrutura dos diferentes tipos de micropartculas (Adaptado de Aftabrouchad, Doelker, 1992). A definio de micropartculas pode ser ampliada para incluir as nanopartculas, semelhantes s anteriores, mas com dimenses de 10 a 1000 nm, caracterizando um sistema coloidal (Allman, Gurny, Doelker, 1993). Outros Na Tabela I esto resumidos diferentes mtodos de preparao de micro e nanopartculas. Tcnicas de revestimento As tcnicas de revestimento em microencapsulao incluem o revestimento clssico em turbina de drageamento, a centrifugao e a fluidizao. No revestimento clssico, so empregadas turbinas de drageamento aquecidas, em que os frmacos de natureza slida sofrem

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TABELA I - Mtodos de preparao de micro e nanopartculas Tcnica Tcnicas de revestimento Revestimento em turbina ou por centrifugao Fluidizao Partculas obtidas Microcpsulas Microcpsulas Referncias (Bakan, 1994; Burgess, Hickey, 1994) (Aftabrouchad, Doelker, 1992; Burgess, Hickey, 1994) (Aftabrouchad, Doelker, 1992; Giunchedi, Conte, 1995)

Nebulizao, spray-chilling e spray-desolvation

Microcpsulas, microesferas

Coacervao Extruso/ solidificao Emulsificao/ solidificao Secagem em fase lquida

Microcpsulas, nanocpsulas (Kas, Oner, 2000; Luzzi, 1970) Microcpsulas (Burgess, Hickey, 1994; Donbrow, 1992)

Microesferas, microcpsulas, (Arshady, 1991; nanoesferas, nanocpsulas ODonnell, McGinity, 1997) Nanoesferas Nanocpsulas Nanoesferas (Kreuter, 1994; QuintanarGuerrero et al., 1998) (Couvreur, Dubernet, Puisieux, 1995) (Couvreur, Dubernet, Puisieux, 1995; QuintanarGuerrero et al., 1998) (Quintanar-Guerrero et al., 1998) (Carino, Jacob, Mathiowitz, 2000; Hirosue et al., 2001)

Nanoprecipitao Deposio interfacial Salting-out

Difuso de solvente Inverso de fases

Nanocpsulas, nanoesferas Microesferas, nanoesferas

Reticulao qumica e trmica Hot-melt Interao inica

Microesferas, microcpsulas, (Arshady, 1990; Burgess, nanocpsulas Hickey, 1994) Microesferas, microcpsulas Microesferas, microcpsulas (Aftabrouchad, Doelker, 1992) (Kim et al., 2002; Lim, Wan, Thai, 1997; Poncelet et al., 1992; Wan, Heng, Chan, 1992) (Burgess, Hickey, 1994; Kreuter, 1994) (Burgess, Hickey, 1994) (Giunchedi, Conte, 1995)

Polimerizao

Polimerizao de emulso Polimerizao de suspenso Polimerizao interfacial Spray-polycondensation

Nanoesferas Microesferas, nanopartculas Microesferas

Microcpsulas, nanocpsulas (Hincal, Kas, 2000)

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rotao e, sobre as quais, nebulizado ou vertido o material de revestimento fundido ou dissolvido (Burgess, Hickey, 1994). No revestimento por centrifugao utilizada uma fora centrfuga para lanar as partculas do frmaco contra massas polimricas presentes nos mltiplos orifcios de uma centrfuga rotativa. Os frmacos encapsulados formam microcpsulas embrinicas, que so, posteriormente, endurecidas pelo ar ou por um agente de endurecimento (Bakan, 1994). O revestimento de pequenas partculas permite um perfil de liberao mais adequado do que o dos comprimidos revestidos, alm de que possvel obter vrios lotes de micropartculas com diferentes espessuras de revestimento e mistur-los para obter diferentes perfis de liberao controlada (Burgess, Hickey, 1994). Na fluidizao ou processo de Wurster, as partculas slidas de frmaco so suspensas numa corrente de ar quente ascendente formando um leito fluidizado. As partculas so revestidas por nebulizao de uma soluo do polmero, como teres da celulose, pectina e polimetacrilatos. Esta tcnica exige, normalmente, a utilizao de uma quantidade importante de substncia ativa, mas permite obter um revestimento de espessura mais uniforme do que o revestimento clssico. Podem surgir problemas com os solventes orgnicos inflamveis pelo risco de exploso na cmara fluidizante (Aftabrouchad, Doelker, 1992; Burgess, Hickey, 1994). Nebulizao, spray-chilling e spray-desolvation Na nebulizao ou spray-drying, o frmaco disperso ou dissolvido numa soluo orgnica ou aquosa do polmero e o sistema nebulizado numa corrente de ar quente. Aps a evaporao do solvente, as micropartculas secas so recuperadas. uma tcnica simples, rpida, permitindo a obteno da forma final sem ter que recorrer a lavagens para isolar as micropartculas ou eliminar resduos de solventes. Tem como inconveniente o uso de calor, capaz de afetar as propriedades de polmeros e frmacos termo-sensveis (Aftabrouchad, Doelker, 1992). Por nebulizao, podem se formar microcpsulas ou microesferas, conforme o frmaco est disperso ou dissolvido na soluo de polmero. Os fatores de formulao que influenciam as caractersticas das micropartculas so a concentrao em polmero, a temperatura e a velocidade de alimentao do sistema. A eficincia de encapsulao varia normalmente entre 70 e 85%, independentemente dos parmetros do processo (Giunchedi, Conte, 1995). Tanto os frmacos hidrossolveis como lipossolveis podem ser encapsulados, contudo, enquanto que a liberao dos primeiros apresenta frequentemente um burst

effect inicial elevado, para os segundos a liberao tem uma cintica prxima de ordem zero. vasta a gama de polmeros utilizados: polisteres biodegradveis, polianidridos, derivados da celulose, polmeros acrlicos, lcool polivinlico (PVA), polivinilpirrolidona (PVP), albumina, ceras, siloxanos e quitosanas. A tcnica de nebulizao permite obter elevada eficincia de encapsulao, o tempo de preparao reduzido e possvel obter liberao gradual de frmaco. Entre as desvantagens da nebulizao encontram-se o custo do equipamento e a dificuldade em obter partculas esfricas (Giunchedi, Conte, 1995). Outro inconveniente a elevada formao de fibras devido a ligaes intermoleculares entre as cadeias polimricas e incapacidade da fora de nebulizao em quebrar o lquido em gotas (Bodmeier, Chen, 1988). De modo idntico, na tcnica de spray-chilling ou spray-congealing, o frmaco dissolvido ou disperso num veculo fundido nebulizado, mas, neste caso, em uma corrente de ar frio, o que causa a solidificao do veculo e a formao das micropartculas. Tal como a nebulizao, esta tcnica rpida e ocorre num s passo, alm de que no envolve a utilizao de gua ou solventes orgnicos. Foram utilizados steres de cidos graxos como materiais para a matriz (Giunchedi, Conte, 1995). A tcnica de spray-desolvation tambm utiliza um nebulizador. Baseia-se na solubilidade/miscibilidade do solvente do polmero num no-solvente. O solvente com o polmero dissolvido nebulizado, sob a forma de gotas, para a superfcie do no-solvente obtendo-se partculas slidas. Deste modo no se utiliza o aquecimento para evaporao do solvente como na nebulizao (spraydrying). Este mtodo aplicvel a frmacos sensveis ao calor, mesmo a baixas temperaturas ou por perodos curtos, como alguns peptdeos e protenas, tendo sido utilizados como polmeros o PVA, cido polilctico (PLA) e cido poli(lctico-co-gliclico) (PLGA) (Giunchedi, Conte, 1995). Coacervao A coacervao ou separao de fases consiste na obteno, a partir de uma soluo contendo uma macromolcula dispersa, de duas fases lquidas imiscveis, uma fase de coacervado, em que a macromolcula est presente em elevada concentrao e uma fase de equilbrio, em que a mesma est em baixa concentrao. Se apenas est presente uma nica macromolcula este processo designado por coacervao simples e quando esto presentes duas ou mais molculas de carga oposta referido como coacervao complexa. A coacervao simples induzida por uma alte-

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rao de condies que causam a dessolvatao da macromolcula, como a adio de um no-solvente, a adio de micro-ons ou alteraes da temperatura, que promovem as interaes macromolcula-macromolcula em detrimento das interaes macromolcula-solvente. Como exemplos temos a adio de lcool ou sulfato de sdio a uma soluo aquosa de gelatina (Luzzi, 1970). A coacervao complexa induzida atravs da criao de foras electrostticas entre as macromolculas, como por exemplo, nas interaes gelatina-accia, Carbopol-gelatina, pectina-gelatina, gelatina-gelatina e carboximetilcelulose sdica-gelatina (Burgess, Hickey, 1994). A deposio do coacervado em volta de pequenas partculas insolveis no lquido de equilbrio leva formao de cpsulas embrinicas, que, aps gelificao, originam as microcpsulas (Kas, Oner, 2000). A coacervao em fase aquosa apenas pode ser usada para encapsular materiais insolveis em gua. A coacervao em fase orgnica permite a encapsulao de material hidrossolvel, mas exige a utilizao de solventes orgnicos (Kas, Oner, 2000). Esta tcnica complexa, em termos operacionais, e necessita de controle minucioso das condies experimentais. Os problemas mais comuns so a aglomerao massia a que as micropartculas so sujeitas e, no caso da manipulao em meios no-aquosos, os custos elevados relacionados com a reciclagem de no-solventes e eliminao de solventes residuais (Aftabrouchad, Doelker, 1992). Em alguns casos, necessria a estabilizao das microcpsulas recorrendo a temperatura elevada, valores de pH extremos ou agentes de reticulao, o que limita a encapsulao de materiais termo- e quimicamente lbeis como as protenas e polipeptdeos (Burgess, Hickey, 1994). Apresenta a vantagem de permitir a obteno de rendimentos elevados na encapsulao de frmacos hidrossolveis (Aftabrouchad, Doelker, 1992). A separao de fases em leo pode ser utilizada na preparao de micropartculas de PLGA. Os frmacos hidrossolveis so dissolvidos em gua e dispersos na soluo orgnica do polmero (emulso A/O) e os frmacos hidrofbicos podem ser dissolvidos ou dispersos na soluo do polmero. Em seguida, adicionado um no-sovente orgnico que induz a separao de fases (Jain, 2000). Extruso/solidificao No mtodo de extruso, o material do ncleo na forma lquida, fundido ou em soluo, lanado atravs do orifcio de um tubo fino ou seringa para formar microgotas, cujo tamanho ser dependente do dimetro do orifcio e da velocidade de sada do material. As gotas contm o mate-

rial de revestimento ou este adicionado quando as gotas caem ou so injetadas. A solidificao do material de revestimento pode ocorrer por evaporao do solvente, difuso do solvente ou reao qumica (Donbrow, 1992). Este mtodo tem sido aplicado na obteno de micropartculas de alginato de clcio, inicialmente desenvolvidas para a encapsulao de clulas vivas (Lim, Sun, 1980), j que o processo utilizado no envolve condies agressivas que possam ser nocivas para as clulas. O mtodo baseia-se na gelificao ionotrpica do alginato e consiste em incorporar o material a encapsular numa soluo de alginato de sdio, para depois a mistura sofrer extruso gota a gota, atravs de uma pipeta de calibre reduzido ou de uma seringa, para uma soluo de cloreto de clcio (Burgess, Hickey, 1994; Kim, Lee, 1992). O alginato gelifica aps ligao dos ons bivalentes de clcio aos blocos de cido gulurnico das cadeias de alginato constituindo o modelo da caixa de ovos (Gombotz, Wee, 1998). Sendo as partculas obtidas relativamente grandes, foram desenvolvidas variantes do mtodo. Algumas destas consistem na utilizao de um sistema de presso para forar a sada do alginato atravs da pipeta, um sistema de vibrao para dispersar as gotas da extremidade da pipeta com o qual se obtiveram partculas com menos de 300 m e um mtodo de nebulizao que originou partculas com menos de 1 m (Burgess, Hickey, 1994). As gotas de gel podem ser reticuladas pela adio de poli(L-lisina) ou quitosana para diminuir a eroso da matriz de alginato e retardar a liberao do composto encapsulado (Lemoine et al., 1998; Murata et al., 1993). A preparao de microesferas de pectinato de clcio tambm foi efectuada por este processo (Sriamornsak, 1998), em que o alginato foi substitudo pela pectina. Emulsificao/solidificao Podem-se preparar micropartculas por formao prvia de uma emulso, cuja fase interna, na forma de microgotas, solidificada para originar as micropartculas (Donbrow, 1992). A emulsificao pode ser direta ou indireta, ocorrendo, neste caso, uma inverso de fases. Quando est presente a fase externa correta, o tamanho da gota pode ser reduzido para um valor desejado por intermdio de foras de disperso. A solidificao pode ocorrer por processos muito variados a seguir descritos. Secagem em fase lquida O mtodo de secagem em fase lquida, tambm designado mtodo de evaporao de solvente ou de emulsificao/evaporao de solvente, envolve a preparao de uma soluo orgnica do polmero contendo o

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frmaco dissolvido e a sua disperso sob a forma de microgotas num meio de no-solvente (meio de suspenso), um lquido em que o polmero seja insolvel, geralmente estabilizado com um agente de suspenso para manter a individualidade das gotas. Em seguida, ocorre a eliminao do solvente por evaporao (Arshady, 1991). O no-solvente dever ter um ponto de ebulio superior ao do solvente orgnico e dever ser imiscvel com este (Aftabrouchad, Doelker, 1992). A gua e o diclorometano so os no-solventes e solventes, respectivamente, mais utilizados. Podem ser utilizados diferentes tipos de emulses, O/A, A/O, A/O/A ou O/A/O. As emulses O/A so vantajosas porque utilizam a gua como no-solvente, ou seja, o processo econmico e no necessita de reciclagem, as partculas so fceis de lavar e raramente aglomeram (Aftabrouchad, Doelker, 1992). A grande limitao a sua utilizao exclusiva para frmacos lipossolveis, pelo que surgiram como alternativas a utilizao de sistemas anidros do tipo O/O e as emulses mltiplas A/O/A, A/O/O ou A/O/O/O, que permitem obter rendimentos de encapsulao de substncias ativas hidrossolveis mais elevados (ODonnell, McGinity, 1997). Na microencapsulao de protenas utilizando emulses mltiplas A/O/A, em que os frmacos so dissolvidos na fase aquosa interna, existe uma tendncia para a sua acumulao na interface solvente-gua, ocorrendo freqentemente, a sua desnaturao ou agregao (Sah, 1999). Para evitar este efeito, que pode alterar a sua atividade, foram desenvolvidos mtodos no-aquosos, que utilizam um sistema do tipo slido em leo em gua (S/O/ A) (Carrasquillo et al., 2001; Castellanos et al., 2001), em que a protena no estado slido dispersa diretamente no solvente do polmero. Os processos de secagem em fase lquida utilizam, muitas vezes, polisteres biodegradveis, como so os polmeros de hidroxicidos, a saber, PLA, PLGA, cido poligliclico (PGA), poliidroxibutirato (PHB), policaprolactona (PCL), policarbonato de etileno (PEC), policarbonato de propileno (PPC) e poli(carbonato de etileno-cocarbonato de propileno) (PEPC) (Arshady, 1991). Tambm foi utilizado como polmero um homopolipeptdeo modificado com segmentos de polisssarcosina, que so solveis quer em gua, quer em solventes orgnicos (Kidchob, Kimura, Imanishi, 1996). A granulometria das micropartculas pode ser controlada por vrios parmetros (viscosidade, velocidade de agitao e estabilizador de suspenso), podendo variar desde 100 nm a 2 mm (Arshady, 1991). A homogeneizao da emulso constitui uma etapa determinante para obter partculas submicrnicas, j que cada gota emul-

sificada origina uma partcula de polmero. A ultrassonicao e os microfluidizadores permitem obter gotas com um tamanho inferior a 0,5 mm (Quintanar-Guerrero et al., 1998). Vrios fatores influenciam a eficincia de encapsulao e a morfologia das micropartculas preparadas a partir de emulses A/O/A, como, a estabilidade da emulso primria (Schugens et al., 1994), a adio de tampes ou sais fase aquosa interna ou externa (Herrmann, Bodmeier, 1995), a adio de tensoativos emulso primria (Soriano et al., 1995) e o volume de fase aquosa interna (Crotts, Park, 1995). O solvente pode, ainda, ser eliminado recorrendo liofilizao e nebulizao (Aftabrouchad, Doelker, 1992). Entre os aspectos mais importantes a considerar na produo em larga escala, por este mtodo, encontram-se a escolha do solvente orgnico e a sua remoo do produto acabado (Arshady, 1991). A transposio escala industrial dificultada no caso das nanopartculas, devido elevada energia que necessrio aplicar durante a homogeneizao (Soppimath et al., 2001). Extrao de solvente Na extrao de solvente, o solvente do polmero escolhido de forma a ser miscvel com o no-solvente, por exemplo, acetona com gua ou diclorometano com um leo mineral, de forma que as gotas de polmero percam o solvente para o meio de suspenso para serem convertidas nas respectivas partculas slidas (Arshady, 1991). A extrao de solvente conduz obteno de micropartculas com melhores caractersticas (forma mais regular, tamanho inferior, menor variao na granulometria) do que a evaporao de solvente, porm a maior porosidade das partculas, devida remoo mais rpida do solvente, aumenta a rea superficial (maior porosidade), o que leva a um efeito burst na liberao de frmaco (Giunchedi, Conte, 1995). Existem vrios mtodos baseados neste princpio, sobretudo na preparao de nanopartculas, como, a nanoprecipitao, a deposio interfacial, o salting-out, a difuso de solvente, a inverso de fases e a separao de fases. A nanoprecipitao e a deposio interfacial so mtodos idnticos baseados numa emulsificao espontnea da fase interna orgnica contendo o polmero dissolvido na fase externa aquosa, porm no primeiro caso so obtidas nanoesferas, enquanto que, no segundo caso, obtmse nanocpsulas. Na nanoprecipitao, o polmero (por exemplo, PLA, PCL, PLGA) e o frmaco so dissolvidos num solvente de polaridade intermdia e miscvel com a gua, como a acetona ou o etanol. Esta fase injetada ou

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vertida para uma soluo aquosa contendo um agente estabilizador (por exemplo, lcool polivinlico ou poloxmero 188), sob agitao. A deposio do polmero na interface entre a gua e o solvente orgnico, causada por uma rpida difuso do solvente, leva formao instantnea de uma suspenso coloidal (Kreuter, 1994; QuintanarGuerrero et al., 1998). Na deposio interfacial introduzido um quinto componente, de natureza oleosa, miscvel com o solvente do polmero, mas imiscvel com a mistura de solvente/no-solvente. O polmero deposita-se na interface entre as gotas de leo finamente dispersas e a fase aquosa dando origem a nanocpsulas (Couvreur, Dubernet, Puisieux, 1995). Contudo, a utilizao de solvente orgnico aumenta o tamanho mdio das partculas (Wehrle, Magenheim, Benita, 1995) e aumenta o risco de toxicidade. A dificuldade em escolher um sistema frmaco/polmero/ solvente/no-solvente, que permita obter uma eficincia de encapsulao adequada, constitui um inconveniente de ambos os mtodos (Allman, Gurny, Doelker, 1993). Por outro lado, necessrio um controle minucioso das condies operacionais e a encapsulao de frmacos hidrossolveis no eficiente (Kreuter, 1994; Quintanar-Guerrero et al., 1998). Na nanoprecipitao e na deposio interfacial utiliza-se soluo aquosa como meio de disperso e, por isso, designam-se por mtodos de difuso de solvente em gua (water solvent diffusion, WSD). Com o objetivo de melhorar a eficincia de encapsulao, sobretudo para frmacos hidrossolveis, os mtodos de WSD foram modificados originando o mtodo de difuso de solvente em leo (oil solvent diffusion, OSD), no qual o meio de disperso era um leo e a soluo de polmero era constituda por PLGA, frmaco, acetona e metanol. Obtiveram-se nanoesferas e a eficincia de encapsulao da elcatonina, um peptdeo hidroflico, foi de 44,5%, comparativamente a um valor de 19,5% obtido por utilizao da gua como meio de disperso (Kawashima et al., 1998). Nos mtodos de WSD, a emulso espontnea devido rpida difuso do solvente na superfcie das gotas, porm, no mtodo de OSD, essa rpida difuso no ocorre sendo necessrio adicionar um tensoativo fase orgnica contendo o polmero (Takeuchi, Yamamoto, Kawashima, 2001). Uma variante deste mtodo baseia-se na separao de um solvente miscvel na gua, normalmente a acetona, a partir de solues aquosas por um efeito de salting-out. O polmero e o frmaco so dissolvidos em acetona e esta soluo emulsificada mediante agitao mecnica num gel aquoso contendo um agente de salting-out (eletrlitos, como o cloreto de magnsio, cloreto de clcio e acetato de magnsio ou no-eletrlitos, como a sacarose) e um estabilizador coloidal (lcool polivinlico, polivinilpirrolidona ou hidroxietilcelulose). A emulso O/A formada

diluda num volume suficiente de gua ou solues aquosas para promover a difuso da acetona para a fase aquosa, induzindo a formao de nanopartculas. Esta tcnica, utilizada na preparao de nanoesferas de PLA, polimetilmetacrilato e etilcelulose, permite encapsular elevadas quantidades de frmaco, origina rendimentos elevados, no requer temperaturas elevadas e facilmente transposta escala industrial. A grande desvantagem a sua aplicao exclusiva a frmacos lipoflicos e as indispensveis etapas de lavagem das partculas (Couvreur, Dubernet, Puisieux, 1995; Quintanar-Guerrero et al., 1998). Uma variante do salting-out a emulsificao/difuso de solvente, que consiste na dissoluo do polmero de encapsulao (por exemplo, PLA) num solvente parcialmente solvel em gua (por exemplo, carbonato de propileno), saturado com gua. Aps emulsificao desta fase, sob agitao vigorosa, numa soluo aquosa contendo um estabilizador, adiciona-se gua ao sistema, o que provoca a difuso do solvente para a fase externa e a formao de nanoesferas ou nanocpsulas, de acordo com a razo leo/polmero. O solvente eliminado por evaporao ou filtrao, de acordo com o seu ponto de ebulio. Este processo utiliza solventes orgnicos aceitveis do ponto de vista farmacutico, no necessita de passos de homogeneizao, conduz a rendimentos elevados, reprodutvel e facilmente transposto escala industrial, porm s eficaz na encapsulao de frmacos lipoflicos (Quintanar-Guerrero et al., 1998). Na microencapsulao por inverso de fases, uma soluo aquosa de frmaco adicionada a uma soluo orgnica diluda de polmero (por exemplo, diclorometano), para formar uma emulso. Esta emulso adicionada rapidamente a uma grande quantidade de um nosolvente (por exemplo, ter de petrleo), o que causa inverso de fases. As nanoesferas e microesferas formamse espontaneamente. Este mtodo foi aplicado na obteno de partculas de PLA e polianidridos (Carino, Jacob, Mathiowitz, 2000; Mathiowitz et al., 1997) e de PLGA (Hirosue et al., 2001). Reticulao qumica e trmica A solidificao das microgotas de uma emulso por reticulao freqentemente utilizada, sobretudo na preparao de microesferas de albumina, mas tambm foi usada na preparao de microcpsulas de hemoglobina e nanocpsulas de fibrinogneo, albumina, gelatina e polissacardeos (Arshady, 1990). A emulsificao da macromolcula numa fase oleosa, com obteno de uma emulso A/O, leva formao de gotas que sofrem reticulao covalente por ao do calor (> 50 C) ou por adio de um agente de reticulao qumico (por exemplo,

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glutaraldedo) (Burgess, Hickey, 1994). Para manter a individualidade das gotas durante o processo de reticulao pode ser necessrio adicionar um agente de suspenso/estabilizador ou um inibidor da coagulao (Arshady, 1990). A utilizao de calor e de agentes de reticulao, com potencial toxicidade, so fortes limitaes na aplicao deste mtodo encapsulao de frmacos peptdicos. Hot-melt No mtodo de hot-melt ocorre a transformao, por arrefecimento, de gotas polimricas fundidas, obtidas por emulsificao, em micropartculas slidas. Este mtodo tem sido aplicado na preparao de microesferas de polianidridos. As vantagens do processo residem na no utilizao de solventes orgnicos, no entanto, a sua aplicao limita-se a polmeros e substncias ativas termoestveis (Aftabrouchad, Doelker, 1992). Interao inica Alternativamente ao mtodo de extruso, pode recorrer-se a uma tcnica de emulsificao para obter micropartculas de alginato de clcio, segundo a qual uma soluo aquosa de alginato de sdio dispersa numa fase imiscvel e as gotas de gel formadas reagem com ons de clcio, que so adicionados fase externa, formando-se microesferas. possvel obter rendimento elevado de encapsulao de frmacos hidroflicos e partculas com tamanho inferior a 150 m (Wan, Heng, Chan, 1992). Este mtodo foi adaptado para obteno de microesferas de quitosana, tendo a gelificao sido induzida por NaOH 1 M (Lim, Wan, Thai, 1997), condies demasiado drsticas para a maioria dos frmacos bioativos. Por esta razo, a utilizao de NaOH foi, posteriormente, substituda pela utilizao de anins multivalentes, como, tripolifosfato, citrato e sulfato para reticular a quitosana emulsificada (Shu, Zhu, 2001). Tambm possvel obter micropartculas de alginato de clcio por emulsificao/gelificao interna. O clcio disperso sob a forma de um sal insolvel (por exemplo, carbonato de clcio) na soluo de alginato de sdio. Esta mistura emulsificada numa fase oleosa para obteno de uma emulso A/O e o clcio presente na fase interna liberado por acidificao da fase oleosa externa causando a gelificao do alginato (Poncelet et al., 1992). Este mtodo foi aplicado na encapsulao de frmacos lipoflicos utilizando uma emulso O/A/O, sendo passvel de ser transposto escala industrial (Ribeiro et al., 1999). Recentemente, foi desenvolvido um mtodo baseado na formao de uma emulso gua em silicone contendo um polmero catinico, o poliquaternio-24, na fase

aquosa (Kim et al., 2002). Esta emulso foi dispersa numa soluo de laurilsulfato de sdio, um tensoativo aninico, que complexa com o polmero catinico, solidificando as gotas da fase aquosa para conduzir formao de micropartculas. Este mtodo vantajoso porque no utiliza solventes orgnicos, nem agentes de reticulao txicos. Polimerizao Existem diversas tcnicas de polimerizao. A polimerizao in situ em sistema emulsionado um mtodo muito rpido, facilmente transponvel escala industrial (Kreuter, 1994). O monmero dissolvido na fase externa de uma emulso, normalmente uma soluo aquosa, na qual est presente um iniciador e um tensoativo numa concentrao superior concentrao necessria para a formao de micelas. A polimerizao ocorre no interior hidrofbico das micelas de tensoativo o qual o monmero e o iniciador se difundem. As partculas obtidas so muito pequenas, mas, normalmente, tm elevadas concentraes de monmero associado (Burgess, Hickey, 1994). O frmaco pode estar presente durante a polimerizao para ser aprisionado na rede polimrica, pode estar ligado covalentemente ao polmero ou pode ser adicionado aps a polimerizao para ser adsorvido superfcie do polmero (Kreuter, 1994). A polimerizao de emulso em fase externa orgnica no to utilizada porque requer elevadas quantidades de solventes orgnicos e tensoativos e tambm pela natureza txica dos monmeros utilizados (Kreuter, 1994). O mtodo foi empregado para obter nanoesferas de poliacrilamida, polialquilcianoacrilato e polimetilmetacrilato (Allman, Gurny, Doelker, 1993). Tambm se utilizou este mtodo para obter microesferas de polmeros acrlicos termossensveis (Ichikawa, Fukumori, 1997). Na polimerizao in situ em sistema suspenso, um monmero lquido insolvel em gua e o frmaco so dispersos numa fase aquosa, que pode conter um iniciador e estabilizadores. O polmero forma-se por reao entre os grupos funcionais de monmero, podendo, no entanto, ocorrer agregao. Por outro lado, a eliminao dos estabilizadores e aditivos usados para prevenir a coalescncia do produto final difcil de realizar. Por este mtodo foram obtidas partculas de poli(2-hidroxietilmetacrilato) (Burgess, Hickey, 1994). A polimerizao in situ interfacial caracteriza-se pela polimerizao de um monmero na interface de duas fases imiscveis. Se a fase interna for um lquido, possvel dispersar ou solubilizar o monmero nesta fase e emulsionar a mistura na fase externa qual se adiciona um co-reagente, que inicia a formao de polmero na super-

Administrao oral de peptdeos e protenas

fcie das gotas de lquido. A sua utilizao limitada pela toxicidade associada aos monmeros que no reagem, pela elevada permeabilidade do revestimento e pela fragilidade das membranas obtidas. No entanto, possvel obter partculas com tamanho e espessura de parede controlveis por utilizao de diferentes monmeros. O mtodo conduziu obteno de partculas de polialquilcianoacrilato, poli(Na,Ne-L-lisinoediltereftalamida), poliamidas, polifenilsteres e poliuretanos (Hincal, Kas, 2000). A spray-polycondensation envolve a condensao de um monmero hidrossolvel reativo e a formao do produto numa nica etapa. A polimerizao ocorre por nebulizao de uma soluo ou disperso do material do ncleo com monmeros e catalizador (Giunchedi, Conte, 1995).

APLICAO DA MICROENCAPSULAO ADMINISTRAO ORAL DE PEPTDEOS E PROTENAS

A Tabela II apresenta exemplos de microencapsulao de protenas e peptdeos destinados a serem administrados pela via oral. Nos casos em que no explcita a aplicao oral da formulao, feita referncia das suas potencialidades. Os estudos relativos microencapsulao da insulina sero enfocados numa terceira parte desta reviso (Silva et al., 2002a). Polisteres biodegradveis Os polmeros de PLGA tm sido extensivamente empregados na encapsulao de peptdeos e protenas pela sua excelente biocompatibilidade celular, biodegradabilidade e aprovao regulamentar (Jain, 2000). A utilizao do PLGA como veculo de antgenos para imunizao oral (Alpar, Eyles, Williamson, 1998), bem como na preparao de micropartculas contendo protenas com o objetivo de obter formulaes de liberao sustentada para administrao parenteral (Castellanos et al., 2001; Jain, 2000; Putney, Burke, 1998) muito freqente, porm os estudos destinados administrao oral de frmacos peptdicos bioativos no so to numerosos. A microencapsulao da albumina srica bovina (BSA) (Conway, Alpar, 1996; Rafati et al., 1997) e de um polipeptdeo de 33 aminocidos (Blanco-Prieto et al., 1998), em microesferas de PLGA, pelo mtodo de secagem em fase lquida, recorrendo a emulso mltipla, permitiu obter diferentes eficincias de encapsulao e perfis de liberao em pH 7,4, de acordo com as condies experimentais. A eficincia de encapsulao mxima ob-

tida foi de 96% (Rafati et al., 1997) e por aumento da hidrofobicidade da superfcie da partcula foi reduzido o burst effect inicial e a quantidade de protena liberada (Conway, Alpar, 1996). A concentrao de agente de estabilizao (PVA), a concentrao de PLGA e a homogeneizao so condies crticas (Rafati et al., 1997). A microencapsulao de um peptdeo de 7 aminocidos (Blanco-Prieto et al., 1998) levou obteno de baixas eficincias de encapsulao e a liberao in vitro quase imediata, pelo fato de a emulso primria no ser suficientemente estvel para que o peptdeo fique retido na fase interna. Este contato do peptdeo com a fase aquosa externa exigiu o desenvolvimento de estratgias eficazes, especificamente, a adio de um agente de estabilizao (ovalbumina) fase aquosa interna da emulso mltipla e, tendo em considerao a solubilidade do peptdeo, a fase aquosa interna foi mantida em pH bsico, em que o peptdeo solvel, enquanto que a fase aquosa externa foi mantida cida. A microencapsulao da ovalbumina em PLGA utilizando o mtodo da emulsificao mltipla/evaporao de solvente permitiu obter eficincias de encapsulao de 40%, sendo que 50% do frmaco ficou localizado na superfcie das micropartculas, que apresentaram tamanho inferior a 2 mm (Takahata et al., 1998). Por incubao, durante duas horas, em meios gstrico e intestinal artificiais, a ovalbumina encapsulada resistiu degradao proteoltica, porm a protena superfcie foi rapidamente degradada pela tripsina e pela pepsina. No entanto, o microambiente cido que criado nas micropartculas incubadas em tampo fosfato salino a 37 C capaz de produzir degradao significativa da protena encapsulada ao fim de 7 dias, apesar do meio externo apresentar pH constante. Os mtodos de OSD, WSD e separao de fases em leo foram utilizados na obteno de nanoesferas de PLGA para encapsulao do hormnio liberador de tirotropina (TRH) e de elcatonina, dois peptdeos hidrossolveis (Kawashima et al., 1998). O rendimento e a eficincia de encapsulao do frmaco nas nanoesferas foram superiores pelo mtodo de OSD em relao aos outros dois mtodos, para ambos os peptdeos. A OSD e a WSD foram, posteriormente, aplicadas na preparao de nanoesferas de elcatonina, revestidas com quitosana, um polmero mucoadesivo, para serem administradas intragastricamente a ratos (Kawashima et al., 2000). A ao fisiolgica do peptdeo, ou seja, a reduo do nvel de clcio no sangue, foi monitorizada, verificando-se que as nanoesferas revestidas com quitosana reduziram significativamente os nveis de calcemia comparativamente a uma soluo de elcatonina e s nanoesferas no-revestidas. Essa reduo foi prolongada por um perodo de 48 horas.

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TABELA II - Microencapsulao de peptdeos e protenas para administrao oral Polmero Sistema Peptdeo ou protena BSA Ovalbumina Elcatonina Lisozima gamainterferona Interferon-g Insulina Insulina Mesilato de camostato Insulina Insulina Derivado da vasopressina Insulina Calcitonina Insulina Insulina Insulina Calcitonina Octreotdeo Calcitonina Tcnica Referncia(s)

Polisteres biodegradveis PLGA Microesferas Micropartculas Nanoesferas Nanopartculas PLA Microesferas Microcpsulas Nanoesferas Microesferas Polmeros acrlicos Eudragit Microesferas Micropartculas Poli(2-HEMA) Poli(NIPAAm-coBMA-co-AA) PIBCA Microesferas Micropartculas Micropartculas Nanocpsulas Nanoesferas Nanoesferas Nanocpsulas Nanocpsulas Nanoesferas

Evaporao de solvente Evaporao de solvente OSD OSD Evaporao de solvente Evaporao de solvente Inverso de fases Evaporao de solvente

(Rafati et al., 1997) (Takahata et al., 1998) (Kawashima et al., 2000) (Yoo, Choi, Park, 2001) (Eyles et al., 1997) (Ma et al., 2000) (Carino, Jacob, Mathiowitz, 2000) (Uchida, Yasuda, Matsuyama, 2001)

Poliacrilamida

Emulsificao/solidificao (Morishita et al., 1993) Extrao de solvente (Agarwal, Reddy, Khan, 2001) Polimerizao de (Lehr et al., 1992) suspenso Emulsificao/ (Ramkissoon-Ganorkar et solidificao al., 1999) Emulsificao/ (Serres, Baudys, Kim, solidificao 1996) Polimerizao interfacial (Damge et al., 1990) Polimerizao de emulso (Damge et al., 1997b) Polimerizao (Radwan, 2001) Polimerizao interfacial (Lowe, Temple, 1994) Polimerizao interfacial (Damge et al., 1997a) Polimerizao de (Lowe, Temple, 1994) microemulso inversa Emulsificao/gelificao Extruso/gelificao Reticulao qumica Extruso/gelificao (Lemoine et al., 1998) (Mumper et al., 1994) (Aiedeh et al., 1997) (Coppi et al., 2001; Okhamafe et al., 1996; Polk et al., 1994; Vandenberg et al., 2001) (Coppi et al., 2001) (Ramadas et al., 2000) (Chandy, Mooradian, Rao, 1998) (Remunan-Lopez et al., 1998) (Nakamura et al., 1998) (Larionova et al., 1999)

Polmeros naturais Alginato Microesferas Microesferas Quitosana Microcpsulas Alginato-Quitosana Micropartculas

BSA TGF-1 Insulina BSA

Micropartculas Micropartculas Alginato-Quitosana- Microcpsulas PEG Quitosana-celulose Micropartculas Gelatina Amido/BSA Microesferas Microcpsulas

BSA Insulina Hirudina BSA Ovalbumina Aprotinina

Nebulizao/gelificao Extruso/gelificao Extruso/gelificao Evaporao de solvente Reticulao qumica Emulsificao/reticulao qumica

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TABELA II - continuao Polmero i-Carragenano Insulina lcool polivinlico Co-polmeros P(MAA-g-EG) P(FA:PLGA) Graft-coPolymers Sistema CPP Sistema Micropartculas Nanoesferas Microesferas Micropartculas Nanoesferas Nanopartculas Nanopartculas Peptdeo ou protena Peroxidase Insulina Insulina Insulina Insulina Calcitonina LHRH Tcnica Extruso/interao inica Reticulao qumica Referncia(s) (Patil, Speaker, 2000) (Oppenheim et al., 1982)

Emulsificao/congelao (Kimura et al., 1996) Polimerizao de suspenso (Lowman et al., 1999) Inverso de fases (Carino, Jacob, Mathiowitz, 2000; Mathiowitz et al., 1997) Polimerizao (Sakuma et al., 1997) Polimerizao (Hillery et al., 1996)

PLGA - cido poli(lctico-co-gliclico); BSA albumina srica bovina; OSD - difuso de solvente em leo; PLA - cido polilctico; HEMA hidroxietilmetacrilato; NIPAAm N-isopropilacrilamida; BMA butilmetacrilato; AA cido acrlico; PIBCA - poli(isobutilcianoacrilato); TGF - fator de crescimento transformante; PEG polietilenoglicol; MAA-EG - co-polmero de cido metacrlico e etilenoglicol; FA - anidrido fumrico; CPP - peptdeo co-polimerizado; LHRH hormnio de liberao do hormnio luteinizante

Quando se utilizam os mtodos de emulso espontnea/difuso de solvente, a protena deve estar dissolvida em solventes miscveis com a gua, como a acetona e o dimetilsulfxido. A dissoluo direta das protenas em solventes orgnicos polares possvel, por exemplo, por emparelhamento inico hidrofbico, no qual os grupos carregados das protenas interagem ionicamente com um grupo carregado de um agente tensoativo, obtendo-se protenas modificadas menos hidrossolveis e com maior solubilidade em solventes orgnicos. Esta estratgia foi adotada na nanoencapsulao de um complexo de lisozima (protena) e oleato de sdio (agente hidrofbico de emparelhamento inico) em PLGA, pelo mtodo de emulso espontnea/difuso de solvente. A eficincia de encapsulao aproximou-se dos 100%, apresentando-se como promissora na administrao oral de protenas (Yoo, Choi, Park, 2001). A gamainterferona foi encapsulada, em microesferas de PLA, um polister biocompatvel e biodegradvel, por um mtodo de emulso mltipla/evaporao de solvente. As microesferas preparadas com quantidade reduzida de protena apresentaram menor dimetro em relao a outras preparadas com maior concentrao de protena. O processo de microencapsulao promoveu aumento da biodisponibilidade oral da protena, j que a distribuio sistmica, aps a sua administrao oral, foi significativamente superior para o gamainterferona encapsulada, em relao no-encapsulada, (Eyles et al., 1997).

O inibidor proteoltico mesilato de camostato foi encapsulado em microesferas de PLA preparadas pelo mtodo de emulsificao mltipla/evaporao de solvente, tendo, posteriormente, sido revestidas com acetato succinato de hidroxipropilmetilcelulose, um polmero entrico (Uchida, Yasuda, Matsuyama, 2001). A eficincia de encapsulao foi prxima de 80%. A liberao em pH 6,8 foi rpida, j que todo o frmaco foi liberado em 45 minutos, enquanto que em pH 1,2, a liberao foi extremamente lenta, o que confirma a obteno de uma formulao entrica. Polmeros acrlicos Foram preparadas microesferas de poli(2-hidroxietilmetacrilato) (poli-(2-HEMA)), por polimerizao em suspenso, contendo 9-desglicinamida-8-argininavasopressina como peptdeo modelo. Estudou-se o efeito do revestimento com polycarbophil, um polmero mucoadesivo, na absoro intestinal do peptdeo. As propriedades mucoadesivas, promotoras da absoro e inibidoras da degradao proteoltica do polmero, permitiram um ligeiro aumento da absoro intestinal in vitro, mas nos resultados obtidos com os ensaios in situ e in vivo no se confirmou o efeito anterior (Lehr et al., 1992). Foi utilizado um polmero sensvel ao pH e temperatura na encapsulao da calcitonina humana por um mtodo de emulsificao/solidificao (Serres, Baudys,

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Kim, 1996). O polmero, produzido a partir de Nisopropilacrilamida (NIPAAm), butilmetacrilato (BMA) e cido acrlico (AA), impede a solubilizao das micropartculas em pH cido e a 37 C, protegendo o frmaco da degradao gstrica, porm a pH neutro solubiliza-se liberando o frmaco no intestino. Obteve-se elevada eficincia de encapsulao da calcitonina e liberao rpida em pH 7,4 e em pH 4,5. Aps contato prolongado com o polmero, a calcitonina permanecia bioativa e sem sofrer agregao. A calcitonina tambm foi encapsulada em nanocpsulas de poli(isobutilcianoacrilato) (PIBCA), pelo mtodo da polimerizao interfacial (Lowe, Temple, 1994). A eficincia de microencapsulao foi de 90% e observouse maior resistncia degradao proteoltica em comparao com o peptdeo livre, porm a absoro intestinal no sofreu aumento significativo. No mesmo estudo, a calcitonina foi encapsulada em nanopartculas de poliacrilamida obtidas por polimerizao duma microemulso A/O. O monmero e o frmaco foram adicionados a um solvente orgnico contendo tensoativo, formando-se microemulso, a qual aps radiao UV, levou polimerizao do monmero. A eficincia de encapsulao atingiu os 23% e o peptdeo foi liberado imediatamente aps re-hidratao, revelando incapacidade de proteo contra a degradao proteoltica. O octreotdeo, um anlogo da somatostatina, tambm foi encapsulado em PIBCA por polimerizao interfacial (Damge et al., 1997a). A eficincia de encapsulao foi de aproximadamente 60% e o tamanho das nanocpsulas obtidas foi de 260 nm. Os resultados obtidos revelaram aumento da atividade biolgica do frmaco administrado, numa relao dose-efeito. Polmeros naturais Microesferas de alginato tm-se mostrado promissoras como sistema de liberao controlada de frmacos macromoleculares, tais como, vacinas (Bowersock et al., 1996; Cho et al., 1998) e polipeptdeos (Kim, Lee, 1992). O uso do alginato na preparao de microesferas contendo antgenos tem como objetivo a obteno de partculas com menos de 10 mm, para serem captadas pelas clulas M do tecido linfide local. Como o mtodo clssico de gelificao ionotrpica no permite a obteno de partculas de dimetro to pequeno, outras tcnicas tm sido abordadas. A BSA foi encapsulada em microesferas de alginato (Lemoine et al., 1998), pelo mtodo de emulsificao/gelificao (Wan, Heng, Chan, 1992). As microesferas apresentaram dimetro mdio de 8 m e a eficincia de microencapsulao e o rendimento de

encapsulao em protena foram elevados (>90% e 10% m/m, respectivamente). Quando as microesferas foram colocadas em tampo fosfato salino, a liberao do frmaco foi rpida, diminuindo aps a reticulao prvia com poli(L-lisina) ou pela utilizao de alginato de maior MM (Lemoine et al., 1998). O alginato tambm foi utilizado para encapsular o TGF-1 (transforming growth factor-1), um frmaco protico de 25 KDa, utilizado para proteger o epitlio intestinal, o seu local de ao (Mumper et al., 1994). As microesferas, preparadas por extruso, foram capazes de proteger a protena das condies agressivas do estmago e liber-lo no intestino delgado. A eficincia de encapsulao e o percentual de frmaco liberado foram prximos de 100%. Devido a elevada afinidade da protena para o alginato foi necessrio recorrer a estratgias apropriadas, especificamente, tratamento das partculas com cido e/ou incorporao de cido poliacrlico, para assegurar a sua bioatividade. A quitosana, um polmero catinico, tem a capacidade de reagir com o alginato, originando a formao de gel. O complexo alginato-quitosana estabiliza o gel de alginato e reduz a sua porosidade (Coppi et al., 2001). Foram utilizadas 3 variantes da tcnica de extruso na preparao de microcpsulas de alginato-quitosana contendo BSA: gerador de gotas do tipo air-Jet (Polk et al., 1994; Vandenberg et al., 2001), gerador eletrosttico de gotas (Okhamafe et al., 1996) e nebulizao (Coppi et al., 2001). Quando se utiliza a tcnica de nebulizao possvel obter partculas com dimetro mdio inferior a 10 m e eficincia de encapsulao elevada (Coppi et al., 2001). Verificou-se que os fatores que influenciam o perfil de liberao da albumina so a concentrao e MM da quitosana, a concentrao de alginato, o tempo de reao alginato-quitosana e o pH da soluo de quitosana (Polk et al., 1994). No trabalho de Okhamafe e colaboradores (1996), concluiu-se que as micropartculas de alginato-quitosana mostravam propriedades inadequadas de liberao da albumina a pH 1,2, com liberao de 80% e 94% s 4 e 24 horas, respectivamente, porm este resultado foi contestado por outros autores (Hari, Sharma, 1998). As microcpsulas de alginato revestidas com quitosana permitiram obter eficincias de encapsulao de BSA superiores a 95% e estabilidade em pH cido, com liberao da protena, em mais de 90%, aps transferncia para valores de pH neutros (Vandenberg et al., 2001), mostrando-se adequadas para a administrao oral de frmacos peptdicos. A hirudina foi incorporada em microcpsulas de alginato preparadas por extruso e revestidas com quitosana (Chandy, Mooradian, Rao, 1998). As microcpsulas de alginato-quitosana obtidas foram, posteriormente, revestidas com PEG tendo-se obtido tamanhos de

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900-1 000 m. A presena de PEG diminuiu a liberao a pH 7,4, j que na sua ausncia 96% do frmaco tinha sido liberado em 48 horas, comparativamente com 86% na sua presena. O tratamento cido das micropartculas (0,1 M HCl, 4 horas) aumentou a liberao em pH 7,4, atingindo 100% ao fim de 6 horas para as micropartculas revestidas com PEG, enquanto que na ausncia de tratamento cido a liberao, nesse perodo de tempo, foi de, aproximadamente, 70%. A BSA foi encapsulada nas mesmas condies, tendo-se verificado que baixas concentraes de PEG (0,05%) diminuem a liberao de protena, embora as concentraes elevadas (0,3%) aumentem a sua liberao. As propriedades anticoagulantes da hirudina so superiores com as micropartculas revestidas com PEG do que com as no-revestidas. Para evitar a reticulao covalente da quitosana e melhorar as propriedades de liberao do polmero, foram desenvolvidas micropartculas de BSA por emulso mltipla A/O/A seguida de evaporao de solvente, constitudas por um revestimento de polmero celulsico contendo no seu interior microncleos de quitosana (fase aquosa interna) nos quais a protena est dissolvida. Estas partculas foram submetidas a liofilizao. Independentemente do tipo de quitosana ou da razo quitosana/revestimento, o tamanho das partculas foi sempre inferior a 70 m. A eficincia de microencapsulao foi elevada e, controlando as condies operacionais, possvel modular a liberao in vitro do frmaco (Remunan-Lopez et al., 1998). A ovalbumina foi encapsulada em microesferas de gelatina por reticulao com glutaraldedo. As maiores eficincias de encapsulao (55 a 65%) foram obtidas quando se utilizou soluo de gelatina a 10% (m/v). A estabilidade das microesferas contra a degradao enzimtica e o perfil de liberao da ovalbumina dependem da concentrao da soluo de gelatina e da quantidade de glutaraldedo (Nakamura et al., 1998). Foram preparadas microcpsulas de amido e BSA por um mtodo de emulsificao/reticulao qumica com cloreto de tereftalola nas quais foi incorporada, aprotinina, um inibidor enzimtico de algumas proteases intestinais, como por exemplo a tripsina (Larionova et al., 1999). Para proteger o inibidor enzimtico da acilao pelo agente de reticulao, os seus grupos amina foram protegidos com anidrido citracnico. Este sistema permitiu que a BSA fosse detectada no estado nativo, aps 3 horas num meio contendo -amilase e tripsina, enquanto que na ausncia de aprotinina ocorreu a degradao tripsnica total da protena. Fatores como o tamanho das partculas, o tratamento com tampo alcalino seguido de incubao em pH 2,0, a densidade da reticulao e a presena de BSA influenciaram o perfil de liberao da aprotinina.

O i-carragenano, um polmero aninico, foi utilizado na preparao de micropartculas contendo a enzima peroxidase de rabanete (Patil, Speaker, 2000). A enzima foi adicionada soluo aquosa de polmero e a mistura foi sujeita a extruso para soluo de oligoaminas que interagem com o carragenano para formar as micropartculas. Dependendo da amina utilizada, a eficincia de encapsulao variou entre 1 e 72%. O processo de encapsulao no alterou a conformao estrutural ou a atividade especfica da enzima. A liberao em pH 7,2 foi rpida, 98% em 100 minutos, o que se deveu estrutura porosa da matriz e baixa massa molecular da protena. Co-polmeros As nanopartculas compostas por graft-coPolymers com estrutura central hidrofbica e ramificaes hidroflicas so teis como veculos para frmacos hidroflicos. A calcitonina foi encapsulada em nanopartculas compostas por diferentes polmeros hidroflicos na superfcie: cido polimetacrlico (polianinico e sensvel ao pH), poli(Nisopropilacrilamida) (termossensvel, no inico) e poli(N-vinilacetamina), poli(N-vinilacetamida-covinilamina) e polivinilamina (catinicos). A eficincia de microencapsulao da calcitonina foi elevada, embora dependente da estrutura das ramificaes hidroflicas. A formulao mostrou-se adequada no s na incorporao de frmacos peptdicos hidrossolveis como tambm na promoo da absoro pelo trato GI (Sakuma et al., 1997). Sistemas conjugados de peptdeo co-polimerizado (CPP) Uma nova abordagem administrao oral de peptdeos consiste na combinao da utilizao de sistemas transportadores com a formao de conjugados frmaco-polmero. O conjugado frmaco-polmero formulado como nanopartculas, de modo que o frmaco fica covalentemente ligado, em vez de ficar retido fisicamente. O sistema CPP foi aplicado na co-polimerizao do hormnio peptdico de liberao do hormnio luteinizante (LHRH) com o monmero n-butilcianoacrilato (nBCA). As partculas formadas apresentaram dimetro mdio de 100 nm e mostraram-se estveis, quando incubadas durante 3 horas em contedo luminal do intestino, na raspagem da superfcie mucosa e em soro. Os resultados in vitro de transporte atravs de linhagens celulares caco-2 sugerem que a absoro in vivo possvel (Hillery et al., 1996). Por administrao oral a ratos, confirmou-se que as partculas so capazes de transportar o peptdeo conjugado para o sangue, enquanto que o peptdeo na for-

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ma livre no era absorvido. A forma biologicamente ativa do peptdeo liberada das partculas apenas aps a absoro oral do complexo LHRH-CPP intacto (Hillery, Toth, Florence, 1996).

ESCOLHA DE UM MTODO DE MICROENCAPSULAO DE PROTENAS E PEPTDEOS

As protenas so molculas de estrutura complexa que, freqentemente, possuem ligaes lbeis e numerosos grupos qumicos reativos nas suas cadeias laterais. A escolha do mtodo de encapsulao deve garantir a estabilidade da molcula e a reteno da sua atividade biolgica. Alguns dos obstculos encontrados microencapsulao das protenas so a utilizao de solventes orgnicos e de temperaturas elevadas, suscetveis de causar a desnaturao do frmaco. As elevadas velocidades de agitao ou o uso de ultra-sons podem provocar alteraes na estrutura tridimensional das protenas (Burke, 2000; Jung et al., 2000). Quando se utilizam polisteres biodegradveis, pela sua hidrofobia, recorre-se normalmente a mtodos que envolvem emulses, nas quais o frmaco peptdico, normalmente hidrossolvel, possa ser solubilizado. A presena de solventes orgnicos capazes de desnaturar os frmacos peptdicos (Manning, Patel, Borchardt, 1989) constitui um dos grandes inconvenientes destes mtodos, alm de outros relacionados com a eliminao do solvente. Os resduos de solvente nas micropartculas esto sujeitos a regulamentao pelos riscos toxicolgicos associados (ODonnell, McGinity, 1997). Pode-se, ainda, obter baixos rendimentos de encapsulao se o frmaco entrar em contato com a fase aquosa externa (Blanco-Prieto et al., 1998; Ogawa et al., 1988). Na preparao de nanopartculas pelo mtodo da emulso mltipla em A/O/A , muitas vezes, necessria a utilizao de ultra-som ou turbinas de elevada velocidade, que podem causar a inativao das protenas. Os novos mtodos de deposio interfacial e salting-out causam menor stress s protenas (Jung et al., 2000). Na microencapsulao com polmeros acrlicos, so freqentemente utilizadas tcnicas de emulso/polimerizao (Damge et al., 1990; Damge et al., 1997b; Lehr et al., 1992; Lowe, Temple, 1994), que apresentam o inconveniente da natureza txica dos monmeros que no reagiram e pela difcil eliminao dos estabilizadores e aditivos usados para prevenir a coalescncia do produto final. Em alguns casos, so necessrias elevadas quantidades de solventes orgnicos. Alguns mtodos de microencapsulao, como a coacervao, a reticulao de suspenso, a nebulizao e a

fluidizao, no tm sido muito utilizados porque envolvem a utilizao de solventes orgnicos e/ou temperaturas extremas ou condies de pH que podem inativar a protena. A microencapsulao em polmeros naturais recorrendo a mtodos de gelificao (Coppi et al., 2001; Lemoine et al., 1998; Mumper et al., 1994; Okhamafe et al., 1996; Polk et al., 1994; Ramadas et al., 2000; Vandenberg et al., 2001) uma alternativa a considerar. Os hidrogis polimricos naturais so inertes perante os frmacos proticos e os mtodos utilizados para preparao das micropartculas no requerem a utilizao de solventes orgnicos, temperaturas elevadas ou condies extremas de pH. Alm disso, pelo fato de serem termodinamicamente compatveis com a gua e intumescerem em meios aquosos, adquirem elevado contedo em gua o que contribui para a sua biocompatibilidade (Peppas et al., 2000).

CONCLUSO
O mtodo de microencapsulao a escolher deve ser simples, reprodutvel, rpido e fcil de ser transportado para a escala industrial, mas deve, sobretudo, minimizar a perda da atividade biolgica do peptdeo ou da protena a encapsular. Entre os mtodos mais utilizados, freqente recorrer utilizao de solventes orgnicos, responsveis por possvel desnaturao do agente teraputico e que podem causar problemas ambientais e riscos para a sade individual. Tambm, a polimerizao, muito utilizada na obteno de nanopartculas, apresenta inconvenientes devido toxicidade relacionada com a presena de monmeros residuais. Os mtodos que utilizam polmeros naturais revelam-se, pela ausncia de condies drsticas e biocompatibilidade do material de encapsulao utilizado, uma alternativa vlida na microencapsulao dos frmacos peptdicos. Nos estudos em que foram aplicadas micropartculas de polmeros naturais foi possvel obter eficincias de encapsulao elevadas e uma proteo dos frmacos peptdicos da degradao enzimtica no trato gastro-intestinal.

ABSTRACT
Oral delivery system for peptides and proteins: II. Application of microencapsulation methods Choosing an appropriate microencapsulation method to improve the oral bioavailability of peptide drugs depends on the drug physico-chemical properties, operation conditions and selected polymers. Microencapsulation techniques and its application in peptide and protein oral

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delivery are reviewed. Natural polymers and techniques involving no harsh conditions such as extreme pH, high temperature and solvents use are the most important when encapsulating peptide drugs. UNITERMS: Microencapsulation. Natural polymers. Oral administration. Peptide drugs.

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