Biotecnologia

CGPE 9550
BIOTECNOLOGIA
estado da arte e aplicaes

na agropecuria
BIOTECNOLOGIA

na agropecuria
Editores Tcnicos
Fbio Gelape Faleiro
Solange Rocha Monteiro de Andrade
Fbio Bueno dos Reis Junior
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria

Embrapa Cerrados
Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento
BIOTECNOLOGIA

na agropecuria
Editores Tcnicos
Fbio Gelape Faleiro
Embrapa Cerrados
Planaltina, DF
2011
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Embrapa Cerrados
BR 020, Km 18, Rodovia Braslia/Fortaleza
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Coordenao editorial
Jussara Flores de Oliveira
Reviso de texto
Francisca Elijani do Nascimento
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Normalizao bibliogrfica
Marilaine Schaun Peluf
Paloma Guimares Correa de Oliveira
Shirley da Luz Soares Arajo
Capa, projeto grfico e diagramao
Fabiano Bastos
Tratamento de figuras
Wellington Cavalcanti
Fotos
Embrapa Cerrados
1 edio
1 impressao (2011): 2.000 exemplares
Todos os direitos reservados.

A reproduo no autorizada desta publicao, no todo ou em parte, constitui
violao dos direitos autorais
(Lei n 9.610).
Dados Internacionais de Catalogao na Publicao - CIP
Embrapa Cerrados
B616 Biotecnologia: estado da arte e aplicaes na agropecuria / editores tcnicos:
Fbio Gelape Faleiro, Solange Rocha Monteiro de Andrade. Planaltina, DF :
Embrapa Cerrados, 2011.
730 p. : il.
ISBN 978-85-7075-059-4
1. Engenharia gentica. 2. Planta transgnica. 3. Organismo trangnico. 4.
Melhoramento gentico. I. Faleiro, Fbio Gelape. II. Andrade, Solange Rocha
Monteiro de.
631.5233 - CDD 21
Embrapa 2011
Autores:
Ana Maria Costa

Engenheira Agrnoma, D.Sc.
Pesquisadora da Embrapa Cerrados
abarros@cpac.embrapa.br
Artur Jordo de Magalhes Rosa
Zootecnista, D.Sc.
Pesquisador da Embrapa Cerrados
artur.rosa@cpac.embrapa.br
Austeclnio Lopes de Farias Neto
Engenheiro Agrnomo, Ph.D.
auster@cpac.embrapa.br
Carlos Frederico Martins
Mdico Veterinrio, D.Sc.
carlos.frederico@cpac.embrapa.br
Chang das Estrelas Wilches
Engenheiro Agrnomo, M. Sc.
Analista da Assessoria de Inovao Tecnolgica da Embrapa
chang.wilches@embrapa.br
Ccero Donizeti Pereira
Engenheiro Agrnomo, Dr.
cicero.pereira@cpac.embrapa.br
Cynthia Torres de Toledo Machado
Engenheira Agrnoma, Ph.D.
cynthia@cpac.embrapa.br
Erich Yukio Tempel Nakasu

Bilogo, M.Sc.
Bolsista de Desenvolvimento Tecnolgico Industrial do CNPq
erichnakasu@cenargen.embrapa.br
Fbio Bueno dos Reis-Junior
Engenheiro Agrnomo, D.Sc.
fabio@cpac.embrapa.br
Fbio Gelape Faleiro
ffaleiro@cpac.embrapa.br
Fbio Martins Mercante
Pesquisador da Embrapa Agropecuria Oeste
BR 163,km 253,6 - Caixa Postal 661
CEP 79804-970 - Dourados, MS
mercante@cpao.embrapa.br
Guilherme Montandon Chaer
Engenheiro Agrnomo, Ph. D.
Pesquisador da Embrapa Agrobiologia
Rodovia BR 465, km 7
Seropdica - RJ - Brasil - CEP: 23890-000
gchaer@cnpab.embrapa.br
Ieda de Carvalho Mendes
mendesi@cpac.embrapa.br
Jerri dson Zilli
Pesquisador da Embrapa Roraima, Rodovia BR-174, Km 8
Distrito Industrial, Boa Vista, RR - Brasil - CEP 69301-970
zilli@cpafrr.embrapa.br
Klecius Renato Silveira Celestino

Engenheiro Qumico, D.Sc.
Professor da Universidade de Braslia
CampusUniversitrio Darcy Ribeiro, Braslia - CEP 70910-900
klecius@unb.br
Luciana Harumi Morimoto Figueiredo
Biloga, M. Sc.
luciana.figueiredo@embrapa.br
Luiz Gustavo B. Siqueira
Mdico Veterinrio, MSc, MVetSc.
Pesquisador da Embrapa Gado de Leite
lgbsiqueira@cnpgl.embrapa.br
Magnlia de Arajo Campos
Biloga, D.Sc.
Professora da Universidade Federal de Campina Grande UFCG
Rua Aprigio Veloso, 882 Bairro Universitrio CEP 58429-140
Campina Grande, PB
magnoliaacp@ufcg.edu.br
Marcelo Ferreira Fernandes
Pesquisador da Embrapa Tabuleiros Costeiros
Av. Beira Mar, 3250 - Jardins
Caixa Postal 44 - Aracaju, SE - Brasil - 49025-040
marcelo@cpatc.embrapa.br
Marco Aurlio Caldas de Pinho Pessoa-Filho
Bilogo, D.Sc.
marco.pessoa@cpac.embrapa.br
Margot Alves Nunes Dode
Mdica Veterinria, Ph.D.
Pesquisadora da Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia
Parque Estao Biolgica - PqEB - Av. W5 Norte (final)
Caixa Postal 02372 - Braslia, DF - Brasil - 70770-900
dode@cenargen.embrapa.br.
Maria Cristina Rocha Cordeiro

Biloga, D.Sc.
cristina@cpac.embrapa.br
Mariangela Hungria
Pesquisadora da Embrapa Soja, Rod. Carlos Joo Strass - Distrito de
Warta, Caixa Postal 231 - CEP 86001-970, Londrina - Paran- Brasil
hungria@cnpso.embrapa.br
Marilia Santos Silva
marilia@cpac.embrapa.br
Mrio Lcio Vilela de Resende
Professor da Universidade Federal de Lavras UFLA
CampusUniversitrio - Prdio da Reitoria
Caixa Postal 3037 - CEP 37200-000 - Lavras MG
mlucio@ufla.br
Mnica Cibele Amncio
Advogada e Biloga, M. Sc.
monica.amancio@embrapa.br
Nilton Tadeu Vilela Junqueira
junqueir@cpac.embrapa.br
Roberto Teixeira Alves
ralves@cpac.embrapa.br
Rodrigo da Rocha Fragoso
Bilogo, D.Sc.
rodrigo.fragoso@cpac.embrapa.br
Sebastio Pedro da Silva Neto

sebastiao.pedro@cpac.embrapa.br
Biloga, D.Sc.
solange@cpac.embrapa.br
Sonia Maria Costa Celestino
Engenheira Qumica, D.Sc.
sonia.costa@cpac.embrapa.br
Thales Lima Rocha
Bilogo, Ph.D.
Pesquisador da Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia
Parque Estao Biolgica - PqEB - Av. W5 Norte (final)
Caixa Postal 02372 - Braslia, DF - Brasil - 70770-900
thales@cenargen.embrapa.br
Valter Lopes
Gegrafo
Professor do Centro Educacional 03, Planaltina, DF
lopes.valtinho@gmail.com
Veronica Massena Reis
Engenheira Agrnoma, D.Sc.
Pesquisadora da Embrapa Agrobiologia
Rodovia BR 465, km 7, Seropdica - RJ - Brasil - CEP: 23890-000
vernica@cnpab.embrapa.br
Walter Quadros Ribeiro Jnior
Bilogo, Ph.D.
walter@cpac.embrapa.br
Sumrio
11 Apresentao
13 Captulo 1 Biotecnologia: uma viso geral
31 Captulo 2 Princpio cientfico e anlises
genticas utilizando marcadores moleculares
55 Captulo 3 Aplicaes de marcadores
moleculares como ferramenta auxiliar
em programas de conservao,
caracterizao e uso de germoplasma
e melhoramento gentico vegetal
121 Captulo 4 Prospeco gnica e bioinformtica
143 Captulo 5 Genmica funcional
175 Captulo 6 Metagenmica:
princpios e aplicaes
195 Captulo 7 Biotecnologia e
diagnsticos moleculares
219 Captulo 8 Microbiologia do solo e
sustentabilidade de sistemas agrcolas
247 Captulo 9 Fixao biolgica de nitrognio:
uma revoluo na agricultura
283 Captulo 10 Fungos micorrzicos arbusculares:

pesquisa e desenvolvimento para a agricultura
321 Captulo 11 Biotecnologia aplicada
engenharia de alimentos
355 Captulo 12 Interaes
moleculares plantapatgeno
379 Captulo 13 Controle biolgico
de insetospraga
409 Captulo 14 Cultura de tecidos
vegetais: princpios e aplicaes
435 Captulo 15 Engenharia gentica:
princpios cientficos e aplicaes
469 Captulo 16 Biossegurana
ambiental e alimentar de OGMs
511 Captulo 17 Recursos genticos:
conservao, caracterizao e uso
551 Captulo 18 Melhoramento gentico
de plantas e biotecnologia
567 Captulo 19 Anlise genmica
aplicada a produo animal
653 Captulo 20 Biotecnologia
aplicada a pecuria bovina
709 Captulo 21 Biotecnologia agropecuria
e propriedade intelectual
Apresentao
A biotecnologia hoje uma das ferramentas de grande importncia

para propiciar benefcios a diferentes setores da sociedade. No caso
da agropecuria, aes de pesquisa e desenvolvimento na rea biotecnolgica so fundamentais para o desenvolvimento de sistemas mais
produtivos e sustentveis. A biotecnologia envolve vrias reas do
conhecimento e, em consequncia, vrios profissionais, sendo uma
cincia de natureza multidisciplinar.
As vrias tcnicas relacionadas biotecnologia tm trazido, via de
regra, benefcios para a sociedade, sendo exemplos, as fermentaes
industriais na produo de vinhos, cervejas, pes, queijos e vinagres;
a produo de frmacos, vacinas, antibiticos e vitaminas; a utilizao de biofungicidas no controle biolgico de pragas e doenas; o uso
de microrganismos visando a biodegradao de lixo e esgoto; o uso de
bactrias fixadoras de nitrognio e fungos micorrzicos para a melhoria de produtividade das plantas; o desenvolvimento de plantas e animais melhorados utilizando tcnicas convencionais de melhoramento
gentico e tambm a transformao gentica.
Neste livro, estas vrias tcnicas so discutidas por vrios especialistas da Embrapa Cerrados e instituies parceiras, sendo um material didtico importante para dar uma idia geral da biotecnologia,
incluindo aspectos conceituais, sua importncia histrica e atual e
tambm sua importncia futura, considerando toda sua potencialidade e o que ainda vai ser descoberto.
Jos Roberto Rodrigues Peres
Chefe-Geral da Embrapa Cerrados
11
Captulo 1
Biotecnologia: uma viso geral

Fbio Gelape Faleiro
A Biotecnologia conceitualmente, a unio de biologia com tecnologia um conjunto de tcnicas que utiliza os seres vivos, ou parte
desses, no desenvolvimento de processos e produtos que tenham uma
funo econmica e (ou) social. A biotecnologia envolve vrias reas
do conhecimento e, em consequncia, vrios profissionais, sendo
uma cincia de natureza multidisciplinar. Na Figura 1A, ilustramse
algumas reas do conhecimento com interface com a biotecnologia.
As vrias tcnicas relacionadas biotecnologia (Figura 1B) tm trazido, via de regra, benefcios para a sociedade (Figura 1C). Podemos
citar como exemplos as fermentaes industriais na produo de
vinhos, cervejas, pes, queijos e vinagres; a produo de frmacos,
vacinas, antibiticos e vitaminas; a utilizao de biofungicidas no controle biolgico de pragas e doenas; o uso de microrganismos visando
biodegradao de lixo e esgoto; o uso de bactrias fixadoras de nitrognio e fungos micorrzicos para a melhoria de produtividade das
plantas; o desenvolvimento de plantas e animais melhorados utilizando tcnicas convencionais de melhoramento gentico e tambm
a transformao gentica.
Neste captulo, apresentada uma viso geral da biotecnologia,
abordando aspectos conceituais e histricos da biotecnologia clssica e
moderna e fazendo um breve relato das principais tcnicas e produtos
biotecnolgicos e seus benefcios econmicos, sociais e ambientais.
13
biotecnologia
estado da arte e aplicaes na agropecuria
Bioqumica
Biologia
Celular
Engenharia
qumica
Gentica e
Melhoramento
Biologia
Molecular
BIOTECNOLOGIA
Gentica
Molecular
Biomedicina
Fitopatologia
Engenharia
gentica
Microbiologia
agrcola
Fermentaes
industriais
Produo de
frmacos
Cultura de
tecidos e clulas
Melhoramento
gentico
Clonagem
BIOTECNOLOGIA
Produo
das vacinas
Anlises
do DNA
Controle
biolgico
Transformao
gentica
Uso de microrganismos
na agricultura
Vinhos, cerveja, pes,
queijos, iogurtes, vinagres
Antibiticos
e vitaminas
Plantas e animais
melhorados
geneticamente
Biodegradao
Multiplicao de
recursos genticos
BIOTECNOLOGIA
Vacinas para o homem

e animais domsticos
Testes de
paternidade
Biofungicidas
Obteno
de OGMs
Bactrias fixadoras de nitrognio

e fungos micorrzicos
Figura 1. Principais disciplinas (A), tcnicas (B) e produtos (C) relacionados

biotecnologia.
14
Captulo 1 Biotecnologia: uma viso geral
O que biotecnologia ?
Podemos encontrar nos mais variados meios de comunicao vrias
definies para o termo biotecnologia. Uma definio ampla de biotecnologia o uso de organismos vivos ou parte deles para a produo de bens e servios. Podemos dizer que, nessa definio, enquadramse a biotecnologia clssica e a moderna. A biotecnologia clssica
envolve um conjunto de atividades que o homem vem desenvolvendo
h milhares de anos, como a produo de alimentos fermentados,
como o po e o vinho. A chamada biotecnologia moderna envolve
tecnologias de engenharia gentica, DNA recombinante, cultura de
clulas e embries para o desenvolvimento de produtos e processos.
Entre as vrias definies de biotecnologia, encontramos aquelas
em sentido amplo:
o uso de conhecimentos sobre os processos biolgicos e sobre as propriedades dos seres vivos, com o fim de resolver problemas e criar produtos
de utilidade. (CONVENTION ON BIOLOGICAL DIVERSITY, 1992).
a tecnologia baseada na biologia, especialmente quando usada na
agricultura, cincia dos alimentos e medicina. (WIKIPDIA, 2009).
Algumas definies se enquadram mais dentro da biotecnologia
clssica:
o uso industrial de processos de fermentao... tecnologia que permite a utilizao de material biolgico para fins industriais. (BORM
etal., 2007).
um conjunto de tcnicas que utiliza seres vivos, ou parte desses, para
produzir ou modificar produtos, aumentar a produtividade de plantas e
animais de maneira eficiente ou, ainda, produzir microrganismos para
usos especficos. (TORRES etal., 2000).
Outras definies esto mais relacionadas biotecnologia moderna:
o uso de clulas e biomolculas para a resoluo de problemas ou
transformao em produtos. um conjunto de tcnicas que potencializa
as melhores caractersticas das clulas, como a capacidades produtivas, e
disponibiliza molculas biolgicas, como DNA e protenas, para serem
utilizadas (AGNCIA BRASILEIRA DE DESENVOLVIMENTO
INDUSTRIAL, 2009).
o desenvolvimento de produtos por processos biolgicos, utilizandose
a tecnologia do DNA recombinante. (BORM; SANTOS, 2004).
15
biotecnologia
Espectro ou conjunto de tecnologias moleculares aplicadas ao estudo de

microrganismos, plantas e animais. (BORM etal., 2009; CONSELHO
DE INFORMAO SOBRE BIOTECNOLOGIA, 2009).
Dessa forma, biotecnologia pode ter diferentes significados,
principalmente quando comparamos a biotecnologia clssica e a
moderna. Podemos resumir o conceito de biotecnologia, com base
na origem da palavra: bio significa vida, tecno significa uso prtico
e aplicado da cincia e logos significa conhecimento, ou seja, conhecimentos que usam organismos, clulas e molculas de forma prtica na obteno de bens e servios. Podemos dizer tambm que
a tecnologia que gera produtos e processos de origem biolgica.
Histria da biotecnologia
O termo biotecnologia foi utilizado, pela primeira vez, no incio
do sculo passado. Apesar de o termo ser novo, o princpio muito
antigo. Considerando o seu conceito amplo, podemos dizer que a biotecnologia iniciouse com a agricultura ou agropecuria, ou seja, com
a capacidade do homem de domesticar plantas e animais para seu
benefcio. Estimase que 8000 anos a.C., na Mesopotmia, bero da
civilizao, os povos selecionavam as melhores sementes das melhores plantas para aumentar a colheita. Outro exemplo histrico da biotecnologia a utilizao da levedura na fermentao da uva e do trigo
para produo de vinho e po, o que j acontecia por volta de 7000
anos a.C. Estimase que a utilizao de bactrias para a fermentao do leite para produo de queijos j acontecia a 3000 anos a.C.
Logicamente, os povos dessa poca no faziam ideia que as leveduras e bactrias fossem utilizadas nesses processos de fermentao. Os
microrganismos somente foram descobertos em 1675 por Anton Van
Leeuwenhoek e, somente em 1862, Louis Pasteur descobriu a associao desses microrganismos com o processo de fermentao. O incio
da biotecnologia ilustrado na Figura 2 e, na Figura 3, a descoberta
dos microrganismos.
16
Figura 2. Incio da biotecnologia com a agricultura e a produo do po e

do vinho.
Figura 3. Anton Van Leeuwenhoek e Louis Pasteur e a descoberta dos microrganismos.
Com a evoluo da cincia em seus diversos setores, inmeras

metodologias biotecnolgicas tm sido sistematizadas, aumentando
seus benefcios econmicos, sociais e ambientais. A descoberta da utilidade dos microrganismos trouxe a primeira revoluo biotecnolgica, a qual ocorreu na medicina com a produo das vacinas. Louis
Pasteur foi o pioneiro e, no Brasil, Oswaldo Cruz foi um importante
seguidor. Oswaldo Cruz foi o pioneiro no estudo das molstias tropicais e da medicina experimental no Brasil (Figura 4). Fundou o
Instituto Soroterpico Nacional no Rio de Janeiro em 1900, transformado em Instituto Oswaldo Cruz, respeitado internacionalmente.
Quase 90 anos aps a sua morte, Oswaldo Cruz lembrado em cada
canto do territrio nacional, embora tenha tido na poca a incompreenso de seus contemporneos por causa de suas campanhas sanitrias, as quais permitiram que a vacinao se tornasse uma prtica corriqueira e de extrema importncia no Brasil (FALEIRO; ANDRADE,
2009). Hoje, seria praticamente impossvel a vida sem as vacinas dos
seres humanos e animais domsticos.
17
biotecnologia
Figura 4. Oswaldo Cruz e seu pioneirismo na produo de vacinas no Brasil.
Entre outros cientistas importantes para o desenvolvimento da biotecnologia, merecem destaque Gregor Mendel, considerado o pai da
gentica, com a descoberta da hereditariedade (como as caractersticas
passam de gerao para gerao) em 1865 e Alexander Fleming, descobridor do antibitico penicilina obtido a partir do fungo Penicillium
(Figura 5).
Figura 5. Gregor Mendel e Alexander Fleming.
E a biotecnologia moderna? Podemos dizer que a biotecnologia

moderna nasceu com a descoberta da estrutura do DNA (cido desoxirribonucleico, molcula responsvel pela informao gentica de
cada ser vivo) por James Watson e Francis Crick em 1953. Essa descoberta foi fundamental para entender como o DNA era capaz de codificar as protenas responsveis por todos os processos e pelo fentipo de todos os seres vivos. Esse entendimento foi concludo com a
decifrao do cdigo gentico por Har Gobing Khorana e Marshall
Niremberg em 1967 (Figura 6). Esses pesquisadores explicaram como
apenas quatro nucleotdeos codificavam os 20 diferentes aminocidos que constituem as milhares de protenas existentes (BORM;
SANTOS, 2004).
18
Figura 6. Watson e Crick e a estrutura do DNA; Niremberg e Khorana e o

cdigo gentico.
A partir da descoberta do DNA e do cdigo gentico, houve uma

revoluo incrvel na rea da gentica e biologia molecular, surgindo
a manipulao controlada e intencional do DNA por meio das tcnicas de engenharia gentica. Segundo Arago (2009), a engenharia
gentica surgiu em 1972, quando cientistas americanos conseguiram ligar sequncias de DNA de Escherichia coli a do Simian papiloma virus. Como consequncia dessas pesquisas, o primeiro organismo transgnico E. coli contendo sequncias de DNA de Xenopus
laevis foi produzido em 1973. Esse resultado levou o lder do projeto, Dr. Paul Berg, a ganhar o Prmio Nobel em 1980. Por meio dessas tcnicas, foi possvel a produo de insulina humana em bactrias e o desenvolvimento de inmeras plantas transgnicas a partir da
dcada de 1980, sendo a primeira uma planta de fumo transformada
com a capa proteica do vrus do mosaico do tabaco (Tobacco mosaic
virus TMV) (POWELL etal., 1986). Em 1994, a U.S. Food and Drug
Administration (FDA) liberou para o consumo humano o primeiro
alimento geneticamente modificado, o tomate Flavr Savr, produzido
pela empresa americana Calgene.
Na histria recente da biotecnologia moderna, merece destaque
a clonagem da ovelha Dolly (Figura 7), em 1996, que foi o primeiro
mamfero a ser clonado com sucesso a partir de uma clula adulta.
Dolly foi gerada a partir de clulas mamrias de uma ovelha adulta com
cerca de 6 anos, por meio de uma tcnica conhecida como transferncia somtica de ncleo. Outro acontecimento marcante foi o anncio
do projeto genoma humano, em 1990, que tinha como objetivo conhecer a sequncia completa dos nucleotdeos que o compem. O prazo
previsto para a concluso do projeto era de 15 anos. Em virtude da
grande cooperao da comunidade cientfica internacional, associada
19
biotecnologia
aos avanos no campo da biologia molecular relacionado s tcnicas de

sequenciamento, de bioinformtica e das tecnologias de informao,
um primeiro esboo do genoma foi anunciado em 26 de Junho de 2000.
Figura 7. Histria recente da biotecnologia moderna com a clonagem da ovelha Dolly e o sequenciamento do genoma humano .
Alm dos produtos tecnolgicos, a biotecnologia moderna tem possibilitado o desenvolvimento de diferentes tipos de marcadores moleculares e tcnicas de anlises genmicas e protemicas, as quais tm
permitido vrias aplicaes prticas na pesquisa e desenvolvimento
da agropecuria. Algumas das principais tcnicas e produtos biotecnolgicos ligados agropecuria so comentados resumidamente a
seguir e apresentados com maior profundidade nos prximos captulos do livro.
Principais tcnicas e produtos biotecnolgicos

As tcnicas e produtos biotecnolgicos possuem aplicaes em diferentes reas, sendo as principais aquelas ligadas indstria, ambiente,
sade, agropecuria, alm da rea cientfica. Abaixo so relatados algumas tcnicas e produtos em cada uma das cinco reas principais de
aplicao. Na Figura 8, ilustrase essa diversidade de aplicaes.
Figura 8. Diversidade de aplicaes da biotecnologia na rea industrial,

ambiental, sade, agropecuria e cientfica .
20
rea industrial
Essas aplicaes esto relacionadas obteno e conservao de
alimentos, principalmente utilizandose de processos fermentativos.
Esses processos foram utilizados, de forma inconsciente, h milhares
de anos a.C.. Com a descoberta dos microrganismos, os processos de
fermentao tm sido otimizados e utilizados em escala comercial.
Vrios so os alimentos obtidos ou modificados por processos fermentativos. Vinhos, vinagres, cervejas, pes, queijos e leite fermentado so os exemplos com relatos de uso mais antigos. Outras bebidas alcolicas obtidas a partir de frutas, cereais e at de folhas e razes
so exemplos de alimentos utilizados por ndios de forma tradicional.
Vrios microrganismos so utilizados em processos fermentativos como as bactrias (Bacillus, Zymomonas, Acetobacter etc.) e fungos (Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, etc.), incluindo a levedura
(Saccharomyces cerevisiae), exemplo mais comum e importante do
ponto de vista econmico. Os principais processos fermentativos so
a fermentao alcolica, lctica e biossntese actica. Os principais
produtos da fermentao alcolica so as bebidas alcolicas e o etanol carburante, os da fermentao lctica so os leites fermentados,
queijos, chucrutes, picles e azeitonas e os da biossntese actica os
vinagres e cido actico.
Com o avano da biotecnologia, esperase que novos produtos
industriais e processos de obteno sejam produzidos e aperfeioados, tornado o sistema mais eficiente, com benefcios sociais, ambientais e econmicos.
rea ambiental
A aplicao mais direta da biotecnologia na rea ambiental est
relacionada biodegradao, ou seja, decomposio de materiais ou
substncias qumicas pela ao dos seres vivos, sobretudo, pela ao
dos microrganismos. A biodegradao vantajosa ao meio ambiente
porque elimina certos contaminantes de origem orgnica como fezes,
detergentes, papeis, etc.
A tecnologia baseada na biodegradao chamada de biorremediao, que a utilizao de seres vivos ou seus componentes (geralmente microrganismos ou enzimas) na recuperao de reas contami21
biotecnologia
nadas, degradando compostos poluentes. Esse processo de degradao

pode no ser efetivo se o contaminante apresentar outras substncias,
tais como, metais pesados (chumbo e mercrio), ou se o meio apresentar um pH extremo ou outras condies que dificultam a ao
microbiana. No caso dos metais pesados, a fitorremediao (utilizao das plantas no processo de recuperao de reas contaminadas)
til, pois muitas plantas so capazes de acumular essas toxinas em
suas razes ou partes areas, as quais so colhidas e eliminadas da
rea contaminada. No caso das condies desfavorveis ao microbiana, um exemplo mais geral o tratamento de derramamentos de
leo com nitratos ou sulfatos, criando condies favorveis decomposio do leo pelas bactrias.
As experincias com a biodiversidade dos microrganismos mostram que inmeros compostos poluentes podem ser degradados.
Pensandose na transformao gentica, microrganismos transgnicos podem ser desenvolvidos para degradar determinado poluente.
Logicamente, o uso de tais microrganismos deve ser precedido de pesquisas relacionadas biossegurana, evitando que tal microrganismo
se torne um invasor do ecossistema.
Alm da biorremediao, a biotecnologia apresenta aplicaes indiretas relacionadas aos benefcios ambientais, como o uso de plantas transgnicas. Andrade e Faleiro (2009) relataram diversos trabalhos que estudaram o efeito ambiental positivo dos OGMs. Segundo
Brookes e Barfoot (2005), as lavouras com plantas transgnicas contriburam para uma significativa reduo no impacto ambiental global
da produo agrcola, relacionada uma diminuio do uso de pesticidas. Outro benefcio de algumas plantas transgnicas est relacionado viabilizao de sistemas de produo que utilizam o cultivo
mnimo ou plantio direto. As vantagens desse sistema so: conservao do solo evitandose a eroso, diminuio da emisso de gases de
efeito estufa, reduo do assoreamento dos rios e mananciais e conservao da fertilidade e da micro e macro fauna e flora do solo.
Acreditase que muito ainda deve ser pesquisado e desenvolvido
considerando os benefcios ambientais da biotecnologia. Segundo
Fontes e Sampaio (1997), entre as novas ferramentas da cincia mencionadas como chave para a agricultura ambientalmente sustentvel,
a biotecnologia ocupa lugar de destaque.
22
rea da sade
Os benefcios da biotecnologia na rea da sade so impressionantes. Villen (2009) relata de forma objetiva os principais impactos positivos da biotecnologia na rea da sade, citando como exemplo histrico o uso de antibiticos. Os antibiticos so empregados
no combate a infeces causadas por microrganismos, notadamente
bactrias, tanto no organismo humano como no animal e vegetal.
Os antibiticos possuem destacada importncia econmica, entre os
produtos obtidos pela biotecnologia. Atualmente, existem mais de 5
mil tipos diferentes de antibiticos. Essa diversidade foi possvel e
impactada pelo melhoramento gentico dos microrganismos utilizados na produo.
Outro exemplo histrico e tambm citado por Villen (2009) o uso
das vacinas. As vacinas representam um importante instrumento no
controle de doenas infecciosas. Muitas doenas podem ser evitadas
pela imunidade induzida como a poliomielite, a varola, o sarampo,
entre outras. As vacinas podem ser de origem viral, bacteriana, protozoria e mesozoria. A biotecnologia, pela tcnica do DNA recombinante, tem permitido o desenvolvimento de novos agentes imunizantes para influenza, herpes, polio e hepatite A e B. Vacinas de origem
bacteriana, para diversos tipos de meningite, tm sido produzidas por
meio de fermentao.
A produo de macromolculas teis na medicina humana e animal pela biotecnologia tambm apresenta grande importncia. A
produo dessas macromolculas por microrganismos teve grande
impulso com a tecnologia do DNA recombinante. Entre os principais
produtos, esto a insulina humana, interferon, hormnio de crescimento humano, peptdios neuroativos, hidrocortisona, testosterona,
vitaminas etc. Podemos dizer que a produo da insulina humana
por bactrias, na dcada de 1970, foi a primeira utilizao comercial
da engenharia gentica. Segundo Arago (2009), atualmente, mais de
400 genes de protenas com potencial para o uso teraputico na medicina humana e veterinria j foram obtidos. Mais de 30 desses genes
foram introduzidos em organismos transgnicos que geraram medicamentos aprovados e utilizados em vrias partes do mundo.
23
biotecnologia
Agropecuria
A atividade agropecuria, conforme documentada pela histria e
por registros arqueolgicos, tem sido inseparvel da evoluo e da atividade da sociedade humana. A sociedade como vista hoje no poderia ter desenvolvido ou mesmo sobrevivido sem uma adequada fonte
de alimentos. A inveno da agricultura, contudo, no resolveu por
definitivo o problema do suprimento de alimentos. Quando a seca ou
a exploso de doenas e pragas caam sobre as culturas, o resultado
era fome e crise. Esses fatos j ocorriam h muitos anos, como citado
em numerosas referncias bblicas.
Alternativas biotecnolgicas para aumentar a produtividade das
plantas e dos animais e tornlos mais resistentes a fatores ambientais foram sendo desenvolvidas ao longo dos anos. Um destaque especial deve ser dado ao melhoramento gentico que, desde o incio da
agricultura, vem sendo utilizado pelos povos, mesmo que de forma
emprica. Aps a redescoberta das leis de Mendel, o melhoramento
gentico comeou a ser realizado de forma mais eficiente e precisa.
Inmeros so os exemplos dos benefcios do melhoramento gentico vegetal e animal na agricultura. Com o advento da biotecnologia moderna, novas perspectivas so esperadas. Segundo Borm e
Milach (1998), a biotecnologia moderna ser gradativamente incorporada na rotina do melhoramento gentico, como instrumento para
desenvolver novas variedades, tornando a cincia ainda mais precisa.
Marcadores moleculares e da engenharia gentica esto permitindo
diminuir o tempo para obteno de novas variedades e expandir o conjunto gnico disponvel para cada programa de melhoramento gentico, entretanto muito ainda deve ser pesquisado considerando toda
potencialidade das tecnologias. Segundo Ferreira e Faleiro (2008),
do ponto de vista comercial, a indstria transgnica vegetal tem sido
marcada at agora pelo emprego de apenas dois tipos de genes: resistncia herbicida e resistncia a insetos. Vrios outros produtos tm
sido testados, como aumento de vitamina A em gros de arroz (golden rice, YE etal., 2000) ou vitamina E (SHINTANI; DELLAPENNA,
1998); qualidade de fruto; resistncia a fungos; resistncia bactria; composio de amido nos gros (JOBLING etal., 2002); tolern-
24
cia estresse abitico, principalmente seca e salinidade (BARTELS;

NELSON, 1994).
Outra alternativa biotecnolgica utilizada na agropecuria o controle biolgico, o qual baseiase na utilizao de recursos genticos
microbianos, insetos predadores e parasitoides para o controle de
doenas e pragas, especialmente os insetos e caros fitfagos, nos
sistemas de produo agrcola. Segundo Menezes (2006), o incio da
histria do uso do controle biolgico de pragas agrcolas ocorreu no
sculo III, quando os chineses se valeram da predao de formigas
(Oecophylla smaragdina) para o controle de pragas de citros. Todavia,
somente no sculo XX que o controle biolgico passou a ser objeto
de pesquisas constantes para sua implantao de forma mais presente
e intensiva nos ecossistemas agrcolas.
O uso de microrganismos na agricultura tambm merece destaque. Bactrias fixadoras de nitrognio e fungos micorrzicos so dois
exemplos clssicos. A fixao biolgica de nitrognio o processo pelo
qual esse elemento qumico captado da atmosfera, onde se caracteriza pela sua forma molecular relativamente inerte (N2) e convertido em compostos nitrogenados, como amnio ou nitrato, usados em
diversos processos qumicobiolgicos do solo, especialmente importantes para a nutrio de plantas. A associao de bactrias diazotrficas, principalmente do gnero Rhizobium, com razes de plantas
um tipo de simbiose em as bactrias utilizam parte dos fotoassimilados da planta hospedeira, a qual beneficiase do nitrognio fixado
pela bactria.
A inoculao de bactrias diazotrficas em sementes de leguminosas uma tecnologia capaz de reduzir consideravelmente a adubao mineral nitrogenada e em alguns casos substituila. A micorriza tambm uma associao simbitica entre fungos micorrzicos
e as razes de algumas plantas. Nesse caso, os fungos utilizam parte
dos fotoassimilados das plantas para o desenvolvimento de hifas que
vo auxiliar as razes da planta na funo de absoro de gua e minerais do solo, j que aumentam a superfcie de absoro ou rizosfera.
A cultura de tecidos, como biotecnologia, tambm apresenta vrios
benefcios para a agricultura e mais especificamente para os programas de melhoramento gentico de plantas. Ferreira etal. (1998) citam
25
biotecnologia
algumas dessas aplicaes como a conservao e avaliao de germoplasma; aumento da variabilidade gentica para fins de seleo;
introgresso de genes de interesse (polinizao in vitro, cultura de
embries, fuso de protoplastos, haploidizao por cultura de anteras);
acelerao do programa de melhoramento (germinao de sementes
in vitro, clonagem de gentipos) e produo comercial de mudas de
alta qualidade (multiplicao e limpeza clonal). Alm disso, para a
obteno de uma planta transgnica, indispensvel um mtodo eficiente de regenerao in vitro (ANDRADE, 2003).
Na agropecuria, importante considerar os avanos da biotecnologia na produo e no melhoramento gentico animal. Tecnologias
como a inseminao artificial, transferncia de embries, a clonagem
animal e a transformao gentica podem ser destacadas pelos avanos obtidos nos ltimos anos. Alm do aumento da produtividade,
essas tcnicas tm sido importantes na seleo e reproduo de animais com caractersticas genticas de interesse, alm da diminuio
do intervalo entre geraes. Pensandose na conservao de recursos
genticos animais, essas tecnologias tm permitido a reproduo de
animais ameaados de extino.
As aplicaes da biotecnologia na agropecuria so inmeras,
embora a perspectiva seja de que novas aplicaes sejam pesquisadas e desenvolvidas a cada ano. Alm do aumento da produtividade
dos sistemas agropecurios, essas aplicaes so importantes para
a busca da sustentabilidade, fazendo com que tais sistemas causem
menor impacto ambiental.
rea cientfica
As aplicaes da biotecnologia na pesquisa cientfica e tecnolgica
so fantsticas. O desenvolvimento de processos e metodologias de
estudo dos microrganismos e mais recentemente as anlises do DNA,
das protenas e das rotas metablicas abriram novas portas para a
atuao dos cientistas. Palavras como genmica, transcriptmica,
protemica e metabolmica so cada vez mais comuns nos artigos
cientficos. Essas metodologias tm permitido os estudos de funo
e regulao da expresso gnica, anlise de processos de transcrio
e traduo. Esses estudos tm permitido a prospeco de genes de
26
interesse em diferentes seres vivos, o estudo de mecanismos envolvidos na resistncia de plantas e animais a estresses biticos e abiticos, o desenvolvimento de tcnicas de diagnose molecular de doenas
e agentes patognicos, entre outras inmeras atividades cientficas e
prtecnolgicas.
Consideraes finais
inquestionvel que a biotecnologia, incluindo as tecnologias da
biotecnologia moderna, hoje uma das ferramentas de grande importncia para propiciar benefcios a diferentes setores da sociedade. No
caso da agropecuria, aes de pesquisa e desenvolvimento na rea
biotecnolgica so fundamentais para o desenvolvimento de sistemas
mais produtivos e sustentveis. A evoluo da cincia biotecnolgica
est caminhando a passos largos e podese dizer que a biotecnologia
moderna ainda uma criana, considerando todas as potencialidades
e o que ainda vai ser descoberto.
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BOREM, A.; GIUDICE, M. P. Biotecnologia e Meio Ambiente. 2. ed. Visconde do
Rio Branco: Suprema, 2008. v.1. 510 p.
BOREM, A.; SANTOS, F. R. Entendendo a Biotecnologia. Visconde do Rio Branco:
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FALEIRO, F. G.; ANDRADE, S. R. M. Biotecnologia, transgnicos e biossegurana.
Planaltina, DF: Embrapa Cerrados, 2009. 183 p.
SASSON, A. Plant and Agricultural Biotechnology: Achievements, Prospects and
Perceptions. Mxico: Ciencia y Tecnologa, 2006.444 p.
29
Captulo 2
Princpio cientfico e anlises

genticas utilizando
marcadores moleculares
Fbio Gelape Faleiro
Introduo
Nos ltimos anos, com os avanos na rea da gentica e biologia molecular, principalmente com o advento da tecnologia do DNA
recombinante, da reao em cadeia da polimerase (PCR) e do sequenciamento automtico do DNA, foram desenvolvidas poderosas tcnicas para o desenvolvimento de diferentes tipos de marcadores genticos moleculares. O elevado nmero de artigos cientficos que utilizam
tais marcadores no estudo de vrias espcies e com as mais variadas
aplicaes evidencia o impacto dessa tecnologia na pesquisa cientfica e tecnolgica (AYAD etal., 1997; FERREIRA;GRATTAPAGLIA,
1998; FALEIRO, 2007; BORM; CAIXETA, 2009).
Marcadores moleculares podem ser definidos como marcadores genticos baseados na deteco de isoenzimas ou sequncias
de DNA. Entre as vantagens dos marcadores moleculares, podemos
citar a obteno de um nmero praticamente ilimitado de polimorfismos genticos; a identificao direta do gentipo sem influncia
do ambiente; a possibilidade de deteco de tais polimorfismos em
qualquer estdio do desenvolvimento da planta ou do animal ou a partir de cultura de clulas ou tecidos e a possibilidade de gerar maior
quantidade de informao gentica por loco no caso de marcadores
codominantes.
Os diferentes tipos de marcadores moleculares tm permitido
estudos de evoluo, de diversidade gentica inter e intraespecfica,
de identidade, origem gentica e identificao de novos variantes,
31
biotecnologia
gerando informaes importantes para subsidiar diferentes aes de

pesquisa, principalmente relacionadas a programas de conservao,
caracterizao e uso de recursos genticos e programas de melhoramento animal e vegetal.
Neste captulo, so apresentadas informaes gerais sobre o princpio cientfico e infraestrutura necessria para obteno de diferentes tipos de marcadores moleculares. As principais anlises genticas
utilizando marcadores moleculares tambm so discutidas e exemplificadas.
Princpio cientfico dos marcadores moleculares

O princpio da utilizao dos marcadores moleculares baseado no
dogma central da biologia molecular e na pressuposio de que diferenas genticas no DNA significam, na maioria das vezes, diferenas nas protenas codificadas, as quais em conjunto levam a diferenas no fentipo (Figura 1).
Ambiente
DNA
Clula
RNA
Protenas
Fentipo
Figura 1. Dogma central da biologia molecular, evidenciando a influncia

direta do DNA no fentipo .
Existem vrios questionamentos sobre o uso apropriado das vrias

tecnologias disponveis, incluindo questes financeiras relacionadas
infraestrutura e material de custeio necessrios s metodologias,
questes metodolgicas de obteno e anlise dos marcadores moleculares considerando os diferentes tipos, questes relacionadas aos
recursos humanos com treinamento e experincia e questes relacio-
32
Captulo 2 Princpio cientfico e anlises genticas utilizando marcadores moleculares
nadas s aplicaes prticas desses marcadores. Tais questes sero

discutidas a seguir.
Infraestrutura necessria obteno

de marcadores moleculares
Fotos: Fbio Gelape Faleiro
Para a obteno de marcadores genticos moleculares, necessria uma infraestrutura para realizar as diferentes fases da metodologia, a qual varia de acordo com o tipo de marcador: de um modo geral,
so necessrios equipamentos de refrigerao para estocagem de reagentes e enzimas, equipamentos para a extrao de DNA, amplificao via reao em cadeia da polimerase (PCR), separao por eletroforese, fotodocumentao e anlise gentica dos marcadores gerados
(FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998) (Figura 2).
Figura 2. Equipamentos utilizados na obteno e anlise de marcadores

moleculares: (A) centrfugas e banho maria; (B) espectrofotmetro; (C) sistemas para eletroforese; (D) sistema refrigerao; (E) computadores; (F) termocicladores; sistemas para fotodocumentao; e (G) sequenciadores automticos de DNA (H ).
Alm do tipo do marcador molecular, a infraestrutura tambm

depende do nmero de acessos a serem analisados, sendo que equipamentos mais robustos so necessrios para anlises de grande
nmero de acessos. Normalmente, no incio do desenvolvimento das
diferentes tecnologias, tanto os equipamentos quanto o material de
33
biotecnologia
custeio so muito caros, contudo, com a concorrncia entre as diferentes empresas que fornecem tais materiais, o preo para a montagem de infraestrutura e obteno de marcadores moleculares vem
reduzindo a cada ano.
Para montar uma infraestrutura necessria obteno de marcadores moleculares, importante considerar a demanda de uso de cada
equipamento a ser adquirido. importante considerar que equipamentos robustos com alto custo de manuteno devem ser adquiridos quando existe, no laboratrio, uma grande demanda de uso de
tal equipamento. Atualmente, existem empresas privadas especializadas em determinados tipos de gerao de dados genmicos, como
sequenciamento de DNA, testes de paternidade e identidade gentica,
alm de dados de genotipagem. Em determinadas situaes, o custo
da montagem e manuteno de infraestrutura laboratorial pode ser
maior que o custo da contratao de servios terceirizados. H uma
tendncia de diminuio do custo de dados genmicos nos ltimos
anos, considerando o desenvolvimento de equipamentos mais robustos que permitem a anlise de grande quantidade de materiais genticos ao mesmo tempo e a otimizao de metodologias de anlises, as
quais utilizam menor quantidade de reagentes e suprimentos.
Outro ponto a ser considerado na montagem da infraestrutura
laboratorial est relacionado aos tipos de marcadores moleculares
e de anlises que sero implementadas. Alguns marcadores moleculares, como os isoenzimticos, exigem uma infraestrutura mais
simples, enquanto outros, como aqueles baseados em anlises de
sequncias, exigem estruturas mais complexas, envolvendo sequenciadores automticos de DNA. De toda forma, considerando a importncia da tecnologia para centros de ensino e pesquisa, desejvel que
tais instituies tenham uma infraestrutura mnima para extrao e
amplificao de DNA, separao por eletroforese, alm de computadores com acesso Internet, onde podem ser obtidas informaes
valiosas em banco de dados genmicos de acesso gratuito.
Diferentes tipos de marcadores moleculares

Existe, atualmente, um grande nmero de marcadores moleculares.
Cada tipo de marcador apresenta vantagens e desvantagens e a utili34
zao de um ou outro vai depender, entre outros fatores, do objetivo

do estudo; da infraestrutura disponvel; dos recursos financeiros para
o investimento; da disponibilidade de recursos humanos com treinamento apropriado; e do nvel de conhecimento da gentica molecular da espcie a ser estudada (FALEIRO, 2007).
Vrios autores, entre eles, Ferreira e Grattapaglia (1998), Faleiro
(2007), Caixeta etal. (2009), descrevem com detalhes vrios tipos de
marcadores moleculares. Na Tabela 1, so apresentadas as principais
caractersticas dos principais tipos de marcadores moleculares e na
Figura 3, so ilustrados alguns deles.
Tabela 1. Diferentes tipos de marcadores moleculares e suas principais caractersticas, segundo Faleiro (2007).
Marcador
Conceito / base gentica
Expresso
gentica
Conhecimento
prvio de
sequncia
Grupo de mltiplas formas

moleculares da mesma enzima
que ocorre em uma espcie,
como resultado da presena de
Isoenzimas mais de um gene codificando
Cdominante No
cada uma das enzimas. As
diferentes isoenzimas so
resultantes de variaes allicas
dos genes codificadores
RAPD
Vem do ingls Random

Amplified Polymorphic DNA,
ou seja, DNA polimrfico
amplificado ao acaso.
So fragmentos de DNA
amplificados pela PCR
utilizando primers curtos
(geralmente dez nucleotdeos)
de sequncia aleatria. Como
o primer possui sequncia
aleatria, a sequncia alvo da
amplificao desconhecida
Dominante
No
Principais
aplicaes
Fingerprinting
e diversidade
gentica
Fingerprinting,
diversidade
gentica,
mapeamento
gentico
Continua
35
biotecnologia
Tabela 1. Continuao.
Expresso
gentica
Conhecimento
prvio de
sequncia
Principais
aplicaes
Marcador
RFLP
Vem do ingls Restriction

Fragment Length Polymorphism,
ou seja, polimorfismo do
comprimento de fragmentos
de restrio. So fragmentos
de DNA obtidos com o uso de
Cdominante Sim
enzimas de restrio, separados
por eletroforese e visualizados
por meio de hibridizaes
com sondas de sequncias
homlogas marcadas com
radioatividade ou fluorescncia
Anlise
filogentica,
fingerprinting,
diversidade
gentica,
mapeamento
gentico
Marcadores microssatlites ou
SSR (Simple Sequence Repeats)
ou SSLP (Simple Sequence
Length Polymorphisms) ou STMS
Microssatlites
(Sequence Tagged Microsatellites),
/ SSR /SSLP
Cdominante Sim
so sequncias do DNA muito
/ STMS
curtas (2 a 5 pb) repetidas em
tandem (lado a lado), cuja
deteco feita pela PCR,
utilizando primers especficos
Mapeamento
gentico,
Fingerprinting,
diversidade
gentica,
anlise
filogentica
Marcador AFLP (Amplified

Fragment Length Polymorphism)
ou SFLA (Selective Fragment
Length Amplification) ou
SRLA (Selective Restriction
Fragment Amplification) so
polimorfismos de comprimento
de fragmentos amplificados.
AFLP / SFLA So fragmentos de DNA (80 a
Dominante
/SRLA
500 pb) obtidos com a digesto
do DNA com enzimas de
restrio, seguida da ligao de
oligonucleotdeos adaptadores
e amplificao seletiva dos
fragmentos via PCR. Este
tipo de marcador combina os
princpios dos marcadores
RAPD (ver) e RFLP (ver)
Mapeamento
gentico,
diversidade
gentica e
fingerprinting
No
Continua
36
Marcador
Marcadores minissatlites ou
VNTRs (Variable Number of
Tandem Repeats) so sequncias
do DNA de 10 a 100 pb repetidas
em tandem (lado a lado). O
Minissatlites nmero de repeties de tais
/ VNTRs
sequncias em cada regio
hipervarivel pode chegar a 50.
As regies hipervariveis esto
distribudas por todo genoma,
constituindo vrios locos nos
diferentes cromossomos
Expresso
gentica
Conhecimento
prvio de
sequncia
Principais
aplicaes
Cdominante
/ Dominante
(no caso de
Sim
sonda para
vrios locos)
Fingerprinting,
diversidade
gentica,
anlise
filogentica
CAPS /
PCRRFLP
Vem do ingls Cleaved

Amplified Polymorphic
Sequence, ou seja, sequncia
polimrfica amplificada e
clivada. So fragmentos de
DNA amplificados via PCR,
Cdominante Sim
utilizandose primers especficos
(20 a 30 pb), seguido da digesto
com endonucleases de restrio.
um tipo de marcador
gentico molecular tambm
conhecido como PCRRFLP
Anlise
filogentica,
fingerprinting,
diversidade
gentica,
mapeamento
gentico
SSCP /
DGGE /
TGGE
Vem do ingls SingleStrand

Conformation Polymorphism.
So fragmentos de DNA de 200
a 800 pb amplificados via PCR
usando primers especficos,
os quais so desnaturados
para fita simples e separados
por eletroforese. O princpio
deste tipo de marcador que
a eletroforese da fita simples
Cdominante Sim
do DNA permite a deteco
da variao da sequncia
de nucleotdeos de cada
fragmento, responsvel por
sua estrutura secundria. As
tcnicas de DGGE (Denaturing
Gradient Gel Electrophoresis) e
TGGE (Thermal Gradient Gel
Electrophoresis) so utilizadas na
obteno destes marcadores.
Anlise
filogentica,
fingerprinting,
diversidade
gentica
Continua
37
biotecnologia
Marcador
ISSR
Vem do ingls Inter Simple

Sequence Repeats. So
fragmentos de DNA de 100 a
3000 pb amplificados via PCR
usando um nico primer (1620
pb) construdo a partir de
sequncia de microssatlites
Expresso
gentica
Dominante
Conhecimento
prvio de
sequncia
Principais
aplicaes
No
Fingerprinting,
diversidade
gentica,
anlise
filogentica
Este tipo de marcador

gentico molecular envolve a
determinao da sequncia de
PCR
nucleotdeos de um fragmento Sequncia de
Sim
sequencing de DNA amplificado via PCR
nucleotdeos
utilizando primers especficos (15
a 30 pb) para uma determinada
regio do genoma em estudo
Taxonomia,
interespecfica,
Anlise
filogentica
SSAP
Vem do ingls SequenceSpecific

Amplified Polymorphism. um
tipo de marcador molecular
baseado na deteco de
variao em fragmentos de
DNA que flanqueiam stios de
insero de retrotransposons. Os
fragmentos so amplificados
via PCR usando um primer
desenhado a partir da regies
de terminao conservadas
(LTRs Long Terminal Repeats)
e outro baseado na presena
de um stio de endonucleases
de restrio prximo s LTRs
Cdominante Sim
Anlise
filogentica,
mapeamento
gentico
IRAP
Vem do ingls
InterRetrotransposon Amplified
Polymorphism. um tipo de
marcador molecular baseado
na deteco de variao
em stios de insero de
Cdominante Sim
retrotransposons. Fragmentos
de DNA so amplificados
via PCR usando primers
desenhados a partir das regies
de terminao conservadas
(LTRs Long Terminal Repeats)
Anlise
filogentica,
mapeamento
gentico
Continua
38
Expresso
gentica
Conhecimento
prvio de
sequncia
Principais
aplicaes
Marcador
REMAP
Vem do ingls
RetrotransposonMicrosatellite
Amplified Polymorphism. um
tipo de marcador molecular
baseado na deteco de variao
em stios de insero de
retrotransposons. Fragmentos
entre retrotransposons e
Cdominante Sim
microssatlites so amplificados
via PCR usando um primer
baseado nas regies de
terminao conservadas
(LTRs Long Terminal
Repeats) e outro baseado em
regies de microssatlites
Anlise
filogentica,
mapeamento
gentico
RBIP
Vem do ingls Retrotransposon

Based Insertional Polymorphism.
um tipo de marcador
molecular amplificado via PCR
utilizando primers desenhados
a partir de retrotransposon e
suas regies flanqueadoras.
A presena ou ausncia da
insero de retrotransposons so Cdominante Sim
investigadas com base em duas
PCRs: a primeira PCR usando
um primer desenhado a partir do
retrotransposon e outro a partir
de uma regio flanqueadora
e a segunda PCR usando
primers desenhados a partir das
duas regies flanqueadoras
Anlise
filogentica,
mapeamento
gentico
Continua
39
biotecnologia
Expresso
gentica
Conhecimento
prvio de
sequncia
Principais
aplicaes
Marcador
Genmica
funcional
um tipo de marcador
molecular do DNA utilizado
para identificar mutaes e
polimorfismos baseados em
informaes de seqenciamento
do DNA para o desenho de
primers e sondas especficas.
Entre estes marcadores, podese
citar aqueles baseados em
Sequncia de
seqencias conservadas de
Sim
nucleotdeos
genes de resistncia como a
NBS (Nucleotide Binding Site) e
a LRR (Leucine Rich Repeat) e
aqueles baseados na tecnologia
do chip de DNA, os quais
so baseados na hibridizao
entre sondas e sequncias
complementares de microarrays
(microarranjos) de DNA
Diversidade
funcional,
mapeamento
gentico,
estudos de
expresso
gnica
SNP
Vem do ingls Single Nucleotide

Polymorphism. um tipo de
marcador molecular do DNA
utilizado para identificar
mutaes e polimorfismos
baseados na posio de
um nico nucleotdeo,
necessitando de informaes
de seqenciamento do DNA
para o desenho de primers
e sondas especficas
Diversidade
funcional,
anlise
filogentica
DAF
Vem do ingls DNA

Amplification Fingerprinting.
uma estratgia para deteco
de diferenas genticas entre
Dominante
organismos por meio da
amplificao do DNA genmico,
utilizandose um nico primer
de sequncia arbitrria
MAAP
Vem do ingls Multiple

Arbitrary Amplicon Profiling.
um termo coletivo para as
tcnicas de PCR que utilizam
primers de sequncia arbitrria,
como os marcadores RAPD,
AFLP, DAF, entre outros
Sequncia de
Sim
nucleotdeos
Dominante
No
Fingerprinting,
diversidade
gentica,
mapeamento
gentico
No
Fingerprinting,
diversidade
gentica,
mapeamento
gentico
Continua
40
DAMD
Vem do ingls Directed

Amplification of
Minisatelliteregion DNA.
uma tcnica de obteno
de marcadores genticos
moleculares amplificados via
PCR usando um nico primer
(1620 pb) construdo a partir
de sequncia de minissatlites
SPAR
Vem do ingls Single Primer

Amplification Reaction, ou seja,
reao de amplificao com
primer nico. uma tcnica
para obteno de marcadores
Dominante
genticos moleculares do DNA
por meio da amplificao via
PCR usando um nico primer
(1620 pb) construdo a partir de
sequncia de microssatlites
Dominante
Conhecimento
prvio de
sequncia
Principais
aplicaes
Sim
Fingerprinting,
diversidade
gentica,
mapeamento
gentico
Sim
Fingerprinting,
diversidade
gentica,
mapeamento
gentico
Foto: Fbio Gelape Faleiro.
Expresso
gentica
Marcador
Figura 3. Polimorfismos dos marcadores moleculares: (A) isoenzimas;

(B)RAPD; (C) RFLP; (D) microssatlites; (E) AFLP; (F) minissatlites;
(G)CAPS; (H) e SSCP.
Continua
41
biotecnologia
Anlises genticas com o uso de

marcadores moleculares
Embora exista um grande nmero de marcadores moleculares,
o princpio da anlise desses marcadores o mesmo: marcadores comuns aos acessos significam semelhanas e marcadores no
comuns significam diferenas genticas. Os dados sobre semelhanas e diferenas genticas entre acessos permitem gerar uma grande
quantidade de informaes sobre a diversidade gentica e relacionamentos filogenticos entre eles. Tais informaes geradas pelos
marcadores moleculares representam uma amostra considervel do
genoma de cada material gentico, sem influncia do ambiente.
Faleiro (2007) relata alguns passos envolvidos na anlise de marcadores moleculares, os quais so descritos a seguir.
O primeiro passo a codificao dos fragmentos moleculares em
dados binrios (no caso de marcadores dominantes) ou dados de coincidncia allica (no caso de marcadores codominantes). Os dados
para marcadores dominantes normalmente so codificados como 1
(presena do marcador) e 0 (ausncia do marcador). Os dados para
marcadores codominantes normalmente so codificados como 0
(ausncia de alelos comuns no loco), (um alelo comum no loco) e
1(os dois alelos comuns no loco). No caso de marcadores baseados
na sequncia de nucleotdeos, a codificao a prpria sequncia de
nucleotdeos, representados pelas quatro diferentes bases nitrogenadas do DNA (Adenina, Timina, Citosina e Guanina).
O segundo passo utilizar os dados codificados para a estimativa
de ndices de similaridade ou de distncia gentica entre cada par de
materiais genticos. Existem vrios ndices descritos na literatura,
como o ndice de similaridade de Nei e Li (1979), Sneath e Sokal
(1973), Gower (1971) tambm citado como coeficiente de similaridade
de Jaccard, entre outros. Normalmente, os coeficientes de correlao
entre os diferentes ndices so muito altos (CORRA etal., 1999),
embora existam algumas diferenas importantes entre eles (DIAS,
1998). No caso de marcadores baseados na sequncia de nucleotdeos
de um determinado fragmento de DNA, os ndices de similaridade
42
ou de distncia so calculados com base na homologia de sequncia

(KIMURA, 1980).
Com base nos ndices, estabelecese uma matriz de similaridade ou
de distncias entre os acessos, a qual vai servir de base para as anlises de agrupamento e de disperso dos acessos. As anlises de agrupamento normalmente so baseadas em mtodos hierrquicos, os quais
podem utilizar diferentes critrios de agrupamento: vizinho mais prximo (single linkage); vizinho mais distante (complete linkage); e baseado na mdia das distncias (unweighted pairgroup method using arithmetic average). Dias (1998) descreve a aplicao de cada um desses
critrios discutindo sobre as vantagens e desvantagens de cada um.
No caso da anlise de disperso dos acessos, o mtodo mais utilizado
aquele baseado em escalas multidimensionais por meio das coordenadas principais. Esse mtodo tem sido denominado anlise de coordenadas principais (PCDA principal coordinates analysis) (GOWER,
1966) e tambm discutido por Dias (1998). Na Figura 4, observamse
as etapas e os procedimentos mais utilizados para as anlises de marcadores genticos moleculares.
Matriz de distncia
1
Marcadores
1
1
2
3
4
5
6
0,50
0,14
0,25
0,33
0,40
2
3
4
5
0,33 0,20 0,11 0,09 0,20 0,09 0,17 0,27 0,17 0,08
Matriz de similaridade
6
-
1
2
3
4
5
6
1
0,50
0,86
0,75
0,67
0,60
2
3
4
5
0,67 0,80 0,89 0,91 0,80 0,91 0,83 0,73 0,83 0,92
6
-
Dendrograma
1
3
4
2
5
6
Anlise
Estatstica
Dados binrios
1
1
0
0
1
0
0
1
1
1
1
0
0
1
1
1
0
0
1
0
1
1
1
0
1
1
0
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Grfico de disperso
Agrupamento
Acessos
Grupo
<1>
<2>
<3>
1
3
2
4
5
2
6
Figura 4. Etapas e os procedimentos mais utilizados para as anlises de marcadores genticos moleculares.
Fonte: Faleiro (2007).
43
biotecnologia
Os mtodos analticos e a interpretao dos dados moleculares com

relao gentica de populaes, filogenia, evoluo e suas diferentes
aplicaes exigem procedimentos de anlise multivariada e dependem
do tipo do marcador molecular que est sendo utilizado e do objetivo
do trabalho (AVISE, 1993; HARTL; CLARK, 1989).
Com relao ao tipo de marcador, importante diferenciar aqueles
que fornecem dados a partir de um nico loco (por exemplo: PCR/
DNA sequencing) daqueles que fornecem dados multilocos obtidos de
mltiplas regies gnicas (por exemplo: RAPD, AFLP, Minissatlites).
Essa diferenciao importante porque a quantidade da informao
acessada influencia as interpretaes dos dados. Outra diferenciao
importante so os dados gerados por marcadores dominantes (por
exemplo: RAPD, AFLP) e por marcadores codominantes (por exemplo: RFLP, microssatlites). Marcadores codominantes fornecem
informaes valiosas sobre nmero e frequncia allica em determinado loco de uma populao ou grupo de indivduos, alm da porcentagem de heterozigosidade dos locos de cada indivduo analisado.
Com relao ao objetivo do trabalho, marcadores moleculares mais
apropriados podem ser preferencialmente utilizados de acordo com
o objetivo do estudo (AVISE, 1993). De um modo geral, marcadores
moleculares multilocos utilizados em DNA fingerprinting (por exemplo: RAPD, AFLP, Microssatlites, Minissatlites) so mais apropriados para estudos de identidade gentica, testes de paternidade e estudos de variabilidade dentro da mesma espcie. Marcadores baseados
em comprimentos de fragmentos de restrio como os RFLPs obtidos de mtDNA, cpDNA, rDNA so mais apropriados para estudos de
diversidade gentica de espcies fortemente relacionadas. Marcadores
baseados em anlises de sequncias (por exemplo: PCR sequencing)
so apropriados para anlises de espcies com alto nvel de divergncia evolucionria, embora possam ser utilizados para anlises de
espcies ou acessos com qualquer nvel de divergncia evolucionria
(FALEIRO, 2007).
A flexibilidade dos marcadores PCR sequencing para estudos em
diferentes nveis de divergncia evolucionria devese existncia de
diferentes genes ou regies gnicas com diferentes taxas de substituio de nucleotdeos (AVISE, 1993), de modo que, dependendo do
44
nvel de divergncia evolucionria que se deseja investigar, genes ou

sequncias de regies gnicas mais apropriadas podem ser escolhidas para a realizao do estudo.
A anlise dessas sequncias para estudos filogenticos baseada na
homologia de sequncias de diferentes indivduos, populaes, espcies, gneros etc. Os resultados de tais anlises podem gerar matrizes
de distncias e suas variaes estatsticas (Figura 4) ou permitir a realizao de algoritmos de anlise filogentica baseados no princpio de
agrupamento de Hennigian (AVISE, 1993) ou em anlises de parcimnia, como a parcimnia de Wagner (FARRIS, 1970), de CaminSokal
(CAMIN; SOKAL, 1965) e a parcimnia generalizada (SWOFFORD;
OLSEN, 1990). Arriel etal. (2009) fazem uma tima reviso sobre
mtodos de anlise filogentica utilizando marcadores moleculares.
Os diferentes procedimentos estatsticos permitem que a reconstruo filogentica possa ser realizada utilizando construes grficas baseadas em unidades de distncia gentica ou em unidades de
tempo (Figura 5). Unidades de tempo permitem, por exemplo, importantes estudos sobre a evoluo de um determinado grupo de espcies ou gneros relacionados.
Unidade de tempo
Seqncias
1
1
5
6
4
2
3
tempo
Unidade de distncia
4
3
5
2
Figura 5. Ilustrao de anlises genticas utilizando como input sequncias

de regies genmicas, gerando como output construes grficas de agrupamento baseadas em unidades de tempo e distncia gentica.
45
biotecnologia
A anlise em unidades de tempo pode ser baseada, por exemplo,

na porcentagem de substituio de nucleotdeos em uma determinada sequncia, comparandose diferentes indivduos, populaes,
espcies, gneros etc. Neste caso, os marcadores moleculares baseados em anlises de sequncias so mais apropriados, entretanto existem metodologias para estimar a diversidade nucleotidica a partir de
marcadores moleculares baseados na PCR, como os RAPD (CLARK;
LANIGAN, 1993). A metodologia descrita por Clark e Lanigan (1993)
usa a frequncia de indivduos com ausncia de um fragmento para
estimar a frequncia de homozigotos recessivos e assim a frequncia
gnica e a diversidade nucleotdica. Tal metodologia foi utilizada com
sucesso por Carvalho e Schaal (2001). A ajuda computacional para
a realizao dessas anlises tambm essencial, considerandose a
grande quantidade de dados moleculares.
Outro tipo de anlise muito comum em trabalhos cientficos que
utilizam marcadores moleculares so aquelas baseadas na cosegregao das marcas moleculares (CRUZ; SILVA, 2009) e sua associao com caractersticas de interesse econmico (FERREIRA;
GRATTAPAGLIA, 2009). Esse tipo de anlise muito utilizado em
trabalhos de mapeamento gentico ou construo de mapas de ligao
(SCHUSTER; CRUZ, 2004). A localizao de genes e regies genmicas que controlam caractersticas de interesse tem sido feita com
sucesso com o auxlio de marcadores moleculares organizados em
grupos de ligao, os quais so construdos com base nas anlises de
cosegregao. Mapas genticos baseados em marcadores moleculares possibilitam a localizao de genes relacionados a caractersticas
qualitativas, bem como a contagem aproximada dos principais locos
envolvidos no controle de caractersticas quantitativas, estimando a
magnitude do efeito destes locos no fentipo de interesse (FERREIRA;
GRATTAPAGLIA, 2009; CRUZ etal., 2009a; 2009b). O princpio das
anlises de cosegregao de marcadores moleculares e caractersticas de interesse econmico so ilustrados na Figura 6.
46
x
Genitor
Suscetvel
Genitor
Resistente
Planta
F1
x
. . .
Populao
Segregante
F2
Marcador molecular que c-segrega com o fentipo de resistncia
Figura 6. Princpio da anlise de cosegregao de marcadores moleculares

e caractersticas de interesse econmico.
Bioinformtica e marcadores moleculares

A realizao de anlises genticas utilizando marcadores moleculares seria praticamente impossvel sem a ajuda computacional, principalmente quando vrios acessos so analisados simultaneamente. Da
unio da cincia computacional com a matemtica e a biologia surgiu
a bioinformtica. Numa definio abrangente, a bioinformtica tida
como o estudo e a aplicao de tcnicas computacionais e matemticas
gerao e gerenciamento de informaes biolgicas, em especial, da
biologia molecular. De maneira geral, a bioinformtica pode combinar informaes de qumica, fsica, biologia, cincia da computao
e matemtica/estatstica para processar dados biolgicos.
Apesar do grande avano obtido at os dias de hoje, a rapidez com
que surgem novas tcnicas da biologia molecular e o gigantesco
volume de dados e informaes produzidos pelos projetos nessa rea
exigem que a bioinformtica esteja em constante evoluo. O desenvolvimento de ferramentas de bioinformtica para a organizao de
bancos de dados, respectivas anlises e modelagem, a adaptao de
ferramentas de bioinformtica para o desenvolvimento de protocolos
para apoio a programas de conservao, caracterizao e uso de ger-
47
biotecnologia
moplasma e de melhoramento gentico so importantes demandas

para a pesquisa (FALEIRO etal., 2009).
Existem vrios softwares disponveis para a anlise de marcadores
moleculares, entre eles o Genes (CRUZ, 1997); o Statistica (STATSOFT,
1999); o NTSYS (ROHLF, 1992); o GQMOL (CRUZ; SCHUSTER, 2000);
o SPSS (NORUSIS, 1993); o SAS (SAS, 1989); Mapmaker (LANDER
etal., 1987; LINCOLN etal., 1992); Joinmap (VAN OOIJEN; VOORRIPS,
2001); Jump (SAS, 1989); QTL Cartographer (BASTEN etal., 1994;
BASTEN etal., 1999), entre outros. Na Figura 7, esto ilustradas algumas das interfaces desses softwares.
Figura 7. Interface de alguns softwares utilizados para a anlise gentica utilizando marcadores moleculares: (A) Genes; (B) Statistica; (C) NTSYS; (D)
GQMOL; (E) SPSS; (F) SAS; (G) Joinmap; (H) Jump; (I) QTL Cartographer.
As diferenas entre os vrios softwares disponveis esto relacionadas aos procedimentos e abrangncia das anlises; aos formatos dos
arquivos utilizados como entrada de dados; robustez e linguagem
de programao; e qualidade grfica dos resultados ou sada dos
dados, bem como facilidade ou no da utilizao dos procedimentos de anlises disponveis na interface com o usurio.
48
Embora a utilizao de cada software seja considerada difcil para

os iniciantes, a maioria dos manuais ou sistemas de ajuda so didticos e contm exemplos de cada procedimento de anlise, facilitando,
dessa forma, sua utilizao. De toda forma, o conhecimento bsico da
gentica mendeliana, molecular e quantitativa fundamental para a
correta interpretao dos dados gerados pelos diferentes tipos de marcadores moleculares.
Consideraes finais
O desenvolvimento de tcnicas de obteno de marcadores moleculares tem sido fascinante. Vrias tcnicas de biologia e gentica molecular esto disponveis para obteno de vrios tipos de marcadores
moleculares e, a cada ano, surgem novas. Algumas tcnicas so mais
robustas possibilitando a obteno de grande quantidade de polimorfismos genticos em curto espao de tempo e outras so mais simples demandando uma infraestrutura bsica e baixa quantidade de
reagentes e suprimentos.
Paralelamente ao desenvolvimento das tcnicas de obteno, grandes avanos tm sido obtidos na rea da bioinformtica, possibilitando
diferentes tipos de anlises genticas cada vez mais acuradas e precisas, dando subsdios para diferentes aplicaes prticas dos marcadores moleculares em estudos genticos e como ferramenta auxiliar
em programas de conservao, caracterizao e uso de germoplasma
e melhoramento gentico vegetal e animal.
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52
Captulo 3
Aplicaes de marcadores
moleculares como ferramenta
auxiliar em programas de
conservao, caracterizao
e uso de germoplasma e
melhoramento gentico vegetal
Fbio Gelape Faleiro
Introduo
Os marcadores moleculares permitem gerar uma grande quantidade de informaes sobre identidade gentica, diversidade, frequncia gnica, relacionamentos filogenticos, mapeamento gentico,
seleo assistida, entre outras. Essas informaes so extremamente
teis em programas de conservao, caracterizao e uso de germoplasma e melhoramento gentico.
As informaes moleculares podem complementar as informaes ecolgicas, morfolgicas e agronmicas dos recursos genticos,
contribuindo para aumentar a eficincia dos processos de coleta; direcionar o enriquecimento da base gentica; formar e validar colees
nucleares e de trabalho; analisar a diversidade e a pureza gentica;
identificar acessos duplicados e redundantes; auxiliar trabalhos de
classificao botnica e filogenia e subsidiar a seleo de genitores, o
planejamento dos cruzamentos e a seleo de gentipos com caractersticas desejadas em programas de melhoramento gentico.
Dessa forma, podese dizer que os marcadores moleculares so
ferramentas poderosas na gerao de informaes teis em diferentes etapas, desde a coleta, caracterizao e uso de recursos genticos, passando por atividades de prmelhoramento, melhoramento
e psmelhoramento. Vrios autores tm discutido as aplicaes prticas dos marcadores moleculares em programas de conservao,
caracterizao e uso de germoplasma (AYAD etal., 1997; FALEIRO,
55
biotecnologia
2007; FALEIRO etal., 2008) e em programas de melhoramento

envolvendo as atividades de pr e psmelhoramento (FERREIRA;
GRATTAPAGLIA, 1998; PINTO etal., 2007; FALEIRO etal., 2008;
PEREIRA etal., 2009; GUIMARES etal., 2009; SCHUSTER etal.,
2009).
Na Figura 1, so apresentadas as principais aplicaes dos marcadores moleculares em uma ordem cronolgica, subsidiando diferentes atividades desde a coleta de recursos genticos at a caracterizao molecular de variedades melhoradas e sua utilizao na proteo
da propriedade intelectual. Essas aplicaes sero discutidas e exemplificadas neste captulo.
Aplicaes prticas dos marcadores moleculares
Anlise da distribuio geogrfica da variabilidade gentica.
Anlise de acessos duplicados e redundantes.
Anlise de pureza gentica e contaminao de germoplasma.
Anlise da diversidade gentica e frequncia gnica.
Auxlio em trabalhos de classificao botnica e filogenia.
Germoplasma
Estratgias de amostragem para coleta de recursos genticos.
Composio de colees nucleares e de trabalho.

Caracterizao de germoplasma.
Recuperao mais rpida do genoma recorrente.

Desenvolvimento de mapas genticos.
Mapeamento comparativo.
Mapeamento gnico.
Seleo assistida por marcadores moleculares.
Seleo genmica ampla.
Predio de desempenho de hbridos simples.
Anlise de homogeneidade gentica de sementes.
Anlise de pureza gentica de sementes e mistura varietal
Anlise de identidade gentica ou fingerprinting.
Caracterizao e proteo de cultivares.
Melhoramento
Testes de ascendncia gentica e paternidade.
Ps-Melhoramento
Confirmao de hibridaes e autofecundaes.
Pr-melhoamento
Auxlio na seleo de genitores para programas de melhoramento.
Figura 1. Principais aplicaes prticas dos marcadores moleculares em programas de conservao, caracterizao e uso de germoplasma e programas de
melhoramento gentico envolvendo atividades de pr e psmelhoramento.
56
Captulo 3 Aplicaes de marcadores moleculares como ferramenta auxiliar em programas...
Anlise da distribuio geogrfica

da variabilidade gentica
O princpio dessa aplicao dos marcadores moleculares confrontar a variabilidade gentica molecular com a distribuio geogrfica
de vrios acessos do germoplasma. Para a anlise da distribuio geogrfica, informaes de latitude e longitude do local de coleta de cada
acesso podem ser plotadas conjuntamente com mapas do Sistema de
Informao Geogrfica (SIG) (BRASIL, 1981) com o auxlio do programa ArcView GIS (www.esri.com) (COSTA, 2004). Dessa forma,
descritores ecolgicos do local de coleta de cada acesso, como o tipo
de vegetao, tipo de solo, estado, municpio, bacia hidrogrfica, pluviometria mdia, entre outros, podem ser obtidos. Na Figura 2, ilustrase a distribuio geogrfica de acessos de Stylosanthes macrocephala
salientando regies onde foram coletados acessos com maior diversidade gentica entre si, segundo dados de Costa etal. (2005).
N
Figura 2. Distribuio geogrfica de acessos de Stylosanthes macrocephala (A),

salientando as reas (B) onde foram coletados acessos com maior diversidade
gentica entre si calculada com base em marcadores moleculares RAPD.
Fonte: Costa (2004).
57
biotecnologia
Marcadores moleculares associados a sistemas de informao

geogrfica tm permitido estudos da diversidade gentica de acessos por regies, identificao de regies de maior ou menor diversidade (OLSEN; SCHAAL, 1999; CARVALHO etal., 2000a; COSTA
etal., 2005) e a recuperao de informaes importantes sobre as
condies ambientais e biolgicas dos locais de coleta de cada acesso
(GREENE etal., 1999; GUARINO etal., 2002). Essas informaes
so complementares aos dados fenotpicos e geogrficos e tm orientado a escolha de locais para conservao in situ, atividades de coleta
para conservao ex situ e a busca de combinaes gnicas de interesse para programas de melhoramento gentico (RICK etal., 1974;
ZIMMERER; DOUCHES, 1991; HUANG etal., 1998; COSTA, 2004;
FALEIRO etal., 2004a).
Estratgias de amostragem para

coleta de recursos genticos
A coleta de recursos genticos uma etapa bsica e de extrema
importncia para os programas de conservao e uso de recursos
genticos realizada por meio de expedies, com o objetivo de resgatar plantas ou populaes de plantas de interesse. Normalmente, em
uma expedio, plantas so resgatadas por meio de sementes e (ou)
mudas e, geralmente, procurase amostrar eficientemente a diversidade gentica existente. A escolha inadequada dos locais de coleta
pode fazer com que no haja uma boa representatividade da variabilidade gentica que precisa ser conservada e utilizada.
Na Figura 3, ilustrase um estudo sobre a diversidade gentica de
acessos de cacaueiro coletados nas regies amaznicas do Brasil, Peru
e Equador (FALEIRO etal., 2004a), mostrando a formao de grupos
contendo materiais de diferentes origens amaznicas, no evidenciando uma regionalizao clara da variabilidade gentica. Esta no
regionalizao, na verdade, explicada pela alta variabilidade gentica
dos materiais utilizados no presente estudo, confirmando a importncia da regio amaznica para misses de coleta de recursos genticos visando ampliao da base gentica de programas de melhoramento do cacaueiro.
58
Estudos da diversidade gentica molecular de acessos ou populaes em diferentes regies podem fornecer informaes importantes
sobre estratgias de amostragem para realizao de eficientes trabalhos de coleta (nmero de acessos, tamanho de cada populao, anlise quantitativa e qualitativa das regies onde sero feitas as coletas,
etc.) (LAMBOY etal., 1994; 1996; CESKA etal., 1997; ZORO BI etal.,
1998; NEBAUER etal., 1999).
Equador
1
3
Brasil
16
14
13
18
19
2
Peru
17
12
15
10
7
11
RAPD
1 CSUL 3
11 CSUL 8
2 SCA 6
12 U 32
3 SIAL 70
13 CAB 148
LEGENDA
4 LCTEEN 37
14 U 6
Amaznia brasileir a
5 CAB 324
15 U 11
6 EQX 3360
16 U 14
7 COCA 3370
17 EQX 107
8 EQX 3348
18 U 10
9 CAB 191
19 EQX 3161
Amaznia peruana
Amaznia equatoriana
Material trinitrio
9
8
12
10
13
17
18
11
19
14
16
5
2
15
10 ICS 1
Microssatlite s
Figura 3. Disperso grfica e anlise de agrupamento de 19 acessos de

cacaueiro (Theobroma cacao L.) provenientes das amaznias brasileira, p
eruana
e equatoriana com base em distncias genticas calculadas a partir de marcadores RAPD (A) e microssatlites (B).
Anlises de acessos duplicados ou redundantes

Em colees base de trabalho e bancos ativos de germoplasma, a
presena de acessos duplicados ou redundantes, em conjunto com
problemas de sinonmia, homonmia e erros de identificao, dificulta
a transferncia de resultados e recomendaes entre diferentes programas de melhoramento e aumenta o gasto de tempo e recursos para
a conservao e avaliao do potencial gentico dos acessos. Esses pro-
59
biotecnologia
blemas so agravados em bancos de germoplasma de acessos mantidos in vivo em espaos nobres como telados antiafdeos onde o custo
de construo do espao e a manuteno do acesso so muito altos
(Figura 4) e em bancos de germoplasma de plantas perenes mantidas em condies de campo em reas extensas que implicam em
rduo trabalho nas atividades de manuteno e avaliao (Figura 5).
Marcadores moleculares tm sido utilizados para eliminar ou diminuir tais problemas, sendo exemplos a anlise de acessos duplicados
ou redundantes em bancos ativos e colees de trabalho de cacaueiro
(FALEIRO etal., 2002); amendoim forrageiro (FALEIRO etal., 2003a);
alface (WAYCOTT; FORT, 1994); cevada (HINTUM; VISSER, 1995);
arroz (VIRK etal., 1995); couveflor (HINTUM etal., 1996); uva
(CERVERA etal., 1998); mandioca (CHAVARRIAGAAGUIRRE etal.,
1999); sorgo (DEAN etal., 1999); batata (MCGREGOR etal., 2002);
entre outras culturas.
Figura 4. Banco de germoplasma de acessos de maracujazeiro mantidos sob

telado antiafdeo, Embrapa Cerrados, Planaltina, DF .
60
Figura 5. Realizao de tratos culturais em banco ativo de germoplasma de

cacaueiro, Centro de Pesquisas do Cacau, Itabuna, BA .
Anlise de pureza gentica e

contaminao de germoplasma
Acessos, principalmente de espcies autgamas, normalmente
so representados em bancos de germoplasma por vrias sementes.
Anlise da pureza gentica dessas sementes pode ser feita utilizando
marcadores moleculares (TANKSLEY; JONES, 1981; TREUREN;
HINTUM 2001). O princpio dessa aplicao estimar o parentesco
gentico entre as sementes com base na similaridade gentica calculada a partir dos marcadores moleculares. possvel, por exemplo,
quantificar taxas de polinizao cruzada (FERREIRA etal., 2000) e
verificar contaminaes genticas em amostras de sementes de um
determinado acesso (STEINER etal., 1997; BORNER etal., 2000). Na
Figura 6, ilustrase a deteco de contaminao gentica de sementes do acesso CPAC 2251 de Stylosanthes macrocephala com base em
anlises de marcadores moleculares (COSTA, 2004). Essa deteco
61
biotecnologia
baseada na diferena gentica da planta 11 em relao s demais, a

qual no seria esperada dentro do acesso.
A estabilidade gentica de uma determinada coleo de germoplasma tambm pode ser analisada com base em marcadores moleculares (ISABEL etal., 1993; WU etal., 1998; GOTO etal., 1998;
BORNER etal., 2000). A manuteno da integridade e da estabilidade
gentica dos recursos genticos um dos principais objetivos dos programas de conservao. A perda da estabilidade gentica devido a
mudanas nas frequncias gnicas, as quais podem ocorrer devido
seleo, mutao, eroso gentica e migrao/contaminao. No
caso de colees de germoplasma, a eroso gentica e os processos de
contaminao, normalmente decorrentes dos ciclos de rejuvenescimento para a recuperao da viabilidade das sementes, so as principais causas da perda da estabilidade gentica. Marcadores moleculares
podem auxiliar o acompanhamento da estabilidade gentica de acessos ao longo do tempo em diferentes condies de armazenamento
ou aps perodos de regenerao (REEDY etal., 1995; WU etal., 1998;
PARZIES etal., 2000) e, dessa forma, subsidiar as melhores estratgias de manuteno e manejo dos acessos no banco de germoplasma.
A perda da estabilidade gentica de um grupo de acessos em uma
determinada condio de armazenamento pode subsidiar a noutilizao ou ajustes da referida condio. A perda da estabilidade aps
um perodo de ciclos de rejuvenescimento pode subsidiar a melhoria
do processo de modo a evitar ou diminuir o problema.
62
PL1
PL7
PL8
PL4
PL5
PL3
PL6
PL9
PL10
PL11
Bulk
PL2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Distncia de Ligao
PL1
PL8
PL2
PL10
Bulk
PL6
PL5
PL3
PL4
PL9
PL7
PL11
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Distncia de Ligao
Figura 6. (A) Anlises de agrupamento de plantas do acessos CPAC 1043 e

(B) CPAC 2251 de Stylosanthes macrocephala, evidenciando a contaminao
de sementes do CPAC 2251 .
Fonte: Costa (2004).
63
biotecnologia
Anlise da diversidade gentica e

frequncia gnica populacional
Os diferentes tipos de marcadores moleculares disponveis apresentam a capacidade de analisar de forma ampla genomas de interesse,
sem influncia do ambiente, e, dessa forma, gerar informaes precisas
sobre a diversidade gentica e a frequncia gnica populacional (HARTL;
CLARK, 1989; OUBORG etal., 1999). Essas informaes so extremamente teis em todas as fases dos programas de conservao de recursos genticos, passando pela coleta (DEL RIO etal., 1997a), conservao (WU etal., 1998), manuteno (SPAGNOLETTIZEULI etal., 1995;
REEDY etal., 1995) e manejo (DEL RIO etal., 1997b) das colees, alm
de facilitar o uso do germoplasma em programas de melhoramento
gentico (ABDELNOOR etal., 1995; BELLON etal., 2007; BELLON
etal., 2009; KARP etal., 1997; FALEIRO etal., 2004b; 2004c; 2009).
Um exemplo da importncia dos estudos de diversidade gentica e
frequncia gnica populacional utilizando marcadores moleculares
o trabalho realizado no Centro de Pesquisas do Cacau. Desde 1993,
um trabalho de identificao e seleo de plantas resistentes vassouradebruxa e com boas caractersticas de produtividade est sendo
realizado em plantaes comerciais da regio cacaueira baiana, com
a valiosa ajuda dos produtores (Figura 7). Diferentes critrios vm
sendo utilizados para a seleo dos acessos de cacaueiro em plantaes comerciais, os quais visam atingir dois requisitos bsicos: produtividade e resistncia vassouradebruxa (PINTO; PIRES, 1998).
Alm dessas duas caractersticas principais, o processo de seleo
busca acessos de cacaueiro com alta diversidade gentica entre si e,
tambm, geneticamente distintos das tradicionais fontes de resistncia vassouradebruxa, como o Scavina6 (FALEIRO etal., 2004d).
Nesse sentido, Faleiro etal. (2004e) realizaram um estudo da diversidade gentica desses acessos selecionados em relao ao Scavina6,
identificando acessos de extrema importncia para uso em programas
de melhoramento e multiplicao para distribuio aos produtores.
Esses acessos selecionados esto contribuindo para a ampliao da
base gentica da resistncia das atuais variedades clonais recomendadas para o plantio.
64
24
4
6
16
27
1
30
31
26
20
32
33
17
23
1 Scavina-6
2 ICS-1
3 SIC-19
29
15
14
5
18
34
19
13
25
28
4 IMC-67
12 11
22
3
21
10
Acessos selecionados
em plantaes comerciais
Acessos distintos
geneticamente de Scavina-6
Figura 7. Identificao e seleo de plantas (acessos) resistentes vassouradebruxa em plantaes comerciais com a ajuda de produtores e estudo
de diversidade gentica desses acessos em relao ao Scavina6 (principal
fonte de resistncia) e outros genitores utilizados no programa de melhoramento gentico do cacaueiro .
As informaes de diversidade gentica e frequncia gnica obtidas com o uso dos marcadores moleculares geram uma grande quantidade de caractersticas adicionais, que podem ser combinadas com
dados de pedigree, do local de coleta e com caractersticas morfolgicas, fisiolgicas e agronmicas, fornecendo uma anlise mais completa da coleo e de cada acesso (LIVINI etal., 1992; ABDELNOOR
etal., 1995; VASCONCELOS etal., 1996; CARVALHO et al, 2000b;
2000c; HUANG etal., 2002; FALEIRO etal., 2004b; 2004c; 2004d;
VIEIRA etal., 2008).
Auxlio em trabalhos de classificao

botnica e filogenia
Diversos sistemas de classificao botnica e filogentica de plantas
e outros organismos, baseados em diferentes critrios, tm sido utilizados e aperfeioados ao longo dos anos. Inicialmente era utilizada
a sistemtica evolutiva (baseada na morfologia, paleontologia, ecologia, ontogenia), depois a taxonomia numrica ou sistemtica fentica (baseada na quantidade de similaridade geral entre os organismos estudados interpretada como distncia evolutiva), e atualmente
a sistemtica cladstica (baseada apenas nas caractersticas homlo-
65
biotecnologia
gas derivadas e compartilhadas de um ancestral comum prximo).

Paralelamente ao avano dos sistemas de classificao, a utilizao
de marcadores moleculares nesses estudos foi se tornando cada vez
mais comum (ARRIEL etal., 2009).
Segundo Arriel etal. (2009), embora os mtodos morfolgicos sejam
muito teis em uma grande variedade de situaes, em muitos casos,
eles no podem ser aplicados, uma vez que no existem caractersticas morfolgicas suficientes compartilhadas entre organismos geneticamente mais distantes. Diante das dificuldades encontradas para a
obteno da filogenia pelos mtodos tradicionais, usando caracteres
morfolgicos, fisiolgicos, comportamentais, entre outros, passouse
a utilizar dados moleculares para obteno das rvores filogenticas,
surgindo a chamada filogenia molecular, que o estudo das relaes
evolucionrias entre os organismos usando dados moleculares, como
sequncias de DNA, RNA e protenas, inseres de elementos transponveis, ou outros marcadores moleculares (ARRIEL etal., 2009).
Um exemplo da utilidade dos marcadores e anlises moleculares
para uma srie de estudos evolucionrios, filogenticos e taxonmicos o trabalho de Muschner (2005), estudando diferentes subgneros e espcies do gnero Passiflora. Importantes informaes sobre
filogenia molecular, taxas evolutivas e tempo de divergncia so apresentadas e discutidas. Na Figura8, ilustrase uma construo filogentica obtida com base em marcadores moleculares.
Com relao classificao botnica, muitas vezes o uso da metodologia no fcil, por causa da alta variabilidade intraespecfica e o
efeito ambiental sobre o fentipo diferenciador entre espcies e variedades botnicas dentro da espcie. Marcadores moleculares podem
ser utilizados para auxiliar tais trabalhos, considerando o poder
de diferenciao inter e intraespecfico e a no influncia ambiental nas informaes geradas (BRONDANI, 1996; LAKSHMI etal.,
1997; OUBORG etal., 1999.; KIM etal., 1999; NICOLOSI etal., 2000;
CABRAL etal., 2000; CHANDLER etal., 2001; RAINA etal., 2001;
FALEIRO etal., 2003b; 2003c). Na Figura 9, ilustrase a diferenciao
interespecfica de trs espcies do gnero Stylosanthes e, na Figura 10,
a diferenciao de variedades botnicas de Stylosanthes guianensis verificada com base em marcadores moleculares RAPD.
66
P. multiflora
P. lobii var. ayaucuchoensis
P. rufa
P. morifolia
89
P. penduliflora
P. tacsonioides
P. helleri
58
P. talamancensis
P. murucuja
P. tulae
89
95
P. misera
100
P. pohlii
79
P. organensis
75
P. tricuspis
65 80
69
P. punctata
P. ornithoura
100
P. capsularis
100
P. sanguinolenta
P. sexflora
100
P. coriacea
92
P. suberosa
P. xiikzodz
P. cupraea
100
P. lancetillensis
P. microstipula
P. cirrhiflora
Tetrastylis ovalis
60
P. racemosa
P. galbana
P. tenuifila
71 P. edmundoi
P. miersii
P. caerulea
100 P. campanulata
setulosa
93 P.
P. villosa
95
94P. jilekii
P. mendoncae
P. sprucei
93P.
reflexiflora
87
100
100
75
72
74
P. umbilicata
P. speciosa
P. vitifolia
95 P. actinia
P. elegans
P. sidaefolia
87
98 P. alata
P. ambigua
P. incarnata
77
P. cincinnata
59
P. edulis
100
P. maliformis
77
P. luetzelburgii
64
100
P. clathrata
P. foetida
P. palmeri
P. antioquiensis
P. mathewsii
78
73
60 P. tripartita
P. mixta
P. manicata
72
73 P. trisecta
P. trifoliata
95 P. rhamnifolia
P. haematostigma
100
P. ceratocarpa
100
P. mansoi
100
P. kawensis
amoena
74 P.
P. candida
100 100 P. citrifolia
100
88P.P.lindeniana
96
macrophylla
P. pittieri
P. tryphostemmatoides
100
Dilkea johannesii
Mitostemma brevifilis
100
Adenia sp.
Deidamia sp.
Paropsia sp.
Turnera subulata
Barteria sp.
Malesherbia linearifolia
70
100
10 mudanas
Figura 8. Construo filogentica de espcies do gnero Passiflora, obtidas

com base em anlises moleculares de sete regies genmicas .
Fonte: Muschner (2005).
67
biotecnologia
CP AC 1348
S. capitata
135 acessos
S. macrocephal a
cv. Mineiro
S. guianensi s
Figura 9. Diferenciao de trs espcies do gnero Stylosanthes com base na

diversidade gentica analisada com o uso de marcadores moleculares RAPD.
Fonte: Faleiro etal. (2003c).
pauciflora?
1
10
12
8
17
3
29
30
31
32
35
5
18
21
23
22
25
28
33
24
26
27
2
4
6
7
13
15
16
14
9
11
19
34
20
0
vulgaris
canescens
pauciflora
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
Figura 10. Diferenciao de variedades botnicas de Stylosanthes guianensis com base em distncias genticas calculadas com o uso de marcadores
moleculares RAPD. Um erro de classificao fenotpica do acesso 3 como
pertencente variedade botnica pauciflora foi detectado com base nos marcadores moleculares.
Fonte: Faleiro etal. (2004b).
68
Os marcadores moleculares, principalmente aqueles baseados em

anlises de sequncia, tm um grande potencial como ferramenta
auxiliar em trabalhos de classificao botnica e em estudos de filogenia, origem gentica e evoluo; entretanto nunca iro substituir o trabalho essencial e de grande importncia dos botnicos e taxonomistas.
Composio e validao de colees

nucleares e de trabalho
A coleo nuclear um grupo de acessos que representa a diversidade gentica de uma coleo original. De um modo geral, a coleo nuclear possui 10% a 15% do tamanho e representa mais de 70%
da variabilidade gentica da coleo original. Normalmente, a coleo original uma coleo base, ou seja, uma coleo abrangente de
acessos da espcie de interesse e de seus parentes silvestres (VALOIS
etal., 1996; 2002). Logicamente, o princpio da composio de colees nucleares pode ser aplicado em diferentes tipos de colees de
germoplasma, como as colees ativas e as colees de trabalho.
A composio de colees nucleares no tem como objetivo a substituio de uma coleo base ou coleo ativa, nem mesmo de uma
coleo de trabalho muito especializada. Um dos principais objetivos
facilitar e viabilizar a caracterizao e avaliao de acessos de bancos de germoplasma, o que fundamental e subsidia a utilizao prtica de tais recursos genticos e sua incorporao em programas de
melhoramento. Muitas vezes, a avaliao agronmica, a qual necessita da montagem de experimentos com repeties em vrios ambientes, muito difcil, principalmente quando um nmero elevado de
acessos deve ser avaliado ao mesmo tempo. Estratgias para reduzir
o nmero de acessos de uma coleo base sem a perda significativa
da variabilidade gentica, s vezes, so fundamentais para viabilizar
a montagem de tais experimentos (FALEIRO, 2007).
A estrutura da coleo nuclear e sua dimenso, alm de facilitar a
caracterizao do germoplasma, estimula o usurio a utilizar os recursos genticos com maior eficincia (UPADHYAYA; ORTIZ, 2001). Na
composio da coleo nuclear, cada acesso vai representar a variabilidade gentica de outros acessos que ficaram no mesmo grupo de
69
biotecnologia
similaridade. Aps uma caracterizao detalhada da coleo nuclear,

caso seja verificado o potencial de um determinado acesso, tal potencial pode ser extrapolado para todos os acessos do mesmo grupo de
similaridade, o que pode ser confirmado por meio de caracterizaes
detalhadas desses acessos.
Vrias colees nucleares de diferentes espcies tm sido desenvolvidas utilizando diferentes tipos de caractersticas e estratgias de
amostragem (DIWAN etal., 1995; MARITA etal., 2000; TAI; MILLER,
2001; CHANDRA etal., 2002; LI etal., 2004). Entre as caractersticas utilizadas para o estabelecimento de colees nucleares, esto
os dados de pedigree, caractersticas ecogeogrficas, morfolgicas,
fisiolgicas, agronmicas, bioqumicas e moleculares (LI etal., 2004).
Entre as caractersticas utilizadas, marcadores moleculares tm sido
utilizados tanto para a composio quanto para a validao de colees nucleares (GEPTS, 1995; TOHME etal., 1996; SKROCH etal.,
1998; HOKANSON etal., 1998; GHISLAIN etal., 1999; GRENIER
etal., 2000; HUAMAN etal., 2000; FALEIRO etal., 2003c; LI etal.;
2004). O uso de marcadores moleculares pode aumentar consideravelmente, na coleo nuclear, a representatividade da variabilidade
gentica da coleo original (FALEIRO, 2007).
O princpio mais utilizado na composio de colees nucleares
analisar a variabilidade gentica da coleo base, subdividir todos os
acessos em grupos de similaridade gentica e selecionar um acesso
para representar cada grupo, de modo que os acessos selecionados
representem mais de 70% da variabilidade gentica inicial. Na Figura
11, ilustrase o princpio utilizado para reduzir uma populao base
de 136 acessos de Stylosanthes macrocephala para uma de 20 acessos (FALEIRO etal., 2003c). Podese observar, na Figura 11, que os
acessos selecionados ocupam praticamente toda disperso grfica e
dessa forma representam boa parte da variabilidade gentica da coleo inicial.
70
0,35
0,25
Grupo 1 ( ) 1, 9, 10, 11,

16, 32, 37, 38, 39, 40, 41,
54, 66, 67, 68, 69, 70, 71,
72, 73, 74, 97, 107, 109,
116, 123, 124, 126, 127,
128, 129, 130, 131, 134, 137
Grupo 2 (
105
0,15
17
Dim 2
92
78
96
0,05
x
63
113
125
25
-0,05
114
124
12
19
82
-0,15
Grupo 5 ( ) 14, 52, 96,

108, 111, 112, 115, 121.
Grupo 6 (
) 29, 36, 92, 118.
Grupo 7 (
) 4, 35, 82
Grupo 8 ( x ) 34, 114.

98
-0,25
-0,25
Grupo 4 ( ) 5, 22, 28, 42,

45, 55, 56, 84, 85, 90, 93,
110, 120, 125, 135 e 136.
100
50
) 20, 100, 101.
Grupo 3 ( ) 8, 13, 15, 21,

23, 24, 26, 27, 30, 31, 43,
44, 46, 47, 48, 49, 51, 57,
58, 59, 60, 61, 64, 65, 75,
76, 77, 79, 80, 81, 86, 87,
88, 89, 91, 94, 99, 102, 103,
104, 106, 11 3, 117, 119,
122, 132,133.
62
Grupo 9 (
) 7, 17, 33, 83, 95
Grupo 10 ( * ) 3, 18
-0,15
-0,05
0,05
0,15
0,25
Dim 1
Figura 11. Disperso grfica de 136 acessos de Stylosanthes macrocephala com

base em distncias genticas calculadas usando marcadores moleculares. Os
acessos em verde so aqueles selecionados para a composio de uma coleo para representar a variabilidade gentica da coleo inicial.
Fonte: Faleiro etal. (2003c).
Com relao validao de colees nucleares, o princpio analisar

a variabilidade gentica da coleo base e da coleo nuclear e verificar a porcentagem da variabilidade presente na coleo nuclear. Para
essa anlise, clculos de distncias genticas entre os acessos da coleo base e da coleo nuclear com base em polimorfismos do DNA,
clculos da riqueza e frequncia allica baseados em marcadores multiallicos e codominantes podem ser utilizados com sucesso (GEPTS,
1995; SKROCK etal., 1998; HUAMAN etal., 2000).
Caracterizao de germoplasma
Para que a variabilidade gentica de acessos de espcies cultivadas
e silvestres conservada nos bancos de germoplasma seja utilizada e
aproveitada de forma prtica, atividades de caracterizao so essenciais. Diferentes grupos de caractersticas so utilizados na caracterizao de germoplasma, destacandose as caractersticas ecolgicas,
morfolgicas, agronmicas e moleculares (Figura 12). Essa caracteri-
71
biotecnologia
zao de cada acesso vai subsidiar a sua utilizao prtica fornecendo

genes de interesse para programas de melhoramento gentico e tambm seu uso per se.
Caractersticas
morfolgicas
Descritore s
ecolgicos
Caractersticas
agronmicas e
quantitativas
longitude
latitude
Caractersticas
moleculares
Figura 12. Principais grupos de caractersticas utilizadas na caracterizao

de germoplasma .
Nos ltimos anos, houve um aumento significativo do uso de marcadores moleculares na caracterizao de germoplasma. Tecnologias
modernas de anlise molecular permitem a gerao de marcadores moleculares diretamente no DNA. O princpio da utilizao desses marcadores moleculares baseado no dogma central da biologia
molecular e na pressuposio de que diferenas genticas no DNA
significam, na maioria das vezes, diferenas fenotpicas. Entre as vantagens dos marcadores, podese citar a obteno de um nmero praticamente ilimitado de polimorfismos genticos; a identificao direta
do gentipo sem influncia do ambiente; a possibilidade de deteco
em qualquer estdio do desenvolvimento da planta ou a partir de cultura de clulas ou tecidos; e a possibilidade de gerar maior quantidade
de informao gentica por loco no caso de marcadores codominantes. Com base nas caractersticas moleculares geradas pelos polimorfismos do DNA dos diferentes acessos ou espcies do banco de ger-
72
moplasma, vrias informaes podem ser obtidas (FALEIRO, 2007),

muitas delas discutidas e exemplificadas neste captulo.
Auxlio na seleo de genitores para

programas de melhoramento gentico
A escolha de genitores e o planejamento de cruzamentos em programas de melhoramento gentico so etapas iniciais e fundamentais
para o sucesso do programa (BORM, 1997). Para subsidiar essas etapas, essencial uma caracterizao gentica refinada e completa da
coleo e de cada acesso do germoplasma, a qual obtida com base na
avaliao acurada de caractersticas morfolgicas, fisiolgicas e agronmicas, alm dos dados de pedigree.
Dados adicionais sobre a diversidade gentica de potenciais genitores obtidos com base em marcadores moleculares podem auxiliar
na escolha dos genitores e no planejamento dos cruzamentos visando
maximizao da heterose e das combinaes gnicas desejadas.
Faleiro etal. (2010) analisaram genitores atuais e potenciais do programa de melhoramento gentico da mangueira com base em marcadores moleculares e verificaram similaridades genticas entre alguns
dos atuais genitores. No entanto, os resultados do trabalho mostraram que novos genitores poderiam ser selecionados e utilizados no
programa para ampliar sua base gentica e maximizar a heterose e as
chances de obteno de combinaes gnicas desejadas (Figura 13).
Genitores selecionados apenas com base em caractersticas agronmicas podem estreitar a base gentica do programa de melhoramento,
caso no haja uma preocupao do melhorista em complementar as
informaes com dados de pedigree e diversidade gentica.
73
biotecnologia
0,20
19
0,15
11
13
0,10
18
23
14
17
15
Coord.2
0,05
25
0,00
16
10
21
20
12
-0,05
22
-0,10
28
24
-0,15
-0,20
-0,25
27
26
-0,20
-0,15
-0,10
-0,05
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
Coord.1
Figura 13. Disperso grfica de 28 variedades de manga com base nas distncias genticas entre elas calculadas com 350 marcadores RAPD. As variedades analisadas so originadas do Mexico ( ); India ( ); Estados Unidos ( );
frica do Sul ( ); e Brasil ( ). As setas indicam as variedades atualmente usadas no programa de melhoramento gentico da manga realizado na Embrapa
Cerrados .
Fonte: Faleiro etal. (2010).
Estudos de diversidade gentica de linhagens de milho tm permitido a caracterizao e o agrupamento das mesmas em grupos heterticos distintos (LIVINI etal., 1992) e tais informaes tm sido
importantes na escolha de genitores para a obteno de hbridos com
elevada performance agronmica (GUIMARES; MOREIRA, 1999).
Pires etal. (2000) propuseram uma estratgia de melhoramento gentico do cacaueiro, utilizando a seleo recorrente envolvendo cruzamentos entre acessos silvestres e domesticados, cujos dados de
diversidade gentica dos acessos estimados com base em marcadores
moleculares auxiliariam a escolha dos genitores. Dados de diversidade
gentica, principalmente de fontes de resistncia vassouradebruxa,
tambm tm auxiliado na escolha de genitores para o melhoramento
74
gentico do cacaueiro visando obteno de variedades com resistncia mais efetiva e duradoura, baseada na ampliao da base gentica
da resistncia (FALEIRO etal., 2001a; 2004d; 2004e).
A escolha de genitores tambm pode ser baseada no agrupamento
de potenciais genitores em grupos de similaridade. A escolha de
menor nmero de genitores para representar determinado grupo de
similaridade pode reduzir o nmero inicial de cruzamentos sem perdas significativas na diversidade gentica, reduzindo os custos e viabilizando a execuo do programa. Faleiro etal. (2004b) estudaram a
diversidade gentica de 35 potenciais genitores de Stylosanthes guianensis; estabeleceram 11 grupos de similaridade gentica e selecionaram um genitor de cada grupo (Figura 14). Nesse trabalho, os autores estabeleceram 11 grupos de similaridade com um ponto de corte
no dendrograma a 0,35 de distncia gentica relativa. Em cada grupo
de similaridade, foi escolhido um genitor, utilizando caractersticas
agronmicas (resistncia a doenas, produo de sementes etc.) como
critrio de seleo dentro do grupo.
1
10
12
8
17
3
29
30
31
32
35
5
18
21
23
22
25
28
33
24
26
27
2
4
6
7
13
15
16
14
9
11
19
34
20
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1 ,4
Distncia Gentica Relativa
Figura 14. Anlise de agrupamento de 35 acessos de Stylosanthes guianenis com base na matriz de distncias genticas geradas por 159 marcadores RAPD. As setas indicam os genitores selecionados com base na diversidade gentica .
Fonte: Faleiro etal., 2004b.
75
biotecnologia
Confirmaes de hibridaes e autofecundaes

As confirmaes de hibridaes artificiais em programas de melhoramento so importantes para garantir que as sementes hbridas
sejam utilizadas no avano das geraes. Normalmente, os melhoristas utilizam marcadores morfolgicos para confirmar que a planta
originada de uma hibridao artificial realmente hbrida e no originada por autofecundao. Por exemplo, a cor de flor um marcador morfolgico muito utilizado (Figura 15). O princpio da utilizao
desse marcador a dominncia da caracterstica cor de flor prpura
sobre cor de flor branca. Para utilizar tal marcador, devese utilizar
como genitor masculino a linhagem com flor prpura e como genitor feminino a linhagem com flor branca. A prognie com flor prpura indica que foi obtida por hibridao e a prognie com flor branca
indica que foi obtida por autofecundao.
GENITORES
PROGNIE
originada por
hibridao
plen
BB
Bb
originada por
autofecundao
bb
bb
Figura 15. Utilizao da cor da flor como marcador morfolgico para confirmao de hibridaes e autofecundaes.
A utilizao de marcadores morfolgicos, apesar de muito til, apresenta limitaes prticas para o melhorista. Alm de o nmero de
marcadores morfolgicos ser reduzido, em muitos casos, os genitores utilizados em cruzamentos no apresentam caractersticas morfolgicas contrastantes que possam ser utilizadas como gene marcador. Para contornar tais limitaes, marcadores moleculares podem
ser utilizados para a confirmao de hibridaes e autofecundaes.
76
Na Figura 16, ilustrase a utilizao de marcadores moleculares RAPD

para a confirmao de hibridao e autofecundao. Essa estratgia
foi utilizada por Junqueira etal. (2008) para a confirmao de vrios
cruzamentos interespecficos de espcies do gnero Passiflora.
P1
P2
P1 (Prognie obtida por

hibridao)
P2 (Prognie obtida por

autofecundao)
Figura 16. Uso de marcadores moleculares RAPD para confirmao de hibridao e autofecundao. As setas indicam marcas moleculares teis, ou seja,
marcas presentes no genitor masculino e ausentes no genitor feminino.
A presena dessas marcas na prognie 1 (P1) indica que ela foi obtida por
hibridao e a ausncia na prognie 2 (P2) indica que foi obtida por autofecundao.
O princpio da utilizao de marcadores moleculares dominantes, como o RAPD, para a confirmao de hibridaes e autofecundaes o mesmo utilizado para marcadores morfolgicos dominantes. Marcadores moleculares codominantes, como os microssatlites,
tambm podem ser utilizados (FALEIRO etal., 2003d). Nesse caso, os
genitores masculino e feminino devem possuir alelos diferentes, de
modo que a prognie obtida por hibridao vai possuir os dois alelos,
e a prognie obtida por autofecundao vai possuir apenas o alelo do
genitor feminino (GUIMARES etal., 2009).
77
biotecnologia
Testes de ascendncia gentica e paternidade

Baseandose no mesmo princpio da utilizao de marcadores moleculares para confirmao de hibridaes e autofecundaes, a anlise
da herana de cada marcador molecular ao longo das geraes oferece
uma poderosa ferramenta para a realizao de testes de ascendncia
gentica e paternidade. Praticamente todos os tipos de marcadores
moleculares do DNA podem ser utilizados para esses testes, no obstante marcadores codominantes e multiallicos sejam os mais indicados (FALEIRO, 2007).
A realizao de testes de paternidade e testes de ascendncia de
acessos de bancos de germoplasma importante, principalmente
para a escolha de potenciais genitores para programas de melhoramento gentico. Essa aplicao pode ser ilustrada pelos trabalhos de
Yamada e Lopes (1999), Faleiro etal., (2001a; 2004d; 2004e) e Yamada
etal. (2009), que analisaram a paternidade e origem gentica de selees de cacaueiros resistentes vassouradebruxa com o objetivo de
identificar potenciais genitores que pudessem ser utilizados em programas de melhoramento para ampliar a base gentica da resistncia.
Testes de paternidade e de ascendncia gentica tambm tm sido
teis no programa de melhoramento gentico da manga e do maracuj realizados na Embrapa Cerrados. No caso da manga, os testes
tm sido realizados para identificao de genitores masculinos de prognies de meioirmos e para distinguir os embries zigticos daqueles nucelares em sementes poliembrinicas (CORDEIRO etal., 2006a;
2006b). No caso do maracujazeiro, os testes tm sido realizados para
confirmar ou descartar possveis genitores masculinos em diferentes cruzamentos interespecficos (JUNQUEIRA etal., 2008), o que
ilustrado na Figura 17.
78
Chave 1
Chave 3
Chave 4
Chave 5
Chave 6
Chave 7
Chave 8
Chave 9
Chave 11
Chave 14
Chave 15
Chave 16
Figura 17. Produtos de amplificao de amostras de DNA genmico dos

genitores femininos; possveis F1 (F1?); e dos genitores masculinos
confirmados e descartados nos testes de paternidade. Bandas informativas
esto destacadas .
Fonte: Junqueira etal. (2008).
Recuperao mais rpida do genitor recorrente

O mtodo dos retrocruzamentos muito utilizado para transferir
caractersticas de alta herdabilidade para gentipos elite (BORM,
1997). Nesse mtodo de melhoramento, aps cada ciclo de retrocruzamento, a proporo do genoma do genitor recorrente recuperada e
a do genitor doador reduzida pela metade (Figura 18). Dessa forma,
estimase que so necessrias, aproximadamente, sete a nove geraes
para recuperar de forma satisfatria o genoma do genitor recorrente.
Baseado no conceito de gentipos grficos (YOUNG; TANKSLEY,
1989), o uso de marcadores moleculares pode acelerar a recuperao
do genoma do genitor recorrente. O objetivo dessa aplicao utilizar
marcadores moleculares distribudos ao longo de todo o genoma para
genotipar plantas obtidas por retrocruzamentos (RC) juntamente com
o genitor recorrente. Aps a genotipagem, as plantas RC que possurem o gene que est sendo introduzido e constituio gentica mais
prxima do genitor recorrente so selecionadas para o prximo ciclo de
79
biotecnologia
retrocruzamentos. Dessa forma, podese reduzir o nmero de geraes

necessrias para recuperar a constituio gentica do genitor recorrente.
Genitor recorrente
Genitor doador
100
Recuperao mdia do genoma recorrente (%)

sem marcadores
com marcadores
F1
50%
80
60
40
50%
20
0
GD
6 9 10 14 15 17 24 25 27 28
100
RC1
75%
>75%
80
60
40
RC2
87,5%
>87,5%
20
0
GD 1
3 5 7 14 15 16 18 20 23 26 29 30 33 36 37 43 44
100
RC3
93,75%
>93,75%
80
60
40
20
0
*
GD 3
**
6 13 14 24 25 35 40 42 43 44 45 48
Distncia gentica em relao ao genitor recorrente

* Plantas RC mais prximas do genitor recorrente
selecionadas para o prximo ciclo de retrocruzamentos
Figura 18. Recuperao do genoma do genitor recorrente em programa de

retrocruzamento sem e com o uso de marcadores moleculares.
O nmero de geraes que podem ser reduzidas depender do

tamanho do genoma da espcie; do nmero de marcadores moleculares utilizados na anlise; do nmero de plantas RC genotipadas
e selecionadas; e da proporo do genoma recorrente a ser recuperada. Segundo Openshaw etal. (1994), considerando uma espcie
com genoma de 200 cM distribudos em 10 cromossomos, possvel reduzir o nmero de ciclos de retrocruzamento de sete para trs
e recuperar 99% do genoma recorrente, utilizandose 80 marcadores
para genotipar 50 plantas a cada ciclo de retrocruzamentos.
Faleiro etal. (2004f), com o uso de marcadores moleculares como
ferramenta auxiliar de seleo, aceleraram a recuperao do genoma
recorrente de feijoeirocomum aps a introduo de genes de resistncia ferrugem e antracnose, o que foi conseguido aps trs ciclos de
retrocruzamentos. Fonseca etal. (2009) utilizaram o mesmo princpio
para acelerar a recuperao do genoma recorrente de maracujazeiro.
80
Desenvolvimento de mapas genticos

Segundo Ferreira e Grattapaglia (1998), o desenvolvimento de
mapas genticos considerado uma das aplicaes de maior impacto
da tecnologia de marcadores moleculares na anlise gentica de espcies, e, potencialmente, no melhoramento gentico, possibilitando a
cobertura e anlise completa de genomas, a decomposio de caractersticas genticas complexas nos seus componentes Mendelianos,
a localizao de regies genmicas que controlam caractersticas de
importncia e a canalizao de toda essa informao para uso em programas de melhoramento, principalmente pensando na seleo assistida por marcadores moleculares.
At meados da dcada de 1960, o desenvolvimento de mapas
genticos de ligao era baseado em marcadores morfolgicos, em
geral fentipos de fcil identificao visual, como cor de ptalas, de
semente, de hipoctilo, morfologia floral e foliar. Esses marcadores
contriburam significativamente para o desenvolvimento terico da
anlise de ligao gnica e para a construo das primeiras verses
de mapas genticos. Entretanto, devido ao seu nmero limitado, a
probabilidade de se encontrar associaes significativas entre esses
marcadores e caracteres de importncia econmica era reduzida. A
revoluo nesse quadro iniciouse com o desenvolvimento de marcadores isoenzimticos, os quais dobraram o nmero de marcadores
genticos disponveis. Com o advento das tcnicas modernas de biologia molecular, surgiram diversos mtodos de deteco de polimorfismo gentico diretamente no DNA, os quais tm possibilitado o
desenvolvimento de mapas genticos com elevado nvel de informao e saturao para vrias espcies vegetais (CARNEIRO; VIEIRA,
2002) e animais (AMARAL etal., 2008). Na Figura 19, ilustrase um
mapa gentico desenvolvido para o cacaueiro, o qual, a cada ano, est
sendo saturado com novas marcas moleculares e caractersticas agronmicas de interesse.
Alm das vrias aplicaes prticas dos mapas genticos
(FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998; CARNEIRO; VIEIRA, 2002), o
desenvolvimento desses mapas tem possibilitado o mapeamento comparativo de diferentes espcies e o mapeamento gnico e seus desdo-
81
biotecnologia
bramentos relacionados seleo assistida por marcadores moleculares, o que discutido a seguir.
0
sAU17.960
sAE18.1095
15
sT12.1320
25
sY20.520
29
32
sacacac.311
iaggcac.149
36
38
41
43
saagctc.137
iaggcag.263
sagccat.151
iI18.940
48
52
53
56
58
60
iAH14.925
mTcCIR32
iI17.1050
mTcCIR43
mTcCIR12
sacactg.176
65
sZ11.740
69
73
75
76
iAW02.720
sAR17.2040
iP081100
sAF08.860
83
85
sAV10.1465
iagccag.177
0
3
5
12
15
16
18
19
20
23
24
26
27
28
29
30
31
33
35
38
39
41
43
47
54
0
5
10
14
20
22
23
24
28
29
30
31
32
33
34
36
37
39
41
43
47
48
49
50
52
54
56
57
61
64
66
68
71
75
78
80
5/6
sAE06.585
saagctc.86
sAD17.1120
saagctc.264
mTcCIR6
iT02.2200sAR10.760
sAV11.1140iAL04.1230
iD08490
sagccat.210
iJ18.440
iR05.960
sAN16.1410sAN16.1100
sAA11.880
iagccat.163
iaaccag.288
iAU15.475
sZ19.640iBG04.1080
iT08.570iaagctc.395
iactcat.153sAF16.2315
iaagctc.266
iAS19.970
iZ06.470
sacacac.83
mTcCIR10
sX18.1430
iAH18.850iT12.260
mTcCIR25
iBB12.1100
iAH15.380iAE06.950
mTcCIR42
iacacac.261mTcCIR62
iBG09.580
iaaccag.126
iaagcac.256iAD19.965
iAC01.475
iaagctc.65
iAH05.980
iM09370
sacactc.97
saaccag.89
sAV16.610
iAU05.1170
sT09.1530
iAN16.1170iagccat.82
sZ15.1365
mTcCIR40
mTcCIR21
iH03.1270
iAB12.1075
iI18.830
sAV20.1400
iacactg.113iI16.910
iAV20.855
iAF15.900
sI061290iAL09.1340
iZ19.1140
sAB12.1750
iactcac.426
iAZ14.600sacacac.234
sAB12.990
iAE07.2140
sG06700
66
mTcCIR22
mTcCIR35
28
31
mTcCIR30
mTcCIR24
38
39
43
iAL04.1040
saggcat.108
sAR15.1380
sacgcag.138
iaaccat.130
10
saaccat.129
16
iacgcag.133
24
mTcCIR1
82
sactcat.106
sJ09520
10
sZ03.2100
16
20
21
26
27
28
29
30
32
33
34
36
39
41
43
47
51
57
sactctc.278
sactcat.216
saaccat.177
sactcat.313
sX18.1090
sAL04.2450
sAU05.980
sactcat.355iacgcat.102
sAI12.790
iacacac.145
sZ06.470
iX05.505
mTcCIR55
sacacac.113
mTcCIR56
mTcCIR46
iY20.800
sZ10.1590
sH08860
mTcCIR37
sT01920
9
10
iO03370
sL10590
sacccta.287
11
mTcCIR61
20
21
iP17570
sM02905
26
29
sC131230
iO18455
17
20
23
25
iAV14.710sT02.500
iAL04.620
sJ13.860
iAB12.1435
30
iAU17.505
33
35
38
sK03875
iP17340
sN071200
14
15
16
18
21
22
28
29
33
sJ13.1490sT1.900
iactcat.65
sAX07.820
sAB04.1305
sAF06.585
mTcCIR26
iAL09.1210
iaggcaa.86
sK08.700
37
39
sZ15.1140
sagccat.90
42
iO18725
42
sAU15.1540
iO03900
8a
10
iAC01.695
13
iacacta.283
13
iaaccag.108
sAE06.1710sAE06.2140
sAE06.1430
iQ01350
Figura 19. Mapa gentico do cacaueiro .

Fonte: Faleiro etal., 2006.
21
8b
iacccta.221
23
saaccag.106
66
sAV14.940
iAZ12.845
sacgcat.78
sZ1.2070
iAF05.1405iAH09.1500
iK18580
iY20.970
mTcCIR29
iAL01.1090sagccat.131
iI04.870
sAB11.775
iaagcac.248
iagccat.85
sacgcag.710
iAL02.1100
iAR17.390
sZ4.1355
iAV18.470
sactcat.80
iacacac.281
iagccat.105
sAL04.410
iacacta.198
iY18.1150
iJ18.540
sAV18.980
15
17
18
sactcat.202
26
6
11
17
18
20
22
23
24
26
27
29
30
31
33
35
37
41
42
43
47
53
56
sAV18.590
sacacac.307
sZ4.500
sX18.1545
iactcac.167
saccctg.80
sacacac.78
sAU15.785
sAB12.350
sAH01.960
sAB01.585
sS10.920iaggcac.121
iAV19.720
sAV11.840
sAI09.650
sacacac.279
iacacac.93
sactcac.150
sAH09.2100
mTcCIR60
sAB01.950
iT1.1020
sactcat.133iactcac.149
iAX07.480saaccag.122
sY18.800
iAE12.1170
iactcac.219
sAH18.1230mTcCIR19
iAX07.1020
iF091130
sAR16.715
0
2
3
6
9
10
13
0
4
8
11
17
18
20
22
26
27
29
32
33
35
36
37
38
40
41
42
43
45
49
56
iAR04.710
Mapeamento comparativo
A facilidade para construir mapas genticos para diferentes espcies
utilizando marcadores moleculares tem possibilitado anlises comparativas da estrutura genmica dessas espcies, quanto homologia de
genes e conservao de distncia e ordem de ligao desses genes nos
cromossomos (AHN; TANKSLEY, 1993; KELLER; FEUILLET, 2000).
Essas anlises so chamadas de mapeamento comparativo ou mapeamento de sintenia genmica. O termo sintenia tem sido usado em
anlises genticas comparativas para se referir a segmentos cromossmicos ou locos gnicos de diferentes espcies localizados e conservados a partir de uma mesma regio cromossmica de espcie ancestral comum.
Existem diferentes nveis de conservao entre genomas de diferentes espcies (KELLER; FEUILLET, 2000) (Figura 20). Um primeiro nvel, chamado de ortologia, a simples conservao de genes
ou locos gnicos derivados de uma espcie ancestral comum entre
diferentes espcies. Esses genes ou locos gnicos podem ser conservados mantendose uma mesma ordem linear entre eles dentro do
segmento cromossmico. Nesse caso, esse tipo de conservao chamado de colinearidade. Dentro desse segmento cromossmico conservado, pode haver inverses, inseres, duplicaes ou delees ao
longo do processo evolucionrio. Um ltimo nvel de conservao,
chamado de microcolinearidade, referese conservao da ordem
de regies codificadoras dentro do gene ou do fragmento de DNA
ortlogo. Inverses, inseres, duplicaes ou delees so frequentemente observadas nesse nvel.
83
biotecnologia
B
A,B, C
D, E
C
C
C
E
1
Ortologia
2
Colineridade
Microcolinearidade
Figura 20. Diferentes nveis de conservao entre genomas. Nesta figura, so

ilustrados segmentos cromossmicos de trs espcies (1,2e3), contendo
cinco genes ou locos gnicos (A, B, C, D e E) e, dentro do loco C, regies
codificadoras ().
Fonte: Adaptada de Keller e Feuillet (2000).
A anlise dos diferentes nveis de conservao da estrutura genmica de diferentes espcies relacionadas, por meio do mapeamento
comparativo, apresenta importantes aplicaes cientficas. O conhecimento detalhado da estrutura genmica de diferentes espcies
pode facilitar a construo de mapas de ligao de uma espcie com
o mapeamento e utilizao de genes da espcie relacionada. Como
exemplo, Pereira etal. (1994) construram um mapa gentico de ligao em sorgo, utilizando sondas genmicas e de cDNA j mapeadas
em milho. Esse tipo de sonda heterloga, alm de facilitar a construo de mapas genticos, pode ser muito til na avaliao do grau de
conservao dos grupos de ligao de espcies relacionadas e do grau
de colinearidade entre essas espcies. Sondas heterlogas podem servir como ncoras permitindo a anlise conjunta de mapas genticos
de diferentes espcies. Essas informaes so valiosas para estudos de
evoluo (MOORE etal., 1995) e tambm para o estabelecimento de
84
modelos e mapa genticos nicos de referncia para grupos de espcies relacionadas (SEWELL etal., 1999).
Mapeamento gnico
O desenvolvimento de um nmero praticamente ilimitado de marcadores genticos moleculares associados evoluo dos aparatos
computacionais para clculos de cosegregao, agrupamento e distncias entre as marcas e sua associao com caractersticas de interesse tem permitido o mapeamento de importantes genes em diferentes espcies (CARNEIRO; VIEIRA, 2002; AMARAL etal., 2008).
Esse mapeamento tem sido feito tanto para genes associados a caractersticas qualitativas quanto para genes associados a caractersticas
quantitativas.
O mapeamento de genes associados a caractersticas qualitativas
ou caractersticas cujos fentipos observados apresentam segregaes Mendelianas (3:1; 1:2:1; 1:1) bastante simples. Nesse caso,
a cosegregao do fentipo e os marcadores moleculares so analisados diretamente, ou seja, a caracterstica qualitativa tratada
como se fosse um outro marcador. O resultado desse tipo de mapeamento so distncias (centiMorgan) entre os marcadores moleculares e o gene associado caracterstica qualitativa (FALEIRO
etal., 2003e). No caso do mapeamento de genes associados a caractersticas quantitativas ou de locos de caractersticas quantitativas
(QTLs), o resultado ser uma porcentagem da variao fenotpica
da caracterstica de interesse explicada pelos marcadores moleculares de forma isolada e conjunta (FALEIRO etal., 2006) (Figura 21).
85
biotecnologia
Mapeamento de caracterstica
qualitativa (resistncia
ferrugem)
OF10-105052
SCARF10-1050
OX1 1-550
sAV14.940
sacgcat.78
fer47
fer56
1.0
fer49
3.5
fer32
5.8
Marcador mT cCIR35
explica 35,5% da varinci a
fenotpica da resistncia
vassoura-de-bruxa
fer52
0.7
3.5
20
2.0
10
sAV18.950
sacacac.307
SCARBA8-560
8.9
2.4
15
8.0
5.4
0.3
Va lor de LO D
Marcadores
Dist
eM
Mapeamento de caracterstica
quantitativa (resistncia
vassoura-de-bruxa)
ant81
Marcador Ox1 550 est

a 8,9 cM do gene de
resistncia ferrugem
(fer52)
.mTcCIR35
mTcCIR30
MTcCIR24
ant73
ant89
saggcat.108
sAR15.1380
Figura 21. Resultados das associaes de marcadores moleculares com caracterstica qualitativa e quantitativa em mapas genticos .
Tanto para caractersticas qualitativas quanto para quantitativas, a

acurcia das avaliaes fenotpicas fundamental para o sucesso do
mapeamento gnico. No caso do mapeamento de genes associados
a caractersticas quantitativas, a fenotipagem mais difcil exigindo
a avaliao de grande nmero de indivduos em experimentos com
repeties e, de preferncia, em diferentes ambientes. A utilizao
de populaes segregantes de espcies que permitem a propagao
vegetativa ou a utilizao de linhagens endogmicas recombinantes
obtidas pelo mtodo de descendente de uma nica semente (SSD)
tm possibilitado o aumento da acurcia das avaliaes fenotpicas,
melhorando a qualidade do mapeamento de QTLs (FALEIRO etal.,
2003f; FALEIRO etal., 2006).
Uma aplicao prtica do mapeamento gnico o acmulo de informaes sobre a herana das caractersticas qualitativas e quantitativas
de interesse. No caso das caractersticas quantitativas, naturalmente
controladas por vrios genes, os marcadores moleculares permitem a
identificao e anlise de cada um dos genes significativamente associados caracterstica. Alm do mapeamento, possvel o estudo dos
86
efeitos gnicos e da ao dos genes de maneira isolada, interativa e

cumulativa (PEREIRA etal., 2009). Alm disso, possvel identificar
a origem dos genes favorveis, ou seja, qual genitor doador dos alelos favorveis associados caracterstica de interesse.
Outra aplicao e possibilidade do mapeamento gnico a gerao de informaes para se caminhar no cromossomo em direo
aos genes de interesse e para aterrissar no gene (TANKSLEY etal.,
1995), o que provocou uma verdadeira revoluo na capacidade de isolar genes na ausncia de informao sobre sua sequncia ou seu produto (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 2009). Essa estratgia culminou
na clonagem de um grande nmero de genes do genoma humano
(COLLINS etal., 1997) e tambm de vrios genes de plantas e animais
que controlam caractersticas de interesse em diferentes espcies,
metodologia conhecida como clonagem posicional (GRATTAPAGLIA;
FERREIRA, 2009). Para realizar a clonagem posicional, necessrio
um mapeamento gnico de alta resoluo, ou seja, um mapeamento
gnico baseado em anlises de cosegregao de milhares de indivduos segregantes.
Alm das aplicaes citadas acima, o mapeamento gnico com base
em marcadores moleculares abriu novas perspectivas para a seleo
assistida, ou seja, a seleo indireta de caractersticas de interesse.
Para o sucesso da seleo indireta, necessrio que a herdabilidade do
marcador e a correlao deste com a caracterstica de interesse sejam
altos. Como a herdabilidade dos marcadores moleculares igual a 1,
o sucesso da seleo indireta depende da identificao de marcadores moleculares altamente correlacionados com as caractersticas de
interesse, ou seja, a qualidade e resoluo do mapeamento gnico a
base para a seleo assistida por marcadores moleculares.
Seleo assistida por marcadores moleculares

A seleo assistida por marcadores moleculares (SAMM) uma
forma de seleo indireta de caractersticas de interesse com base
em marcadores moleculares. No melhoramento gentico, o principal
objetivo da seleo propiciar ganhos genticos. O ganho gentico da
seleo de uma caracterstica (GSY) depende diretamente da intensidade de seleo (kY), do controle parental (p), da acurcia da avaliao
87
biotecnologia
fenotpica (hY) e da variabilidade gentica disponvel da caracterstica

na populao submetida seleo (gY) (CRUZ; REGAZZI, 1997),
conforme a frmula abaixo.
GSY = kY . p . hY . gY
Quando pensamos na seleo indireta de uma caracterstica Y com
base em uma caracterstica X [GSY(X)], o GS pode ser quantificado conforme a frmula abaixo.
GSY(X) = kX . p . hX . rgXY . gY
A relao entre o ganho gentico baseado na seleo indireta e o
ganho gentico baseado na seleo direta apresentada abaixo.
GS Y(X)
GS Y
K X . p . h X . rg XY . s gY
K Y . p . hY . s gY
Ao analisarmos essa relao, podemos verificar que, em algumas

situaes, a seleo indireta pode propiciar ganhos genticos maiores que a seleo direta. Isso vai acontecer quando a acurcia fenotpica da caracterstica auxiliar (hx) for alta, a da caracterstica principal
(hx) for baixa e a correlao gentica entre as caractersticas auxiliar e
principal (rgXY) for alta. Uma das vantagens da utilizao de marcadores moleculares como caracterstica auxiliar na seleo indireta
que a acurcia mxima, ou seja, igual a 1. Como mencionado no
item anterior, a correlao gentica entre o marcador molecular e a
caracterstica principal definida pelo mapeamento gentico. Com
base em trabalhos de mapeamento gentico, j foram identificados
vrios marcadores moleculares associados a locos para caractersticas de herana gentica qualitativa quanto a locos para caractersticas quantitativas (QTLs).
A utilizao dos marcadores moleculares na seleo de caractersticas qualitativas uma realidade, embora existam, ainda, algumas
restries por parte dos melhoristas. O principal argumento que
caractersticas qualitativas no necessitam de marcadores para seleo
indireta, uma vez que, de um modo geral, as plantas com tais carac-
88
tersticas podem ser facilmente identificadas e selecionadas. Apesar

da veracidade do argumento, em algumas situaes, o uso de marcadores moleculares pode trazer algumas vantagens como na seleo
em estgios iniciais de desenvolvimento, na seleo de genes de resistncia sem a necessidade de inoculao das plantas com o patgeno
ou praga, na seleo de caractersticas qualitativas de difcil avaliao
fenotpica e tambm na seleo simultnea de diferentes genes de
interesse (FALEIRO etal., 2003g).
A seleo em estgios iniciais de desenvolvimento possui grande
aplicabilidade em espcies perenes, com perodo juvenil longo, e em
casos onde a expresso da caracterstica s ocorre na fase final do ciclo
da espcie, a exemplo de caractersticas de interesse para agroindstria em gros de soja (MOREIRA etal., 2001). Outra importante vantagem da seleo em estgios iniciais com base em marcadores moleculares para as situaes em que a avaliao fenotpica da caracterstica
de interesse necessita da destruio da planta, como, por exemplo, a
avaliao da resistncia a nematoides (ALZATEMARIN etal., 2006).
A seleo de genes de resistncia sem a necessidade de inoculao das plantas importante no desenvolvimento de materiais resistentes a um patgeno ou praga extica, ainda no detectado em uma
regio, onde sua entrada proibida pelo servio de quarentena e controle fitossanitrio. Um exemplo seria o desenvolvimento de variedades de cacaueiro resistentes Moniliophthora roreri no Brasil, o que
tem sido viabilizado mediante um projeto internacional envolvendo
instituies de pesquisa do Equador, Peru e Brasil e o uso de marcadores moleculares (www.cepec.gov.br/ biotecnologia.htm).
A seleo de caractersticas qualitativas de difcil avaliao fenotpica seria outra vantagem da SAMM. Essa dificuldade de avaliao
fenotpica pode ser relacionada complexidade e (ou) aos elevados
custos envolvidos da fenotipagem. A avaliao da resistncia de plantas a insetos, por exemplo, na maioria das vezes, exige procedimentos
demorados e laboriosos envolvendo a multiplicao do inseto, montagem de diferentes bioensaios e diferentes avaliaes. Um exemplo,
citado por Milach (2001), a seleo de plantas com resistncia a insetos, conferida pelo transgene Bt. Nesse caso, a seleo pode ser feita
com a utilizao de primers especficos que possibilitam a amplifica-
89
biotecnologia
o direta do gene. Guimares etal. (2009) citam outros exemplos de

avaliaes fenotpicas complexas ou caras como de caractersticas relacionadas qualidade nutricional, composio aminoacdica, caractersticas organolpticas, entre outras.
No caso da seleo simultnea de diferentes genes de resistncia, o
exemplo prtico da SAMM a piramidizao de genes que conferem
resistncia a doenas. Nesse caso, podemos pensar na piramidizao de genes ou blocos gnicos que conferem resistncia a diferentes
raas de um patgeno (MILACH; CRUZ, 1997; FALEIRO etal., 2000a)
ou que conferem resistncia a diferentes patgenos (FALEIRO etal.,
2000b; 2003e; 2004f). Uma das dificuldades da piramidizao de genes
a seleo das plantas que apresentam todos os genes R a serem piramidizados. Quando pensamos na resistncia a diferentes raas de um
patgeno, o fentipo da resistncia o mesmo quando um, dois ou
mais genes de resistncia esto presentes e, quando pensamos na
resistncia a diferentes patgenos, a dificuldade so as interaes existentes entre diferentes patgenos inoculados simultaneamente. As
dificuldades so ainda maiores quando pensamos na piramidizao
de genes de efeito menor junto com genes de efeito maior, visto que
estes mascaram a presena daqueles (FALEIRO etal., 2001b). Essas
dificuldades so eliminadas com a utilizao da SAMM. Logicamente,
para a utilizao da SAMM, necessrio que marcadores moleculares
associados aos genes de resistncia sejam identificados. A utilizao
de marcadores moleculares flanqueando o gene ou o bloco gnico
fortemente ligado a ele aumenta muito a confiabilidade e a eficincia
da seleo indireta (FALEIRO etal., 2000a).
Outra vantagem da SAMM relatada por Guimares etal. (2009)
a possibilidade de maximizar os ganhos genticos com a seleo em
ambos os sexos. Essa possibilidade importante no melhoramento
gentico animal, quando as caractersticas de interesse so expressas somente em um sexo, como, por exemplo, a produo de leite
em bovinos.
Quando pensamos em caractersticas quantitativas, ou seja, caractersticas controladas por vrios genes e fortemente influenciadas pelo
ambiente, a SAMM dos QTLs mais complexa. Existem, na literatura
cientfica, numerosos trabalhos de deteco e mapeamento de QTLs
90
utilizando marcadores moleculares, entretanto poucos so os exemplos de variedades comerciais obtidas com o auxlio de marcadores
moleculares na seleo desses QTLs. Segundo Guimares e Moreira
(1999), a baixa variabilidade gentica dos genitores utilizados nos programas de melhoramento e a falta de interao entre as equipes envolvidas no mapeamento gentico e no melhoramento gentico so fatores que contribuem para esse fato.
Antes de pensar na SAMM, devese questionar a repetibilidade da
informao de ligao entre o marcador e o QTL, a interao entre o
QTL e o ambiente e a seleo simultnea de vrias caractersticas muitas vezes correlacionadas. Outro questionamento a validao desses
QTLs para outras populaes e outros ambientes. Temos que considerar tambm a dificuldade de selecionar concomitantemente vrios
QTLs, cada um explicando uma parte da variao fenotpica da caracterstica de interesse (BEARZOTI, 2000). Essa ltima dificuldade foi
analisada por Lande e Thompson (1990), os quais propuseram o uso
de um ndice de seleo que combina o valor fenotpico com a informao molecular, a qual o somatrio dos efeitos de cada marcadorQTL na caracterstica ponderados por um fator que depende da
herdabilidade da caracterstica e da proporo da varincia gentica
aditiva explicada pelos marcadoresQTLs (Figura 22).
i= i
b(
jXji)
j =1
Marcador
gentico j
Va lor
fentipo
Herdabilidade
da caracterstica
1
1
2
h
1
1 p
Efeito do marcador
gentico j
Proporo da varincia gentica
aditiva explicada pelos marcadores
2c
(R da regresso)
Figura 22. ndice proposto por Lande e Thompson (1990) para seleo de
caractersticas de interesse, combinando informaes fenotpicas e moleculares derivadas do mapeamento de QTLs.
91
biotecnologia
Apesar de todas as dificuldades, existem experincias de sucesso

na transferncia de QTLs de efeito maior para gentipos elite
(EATHINGTON etal., 1997). Outro exemplo de sucesso da SAMM
de caractersticas quantitativas a identificao e posterior transferncia de alelos (QTLs) de interesse agronmico de acessos no adaptados
ou silvestres para gentipos elite. So exemplos, QTLs para aumento
do tamanho do fruto em tomate (TANKSLEY etal., 1996) e para
aumento da produtividade em arroz (XIAO etal., 1996; BRONDANI
etal., 2002). Esse uso de espcies silvestres no melhoramento gentico vegetal e da SAMM de caractersticas quantitativas normalmente
feito utilizandose o mtodo dos retrocruzamentos, o qual permite
a recuperao do genoma recorrente, mantendose os genes de interesse provenientes da espcie silvestre (FERREIRA; RANGEL, 2005).
A integrao do mtodo dos retrocruzamentos com a SAMM de
caractersticas quantitativas tem sido referenciada na literatura como
um novo mtodo de melhoramento, chamado retrocruzamento avanado de QTLs (ABQTLs) (FERREIRA; RANGEL, 2005; FERREIRA;
FALEIRO, 2008). Nesse mtodo, um mapa gentico para caractersticas quantitativas de interesse gerado e a recuperao do genoma
recorrente realizada com base na seleo de marcadores moleculares associados ao controle gentico da caracterstica quantitativa de
interesse. Esses marcadores podem ser provenientes tanto da espcie
silvestre quanto do acesso elite. O mtodo do ABQTLs tem sido aplicado com sucesso em diferentes espcies, permitindo no somente a
compreenso da base gentica de caractersticas quantitativas de interesse econmico, como tambm o desenvolvimento de linhagens para
programas de melhoramento gentico (FERREIRA; RANGEL, 2005).
A seleo indireta de caractersticas quantitativas utilizando marcadores moleculares poderia ser facilitada se fosse possvel identificar todos os genes/alelos que controlam a caracterstica, conhecer a
localizao de cada gene e mensurar o efeito individual no fentipo
(FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998). Contudo, ao desenvolver um
estudo de mapeamento de QTLs, apenas uma frao dos genes envolvidos no controle da caracterstica quantitativa detectada. Os QTLs
mapeados, em geral, so de grande efeito, relativamente queles que
tambm contribuem para o fentipo. Embora seja importante detectar
e utilizar os QTLs de maior efeito para fins de seleo, inevitvel a
92
constatao de que o limite mximo de incremento de uma caracterstica quantitativa no poder ser atingido sem o mapeamento de todos
os locos envolvidos (FERREIRA; FALEIRO, 2008). Outro ponto a ser
considerado que, dependendo do nmero de genes envolvidos, um
grande nmero de indivduos e um grande nmero de anlises moleculares em cada indivduo pode tornar a SAMM invivel do ponto de
vista prtico, considerando o custo das anlises e, principalmente, o
tempo necessrio para a realizao delas, considerando o curto tempo
entre os ciclos de seleo em programas de melhoramento gentico.
Considerando as limitaes, dificuldades envolvidas e raros casos
de sucesso, a SAMM de caractersticas quantitativas baseada no
modelo atual de mapeamento e utilizao de QTLs est passando por
um momento de reflexo. Para que esse mtodo de seleo seja til,
os QTLs mapeados devem explicar grande parte da variao gentica
da caracterstica quantitativa, a qual controlada por vrios genes de
pequenos efeitos. Esse fato no tem sido observado na prtica, exatamente em funo da natureza polignica e da alta influncia ambiental nos caracteres quantitativos (RESENDE etal., 2008). Em funo
desses aspectos e outras limitaes mencionadas anteriormente, a
implementao prtica da SAMM de caractersticas quantitativas tem
sido limitada e os ganhos em eficincia muito reduzidos (DEKKERS,
2004; RESENDE etal., 2008).
Seleo genmica ampla

Considerando as principais limitaes da SAMM de caractersticas quantitativas baseadas no mapeamento e utilizao de QTLs, um
novo mtodo de seleo chamado seleo genmica ampla (SGA)
ou Genomic wide selection (GWS) foi proposto (MEUWISSEN etal.,
2001). Recentemente, com o desenvolvimento de marcadores do tipo
SNP (Single Nucleotide Polymorphism), com as novas tecnologias de
sequenciamento de alto desempenho (HT High Throughput e UHT
Ultra High Throughput) e com o aumento da capacidade de anlises
computacionais, o mtodo tornouse mais atrativo, sendo claras as
possibilidades de utilizao prtica com importantes benefcios para
o melhoramento gentico vegetal (BERNARDO; YU, 2007) e animal
(SCHAEFFER, 2006).
93
biotecnologia
Resende etal. (2008) apresentaram os fundamentos do mtodo da

seleo genmica ampla enfatizando suas vantagens e possibilidades
para maximizao da eficincia da seleo em programas de melhoramento gentico. Conforme relatado por Resende etal. (2008), a seleo genmica ampla pode ser definida como a seleo simultnea de
centenas ou milhares de marcadores, os quais cobrem o genoma de
uma maneira densa, de forma que todos os genes de um carter quantitativo estejam em desequilbrio de ligao com pelo menos uma
parte dos marcadores. Esses marcadores em desequilbrio de ligao
com os QTLs, tanto de grandes quanto de pequenos efeitos, explicaro quase a totalidade da variao gentica de um carter quantitativo.
A seleo genmica dita ampla porque atua em todo o genoma,
capturando todos os genes que afetam uma caracterstica quantitativa. Uma grande vantagem da SGA que no h necessidade prvia
de identificar os marcadores com efeitos significativos e de mapear
QTLs. Os marcadores moleculares tero seus efeitos genticos estimados a partir de uma amostra de pelo menos 1.000 indivduos genotipados e fenotipados. Por esse motivo, a SGA fundamentase nos marcadores genticos moleculares do tipo SNP (polimorfismo de um nico
nucleotdeo). Esses marcadores so a forma mais abundante de variao do DNA em genomas e so preferidos em relao a outros marcadores genticos por causa da sua baixa taxa de mutao e facilidade
de genotipagem. Milhares de SNPs podem ser usados para cobrir o
genoma de um organismo com marcadores que no esto a mais de
1 cM um do outro no genoma inteiro. Tecnologias para genotipagem
de milhares de SNPs em microarranjos esto disponveis atualmente.
Com o processo de genotipagem e fenotipagem dos indivduos,
so identificados os QTNs (nucleotdeos de caractersticas quantitativas), que so polimorfismos funcionais, causadores diretos da variao quantitativa observada. A anlise de SNPs permite a deteco de
polimorfismos funcionais ou polimorfismos em forte desequilbrio
de ligao com os QTNs (RESENDE etal., 2008).
Segundo descrito por Goddard e Hayes (2007) e Resende etal.
(2008), para a implementao prtica da seleo genmica ampla,
trs populaes ou conjuntos de dados so necessrios:
94
a) Populao de Descoberta. Esse conjunto de dados contempla um

grande nmero de marcadores SNPs avaliados em 500 a 1.000
indivduos, os quais devem ter seus fentipos avaliados para
as vrias caractersticas de interesse. Equaes de predio de
valores genticos genmicos so obtidas para cada caracterstica de interesse.
b) Populao de Validao. Esse conjunto de dados menor do que
aquele da populao de descoberta e contempla indivduos avaliados para os marcadores SNPs e para os vrios caracteres de
interesse. As equaes de predio de valores genticos genmicos so testadas para verificar suas acurcias nessa amostra independente.
c) Populao de Seleo. Esse conjunto de dados contempla apenas
os marcadores SNPs avaliados nos candidatos seleo. Essa
populao ser submetida seleo indireta da caracterstica
de interesse com base nos marcadores moleculares de acordo
com as equaes de predio derivadas na populao de descoberta. As equaes de predio vo gerar um ndice chamado
valor gentico genmico (VGG), o qual ser utilizado na predio dos fentipos futuros dos candidatos seleo.
Os resultados de simulao revelam um grande potencial da SGA
em aumentar a eficincia do melhoramento. Entretanto, conforme
relatado por Resende etal. (2008), esse benefcio somente ser concretizado se houver um alto grau de desequilbrio de ligao envolvendo
marcadores SNPs proximamente espaados e se os efeitos genticos
dos marcadores nas caractersticas sob melhoramento forem estimados (a partir dos fentipos) com alta acurcia e usados na prpria
populao e ambientes em que forem estimados. preciso adquirir
experincia prtica com a SGA para uma real inferncia sobre sua
efetividade.
Predio de desempenho de hbridos simples

A produo e avaliao de hbridos a partir do cruzamento de linhagens uma estratgia muito utilizada em programas de melhoramento gentico de plantas algamas. Diferentes tipos de hbridos
95
biotecnologia
podem ser obtidos, tais como: hbridos simples, simples modificado,

triplo, triplo modificado e duplo (BORM, 1997).
O hbrido simples obtido pelo cruzamento de duas linhagens.
Em geral, o hbrido simples mais produtivo que os demais e apresenta maior uniformidade. Com um pequeno nmero de linhagens
possvel a produo de grande quantidade de hbridos diferentes.
Por exemplo, com 100 linhagens possvel a produo de 4.950 hbridos simples, 485.100 hbridos triplos e 11.763.675 hbridos duplos.
A obteno e avaliao de um nmero muito grande de hbridos em
experimentos com repeties e em diferentes locais so extremamente
difceis, considerando os custos financeiros e a viabilidade experimental. Diante dessa dificuldade, a predio de hbridos com base no comportamento dos genitores (linhagens ou hbridos simples) tornouse
uma estratgia importante dentro dos programas de melhoramento
(BORM, 1997).
Existem diferentes mtodos para predio do desempenho de
hbridos (BORM, 1997). No caso de hbridos simples, a predio
baseada na habilidade da linhagem genitora em transmitir uma performance desejada para a prognie hbrida. Existem dois tipos de
habilidade de combinao. A capacidade geral de combinao (CGC)
que mede o comportamento mdio da linhagem, ou seja, o desempenho mdio dos hbridos obtidos pelo cruzamento desta linhagem
com diversas outras. A capacidade especfica de combinao (CEC)
que mede o comportamento de uma linhagem em uma combinao
especfica com outra linhagem.
O desempenho dos hbridos funo da heterose expressa no
cruzamento entre os genitores utilizados. A heterose geralmente
aumentada em funo da distncia gentica entre os genitores. Com
base nesse princpio, marcadores moleculares poderiam ser utilizados
para estimar, com detalhes, a distncia gentica entre diferentes linhagens e tais distncias poderiam ser utilizadas na predio do desempenho dos hbridos. Vrios trabalhos foram realizados para avaliar a correlao entre distncias genticas entre linhagens estimadas com base
em marcadores moleculares e o desempenho dos hbridos (SMITH
etal., 1990; BERNARDO, 1992; BARBOSA etal., 2003; GUIMARES
etal., 2007). Guimares etal. (2009) analisaram os resultados de vrios
96
desses trabalhos e verificaram que essas correlaes foram positivas

e altas quando os hbridos eram obtidos pelo cruzamento de linhagens do mesmo grupo hetertico, entretanto eram muito baixas para
hbridos obtidos a partir de linhagens de grupos heterticos distintos.
Como os hbridos so, normalmente, obtidos a partir de cruzamentos
de linhagens pertencentes a grupos heterticos distintos, as informaes de distncias genticas obtidas por marcadores moleculares no
poderiam ser utilizadas na predio de hbridos simples. Bernardo
(1992) mostrou que os valores de correlao entre distncias genticas e performance de hbridos dependem da ligao entre os marcadores e QTLs que controlam a caracterstica.
Diante das limitaes da eficincia do uso de marcadores moleculares para predio do desempenho de hbridos, Bernardo (1996)
props a utilizao de uma nova metodologia de predio de hbridos
baseada no uso de modelos mistos, mais especificamente do BLUP
(Best Linear Unbiased Predictor), com informaes obtidas por marcadores moleculares. Nessa metodologia, o desempenho dos hbridos
simples predito em funo do parentesco com outros hbridos j
fenotipados. As linhagens genitoras so genotipadas com marcadores
moleculares e os coeficientes de parentesco entre elas so estimados
e utilizados na predio dos hbridos simples. Guimares etal. (2009)
explicam com detalhes a utilizao dessa metodologia. Segundo esses
autores, trabalhos de validao dessa metodologia, como o realizado
por Charcosset etal. (1998), sugerem que tal metodologia no seria
eficiente para predizer o hbrido mais produtivo, entretanto seria eficiente para predizer o desempenho dos hbridos simples a partir de
um grupo de hbridos simples j fenotipados com elevada preciso.
Dessa forma, um conjunto menor de hbridos simples com potencial
superior seria selecionado para ser efetivamente avaliado em condies de campo.
Anlise de homogeneidade gentica de sementes

Cultivares de espcies autgamas, assim como as linhagens envolvidas na obteno de hbridos de espcies algamas, devem possuir
elevado nvel de homogeneidade. Normalmente, sementes genticas
de uma nova cultivar so obtidas a partir de dezenas de plantas feno97
biotecnologia
tipicamente idnticas oriundas de uma gerao com elevado nvel

de homozigose. Pelo fato da acurcia da avaliao fenotpica no ser
100% devido dependncia dos fatores ambientais, as plantas fenotipicamente idnticas, podem no ser genotipicamente idnticas, ou
seja, podem apresentar falta de homogeneidade ou de uniformidade
gentica.
Marcadores moleculares podem ser utilizados para avaliar essa
homogeneidade gentica com altssima preciso. Mesmo com todo
o rigor adotado nas etapas de seleo fenotpica, linhagens de composio gentica diferente so detectadas na anlise molecular
(SCHUSTER etal., 2009). A possibilidade de identificar e eliminar
as linhagens que apresentam composio molecular diferente certamente vai proporcionar maior nvel de homogeneidade das sementes genticas e, por consequncia, maior nvel de homogeneidade da
cultivar a ser recomendada aos produtores.
Anlise de pureza gentica de

sementes e mistura varietal
Como comentado no item anterior, sementes de uma cultivar ou
variedade podem apresentar caractersticas fenotpicas semelhantes,
mas serem genotipicamente diferentes. A contaminao ou mistura
gentica pode ocorrer nas fases finais do programa de melhoramento,
nos campos de produo de sementes e nos processos de manuteno
de estoques de sementes genticas (SCHUSTER etal., 2009; PINHO
etal., 1996; GETHI etal., 2002).
Segundo Schuster etal. (2009), o monitoramento e rastreamento de
contaminaes genticas no sistema de produo de sementes devem
ser eficientes, de maneira a garantir elevados padres de pureza gentica no material disponibilizado aos produtores de sementes certificadas e, consequentemente, aos produtores de gros. Isso se torna
ainda mais importante com a abertura do sistema de certificao a
entidades privadas e produtores de sementes e tambm com o fortalecimento do sistema de fiscalizao da produo e comercializao de sementes no Pas, previstos na Nova Lei de Sementes (Lei n
10.711 de agosto de 2003).
98
Dentro desse contexto, o uso de marcadores moleculares assume

grande importncia. Alm da avaliao da pureza gentica, marcadores moleculares podem ser utilizados em processos de purificao
da cultivar ou linhagem. Nesse caso, os marcadores podem identificar plantas homozigotas idnticas reais representantes da cultivar ou
linhagem, de modo a utilizlas na multiplicao das sementes.
Marcadores moleculares tambm podem ser utilizados para avaliao de pureza gentica de sementes hbridas. A contaminao
gentica em campos de produo de sementes hbridas pode ocorrer, principalmente, pela autofecundao da linhagem genitora feminina. Nesse caso, vai haver uma mistura das sementes hbridas com
as sementes das linhagens autofecundadas, as quais vo gerar plantas
com baixo desempenho agronmico. Nesse caso, marcadores moleculares codominantes, como os microssatlites, so indicados para
o monitoramento da pureza gentica, pois permitem a verificao da
contribuio de ambos os pais na composio gentica das sementes
hbridas. Schuster etal. (2009) ilustram esse processo de avaliao
de pureza gentica em sementes de milho evidenciando as sementes
hbridas (com contribuio gentica de ambas linhagens genitoras)
e as sementes contaminantes (com contribuio gentica apenas da
linhagem genitora feminina).
Anlise de identidade gentica ou fingerprinting

Cada material gentico (acessos em bancos de germoplasma, linhagem, hbrido, matriz, variedade, cultivar, organismos geneticamente
modificados etc.) possui uma sequncia de nucleotdeos que compem o seu DNA. A deteco de diferenas entre essas sequncias
atravs de polimorfismos de fragmentos de DNA revela um padro
nico, ou seja, uma impresso digital gentica (genetic fingerprinting)
que pode ser utilizada na identificao de indivduos (FERREIRA;
GRATTAPAGLIA, 1998). A impresso digital gentica obtida com
base em marcadores moleculares pode ser comparada a uma impresso digital utilizada nas carteiras de identidade (Figura 23), sendo to
ou mais eficiente para trabalhos de identificao.
99
biotecnologia
~
Figura 23. Analogia entre impresso digital e a impresso digital gentica
obtida com base em marcadores moleculares.
A correta identificao de um material gentico animal ou vegetal essencial. A transferncia de resultados e recomendaes entre
diferentes instituies de pesquisa muitas vezes dificultada em virtude da identificao errada de materiais genticos. Erros de identificao podem ser causados por problemas de homonmia (o mesmo
nome para diferentes acessos); de sinonmia (diferentes nomes para
o mesmo acesso); administrao e controle inadequado do material
gentico; problemas de etiquetagem, mistura de material propagativo
(sementes, mudas, garfos para enxertia, estacas, etc.) utilizado na multiplicao do material gentico; crescimento de ramos a partir de porta
enxerto em materiais genticos mantidos no campo, entre outros.
A anlise de fingerprinting de DNA uma ferramenta poderosa para
a identificao desses erros e tem sido utilizada em vrios trabalhos
(CAETANOANOLLES etal., 1997; SMITH, 1998; YAMADA etal.,
2004). Praticamente todos os tipos de marcadores moleculares do DNA
podem ser utilizados para a identificao de acessos por fingerprinting,
embora diferenas relativas ao contedo de informao gentica por
loco, nmero de polimorfismos detectados, dificuldade e custo da anlise so observadas entre os diferentes marcadores (POWELL etal.,
1996; RUSSELL etal., 1997; PEJIC, 1998; MCGREGOR etal., 2000;
FALEIRO etal., 2004e). De um modo geral, marcadores codominantes e multiallicos so os mais indicados para esses estudos.
100
Caracterizao e proteo de cultivares

Entre as vrias aplicaes dos marcadores moleculares no
psmelhoramento, a caracterizao molecular de variedades e cultivares e sua utilizao na proteo da propriedade intelectual, ou do
direito do obtentor merecem destaque (SCHUSTER etal., 2009). O
desenvolvimento e disponibilizao de novas variedades e cultivares
das mais diversas espcies aumentam a cada ano. Para que os direitos autorais dos obtentores dessas variedades e cultivares possam
ser respeitados, legislaes especficas so criadas, em diversos pases. Em 1961, ocorreu a Conveno Internacional para a Proteo
de Cultivares, que resultou na criao da Unio Internacional para
Proteo de Novas Variedades de Plantas (UPOV). Tratase de um
acordo multilateral que determina normas comuns para o reconhecimento e a proteo da propriedade intelectual dos obtentores de
novas variedades vegetais (UPOV, 2010). Esse marco regulatrio deve
ser seguido pelos pases signatrios ao estabelecerem os certificados
de Proteo de Variedades de Plantas (PVP) nas legislaes locais
(AVIANI etal., 2008).
No Brasil, a proteo de cultivares foi instituda pela Lei n 9.456,
de 25 de abril de 1997, a qual criou o Servio Nacional de Proteo de
Cultivares (SNPC). Para a proteo de uma cultivar no Brasil, alguns
requisitos so necessrios: (a) ser produto de melhoramento gentico;
(b) ser de uma espcie passvel de proteo no Brasil; (c) no ter sido
comercializada no exterior h mais de quatro anos, ou h mais de seis
anos, no caso de videiras ou rvores; (d) no ter sido comercializada
no Brasil h mais de um ano; (e) ser distinta; (f) ser homognea e (g)
ser estvel. Os trs ltimos requisitos so comprovados por meio dos
testes de distinguibilidade, homogeneidade e estabilidade (DHE).
A distinguibilidade entre as cultivares feita por meio do preenchimento de um formulrio contendo os descritores mnimos recomendados pelo SNCP. O SNPC, seguindo as recomendaes da UPOV,
j possui listas de descritores mnimos para um grande nmero de
espcies. Esses descritores baseiamse principalmente em caractersticas morfolgicas de sementes, plntulas, folhas, flores e frutos
e apresentam algumas limitaes como o tempo gasto para realizar
as avaliaes e a falta de acurcia devido ao efeito ambiental e sub101
biotecnologia
jetividade de alguns descritores. Alm disso, com o estreitamento da

base gentica da maioria das espcies cultivadas, as cultivares apresentam muitos marcadores morfolgicos em comum, no podendo
ser distinguidos. Nessas situaes, o uso de marcadores moleculares pode ser requerido (SCHUSTER etal., 2009). As tcnicas moleculares para caracterizar cultivares, apesar de ainda no serem reconhecidas como metodologia oficial, vm sendo utilizadas para se ter
informao adicional em alguns processos de descrio de cultivares
para fins de proteo.
As cultivares melhoradas tendem a ser muito parecidas. de se
esperar que, medida que maior nmero de cultivares seja caracterizado, ser mais difcil discriminar, com base em caractersticas morfolgicas, as novas cultivares entre as j existentes. Nesse contexto, o uso
de marcadores moleculares pode assumir grande importncia, uma
vez que podem distinguir com facilidade as cultivares, mesmo quando
elas possuem a mesma genealogia. Schuster etal. (2009) citam um
exemplo em que marcadores moleculares microssatlites permitiram
a diferenciao clara e precisa de duas cultivares de soja com 99,22%
de parentesco. Apesar da comprovada eficincia dos marcadores moleculares na caracterizao de cultivares, ainda no existe metodologia
padronizada aceita pelo SNPC para ser utilizada oficialmente ao processo de caracterizao e proteo de cultivares.
Consideraes finais
Neste captulo, foram discutidas e exemplificadas as principais
aplicaes de marcadores moleculares como ferramenta auxiliar em
programas de conservao, caracterizao e uso de germoplasma e
melhoramento gentico vegetal. Considerando todas as aplicaes
discutidas em diferentes etapas, desde a coleta de germoplasma at
a caracterizao molecular de variedades melhoradas, difcil imaginar uma cultura ou um programa de pesquisa ou desenvolvimento
tecnolgico envolvendo germoplasma e (ou) melhoramento gentico
que no possa ser beneficiado com o uso de tal tecnologia em algumas situaes.
importante mencionar que prticas de avaliao fenotpica contabilizando os efeitos ambientais e das interaes gentipo x ambiente
102
continuaro sendo de grande importncia e essenciais para subsidiar

a caracterizao e utilizao prtica dos recursos genticos, bem como
para subsidiar os procedimentos de recombinao e seleo realizados em programas de melhoramento gentico. Tais avaliaes nunca
sero substitudas pelos marcadores moleculares. adequado supor
que, em vez de substituio, haver, na verdade, uma integrao cada
vez mais intensiva entre as avaliaes fenotpicas e os marcadores
moleculares. A formao de equipes multidisciplinares e trabalhos
envolvendo maior interao entre os pesquisadores ligados gentica
molecular e pesquisadores ligados ao desenvolvimento tecnolgico
vo permitir que marcadores moleculares sejam utilizados de forma
prtica para resolver problemas, aumentar eficincia, reduzir custos
e atender demandas reais das atividades cientficas e tecnolgicas.
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118
Captulo 4
Prospeco gnica e
bioinformtica
Ana Maria Costa
Introduo
A biotecnologia vem contribuindo significativamente para a gerao de novos produtos como frmacos e alimentos. Genes isolados
de diferentes organismos hoje so transferidos para outros, conferindolhes novas propriedades. Por exemplo, a insulina disponvel
para tratamento do diabetes e o hormnio GH utilizado no controle
de distrbios do crescimento, que antes eram extrados de sunos e
cadveres, so produzidos atualmente por microorganismos portadores de genes humanos construdos por engenharia gentica. Como
resultado, a sociedade pde usufruir de medicamentos de melhor qualidade a preos mais acessveis e sem os riscos sade decorrentes do
processo de obteno antigo.
Hoje a indstria biotecnolgica emprega microorganismos, plantas
e animais como biofbricas de substncias de interesse. Plantas e animais geneticamente modificados esto sendo construdos para usos
especiais dos mais diversos. Como por exemplo, temos os alimentos vacinas, que so alimentos que carregam informaes genticas
que promovem imunizao para diferentes doenas e fibras de alta
qualidade para confeco de tecidos produzidos no leite de animais
(TRIPURANI etal., 2003; BOLDUC; LAZARIS, 2002).
Na agropecuria, a biotecnologia vem contribuindo para acelerar os
programas de melhoramento gentico. Os marcadores moleculares do
DNA, regies que cossegregam com genes de interesse, so empregados para selecionar plantas e animais que apresentem as propriedades desejadas antes que elas se manifestem. Permitindo, assim, que
produtos dos cruzamentos sejam selecionados logo nas primeiras etapas do desenvolvimento da planta ou do embrio de animais, economizando tempo e recursos dos programas de pesquisa.
evidente, portanto, a importncia da biotecnologia para a melhoria da qualidade de vida do homem. A questo : como so identifi121
biotecnologia
cados os genes de interesse para a construo de organismos geneticamente modificados e marcadores moleculares? A seguir sero
apresentadas algumas estratgias comumente empregadas pelos profissionais da rea.
Projetos genoma
Os projetos genomas foram criados para compreender as bases do
funcionamento dos seres vivos. a partir das informaes geradas
nesses estudos que se obtm os segmentos genmicos utilizados no
desenvolvimento biotecnolgico.
Genoma estrutural
A palavra genoma foi cunhada por Hans Winkler, em 1920, como
uma conjugao de gene e cromossomo. No entanto, o conceito geral
de genoma pode ser atribudo ao sculo IV antes da era crist, quando
Aristteles apontou os primeiros conceitos em relao hereditariedade. Embora os trabalhos de Mendel no final do sculo XIV tenham
trazido grandes contribuies no campo da hereditariedade, essa
rea mostravase ainda bastante abstrata. Com o avano dos mtodos
cientficos e das tecnologias, a hereditariedade passou a ser associada
s estruturas presentes no ncleo das clulas chamadas cromossomos (final do sculo XIX e incio do sculo XX) e finalmente com os
polmeros de nucleotdeos duplafita chamados de DNA (meados do
sculo XX) que formam os cromossomos (COSTA; MARTINS, 2010).
No DNA, encontramse codificados segmentos associados expresso de cadeias polipeptdicas e regies estruturais diversas, importantes na manuteno da estrutura do cromossomo e diviso celular. Denominase de genoma estrutural ao conjunto das informaes
contidas nos cromossomos e de projeto genoma estrutural ao programa de pesquisa que vem determinando a ordem das bases nitrogenadas dos polmeros de DNA dos genomas de diversos organismos
(Figura 1). Os resultados do sequenciamento dos segmentos clonados so depositados nos bancos de dados internacionais, sendo o mais
comum e mais importante na atualidade o do NCBI (NCBI, 2009
122
Captulo 4 Prospeco gnica e bioinformtica
Genoma estrutural
Extrao do DNA
ACTTGGAAGTAAAGCTCTCCTCAGCAAATGTAAAAGAACACAAATTATAACAAACTATC
CTCAGACCACAGTGCAATCAAACTAGAACTCAGGATTAAGAATCTCACTCAAAACCGCT
Clonagem
vetor
AACTACATGGAAACTGAACAACCTGCTCCTGAATGACTACTGGGTACATAACGAAATGA
GGCAGAAATAAAGATGTTCTTTGAAACCAATGAGAACAAAGACACAACATACCAGAATC
CTGGGACGCATT CAAAGCAGTGTGTAGAGAGAAATTTATAGCACTAAATGCCCACAAG
AAAGCAGGAAAGATCCAAAATTGACACCCTAACATCACAATTAAAAGAACTAGAAAAGC
AGACCAAACACATTCAAAAGCTAGCAGAAGGCAAGAAATAACTAAAATCAGAGCAGAA
GAAGGAAATAGAGACACAAAAAACCCTTCAAAAAATTAATGAATCCAGGAGCTGGTTTT
TGAAAGGATCAACAAAATTGATAG ACCGCTAGTAAGACTAATAAAGAAAAAAAGAGA
GAATCAAATAGACACAATAAAAAATGATAAAGGGGATATCACCACCGATCCAACAGAAA
ACAAACTACCATCAGAGAATACTACAAACACCTCTACGCAAATAAACTAGAAAATCTAG
AGAAATGGATAAATTCCTCAACACATACACTCTCCCAAGACTAAACCAGGAAGAAGTTG
ATCTCTGAATAGACCAATAACAGGAGCTGAAATTGTGGCAATAATCAATAGCTTACCAA
CAAAAAGAGTCCAGGACCAGATGGATTCACAGCCGAATTCTACCAGAGGTACAAGGAG
ACTGGTACCATTCCTTCTGAAACTATTCCAATCAATAGAAAAAGAGGGAATCCTCCCTAA
CTCATTTTATGAGTCCAGCATCATTCTGATACCAAAGCCTGGCAGAGACACAACCAAAA
Sequenciamento
Banco de DNA
Banco de dados
Figura 1. Sequncia de eventos para obteno das informaes genticas que

alimentam o banco de dados do genoma estrutural a partir de um banco de DNA.
Genoma funcional
Todas as clulas de um mesmo indivduo, salvo algumas excees,
possuem o mesmo genoma estrutural, ou seja, apresentam todas as
informaes genticas necessrias para gerar um organismo inteiro.
Contudo, cada clula, ao se especializar, passa a expressar somente
uma parte dessas informaes. Nos estudos de genmica funcional,
obtmse as informaes do que est sendo expresso nas clulas e tecidos (RNAs e protenas) do organismo. Como se trata de uma anlise
fenotpica, as informaes expressas podem se modificar em funo
das variaes ambientais, tais como temperatura, umidade, nutrio,
estgio de desenvolvimento e idade do organismo.
A genmica funcional, portanto, compreende a anlise das sequncias de RNAs mensageiros e do padro proteico codificado pelo
genoma estrutural numa determinada condio ambiental. So chamados de transcriptomas os bancos de genticos construdos com
os RNAs de um determinado tipo celular (Figura 2). O estudo protemico determina o padro de protenas/peptdeos peculiar cada
tipo celular (Figura 3). E o estudo metabolmico avalia e organiza em
mapas metablicos os compostos qumicos resultantes da expresso
gnica (Figura 4).
123
biotecnologia
Genoma funcional
Isolamento do RNA mensageiro

Construo Banco de cDNA
ACTTGGAAGTAAAGCTCTCCTCAGCAAATGTAAAAGAACACAAATTATAACAAACTATCT
CTCAGACCACAGTGCAATCAAACTAGAACTCAGGATTAAGAATCTCACTCAAAACCGCTC
AACTACATGGAAACTGAACAACCTGCTCCTGAATGACTACTGGGTACATAACGAAATGAA
GGCAGAAATAAAGATGTTCTTTGAAACCAATGAGAACAAAGACACAACATACCAGAATCT
CTGGGACGCATTCAAAGCAGTGTGTAGAGAGAAATTTATAGCACTAAATGCCCACAAGAG
AAAGCAGGAAAGATCCAAAATTGACACCCTAACATCACAATTAAAAGAACTAGAAAAGCA
AGACCAAACACATTCAAAAGCTAGCAGAAGGCAAGAAATAACTAAAATCAGAGCAGAACT
GAAGGAAATAGAGACACAAAAAACCCTTCAAAAAATTAATGAATCCAGGAGCTGGTTTTT
TGAAAGGATCAACAAAATTGATAGACCGCTAGTAAGACTAATAAAGAAAAAAAGAGAGAA
GAATCAAATAGACACAATAAAAAATGATAAAGGGGATATCACCACCGATCCAACAGAAAT
ACAAACTACCATCAGAGAATACTACAAACACCTCTACGCAAATAAACTAGAAAATCTAGA
AGAAATGGATAAATTCCTCAACACATACACTCTCCCAAGACTAAACCAGGAAGAAGTTGA
ATCTCTGAATAGACCAATAACAGGAGCTGAAATTGTGGCAATAATCAATAGCTTACCAAC
CAAAAAGAGTCCAGGACCAGATGGATTCACAGCCGAATTCTACCAGAGGTACAAGGAGGA
ACTGGTACCATTCCTTCTGAAACTATTCCAATCAATAGAAAAAGAGGGAATCCTCCCTAA
CTCATTTTATGAGTCCAGCATCATTCTGATACCAAAGCCTGGCAGAGACACAACCAAAAA
Sequenciamento
Banco cDNA
Banco de dados
Figura 2. Sequncia de eventos para obteno das informaes genticas

expressas na forma de RNA mensageiro (transcriptoma) para compor o
banco de dados do genoma funcional de transcritos.
Proteoma
Purificao e
sequenciamento
de peptdeos
Extrao de peptdeos
MSASFSPHTITLIKSTVPLLAEHGTTIIEAMYHQLFEDPQIEALFNQ
ANQKNGTQIHALAGAILAYARNIDNPGVLASAIERISQKHVGYAIHP
Separao em gel bidimensional
EHYPHVATALLGAIKQVLGDVATSEVLQAWGEAYWFIANLLKDRE
AVIREGIMTKNGGWIHWRRFVISKRIPESETITSFMLHPDDGGPVV
Isolamento
PHQAGQYLTFRFDAAGMPGMKRNYSISCGPNSDHYRITVKREHG
TGASAFLHDQAKVGTIIECTPPVGDFFLPSVIERPIVLLSGGVGLTP
Sequenciamento do peptideo
MVSMMEQIAEAYPDAQVWYVHGTQNRETHAMDAHIRALVSRHK
HMKATTFYTQRSEADDAEAGFITIDWLRANTPFQKADFYLCGPRP
Banco de dados
FLRTFVRDLIGAGVPAAQVHYEFFGPMDEEMAA
Figura 3. Sequncia de eventos para obteno das informaes genticas

expressas na forma de RNA mensageiro (transcriptoma) para compor o
banco de dados do genoma funcional de transcritos.
124
Zetacaroteno
Lutena
Beta-caroteno
Violaxantina
cido Abscsico
Figura 4. Exemplo de mapa metablico disponvel nos bancos de dados.
Os resultados depositados nos bancos de dados no caso de DNAs

e ou cDNAs (DNA sintetizado a partir da fita de RNA mensageiro)
em geral so sequncia de letras que representam a ordem das bases
nitrogenadas orientadas da extremidade 5fosfato para a extremidade
3 OH. No caso das protenas, as sequncias de letras representam a
ordem dos aminocidos da cadeia polipeptdica da extremidade amino
para a carboxiterminal (Figura 5). A grande questo como decifrar o
significado biolgico das frases fornecidas pelas centenas de milhares
de sequncias obtidas dos diferentes materiais genticos, para que se
possa utilizar a informao gerada nos sequenciamentos.
125
biotecnologia
DNA e cDNA
ACTTGGAAGTAAAGCTCTCCTCAGCAAATGTAAAAGAACACAAATTATAACAAACTATCT
CTCAGACCACAGTGCAATCAAACTAGAACTCAGGATTAAGAATCTCACTCAAAACCGCTC
AACTACATGGAAACTGAACAACCTGCTCCTGAATGACTACTGGGTACATAACGAAATGAA
GGCAGAAATAAAGATGTTCTTTGAAACCAATGAGAACAAAGACACAACATACCAGAATCT
CTGGGACGCATTCAAAGCAGTGTGTAGAGAGAAATTTATAGCACTAAATGCCCACAAGAG
AAAGCAGGAAAGATCCAAAATTGACACCCTAACATCACAATTAAAAGAACTAGAAAAGCA
AGACCAAACACATTCAAAAGCTAGCAGAAGGCAAGAAATAACTAAAATCAGAGCAGAACT
GAAGGAAATAGAGACACAAAAAACCCTTCAAAAAATTAATGAATCCAGGAGCTGGTTTTT
TGAAAGGATCAACAAAATTGATAGACCGCTAGTAAGACTAATAAAGAAAAAAAGAGAGAA
GAATCAAATAGACACAATAAAAAATGATAAAGGGGATATCACCACCGATCCAACAGAAAT
ACAAACTACCATCAGAGAATACTACAAACACCTCTACGCAAATAAACTAGAAAATCTAGA
AGAAATGGATAAATTCCTCAACACATACACTCTCCCAAGACTAAACCAGGAAGAAGTTGA
Banco com sequncias de peptdeosdeos

MSASFSPHTITLIKSTVPLLAEHGTTIIEAMYHQLFEDPQIEALFNQ
ANQKNGTQIHALAGAILAYARNIDNPGVLASAIERISQKHVGYAIHP
EHYPHVATALLGAIKQVLGDVATSEVLQAWGEAYWFIANLLKDRE
AVIREGIMTKNGGWIHWRRFVISKRIPESETITSFMLHPDDGGPVV
PHQAGQYLTFRFDAAGMPGMKRNYSISCGPNSDHYRITVKREHG
TGASAFLHDQAKVGTIIECTPPVGDFFLPSVIERPIVLLSGGVGLTP
MVSMMEQIAEAYPDAQVWYVHGTQNRETHAMDAHIRALVSRHK
HMKATTFYTQRSEADDAEAGFITIDWLRANTPFQKADFYLCGPRP
FLRTFVRDLIGAGVPAAQVHYEFFGPMDEEMAAJFKDSLASLDKF
Figura 5. Exemplo de resultados gerados a partir do sequenciamento de

DNAs e peptdeos.
Ferramentas de bioinformtica
As ferramentas de bioinformtica so programas de computador
que auxiliam na interpretao dos resultados gerados pelos diferentes sequenciamentos. Permitem identificar um possvel papel biolgico para os segmentos de DNAs e protenas, por meio de comparaes com sequncias e estruturas depositadas em bancos de dados e
desenvolver marcadores moleculares especficos e iniciadores de replicao (primers) para identificao e ou captura de genes de interesse.
Na pesquisa biotecnolgica, existem duas situaes corriqueiras em
que o pesquisador busca as ferramentas de bioinformtica:
1) Quando se tem uma ou conjunto de sequncias da qual se
deseja identificar a funo biolgica.
2) Quando se tem um problema biolgico para o qual h necessidade de se identificar os genes ou rotas metablicas.
A seguir sero apresentadas algumas dessas ferramentas no contexto da situao um e dois.
126
Ferramentas para anotao de

sequncias genmicas
Nos estudos de genmica, protemica, engenharia gentica e desenvolvimento de marcadores moleculares, frequentemente o pesquisador tem necessidade de confirmar se o segmento obtido realmente o
desejado. Para tanto, fazse a determinao da ordem das bases nitrogenadas (no caso de DNAs) ou dos aminocidos (no caso de peptdeos)
pelo mtodo de sequenciamento de DNA ou de peptdeos. Uma vez
obtidos os dados dos sequenciadores, iniciase a etapa de tratamento
informatizado para interpretao dos resultados.
No caso especfico de DNAs, chamase de sequncia bruta quela
recmobtida da leitura do eletroferograma (representao grfica da
ordem das bases nitrogenadas gerado pelo sequenciador automtico
de DNA). Essas sequncias podem conter, alm do DNA de interesse,
segmentos do vetor de clonagem que necessitam ser identificados
e removidos antes de qualquer estudo para se evitar interpretaes
errneas. A remoo de vetores da sequncia bruta feita comparandose o segmento com bancos genticos de vetores de clonagem.
Identificada a similaridade, fazse a retirada da regio correspondente
ao vetor. Esse processo pode ser feito visualmente e o prprio pesquisador analisa e identifica a sequncia do vetor, ou com auxlio de programas de bioinformtica.
Aps esse tratamento inicial, fazse o envio da sequncia para a
comparao com outras depositadas em bancos de dados. O objetivo
da etapa de comparao identificar similaridades com segmentos de
DNA ou de peptdeos disponveis nos bancos de dados, permitindo
atribuir provveis funes ao segmento em estudo. O programa de
busca de similaridades mais conhecido na atualidade o Blast, que
est disponvel na pgina inicial do NCBI (NCBI, 2009; BLAST, 2009).
A Embrapa desenvolveu um programa de bioinformtica que permite, de forma automatizada, identificar e retirar o vetor, enviar e
recuperar as sequncias similares dos bancos de dados. O programa
dispe de um tutorial e est disponvel para pesquisadores cadastrados no site: www.genoma.embrapa.br (SISGEN, 2009).
Na Figura 6, ilustrase o resultado de uma pesquisa de similaridade
em bancos de dados provenientes do Blast. No exemplo, foi identifi-
127
biotecnologia
cado apenas um segmento similar sequncia pesquisada, contudo

comum aparecer mltiplas sequncias ou a situao inversa em que
no aparecem similaridades.
Figura 6. Pgina de resultados da busca de similaridades com sequncias

depositadas no banco de dados BLAST. No exemplo foi pesquisada a similaridade no banco de arroz da sequncia de tocoferol obtida do sequenciamento
do banco genmico do milho. A representao grfica mostra a regio do segmento do milho com similaridade ao clone NR008395.1 do banco de arroz.
Igualmente comum a situao em que apenas uma parte da sequncia apresenta similaridade com outras provenientes dos bancos de
dados. Esses casos geralmente ocorrem quando existem domnios
conservados entre famlias gnicas ou genes com origem evolutiva
comum, ou mesmo em virtude da presena de elementos repetitivos diversos de origem viral ou no viral (COSTA; MARTINS, 2010).
Identificada a similaridade, fazse a anotao das bases e (ou) aminocidos de incio e fim e sua funo hipottica, destacando o termo
hipottico quando a funo no tiver sido comprovada experimentalmente.
O Blast permite identificar e recuperar dos bancos de dados as fases
abertas de leitura (open reading frame ORF), ou seja, possveis peptdeos que poderiam ser codificados pelo segmento se a regio cor128
respondesse a um gene. Esse procedimento pode ser feito de forma

menos automatizada por meio de outros programas de bioinformtica disponveis gratuitamente ou no para esse fim (ex.: ORF finder
encontrado no prprio site do ncbi: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
projects/gorf/) (Figura 7).
Aes necessrias e anotaes
genticasmais frequentes
Sequncia bruta
Retirada vetor
Comparao com
sequncias depositadas
(www.ncbi.nlm.nih.gov)
Consensos da
expresso gnica
(transcrio e traduo)
(http://www.bimas.cit.nih.gov/molbio/signal/)
Anlise estrutural
(http://hydra.icgeb.trieste.it/~kristian/dna/)
Fase aberta de
leitura (ORF)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
gorf/gorf.html)
Consenso com
elementos repetitivos
(transposons)
Figura 7. Anotaes mais comuns realizadas nas sequncias brutas: (1) retirada da regio do vetor; (2) Comparao com sequncias depositadas em
banco de dados; (3) Identificao de fases abertas de leitura; (4) Identificao
de consensos da transcrio ou traduo; (5) Identificao de elementos repetitivos; e (6) Anlise estrutural.
No caso particular de no existirem similaridades com as sequncias depositadas nos bancos de dados, dependendo da necessidade
do pesquisador, fazse uso de outros programas de bioinformtica
que permitam identificar outras informaes que possam auxiliar na
identificao do papel biolgico. Entre esses programas, destacamse
aqueles que identificam consensos ativadores ou repressores da transcrio, segmentos caractersticos de regio promotora. Essas regies
podem ser caracterizadas com o auxlio de programas do tipo Signal
scan. Tambm, podemse fazer anlises de curvaturas e dobramentos de DNAs e cadeias polipeptdicas com ferramentas especficas disponveis para tal (Figura 7).
129
biotecnologia
Aps a etapa de anotao, em geral as sequncias caracterizadas so

enviadas para depsito nos bancos de DNA ou de protenas. A forma
de envio e depsito depende do banco de dados. No caso do site do
NCBI, h a possibilidade de se depositar a sequncia de forma unitria ou em conjunto por meio do programa especficos. No caso de
depsito no NCBI, o tutorial encontrase na pgina http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/Genbank/update.html. (UPDATING INFORMATION
ON GENBANK RECORDS, 2009).
Com base no conhecimento gerado pelas anotaes, possvel definir as estratgias para comprovao da funo do segmento no organismo. Portanto, a anotao bastante til na situao em que o pesquisador tem alguma sequncia (ou conjunto de sequncias) da qual
necessita identificar a funo biolgica.
De tempos em tempos, as sequncias depositadas nos bancos de
dados so atualizadas. Somente a equipe que as depositou poder promover modificaes nas informaes disponibilizadas. Essa situao
comum quando so disponibilizados os resultados de sequenciamentos parciais ou quando se deseja atualizar as anotaes.
Uma vez publicadas as sequncias pelos bancos, qualquer usurio pode salvar a informao em seu computador. Os arquivos no formato Genebank fornecem a sequncia com todas as informaes anotadas pelo depositante (Figura 8). Por meio desse arquivo, possvel
conectar as informaes complementares disponibilizadas na internet como, por exemplo, a bibliografia relacionada ao arquivo.
130
Figura 8. Exemplo de sequncia no format Genebank. As anotaes em azul

permitem o acesso ao detalhamento da informao, incluindo acesso s
publicaes via ligao com o Medline e Pubmed (seta em vermelho).
O formato Fasta disponibiliza a sequncia sem as anotaes

(Figura9). Esse formato de apresentao til quando a informao
obtida utilizada em algum programa de anlise de bioinformtica,
como no caso de desenho de primers para amplificao de regies
especfica do genoma.
131
biotecnologia
FASTA
>C5 regio hibrida humana/minicrculo kDNA, 1075 bp
GAATTCTCTGTGGCATAGTTCCCAACTTCGATGGCTTACCCTGTTACTCAGCAACATCCTAG
GACTGTCCATCCTGCTTGAAAAATAAGGAAGTTGGCCAAAGTTATGGTTCAGAGGGTAACAT
ACTTGTGGAACAGCATGAGGGACCTCAGTTTGAATCCCCAGCGACCCTGTAAAAGTCAGTTG
TGACTGTACTACAAGTATCATGCTATAACTCCAGTTCTGGGAGGCAGAGACAGGTGGGTCCC
TGGAGTTCACAAGTCAGTCATCCTATTTCAATAGATAGTTTTATGTTCAGGGAAAGGGACTG
TCTCAAAATCGAGGAAGATACACGCACAACTCTGGTATACACACACACACACACACACACAC
ACACACACACACACTCACACACAGTTTTCAGCACCTCCATTTACCATAAAACACCACAACTA
TCACCAAACTCTCTATATTACACCAACCCCAATCGAACCCCACCTCCCGTAAACAACCCCCC
ACTTTCGGCCAAATAATGTACGGGGGAGATGCATGAATTTTCCGGCCAAAATCTGA
> FOSB_MOUSE Protein fosB. 338 bp
MFQAFPGDYDSGSRCSSSPSAESQYLSSVDSFGSPPTAAASQECAGLGEMPGSFVPTVTA
ITTSQDLQWLVQPTLISSMAQSQGQPLASQPPAVDPYDMPGTSYSTPGLSAYSTGGASGS
GGPSTSTTTSGPVSARPARARPRRPREETLTPEEEEKRRVRRERNKLAAAKCRNRRRELT
DRLQAETDQLEEEKAELESEIAELQKEKERL EFVLVAHKPGCKIPYEEGPGPGPLAEVRD
LPGSTSAKEDGFGWLLPPPPPPPLPFQSSRDAPPNLTASLFTHSEVQVLGDPFPVVSPSY
TSSFVLTCPEVSAFAGAQRTSGSEQPSDPLNSPSLLAL
Figura 9. Exemplo de sequncia de DNA (A) e de peptdeo (B) no formato

fasta. O sinal maior (>) indica que a linha o cabealho da sequncia e que
o pargrafo seguinte contm a sequncia.
A segunda situao muito comum enfrentada pelos profissionais

que atuam na rea de biotecnologia aquela em que se tem um problema biolgico para o qual h a necessidade de se identificar os
genes ou rotas metablicas. Nesses casos, os bancos de dados podem
ser muito teis para obter as informaes desejadas. Entre os bancos, destacamse os do NCBI (ENTREZ, 2009) e os do KEGG (Kyoto
Encyclopedia of Genes and Genomes) (KEGG,2009).
A pesquisa do tema geralmente feita por meio de palavraschave
grafadas em ingls. Os resultados so pginas com dados gerais e
links para o acesso s informaes especficas.
O NCBI um portal que integra diferentes bancos de dados por
meio do sistema Entrez (NCBI, 2009; ENTREZ, 2009). A entrada
para o sistema feita pela pgina inicial do NCBI (Figura 10). Nessa
pgina, o usurio visualiza dois campos. O campo 1 destinado
colocao da palavrachave, e o segundo, marcado com a frase All
Database, permite a escolha do banco de dados onde ser realizada a
busca, clicandose na seta ao lado da frase. Ao realizar o procedimento,
abrese uma janela com as opes: Pubmed, Protein, Nucleotide, EST,
GSS, Structure, Genome, Biosystems, Books, Cancercromossome,
Conserved Domains, 3D Domains, Gene, Genome Project, DBGAP,
Gensat, Geoprofiles, Unigene, entre outros. Aps a escolha do banco
132
de dados e colocao da palavrachave, o usurio dever clicar na palavra Go para iniciar a consulta. Para a busca geral, a pesquisa feita
sem a definio de um banco. Nesse caso, todos os bancos sero consultados, gerandose uma relao com o nmero de ocorrncias da
palavrachave em cada um dos bancos e chamadas para acesso.
Figura 10. Resultado da pesquisa da palavrachave tolerncia seca no Entrez.

Os nmeros esquerda de cada cone indicam a quantidade de arquivos obtidos com a palavrachave em cada banco de dados. Para acessar o resultado,
basta clicar sobre o cone.
A seguir sero apresentados alguns dos bancos disponveis no site

com maior utilidade geral. Contudo, em virtude da importncia especfica de algumas das ferramentas, sugerimos a navegao no Entrez
para maiores detalhes.
O Pubmed um banco de dados que disponibiliza os trabalhos
publicados conforme a palavrachave (resumos e artigos). muito
til no caso de revises bibliogrficas, principalmente em temas volta-
133
biotecnologia
dos para a rea de sade, veterinria, bioqumica, gentica molecular,

fisiologia vegetal e cincias biolgicas em geral. Contudo, o sistema
no varre as revistas que focam temas agronmicos ou zootcnicos
propriamente ditos (sistemas de cultivo, adubao, mecanizao agrcola, manejo animal, etc.), fazendose necessria a busca em outros
portais como o Science Direct (SCIENCE DIRECT, 2009).
Os bancos Protein, Nucleotide, EST, GSS disponibilizam acessos
s sequncias de protenas e de DNAs obtidos por diferentes mtodos biotecnolgicos (isolamento e sequenciamento de peptdeos, clonagem e sequenciamento de bancos genmicos, sequenciamento
de segmentos de DNA expressos, sequenciamento de segmentos de
DNA isolados, clonados ou no, entre outros). A consulta a esses bancos gera uma pgina com relao de arquivos Genbank classificada
por organismo. Por sua vez, cada arquivo permite o acesso s publicaes correspondentes e outras informaes quando disponveis,
como localizao do segmento visualizado no cromossomo, nmero
de cpias, via metablica, etc.
O banco Estructure til quando se deseja consultar a estrutura
cristalogrfica relacionada palavrachave permite acesso aos arquivos de banco de dados de protenas (PDB). Da mesma forma, permite
recuperar a literatura correspondente.
O Biosystems disponibiliza o acesso s rotas de sntese metablica que envolvem a palavrachave. Interligase com o banco de dados
KEGG. O portal KEGG especialmente til quando se deseja correlacionar vias celulares, genes e fentipos, e na predio de comportamento biolgico do organismo em funo do ambiente ou do perfil
allico. O banco oferece mapas metablicos com acesso a informaes
de sequncias de protenas e DNAs, estruturas qumicas, cinticas
enzimticas, alm de acesso s publicaes correspondentes. Entre
os mapas, destacamse os das rotas fotossintticas e dos carboidratos, sntese de vitaminas, metabolismo secundrio (Figura 11 e 12).
O banco Books disponibiliza os livros sobre o assunto. O
Cancercromossome possibilita a localizao e informaes cromossmicas relacionadas palavrachave e relacionadas formao de
tumores. Conserved Domains e 3D Domains so bancos teis quando
se realiza estudos de distncias genticas e elaborao de iniciali-
134
zadores (primers) para amplificar genes em organismos aparentados. O banco DBGAP disponibiliza os projetos e estudos que correlacionam os padres genotpicos aos fenotpicos, compreendendo
a diversidade allica e documentaes. O Gensat acessa o banco
de dados do projeto que objetiva o mapeamento dos genes expressos no sistema nervoso central de camundongo. O Geoprofiles e
Unigene disponibilizam a organizao e anlises de transcriptomas.

=HWDFDURWHQR
%HWDFDURWHQR
/XWHtQD
9LROD[DQWLQD
FLGR$EVFtVLFR
Figura 11. Sequncia de busca da via de sntese de carotenides via banco de

dados Kegg. (A) Pgina inicial do Kegg. Verificase o campo para a colocao
da palavra chave e recursos do KEGG; (B) Resultado da busca com a palavra
chave carotenoid; (C) Mapa de sntese de carotenoide; (D) detalhamento
do mapa: enzimas e substratos.
135
biotecnologia

^
^
'

Figura 12. Detalhamento do mapa de sntese de carotenoides. Os smbolos

so portas de acesso para o detalhamento da informao (A): Ao clicar no
crculo, visualizase a estrutura do substrato (B), que, por sua vez, permite o
acesso a outras informaes como as das enzimas envolvidas no processo (C
e E) e sequncia da protena/gene (D) entre outras informaes.
136
Exemplo de problema biolgico aplicado ao melhoramento

gentico
Existe hoje uma grande expectativa da sociedade por alimentos mais
ricos em nutrientes e benficos sade, os chamados alimentos funcionais. Uma categoria de composto correlacionada a propriedades
funcionais a dos antioxidantes. Para tanto, alguns grupos de pesquisa desenvolveram alimentos com maiores teores de compostos
fenlicos e carotenoides. No melhoramento gentico clssico, identificamse os materiais genticos ricos nesses compostos e, por meio
de cruzamentos e selees, agregamse as propriedades benficas s
caractersticas agronmicas da variedade comercial. Mas, como predizer o comportamento biolgico da planta rica em carotenoide? Como
identificar as variantes allicas da via dos carotenoides para sntese em
sistemas biotecnolgicos com o auxlio das ferramentas de bioinformtica? Como aplicar as ferramentas de bioinformtica para desenvolver marcadores moleculares especficos para acelerar os programas de melhoramento gentico?
Para responder essas questes, h a necessidade de se identificar
os genes envolvidos na via de sntese dos carotenoides. A pesquisa
pode ser feita pelo Entrez (NCBI, 2009; ENTREZ, 2009), no banco
Biosystems ou consultar diretamente a existncia dos mapas metablicos no Kegg (KEGG, 2009), utilizandose a palavrachave carotenoid nos campos de busca correspondentes. Nas Figura 11 e 12,
mostrase o resultado da pesquisa realizada no banco de dados Kegg.
A anlise da via permite identificar uma correlao da via de sntese dos carotenoides com a de sntese de cido abscsico. O cido abscsico um hormnio vegetal associado aos processos de maturao
de frutos, queda de folhas e proteo da planta ao estresse ambiental. Esse hormnio provoca dormncia das sementes e diminuio do
porte da planta. Como existe ligao entre as duas vias, possvel inferir que plantas ricas em carotenoides podem, eventualmente, apresentar maior expresso do hormnio, o que poderia afetar no porte e
dormncia das sementes.
A manifestao ou no do prognstico, entretanto, vai depender
da combinao allica da planta. No caso do exemplo, para haver ac-
137
biotecnologia
mulo dos carotenoides, fazse necessrio combinaes allicas mais

eficientes na sntese do composto. Como esse produto substrato de
outras vias biossintticas, necessrio tambm que essas vias possuam alelos menos eficientes no consumo do composto.
No momento, ainda no esto disponveis programas de predio do comportamento fenotpico em funo do perfil allico. A
dificuldade est na falta de informaes organizadas sobre o comportamento gentico dos alelos frente s variaes ambientais que
permitam subsidiar a elaborao de programas preditivos. Contudo
j existem alguns estudos em andamento conforme pode ser constatado na lista de projetos sobre o assunto disponibilizado pelo Entrez
(DBGAP, 2009).
Para se identificar os alelos conhecidos de um determinado gene,
o interessado pode fazer a busca nos bancos Protein ou Nucleotide,
EST, GSS do Entrez (ENTREZ, 2009) ou pelo Kegg (KEGG, 2009). Se
o usurio dispuser de informao da sequncia gnica ou da protena,
tambm o Blast pode ser til na pesquisa (BLAST, 2009).
Recuperados os alelos, fazse o alinhamento das sequncias para
identificar as regies mutadas e no mutadas. Existem programas que
auxiliam nesse processo, sendo um dos mais utilizados o ClustalW
(CLUSTALW, 2009). O ClustalW pode ser utilizado online ou instalado
no terminal do usurio. O programa aceita a comparao de sequncias que estejam no formato Fasta. Essas podem ser copiadas e coladas diretamente no campo disponibilizado na pgina inicial do programa ou podem ser carregadas pelo programa a partir de arquivos
tipo DOC ou TXT (Figura 13).
138
Clustal W: www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html
>C1, 181 bp
GAATTCGGCTTGGTTCGATTGGGGTTGGTGTAATATAGAGAGTTTGGTGATAGTTGTGGTGTTT TATGTAAAT
GGAGGTGCTGAAATGCAGATTTTGATTTTNAGGGCGTCAGATTTCCGACAAATCATTCATCTCC CCGACNNNG
CGAAGTGGTGNNGTTACTTAGTGTCGATGGGTGGG
>C2, 666 bp
GGTTCGATTGGGGTTGGTGTAATATAGAGAGTTTGGTGATAGTTGTGGTGTTTTATGGTAAATG GAGGTGCTG
AAAATTGGCAGAATTTTGATTTTGGGAGGGGCGTTCAGATTTCGGCGGAAAATTCATGCATCTC CCCCGTACA
TTATTTGGCCGAAAGTGGGGGTTGTTTACGCGAGGTGGGTTCGATTGGGGTTGGTGTAATATAG AGAGTTTGG
TGATAGTTGTGGTGTTTATGGTAAATGGAGGTCTAAAATGCAGATTTATTTGGAGGCTCAGTTG CGAATCATG
CATCTCCCCCGTACTGACTGCTAATAGGTCTCACGACGCGGTTCGATGGGTGGTGTATATAAAA GGTTGTGAT
AGTTGTGCTGCTTTATGTCAAATGGAGGTGCTTGAAAATGCAGAACTTTTGATTTTGGGAGGGC GTTCAGACT
TTTGGGCGGAAAACTTCATGCATCTCCCCCGTACATTACCTTTGGCCGAAAGTGGGGGTCTGTT TACGGGAGG
CTGGGGTTCGATTGGGGTTGGTGTAATATAGAGAGTTTGGTGATAGTTGTGGTGTTTTATGGTA AATGGAGGT
GCTGAAAACTGGCAGAATTTTGATTTTGGGAGGGGCGTTCAGATTTTGGCCGGAAAATTCATGC ATCTCCCCC
GTACATTAT
>C4, 151 bp
GGTTCGATTGGGGTTGGTGTAATATAGAGAGTTTGGTGATAGTTGTGGTGTTTTATGGTAAATG GAGGTGNTG
AAAATTGGCAGAATTTTGATTTTNGGAGGGGCGTTCAGATTTTGGGCGGAAAATTCATGCATCN CCCCCNTAC
ATTAT
Figura 13. Pgina inicial do programa ClustalW. As sequncias devem ser

colocados no formato Fasta.
Na Figura 14, mostrase o resultado da comparao de segmentos de DNA por meio do ClustalW. Identificada as regies similares e no similares, a informao pode servir para diferentes finalidades, incluindo o desenvolvimento de marcadores moleculares ou
para desenho de inicializadores que iro amplificar regies especficas para estudo e uso biotecnolgico.
139
biotecnologia
Comparao das sequncias para busca de primers
Regio potencial para

desenho de primer/sonda
Figura 14. Exemplo de comparao de trs alelos realizada com o auxlio do

programa ClustalW. A linha pontilhada indica ausncia das bases no alelo.
O smbolo estrela na linha abaixo dos clones indica que todos os alelos apresentam a mesma base no ponto indicado. Os nmeros direita indicam a
posio no alelo da ultima base visualizada na linha.
Consideraes finais
As ferramentas de bioinformtica e bancos de dados permitem que
o usurio adquira uma noo do estado da arte e acesso ao detalhamento de informaes biolgicas teis, tais como sequncias de DNA
e de protena, estruturas tridimencionais de cidos nucleicos e peptdeos, localizao de segmentos gnicos e no gnicos nos cromossmicos, identificao de rotas metablicas, entre outros. Esse conhecimento de extrema utilidade na gerao, interpretao e discusso
de dados e formulao de hipteses.
Como qualquer fronteira do conhecimento, os programas de bioinformtica esto em constante aprimoramento. Dia aps dia, novas
ferramentas surgem no mercado, exigindo ateno e esforos por
140
parte do usurio no sentido de conhecer os novos recursos. Contudo,

tratase de um esforo compensador que resulta em grande economia de tempo e tambm de esforos, que, se bem explorado, pode ser
uma poderosa ferramenta para o avano tecnolgico.
Referncias
BLAST. 2009. Disponvel em: <http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi>. Acesso
em: nov. 2009.
BOLDUC, M.; LAZARIS, A. Spider Silkbased advanced performance fiber for
improved personnel ballistic protection systems. Defence R&D Canada Valcartier.
Technical Memorandum DRDC Valcartier TM 2002.222. 2002. Disponvel em: <
http://cradpdf.rddc.gc.ca/PDFS/unc07/p518792.pdf >. Acesso em: nov. 2009.
CLUSTALW. 2009. Disponvel em: <www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html>.
Acesso em: nov. 2009.
COSTA, A. M.; MARTINS, C. Estrutura e evoluo dos genomas. Planaltina, DF:
Embrapa Cerrados, 2010. 110 p.
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MARTINS, C.; BARROS, A. M.Estrutura e evoluo de genomas.Planaltina, DF:
Embrapa Cerrados, 2007.
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TRIPURANI, S. K.; REDDY, N. S.; RAO, K. R. S. S. Green revolution vaccines,
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UPDATING INFORMATION ON GENBANK RECORDS. Disponvel em: <http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/update.html>. Acesso em: nov. 2009.
141
Captulo 5
Genmica funcional
Erich Yukio Tempel Nakasu
Thales Lima Rocha
Introduo
A biodiversidade existente hoje, ou mesmo a extinta, que observada nos registros fsseis desde 3 billhes de anos atrs, nos mostra uma infinita variedade de formas, tamanhos, cores, nichos e relaes ecolgicas. Paradoxalmente, os seres vivos so bioquimicamente
iguais e, essa infinita variabilidade constituda basicamente de umas
dezenas de precursores moleculares idnticos. Da mesma forma,
incrvel que quase toda informao biolgica esteja armazenada
no cido desoxirribonucleico, o DNA, que apresenta apenas quatro
tipos de bases nitrogenadas diferentes (Adenina, Citosina, Timina
ou Guanina). Da mesma forma, quase todas protenas so constitudas de apenas 20 tipos de aminocidos, encadeados sequencialmente. A variao de nmero e de sequncia nucleotdica o que pode
gerar teoricamente infinitos genes diferentes (para uma introduo
detalhada, CORDEIRO, 2003). De forma semelhante, essa informao do gene pode ser utilizada para determinar a sequncia precisa
de aminocidos que constitui uma determinada protena, que aps
seu enovelamento, endereamento e ativao, ir assumir sua funo celular. Como os carboidratos, lipdeos e metablitos podem ser
observados como produtos enzimticos gerados por protenas especficas, muito pode ser entendido a partir dos genes e suas protenas
codificadas, num nico mecanismo de fluxo de informao biolgica,
que est baseado num nmero nfimo de precursores moleculares.
O conjunto completo dos genes de determinado ser vivo chamado
de genoma. A genmica a cincia que trata do sequenciamento e
os diversos estudos da informao gerada. J a genmica funcional
um campo da Biologia Molecular e Bioqumica que descreve a funo especfica de genes e protenas, relacionando as etapas do fluxo de
143
biotecnologia
informao biolgica, relacionando a regulao da expresso gnica

com mecanismos bioqumicos e fisiolgicos. A genmica funcional
inclui estudo da atividade molecular, que compreende vrias micas (Figura 1), como transcriptmica (expresso gnica), protemica
(expresso proteica) e, mais recentemente, metabolmica (presena
e abundncia de metablitos).
DNA
Genmica
RNA
Transcriptoma
Protena
Proteoma
Metablito
Metaboloma
Figura 1. Cincias micas e os tipos de biomleculas estudadas. As setas

mostram o sentido direto do fluxo de informao biolgica, onde a informao gentica transmitida do DNA do ncleo para o citoplasma na forma
de RNA, cuja informao utilizada para sntese de protenas nos ribossomos. Enzimas controlam o transporte, a sntese e a degradao dos metablitos celulares .
Ao contrrio da genmica, a genmica funcional focaliza os aspectos dinmicos como transcrio gnica, traduo proteica, interao protenaprotena e alterao metablica, alternativamente aos
aspectos estticos da informao genmica como sequncia de DNA
e estrutura gnica. Por natureza, a genmica estuda um fenmeno
populacional e apresenta enfoque gentico e evolutivo, enquanto a
genmica funcional aborda um fenmeno fisiolgico com enfoque
celular, molecular e bioqumico.
144
Captulo 5 Genmica funcional
Considerando a reproduo sexuada de espcies diploides, cada

indivduo herda dois genomas haploides, cada qual oriundo de um
gameta e constitudo de segmentos cromossomais que podem sofrer
mutao, recombinao, duplicao, transposio e segregados pela
meiose, que foram combinados pela fecundao. A grande variabilidade gerada matriaprima para a seleo natural dos indivduos, e
para seus genomas nicos, que apresentam caractersticas mais vantajosas em determinadas condies (adaptao). Salvo raras excees,
todas as clulas de determinado indivduo compartilham o mesmo
genoma, do momento de sua formao at a sua morte. A genmica
tem gerado descobertas fascinantes com relao evoluo das espcies, comparando tanto a sequncia dos genes e famlias gnicas como
sua arquitetura nos cromossomos em estudos de sintenia.
Entretanto, sendo o genoma funcional um fenmeno fisiolgico.
Quando um indivduo modifica sua fisiologia em resposta a variaes
ambientais (aclimatao), o que ocorre em nvel celular a alterao
da expresso gnica (transcrio) e expresso proteica (traduo), que
refletem nos metablitos. Ou seja, o genoma funcional varia conforme
diversos estmulos do prprio organismo (local e tipo de tecido, fase
da vida, hormnios, etc) e do meio ambiente (temperatura, fotoperodo, umidade, altitude, latitude, estao do ano, patgenos, etc).
A questo principal como atribuir uma funo especfica a genes e
protenas dentro de clulas extremamente complexas e pequenas? As
melhores abordagens de estudo so baseadas em comparao entre
espcies, indivduos ou tratamentos. Conceitualmente simples, a soluo est organizada em trs princpios comparativos:
a) Comparativo de sequncia Assumindo a ancestralidade
comum de todos os seres vivos e sua diversificao conforme
a evoluo biolgica, fazse a comparao da informao biolgica. Constatase que alta a probabilidade de que molculas com sequncias similares desempenhem papel semelhante, mesmo comparando espcies bem diversificadas.
Logicamente, espcies mais distantes filogeneticamente apresentam menor identidade de sequncia de determinada molcula, assim como espcies mais prximas evolutivamente tm
sequncias com alta identidade. Normalmente, mecanismos
145
biotecnologia
biolgicos bsicos so idnticos em todas as espcies, e seus

genes, transcritos e protenas relacionados so extremamente
conservados ao longo do tempo. Considerando isso, inferese
a funo predita a uma molcula recmdescoberta com base
na funo confirmada numa outra espcie, desde que compartilhem relativa identidade de sequncia nucleotdica ou peptdica. As bioinformtica genmica se encarrega dessa comparao em larga escala de sequncias de genes, mRNAs (cDNAs)
e protenas, assim como das relaes evolutivas entre as espcies estudadas.
b) Comparativo de abundncia Indivduos da mesma espcie
submetidos a diferentes condies e tratamentos so comparados com relao resposta fisiolgica que induzida e quais
molculas so utilizadas nesse mecanismo, observando quais
mRNAs, protenas e metablitos aumentam e quais diminuem
de abundncia. As principais tcnicas de genmica funcional
atuam na identificao, isolamento e quantificao de mRNAs,
protenas e metablitos para comparao entre situaes contrastantes. Inferese a funo relacionada a determinadas situaes por quantificao diferencial das molculas.
c) Comparativo de fentipo A comparao de indivduos com
alteraes genticas e indivduos sem alteraes genticas pode
indicar a funo especfica do gene mutante. Inferese a funo da molcula nos indivduos silvestres ou selvagens pela
observao da perda de funo nos mutantes. Essa forma de
estudo conhecida como gentica reversa e dispe de vrias
tcnicas. Inicialmente, os mutantes de vrias espcies, inclusive humanos, eram detectados para serem estudados e relacionados aos genes mutantes. Depois, mutantes podiam ser gerados por mutao gnica aleatria induzida por irradiao ou
quimicamente, principalmente em fungos, drosfilas e plantas. Com o advento das tcnicas de Biologia Molecular, genes
especficos podiam ser introduzidos, modificados ou nocauteados (OGM), gerando indivduos sob encomenda para estudo
da funo de genes especficos.
146
A gentica reversa muito poderosa e rene os trabalhos que de

fato demonstram a relao de causa e efeito e formou grande parte da
base do conhecimento atual da Biologia e reas correlatas. Porm, a
gerao de OGM demorada, laboriosa e onerosa, mesmo para organismos modelo, sendo, portanto, atualmente impraticvel a gerao
de em torno de 25 mil OGMs (nmero predito para vrios eucariotos multicelulares) para estudar a funo de todos os genes para cada
espcie. O silenciamento gnico, entretanto, relativamente mais
rpido, fcil e acessvel, pois no envolve transformao gentica e,
sim, ingesto e (ou) injeo e (ou) infeco viral de molculas de RNA
dupla fita (dsRNA) no organismo em estudo. O gene especfico desligado e a funo individual perdida observada. Gene a gene, so
meticulosamente estudados.
Utilizando essas estratgias possvel: comparar padres de expresso gnica e proteica entre diferentes tecidos, diferentes estdios de
desenvolvimento, processos patolgicos e imunolgicos; correlacionar abundncia diferencial de mRNA, protenas e metablitos com
mudanas fisiolgicas; descobrir mecanismos biolgicos; estudar as
respostas celulares a drogas, diferentes condies fisiolgicas e exposies ao ambiente; descobrir relaes funcionais entre genes, protenas e metablitos; rastrear genes de interesse para melhoramento
gentico, transgenia, desenvolvimento de frmaco entre outros.
Transcriptmica
Transcriptmica a cincia que estuda o transcriptoma, que, por
definio, o conjunto completo de RNA transcritos de determinado
indivduo, de determinada espcie, de determinada idade, de determinado tecido, em determinadas condies ambientais, sob determinado tratamento experimental, etc. Ou seja, se o genoma o conjunto
de genes de um certo indivduo, ele no varia para aquele indivduo.
Todas as clulas daquele indivduo apresentam o mesmo genoma,
exceto linfcitos e clulas germinativas devido a peculiaridades funcionais. Bastaria fazer um genoma por espcie, determinando todos
os alelos para cada lcus gnico. No entanto, um enorme nmero de
diferentes transcriptomas pode ser gerado de um nico indivduo,
considerando todas as condies especficas utilizadas para coletar as
147
biotecnologia
amostras. Se a soma dos recursos aplicados para obter cada genoma

atualmente conhecido (4.955 incompletos e 1.043 completos, http://
www.genomesonline.org/gold.cgi) fosse aplicada em transcriptomas
de uma nica espcie, por exemplo Homo sapiens, seriam, quem sabe,
uns 3 mil transcriptomas. Entretanto, se for considerado que o ser
humano apresenta diversas fases da vida, centenas de tipos celulares, dezenas a centenas de disfunes fisiolgicas, doenas genticas,
parasitas e patgenos, provavelmente esse nmero de transcriptomas
no atenderia a todas as perguntas biolgicas. Por isso, vrias estratgias metodolgicas foram criadas para abordar transcriptmica sem
necessariamente sequenciar transcritos em larga escala.
Biblioteca de cDNA
Molculas de RNA so sintetizadas (transcrio) para cumprir
diversas funes, sendo o mRNA responsvel por levar a informao biolgica armazenada no DNA para os ribossomos, local da sntese de protenas (traduo). Em eucariotos, a grande maioria dos
mRNA possui na sua extremidade 3 uma sequncia homopolimrica de adenosinas (cauda PoliA). Tal caracterstica explorada nas
tcnicas de transcriptmica para excluir outros tipos funcionais
de RNA. Utilizando um iniciador oligonucleotdeo com sequncia
homopolimrica de timidinas (OligodT) e uma DNA polimerase
RNAdependente (transcriptase reversa viral), possvel sintetizar
in vitro molculas de DNA complementar (cDNA), que podem ser
clonados (ligados em plasmdeos com DNA ligase e inseridos em
clulas bacterianas de Escherichia coli por eletroporao) para produo de massa e sequenciamento (GUBLER; HOFFMAN, 1983).
A biblioteca de cDNA representa todos os genes expressos nas condies de coleta da amostra.
Ferramentas de bioinformtica para anlise de sequncia so utilizadas para inferir funo gnica, mecanismos fisiolgicos, vias metablicas, etc que atuam em determinada situao. Quando se pretende
comparar tratamentos experimentais, devem ser geradas bibliotecas
de cDNA para cada situao. Posteriormente, fazse a subtrao in
silico por bioinformtica, que resulta na discriminao de quais genes
ocorrem apenas em um tratamento, apenas no outro tratamento ou
148
ambos, ou seja, um resultado qualitativo. Apenas quando um grande

nmero de clones sequenciado (alta taxa de redundncia), os dados
podem ser considerados quantitativos com certa confiana, mas com
custo muito elevado.
Biblioteca subtrativa
A biblioteca subtrativa representa o subconjunto de cDNA que
ocorre exclusivamente em uma determinada situao. Apesar de haver
certas variaes, os protocolos se baseiam na extrao de RNA de dois
tratamentos (A e B, por exemplo) e na incubao conjunta dos respectivos cDNA desnaturados para subtrao in vitro, que teoricamente
seleciona os exclusivos (ocorre em A, mas no em B, ou viceversa).
Assim, apenas so clonados e sequenciados os cDNA diferencialmente expressos, diminuindo o tempo e o custo em relao subtrao in silico, que sua principal vantagem (SARGENT; DAVID, 1983).
Na verdade, essa estratgia de subtrao foi idealizada para permitir
a clonagem de genes com baixa taxa de expresso, em que a amostra de cDNA era subtrada dela mesma usando uma massa de 10 a
30 vezes da mesma amostra (TIMBERLAKE, 1980; ZIMMERMANN
etal., 1980).
Apesar das vantagens de se clonar cDNA raros ou comparar dois
tratamentos sem a necessidade de sequenciar dezenas de milhares
de clones (SAMBROOK etal., 1989), tal estratgia no est to presente nas publicaes mais recentes devido provavelmente ao surgimento de novas estratgias e a gerao de grande nmero de falsos
positivos, ou seja, genes expressos nos dois tratamentos so clonados
como sendo genes diferencialmente expressos. Outra desvantagem
que variaes quantitativas menores no so detectadas e, inversamente, grandes variaes quantitativas podem ser confundidas com
variaes qualitativas.
DDRTPCR
A estratgia de apresentao diferencial por transcrio reversa
seguida de reao em cadeia da polimerase (DDRTPCR, do ingls
Differential Display RTPCR) uma poderosa tcnica de identificao
149
biotecnologia
e isolamento de genes diferencialmente expressos (LIANG; PARDEE,

1992). Essa tcnica consiste na sntese de cDNA em subconjuntos utilizando oligodT diferentes. Por exemplo, utilizando paralelamente
os oligodT terminados em A, C ou G (M) e transcriptase reversa,
os mRNAs servem de molde para a sntese de trs subpopulaes
de cDNA que terminam em T, G ou C logo antes da cauda PoliA.
Tambm possvel separar a populao de mRNA em doze subpopulaes utilizando iniciadores oligodT diferenciados nos dois ltimos nucleotdeos (AA, AC, AG, CA, CC, CG, TA, TC, TG, GA, GC e
GG, ou NM). Dessa forma, considerando dois tratamentos amostrados, os cDNAs de cada subpopulao so separados por tamanho em
gel de poliacrilamida por eletroforese. Como os cDNAs so marcados com radioatividade (normalmente fsforo 33, mais seguro que o
fsforo 32) ou digoxigenina (eptopo para anticorpo fusionado com
enzima), eles so selecionados como diferencialmente expressos visualmente e as bandas cortadas do gel so diretamente sequenciadas ou
so primeiro clonadas em E. coli. Apesar de laborioso, normalmente
depender de radioatividade e demorar algumas semanas, uma tcnica eficiente para isolamento de genes diferencialmente expressos,
incluindo genes desconhecidos.
Macroarranjo de DNA
O princpio do macroarranjo de DNA est baseado na tcnica de
hibridizao, sendo uma estratgia de anlise interessante para organismos que j apresentam estudos genmicos prvios. A utilizao de
uma coleo de DNA distintos arranjados para observao do padro
de expresso foi primeiramente descrito por Kulesh etal. (1987). O
macroarranjo pode ser interpretado como o inverso de um Southern
blot (SOUTHERN, 1975), que tem como princpio a separao das
amostras de DNA por eletroforese em gel desnaturante, transferncia do DNA para membrana, imobilizao por ligao covalente do
DNA com a membrana e a hibridizao com sondas de DNA marcadas com radioatividade correspondentes a um nico gene (Figura 2).
150
Teste
Controle
Marcao
radioativa de
cidos nuclicos
Hibridaes
paralelas
12 cm
m
Revelao
2 - 3,000
Sondas
Figura 2. Esquema representativo de um Macroarranjo. Duas situaes so

contrastadas, controle e o teste (tratamento). Amostras de RNA so obtidas
para sntese de cDNA, em que essas molculas recebem uma marcao normalmente radioativa. Robs, em larga escala, ou carimbos, em menor escala,
so utilizados para aplicao uniforme e localizada das sondas especficas (at
3 mil sondas). A hibridizao das sondas assegura uma marcao detectvel
por revelao fotogrfica. Dessa forma, a presena e abundncia so percebidas como sinais escuros na membrana, indicando uma anlise de expresso diferencial qualitativa e quantitativa.
Inversamente, a estratgia de macroarranjo inicia com a imobilizao em membrana de nylon de produtos de PCR ou cDNA clona-
151
biotecnologia
dos, com sequncia, nome e funo conhecidos, de forma que, em

cada posio exata (spot), tem um nico cDNA associado para posterior hibridizao com uma populao de cDNA marcado com radioatividade ou digoxigenina. Robs podem ser utilizados para depositar
os cDNA nas membranas de nylon numa densidade aproximada de
40 spots/cm2. Tambm possvel utilizar um carimbo prprio (para
placa de 96 poos) para aplicar o cDNA em estudos de menor escala.
Quando existe complementaridade com alguma sequncia imobilizada, o cDNA marcado que sondado fica pareado e pode ser detectado em filme fotogrfico devido s emisses. Alternativamente, existe
um tipo de marcao enzimtica, sendo aplicada s mesmas etapas
iniciais, variando apenas a forma de deteco. Nesse caso, o cDNA
sintetizado com um eptopo para reconhecimento por anticorpos
fusionados a enzimas. Ao se adicionar o substrato incolor, aqueles
spots sem homologia permanecem incolores e os spots com homologia ficam coloridos. A colorao se deve a uma sequncia de eventos: (a) o DNA fixado na membrana forma ligaes de hidrognio com
o cDNA complementar sondado; (b) essa sonda sintetizada com
nucleotdeo contendo digoxigenina, um eptopo; (c) um anticorpo
antidigoxigenina se liga nos spots; (d) conjugado ao anticorpo est a
fosfatase alcalina; e (e) essa enzima cataliza a converso do substrato
incolor em um produto colorido, marcando os spots onde houve as
etapas anteriores.
Dessa forma, centenas de cDNA, vistos como pontos na membrana,
so sondados simultaneamente para gerao de dados qualitativos e
quantitativos de expresso gnica. Utilizando algum programa dedicado para detectar os spots, quantificar a intensidade das imagens
geradas, procedese a anlise estatstica considerando as duplicatas e
os controles. Assim, diferentes tratamentos so observados quanto
expresso diferencial de centenas de genes conhecidos, de modo que
possvel relacionlos com os mecanismos bioqumicos que atuam
nos processos fisiolgicos estudados.
Microarranjo de DNA
O microarranjo de DNA (Microarray) tem sido a principal ferramenta de transcriptmica e que mais contribuiu para o avano do
152
conhecimento na era ps genmica at o momento. A miniaturizao do macroarranjo foi relatada em 1995 (SCHENA etal., 1995) e,
apenas dois anos depois, j era possvel organizar o primeiro genoma
eucaritico completo, da levedura Saccharomyces cerevisiae, em uma
nica e pequena lmina (LASHKARI etal., 1997).
A metodologia do microarranjo apresenta algumas melhorias em
relao estratgia anterior. Inicialmente, robs depositam dezenas
de milhares de sondas especficas em lminas de vidro ou silicone
(6.000 spots/cm2) em empresas privadas que comercializam chips de
DNA, padronizados ou encomendados (Figura 3). Assim, instituies
de pesquisa e universidades realizam seus experimentos de expresso
gnica em larga escala, gerando grande quantidade de dados com alta
reprodutibilidade e confiabilidade, sem precisar investir nos equipamentos de elevado custo de aquisio, operao e manuteno.
Outra melhoria foi na forma de marcao. No lugar da radioatividade, os cDNAs so marcados com dois fluorforos, ficando cada
tratamento com uma determinada cor. Aps a hibridizao, modernos aparelhos excitam as molculas fluorforas com laser e captam
imagens coloridas com alta resoluo em escaner fluorescente para
compor os dados de expresso gnica quando comparadas pela intensidade e colorao apresentada em cada ponto que representa um
determinado gene. O uso de diferentes fluorocromos permite que os
sinais de hibridizao sejam determinados para os dois tratamentos
distintos em um nico experimento. Cada spot apresenta uma cor
que resultante da mistura dos dois fluorocromos, cada qual com
sua intensidade, e representa aquela sequncia de DNA em relao
aos dois tratamentos observados. Dessa forma, o microarranjo de
DNA permite a anlise simultnea de expresso de milhares de genes.
Tambm existe o chip de DNA para genotipagem, em que os pontos
fixados correspondem a marcadores moleculares (normalmente do
tipo SNPs) que se correlacionam com fentipos conhecidos.
A maior desvantagem do microarranjo de DNA sua dependncia
de genes previamente caracterizados. Por isso, existem alguns estudos
de hibridizao heterloga, em que amostras de espcies sem genoma
utilizam chip de DNA da espciemodelo filogeneticamente mais prxima. A dependncia de empresas privadas eleva o custo, porm os
153
biotecnologia
arranjos montados em laboratrios so tecnicamente trabalhosos e

podem resultar em dados no to confiveis. A anlise estatstica
igualmente trabalhosa e a imensa quantidade de dados pode dificultar a interpretao final.
Teste
Controle
Marcao
fluorescente de
cidos nuclicos
Cy5
Hibridao
competitiva
2,5
cm
7, 5 c
Cy3
20.000
Sondas
Scanner
Figura 3. Esquema representativo de um Microarranjo. Duas situaes so

contrastadas: controle e teste (tratamento). Amostras de RNA so obtidas
para sntese de cDNA, em que essas molculas recebem uma marcao fluorescente distinta. Robs so utilizados para aplicao uniforme e localizada
das sondas especficas (20 mil sondas). A hibridizao competitiva ocorre
no mesmo suporte slido. A cor resultante est associada combinao de
cores das amostras, controle ou teste, indicando a presena e abundncia de
cada, resultando numa anlise de expresso diferencial qualitativa e quantitativa em larga escala.
SAGE
A poderosa tcnica de anlise seriada da expresso gnica (SAGE,
do ingls Serial Analysis of Gene Expression) permite estudar o
padro global de expresso gnica e foi desenvolvida e publicada em
154
1995 (VELCULESCU etal., 1995). O SAGE pode ser utilizado para

identificar e quantificar a expresso de genes novos ou previamente
conhecidos.
Sua metodologia se baseia na gerao de etiquetas de cDNAs (tags)
de 10 a 14 pares de bases, que contm informao suficiente para
identificao especfica de transcritos. Os tags so gerados de uma
nica posio dentro de cada transcrito, evitando redundncia ou
superestimativa. Os tags gerados so ligados numa molcula longa
e serial de DNA (concatmero), que clonado e sequenciado. Dessa
forma, cada clone sequenciado traz informao de dezenas de transcritos, multiplicando a gerao de dados e minimizando custo. Todas
sequncias obtidas devem ser processadas por programas de bioinformtica para reconhecer e separar os tags dos concatmeros, anotar individualmente e fazer a contagem das vezes que cada tag especfico representado.
Por ser um mtodo direto e quantitativo de medir abundncia dos
transcritos, seu resultado de nvel de expresso gnica muito confivel e tem alta correlao com experimentos confirmatrios utilizando PCR em tempo real.
Entretanto, o SAGE tem como desvantagens alto custo e longo
tempo demandado para clonar, sequenciar e analisar os tags, alm da
maior dependncia de genomas completamente sequenciados para a
associao entre os tags e os genes correspondentes. Outro problema
que os tags representam as extremidades 3 dos mRNAs e, em alguns
genes, essa regio pode ser muito polimrfica, dificultando a anlise.
Algumas melhorias tcnicas foram desenvolvidas em estratgias
derivadas, como LongSAGE, RLSAGE e SuperSAGE, para capturar
tags mais longos, melhorando a correta identificao do gene correspondente.
Sequenciamento de nova gerao

Mais recentemente, novas tecnologias de sequenciamento de DNA
(conhecidas como Next Generation Sequencing) foram desenvolvidas e novos equipamentos esto sendo comercializados, como o
454 FLX (Roche), SoLiD (Applied Biosystems) e Solexa (Illumina).
Considerando apenas os ltimos sete anos, o custo do sequencia155
biotecnologia
mento foi reduzido mais de 100 vezes e a capacidade de sequenciamento por mquina aumentou mais de 1.000 vezes. De fato, est
acontecendo uma mudana de paradigma na execuo dos experimentos. Os fatores tempo e dinheiro, que determinaram o sucesso
e insucesso de adoo das estratgias anteriormente descritas, j iniciam um redirecionamento metodolgico.
Num futuro bem prximo, teoricamente qualquer ser vivo conhecido poder ter seu genoma completamente sequenciado para estudos de genmica comparativa. Imaginem a gerao de milhares de
genomas de indivduos da mesma espcie para genotipagem total e
identificao de marcadores moleculares para todos os genes e seus
alelos. Ou milhares de transcriptomas de uma espcie direcionados
para responder questes biolgicas, mdicas, patolgicas, fisiolgicas e tantas outras. Ou ainda, genomas de inmeras amostras complexas de gua e solo (metagenmica), sem identificao prvia dos
seres vivos presentes.
Entretanto, novos desafios so lanados para a bioinformtica,
pois o tipo de dado gerado requer novos programas dedicados, e o
volume de dados que pode ser gerado a baixo custo em curto tempo
absurdamente grande, dificultando seu armazenamento e anlise.
Curiosamente, maior custo e tempo sero necessrios para armazenar
e analisar os dados do que para gerar as sequncias, ou seja, o inverso
do que vinha ocorrendo com a utilizao do sequenciamento automtico (SMITH etal., 1985; SMITH etal., 1986), baseado no mtodo de
Sanger (SANGER; COULSON, 1975).
Considerando essa transio, o sequenciamento de nova gerao
oferece nova perspectiva para genmica funcional. A rapidez e baixo
custo tornam o sequenciamento completo do transcriptoma melhor
que qualquer tcnica atual, que foram desenvolvidas justamente para
contornar a demora e alto custo necessrios para sequenciar um transcriptoma. Provavelmente, em pouco tempo, no haver mais interesse em se executar microarranjo ou SAGE para avaliar e comparar
a expresso gnica. O transcriptoma rene todos os transcritos, sejam
conhecidos ou no, codificadores ou no, mais abundantes ou no.
Seu dado quantitativo podendo ser utilizado para determinar nveis
de expresso gnica.
156
Protemica
A protemica pode ser definida como a varredura, em larga escala,
de protenas provenientes de uma clula, organismo ou fluido biolgico. O estudo de proteomas desafiador, uma vez que a expresso
gentica de uma clula muito dinmica e dependente do seu estdio de desenvolvimento, da presena de ativadores e inibidores e das
condies ambientais. Apesar disso, a protemica, por estudar os produtos finais do genoma, oferece as ferramentas mais adequadas para
a anlise e interpretao das funes gnicas.
Os dados gerados pela protemica, pela alta capacidade de resolver
diferenas mnimas entre protenas, incluem importantes descobertas relacionadas a vias de transduo de sinais, protenas reguladoras, modificaes pstraducionais, assim como condies fisiolgicas e patolgicas de clulas e organismos (WESTERMEIER; NAVEN,
2002). Do ponto de vista agronmico, a protemica de plantas cultivadas pode fornecer informaes como diferenas de expresso proteica entre cultivares com nveis variados de produo, de resistncia
a estresses biticos e abiticos, bem como no desenvolvimento de alimentos com altos valores nutritivos.
O estudo de um determinado proteoma tem aplicaes diretas na
descoberta de vias metablicas em todos os estdios do ciclo celular,
gerando uma massiva quantidade de conhecimento em biologia celular e bioqumica. Alm disso, permite a identificao de novas molculas bioativas em extratos naturais, levando ao desenvolvimento de
novos medicamentos e a caracterizao de marcadores biolgicos,
incluindo molculas endgenas e exgenas especficas a um estado
patolgico. Atualmente, as principais tcnicas utilizadas para anlise de proteomas so a eletroforese bidimensional, a cromatografia
lquida e a identificao por espectrometria de massa (MS, do ingls
mass spectrometry).
Eletroforese bidimensional
A eletroforese bidimensional (2DE, do ingls TwoDimensional
Electrophoresis) uma tcnica amplamente utilizada para a anlise
de misturas complexas de protenas extradas de clulas, tecidos ou
157
biotecnologia
outras amostras biolgicas. Esse mtodo permite separar protenas de

acordo com duas propriedades independentes, em duas etapas distintas (OFARRELL, 1975). Inicialmente, h separao de protenas de
acordo com seu ponto isoeltrico (pI), etapa conhecida como primeira
dimenso ou focalizao isoeltrica (IEF, do ingls isoelectric focusing); posteriormente, as protenas so separadas de acordo com suas
massas moleculares por eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sdio (SDSPAGE, do ingls Sodium Dodecyl
SulfatePolyacrylamide Gel Electrophoresis), etapa essa conhecida
como segunda dimenso (Figura 4). Dessa forma, pequenos pontos
ou spots aparecem no gel, cada um deles potencialmente correspondendo a uma nica forma de uma protena. Uma caracterstica marcante de 2DE a capacidade de separar de centenas a milhares de protenas em uma amostra, podendo gerar informaes como pI, massa
molecular aparente e a quantidade relativa de cada protena. Aps a
separao e gerao desses dados, os spots podem ser identificados
por diferentes tcnicas de espectrometria de massa.
Outras caractersticas inerentes tcnica de 2DE incluem a deteco de modificaes ps transcricionais e pstraducionais, que no
podem ser preditas a partir de sequncias genmicas.
158
Figura 4. Eletroforese bidimensional de protenas de razes de algodoeiro.

Horizontalmente as protenas foram separadas levando em conta a variao
de carga pI intrnseca de cada protena, o que depende da composio dos
aminocidos carregados positivamente ou negativamente. Verticalmente, as
protenas foram separadas por massa, caracterstica que considera todos os
aminocidos que constituem a protena.
Imagem: Dr. Thales Lima Rocha.
Preparao de amostras
O preparo de amostras para 2DE essencial para aumentar a resoluo e representatividade dos spots derivados de misturas complexas (ROCHA etal., 2005). Devido grande diversidade das protenas,
159
biotecnologia
a otimizao do preparo de amostras deve ser feita empiricamente.

Idealmente, o processo resultar em completa solubilizao, desagregao, desnaturao e reduo das protenas na amostra. Dilises,
precipitaes (usualmente utilizando cido tricloroactico TCA) e
(ou) tratamentos com nucleases podem ser utilizadas para aumentar
a qualidade dos gis bidimensionais, evitando a presena de cidos
graxos, sais, metablitos secundrios e cidos nucleicos como interferentes. Alguns cuidados especiais devem ser levados em considerao
quando amostras ricas em protenas hidrofbicas com baixa abundncia ou com valores extremos de pI e (ou) massa molecular so analisadas. Recentemente, mtodos alternativos foram desenvolvidos para
contornar essas limitaes, como adio de detergentes para solubilizar amostras muito hidrofbicas, mtodos de extrao diferencial de
protenas e faixas contendo pH extremos.
Focalizao isoeltrica
A focalizao isoeltrica (IEF, do ingls Isoelectric Focusing) um
mtodo eletrofortico que separa as protenas de acordo com seus
pontos isoeltricos. Na IEF, os gradientes so normalmente imobilizados em tiras contendo um intervalo especfico de pH (por exemplo,
pH 310, pH 47). As protenas so molculas anfotricas, podendo
ter carga positiva, negativa ou igual zero, dependendo do pH do
meio. A carga lquida de uma protena pode ser calculada pela soma
de todas as cargas positivas e negativas dos grupos laterais dos resduos de aminocidos e extremidades amino e carboxiterminais. O
ponto isoeltrico o pH especfico onde carga lquida da protena
zero. Protenas so carregadas positivamente em pH abaixo do seu
pI e negativamente carregadas em pH acima do pI.
A presena de um gradiente de pH essencial para a tcnica de IEF.
Em um gradiente de pH e sob influncia de um campo eltrico, as
protenas movemse para a posio onde sua carga ser igual zero.
Dessa forma, uma protena com carga positiva migrar na direo do
ctodo, tornandose progressivamente menos positiva ao moverse
pelo gradiente, at chegar ao seu prprio pI. Inversamente, uma protena com carga negativa migrar para o nodo, at atingir a carga zero.
Se uma protena difunde de seu pI, ela imediatamente adquire uma
160
carga, migrando novamente para a faixa de pH correspondente ao pI.

Esse o efeito focalizador da IEF, concentrando protenas em seus
respectivos pIs, permitindo separlas por diferenas de carga nfimas.
Para aplicar as amostras nessa primeira dimenso, recomendvel quantificar por mtodos como Bradford, Lowry ou BCA e verificar
integridade das molculas utilizando SDSPAGE. Adicionalmente,
o mtodo de colorao a ser utilizado deve levar em considerao a
complexidade (extratos proteicos ou protenas purificadas) e a quantidade da amostra.
Segunda dimenso (SDSPAGE )

Aps a IEF, as tiras so posicionadas sobre um gel de poliacrilamida
contendo o detergente SDS. Dessa forma, as protenas so separadas
de acordo com sua massa molecular. O gel, constitudo de polmeros
de acrilamida com Nmetilbisacrilamida, permite escolha da porosidade da malha. Assim, o poder de resoluo do SDSPAGE selecionado pela porcentagem de acrilamida contida no gel. De uma forma
geral, gis contendo uma determinada porcentagem contnua de acrilamida oferecem uma resoluo eficiente para protenas presentes em
uma faixa especfica de tamanho. Entretanto, quando um gradiente
de concentrao de acrilamida utilizado, o intervalo de separao
maior. A escolha de um ou outro mtodo est diretamente relacionada
ao tipo de amostra a ser analisada.
Mtodos de colorao de gis

Os mtodos mais comuns de colorao de gis so aqueles que utilizam Coomassie Brilliant Blue ou nitrato de prata, que diferem em
relao sensibilidade de deteco. Enquanto a colorao com nitrato
de prata oferece um poder de deteco cerca de 50 vezes maior que
Coomassie Brilliant Blue, essa tcnica laboriosa e de relativa baixa
reprodutibilidade. Entretanto, outras estratgias, como eletroforese
em gel diferencial (DIGE, do ingls Differencial Gel Electrophoresis),
empregam marcaes fluorescentes, podendose analisar mais de
uma amostra em um nico gel, comparandose diferenas de expresso gnica e abundncia relativa de protenas. Marcaes contendo
161
biotecnologia
radioatividade como 35P, 14C, 3H e 32P podem ser feitas in vivo e

possuem alta capacidade de deteco por autoradiografia.
Espectrometria de massa
A espectrometria de massa (MS, do ingls Mass Spectrometry)
uma ferramenta amplamente utilizada para identificao de protenas, podendo caracterizar ainda modificaes pstraducionais, assim
como interaes protenaprotena e formao de complexos.
As protenas a serem identificadas podem ser inicialmente separadas eletroforeticamente (protemica topdown) ou cromatograficamente (bottomup ou mudpit). Utilizandose hidrlise enzimtica dessas protenas, comumente utilizando tripsina, possvel identificlas
por um perfil de digesto ou impresso digital de peptdeos (PMF,
do ingls Peptide Mass Fingerprinting) utilizando MS ou sequenciamento de novo via tandem MS (MS/MS).
Para a gerao desses dados, dois tipos de ionizao so mais
comumente utilizados: aqueles do tipo MALDI (matrixassisted laser
desorption/ionization) e ionizao do tipo eletrospray (ESI). No primeiro caso, as amostras so cocristalizadas com molculas pequenas
de cidos orgnicos em placas metlicas, seguindose dessoro e
ionizao por pulsos intensos e curtos de uma fonte de laser. Na ESI,
peptdeos em soluo acdica so dispersos por um spray e a soluo
em gotculas evapora, deixando os peptdeos ionizados.
Os analisadores de massa mais empregados em estudos protemicos so os baseados em tempo de voo (TOF, do ingls time of flight),
quadrupolo, ion trap (IT) e Fourier transform ion cyclotron (FTIC),
apresentando interfaces ou com MALDI ou com ESI. Cada um desses analisadores possui caractersticas especficas, podendo ser utilizados dois ou mais analisadores de massa em um mesmo aparelho,
possibilitando separar ons de acordo com sua razo massa/carga.
Finalmente, um detector utilizado para registrar o nmero de ons
que emergem de um analisador.
Os dados gerados por espectrometria so confrontados com bancos de dados computacionais, como NCBI e SwissProt, que contm
milhares de sequncias peptdicas e nucleotdicas, que podem ser
convertidas em sequncias de aminocidos.
162
Metabolmica
Metabolmica a cincia que estuda o metaboloma, definido como
o conjunto total de metablitos de um indivduo em condies especficas. Essas molculas podem atuar como precursores de importantes rotas metablicas, bem como substratos, inibidores ou ativadores
alostricos de diferentes enzimas. De uma forma geral, os metablitos so divididos em duas classes: primrios e secundrios, cuja composio varia enormemente conforme as condies genticas, fisiolgicas e ambientais.
Os metablitos primrios so encontrados dissolvidos no citosol de
qualquer clula, estando envolvidos nas principais rotas metablicas.
Entre esses, esto os aminocidos, nucleotdeos, lipdeos, carboidratos
e seus derivados fosforilados, alm de um grande nmero de cidos
mono, di e tricarboxlicos. So molculas altamente polares ou carregadas eletricamente, solveis em gua e presentes nas clulas em
pequenas concentraes (entre milimolar e micromolar).
Existe outro grupo de pequenas biomolculas que, ao contrrio dos
metablitos primrios, so especficas de certos tipos de clulas ou
organismos. Essas molculas so comumente chamadas de metablitos secundrios (DIXON, 2001). Os principais grupos de metablitos secundrios so os alcaloides, terpenos, taninos, flavonoides e
glicosdeos (HALL, 2006). Os alcaloides so bases nitrogenadas com
grande variao na estrutura molecular. Possuem sabor amargo e pH
alcalino quando em soluo. Nas plantas, tm funo de regulao do
crescimento e de proteo. Os terpenos so molculas de estrutura
cclica, tambm conhecidos como leos essenciais. Eles so volteis
e por isso so responsveis pelos odores dos vegetais.
Quanto ao nmero de tomos de carbono, podem ser classificados
como mono, sesqui, di e triterpenos. Nas plantas, possuem funes
como estimular polinizao por insetos, proteo contra patgenos
etc. Os taninos so compostos fenlicos (poli fenis) de estrutura varivel. Apresentam atividade adstringente, ou seja, precipitam protenas. Nos vegetais, tm funo de proteo. Os flavonoides so heterosdeos contendo uma poro acar (diferente da glicose) ligada a
uma poro noglicdica (aglicnio), que, neste caso, um pigmento.
Esses compostos possuem cores de acordo com o tipo de pigmento
163
biotecnologia
presente na molcula; como exemplo, as flavonas so amarelas e os

flavonoides antocinicos so azuis. Nas plantas atuam na colorao
dos rgos vegetais e na diferenciao celular. Por fim, os glicosdeos
so compostos que contm um acar ligado a um aglicnio, sendo
esse a poro ativa da molcula. Possuem gosto amargo e so classificados de acordo com o tipo de aglicnio. Por exemplo, em glicosdeos
alcolicos o aglicnio um lcool; os glicosdeos cianognicos liberam cido ciandrico quando hidrolisados; glicosdeos esterides possuem um esteride como aglicnio; glicosdeos antraquinnicos possuem antraquinona como aglicnio etc. Nos vegetais, a funo varia
de acordo com a poro noglicdica (MARASCHIN; VERPOORTE,
1999; ZHANG etal., 2003).
Metaboloma, metabolmica, metabolic profiling e

engenharia de metabolismo
A metabolmica, em virtude do seu objetivo de estudar a composio metablica, no utiliza parmetros, mas sim os determina. Aps
serem determinados, o metabolic profiling os utiliza (ROBERTSON,
2005; WECKWERTH; MORGENTHAL, 2005). A linha que divide
essas duas plataformas geralmente muito tnue. Tcnicas como a
Ressonncia Magntica Nuclear de biofluidos ou a Espectrometria de
Massa de biofluidos so utilizadas para os dois propsitos. No entanto,
o que se sabe acerca do biofluido e o conhecimento prvio de parmetros a serem analisados que vai definir se a anlise se enquadra na
metabolmica ou no metabolic profiling.
Aps a descoberta dos metablitos de uma amostra qualquer e
a identificao de algum composto de interesse (farmacutico, por
exemplo), possvel iniciar os estudos de engenharia de metabolismo
(Figura 5). Tais estudos primam por identificar os genes e as rotas
metablicas desses compostos, visando aumentar ou diminuir a sua
produo. Alm disso, a engenharia de metabolismo pode ser aplicada
na modificao gentica de outro organismo, para que este possa produzir o metablito em questo (AHARONI etal., 2005).
164
Escolha do organismo
Fracionamento
5
3
2
Preparo da
amostra
Converso de
Prfracionamento
6
Anlise estatstica
Identificao dos genes e rotas metablicas envolvidos

na produo de metablitos especficos
Figura 5. Esquema bsico de anlise metablica de plantas.

Fonte: adaptado de Fukusaki e Kobayashi (2005).
Muitas amostras, antes de serem analisadas, necessitam de um

prfracionamento, que tem por finalidade agrupar os compostos de acordo com suas caractersticas moleculares utilizando diferentes solventes (WANT etal., 2006). O ponto mais crtico desse
prfracionamento a escolha do solvente usado para a separao
(FUKUSAKI; KOBAYASHI, 2005). Devese prestar muita ateno
nas possveis interferncias que esse solvente pode causar nos equipamentos de anlise, assim como nas possveis reaes indesejadas
que podem ocorrer entre o solvente e a amostra, produzindo novos
compostos (ROBERTSON etal., 2000; BECKWITHHALL etal., 2002;
ROBERTSON, 2005; WANT etal., 2006).
Embora qualquer ferramenta que permita mensurar os metablitos possa ser usada na metabolmica, a Espectrometria de Massa
(MS) acoplada a Cromatografia lquida, Cromatografia Gasosa ou
Eletroforese Capilar, juntamente com a Ressonncia Magntica
Nuclear (RMN), so as mais utilizadas (NICHOLSON etal., 1999;
165
biotecnologia
FIEHN, 2002; REO, 2002; LINDON etal., 2003, 2004; NICHOLSON;

WILSON, 2003; WECKWERTH, 2003; BINO etal., 2004; FERNIE
etal., 2004; GOODACRE etal., 2004; ROBERTSON, 2005;
WECKWERTH; MORGENTHAL, 2005). A MS muito mais sensvel do que a RMN, muito embora isso nem sempre represente uma
vantagem. Essa maior sensibilidade implica em uma menor reprodutibilidade da anlise no mesmo equipamento ou em equipamentos
equivalentes (FUKUSAKI; KOBAYASHI, 2005; ROCHFORT, 2005;
WECKWERTH; MORGENTHAL, 2005; WILSON etal., 2005). Uma
variao da RMN, conhecida como Magic Angle Spinning (MAS),
permite a anlise direta de tecidos, no necessitando das etapas de
extrao e prfracionamento. Entretanto essa tcnica necessita de
equipamentos especiais e recursos humanos altamente qualificados,
acabando por limitar seu uso (STRAUS, 2004). Devido a essas peculiaridades, a maioria dos grupos de pesquisa voltados aos estudos de
metabolmica est usando tanto os equipamentos associados a MS
quanto os associados a RMN (ROBERTSON, 2005).
Aps todos os passos de fracionamento, fazse necessria a converso dos valores obtidos por diferentes equipamentos para uma
unidade padro. Contudo, isso nem sempre fcil, ainda mais se
forem utilizados muitos passos para o fracionamento (FUKUSAKI;
KOBAYASHI, 2005; ROBERTSON, 2005; ROCHFORT, 2005). Dados
obtidos por cromatografias, eletroforeses ou mesmo RMN necessitam ser convertidos em uma linguagem digital que possa ser utilizada em anlises multivariadas utilizando ferramentas estatsticas
(FIEHN, 2002; DURAN etal., 2003; STEUER etal., 2003; FUKUSAKI;
KOBAYASHI, 2005; MUNGUR etal., 2005; ROBERTSON, 2005;
ROCHFORT, 2005; WECKWERTH; MORGENTHAL, 2005).
A escolha do tipo de anlise estatstica a ser utilizada nos dados obtidos pelas tcnicas de fracionamento varia de acordo com a estrutura dos
dados e da inteno da anlise. Entretanto, a Anlise de Componente
Principal (ACP) a mais utilizada na metabolmica (NICHOLLS etal.,
2001; NICHOLSON etal., 2002). Essa anlise til para se reduzir grupos de dados muito grandes e identificar sinais importantes nesses
grupos, sobretudo se o fracionamento no foi bem sucedido. A partir
de uma srie de clculos conhecidos por anlise dos vetores de Eigen,
166
a ACP permite identificar os compostos mais abundantes e, a partir

disso, visualizar as diferenas dentro da amostra e agrupar os compostos hierarquicamente (FUKUSAKI; KOBAYASHI, 2005).
Associandose todo esse conhecimento gerado pela metabolmica
queles obtidos pelas outras micas, possvel determinar quais so
as rotas metablicas e os genes que possivelmente estejam envolvidos na produo dos compostos de maior destaque. Essa integrao
entre as diferentes plataformas tecnolgicas chamada de Biologia
de Sistemas.
Aplicabilidade da metabolmica
As informaes obtidas pela metabolmica, assim como aquelas
obtidas pelo metabolic profiling, tm sido frequentemente usadas
em pesquisas de diversas reas. Exemplos especficos para indicar o
alcance dessa tecnologia incluem a correlao entre perfis metablicos dos biofluidos e doenas em animais, na influncia da dieta no
padro metablico do indivduo, na investigao dos efeitos causados
pela insero de um gene em um organismo transgnico, entre outras
(BRINDLE etal., 2003; FUKUSAKI; KOBAYASHI, 2005; GIBNEY
etal., 2005; ROBERTSON, 2005; ROCHFORT, 2005; WECKWERTH;
MORGENTHAL, 2005).
Farmacologia
A metabolmica tem uma gama de aplicaes na rea farmacutica, tendo grande destaque as pesquisas para seleo de frmacos
efetivos e seguros, a identificao de marcadores biolgicos de toxicidade e doenas e o entendimento dos mecanismos de toxicidade
(ROBERTSON, 2005).
Certamente, a maior parte do esforo em prol da utilizao da metabolmica para esse fim realizada pelo Consrcio de Metabolmica
aplicada a Toxicologia (Comet). Esse consrcio visa montar um banco
de dados com milhares de espectros de RMN utilizando biofluidos
de animais tratados com toxinas modelo. Esse grupo formado pela
Imperial College de Londres e mais seis companhias farmacuticas
que investem milhes de dlares na seleo e produo de frmacos.
167
biotecnologia
Nutrio
Assim como na farmcia, a metabolmica tem varias aplicaes na
rea nutricional. Como a dieta influencia diretamente no desenvolvimento do indivduo, a metabolmica possibilita conhecer os arranjos e desarranjos metablicos causados pela alimentao (GERMAN
etal., 2005). Dessa forma, o papel que os componentes alimentares
desempenham na sade e na doena, assim como os efeitos causados
pela falta ou excesso de determinados nutrientes podem muito bem
ser conhecidos pela metabolmica (WATKINS etal., 2001; GERMAN
etal., 2003).
Ecologia e evoluo
Outro campo de notria aplicabilidade da metabolmica a ecologia (ROBERTSON, 2005; ROCHFORT 2005). A utilizao dessa plataforma nos estudos com vegetais tem sido constante nos ltimos
anos. A realizao desses estudos visa entender, sobretudo, o mecanismo de ao de compostos bioativos e a diferenciao de variedades selvagens daquelas modificadas geneticamente (OTT etal., 2003;
FUKUSAKI; KOBAYASHI, 2005; MUNGUR etal., 2005; RISCHER,
H.; OKSMANCALDENTEY, 2006).
Outra aplicao da metabolmica na botnica reside no entendimento da relao plantapatgeno. Ao serem parasitadas por insetos ou nematoides, por exemplo, as plantas produzem e liberam
uma srie de compostos como fenis, terpenos ou alcaloides. Esse
aumento de produo induzido pelo contato com sinalizadores qumicos oriundos dos patgenos. Contudo, apesar de todas as plantas
reagirem ao parasitismo, nem todas produzem os metablitos necessrios para o controle do patgeno. Dessa forma, a metabolmica pode
ser aplicada na identificao dos metablitos diferenciais entre variedades resistentes e susceptveis a uma determinada praga. Esse tipo
de trabalho j largamente efetuado a nvel transcriptmico e protemico. Entretanto, em se tratando de metabolmica, isso j bem
mais incomum (FORST, 2006).
168
Consideraes finais
Devido ao grande avano das modernas tecnologias de deteco, isolamento e quantificao em larga escala de genes, transcritos, protenas e metablitos, cujos estudos so organizados em micas (genmica, transcriptmica, protemica e metabolmica) e da capacidade
de armazenamento e anlise de dados pela bioinformtica (BINNECK,
2004), j possvel formar uma viso ampla de toda malha bioqumica
de interao, sinalizao, regulao e converso metablica, que permeia os mecanismos moleculares, processos bioqumicos e fisiologia
celular, considerando cada mica.
Mais recentemente, surgiu um novo conceito cientfico cunhado
como Biologia Sistmica ou Biologia de Sistemas (do ingls Systems
Biology), que objetiva compreenso funcional abrangente devido
integrao das cincias micas. Idealizada como a sobreposio de
dados de transcriptmica, protemica, metabolmica, glicmica
(todos carboidratos de uma clula) e lipidmica (conjunto completo
de lipdeos), a Biologia Sistmica opera numa viso holstica sobre
os fenmenos biolgicos. Dessa forma, esperase que os complexos
fenmenos biolgicos sejam desvendados profundamente, gerando
novas aplicaes biotecnolgicas em prol da sade humana, maior
qualidade de vida e uso sustentvel dos recursos naturais.
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173
Captulo 6
Metagenmica: princpios
e aplicaes
Marco Aurlio Caldas de Pinho Pessoa Filho
Introduo
O primeiro genoma microbiano sequenciado por completo foi
o do patgeno Haemophilus influenzae (FLEISCHMANN etal.,
1995). Nesse mesmo ano, o genoma de outro patgeno humano
Mycoplasma genitalium tambm foi publicado (FRASER etal., 1995).
Desde ento, dados genmicos tm sido gerados de forma exponencial para centenas de microrganismos. O sucesso na realizao de projetos genoma dos mais diversos organismos de interesse biotecnolgico evidenciado pela elevada quantidade de informaes presentes
em bancos de dados genmicos pblicos, disponveis online. Uma
consulta ao banco Entrez Genome, pertencente ao National Center for
Biotechnolgy Information (NCBI), demonstra que existem informaes armazenadas sejam elas sobre genomas, cromossomos completos, mapas de sequncia com contigs, ou mapas genticos e fsicos
integrados sobre 6.527 espcies. Considerandose somente genomas microbianos, uma busca no banco Entrez Genome Project lista
mais de 1.000 projetos j completos, de organismos pertencentes aos
mais variados grupos microbianos.
Para aqueles organismos cujo genoma completo j foi obtido, uma
srie de produtos e ferramentas resultantes do esforo de sequenciamento de DNA pode ser desenvolvida com maior rapidez. A posterior montagem genmica e anotao gnica e a integrao entre mapa
fsico e mapas genticos, permitem a elaborao e o teste de hipteses visando comparao entre dados genotpicos e fenotpicos.
Estratgias como a genmica comparativa e estudos de sintenia permitem que conhecimento baseado em experimentos prvios possa ser
transferido para novos genomas, e que ferramentas criadas como
o desenvolvimento de marcadores moleculares possam ser aplicadas em organismos evolutivamente prximos, para os quais pouco
175
biotecnologia
conhecimento acerca de genmica tenha sido gerado. Dessa forma,

nos casos em que as bases sobre a compreenso do genoma j esto
em fase avanada, possvel mudar o foco das iniciativas de estudo:
esforos em sequenciamento e (ou) genotipagem teriam como objetivo a predio de caractersticas de interesse, a fim de se compreender a sua base gentica (TRINGE; RUBIN, 2005). A quantidade de
informao armazenada e disponvel para consulta em bancos de
dados significativa.
Historicamente, os projetos genoma focaram em organismos possuidores de uma caracterstica distinta, que vai alm do prprio interesse cientfico ou econmico na espcie: a facilidade em se obter
amostras biolgicas como o caso de animais e plantas e, no caso
de microrganismos, daqueles que poderiam ser facilmente cultivados em laboratrio (TRINGE; RUBIN, 2005). Isso fica claro a partir
da constatao de que a maioria dos genomas microbianos j publicados pertence a espcies patognicas (BINNEWIES etal., 2006). Essa
tendncia reflete a prpria histria da pesquisa em microbiologia e
diversidade microbiana, brevemente apresentada a seguir.
Mudanas de paradigma em diversidade microbiana

Por muitos anos, o foco de pesquisa em microbiologia estava localizado na rica fonte de descobertas existentes nos microrganismos cultivveis, j estabelecidos como modelo biolgico. As razes da microbiologia esto associadas ao advento da microscopia, com o primeiro
relato da visualizao de uma clula bacteriana datando de 1663, por
Antonie van Leeuwenhoek. Por 200 anos, o microscpio permitiu a
visualizao de bactrias heterotrficas, autotrficas, ou de parasitas
obrigatrios (HANDELSMAN, 2004).
A primeira mudana de paradigma em microbiologia surgiu com
os trabalhos de Robert Koch. A partir dos anos 1880, seus postulados e
sua inovao no desenvolvimento de meios de cultura levaram diviso do mundo microbiolgico em cultivvel e no cultivvel. O interesse de pesquisadores foi dedicado ao estudo de bactrias mantidas
em cultura pura, gerando a considervel quantidade de informaes
contidas em livrostexto de microbiologia. Por muito tempo, microbiologistas ignoraram o desafio de identificar e caracterizar organis176
Captulo 6 Metagenmica: princpios e aplicaes
mos no cultivveis. Entre os anos 1960 e 1970, tal trabalho foi deixado
nas mos de cientistas que persistiam em acumular informaes que
sugeriam que meios de cultura no capturavam o espectro completo
da diversidade microbiana (HANDELSMAN, 2004).
De fato, trabalhos de levantamento da atividade de microrganismos aquticos no fotossintticos evidenciaram que grande parte do
mundo microbiano no era representada pelos organismos cultivveis
(STALEY; KONOPKA, 1985). Havia uma grande discrepncia entre os
tamanhos populacionais estimados por diferentes mtodos de quantificao. Esse fenmeno ficou conhecido como a grande anomalia em
contagem em placas. Era comum o relato de valores muito maiores
de clulas bacterianas por contagem microscpica direta do que por
contagem em placa de cultivo. Especulavase que as bactrias que no
cresciam em meio de cultura no eram viveis, ou como alternativa,
que elas poderiam ser consideradas vivas, mas incapazes de crescer
sob as condies fornecidas pelo procedimento de cultivo (STALEY;
KONOPKA, 1985). Em ambientes como o solo, os valores chegavam
a 0,1 % a 1 % de bactrias presentes no ambiente que poderiam ser
cultivadas em meios de uso padro (TORSVIK etal., 1990).
Uma nova mudana de paradigma aconteceu em 1985, com um
grande avano experimental embasado no trabalho pioneiro de Carl
Woese, que demonstrou que genes do RNA ribossomal (rRNA) poderiam ser utilizados como ferramentas de medida de divergncia evolutiva (WOESE, 1987). A anlise direta das sequncias dos genes rRNA
5S e 16S foi utilizada para a descrio da diversidade de microrganismos em uma amostra ambiental, sem isolamento ou cultivo (LANE
etal., 1985). Essa metodologia ficou conhecida como filotipagem. Na
poca, essa abordagem apresentava o grande desafio tcnico de se
trabalhar com sequenciamento direto de RNA ou de cpias de DNA
geradas por transcriptase reversa. O desenvolvimento da tecnologia
da reao em cadeia da polimerase (PCR) e o desenho de iniciadores
que poderiam ser utilizados na amplificao do gene ribossomal aceleraram a descoberta de novos txons nos mais diversos ambientes
terrestres (HANDELSMAN, 2004).
A partir da, diferentes tcnicas moleculares foram implementadas para a utilizao do gene ribossomal bacteriano como medida de
177
biotecnologia
diversidade filogentica. A amplificao da regio 16S a partir de uma

amostra ambiental, com iniciadores conservados, foi seguida da utilizao de tcnicas como eletroforese em agarose ou poliacrilamida,
eletroforese em gel com gradiente desnaturante (DGGE) (MUYZER
etal., 1993), ou eletroforese capilar. A amplificao da regio espaadora entre as unidades 16S e 23S (a regio ITS) tambm foi utilizada
como medida de diversidade entre txons mais prximos, em razo
da sua maior taxa de mutao e maiores nveis de diversidade de sequncia. Essa tecnologia ficou conhecida como RISA (do ingls rRNA
internal spacer analysis) (BORNEMAN; TRIPLETT, 1997). A posterior fragmentao do amplicon por enzimas de restrio (ARDRA)
tambm foi implementada como ferramenta molecular de anlise
de diversidade bacteriana. A tcnica , na verdade, um tipo de RFLP,
e envolve a fragmentao por uma ou vrias enzimas de restrio
do fragmento ribossomal amplificado, seja ele 16S, 23S, ou espaador,
dependendo do tipo de aplicao desejado (REIS JUNIOR etal., 2002).
A incluso de um passo de clonagem de fragmentos de DNA
ambiental em um hospedeiro cultivvel levou ao surgimento de
uma nova linha de pesquisa em diversidade microbiana e na biotecnologia de microrganismos. A anlise genmica de uma populao de microrganismos surgiu como pea chave de um novo avano
na pesquisa em microbiologia. Assim, capturado para estudo e preservao, DNA microbiano poderia ser utilizado na busca de informaes sobre a fisiologia e a gentica de organismos no cultivveis
(HANDELSMAN, 2004). A esse novo insight no mundo das bactrias
no cultivveis foi dado o nome de metagenmica.
Metagenmica anlise genmica

de populaes microbianas
O primeiro relato de clonagem de DNA diretamente extrado e purificado de amostras ambientais foi feito em uma anlise de comunidades microbianas marinhas (SCHMIDTetal., 1991). Esse trabalho
tratava da amplificao e clonagem do gene 16S, e posterior sequenciamento de clones dessa biblioteca, permitindo um levantamento
da diversidade filogentica das populaes de picoplncton marinho.
178
Posteriormente, a construo de uma biblioteca metagenmica a partir de uma mistura de organismos enriquecidos em gramneas ressecadas em laboratrio permitiu a deteco de clones que expressavam atividade celuloltica (HEALY etal., 1995). A partir da, estavam
embasados dois dos componentes principais da pesquisa em metagenmica: a anlise de diversidade microbiana da frao no cultivvel de organismos e a anlise funcional de genes de organismos presentes em um ambiente de interesse, independente do cultivo desses.
O termo metagenmica foi descrito pela primeira vez por Jo
Handelsman, da Universidade de Wisconsin (EUA), a partir da sugesto de uma srie de procedimentos para acessar o metabolismo de
microrganismos desconhecidos no solo. Seu propsito era avanar
a pesquisa em produtos naturais. Partindo do pressuposto de que a
grande maioria dos microrganismos de solo nunca foi isolada nem
cultivada em laboratrio, foi sugerido que esse ambiente poderia constituir a maior fonte de recursos intocados para a qumica de produtos naturais (HANDELSMAN etal., 1998). A maneira sugerida seria
a clonagem de metagenomas a fim de se acessar os genomas coletivos e o maquinrio biossinttico da microbiota de solos.
Dessa forma, assim como a genmica, a metagenmica consiste
tanto de um conjunto de tcnicas de pesquisa, contendo diferentes abordagens e metodologias, bem como de uma rea de pesquisa
propriamente dita. O significado do prefixo meta (alm, transcendente, em grego) inclui o ideal de se superar a impossibilidade de
se isolar e avaliar a diversidade genmica da grande maioria dos
microrganismos. Por um lado, a metagenmica busca a compreenso da biologia em um nvel de comunidades, transcendendo
o organismo individual e focando em genes e seus efeitos na prpria comunidade. Por outro, expressa a necessidade do desenvolvimento de mtodos computacionais que maximizem o entendimento
da composio gentica e das atividades de comunidades por vezes
to complexas que s podem ser avaliadas por amostragem, e nunca
completamente caracterizadas (RESEARCH COUNCIL (U.S.), 2007).
Em termos prticos, as diversas abordagens que compem o que
se chama hoje de metagenmica incluem a caracterizao de comunidades microbianas ou seus membros por mtodos que no depen-
179
biotecnologia
dem de cultivo, aplicando tcnicas de anlise em alta escala (ferramentas da genmica, protemica, transcriptmica, etc.)(RESEARCH
COUNCIL (U.S.), 2007).
A metagenmica difere da genmica na medida em que independe
do isolamento de um organismo em particular para posterior anlise de seu genoma individual. A princpio, a metagenmica poderia
acessar 100 % dos recursos genticos presentes em um ambiente,
enquanto mtodos tradicionais de cultivo e da genmica acessariam
1 % dessa diversidade. Os primeiros estudos de filotipagem respondiam com confiana perguntas sobre quem estava presente no
ambiente amostrado, sem grandes possibilidades de responder o
que esses organismos estavam fazendo, ou seja, que funes eles
potencialmente exerciam nesses ambientes. As tcnicas aplicadas atualmente em metagenmica aprofundam a capacidade de avaliar ecossistemas como unidades biolgicas, possuidoras dos seus prprios
mecanismos genticos, indo alm da considerao de espcies individuais. Sugerese que a pergunta principal em projetos em metagenmica seja O que est sendo feito pela comunidade microbiana?
(RESEARCH COUNCIL (U.S.), 2007)..
Principais abordagens em projetos

de metagenmica
Em linhas gerais, anlises metagenmicas consistem no isolamento de DNA proveniente de uma amostra ambiental, fragmentao e clonagem do DNA em um vetor adequado, insero dos clones
em um hospedeiro bacteriano, e screening das clulas transformadas.
Os clones podem ser avaliados quanto presena de marcadores filogenticos (conhecidos como ncoras), tais como o prprio gene rRNA
16S ou o gene recA, ou de outros genes conservados. Tambm podem
ser testados quanto expresso de fentipos ou caractersticas especficas, tais como atividades enzimticas ou a produo de antibiticos. Por fim, outra possibilidade o sequenciamento aleatrio de clones da biblioteca (HANDELSMAN, 2004). Na Figura 1, mostrase um
organograma clssico em projetos de metagennmica.
180
Escolha de um metagenoma
Projetos Genoma
Tradicionais
Projetos em
Metagenmica
Descrever ambiente
(coleta de metadados)
Amostra
Extrao
DNA/RNA
Baseados em sequncia
Baseados em funo
Novas tecnologias permitem

o sequenciamento sem
a construo de bibliotecas
Anotao
Gerao
de genomas
completos
Comparar
com outras
comunidades
Anlises de rRNA 16S

Fingerprinting com T-RFLP
Anlises baseadas em hibridizao
Criar biblioteca
Sequenciamento
Montagem
Avaliar diversidade
:
Avaliar funo
Identificar
genes
Identificar
vias
metablicas
Diagrama completo de um organismo
Depsito e
curadoria de
banco de
dados
Bioinformtica
e Anlise
QUAIS ORGANISMOS?
Expresso de genes
em sistemas heterlogos
Deteco de clones positivos
para a funo de interesse
Sequenciamento de clones
O QUE ELES
ESTO FAZENDO?
Traduzido e adaptado de: RESEARCH COUNCIL (U.S.). COMMITTEE ON METAGENOMICS: CHALLENGES AND FUNCTIONAL APPLICATIONS, 2007
Figura 1. Organograma das diferentes etapas de um projeto em metagenmica .

Fonte: Traduzido e adaptado de Research Council (US). Committee on Metagenomics:
Challenges and Functional Application, 2007.
Dessa forma, duas estratgias so mais frequentemente utilizadas

na busca de alvos funcionais presentes em bibliotecas metagenmicas, sendo possvel dividir os estudos nos seguintes tipos de abordagens: screenings baseados em anlise funcional e screenings baseados
em sequenciamento.
Uma abordagem baseada em funo gnica busca por clones que
expressam a caracterstica de interesse nas bibliotecas construdas. A
partir da seleo de clones positivos, possvel a obteno de informaes acerca do controle gentico da caracterstica em estudo. Isso pode
ser realizado por subclonagem e sequenciamento do fragmento metagenmico inserido no vetor de expresso, e posterior anotao gnica
para definio das ORFs presentes no fragmento clonado (MIRETE
etal., 2007). Uma das vantagens desse tipo de estratgia est na possibilidade de se capturar clones com potencial aplicao direta por
181
biotecnologia
exemplo, na descoberta de enzimas de interesse biotecnolgico para

a indstria. Outra vantagem a chance de descoberta de sequncias
funcionais no descritas em estudos anteriores, com papis distintos
de biocatalisadores j conhecidos (YUN; RYU, 2005).
Por outro lado, para que os fragmentos metagenmicos inseridos
nos hospedeiros de expresso (por exemplo, E. coli) possibilitem a
deteco de clones positivos para a caracterstica de interesse na biblioteca, preciso que os genes contidos nos fragmentos sejam corretamente transcritos, traduzidos e que as enzimas sintetizadas sejam
biologicamente funcionais. Alm disso, caso a funo biolgica exija
a expresso de mltiplos genes, necessria a presena de todos os
genes da via em questo, para que esta seja identificada. Em uma situao em que centenas ou milhares de clones precisam ser avaliados,
essa estratgia exige o estabelecimento de mtodos eficientes e econmicos para que a avaliao seja feita em alta escala (YUN; RYU, 2005).
Os primeiros estudos que utilizaram um screening baseado em
sequncia fizeram uso de hibridizao ou PCR para a deteco de
genes de interesse, tendo como referncia sequncias de DNA conservadas. Assim, essa estratgia no poderia ser aplicada para um
nmero grande de alvos, e tambm no garantiria a obteno de genes
completos, ou grupos gnicos necessrios para a sntese de um produto desejado. Apesar de j ter sido utilizada na descoberta de vrias
enzimas de importncia industrial, a aplicao tpica para esse tipo
de abordagem acabou sendo a amplificao de genes ribossomais em
estudos de diversidade filogentica (YUN; RYU, 2005).
Estudos de sequenciamento de bibliotecas metagenmicas tm
feito uso de sequenciamento shotgun, e mais recentemente, sequenciamento de nova gerao (como, por exemplo, pirosequenciamento).
Essas metodologias fornecem uma grande quantidade de informao,
desde relaes filogenticas, descoberta de novos genes e deduo de
vias metablicas em bactrias no cultivveis. A quantidade de dados
leva a anlises laboriosas para as quais novos paradigmas de estudo
em bioinformtica ainda esto sendo estabelecidos.
Tanto os estudos baseados em prospeco de funo, quanto os
estudos que fazem uso de sequenciamento de DNA apresentam uma
baixa frequncia de deteco de clones positivos (to baixas quanto
182
quatro clones positivos em 930.000 clones avaliados) (HENNE etal.,

2000). Vrias estratgias foram implementadas para aumentar a eficincia no screening. Entre elas, o uso de organismos hospedeiros como
Streptomyces lividnas ou Pseudomonas putida e E. coli a fim de se superar as limitaes e dificuldades da expresso heterloga de metablitos secundrios (KOMATSU etal., 2010). Etapas de enriquecimento
de microrganismos no cultivveis que contm as caractersticas de
interesse tambm tm sido empregadas antes da construo de bibliotecas metagenmicas (ENTCHEVA etal., 2001).
Outra abordagem de screening (Screening de Expresso Gnica
Induzida por Substrato SIGEX, em sua sigla em ingls) foi proposta como alternativa para o aumento na frequncia de deteco de
clones positivos (UCHIYAMA etal., 2005), tendo sido testada inicialmente na busca por genes induzidos por hidrocarbonetos aromticos
em uma biblioteca metagenmica de guas subterrneas.
Sua lgica se baseia no fato de a expresso de genes catablicos ser,
em geral, induzida por substratos ou metablitos de enzimas catablicas. Alm disso, a expresso de genes catablicos controlada por elementos regulatrios em grande parte localizados em regies prximas
aos genes. Dessa forma, a tcnica detecta clones que hospedam genes
catablicos expressos na presena de substratos, e no expressos na
ausncia destes. A estratgia faz uso de um vetor (p18GFP) no qual o
stio de clonagem divide o promotor lac e o gene gfp. Aps a construo
da biblioteca metagenmica utilizando esse vetor, clones sem inserto
e clones expressando GFP constitutivamente na ausncia de substrato
so removidos por induo por IPTG. A expresso de genes catablicos na biblioteca determinada pela expresso de GFP na presena
do substrato. Dessa forma, clones positivos so separados em placas
contendo gar e posteriormente caracterizados (YUN; RYU, 2005).
Evidentemente, um dos primeiros e mais importantes passos
em qualquer projeto em metagenmica o isolamento de DNA do
ambiente em estudo. No existe um nico protocolo adequado para
a extrao de DNA de todos os ambientes imaginveis. Quantidade,
pureza, integridade e representatividade do DNA aps o isolamento
so elementoschave passveis de considerao. A extrao pode ser
realizada por lise direta ou indireta, ou seja, diretamente da amostra
183
biotecnologia
ambiental ou aps a separao e concentrao das clulas microbianas presentes na matriz ambiental (LEVEAU, 2007). O tipo de protocolo escolhido altamente dependente do ambiente em estudo, dada a
diferena gritante entre fatores como densidade microbiana, presena
de contaminantes ou inibidores de amplificao por PCR, por exemplo. Em alguns casos, um passo de purificao includo no protocolo
aps a extrao, a fim de se minimizar a contaminao com substncias indesejveis. Vrios kits comerciais tambm esto disponveis no
mercado, otimizados para tipos especficos de amostra.
Outros fatores que tambm devem ser levados em considerao
envolvem a representatividade microbiana na amostra de DNA extrado. Em alguns casos, o mtodo de extrao necessrio na obteno
de DNA de um organismo pode degradar o DNA de outro. Dessa
forma, possvel que, em algumas situaes, mais de um mtodo de
extrao deva ser utilizado na construo de uma biblioteca metagenmica. Alm disso, a integridade do DNA isolado vai refletir no tipo
de uso posterior desse material no fluxo do projeto: procedimentos
que envolvem lise por triturao com beads tendem a fragmentar o
DNA e so mais adequados construo de bibliotecas de pequenos
insertos, como, por exemplo, para sequenciamento shotgun. Por outro
lado, protocolos de lise qumica de clulas recuperadas de plugues de
gar podem produzir fragmentos clonveis de tamanho superior a 1
milho de pares de base, adequados ao screening de ncoras filogenticas ou de fentipos de interesse (LEVEAU, 2007).
Projetos pioneiros
Projeto Efluente cido de Minerao
A produo de cidos a partir da oxidao de minerais sulfdicos
expostos ao ar consequncia de atividade mineradora em vrias partes do mundo. As solues cidas que se formam nesses casos so
denominadas efluentes cidos de minerao (EAM). Comunidades
microbianas conduzem essa acidificao, e elas foram foco de uma
importante anlise em metagenmica, com o objetivo de explorar
a distribuio e a diversidade de vias metablicas envolvidas com o
184
EAM. Exemplos dessas vias so a fixao de nitrognio e a oxidao de enxofre e ferro. Esse estudo permitiria compreender como
microrganismos toleram ambientes altamente cidos, avaliando como
estes mecanismos de tolerncia afetam a geoqumica do ambiente
(RESEARCH COUNCIL (U.S.), 2007; TYSON etal., 2004).
A comunidade avaliada nesse tipo de ambiente estabeleceu um
paradigma de anlise em metagenmica em virtude de seu nvel de
complexidade relativamente simples: havia somente cinco principais
organismos (trs espcies bacterianas e duas espcies de Archaea) formando um denso biofilme no local de coleta. Isso tambm permitiu
que o ambiente fosse estudado em grande profundidade. Por causa
da baixa complexidade da comunidade microbiana, um processo de
sequenciamento shotgun do DNA do ambiente permitiu a montagem quase completa de dois genomas (dos cinco presentes) e a recuperao parcial dos outros trs. O desafio na montagem simultnea
de mltiplos genomas foi atingido por procedimentos de direcionamento de contigs genmicos a cada genoma especfico, tendo como
base a composio de bases da sequncia e frequncia de recuperao (RESEARCH COUNCIL (U.S.), 2007)
A anlise de dados de sequncia por bioinformtica demonstrou
as interaes bioqumicas que poderiam ocorrer entre os membros
da comunidade microbiana, alm de evidenciar interaes genticas
em termos de recombinao e transferncia gentica lateral. Foi possvel se determinar a presena de um processo de fixao de nitrognio ligado a uma espcie no abundante. Essa informao permitiu
que essa bactria fosse isolada em laboratrio em forma pura, a partir da elaborao de mtodos de isolamento baseados em informao
de metabolismo bacteriano gerada por sequenciamento e anlises do
genoma do organismo. Foi demonstrado, ento, um dos benefcios
de estudos em metagenmica: a possibilidade de se cultivar organismos previamente no cultivveis, a partir da compreenso das necessidades metablicas destes microrganismos (RESEARCH COUNCIL
(U.S.), 2007).
Um dos principais motivos do sucesso e rpido avano do projeto
relacionado aos efluentes cidos de minerao foi a baixa complexidade da comunidade microbiana em estudo. A maioria dos conjuntos
185
biotecnologia
microbianos na natureza no possui o mesmo nvel bsico de complexidade, sendo este um caso raro a exceo, e no a regra. Para os
nveis de complexidade mais altos encontrados em outros objetos de
estudo, sabese que somente o sequenciamento shotgun no pode ser
utilizado com o propsito de se montar genomas microbianos completos, mesmo que essa complexidade seja moderada. Nesses casos,
outras metodologias se fazem necessrias (RESEARCH COUNCIL
(U.S.), 2007).
O Projeto Mar de Sargasso

A iniciativa de se sequenciar, em altssima escala, DNA presente
em menos de 2m3 de gua do Mar de Sargasso (VENTER etal., 2004)
demonstrou o potencial de gerao de dados de projetos em metagenmica. Aproximadamente 1 Gpb de sequncia no redundante, o
que representava entre duas a trs ordens de magnitude mais dados
do que aqueles gerados pelo Projeto Genoma Humano, foi produzido.
A quantidade de informao em diversidade microbiana era sem precedentes: 148 filotipos bacterianos desconhecidos e 1.200.000 genes,
tambm desconhecidos, foram listados (LEVEAU, 2007). Somente
essa quantidade de protenas putativas era dez vezes maior do que as
sequncias presentes em todos os bancos de dados curados poca
(RESEARCH COUNCIL (U.S.), 2007). Estimouse a presena de aproximadamente 1.800 espcies na amostra, a maioria consistentes com
o que se esperava ser prevalente em oceanos.
Devido complexidade da comunidade amostrada, foi evidenciada
a dificuldade em se montar contigs de grande tamanho a partir de
dados de sequenciamento shotgun de comunidades mais abundantes
em espcies. Nenhum genoma completo foi gerado no Projeto Mar
de Sargasso, e somente poucos contigs puderam ser agrupados a partir da populao microbiana (RESEARCH COUNCIL (U.S.), 2007).
A contaminao amostral tambm foi um problema detectado nesse
projeto, indicando a necessidade de esforos integrados de amostragem cuidadosa.
186
Projeto Resistoma do Solo

Esse projeto utilizou uma abordagem de metagenmica funcional
na busca de genes de resistncia a antibiticos presentes no solo. Em
suma, fragmentos de DNA metagenmico do solo foram clonados, e
os clones foram avaliados quanto presena de fentipos expressando
resistncia a antibiticos (DCOSTA etal., 2006). O projeto levou ao isolamento de novos grupos de genes de resistncia a antibiticos. O fato
de o objeto de estudo a resistncia a antibiticos representar um
fentipo de fcil seleo foi uma das vantagens do projeto. Clones positivos crescem na presena de antibitico, sendo possvel a avaliao de
bibliotecas contendo milhes de clones. Genes de resistncia a aminoglicosdeos, que codificam um grupo de enzimas chamadas acetiltransferases, foram descritos (RIESENFELD etal., 2004), alm de genes de
resistncia a lactmicos (semelhantes a penicilina), distintos de enzimas descritas anteriormente (RESEARCH COUNCIL (U.S.), 2007).
Aplicaes da metagenmica
A metagenmica possibilita aplicaes de ordem prtica em diferentes reas, como, por exemplo, em biomedicina, agricultura, indstria
e meio ambiente. Na agropecuria, por exemplo, existe potencial no
desenvolvimento de metodologias de deteco precoce de ameaas
produo de alimentos como patologias vegetais ou animais. Em segurana alimentar, podese monitorar e detectar contaminantes microbianos nocivos. Alm disso, permite estudos que possibilitam o desenvolvimento de estratgias e prticas que maximizam os benefcios
de comunidades microbianas agindo em conjunto com culturas de
importncia agronmica, ou animais. Na pesquisa em bioenergia, permite estudos para o desenvolvimento de sistemas microbianos capazes
de processar novas fontes de bioenergia, mais sustentveis economicamente e ambientalmente. Ferramentas biotecnolgicas provenientes de estudos em metagenmica levariam identificao e explorao de mecanismos metablicos microbianos gerando benefcios em
produtos industrias, alimentcios e de sade. Em meioambiente,
ferramentas como a biorremediao podem ser resultantes de projetos em metagenmica, a partir do desenvolvimento de tcnicas de
187
biotecnologia
monitoramento de dano ambiental em diferentes nveis, levando a

mtodos de restaurao de ambientes com a utilizao de microrganismos biorremediadores (RESEARCH COUNCIL (U.S.), 2007).
Na pesquisa em agricultura, provavelmente a maior contribuio da
metagenmica resida em estudos de comunidades microbianas presentes no solo, em associao ou no com plantas de interesse agronmico. Uma srie de projetos em metagenmica de solos j identificou
diversos tipos de genes de interesse, entre pigmentos, antibiticos,
enzimas lipolticas, e outros biocatalistas (DANIEL, 2005). H possibilidade de aplicao da metagenmica no estudo de rizobactrias promotoras do crescimento de plantas (PGPR) (LEVEAU, 2007)
No Cerrado, levantamentos de diversidade microbiana de bactrias
e fungos j foram realizados por meio do sequenciamento de bibliotecas 16S e 18S, respectivamente (DE CASTRO etal., 2008; QUIRINO
etal., 2009). No caso do levantamento de populaes bacterianas,
detectouse uma maior riqueza de espcies no Cerrado sensu stricto
em relao a Cerrado convertido em pastagem. A riqueza esperada
de espcies no Cerrado sensu stricto seria 10 vezes maior do que a do
Cerrado convertido em pastagem, por meio da plotagem de linhagens
atravs do tempo (QUIRINO etal., 2009). No caso das populaes fngicas, foi detectada uma reduo na diversidade de espcies, associada
a atividades antropognicas como o cultivo de soja, em comparao
com Cerrado nativo (DE CASTRO etal., 2008).
Um exemplo de uso da metagenmica em projetos envolvendo
meioambiente e potenciais aplicaes biotecnolgicas de recursos
genticos microbianos envolve a descoberta de mecanismos metablicos relacionados com a resistncia ao excesso de nquel em uma
populao bacteriana. Populaes de bactrias da rizosfera de Erica
andevalensis (MIRETE etal., 2007), presentes em reas de oxidao de
sulfetos minerais, ricas em metais txicos e altamente cidas, foram
analisadas em termos de sua diversidade filogentica, e do potencial
de expresso de genes de tolerncia ao excesso de nquel. O artigo
apresenta o primeiro relato sobre a descoberta de genes de resistncia a Ni a partir de uma comunidade microbiana desse tipo de
ambiente. Genes j conhecidamente envolvidos com resistncia a
Ni foram detectados, e de um total de 13 clones positivos, 5 codifica-
188
vam protenas j conhecidas, porm nunca associadas resistncia

Ni, enquanto 6 clones codificavam protenas hipotticas ou de funo desconhecida. Este trabalho demonstra a possibilidade de aplicao de abordagens recentes em microbiologia ambiental, associando
genmica avanada em alta escala, prospeco de funo gnica, alm
da anlise em alta escala de diversidade de populaes microbianas.
Na busca de genes de interesse na produo de biocombustveis,
diversos trabalhos j foram publicados. Um deles (BRULC etal.,
2009) fez uso de pirosequenciamento, uma tecnologia de sequenciamento de nova gerao que gera uma quantidade de dados maior
que o sequenciamento tradicional de Sanger, a um custo mais baixo,
permitindo estudos em altssima escala. Essa metodologia elimina
a necessidade de clonagem, partindo diretamente para o sequenciamento (LIU, 2009; SNYDER etal., 2009). O trabalho de Brulc e colaboradores tambm utilizou uma abordagem de metagenmica comparativa entre 3 microbiomas aderidos a fibras e 1 amostra lquida.
Os microbiomas dos trs animais amostrados foram completamente
diferentes, apesar da dieta similar, quanto a sua estrutura, diversidade
filogentica e potencial metablico.
Na indstria, a busca por enzimas de interesse como biocatalisadores tem ligado a metagenmica a aplicaes e processos industriais.
Diversos empreendimentos em biotecnologia tm sido estabelecidos com o propsito de prospectar enzimas com potencial aplicao
industrial (LORENZ; ECK, 1988).
Consideraes finais
Apesar do enorme potencial de uso da metagenmica em diferentes objetos de pesquisa, o conhecimento de suas limitaes permite
um uso racional de suas metodologias e um melhor planejamento
de futuros projetos. Abordagens que fazem uso de uma triagem funcional dependem da expresso bem sucedida de genes clonados na
bactria hospedeira, conforme j mencionado anteriormente. Em
triagens baseadas em sequenciamento, no possvel a obteno de
genes completamente novos. Alm disso, pode ocorrer a clonagem de
genes parciais, e a seleo de genes no funcionais (DANIEL, 2005).
189
biotecnologia
O pesquisador deve ter em mente que o valor de predio e interpretao de dados em metagenmica limitado pela validade de informao presente em banco de dados. A quantidade de genes listados
com funo desconhecida enorme, e para aqueles genes com funo inferida a partir de anlises de similaridade, ainda necessria
validao experimental. Nesse sentido, o progresso no cultivo de bactrias antes no cultivveis, a fim de se obter representantes isolados
do ambiente em estudo, de extremo valor. Dessa forma, a metagenmica deve ser recebida como uma metodologia complementar a abordagens tradicionais em testes de hiptese sobre a composio, diversidade e funcionalidade de comunidades microbianas (LEVEAU, 2007).
A mudana de paradigmas de sequenciamento que tem ocorrido
nos ltimos anos tambm um fator limitante de abordagens que
geram quantidades exorbitantes de informao. Sero necessrios
avanos em bioinformtica diante da adaptao enorme quantidade
de dados de sequenciamento gerados. Em virtude da inexistncia de
pacotes para anlise global de dados, devem ser levados em conta,
em projetos de metagenmica, a complexidade da amostra e a montagem de genomas a partir de amostras complexas. Vale salientar que
todo o progresso e desenvolvimento em bioinformtica atenderam a
projetos que utilizavam a tecnologia de sequenciamento de Sanger,
sendo necessria uma renovao e adequao de processos e metodologias que atendam projetos futuros (CHEN; PACHTER, 2005;
KUNIN etal., 2008; RESEARCH COUNCIL (U.S.), 2007).
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193
Captulo 7
Biotecnologia e diagnsticos
moleculares
Maria Cristina Rocha Cordeiro
Introduo
Em primeiro lugar, necessrio conceituar o que seja biotecnologia e diagnstico molecular para, em seguida, explicar qual a relao entre biotecnologia e diagnstico molecular.
Biotecnologia um termo relativamente novo, muito embora sua
prtica seja at antiga. A biotecnologia em si a utilizao de processos biolgicos como geradores de tecnologias de forma que se agregue valor a um dado produto. A biotecnologia pode ser considerada
um processo antigo quando nos referimos por exemplo tecnologia
de produo de vinhos, cerveja, queijo etc. O que so, em ltima instncia, essas prticas? So processos biolgicos que foram aproveitados para a gerao de tecnologia tendo em vista a formao de um
novo produto com valor agregado. No caso do vinho e da cerveja, o
aproveitamento foi da fermentao anaerbica do suco da uva ou da
cevada e, no caso do queijo, do leite.
Diagnstico molecular pode ser conceituado como sendo o uso de
ferramentas moleculares que indique, ou demonstre, a soluo de
uma dada questo. Por exemplo, no campo da sade, o termo diagnstico utilizado como um meio de esclarecer os sintomas de uma
doena. Diagnstico molecular quando esse esclarecimento realizado em nvel molecular. No campo da biologia, o diagnstico molecular pode ser utilizado, por exemplo, quando se quer identificar especificamente uma planta ou um animal. Na agropecuria, o diagnstico
molecular pode estar relacionado com a identificao de uma dada
cultivar mais produtiva, mais resistente a uma dada doena, a identificao de um dado patgeno etc. O diagnstico molecular pode ser
considerado como um caminho que leva biotecnologia e esta, como
geradora de um processo, uma tecnologia nova com valor agregado.
Como exemplo dessa relao esto os processos de identificao em
195
biotecnologia
nvel molecular de, por exemplo, plantas e animais transgnicos e (ou)

kits de identificao de patgenos que podem resultar em processos
patenteveis (com valor agregado).
Para que um diagnstico molecular seja efetivo, para qualquer situao, ele deve ser considerado dentro de quatro quesitos importantes como: a reprodutibilidade, a especificidade, a distinguibilidade e
a sensibilidade. Reprodutibilidade significa que o diagnstico deve
ser sempre repetido exatamente da mesma maneira dentro da situao especfica. Especificidade significa que deve ser especfico para a
questo estudada (ex.: planta, patgeno etc); distinguibilidade significa que o diagnstico ou a identificao distinta e no assume mltiplas formas (no h falsos positivos ou negativos), nica; e sensibilidade significa que o diagnstico ou a identificao capaz de ser
realizado com quantidade muito reduzidas de matriaprima (ex. sangue, tecido vegetal, animal, DNA, RNA, protena etc). Esses quesitos
esto diretamente relacionados com o objeto que conduz identificao, que chamado de biomarcador.
Biomarcador a molcula que identifica, reconhece, diagnostica
um determinado sistema como uma cultivar, um patgeno, uma
enfermidade etc. Essa molcula deve ser selecionada e relacionada
com o ser que se quer identificar, o agente causal da enfermidade ou
um sistema biolgico especfico. Pode ser de origem proteica ou outra
como o cido desoxiribonucleico (DNA), cido ribonuclico (RNA),
compostos fenlicos etc.
Outra relao entre biotecnologia e diagnsticos moleculares diz
respeito s ferramentas moleculares da biotecnologia moderna que
so utilizadas para selecionar e relacionar uma molcula como biomarcadora de um determinado ser vivo, processo ou sistema. Essas
ferramentas moleculares assim utilizadas podem ter origem na genmica, na transcriptmica, na protemica ou no metaboloma.
Genmica a parte da biotecnologia que estuda os genomas em
sentido macro, sua estrutura bsica. So, por exemplo, os grandes trabalhos de sequenciamento de genomas que tm, por principal objetivo, revelar o tamanho preciso dos diversos genomas animais ou
vegetais; inferir no nmero provvel de genes que se encontra nesse
genoma; bem como conhecer a sequncia desses diversos genes. As
196
Captulo 7 Biotecnologia e diagnsticos moleculares
principais ferramentas utilizadas pela genmica so o sequenciamento automatizado de DNA e as ferramentas de bioinformtica de
anotao e anlise das sequncias gnicas. Porm, o sequenciamento
completo dos genomas no informa sobre a funcionalidade de muitas
das sequncias gnicas conhecidas nos estudos da genmica e esta
somente pode ser revelada por meio das ferramentas da transcriptmica e da protemica.
A transcriptmica representa todos os estudos que visam identificao e anlise de genes expressos especificamente em um determinado sistema como, por exemplo, os genes expressos em tecidos
vegetais infectados por diversos patgenos, em tecidos de plantas tolerantes a condies desfavorveis como a seca ou a presena de metais
pesados no solo e outras. Diversas metodologias moleculares so utilizadas nos estudos da transcriptmica como a sntese de biblotecas
de cDNA (DNA complementar), o PCR (Polymerase Chain Reaction),
o RTPCR (Reverse transcrition PCR), o PCR quantitativo (RTqPCR)
etc. Esses estudos inferem, em ltima anlise, situaes fisiolgicas
especficas e contribuem para respostas e identificao dos principais
genes (biomarcadores potenciais), que so ativados em diversas dessas situaes fisiolgicas diferentes.
A protemica representa os estudos de todas as protenas que so
expressas em clulas especficas (tecidos especficos, situaes fisiolgicas especficas). As principais ferramentas metodolgicas utilizadas, hoje, nesses estudos so a eletroforese em duas dimenses, o
sequenciamento de protenas, a espectroscopia de massa e as anlises de bioinformtica.
E, por fim, a metabolmica o conjunto de ferramentas utilizadas para estudar molculas relacionadas identifcao de compostos
no proteicos ou DNA/RNA como os alcaloides, flavonoides etc. e sua
relao com seus ciclos de sntese. Algumas dessas metodologias so
a cromatografia lquida de alta presso (HPLC), a cromatografia em
camada fina (TLC) e a ressonncia nuclear magntica (NMR).
Outros estudos no campo da genmica so aqueles relacionados
com a gentica. Nesse tipo de abordagem, utilizamse como ferramentas experimentais as tecnologias dos marcadores moleculares
197
biotecnologia
que auxiliam no mapeamento de genomas. Esses estudos so melhor

estudados em outros captulos desse livro.
Metodologias e seleo de biomarcadores

para o diagnstico molecular
Uma vez introduzido o assunto, agora podemos discorrer mais
sobre como que algumas metodologias utilizadas pela biotecnologia
auxiliam a seleo e distino de molculas biomarcadoras capazes
de serem o objeto de diagnsticos moleculares.
Construo de biblioteca de cDNA

Uma biblioteca de cDNA um conjunto de cDNAs (DNA complementar) obtido de todos os RNAs mensageiros (RNAsm) presentes
e que se expressam em um determinado sistema biolgico em um
tempo especfico. Os fundamentos tericos para a sua construo
esto relacionados com a associao de diversas ideias e ferramentas da engenharia gentica, tais como, a construo de bibliotecas
de DNA; polimerizao de cadeia de DNA em sentido reverso pela
enzima transcriptase reversa; clonagem molecular; transformao
bacteriana e outros.
A construo de bibliotecas de cDNA objetiva facilitar a seleo
de um gene especfico que se expresse em uma situao fisiolgica
especfica. Para que uma biblioteca de cDNA seja construda, necessrio obter como primeira etapa os RNAsm presentes no sistema
desejado (ex:. tecido de planta infectada com um patgeno, tecido
de cultivar tolerante seca, entre outros). A partir dos RNAm, sintetizase o cDNA correspondente para cada RNAm por meio da utilizao de um primer oligodT e a enzima transcriptase reversa. Esse
passo possvel para todos os sistemas eucariticos, pois seus RNAm
tem uma extenso de poliA na extremidade 3 terminal. Essa enzima
(transcriptase reversa), alm de poder sintetizar uma cadeia de DNA
em sentido reverso (3 para 5) a partir do RNAm tambm, ao final
da extenso, constitui uma formao em gancho (Figura 1) que permite que, em uma segunda etapa, o DNA polimerase I possa sintetizar a segunda cadeia constituindo o cDNA de dupla cadeia. Ao final
198
da polimerizao das duas cadeias, esse gancho destrudo e o pool

de cDNAs gerado ligado a um vetor de clonagem (plasmdeo, cosmdeo ou DNA de fago) e os cDNAs clonados so transformados em
clulas bacterianas ou incorporados a partculas virais que vo infectar
clulas bacterianas. A presena desses clones em clulas bacterianas
importante para a manuteno da biblioteca por um perodo de tempo
longo, alm de permitir sua amplificao para anlises posteriores.
Polimerizao das cadeias de
cDNa com a utilizao da
transcriptase reversa e DNA
polimerase I
5
TTTTT
AAAAA
RNA-m
3
Vetor de clonagem
Sequncia biomarcadora
Figura 1. Esquema geral da construo de uma biblioteca de cDNA.
As diversas bibliotecas de cDNA possveis assumem importncia

para o diagnstico molecular no sentido em que elas permitem a seleo de uma sequncia gnica especfica que est relacionada como
uma molcula biomarcadora de um sistema fisiolgico.
Uma variao dessa metodologia a construo de bibliotecas subtradas de cDNA. Essas bibliotecas subtradas so o produto da subtrao de dois diferentes pools de cDNAs, por exemplo, biblioteca de
cDNA dos genes expressos em um planta tolerante a estresse hdrico
de onde foram subtrados a maior parte dos genes constitutivos, ou
seja, que existiam na planta independentemente a expresso de genes
diretamente relacionados com o processo de tolerncia antes da etapa
de clonagem molecular. Bibliotecas de cDNA subtradas minimizam
199
biotecnologia
muito o trabalho para a seleo de um biomarcador para a situao

estudada.
Outra variao, que na verdade anterior e, a partir dela, foi idealizada a biblioteca de cDNA, a construo de bibliotecas genmicas,
que nada mais do que o conjunto completo de fragmentos gnicos que, juntos, representam todo um genoma. Porm, nesse caso,
utilizado o DNA genmico. So utilizadas para selecionar sequncias gnicas completas (regies no transcritas para o RNAm como
regies de introns, sequncias gnicas regulatrias, sequncias gnicas promotoras etc).
Microarranjos de DNA
Microarranjos de DNA a metodologia mais avanada para a seleo de uma ou mais sequncias biomarcadoras ao mesmo tempo para
diversas situaes. Ela realizada por meio da construo prvia de
uma biblioteca de DNA genmico (biblioteca genmica). A partir do
pool de fragmentos genmicos, adicionase cada um desses clones em
uma microplaca de forma automatizada. Cada microplaca, portanto,
tem a representao de uma grande parte dos clones da biblioteca de
DNA para um determinado genoma. Logo, cada spot na microplaca
representa um clone de DNA que j conhecido por uma sequncia
gnica especfica, sequenciada previamente. Para a seleo das molculas biomarcadoras (p.ex., os genes expressos em um dado sistema),
fazse a hibridizao com diferentes pools de cDNA, cada um marcado com um fluorforo diferente (Figura 2). A leitura das diferentes
emisses de fluorescncia na microplaca analisada em um software
especfico e clculos estatsticos de forma a dizer qual dos genes ativado somente em um determinado sistema. Essa expresso diferencial, no entanto, deve ser confirmada por meio de experimentos de
RTqPCR. Os fundamentos tericos ou ideias fundamentais que esto
por trs dos microarranjos de DNA so, por exemplo, as bibliotecas
de DNA, a hibridizao em Southern blot etc. conveniente ressaltar
que a base da anlise em microarronjos de DNA o Southern blot que
rendeu o prmio Lasker de 2005 a seu inventor.
200
Gene
selecionado
Microplaca
Figura 2. Esquema geral de um anlise em microarrnjos de DNA (microarray).
Eletroforese em 2D
A eletroforese em 2D foi descrita pela primeira vez por OFarrel
em 1975. Ela consiste na separao de protenas em duas dimenses
em um gel de eletroforese de poliacrilamida. O fundamento terico
dessa metodologia consiste na qumica de protenas que, por meio
desses estudos, sabese quais protenas tm cargas eltricas positivas
e negativas em meio aquoso, por causa dos grupos amino e carboxila
dos aminocidos. Porque possuem cargas eltricas, podem migrar
em um campo eltrico (princpio da eletroforese), seja para o plo
positivo (se a predominncia de carga for negativa) ou negativo (se a
predominncia de carga for positiva). No entanto, se a protena tem
uma proporo de cargas positivas e negativas iguais, esta no migra
no campo eltrico, ento esse ponto chamado de ponto isoeltrico.
por esse motivo que se consegue a separao de uma amostra heterognea de protenas na primeira dimenso da eletroforese em 2D.
O outro princpio que molculas proteicas grandes migram em um
campo eltrico com uma velocidade menor do que molculas pequenas, podendo serem separadas por seu peso molecular. E essa a separao obtida na segunda dimenso da eletroforese em 2D. A vantagem
para um diagnstico molecular que essa metodologia, associada ao
sequenciamento de protenas, tem o potencial de identificar todas as
protenas componentes de um determinado tecido, como tambm
as protenas diferenciais expressas entre dois diferentes tecidos (biomarcadores proticos em potencial). Atualmente, essa identificao
realizada por meio de softwares especializados que escaneiam os
gis em anlise e subtraem in silico as marcas de protenas de um em
relao ao outro (Figura 3).
201
biotecnologia
(-)
(+)
(-)
(+)
Figura 3. Esquema geral de uma anlise de eletroforese em 2D demonstrando a expresso de protenas diferentes nos tecidos A e B.
Recapitulando, as duas dimenses em que so separadas as protenas em gel de eletroforese consistem na separao por pontos isoeltricos (pH em que a protena tem carga nula e, portanto, estaciona
no gel) em uma primeira etapa, e, em seguida, a separao em gel por
peso molecular. Essa tcnica parte da premissa de que as diversas protenas que existem no tm, ao mesmo tempo, o mesmo ponto isoeltrico e o mesmo peso molecular.
Sequenciamento de DNA
A metodologia do sequenciamento de DNA foi descrita por
Frederick Sanger na dcada de 1970. O procedimento original realizado por meio da amplificao em PCR da sequncia alvo com oligonucleotdeos (primers) especficos localizados no vetor (DNA plasmidial) onde est clonado a sequncia de interesse alvo (gene) e a
utilizao de dideoxnucleotdeos (ddNTPs). ddNTPs so nucleotdeos
que contm duas oxidrilas ao invs de apenas uma, normalmente
encontrada nos dNTPs. Esses dideoxinucleotdeos so adicionados
um a um no processo de amplificao em PCR (Polymerase Chain
Reaction). Na verdade, fazemse 4 reaes diferentes em que 3 dos
dNTPs so normais e apenas 1 ddNTP. A reao de polimerizao
das novas cadeias de DNA onde est o ddNTP parada com a adio
do mesmo gerando como produto da PCR uma gama de fragmentos
de DNA de tamanhos diferentes de acordo com a adio do ddNTP.
Assim, cada uma das reaes possuem fragmentos cujas pontas contm ddATP, outra ddTTP, outra ddCTP e outra ddGTP. Alm da adi202
o diferencial dos ddNTPs nas reaes do PCR, adicionado a cada

reao um dos dNTPs (geralmente dATP ou dCTP) marcados com
radioatividade. Portanto, os fragmentos gerados em cada reao tero
um diferencial na ponta (por causa do ddNTP) e so radioativos.
Essas quatro reaes so adicionadas em um gel de poliacrilamida
com uria que permite a resoluo dos diferentes fragmentos de DNA
sintetizados em cada reao. Aps a corrida eletrofortica, o gel seco
e exposto a um filme radiogrfico. Esse procedimento chamado de
autorradiografia, que representa uma imagem negativa dos fragmentos resolvidos no gel que imprimem sua imagem no filme radiogrfico por estarem radioativos. A leitura dessa autorradiografia fazse
de baixo para cima, pois os fragmentos mais baixos so menores do
que os fragmentos que esto acima. Como se aplica as quatro reaes
no mesmo gel, a leitura feita da banda mais baixa, seja na linha do
ddATP, ou ddCTP, ou ddTTP, ou ddGTP, e vaise alternando conforme as diferentes posies (Figura 4).
A
a
b
A
T
T
C
T
T
G
A
C
G
A
T
Figura 4. Esquema do procedimento de sequenciamento automtico. (a)

dideoxinucleotdeos marcados com fluorescncia diferencial; (b) reao de
polimerizao de fragmentos; e (c) separao eletrofortica dos fragmentos
gerados na reao do PCR.
203
biotecnologia
A sequncia lida estar no sentido direto ou reverso conforme a

orientao do primer utilizado no plasmdeo para a reao de sntese dos fragmentos homlogos gerados do gene alvo. Com a sequncia lida, podese buscar uma sequncia homloga a ela em banco de
dados gnicos ou proteicos utilizando ferramentas de bioinformtica
como o Blast em suas mltiplas formas como nBlast, tBlast, Blastx etc.
Ou vrias sequncias podem ser analisadas em comparao utilizando
o programa Clustal W ou ainda montadas de forma que se encontre a
continuidade das sequncias gerando uma sequncia maior.
Em resumo, como fundamentos tericos da metodologia do
sequenciamento, podemos apresentlos assim: (1) para a cadeia do
DNA crescer em uma reao de polimerizao em PCR, necessria
a adio de um nucleotdeo do tipo dNTP, caso contrrio ela parada
(adio de ddNTP); (2) se um dos dNTPs na reao de polimerizao
for marcado de alguma maneira (com radioatividade ou fluorescncia), toda a cadeia ser marcada da mesma forma; (3) fragmentos de
DNA de tamanhos diferentes migram em um gel submetido a um
campo eltrico em geral para o plo positivo e os menores com mais
velocidade do que os maiores (princpio da eletroforese); (4) partculas radioativas, porque emitem radioatividade na forma de eltrons
livres da camada mais externa dos tomos, podem imprimir filmes
radiogrficos permitindo uma autorradiografia.
A metodologia do sequeciamento atual mais utilizada a do
sequenciamento automtico. Ela est baseada na metodologia original de Sanger, contudo realizada em um mesmo tubo onde so
adicionados os quatro ddNTPs marcados com quatro diferentes fluorforos que emitem intensidade luminosa diferente quando submetidos luz. Os picos de diferentes fluorescncias so relacionados
presena de um diferente ddNTP. Essa metodologia mais vantajosa porque tem o poder maior de leitura em relao ao tamanho da
sequncia, que pode ser lida em uma nica reao, e tambm por no
utilizar radioatividade.
O sequenciamento de DNA auxilia um diagnstico molecular, uma
vez que permite o conhecimento de sequncias gnicas espcieespecficas que podem ser comparadas por programas de bioinformtica
e, a partir dessa comparao, primers especficos podem ser sintetizados de forma a permitirem a amplificao especfica de fragmentos
espcieespecficos que funcionem para identificar especificamente
204
patgenos, plantas, animais, plantas transgnicas (geram biomarcadores) (Figuras 5 e 6). Esses diagnsticos tm sido alvo de muitos trabalhos (FERRI, 2009).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
?
Figura 5. Esquema geral do diagnstico molecular de uma planta.
Figura 6. Gel de agarose 2% corado com brometo de etdio que demonstra o diagnstico molecular especfico para o nematoide Heterodera glycines.
MiMeloidogynes incognita; MjM. javanica; MaM. arenaria; HgHeterodera
glycines; PbPratylenchus brachyurus e RrRotylenchulus reniformis.
205
biotecnologia
Tecnologias principais utilizadas

em diagnstico molecular
PCR e variaes
A reao do Polymerase Chain Reaction (PCR) uma metodologia
que mimetiza a duplicao do DNA em um tubo de ensaio e esse o
seu fundamento terico. Ela foi descrita pela primeira vez por Mullins
em 1983 (SAIKI etal., 1988), provavelmente aps a identificao de
uma enzima DNA polimerase (enzima que polimeriza cadeias novas
de DNA) chamada Taq polimerase, que tem esse nome por ter sido
purificada pela primeira vez de uma bactria chamada Thermophilus
aquaticus. A Taq polimerase capaz de resistir a ciclos de alta temperatura peridicos, por ser termoresistente. E essa alta temperatura
(92oC a 94oC) necessria na reao de PCR na etapa de desnaturao do DNA.
O PCR constitudo de trs etapas fundamentais (Figura 7): desnaturao do DNA; o anelamento de oligonucleotdeos (primers); e a
polimerizao de novas cadeias. A etapa de desnaturao necessria para que a dupla cadeia do DNA seja aberta, permitindo assim o
anelamento dos primers; a etapa de polimerizao aquela que polimeriza novas cadeias de DNA a partir de uma cadeia que serve como
molde (a duplicao do DNA semiconservativa). Esse ciclo se repete
sucessivas vezes de forma a aumentar a quantidade do fragmento
amplificado de maneira que obedea uma progresso geomtrica.
Assim, a partir de quantidades nfimas de DNA, podemse detectar
fragmentos especficos e analislos. A grande vantagem do PCR
que uma metodologia muito sensvel, rpida e de relativo pouco
custo, dessa forma um diagnstico molecular que utiliza essa reao
tem um grande impacto.
206
Hibridizao
do
primer
Desnaturao
do
DNA
Polimerizao de
novas cadeias do
DNA
Figura 7. Esquema geral da reao de PCR.
Com o passar do tempo, foram aparecendo variaes permitindo

assim diversas aplicaes, como as anlises genticas com marcadores moleculares do tipo Rapid Amplified Polymorphic DNA (RAPD);
Inter Sequence Simple Repeats (ISSR); Sequence Simple Repeats
(SSR); Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP). Todas
essas metodologias genticas so muito teis como ferramentas que
auxiliam programas de melhoramento gentico. Um dos atributos do
uso de marcadores moleculares visando um diagnstico molecular
seu implemento para a gerao de fingerprintings (impressos digitais)
que servem para identificar cultivares, animais etc, alm de permitir
anlise de divergncia gentica entre elas (Figura 8). Outra aplicao
do RAPD que gera diferentes fingerprintings de cultivares o estudo de
variaes somaclonais gerado na cultura de tecidos vegetais in vitro.
207
biotecnologia
2 3
6 7 8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Figura 8. gel de agarose a 1,2% corados com brometo de etdio demosntrando o fingerprinting obtido por meio da metodologia do RAPD de diferentes plantas de mangueira.
Outras variaes do PCR so o RTPCR (Reverse transcription

PCR), o RTqPCR (Real time quantitative PCR). O primeiro ocorre
basicamente da mesma maneira que o PCR convencional, porm,
aps uma reao inicial de sntese da primeira fita de cDNA (DNA
complementar), pois o RTPCR amplifica transcritos gnicos (a partir
do RNA mensageiro). Essa metodologia importante quando se tem o
objetivo de estudar a expresso de um determinado gene em um sistema biolgico especfico. A vantagem do RTPCR para o diagnstico
molecular que, alm de selecionar um biomarcador com ela, tambm se pode inferir sobre a expresso de um dado transcrito gnico
relacionandoo ao sistema como um biomarcador.
O RTqPCR um processo semelhante, que pode ser realizado com
DNA ou RNA inicial, porm a sua vantagem que ele permite a quantificao do gene ou transcrito especfico gerado em tempo real de
forma bastante sensvel e precisa, porque utiliza um corante que intercala nas cadeias dos fragmentos gerados no PCR (geralmente o Syber
green) e que pode ser detectado por sensores do equipamento utilizado no PCR, permitindo a quantificao do aumento da concentrao
do fragmento gerado em tempo real. Essa metodologia pode relacionar genes como muito ou pouco expressos em um sistema ou quantidade do DNA presente na amostra analisada. uma metodologia
208
muito sensvel e os trabalhos com ela hoje tm um grande impacto.

a metodologia por excelncia para validar os estudos realizados em
bibliotecas de cDNA ou microarranjos de DNA.
Southern e Northern blot

A metodologia do Southern blot foi inventada pelo bilogo britnico Edwin Southern. Ela consiste na identificao da presena de um
gene em um dado genoma. Tambm pode ser utilizada para estimar
o nmero de cpias gnicas, para um gene especfico, nesse genoma.
O embasamento terico dessa metodologia reside na associao de
vrias metodologias e descobertas como: o tipo de corte de restrio
gerado em DNA genmico por diversas enzimas; a eletroforese; a
transferncia de fragmentos, utilizandose o processo da capilaridade
ou campo eltrico; a desnaturao da dupla cadeia de DNA com lcalis
fortes; a complementariedade de sequncias e preferncia para hibridizao especfica; a marcao de nucleotdeos com tomos radioativos; a impresso de eltrons em filmes radiogrficos (autorradiografia). O protocolo para a sua realizao depende em primeiro lugar que
se obtenha o DNA de interesse extrado e digerido com quatro diferentes tipos de enzimas de restrio.
Em geral, utilizamse enzimas que cortam pouco e muito o DNA.
Em seguida, os fragmentos gerados na digesto enzimtica so separados em gel de eletroforese de agarose a 0,8%. Ao trmino da corrida,
o gel utilizado para fazer a transferncia desses fragmentos separados para um filtro de nylon (Figura 9). Essa transferncia pode ocorrer por algumas horas utilizandose corrente eltrica ou pela noite
por capilaridade. No outro dia, os fragmentos transferidos para o filtro de nylon so desnaturados com solues alcalinas desnaturantes e
fixados nele. Esse ltimo fenmeno chamado de crosslinking e pode
ocorrer pela ao do ultravioleta por alguns segundos ou a 2 horas em
forno +80oC. O filtro com os fragmentos de DNA transferidos e fixados ento submetido a uma prhibridizao e, em seguida, a uma
hibridizao em tampes especficos, em temperaturas especficas.
A temperatura pode variar conforme a homologia do gene em
estudo, se bastante homlogo, geralmente 52oC a 65oC, se no, 37oC
a 45oC. Se a temperatura alta, dizemos que a hibridizao de alta
209
biotecnologia
estringncia; e, se a temperatura baixa, dizemos que a estringncia

baixa. A hibridizao realizada em sacos de plstico selados onde
adicionado um fragmento gene especfico marcado com radioatividade (sonda) em banhos trmicos por um pernoite. Tambm pode
ser utilizado hibridizadores comerciais. Atualmente tambm realizado com sondas marcadas com fluorescncia. No dia seguinte, o
filtro hibridizado lavado de forma a remover a radioatividade de
excesso em tampes especficos, utilizando temperatura de acordo
com a estringncia apropriada. O filtro ento seco e exposto em cassetes a filmes radiogrficos a 80oC (autorradiografia).
Fragmentos de DNA/ RNA
Southern / Northern Blot
filtro de Nylon
gel
transferncia
gel
Filtro de Nylon
Marcao fluorescente
ou radioativa
Southern / Northern blotting
Figura 9. Esquema geral de um Southern / Northern blot.

De acordo com o sinal radioativo remanescente no filtro, o filme
revelado em um dia, dois, uma semana ou um ms, obtendose ento
o resultado. Se a marcao foi fluorescente, o resultado obtido por
meio do escaneamento do filtro em equipamentos leitores especficos que emitem feixe de luz capazes de fazer fluorescer a(s) banda(s)
hibridizada(s) para sua identificao. O Southern blot para estimar o
nmero de cpias gnicas vem, atualmente, sendo substitudo pelo
RTqPCR. Contudo, pode ser ainda utilizada como diagnstico de plantas transgnicas.
210
A metodologia do Northern blot foi batizada por Southern, pois consiste em uma anlise similar ao Southern blot, porm realizada com
RNA. As diferenas representam o gel de eletroforese que, nesse caso,
de glioxal ou formaldedo, e a etapa de desnaturao omitida pelo
fato dos RNAm serem cadeia simples. Essa metodologia tambm
tende a ser substituda pelos microarranjos de DNA em que se utiliza
como sondas pools de cDNA diferentes marcados com diferentes fluorforos e pela RTqPCR, j que essas tcnicas tambm so capazes de
detectar a expresso de um dado gene em um dado sistema, porm
de maneira muito mais sensvel. A deteco da expresso de um dado
gene em um dado sistema o principal resultado que a metodologia
do Northern blot pode trazer para um diagnstico molecular.
Western blot
A metodologia do Western blot foi batizada por Southern, assim
como o Southern e o Northern blot, realizada para identificar especificamente genes. Nesse caso, o reconhecimento especfico de protenas e, por isso, pode identificar apenas uma protena que est presente em uma amostra heterognea. Dessa maneira, a identificao
especfica proteica no realizada no Western blot por meio de sondas e, sim, pelo reconhecimento especfico com anticorpos monoclonais ou policlonais.
O fundamento terico dessa metodologia est na imunologia e o
reconhecimento especfico antgenoanticorpo. Em seu processo, tambm realizada uma separao eletrofortica de protenas em gel de
poliacrilamidaSDS similar segunda dimenso da eletroforese em
2D (separao por peso molecular). Em seguida, realizase a transferncia das protenas separadas no gel para um filtro de nylon por
meio de corrente eltrica. Nessa tcnica, no necessrio fixar as
protenas no filtro porque o processo mais rpido, o que evita perdas por difuso das protenas transferidas para o filtro. Em seguida,
realizada uma prlavagem do filtro em tampes especficos e, aps,
adicionado o anticorpo primrio especfico para a protenaalvo. A
ligao antgeno (regio antignica na protena alvo reconhecida pelo
anticorpo) anticorpo realizada por algumas horas e, depois, realizase a ligao de um segundo anticorpo especfico a outra a regio
211
biotecnologia
dos anticorpos IgG (anticorpo secundrio) (uma regio diferente da

regio de reconhecimento especfico que igual em todos os anticorpos) especfico para a protena alvo. Esse segundo anticorpo marcado com algum tipo de (Figura 10) molcula indicadora (ex.: peroxidase, biotina, substncia luminescente etc).
Polo (- )
Polo (+)
Wessern
blot
1 2 34
gel
***
Marcao
luminescente
1 2 3 4
Membrana
de Nylon
Identificao de transgnicos
Identificao de doenas
(pecuria)
Figura 10. Esquema geral de um Western blot.
A revelao do complexo antgenoanticorpo realizada com um

revelador especfico marcao no segundo anticorpo que produz reao no complexo antgenoanticorpo (ex.: biotina/avidina). Essa revelao geralmente uma reao enzimtica, por conseguinte ocorre em
um tampo especfico e produz uma cor ou luz. A protena especfica
alvo da amostra analisada no gel assim revelada como presente ou
ausente diretamente no filtro ou em um filme radiogrfico.
O Western blot utilizado como ferramenta do diagnstico molecular todas as vezes que permite o reconhecimento especfico de uma
dada protena. Essa protena, por exemplo, pode ser expressa em uma
planta transgnica e assim confirma a expresso de um dado gene utilizado para transformla. Tambm pode ser uma protena relacionada
com alguma enfermidade seja vegetal, animal ou humana expressa
no tecido, sangue, entre outros.
212
Elisa
A metodologia do Enzyme linked Immuno Sorbent Assay (Elisa),
assim como o Western blot e a eletroforese em 2D constitui mais uma
tcnica utilizada para gerar um diagnstico molecular tendo como
base biomolculas de protenas. O fundamento terico dessa metodologia o mesmo do Western blot. Nela tambm se identifica uma
protena especfica com anticorpos especficos desenvolvidos a ela e
a revelao tambm realizada de forma indireta com indicadores
luminescente, radioativos ou fluorescentes. Porm, utilizamse placas apropriadas para fixar a protena de escolha (protena alvo) que
(Figura 11) contm vrios pocinhos. Em cada pocinho, adicionado
um material que se quer investigar se h anticorpos especficos para
a protena alvo (ex.: soro humano). Aps essa primeira etapa, adicionado o segundo anticorpo marcado com um indicador. E, finalmente,
a revelao realizada por meio de reaes enzimticas tpicas para
cada indicador. Se o indicador for fluorescente, a placa lida em equipamentos adequados que indicar em qual pocinho encontrado a
marcao positiva. Essa a metodologia mais utilizada no teste de
Sndrome da Imuno Deficincia Adquirida (AIDS).
A metodologia do Elisa tambm pode ser realizada utilizandose
reconhecimento gnico especfico.
Elisa
Anticorpo secundrio marcado

com fluorescncia
Anticorpo primrio
Marcao
fluorescente
Protena biomarcadora
Identificao de
doenas (pecuria)
Figura 11. Esquema geral de um Elisa.
213
biotecnologia
Consideraes finais
Como uma recaptulao geral, podemos dizer que as metodologias de preparao de bibliotecas genmicas, de cDNA (subtrativas
ou no), os micorarranjos de DNA e a eletroforese em duas dimenses fornecem informaes valiosas sobre biomarcadores em potencial para diversos sistemas biolgicos sejam de origem DNA ou protena. O sequenciamento de DNA ou protena complementa a primeira
informao e permite o desenho de primers especficos ao biomarcador. E, finalmente, o PCR em suas vrias modalidades bem como as
metodologias do Southern blot, Northern blot, Western blot e Elisa
oferecem a possibilidade de um diagnstico molecular especfico, seja
para sequncias gnicas ou proteicas.
Todas essas metodologias so muito sensveis. Praticamente a eleio de uma ou outra depende do custo, da expertise e da velocidade
para a obteno de resultados.
O ideal para o diagnstico molecular ter 100% de sensibilidade
(deteco do biomarcador em quantidades nfimas de matria prima),
100% de reprodutibilidade, 100% de especificidade (que evita falsos
positivos e negativos), 100% de distinguibilidade em um custo baixo,
um tempo rpido e necessitando de pouca expertise para o operador. Porm, essa situao utpica. Portanto, deve ser avaliado o que
seja melhor caso a caso. Alguns problemas como reprodutibilidade
podem ser resolvidos com anlises em duplicata, triplicata e anlises estatsticas, e a especificidade, que pode gerar falsos positivos ou
negativos, pode ser resolvida com o uso de controles positivos e negativos no diagnstico. Com relao ao custo, em geral, avaliase e relacionase ao custo/benefcio do diagnstico, e o tempo e a expertise so
aspectos em que h sempre novos estudos na tentativa de superlos
o mximo possvel de modo a ter um diagnstico mais barato e de
fcil manipulao.
Na Tabela 1, apresentamse as vantagens e desvantagens de algumas metodologias utilizadas no diagnstico molecular para servir de
tomada de deciso para cada caso.
214
Tabela 1. Resumo das principais caractersticas, vantagens e desvantagens das metodologias utilizadas no diagnstico molecular.
Metodologia
Sensibilidade
Distinguibilidade
Reproducibilidade
PCR
RTPCR
++++
++++
++++
RAPD
++++
+++
+++
ISSR
++++
+++
+++
SSR
++++
++++
++++
Southern blot
Northern blot
++++
++++
Elisa
++++
Wessern blot
Especificidade
++++
Tempo para
obteno de
resultados
Custo
Expertise
++
+++
++
++++
++++
++
++++
++++
+++
++
++
++++
++++
++++
+++
++
++
++++
++++
++++
+++
++
++
+++++++
++++
++++
+++++
+++++
++
++++
RTqPCR
+++++++
++++
++++
++++
+++++
+++
215
++++
Microarranjos
de DNA
biotecnologia
Referncias
FERRI, E.; BARBUTO, M.; BAIN, O.; GALIMBERTI, A.; SHIGEHIKO,
U.; GUERRERO, R. A.; FERTE, H.; BANDI, C.; MATIN, C.; CASIRAGHI,
M. Integrated taxonomy: traditional approach and DNA barcoding for the
identification of filarioid worms and related parasites (Nematoda). Frontiers in
Zoology, v.6, p.126, 2009.
OFARREL, P.H. High Resolution twodimensional electrophoresis of proteins.
Journal of Biological Chemistry, v.250, p.40074021, 1975.
SAIKI, R. K.; GELFAND, D. H.; STOFFEL, S.; SCHARF, S. J.; HIGUCHI,
R.; HORN, G. T.; MULLIS, K. B.; ERLICH, H. A. PrimerDirected Enzymatic
Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase. Science, v.239,
p.487491, 1988.
216
Captulo 8
Microbiologia do solo
e sustentabilidade de
sistemas agrcolas
Ieda de Carvalho Mendes; Fbio Bueno dos ReisJunior; Mariangela
Hungria; Marcelo Ferreira Fernandes; Guilherme Montandon Chaer;
Fbio Martins Mercante; Jerri dson Zilli
Introduo
Embora a afirmao de que os microrganismos controlam o mundo
parea um pouco exagerada, no . Todos os processos responsveis
pela vida no planeta terra dependem da atividade microbiana. Tratase,
de fato, de um universo paralelo. Por exemplo, um nico grama de
solo possui mais de 10 mil espcies diferentes de microorganismos,
cerca de 1 bilho de bactrias, 1 milho de actinomicetos e 100 mil
fungos. Esses nmeros tambm do uma ideia da imensa diversidade
metablica dessas comunidades microbianas e da diversidade de processos em que elas atuam.
O maior desafio para a agricultura do sculo XXI est na resoluo de uma equao que envolve o aumento da produo de alimentos baratos e saudveis a um baixo custo ambiental. A soluo dessa
equao, por sua vez, no pode negligenciar o componente biolgico
do solo, pois ele apresenta uma estreita interrelao com os componentes fsicos e qumicos, os quais iro em conjunto influenciar no
s a produtividade das culturas, mas tambm a sustentabilidade dos
sistemas agrcolas (Figura 1).
Neste captulo, sero abordados aspectos relacionados ao uso de bioindicadores nas avaliaes de qualidade do solo, os indicadores biolgicos mais apropriados para esse fim, o estado da arte da pesquisa
com bioindicadores e os ndices de qualidade de solo no Brasil e no
mundo e as suas perspectivas de uso pelos agricultores.
219
biotecnologia
Maquinaria
biolgica do solo
Altas produtividades,
baixo custo
ambiental, social
=
SUSTENTABILIDADE
Minimizar o preparo
mecnico
+
Maximizar o retorno
de resduos vegetais
+
Rotao de Culturas
Figura 1. O aumento da produo de alimentos baratos e saudveis a um

baixo custo ambiental no pode negligenciar o componente biolgico do solo.
Qualidade do solo e bioindicadores

Pesquisadores e a sociedade, de uma maneira geral, esto bastante
familiarizados com os conceitos de qualidade da gua e do ar, e de
como o uso inadequado desses recursos pode afetar a sade humana
e o meio ambiente. Entretanto, a despeito da importncia do solo
para a humanidade, como base para todo o sistema de produo alimentar, de fibras e de agroenergia, o interesse pelo tema Qualidade
de solo relativamente recente, datando do fim da dcada de 1980 e
incio da dcada de 1990. De acordo com Doran e Parkin (1994), qualidade do solo seria a sua capacidade de funcionar dentro dos limites dos ecossistemas para: (a) sustentar a produtividade biolgica; (b)
manter a qualidade da gua e do ar e (c) promover a sade humana,
de plantas e animais (Figura 2). Ou seja, alm da importncia do solo
para a produo de alimentos, o conceito de qualidade do solo tambm destaca a importncia desse recurso para o funcionamento global dos ecossistemas.
220
Captulo 8 Microbiologia do solo e sustentabilidade de sistemas agrcolas
Sustentar a
produtividade
Qualidade
do Solo
Qualidade
Ambiental
Promover a
sade
das pessoas,
animais e
plantas
Figura 2. O conceito de qualidade do solo destaca a importncia desse recurso

para o funcionamento global dos ecossistemas .
Embora haja consenso entre pesquisadores e agricultores de que

a manuteno/melhoria da qualidade do solo um elementochave
para a sustentabilidade dos sistemas agrcolas, a avaliao dessa qualidade no uma tarefa fcil. A multiplicidade de fatores qumicos,
fsicos e biolgicos que controlam os processos biogeoqumicos e
suas variaes em funo do tempo e espao, aliados complexidade
do solo, esto entre os fatores que dificultam a capacidade de acessar
a sua qualidade e identificar parmetroschaves que possam servir
como indicadores do seu funcionamento. Por essa razo, um conjunto
mnimo de indicadores englobando atributos fsicos, qumicos e biolgicos deve ser utilizado nas anlises de qualidade do solo (DORAN;
PARKIN, 1994), uma vez que nenhum indicador individualmente ir
descrever e quantificar todos os aspectos da qualidade do solo.
O componente biolgico do solo est intimamente relacionado ao
seu funcionamento, apresentando uma estreita interrelao com os
componentes fsicos e qumicos. Os microrganismos do solo so res-
221
biotecnologia
ponsveis por servios ambientais de importncia fundamental, tais

como os processos de formao do solo, decomposio de resduos
orgnicos (animais e vegetais), ciclagem de nutrientes e formao da
matria orgnica, biorremediao de poluentes e agrotxicos, entre
outros. A participao dos microrganismos em todos esses processos
justifica a incluso dos indicadores biolgicos ou bioindicadores nos
ndices de qualidade do solo e a necessidade de estudos visando selecionar quais desses indicadores biolgicos seriam os mais apropriados para esse fim. Como o estabelecimento de diferentes agroecossistemas influencia diretamente a biota do solo e os processos realizados
por ela, o uso de bioindicadores emerge como um componente importante dos estudos envolvendo a avaliao da qualidade dos solos agrcolas, devido a sua sensibilidade para detectar, em etapa anterior em
comparao a outros parmetros fsicos e qumicos, alteraes que
ocorrem nesse ambiente em funo do seu uso e manejo, seja ele
mantenedor, melhorador ou degradador da qualidade (DORAN, 1980;
DICK, 1994; MATSUOKA etal., 2003; SILVA etal., 2009).
Diferentemente do que ocorre com os indicadores qumicos de fertilidade, cujos nveis (muito baixo, baixo, mdio, adequado e alto) j
esto relativamente bem definidos para cada nutriente e tipo de solo
(sempre levando em considerao caractersticas como: textura, teor
de matria orgnica, etc.), a base de informaes disponvel sobre
os dados biolgicos ainda muito pequena. Dessa forma, as dificuldades na interpretao dos bioindicadores de qualidade, ou seja, de
saber quando que os valores obtidos indicam ou no um bom solo,
constituem um dos grandes obstculos a serem transpostos para o
uso dessas variveis nas avaliaes de qualidade do solo (TTOLA;
CHAER, 2002).
Outro aspecto a ser destacado que os valores ideais para os bioindicadores podem variar conforme o tipo de solo, sistemas de manejo
e condies climticas. Santana e BahiaFilho (1999) utilizaram o
termo limite de sustentabilidade para separar a condio sustentvel
da nosustentvel e sugeriram dois enfoques para o estabelecimento
de critrios de referncias: (1) condio de solo nativo e (2) condies
que maximizem a produo e conservem o meio ambiente. Podese
ainda adotar como referncia critrios de variao temporal, quando
222
ocorre o acompanhamento de uma mesma rea ao longo do tempo.

Nesse caso, os valores determinados para os bioindicadores podem
ser monitorados para se avaliar tendncias ao longo do tempo. Na
realidade, tanto as avaliaes comparativas usando as reas de referncias (comparative assessment), como as avaliaes temporais
(dynamic assessment), so complementares, pois permitem diferentes escalas de avaliao. Desses critrios de referncia, o uso de
reas nativas, com mnimos impactos antropognicos, tem prevalecido (DICK, 1994; DORAN; PARKIN, 1994; TRASARCEPEDA etal.,
1998; MENDES etal., 2003).
Entre os parmetros utilizados pela comunidade cientfica para
caracterizar o componente biolgico dos solos, destacamse as avaliaes de biomassa, atividade e diversidade microbiana.
A biomassa microbiana do solo (geralmente expressa em g de
C. g1 de solo ou mg de C. kg1 de solo) a parte viva e mais ativa da
matria orgnica do solo e constituda principalmente por fungos,
bactrias e actinomicetos. Apesar da sua importncia em relao ao
teor total de C orgnico no solo, o tamanho dos componentes vivos
da matria orgnica relativamente pequeno, variando de 1% a 5%
do C orgnico total dos solos (JENKINSON; LADD, 1981; SMITH;
PAUL, 1990). Como de 99% a 95% da matria orgnica constituda por fraes mortas, relativamente estveis e resistentes a alteraes, mudanas significativas nessas fraes podem levar anos e (ou)
dcadas para serem detectadas (RICE etal., 1996). Entretanto, alteraes significativas na biomassa microbiana podem ser detectadas com
maior antecedncia quando comparadas a mudanas na matria orgnica (POWSON etal., 1987; TURCO etal., 1994), porque a biomassa
a frao mais dinmica do C orgnico do solo. Por essa razo, a biomassa microbiana tem sido proposta como um indicador do estado e
das alteraes da matria orgnica total do solo e sugerida como uma
medida sensvel do aumento ou decrscimo de sua quantidade.
Entre os mtodos mais utilizados na determinao da biomassa
microbiana no Brasil, destacamse o de clorofrmiofumigaoincubao CFI (JENKINSON; POWLSON, 1976) e clorofrmiofumigaoextrao CFE (VANCE etal., 1987), ambos baseados na esterilizao parcial (fumigao) de amostras de solos com clorofrmio. No
223
biotecnologia
mtodo CFI, a determinao do tamanho da biomassa feita com base

no fluxo de CO2 liberado das amostras de solo fumigadas e no fumigadas aps um perodo de incubao de 7 a 10 dias (Figura 1). No CFE,
essa determinao feita a partir da extrao do Corgnico das amostras fumigadas e no fumigadas utilizando um extrator fraco como o
sulfato de potssio (Figura 3). Maiores informaes sobre esses mtodos podem ser encontradas em Oliveira etal. (2001), Roscoe etal.
(2006), ReisJunior e Mendes (2007), BrandoJunior etal. (2008).
Na Reunio de Fertilidade e Biologia do Solo (Fertbio) organizada pela Sociedade Brasileira de Cincia do Solo em Lages, SC, em
2004 , os pesquisadores que trabalham com o intuito de identificar
bioindicadores de qualidade do solo se reuniram e definiram sobre
a padronizao de algumas condies mnimas entre os laboratrios, visando permitir a construo de uma base nacional de dados.
Principalmente pela praticidade, menor tempo e trabalho envolvidos
nas anlises e boa repetibilidade na maioria dos ensaios, o mtodo
CFE foi escolhido, com amostragem de solo na camada de 0 cm a 10
cm. Essa deciso visou, tambm, incentivar a adoo dessa anlise em
um nmero maior de laboratrios. O maior desafio a essa metodologia, porm, consistir em encontrar novos mtodos para a anlise do
C, evitando produtos txicos como o dicromato de potssio, uma vez
que h uma demanda mundial de anlises utilizando uma qumica
limpa. Para fins de pesquisa, o mtodo CFI continua a ser til em
diversas situaes. Finalmente, de grande importncia mencionar
que, em qualquer mtodo utilizado, as medidas devem ser feitas sob
condies totalmente padronizadas, a fim de permitir a reprodutibilidade e comparao dos resultados.
O quociente microbiano (qMIC) um ndice utilizado para fornecer indicaes sobre a qualidade da matria orgnica sendo expresso
pela relao entre o C da biomassa microbiana e o C orgnico total.
Em circunstncias de fatores estressantes para os microrganismos
(pH, deficincias nutricionais, presena de metais pesados), a capacidade de utilizao do C menor e, consequentemente, o qMIC tambm diminui (WARDLE, 1994). J com a adio de matria orgnica
de boa qualidade ou com o trmino de uma situao de estresse, a bio-
224
massa aumenta, assim como o qMIC, mesmo se os teores de C orgnico permanecerem inalterados (POWLSON etal., 1987).
Determinaes da biomassa microbiana no fornecem indicaes
sobre os nveis de atividade das populaes microbianas do solo, ou
seja, podem ocorrer situaes em que os solos apresentem elevadas
quantidades de biomassa inativa e viceversa. Da a importncia das
anlises que medem a atividade microbiana ou o estado metablico
atual e potencial das comunidades de microrganismos do solo. Entre
esses, destacamse as determinaes do C e N prontamente mineralizveis e as de atividade enzimtica dos solos.
A quantidade de CO2 liberada pela respirao dos microrganismos
(tambm denominada, C prontamente mineralizvel) um dos
mtodos mais tradicionais e mais utilizados para avaliar a atividade
metablica da populao microbiana do solo (ZIBILSKE, 1994). Da
mesma forma que outras atividades metablicas, a respirao depende
do estado fisiolgico das clulas e influenciada por diferentes fatores,
como a umidade, a temperatura e a disponibilidade de nutrientes.
Enquanto os ensaios para determinao da respirao do solo como
um todo podem ser realizados no campo, os ensaios para respirao
microbiana so comumente realizados em vasos hermeticamente
fechados, incubados sob condies controladas de temperatura e
umidade em laboratrio, utilizandose uma base (KOH ou NaOH)
para capturar o CO2 que evoludo do solo. Atualmente, nos EUA,
o kit Solvita produzido pelo Woods End Research Laboratory,
baseado na tecnologia de gel colorimetria, tem sido comercializado
para que os prprios agricultores possam avaliar a respirao do
solo de uma maneira eficiente, rpida e barata (www.solvita.co.uk/
products/soillifetestkit.htm).
O quociente metablico (qCO2) um ndice que expressa a relao
entre a respirao basal do solo e o tamanho da biomassa microbiana.
Esse quociente foi proposto originalmente por Andersom e Domsch
(1978) baseado na teoria do desenvolvimento bionergtico dos ecossistemas de Odum (1969). Essa teoria prediz que comunidades microbianas sob estresse (metais pesados, limitaes de nutrientes, baixo
pH, etc.) ou expostas a qualquer tipo de perturbao (cultivo, queimada, etc.) sero menos eficientes em converter o C assimilado em
225
biotecnologia
nova biomassa, pois uma maior parte desse C dever ser utilizado
para fornecer energia (e portanto, respirado como CO2) para processos metablicos necessrios manuteno da homeostase celular. Por
conseguinte, sob tais condies de estresse ou distrbio, o qCO2 ser
mais elevado quando comparado a ambientes (solos) mais estveis,
ou mais prximos do seu estado de equilbrio.
As enzimas do solo participam das reaes metablicas intercelulares, responsveis pelo funcionamento e pela manuteno dos seres
vivos e tambm desempenham papel fundamental atuando como
catalizadoras de vrias reaes que resultam na decomposio de resduos orgnicos (ligninases, celulases, proteases, glucosidases, galactosidases), ciclagem de nutrientes (fosfatases, amidases, urease, sulfatase), formao da matria orgnica e da estrutura do solo (MENDES;
VIVALDI, 2001). A atividade enzimtica de um solo o resultado do
somatrio da atividade enzimtica dos organismos vivos (plantas,
microrganismos e animais) e das enzimas abinticas (enzimas associadas frao no viva, que se acumulam no solo protegidas da ao
de proteases atravs da adsoro em partculas de argila e na matria orgnica). Os ensaios para determinao da atividade enzimtica
so simples e rpidos e baseiamse na adio de substratos especficos para cada tipo de enzima, a uma amostra de solo suspensa em
um tampo (DICK etal., 1996). Aps um curto perodo de incubao,
as amostras so filtradas e realizada a determinao do produto,
por colorimetria (Figura 3). Quanto maior a intensidade da colorao, maior a quantidade de produto formado e, consequentemente,
maior a atividade enzimtica do solo (Figura 4) . Como esses ensaios
so realizados sob condies ideais de pH, temperatura e disponibilidade de substrato, representam a atividade potencial mxima e no a
atividade enzimtica real do solo (ALEF; NANNIPIERI, 1995). Vrios
trabalhos tm demonstrado o grande potencial das anlises enzimticas como indicadores sensveis para detectar diferenas entre solos
e mudanas que variam em funo da influncia antrpica nos mesmos (DICK,1994; DICK etal., 1996; TRASARCPEDA etal., 1998;
MENDES etal., 2003).
226
Biomassa microbiana (CFI)

Pr-incubao
Fumigao por 48 horas
Amostras no fumigadas
Bomba
de vcuo
Dessecador
solo
solo
solo
Incubao
10 dias
solo
solo solo solo solo
CHCl 3
CO 2
Amostras
fumigadas
CO2 das
amostras
fumigadas
KOH
CO2 das
amostras
no fumigadas
Biomassa microbiana (CFE)

Pr -incubao
Amostras no fumigadas
Bomba
de vcuo
Dessecador
solo
solo
solo
solo
solo solo solo solo
CHCl 3
Amostras
fumigadas
Extrao com K2 S O4
C extrado das
amostras
fumigadas
C extrado das
amostras
no fumigadas
Figura 3. Metodolodogias de determinao do carbono da biomassa microbiana.
227
biotecnologia
Adio do substrato
Formao do produto
p-nitrofenil
fosfato
sulfato
glucopiranosideo
Filtragem
p-nitrofenil
Ta mpo + solo
Incubao
por 1 hora
Temperatura
pH
Determinao
colorimtrica
420 mm
Figura 4. Mtodo colorimtrico de determinao da atividade enzimtica

do solo.
As avaliaes de diversidade microbiana fornecem indicativos sobre

a variedade e a variabilidade, em termos de nmero (riqueza) e abundncia (equitatividade), de espcies presentes em um determinado
solo. O advento de tcnicas moleculares tem permitido identificar
que o nmero de espcies microbianas presentes no solo bastante
superior ao estimado com base em tcnicas tradicionais de cultivo em
placa (WARD etal., 1990). Torsvik etal. (1990), com base em dados
de reassociao de DNA extrado de solo, estimaram que o nmero
de genomas em uma grama de solo estaria em torno de 10.000, dos
quais uma pequena minoria (de 0,1% a 10%) teria capacidade de crescer em meios de cultivo no laboratrio. Embora menos evidente, a
diversidade microbiana to importante quanto diversidade de plantas e animais. Quanto maior a diversidade, maior ser a estabilidade
do ecossistema e a eficincia do uso dos recursos disponveis, pois
menor ser o gasto de energia para sustentar a biomassa ali presente
(TTOLA; CHAER, 2002). Uma alta diversidade microbiana garante
a estabilidade do ecossistema, pois ela produz um efeito tampo no
solo contra estresses ambientais naturais ou causados pelo homem.
Por exemplo, o estabelecimento de uma condio ambiental desfa-
228
vorvel no solo pode resultar na inibio de algumas populaes que

desempenham funes essenciais na comunidade. Em comunidades
com alta diversidade, entretanto, h uma alta probabilidade de ocorrncia de microorganismos quiescentes que poderiam desempenhar
a mesma funo, mas que possuem exigncias diferentes relacionadas a fatores fsicos, qumicos e biolgicos. Consequentemente, essas
populaes podem atuar como substitutos funcionais, assegurando
que algumas funes vitais sejam sustentadas independentemente
das mudanas ambientais (VAN BRUGGEN; SEMENOV, 2000). Para
um determinado solo, as avaliaes de diversidade envolvem aspectos genticos (riqueza/abundncia de genomas) e funcionais (variedade de funes de decomposio, transformao de nutrientes, promoo/supresso do crescimento de plantas etc.).
Em geral, os estudos de diversidade gentica microbiana so baseados na extrao e purificao do DNA das comunidades microbianas do solo, seguidas da amplificao dos genes que codificam para
o RNA ribossmico (rDNA), pela reao da polimerase em cadeia
(PCR), utilizandose oligonucleotdeos iniciadores universais, para
espcies ou domnios especficos. Posteriormente, os produtos da
amplificao so separados por tcnicas como o eletroforese em gel
de gradiente desnaturante (DGGE); eletroforese gel com gradiente
trmico (TGGE); polimorfismo do comprimento dos fragmentos de
restrio (RFLP); anlise de restrio do rDNA amplificado (ARDRA);
polimorfismo conformacional de fita simples (SSCP); e polimorfismo
do comprimento de fragmentos de restrio terminal (tRFLP).
O padro de bandas obtidos nessas anlises reflete os gentipos
dominantes e a diversidade gentica. As anlises de steres metlicos
de cidos graxos (FAME) e cidos graxos ligados a steres de fosfolipidios (PLFAs), baseadas nos perfis de lipdios extrados do solo, tambm so utilizadas para a caracterizao da estrutura da comunidade
microbiana. Alguns cidos graxos com estruturas qumicas distintas
esto associados com maior frequncia e abundncia a determinados
grupos taxonmicos de microrganismos. Essa associao possibilita o
uso dessas molculas como biomarcadores para investigao de alteraes na estrutura da comunidade microbiana. Inferncias sobre
mudanas nas estruturas dessas comunidades so baseadas em dife-
229
biotecnologia
renas na composio do perfil cromatogrfico de cidos graxos derivados de fosfolipdios entre amostras. Maiores detalhes sobre todas
essas tcnicas podem ser obtidos em Kirk etal. (2004).
Tambm merecem destaque as metodologias moleculares que independem do cultivo, baseadas na extrao direta de cidos nuclicos
de amostras ambientais (metagenmica), associada s tcnicas de
hibridizao com sondas grupoespecficas e (ou) PCR, clonagem e
sequenciamento, que vm permitindo uma avaliao mais precisa da
diversidade microbiana no ambiente e a descoberta de novos grupos
de organismos, nunca antes cultivados (CANHOS; MANFIO, 2004).
O uso do sistema BiologTM (GARLAND; MILLS, 1991), baseado na
incubao de suspenses de solo em microplacas contendo sais de
tetrazlio e 95 fontes diferentes de C, permite a determinao dos perfis fisiolgicos da comunidade microbiana (communitylevel physiological profiles; CLPP). Originalmente essas placas destinavamse caracterizao de isolados bacterianos provenientes de amostras clnicas
(havia placas especficas para bactrias grampositivas e gramnegativas) e no para anlises de estrutura das comunidades microbianas do
solo. Posteriormente, foi desenvolvida a microplaca EcoPlateTM Biolog,
que utiliza o mesmo princpio, porm, com 3 repeties de 31 fontes
de carbono consideradas ambientalmente mais relevantes. O corante
tetrazlio, presente em cada poo das microplacas, incolor, mas, ao
ser reduzido pela atividade microbiana, tornase roxo. A intensidade
dessa colorao medida por espectrofotometria, e a absorbncia utilizada como medida da capacidade da comunidade em degradar os
substratos. Muitas espcies de fungos presentes no solo no conseguem promover a reduo dos sais de tetrazlio, por isso placas especficas para anlises das comunidades de fungo tambm foram desenvolvidas (CLASSEN etal., 2003). De acordo com a utilizao dessas
fontes, a similaridade entre as comunidades comparada por meio
de uma anlise de agrupamento dos dados. A importncia das anlises de diversidade funcional reside no fato de que, somente com
base nas alteraes na diversidade gentica, no possvel inferir se
algumas funes do solo foram perdidas ou no (TTOLA; CHAER,
2002). Alm disso, as anlises de diversidade funcional permitem uma
melhor compreenso do funcionamento da comunidade microbiana,
230
pois possibilitam averiguar a presena de redundncia funcional no

solo, isto , a existncia de populaes que desempenham um mesmo
papel funcional. Quanto maior a redundncia funcional e a diversidade, mais rpido o ecossistema pode retornar s condies originais
iniciais, ou seja, maior a sua resilincia.
Os estudos sobre o efeito de diferentes manejos de solo na microbiota dos solos tropicais utilizando avaliaes qualitativas e quantitativas da biomassa, atividade e diversidade microbianas so fundamentais para identificar quais os parmetros que poderiam ser
recomendados como bioindicadores (Figura 5). Todos os procedimentos mencionados anteriormente para a avaliao da biomassa, atividade e diversidade microbiana permitem avaliar alguns aspectos do
componente microbiolgico dos solos e auxiliam nos estudos sobre
os efeitos do manejo do solo na microbiota (BALOTA etal., 2003;
BALOTA etal., 2004a,b; MENDES etal., 2003; FRANCHINI etal.,
2007; HUNGRIA etal., 2009; SILVA etal., 2009). Entretanto, considerando que, alm de (a) refletir algum aspecto do funcionamento
do ecossistema; (b) mostrar uma resposta precisa e rpida a qualquer
perturbao; (c) possuir distribuio universal mas com especificidades regionais, um bom indicador ecolgico de qualidade do solo tambm deve (d) ser de simples determinao e barato (Holloway & Stork,
1991), possvel que alguns desses procedimentos, devido sua complexidade de anlise e custo elevado (por exemplo, anlises de diversidade genotpica), sejam limitados para utilizao como biondicadores.
Outro aspecto importante e que tambm deve ser considerado que,
como um nico parmetro no capaz descrever e quantificar todos
os aspectos da qualidade do solo, tornase imprescindvel a combinao de vrias determinaes.
231
Fotos: Ieda de C. Mendes e Jos Humberto Valadares Xavier
biotecnologia
Atividade enzimtica do solo

Adio do substrato
Formao do produto
p-nitrofenil
fosfato
sulfato
glucosidase
Filtragem
p-nitrofenil
Ta mpo + solo
Incubao
por 1 hora
Temperatura
pH
Determinao
colorimtrica
420 mm
Biomassa microbiana (CFI)

Pr-incubao
Amostra no fumigadas
Bomba
de vcuo
Dessecador
Incubao
10 dias
solo
solo
solo
solo
solo solo solo solo
CHCl 3
Amostra
fumigadas
CO 2
CO2 das
amostras
fumigadas
KOH
CO2 das
amostras
no fumigadas
Figura 5. Para que possa vir a ser utilizado rotineiramente em anlises de

solo, o bioindicador de qualidade dever ser de simples determinao e
barato .
Em um futuro prximo, o que se vislumbra a possibilidade de que,

alm das propriedades qumicas e fsicas, determinaes das propriedades biolgicas possam fazer parte das rotinas de anlises de solo. A
incluso dos bioindicadores em anlises de solo ser importante tanto
no sentido de atestar a sustentabilidade dos sistemas de produo com
adoo de manejos conservacionistas, como para alertar agricultores
que estejam adotando sistemas de manejo que possam levar degradao do solo. Outras utilizaes dos bioindicadores podem envolver
a ecocertificao de produtos agrcolas, o monitoramento de programas de recuperao de reas degradadas, o monitoramento de transgnicos, entre outros.
232
ndices de qualidade do solo

Tendo em vista que a quantificao da qualidade de um solo um
processo complexo, a elaborao de ndices de Qualidade de Solo
(IQS) (Figura 6) , englobando aspectos fsicos qumicos e biolgicos, constituise numa forma de agregar e simplificar informaes
de natureza diversa (SMITH etal., 1994; KARLEN; STOTT, 1994;
TRASARCEPEDA etal., 1998; HUSSAIN etal., 1999).
Qumicas
Mat. orgnica
pH
Al
Ca+Mg
P
K
Fsicas
ndice de
qualidade
do solo
Textura
Densidade
Cap. ret. H2 O
Biolgicas
Diversidade
Biomassa
Atividade microbiana
Figura 6. Nenhum indicador individualmente descreve e quantifica todos os

aspectos da qualidade do solo. O ndice de Qualidade de Solo (IQS) agrega
e simplifica informaes sobre as propriedades fsicas, qumicas e biolgicas do solo.
Karlen e Stott (1994) propuseram uma estratgia para calcular um

IQS baseado na determinao de parmetros qumicos, fsicos e biolgicos que avaliassem funes especficas do solo. Posteriormente, essa
estratgia foi replicada/adaptada por diversos autores (HUSSAIN etal.,
1999; CHAER, 2001; SILVA, 2008). A ttulo de exemplo, no modelo
proposto por Chaer (2001) para quantificar o efeito de diferentes manejos na cultura do eucalipto sobre a qualidade do solo, as propriedades
fsicas, qumicas e biolgicas foram relacionadas s seguintes funes
do solo: (1) receber, armazenar e suprir gua; (2) armazenar, suprir e
ciclar nutrientes; (3) promover o crescimento das razes; (4) promover a atividade biolgica; e (5) manter a homeostase. A cada funo foi
associado um peso numrico, expresso em porcentagem, que determina o seu peso dentro do modelo. Similarmente, foram definidos
233
biotecnologia
pesos para cada indicador associado a cada funo do solo. Cada indicador do modelo foi pontuado em uma escala de 0 a 1 por meio de funes de pontuao padronizada (FPPs) (WYMORE, 1993).
As FPPs possuem forma sigmoide e descendente ou do tipo menos
melhor, quando o aumento do valor do indicador representa piora
da funo do solo (ex.: densidade aparente); ascendente ou do tipo
mais melhor, quando o aumento do valor do indicador representa
melhora da funo (ex.: matria orgnica ou biomassa microbiana do
solo); e do tipo timo, usada para indicadores que possuem nvel
timo para a funo (ex.: pH ou nveis de determinados nutrientes).
Os valores dos limites inferiores, superiores e timo que determinam a forma das curvas das funes de pontuao foram definidos
com base na literatura (para os indicadores qumicos) e nos valores
encontrados em uma rea com mata nativa adjacente ao povoamento
de eucalipto (para os indicadores fsicos e biolgicos). Finalmente, o
IQS foi calculado pela soma das pontuaes obtidas por cada indicador, ponderada pelos pesos definidos de acordo com o grau de importncia atribudo tanto ao indicador, em relao funo do solo ao qual
ele foi associado, quanto prpria funo, em relao qualidade global do solo. Na profundidade de 0 cm a 5 cm, o maior IQS foi obtido
no solo sob vegetao natural, seguido dos solos sob eucalipto submetidos a manejos que priorizaram a conservao dos resduos orgnicos por ocasio da reforma do povoamento. Os valores mais baixos
dos IQS foram observados nos tratamentos em que houve a remoo
ou queima do material orgnico da superfcie do solo.
Wienhold etal. (2004) tambm usaram uma estratgia semelhante
e compararam vrios sistemas de manejo por meio do clculo de um
IQS a partir de valores normalizados de vrios indicadores. A pastagem fertilizada e bem manejada foi o sistema que apresentou o
maior IQS seguida em ordem decrescente pelos seguintes sistemas
de manejo: pastagem com moderada carga animal; pastagem sem
animais; pastagem com alta carga de animais; cultura anual sob plantio direto; e cultura anual sob plantio convencional, que apresentou
o menor IQS.
As planilhas utilizadas no trabalho de Chaer (2001) constituram
a base para o desenvolvimento do software SIMOQS Sistema de
234
Monitoramento da Qualidade do Solo, uma ferramenta computacional desenvolvida na Universidade Federal de Viosa. O Simoqs
permite a construo e conduo de testes de modelos para clculos
de ndices de qualidade de solos de forma rpida, com uma interface
amigvel e que podem ser aplicados a diferentes regies e culturas
(CHAER, 2001). Mendes etal. (2008) verificaram que o uso do Simoqs
foi eficaz como ferramenta para auxiliar na avaliao da qualidade do
solo em diferentes agroecossistemas na regio do Cerrado. Por meio
dos clculos do IQS, foi possvel confirmar os benefcios das pastagens bem manejadas (principalmente quando em consrcio com leguminosas), da rotao lavoura/pastagem e do plantio direto como sistemas de manejo capazes de favorecerem a qualidade desses solos.
Outra estratgia para elaborao de ndices de qualidade de solo
baseada na construo de modelos orientados por anlises de componentes principais (ACP) (ANDREWS etal., 2002) ou de regresso
mltipla (TRASARCEPEDA etal., 1998; CHAER etal., 2009). Por
exemplo, TrasarCepeda etal. (1998) sugeriram que a matria orgnica de solos no perturbados (sob vegetao nativa) est em equilbrio com vrias propriedades biolgicas e bioqumicas do solo. Esse
equilbrio pde ser expresso por uma equao de regresso linear
mltipla que estimou o contedo total de N do solo em funo do C
da biomassa microbiana, da capacidade de mineralizao de N e das
atividades de fosfatase, glucosidase e urease (R2=0,97). Desse modo,
esses autores propuseram um ndice bioqumico de qualidade de solo
calculado a partir dos teores reais e estimados de N do solo (relao N
medido/N estimado). Estudos posteriores demonstraram a validade
desse ndice para indicar a degradao ou o distrbio de solos afetados pelo manejo, minerao ou contaminao com efluentes orgnicos e metais pesados (LEIROS etal., 1999; TRASARCEPEDA etal.,
2000). Chaer etal. (2009), utilizando a mesma estratgia proposta por
TrasarCepeda etal. (1998), observaram que o teor de C total de diferentes solos de florestais de conferas noperturbadas do noroeste
dos EUA pde ser explicado apenas pelo C da biomassa microbiana e
pela atividade de fosfatase, independentemente do horizonte do solo
ou da poca de coleta das amostras. A relao entre o C medido (Cmed)
e o C estimado (Cest) por meio de um modelo de anlise de regresso
235
biotecnologia
linear mltipla (R2=0,97) provou ser um indicador simples para acessar os efeitos de diferentes estresses (pH e metais pesados) e distrbios (ciclos de umedecimento e secagem e de congelamento e descongelamento) aplicados aos solos daquela regio.
Em um mundo globalizado, em que a preocupao com a valorao dos servios ambientais e as barreiras ao comrcio internacional
se tornam cada vez mais evidentes, possvel que, uma vez bem definidos e normatizados, o uso de ndices de qualidade de solo permita
a agregao de valor aos produtos agrcolas oriundos de propriedades rurais/pases que sejam capazes de comprovar que as prticas de
manejo adotadas em suas lavouras permitem a manuteno/melhoria da qualidade do solo, garantindo a preservao desse recurso para
as geraes futuras. Seguindo esse raciocnio, o uso desses ndices
poderia tambm servir como referencial para a valorao das terras
(TTOLA; CHAER, 2002). Vrias agncias reguladoras internacionais tm discutido os padres a serem utilizados nas avaliaes de
qualidade do solo. A ttulo de exemplo, o comit tcnico internacional ISO 190, Qualidade do Solo, props uma lista de 35 parmetros (qumicos, fsicos e biolgicos) como indicadores de qualidade
de solo; o US Environmental Protection Agency (EPA) props uma
lista de 1.800 parmetros como indicadores de qualidade qumica
do solo, enquanto, na Organization for Economic Cooperation and
Development (OECD), esto sendo definidos diversos indicadores
agroambientais (aproximadamente 250, dos quais 58 relacionados
qualidade do solo) (BURNS etal., 2006).
Atualmente, a Nova Zelndia j possui um sistema governamental
online (http://sindi.landcare.cri.nz ) para avaliao da qualidade do
solo, denominado The New Zealand Soil Indicators (SINDI), que utiliza apenas sete parmetros. Os dados obtidos em cada propriedade
rural podem ser comparados, simultaneamente, a um banco de dados
nacional oriundo de 500 solos ou ao melhor conhecimento disponvel
para cada indicador (interpretao do especialista). A Holanda tambm possui um programa de monitoramento da qualidade do solo em
larga escala, onde 200 locais so monitorados (BLOEM etal., 2006). A
rede holandesa para monitoramento da qualidade do solo dividiu os
solos do pas, com seus respectivos usos da terra, em 10 classes. Para
236
cada classe de solo/uso, 20 locais diferentes (repeties) so amostrados. Desde 1997, um grupo de bioindicadores (biomassa, C e N mineralizvel, incorporao de timidina) foi includo no monitoramento
holands. As amostras de solo so coletadas na profundidade de 0 cm
a 10 cm, armazenadas em geladeira (12C) e princubadas a 12C e
50% da capacidade de campo por quatro semanas antes do incio das
determinaes analticas.
Longe da pretenso de representar um consenso, as vrias abordagens utilizadas para o monitoramento da qualidade do solo e para os
clculos de IQS constituem, antes de tudo, subsdios para discusses
tcnicas e filosficas sobre:
a) Quais os atributos (qumicos, fsicos e biolgicos) devem fazer
parte de um conjunto mnimo de dados para avaliar a qualidade do solo.
b) Como padronizar as metodologias utilizadas na sua determinao e os procedimentos para coleta e armazenamento das
amostras de solo.
c) Como ajustar modelos de referncia para cada sistema de
manejo/cultura avaliado, definindo os pesos e valores de cada
funo/indicador nesses modelos e levando em considerao
os aspectos locais, principalmente aqueles relacionados s condies edafoclimticas.
Conforme destacado por Chaer (2001), o estudo da qualidade do
solo implica na avaliao de um grande nmero de caractersticas que,
alm de gerarem um grande volume de dados, geram tambm muitas
dificuldades na interpretao dos mesmos, pois comum a ocorrncia de tendncias divergentes entre os indicadores. A ttulo de exemplo, esse autor cita que, em solos sob vegetao nativa que foram convertidos para agricultura com base em adubaes qumicas e calagem
do solo, a rpida melhoria nos atributos qumicos para o desenvolvimento das plantas cultivadas acompanhada simultaneamente por
uma drstica alterao nos aspectos relacionados biologia do solo,
tais como a reduo do carbono da biomassa microbiana, que no so
passveis de reconstituio no curto/mdio prazo. A compatibilizao
dessas questes, a incluso do componente econmico relacionado
produtividade das culturas nos clculos de IQS e a prpria forma de
237
biotecnologia
utilizao desses ndices so aspectos importantes que tambm devero ser objeto de discusso em estudos futuros. Uma certeza, porm,
permanece, conforme destacado por Mendes e Reis Junior (2004): a de
que a busca por prticas agrcolas que proporcionem altas produtividades, mas que tambm levem em considerao os diversos aspectos
relativos qualidade ambiental uma equao complexa cuja resoluo no pode, definitivamente, negligenciar o componente biolgico
do solo, pois este apresenta uma estreita interrelao com os componentes fsicos e qumicos, os quais iro em conjunto influenciar no
s a produtividade das culturas, mas tambm a sustentabilidade dos
sistemas agrcolas.
Consideraes finais
O futuro da utilizao dos bioindicadores nos estudos de qualidade dos solos brasileiros depende das aes que esto sendo conduzidas hoje. Existe a necessidade de um esforo a nvel nacional
para a realizao de avaliaes sistemticas para se medir e interpretar os parmetros que sirvam adequadamente como bioindicadores, padronizando os mtodos desde a amostragem, a estocagem e o
prtratamento das amostras at os procedimentos analticos e a apresentao dos resultados. Embora j existam atualmente algumas iniciativas nesse sentido no Pas, tais como o Projeto Uso de parmetros microbiolgicos como bioindicadores para avaliar a qualidade
do solo e a sustentabilidade dos agroecossistemas (www.cpac.cnptia.
embrapa.br), a articulao/estruturao de uma rede Rede Brasileira
para Monitoramento da Qualidade de Solos Agrcolas, com arranjo
multiinstitucional e carter transdiciplinar, seria uma forma de agregar todos os especialistas envolvidos no assunto. Esse esforo favoreceria a otimizao dos recursos investidos na pesquisa e auxiliaria
na comparao dos resultados obtidos em diferentes pontos do territrio nacional.
Outra questo referese necessidade da construo de uma base
de dados consistente sobre os atributos biolgicos de diferentes solos
brasileiros, semelhantemente ao banco de dados de 500 solos utilizados pelos pesquisadores neozelandeses para a elaborao do Sindi. A
formao, manuteno e alimentao constante de uma base de dados
238
dessa natureza auxiliariam fortemente na superao de dificuldades

na interpretao dos valores dos bioindicadores, permitindo saber, por
exemplo, quo distantes os valores obtidos esto ou no de um bom
solo, localizado sob condies similares. Outro aspecto que tambm
deve ser considerado o fato de que, num pas de dimenses continentais, como o Brasil, possvel a ocorrncia de variaes regionais,
com relao aos bioindicadores.
Enfim, existe no cenrio atual uma forte demanda de pesquisa
sobre Bioindicadores de qualidade solo, tema complexo, de abrangncia nacional, cujas respostas no podem ser atendidas por projetos de pesquisa isolados. O Brasil possui especialistas com capacidade para responder esses desafios cabendo a ns cientistas do solo,
nossas instituies, rgos governamentais e sociedades cientficas
envidar todos os esforos para tornar esse sonho realidade no mais
breve perodo de tempo.
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Captulo 9
Fixao biolgica de nitrognio:

uma revoluo na agricultura
Ida de Carvalho Mendes
Veronica Massena Reis
Mariangela Hungria
Introduo
Entre os nutrientes minerais essenciais s plantas, o nitrognio
(N) o mais caro, o que consome mais energia para sua produo e,
potencialmente, o mais poluente, sendo geralmente o mais limitante
produo vegetal (HUNGRIA etal., 2007). No entanto, no Brasil, o
uso do nitrognio bem menor quando comparado a outros pases,
o que se deve, em parte, utilizao e busca por sistemas produtivos
que se beneficiem da fixao biolgica do nitrognio (FBN).
A FBN considerada, aps a fotossntese, o mais importante pro
cesso biolgico do planeta, sendo fundamental para vida na terra.
baseada no fato de que alguns microrganismos especiais, conhecidos
como microrganismos fixadores de N2, tambm chamados de diazo
trficos, so capazes de quebrar a tripla ligao que une os dois to
mos de nitrognio atmosfrico (N2), transformandoo em amnia,
que assimilvel pelas plantas. Se a associao entre esses microrga
nismos e as plantas for eficiente, o N fixado pode suprir quase todas
as necessidades do vegetal, dispensando o uso de fertilizantes nitro
genados e oferecendo, assim, vantagens econmicas e ecolgicas.
O exemplo mais conhecido consiste na simbiose de bactrias da
ordem Rhizobiales, denominadas corriqueiramente como rizbios,
com plantas da famlia Leguminosae. Nesse caso, as bactrias diazo
trficas se associam simbioticamente s plantas, formando estrutu
ras especializadas nas razes chamadas ndulos, nos quais ocorre o
processo de FBN. Ainda nos ndulos, amnia sintetizada so rapi
damente incorporados ons hidrognio (H+), abundantes nas clulas
das bactrias, ocorrendo a transformao em ons amnio (NH4+) que
247
biotecnologia
sero, ento, distribudos para a planta hospedeira e incorporados em

diversas formas de N orgnico, como os uredos, aminocidos e ami
das (HUNGRIA etal., 2007).
No so apenas as plantas da famlia das leguminosas que se benefi
ciam da FBN. Estudos iniciados na dcada de 1970 tm mostrado que
valores de 10% a 60% do N acumulado na planta tambm podem ser
provenientes do nitrognio atmosfrico em milho (Zea mays), arroz
(Oryza sativa), canadeacar (Saccharum spp.), algumas gramneas
forrageiras e outras no leguminosas. O N proveniente da FBN nessas
plantas seria derivado, principalmente, de associaes com bactrias
diazotrficas localizadas na regio rizosfrica, ou at mesmo dentro
dos tecidos das razes, colmos e folhas das plantas (bactrias endof
ticas). So conhecidas vrias espcies de bactrias associadas a no
leguminosas, como exemplo, podemos citar aquelas pertencentes aos
gneros Azospirillum, Herbaspirillum e Gluconacetobacter.
Fixao biolgica de nitrognio na soja

Das leguminosas produtoras de gros, a soja a de maior importn
cia econmica e a que recebe maior contribuio da FBN (Figura1).
Para a produo de uma tonelada de gros de soja, com 6,5% de N,
so necessrios, pelo menos, 80kg de N (gros + parte vegetativa).
Considerandose a produtividade mdia de 2.661kg/ha (CONAB,
2009), so necessrios cerca de 200kg de N por hectare. Resultados
experimentais indicam que a FBN contribui com cerca de 85% do N
total acumulado, somado ao N existente no solo, que absorvido pela
planta. Consequentemente, a FBN contribuiu com 170kg de N/ha,
correspondentes a 378kg de uria/ha, pois esse fertilizante contm
45% de N. Com o preo da uria a U$ 600,00/ton (cotao em junho
de 2009), seriam gastos, portanto, U$ 4,9 bilhes para a utilizao
de uria nos 21,6 milhes de hectares cultivados com soja no Brasil
(CONAB, 2009). Contudo, como a eficincia de utilizao do fertili
zante nitrogenado , em mdia, de apenas 50%, devido imobiliza
o microbiana e a possveis perdas por volatilizao de amnia, lixi
viao e desnitrificao, por exemplo, essa economia pode atingir at
U$ 9,8 bilhes/ano. Isso mostra que, alm dos trabalhos de melhora
mento, que resultaram no lanamento de cultivares de alta produti
248
Captulo 9 Fixao biolgica de nitrognio: uma revoluo na agricultura
Foto: Mariangela Hungria
vidade adaptadas aos trpicos, a viabilidade econmica da cultura da

soja, no Brasil, devese tambm ao desses microrganismos que
trabalham de graa para o agricultor.
Figura 1. Ndulos nas razes de soja (Glycine max (L.) Merr.). Dentro dos
ndulos, ocorre o processo de fixao biolgica de N2, pela ao do com
plexo enzimtico da nitrogenase, responsvel pela reduo do N2 atmosf
rico em amnia.
Fonte: Hungria etal., (2007) .
No incio da expanso da cultura da soja no Brasil, nossos solos

no possuam populao estabelecida de rizbios capazes de for
mar uma simbiose eficaz com essas plantas e a qualidade dos inocu
lantes era sofrvel. Nos anos 1970, no antigo Instituto de Pesquisas
Agropecurias do Centro Sul (IPEACS), hoje Embrapa Agrobiologia,
a estirpe de Bradyrhizobium elkanii 29W (=Semia 5019) foi isolada
e inicialmente testada em diversos trabalhos de seleo e adaptao
de estirpes de rizbio (DEPOLLI etal., 2008). Esses trabalhos foram
muito importantes para que o grupo de pesquisadores da Embrapa
249
biotecnologia
Foto: Milton Alexandre Teixeira Vargas
Cerrados, em trabalho conjunto com a UFRGS, selecionasse essa

estirpe para utilizao em inoculantes comerciais para soja (PERES;
VIDOR, 1980). Em 1980, alm da SEMIA 5019, outra estirpe de B.
elkanii, a Semia 587, tambm foi selecionada (VARGAS; SUHET,
1980). Com a incluso dessas duas estirpes nos inoculantes comer
ciais, foi possvel viabilizar o cultivo da soja no Cerrado brasileiro sem
o uso de fertilizantes nitrogenados e com produtividade semelhante
a obtida na regio Sul poca. Treze anos depois do lanamento das
estirpes Semia 5019 e Semia 587, grande parte das reas plantadas
com soja j tinha sido inoculada e apresentavam populao estabe
lecida de Bradyrhizobium, mas a continuidade dos trabalhos culmi
nou com o lanamento, em 1993, de duas estirpes de Bradyrhizobium
japonicum, a CPAC7 (=Semia 5080) e a CPAC15 (=Semia 5079), que
se mostraram mais eficientes que as estirpes lanadas anteriormente
(PERES etal., 1993). Ainda, hoje, so essas as quatro estirpes reco
mendadas para o inoculante comercial de soja no Brasil (Figura2).
Figura 2. Ensaio conduzido em rea de primeiro cultivo de soja, comparando

plantas no inoculadas (primeiro plano) com plantas inoculadas com estir
pes eficientes (segundo plano).
Fonte: Hungria etal., (2007).
Quando a soja comeou a ser cultivada havia o temor, por parte

dos agricultores, de que somente a inoculao no seria suficiente
250
para suprir todo o nitrognio necessrio para alcanar boas produti

vidades. No entanto, vrias pesquisas realizadas na dcada de 1980
demonstraram que, utilizandose um inoculante de boa qualidade, a
prtica da adubao nitrogenada na semeadura da soja era totalmente
desnecessria (VARGAS; SUHET,1980; VARGAS etal., 1982). Mais
recentemente, outros estudos confirmaram que no h a necessi
dade da utilizao de doses de arranque de adubo nitrogenado na
semeadura, visando superar possveis problemas relacionados imo
bilizao do N mineral do solo e (ou) competio inicial com ervas
daninhas, tanto em reas de plantio direto quanto de plantio conven
cional (HUNGRIA etal. 1997; MENDES etal., 2003). No entanto, o
lanamento de cultivares com tetos mais elevados de produtividade e
resultados de pesquisa obtidos nos Estados Unidos evidenciando res
posta da soja inoculada aplicao tardia de nitrognio no prflores
cimento e no incio do enchimento de gros voltaram a gerar dvidas
sobre a necessidade de adubar a soja brasileira com nitrognio. Diante
disso, uma srie de experimentos foi conduzida nos ltimos anos
pela Embrapa Cerrados e pela Embrapa Soja, reforando, mais uma
vez, os benefcios econmicos que resultam da substituio dos fer
tilizantes nitrogenados pela inoculao com rizbio e indicando que
no existe razo para a utilizao desses insumos em nenhum est
gio do cultivo da soja no Brasil (HUNGRIA etal., 2006a; HUNGRIA
etal., 2006b; MENDES etal., 2008).
Outra questo importante e que geralmente motivo de debates
trata da necessidade de reinoculao, ou seja, a inoculao de reas
que j foram inoculadas anteriormente. Quanto a essa questo, os
resultados de pesquisa tm mostrado que vantajoso inocular as reas
de produo de soja a cada safra e que os incrementos mdios na pro
duo de gros giram em torno de 8% (HUNGRIA etal. 2006a).
Considerandose todos os benefcios advindos dos estudos brasi
leiros em FBN, e que o potencial gentico de rendimento da soja de
8mil quilos por hectare (SPECHT etal., 1999), as abordagens de pes
quisa devem priorizar a realizao de projetos que permitam o apri
moramento contnuo desse processo. Assim, devese garantir que as
novas cultivares de soja estabeleam simbioses altamente eficazes no
processo de FBN (NICOLS etal., 2006), inclusive no caso de mate
251
biotecnologia
riais transgnicos. Em relao s estirpes, o bem sucedido programa

de seleo deve continuar, mas acelerado pelo uso de marcadores
moleculares (BARCELLOS etal., 2007). Estudos de ecologia dos riz
bios tambm devem ser complementados, uma vez que taxas elevadas
de recombinao gnica e de transferncia horizontal de genes, entre
estirpes inoculantes e rizbios nativos, foram observadas em nossos
solos (BARCELLOS etal., 2007; BATISTA etal., 2007), e podem afe
tar, no futuro, as respostas inoculao. Finalmente, necessrio dar
continuidade ao desenvolvimento e validao de novos inoculantes
e tecnologias de inoculao, dos quais se pode citar como exemplo
a inoculao no sulco, para a compatibilizao com o tratamento de
sementes com fungicidas e o enriquecimento das sementes em moli
bdnio (CAMPO etal., 2002). fundamental o contnuo aprimora
mento das pesquisas em fixao biolgica do nitrognio para que se
evite a necessidade futura de adubao suplementar com nitrognio
na cultura da soja.
Fixao biolgica de nitrognio no feijoeiro

Principal fonte de protenas para a populao brasileira, o feijoeiro
uma planta que tambm se beneficia do processo da FBN (Figura3).
Em relao filogenia das bactrias capazes de nodular o feijoeiro,
at 1984 estava definida uma nica espcie, Rhizobium leguminosa
rum bv. phaseoli (JORDAN, 1984). Contudo, com o avano nas tc
nicas de biologia molecular, foi possvel definir mais quatro novas
espcies e biovares: R. tropici tipo IIA e IIB (MARTNEZROMERO
etal., 1991), R. etli bv. phaseoli (SEGOVIA etal., 1993), R. gallicum
(bv. phaseoli e bv. gallicum) e R. giardinii (bv phaseoli e bv. giardi
nii) (AMARGER etal., 1997). Estirpes pertencentes a outros gneros,
como Sinorhizobium e Mesorhizobium, bem como estirpes sem posi
o taxonmica conhecida, podendo representar novas espcies, tam
bm tm capacidade de formar ndulos em associao com o feijoeiro
(GRANGE; HUNGRIA, 2004).
Ao contrrio da soja, existem estirpes de rizbio nativas nos solos
brasileiros capazes de nodular o feijoeiro (MERCANTE etal., 1998;
STRALIOTTO etal., 1999; ANDRADE etal., 2002; GRANGE etal.,
2007) e que, geralmente, so de baixa eficincia fixadora (GRANGE
252
Foto: Jos Roberto Rodrigues Peres
etal., 2007). Essa presena nos solos brasileiros de estirpes nativas

capazes de nodular o feijoeiro um dos principais motivos que podem
prejudicar o sucesso da inoculao. Vargas etal. (2000) observaram
que o cultivo sucessivo do feijoeiro em uma mesma rea favoreceu
o aumento de populaes nativas dessa bactria, capazes de compe
tir com as estirpes selecionadas, introduzidas atravs da inoculao.
Dessa forma, observase a importncia da seleo de estirpes que,
alm de elevada eficincia fixadora, tambm possuam uma maior
capacidade competitiva e de estabelecimento nos solos cultivados.
Entre outros fatores limitantes para um bom desempenho das plan
tas inoculadas, podem ser citados a susceptibilidade do feijoeiro ao
estresse hdrico (PERES etal., 1994), a variabilidade de resposta das
diferentes cultivares inoculao (DBEREINER; RUSCHEL, 1961;
PERES etal., 1994) e a instabilidade gentica de algumas estirpes
devido a ocorrncia de rearranjamentos genmicos e a perda de plas
mdeos (HUNGRIA; ARAUJO, 1995).
Figura 3. Resultados da inoculao do feijoeiro com rizbio sob condies

controladas em casa de vegetao.
Fonte: Mendes etal., (2007) .
Por todas essas razes, a resposta do feijoeiro inoculao, em con

dies de campo, tem apresentado resultados que variam em fun
o do solo, da cultivar e do histrico de cultivo da rea (Figura4).
Ausncias de respostas inoculao foram observadas na dcada de
1980, por Pereira etal. (1984) e Ramos e Boddey (1987). Entretanto,
sob condies irrigadas, em um solo Gley Humico de vrzea sem
populaes nativas de rizbio, Mendes etal. (1994) reportaram ganhos
253
biotecnologia
Foto: Ida de Carvalho Mendes
de at 1,5 mil quilos por hectare em relao testemunha no ino

culada em cultivares responsivas inoculao (esses ganhos foram
semelhantes aos obtidos com 100kg N/ha). Peres etal. (1994) obser
varam, sob condies de sequeiro, em latossolos de Cerrado de pri
meiro cultivo de feijoeiro, ou seja, apresentando baixas populaes
nativas de rizbios, que as respostas em termos de ganhos mdios
de produtividade foram menores que as obtidas sob condies irri
gadas e variaram de 63 a 290kg/ha, em relao aos tratamentos sem
inoculao (mdias de trs anos de experimentao). Hungria etal.
(2003) obtiveram, no Paran, respostas expressivas a inoculao, com
ganhos mdios, em seis experimentos, de 450kg gros/ha, utilizando
as estirpes de R. tropici CPAC H12 e CPAC H20. As produtividades
obtidas com a inoculao foram comparadas a das plantas que rece
beram 60kg de N/ha.
Figura 4. Diferenas entre plantas inoculadas e plantas no inoculadas, em

condies de campo.
Fonte: Mendes etal. (2007)
Os trabalhos com R. tropici dentro dos programas de seleo de estir

pes conduzidos no Brasil so baseados no fato de que essa esp
cie apresenta maior tolerncia acidez e a temperaturas elevadas,
254
assim como maior estabilidade gentica em comparao com outras

espcies que nodulam o feijoeiro (MARTNEZROMERO etal.,
1991; HUNGRIA etal. 1993, 2000, 2003; MICHIELS etal., 1994).
Atualmente, trs estirpes so autorizadas para a fabricao de inocu
lante comercial no Brasil, a Ciat 899 (=Semia 4077), isolada pelo Ciat,
na Colmbia; a PRF 81(=Semia 4080), isolada no Paran pelo Iapar e
pela Embrapa Soja, e que permitiu ganhos de at 906kg/ha em rela
o ao controle noinoculado (Hungria et al, 2000); e a CPAC H12
(=Semia 4088), isolada no Distrito Federal (MOSTASSO etal., 2002;
HUNGRIA etal., 2003).
Embora vrias pesquisas realizadas no Brasil tenham mostrado res
postas expressivas inoculao do feijoeiro em condies de campo,
o nvel de adoo dessa tecnologia, especialmente entre os agricul
tores familiares, ainda muito baixo. Na safra 2006/2007 (feijo das
guas), a inoculao do feijoeiro foi testada em 11 lotes de assentados
da reforma agrria, em Una, MG (MENDES etal., 2007). Foi obser
vado que, na mdia, em relao ao tratamento controle no inoculado,
a produtividade do feijo com inoculao aumentou em 209kg/ha
para a cultivar Requinte (grupo do feijo carioca) e em 128kg/ha
para a cultivar Diamante Negro (grupo do feijo preto). Na cultivar
Requinte, o rendimento obtido com 120kg de ureia (858kg/ha) foi
semelhante ao obtido com a inoculao (875kg/ha). J na cultivar
Diamante Negro, o rendimento obtido com a uria (934kg/ha) foi
maior. Entretanto, importante destacar que o custo do adubo nitro
genado na safra 2006/2007 foi de R$ 90,00, enquanto o custo do ino
culante foi de R$ 6,00. Para o pequeno agricultor, essa diferena de
preos muito significativa, principalmente em se tratando do cultivo
do feijo das guas onde fatores climticos podem afetar o desempe
nho da cultura. Ou seja, em alguns casos, o ganho com a inoculao
pode ser menor que o ganho obtido com o adubo nitrogenado, mas,
como o inoculante custa menos, o risco associado ao seu uso tambm
menor, principalmente nos casos em que as chances de ocorrer que
bras de produo por fatores adversos so elevadas.
Podese afirmar que FBN nessa cultura realmente importante,
pois se estima que mesmo as estirpes nativas possam contribuir com
at 40% do N presente na planta. A adoo da tcnica de inoculao
255
biotecnologia
com estirpes selecionadas pela pesquisa, aliada ao uso de cultivares

melhoradas, tcnicas de manejo integrado de pragas e doenas e de
correo e adubao do solo podero, no mnimo, duplicar a mdia de
produtividade nacional a um baixo custo para o agricultor.
Fixao biolgica de nitrognio

em outras leguminosas
Ainda na famlia das leguminosas, as espcies forrageiras, arbusti
vas e arbreas, fixadoras de nitrognio, assumem papis importantes,
seja na produo de alimentos, ou na produo de forragem, madeira,
lenha, carvo e na recuperao de reas degradadas, entre outros.
Diversas leguminosas produtoras de gros utilizados na alimenta
o humana, que se beneficiam da FBN, ainda podem ser citadas. O
feijocaupi ou feijodecorda (Vigna unguiculata) um desses exem
plos. Sendo um componente importante dos sistemas de produo da
regio semirida brasileira, essa cultura, geralmente, apresenta baixos
nveis de FBN quando noduladas por estirpes nativas. Recentemente,
porm, a seleo de estirpes eficientes e adaptadas s condies regio
nais culminou com o lanamento da estirpe BR 3267, que possibili
tou incrementos de produtividade de at 40% em condies expe
rimentais e de at 52% nas reas de agricultores experimentadores
(RUMJANEK etal., 2006).
Trabalhos conduzidos na dcada de 1980, por exemplo, demons
traram que a ervilha poderia ser cultivada sem a utilizao de adu
bos nitrogenados, quando inoculada com estirpes selecionadas de
Rhizobium leguminosarum biovar viceae. Nesses trabalhos, os ganhos
com a inoculao variaram de 63% a 240% em relao testemunha.
O rendimento de gros das plantas inoculadas atingiu valores de at
3.500kg/ha e foram iguais ou superiores aos obtidos com a utilizao
de 80kg de N fertilizante/ha (VARGAS etal., 1994).
A resposta da lentilha inoculao, principalmente em solos onde
no existe populao estabelecida de R. leguminosarum biovar viceae,
foi demonstrada nos trabalhos de Khumar etal. (1988) e Bhattacharyya
e Sengupta (1981). No Brasil, isolados de Rhizobium obtidos em solos
de Cerrados anteriormente cultivados com lentilha, foram seleciona
256
dos e apresentaram alto potencial de fixao de N2 (VARGAS etal.,

1994). Alm de propiciar menor custo de produo, a inoculao pro
moveu ganhos adicionais de at 873 kg/ha de gros em relao ao tra
tamento com 60kg Nfertilizante/ha (VARGAS etal., 1994).
Outros estudos mostraram o potencial das plantas de grodebico
para obteno de quantidades significativas de N via FBN. Em ava
liaes de quantificao da FBN, utilizando os mtodos de diluio
isotpica de 15N ou abundncia natural de 15N, Doughton etal. (1995)
afirmaram que essas plantas podem obter mais de 100kg de N/ha. A
seleo de estirpes de Rhizobium que se associam com essas plantas
pode ser uma estratgia interessante visando uma maior eficincia
da FBN. No trabalho de CleyetMarel etal. (1990), foram demonstra
das diferenas entre estirpes de bactria quanto habilidade de for
necer N para as plantas.
Em relao ao uso de leguminosas forrageiras, por exemplo, dados
experimentais indicam que pastagens com uma composio botnica
contendo, aproximadamente, 30% de leguminosas consorciadas com
gramneas seriam suficientes para manter a produtividade vegetal e
animal, assim como a fertilidade do solo no longo prazo (THOMAS,
1992; CADISH etal., 1994). Alm de incorporarem N, fixado sim
bioticamente, as leguminosas ainda contribuem efetivamente para a
produo e sustentabilidade dos sistemas de pastejo, especialmente
em regies com limitaes ambientais. Diversos trabalhos com pas
tagens consorciadas mostram sua superioridade quando comparadas
s pastagens puras de gramneas. Em um estudo realizado em rea
de Cerrado, no consrcio de Brachiaria ruziziensis com a leguminosa
forrageira Stylosantis guianenensis, a produo vegetal e animal da pas
tagem consorciada foi bem superior da pastagem em monocultura
(AYARZA etal., 1997). Zimmer e Correa (1993) tambm mostraram
o efeito positivo da consorciao de leguminosas em pastagens, con
cluindo que, com a presena da leguminosa em consrcio, depen
dendo do manejo aplicado, os resultados se equiparam a pastos de
gramnea pura adubados com at 100 kg N/ha.
Em condies de solos cidos e de baixa fertilidade dos Cerrados,
as leguminosas que mais tm persistido em consrcio com
Brachiaria so o Calopogonium muconoides, Stylosanthes guianensis
257
biotecnologia
cvs. Bandeirante e Mineiro, S. macrocephala cv. Pioneiro e Arachis

pintoi (VALLE etal., 2000). Infelizmente, apesar de todos os resulta
dos positivos, na prtica o uso da consorciao continua sendo pouco
significativo. Em geral, o fracasso na utilizao de pastagens consor
ciadas atribudo falta de persistncia das leguminosas nas pasta
gens, exigncia de melhor manejo que pastagens de gramneas puras,
necessidade de solos mais frteis, susceptibilidade a doenas provo
cadas por fungos e nematoides ou, ainda, pelas leguminosas no se
adaptarem s regies de implantao.
A utilizao de leguminosas arbreas nos programas de recupera
o de reas degradadas outro exemplo de sucesso onde a FBN tem
papel de destaque. O uso de leguminosas nativas ou introduzidas,
como Acacia spp., Albizia spp. e Mimosa spp., entre outras, em asso
ciao com bactrias diazotrficas selecionadas pela pesquisa e fungos
micorrzicos, tem sido preconizado para a revegetao de solos depau
perados, com o objetivo de restabelecer sua fertilidade (FRANCO;
FARIA, 1997). A interao entre as plantas e os microrganismos per
mite um rpido crescimento das espcies tornandoas mais tolerantes
aos estresses ambientais (FRANCO; BALIEIRO, 2000), o que propcia
um incremento do contedo de matria orgnica e da atividade biol
gica do solo por meio do aporte de material orgnico via serrapilheira.
Os BetaRizbios
Entre as pesquisas atuais envolvendo a simbiose entre bactrias
diazotrficas e leguminosas, devem ser citados os estudos que ajuda
ram a dissolver a velha idia de que apenas Rhizobium e seus relati
vos poderiam formar ndulos e fixar nitrognio em associao com
essas plantas. H alguns anos, acreditavase que as leguminosas eram
noduladas, exclusivamente, por membros das proteobactrias. Essas
bactrias seriam pertencentes a alguns gneros relacionados ordem
Rhizobiales, o que inclui Allorhizobium, Azorhibium, Bradyrhizobium,
Mesorhizobium, Rhizobium e Sinorhizobium (YOUNG, 1996). Em estu
dos recentes, entretanto, um nmero de outras proteobactrias
foram mostradas como noduladoras de leguminosas (MOULIN
etal., 2002) incluindo estirpes de Methylobacterium (SY etal., 2001),
Blastobacter (VAN BERKUN; EARDLY, 2002) e Devosia (RIVAS
258
etal., 2002). Alm disso, tambm foram descobertos membros das

proteobactrias em ndulos de leguminosas tropicais e passaram
imediatamente a serem conhecidos como os rizbios (MOULIN
etal., 2002).
Entre os rizbios, bactrias da espcie Cupriavidus taiwanensis
foram isoladas de ndulos de Mimosa pudica e M. diplotricha, nos tra
balhos desenvolvidos por Chen etal. (2001) e Verma etal. (2004). Em
um trabalho com espcies vegetais coletadas na frica do Sul e Guiana
Francesa, Moulin etal. (2001) tambm isolaram, a partir dos ndulos
das leguminosas Aspalathus carnosa e Machaerium lunatum, estirpes
de bactrias que pertencem ao gnero Burkholderia, includo na sub
diviso das proteobactrias. Outras estirpes de Burkholderia tam
bm foram isoladas de ndulos de Mimosa casta, M. pellita, M. pudica
e Abarema macradenia, no Panam (BARRET; PARKER, 2005). Chen
etal. (2005) apresentaram um estudo em que 20 estirpes isoladas de
ndulos de vrias espcies de Mimosa na Amrica do Sul foram classi
ficadas como pertencentes ao gnero Burkholderia e so intimamente
relacionadas com outras espcies nodulantes deste gnero, como B.
caribensis, B. phymatum e B. tuberum. Algumas dessas estirpes foram
descritas como novas espcies dentro do gnero Burkholderia, como
B. mimosarum e B. nodosa (CHEN etal., 2006, 2007). Na Figura 5, so
apresentados alguns exemplos que comprovam a existncia de sim
biose entre as leguminosas do gnero Mimosa com os rizbios.
259
Foto: Euan Kevin James (Universidade de Dundee )
biotecnologia
Figura 5. (A) Ndulos de Mimosa pigra inoculados com uma estirpe de

Burkholderia sp. marcada com o gene gfp (green fluorescent protein); (B)
Ndulos de Mimosa pigra inoculados com uma estirpe de Burkholderia mar
cada com o gene gfp sob fluorescncia; (C) Microscopia Confocal Laser mos
trando o incio do processo de nodulao (encurvamento do plo radicular)
em Mimosa pudica inoculada com Cupriavidus taiwanensis; (D) Microscopia
Confocal Laser de bacterides (Burkholderia sp.) expressando o gene gfp em
ndulo de Mimosa pellita .
Fonte: Reis Junior etal.( 2006).
Em uma parceria com pesquisadores de diferentes unidades da

Embrapa e universidades brasileiras e do Reino Unido, foi desenvol
vido um projeto para o estudo da ocorrncia e capacidade simbitica
de rizbios associados com plantas nativas pertencentes ao gnero
Mimosa, do qual o Cerrado o maior centro de diversidade. Os resul
260
tados obtidos at o presente momento indicam que a nodulao nes

sas plantas decorrente, em sua grande maioria, da simbiose com
bactrias do gnero Burkholderia e que a fixao biolgica promovida
por essa interao, provavelmente, valiosa para a ciclagem do N no
Bioma Cerrado (REIS JUNIOR etal., 2006, 2009).
Na maior parte dos casos, os rizbios foram encontrados em asso
ciao com leguminosas da subfamlia Mimosoideae. No entanto,
novas descobertas sugerem que a nodulao de leguminosas por essas
bactrias parece ser muito mais ampla do que era imaginado inicial
mente. Como exemplo, nos trabalhos de Garau etal. (2009) e Beukes
etal. (2009), foram encontradas bactrias do gnero Burkholderia
em simbiose com plantas de gneros diversos, como Rhynchosia,
Podalyria, Virgilia, Cyclopia e Hypocalyptus.
Fixao biolgica de nitrognio em

gramneas e outras no leguminosas
Diferentemente dos rizbios em simbiose com leguminosas, as
bactrias diazotrficas associadas a gramneas, entre outras plan
tas, no formam ndulos e localizamse preferencialmente na regio
rizosfrica, na superfcie das razes ou at mesmo dentro dos teci
dos de razes, colmos e folhas, quando so conhecidas como bact
rias endfitas ou endofticas (Figura6). O termo endfito era utili
zado, originalmente, referindose colonizao interna das razes por
microrganismos (bactrias e fungos) que normalmente no causam
danos a planta hospedeira e vivem a maior parte de suas vidas no inte
rior dos tecidos dos vegetais sem promover sintomas de patogenici
dade (PEREIRA, 1995). Kloepper e Beauchamp (1992) classificaram
como endfitos os microrganismos que colonizavam o interior das
razes e promoviam benefcios as plantas. Dbereiner (1992) esten
deu o termo endfito para as bactrias diazotrficas, tendo em vista
a habilidade de algumas bactrias de gneros como Herbaspirillum e
Gluconacetobacter de colonizarem o interior dos vegetais, e apresen
tarem uma baixa capacidade de sobrevivncia no solo.
261
Fotos: Fbio Bueno dos Reis Junior
biotecnologia
Figura 6. Fotomicrografias de microscopia eletrnica de varredura mostrando

a colonizao de Gluconacetobacter diazotrophicus em uma juno de raiz late
ral (A) e nos espaos intercelulares do parnquima cortical (B) de plntulas
de canadeacar .
Fonte: Reis Junior (1998).
A ocorrncia de bactrias no interior das plantas assume um car

ter ecolgico muito importante, j que essas bactrias recebem os
nutrientes diretamente no interior do vegetal, sem sofrer estresses
ou competio com outros organismos do solo. Alm disso, prova
velmente, podem colonizar stios onde o acesso de O2 restrito, no
tendo assim problemas de inibio da atividade da nitrogenase (com
plexo enzimtico responsvel pela FBN, que sensvel ao O2). Em con
trapartida, a bactria pode prontamente disponibilizar o nitrognio
fixado e outras molculas promotoras de crescimento para as plantas
(DBEREINER etal., 1995a; BALDANI etal., 1997). No entanto, a
contribuio das bactrias de vida livre no solo ou rizosfera no deve
ser subestimada, devido a seu alto nmero e diversidade encontrados
(BALDANI; BALDANI, 2005).
Bactrias diazotrficas associativas, dos mais diferentes gneros e
espcies, tm sido relatadas em associao com um grande nmero de
plantas no leguminosas, tanto em clima tropical como em clima tem
perado. Diversos estudos tm mostrado que essas bactrias, de ocorrn
cia natural nos solos, podem ser responsveis por boa parte do N neces
srio para a nutrio das plantas (BODDEY; DBEREINER, 1995).
Alm da FBN, a maioria das bactrias diazotrficas em associa
o com plantas no leguminosas tambm conhecida pela sua
capacidade de produzir hormnios de crescimento, tais como auxi
nas, giberelinas e citoquininas (FUENTESRAMREZ etal., 1993;
262
Fotos: Fbio Bueno dos Reis Junior
HARTMANN; ZIMMER, 1994; BASHAN; HOLGUIN, 1997;

BASTIN etal., 1998; RADWAN etal., 2002). A produo dessas subs
tncias promotoras de crescimento pode estimular o aumento na den
sidade de pelos radiculares, da taxa de aparecimento de razes secun
drias e da superfcie radicular quando as plantas so colonizadas por
essas bactrias (Figura7). Esse incremento resulta numa melhora da
absoro de gua e nutrientes aumentando, assim, a capacidade da
planta de produzir e suportar estresses ambientais (BALDANI etal.,
1983; LIN etal., 1983; KAPULNIK etal., 1985; KAPULNIK etal., 1987).
Sem inoculao
Inoculado com
H. seropedicae
Figura 7. Efeito da inoculao com H. seropedicae sobre o desenvolvimento

de razes de plntulas de canadeacar .
Fonte: Reis Junior (1998).
263
biotecnologia
Fixao biolgica de nitrognio

em gramneas forrageiras
A primeira associao entre uma gramnea forrageira tropical e
bactrias fixadoras de nitrognio, estudada detalhadamente, foi a des
crita entre Paspalum notatum e Azotobacter paspali (DBEREINER;
CAMPELO, 1971). Boddey etal. (1983), utilizando a tcnica de dilui
o isotpica de 15N, demonstraram que P. notatum cv. Batatais con
seguiu obter aproximadamente 10% do seu N (20kg N/ha/ano) via
fixao biolgica. Evidncias da FBN em outras gramneas forragei
ras continuaram sendo apresentadas, como nos casos de Cynodon
dactylon (DBEREINER; DAY, 1975), Digitaria decumbens (DEPOLLI
etal., 1977), Panicum maximum (MIRANDA etal., 1990) e Pennisetum
purpureum (QUESADA, 2001), entre outras.
Em Brachiaria, mesmo com as observaes de perdas de N do solo,
existem relatos na literatura indicando que alguns gentipos no apre
sentam redues significativas em sua produtividade. Essas perdas
de N poderiam estar sendo compensadas pela FBN que, pelos pou
cos estudos disponveis, poderia ser responsvel pela introduo de
30 a 45kg de N/ha/ano no sistema soloplanta (BODDEY; VICTORIA,
1986; LOUREIRO; BODDEY, 1988). Os estudos para a quantificao
da FBN efetuados por Boddey e Victoria (1986) demonstraram que
as espcies B. decumbens e B. humidicola receberam uma quantidade
de N via FBN bem mais significante que aquelas apresentadas por B.
radicans e B. ruziziensis. Os resultados de Loureiro e Boddey (1988)
tambm sugerem uma maior contribuio da FBN para a espcie B.
humidicola.
Embora esses estudos tenham mostrado que as contribuies da
FBN no ultrapassaram 30% a 40% do N acumulado pelas plantas,
possvel que, para sistemas de manejo mais extensivos onde as vias
de perdas so menos expressivas, a quantidade de N fixado seja sufi
ciente para proporcionar um balano nulo ou at positivo de N para
o sistema soloplanta e com isso permitir uma maior longevidade da
pastagem com uma produtividade em nvel aceitvel.
264
Fixao biolgica de nitrognio na canadeacar

O Brasil o maior produtor mundial de canadeacar com, apro
ximadamente, nove milhes de hectares cultivados e produo anual
girando em torno de 690 milhes de toneladas (IBGE, 2009). Essa cul
tura altamente exigente em N e, para alcanar uma produtividade de
100 Mg de colmos por ha, acumula em sua parte area 120 a 250kg
de nitrognio (XAVIER, 2002). Resultados de pesquisa mostram que
at 60% do N exigido pela cultura pode ser oriundo da FBN (BODDEY
etal., 2001; POLIDORO etal., 2001), valor esse que dependente do
gentipo da planta, de sua interao com bactrias diazotrficas e
caractersticas edafoclimticas das reas de plantio. J na dcada de
1950, a pesquisadora da Embrapa, Dra. Johanna Dbereiner, havia
isolado algumas espcies de bactrias diazotrficas associadas
cana (DBEREINER, 1961). O avano desses estudos permitiu que,
hoje, sejam conhecidas diversas espcies de bactrias, pertencentes
a gneros distintos, com destaque para Azospirillum, Herbaspirillum,
Gluconacetobacter e Burkholderia.
Boddey (1995) sugere que a caracterstica de obteno de signi
ficativas contribuies da FBN, presente em variedades brasileiras
de canadeacar, pode ser devida aos processos de melhoramento
e seleo feitos sob condies de baixa disponibilidade de N. Como
exemplo, no estudo de Coelho etal. (2003), as variedades do grupo
das RBs (RB 739735, RB 758540 e RB 835089) foram as que mais se
destacaram, obtendo maior contribuio da FBN. Provavelmente isso
se deve ao fato de que essas variedades foram melhoradas em solo
com pouco N e, naturalmente, terem sido selecionadas para alta efi
cincia fixadora.
Algumas medidas tambm poderiam ajudar a maximizar as contri
buies da fixao biolgica de nitrognio para a cultura da cana. Entre
essas medidas est a aplicao do micronutriente molibdnio, espe
cialmente em solos cidos, onde sua disponibilidade prejudicada
(BODDEY etal., 2003). Alguns estudos mostraram resultados onde,
mesmo em solos pobres, a FBN pode ajudar a cultura a alcanar produ
es prximas ao dobro da mdia atual de produtividade, se os outros
nutrientes forem supridos de acordo com as necessidades mostra
das pela anlise do solo e se a tecnologia for adequada, usando, entre
outras, a aplicao de molibdnio e irrigao (URQUIAGA etal., 1998).
265
biotecnologia
Inoculantes de bactrias diazotrficas para no leguminosas

Diante da comprovao de que bactrias diazotrficas associadas a
plantas no leguminosas possuam a capacidade de fixar o N2 atmos
frico e produzir outras substncias promotoras de crescimento, logo
surgiram os primeiros estudos buscando avaliar os benefcios da ino
culao dessas plantas com estirpes de bactrias selecionadas pela
pesquisa. Avaliaes de experimentos com inoculao, feitos prin
cipalmente com Azospirillum, mostraram que esses organismos so
capazes de promover incrementos na produtividade de importantes
culturas em diferentes situaes de solo e clima. Entre 60% e 70%
dos experimentos levantados por Okon e LabanderaGonzalez (1994)
apresentaram resposta positiva inoculao com Azospirillum com
aumentos no rendimento estatisticamente significativos na ordem
de 5% a 30%. Utilizando a estratgia de combinar a inoculao com
a aplicao de fertilizantes nitrogenados, constatouse a possibili
dade de substituio de at 40% da dose recomendada de nitrognio
para a cultura do milho e, no caso do trigo e aveia, at 30% (OKON;
LABANDERAGONZALEZ, 1994). Sumner (1990), em outro estudo
sobre inoculao de cereais, observou que 32 ensaios apresentaram
respostas positivas inoculao, enquanto outros sete (a maioria com
trigo) mostraram resultados negativos na produo de gros.
Embora ainda no se constitua em prtica agrcola consoli
dada, principalmente no Brasil, inoculantes comerciais con
tendo A. brasilense foram lanados no mercado mundial (OKON;
LABANDERAGONZALEZ, 1994). Nos Estados Unidos, um produto
com o nome de AzoGreenTM foi produzido pela companhia Genesis
Turfs Forages e recomendado para aumentar o vigor da semente, esta
belecimento do sistema radicular, resistncia a geada e uma melhoria
geral da sade da planta (REIS, 2007). Na Itlia, Alemanha e Blgica
foi desenvolvido um produto contendo uma mistura de A. brasilense
(estirpe Cd) e A. lipoferum (estirpe Br17) comercializado na forma de
mistura com vermiculita ou em forma lquida. O nome comercial
desse produto ZeaNitTM, produzido pela companhia Heligenetics.
Segundo os fabricantes, esse produto reduziria a aplicao do nitro
gnio necessrio cultura em 30% a 40% (REIS, 2007). Na Frana,
foi lanado outro produto base de Azospirillum, estirpe CRT1. O
266
uso desse inoculante, em um experimento com milho na Estao

de Agbasar, a nordeste de Togo na frica, promoveu aumentos de
100% na produo de gros (FAGES; MULARD, 1988). No Mxico,
foi desenvolvido, pela Universidade de Puebla, um inoculante a base
de Azospirillum que tem sido usado com sucesso nas culturas de
milho trigo e cevada. Ainda no Mxico, a empresa Asia (Assessoria
Integral Agropecuria S.A.) comercializa um produto para milho e
sorgo e outro para trigo e cevada, contendo uma mistura de estirpes
de A. brasilense (REIS, 2007). Na Argentina, foi lanado um produto
denominado GraminanteTM, base de p de carbonato de clcio, con
tendo uma mistura de estirpes de Azospirillum. Os fabricantes infor
mam que o produto pode aumentar a produo de gros em cerca
de 20% (REIS, 2007). Na ndia, vrias indstrias produzem biofer
tilizantes contendo Azospirillum para diversas culturas e at mesmo
Gluconacetobacter para canadeacar (REIS, 2007).
No Brasil, diversos estudos tm mostrado resultados tanto interes
santes quanto promissores. No trabalho de Pereira e Baldani (1995), a
inoculao de sementes de arroz com Herbaspirillum seropedicae pro
moveu incrementos na produtividade das plantas equivalentes aos
obtidos com a dose de 40kg de N/ha. Guimares etal. (2000) tam
bm mostraram incrementos significativos na produtividade de arroz
quando inoculado com Herbaspirillum, no entanto as respostas eram
dependentes das cultivares avaliadas. Guimares etal. (2003) mostra
ram que a inoculao de arroz com a estirpe ZAE 94, de H. seropedicae,
proporcionou aumento da produo de gros da variedade Guarani
em mais de 50% sob condies de sequeiro, mostrando potencial
dessa estirpe como inoculante. A inoculao dessa mesma bactria
em sementes de milho tambm contribuiu significativamente para o
aumento do rendimento de gros no hbrido BRS 1010, ao passo que
na variedade BRS 4157 este efeito no foi observado (ZILLI etal., 2007).
A Embrapa Soja e a UFPR realizaram um trabalho de validao
de estirpes de Azospirillum brasilense para as culturas do milho e do
trigo. Obedecendo a todos os critrios da legislao brasileira para
inoculantes, foram testadas e selecionadas as estirpes que apresenta
ram melhor crescimento e sobrevivncia no solo, maior promoo de
crescimento das plantas e maior adaptao s tecnologias utilizadas
267
biotecnologia
nessas culturas. Os resultados de ensaios a campo, totalizando cinco

safras, foram consistentes e resultaram em incrementos mdios de
25% a 30% no rendimento do milho e de 8% a 11% no rendimento do
trigo. Seis estirpes de A. brasilense comprovaram a eficincia agron
mica e passaram a serem autorizadas para a produo de inoculantes
comerciais (HUNGRIA etal., 2006c). Como resultado dessa pesquisa,
uma grande novidade foi o lanamento e a comercializao do pri
meiro inoculante para milho do mercado brasileiro. Os fabricantes do
Masterfix GramneasTM, que chegou as lojas na segunda quinzena de
julho de 2009, apontam um potencial para economia de at 50% na uti
lizao de fertilizantes nitrogenados industriais (AGROLINK, 2009).
A canadeacar naturalmente colonizada por bactrias diazo
trficas, no entanto trabalhos recentes tm mostrado o potencial da
inoculao dessas plantas com bactrias selecionadas pela pesquisa.
Sevilla etal. (2001) mostraram que plantas, quatro meses aps terem
sido inoculadas com a estirpe padro de G. diazotrophicus (PAL5),
apresentaram produtividade 40% maior que as plantas no inocu
ladas. Em experimentos de campo onde foram utilizadas misturas
com as bactrias Gluconacetobacter diazotrophicus, Herbaspirillum sero
pedicae, Herbaspirillum rubrisubalbicans, Azospirillum amazonense e
Burkholderia tropica, foram observados incrementos de at 24,7% na
produtividade e 31,4% na produo de matria seca das plantas ino
culadas, que tambm obtiveram at 42,7% do N acumulado prove
niente da fixao biolgica, dependendo do tipo de solo, do gentipo
da planta e da combinao de bactrias utilizada como inoculante
(OLIVEIRA etal., 2006).
Diante da persistncia dos efeitos benficos da inoculao obser
vada por Oliveira etal. (2006), os autores desse trabalho foram estimu
lados a levar em considerao a recomendao dessa tecnologia para
uso futuro pelos produtores de cana brasileiros. Como desdobramento
dos resultados alcanados nesse estudo, a Embrapa Agrobiologia lan
ou, em maio de 2008, o inoculante desenvolvido para a cultura da
canadeacar. Por enquanto, o produto vem sendo utilizado em reas
experimentais e avaliado em usinas produtoras de lcool e acar
espalhadas pelo Pas. A princpio, a utilizao da inoculao tem como
principal impacto a substituio de parte do N utilizado na cana de
268
primeiro ano. Os resultados tm mostrado que, com o uso do inocu

lante, cerca de 30kg de N/ha/ano podem deixar de ser aplicados. As
estirpes de bactrias que fazem parte do inoculante j foram repas
sadas para quatro empresas que se mostraram interessadas e partici
param de edital para o desenvolvimento do produto comercial (REIS
JUNIOR; REIS, 2009).
Apesar dos resultados animadores, a utilizao de inoculantes con
tendo essas bactrias como uma prtica usual na agricultura requer
anlise crtica cuidadosa devido alta variabilidade observada, geral
mente, na resposta de plantas de diferentes gentipos sob condies
edafoclimticas distintas (OLIVEIRA etal., 2006). Sabese que as
associaes ocorrem em diferentes graus de interao e, em muitos
casos, esto relacionadas especificidade das caractersticas genticas
dos microrganismos e da planta hospedeira (BASHAN; HOLGUIM,
1997). De fato, as razes para a variabilidade de resposta da FBN em
gramneas ainda no foram completamente elucidadas. Tem sido
sugerido que a interao gentipo da planta e ambiente exera um
papel decisivo sobre a eficincia do diazotrfico (GYANESHWAR
etal., 2002). Essas diferenas entre gentipos em relao FBN mos
tram um grande potencial para a sua melhor explorao atravs de
melhoramento vegetal.
Consideraes finais
Alm da inegvel importncia econmica, muito importante a
busca por uma melhor eficincia de uso dos fertilizantes nitrogena
dos industriais para evitar ao mximo suas perdas por lixiviao e (ou)
transformaes para formas gasosas, que contribuem para a poluio
de cursos e mananciais de gua, a degradao da camada de oznio
e o aquecimento global. Nesse contexto, a explorao e a utilizao
da FBN em sistemas agrcolas visando substituio ou, ao menos, a
complementao do N fornecido por meio de fertilizantes industriais
uma estratgia fundamental.
Programas de melhoramento de plantas contando com equipes for
madas por especialistas de diversas reas, com nfase na busca por
gentipos capazes de suprir suas necessidades em N, principalmente
por meio da associao com bactrias diazotrficas, poderiam trazer
269
biotecnologia
grande contribuio. Com os resultados recentes de mapeamento dos

genomas de plantas e bactrias fixadoras de nitrognio, esperase que
o conhecimento gerado possa incrementar o entendimento dessas
associaes, consequentemente, abrindo caminho para uma melhor
explorao de seu potencial.
O investimento na pesquisa e difuso da FBN, por meio de estudos
multidisciplinares e integrados, em reas como microbiologia, cin
cia do solo, melhoramento de plantas, manejo de culturas, etc., pode
trazer um grande benefcio para o planeta, aumentando a produo
de alimentos, reduzindo o uso de combustveis fsseis e a contami
nao dos recursos hdricos, proporcionada pela diminuio do uso
de fontes externas de fertilizantes nitrogenados.
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281
Captulo10
Captulo
5
Fungos micorrzicos arbusculares:

pesquisa e desenvolvimento
para a agricultura
Cynthia Torres de Toledo Machado
Ccero Donizete Pereira
Valter Lopes
Introduo
A micorriza arbuscular , provavelmente, a simbiose plantamicror
ganismo mais comum. Cerca de 70% a 90% das plantas terrestres so
hospedeiros desse grupo de fungos biotrficos obrigatrios altamente
especializados (HAYMAN, 1982; SMITH; READ, 1997; RENKER
etal., 2003).
As micorrizas arbusculares representam, entre os sete tipos distin
tos de associaes micorrzicas descritas (arbuscular, ectomicorriza,
ectendomicorriza, arbutide, monotropide, ericide e orquidide), a
associao simbitica mais abundante em todos os ecossistemas nas
mais diversas regies do planeta. As especificidades desses tipos so
descritas e ilustradas em Moreira e Siqueira (2002) e Miranda (2008).
As diferenas bsicas residem no fato de que, nas ectomicorrizas que
predominam em espcies arbreas de clima temperado, o fungo se
localiza externamente s clulas dos hospedeiros, enquanto, nas endo
micorrizas (arbusculares), parte das estruturas fngicas so intrace
lulares (PARNISKE, 2008).
Os primeiros estudos cientficos sobre a anatomia e a ocorrncia
dessas associaes entre fungos e razes, j especulando sobre os pos
sveis benefcios para as plantas, comprovando experimentalmente a
natureza mutualista da relao e descrevendo as bases funcionais da
mesma, foram conduzidos por Frank, cientista alemo considerado o
pai da micorrizologia, a partir de 1885. Foi ele tambm quem empre
gou o termo micorriza (mico, do grego mykes = fungo e riza, do grego
283
biotecnologia
rhiza = razes) pela primeira vez (SIEVERDING, 1991; MOREIRA;

SIQUEIRA, 2002; PARNISKE, 2008).
A infeco micorrzica se caracteriza pela formao de hifas no
septadas externas s razes e hifas intra e intercelulares nas camadas
das clulas crtex, alm de arbsculos intracelulares e vesculas intra
e intercelulares (SIEVERDING, 1991).
O desenvolvimento dessa simbiose resulta na formao de estru
turas ramificadas dentro das clulas vegetais os arbsculos que
parecem ser o principal ponto de troca de nutrientes entre os fungos
e as plantas. Essa associao responsvel no s pelo incremento
na absoro de nutrientes, principalmente fosfato, mas tambm pela
aquisio de gua e pela promoo da resistncia das plantas a diver
sos estresses biticos e abiticos, sendo considerada por Smith e Read
(1997), como ecologicamente obrigatria.
A contribuio das plantas na simbiose o fornecimento de carboi
dratos aos fungos (SOLAIMAN; SATO, 1997), e estima-se que mais
de 20% dos produtos da fotossntese das plantas terrestres (aproxima
damente 5 bilhes de toneladas de carbono/ano) sejam consumidos
pelos fungos micorrzicos arbusculares (FMAs) (BAGO etal., 2000).
Essa associao contribui de forma importante para o ciclo global do
carbono (C).
Os efeitos benficos da micorriza arbuscular so mais aparentes sob
condies de disponibilidade limitada de nutrientes. Verificase que a
colonizao radicular reduzida significativamente sob condies de
abundncia de nutrientes. Entretanto, esses mecanismos regulatrios
ainda no foram completamente elucidados, bem como os que indu
zem inibio de patgenos em razes colonizadas (PARNISKE, 2008).
Ocorrncia e importncia ecolgica dos

fungos micorrzicos arbusculares (FMAs )
H indcios, a partir de estudos realizados em razes fossilizadas,
que essa simbiose tenha surgido h aproximadamente 400 milhes
de anos e, a partir dessas evidncias, supese que as plantas terres
tres e os fungos micorrzicos tenham coevoludo juntos (HECKMAN
etal., 2001; PARNISKE, 2008).
284
Captulo 10 Fungos micorrzicos arbusculares: pesquisa e desenvolvimento para a agricultura
O processo evolucionrio no bem conhecido, mas muito pro

vavelmente os fungos micorrzicos originaramse de fungos saprof
ticos que adquiriram, ao longo da evoluo, alto grau de compatibi
lidade gentica e funcional com os parceiros autotrficos. No incio
desse processo, a colonizao se dava na rizosfera e na superfcie
das razes. Posteriormente, esses fungos desenvolveram mecanis
mos que permitiram a penetrao inter e intracelular das razes. Em
seguida, os fungos perderam a capacidade saproftica, tornandose
essencialmente biotrficos. A perda da capacidade de patognese se
deu quando esses organismos adquiriram a capacidade de regular a
sntese e a atividade de enzimas hidrolticas que causam a citlise e
necrose das clulas do hospedeiro. Essas hipteses so relatadas por
Moreira e Siqueira, 2002.
O tempo que os fungos micorrzicos arbusculares tiveram para se
dispersar e a falta de hospedeiro especfico explicam a ocorrncia das
micorrizas arbusculares nos diversos eco e agroecossistemas, como
as reas agrcolas, florestas tropicais e temperadas, desertos, dunas
e pradarias (BRUNDRETT, 1991, citado por MOREIRA; SIQUEIRA,
2002). No existem padres biogeogrficos que descrevam a ocorrn
cia dessas associaes, que so raras apenas nos ambientes rticos e
nas regies de tundras, onde predominam as ericceas e suas micor
rizas especficas (MOREIRA; SIQUEIRA, 2002).
Portanto, micorrizas arbusculares so a regra na natureza e no
a exceo, e a ausncia da associao simbitica uma situao res
trita a poucas famlias, gneros ou espcies vegetais como as cruc
feras, que pertencem famlia das brssicas, em que 87% de seus
membros no formam micorrizas. Famlias tipicamente micorrzi
cas, como as leguminosas, possuem espcies que no se associam
aos FMAs, como acontece com 4% das espcies do gnero Lupinus.
Outras famlias que possuem membros que no formam micorri
zas so: Chenopodiaceae, Poligonaceae, Amarantaceae, Comelinaceae,
Juncaceae, Proteaceae e Cyperaceae (MOREIRA; SIQUEIRA, 2002).
As razes para a condio no micorrzica de algumas espcies so
pouco conhecidas, mas alguns fatores j foram identificados, como
a produo de compostos fungistticos como os glicosinolatos pelas
crucferas, a insuficincia de fatores estimulantes ou sinais molecu
285
biotecnologia
lares nos exudatos de certas espcies e at mesmo deficincias na

aderncia ou existncia de barreiras fsicas na parede do hospedeiro
(MOREIRA; SIQUEIRA, 2002).
At o momento so conhecidas entre 180 e 200 espcies de FMAs,
listadas na pgina do International Culture Collection of Arbuscular
and VesicularArbuscular Mycorrhizal Fungi (INVAM), http://invam.
caf.wvu.edu, sendo esse nmero significativamente pequeno quando
comparada a outros microorganismos, considerando os 400 milhes
de anos de seu surgimento. Smith e Read (1997) comentam que o
reduzido nmero de espcies e a ausncia de especificidade com hos
pedeiro podem ser explicados pelo modo de reproduo exclusiva
mente clonal desses fungos, bem como pela possibilidade de uma
nica planta hospedeira ser colonizada por diferentes espcies desse
fungo. Portanto, essa diversidade gentica considervel e inesperada
para organismos de reproduo assexuada.
As possveis razes para tal variabilidade gentica podem ser expli
cadas por algumas caractersticas. A primeira delas que as hifas
dos FMAs so asseptadas e cenocticas, ou seja, no possuem sep
tos e concentram mltiplos ncleos dentro da mesma clula. Outro
aspecto muito relevante que os esporos individuais contm centenas
de ncleos geneticamente distintos (PARNISKE, 2008). Alm disso,
embora no haja relatos de fases sexuais no ciclo de vida desses fun
gos, possvel que o material gentico dos mesmos seja trocado e
recombinado porque ocorre anastomose nas hifas (GIOVANNETTI
etal., 2004), ou seja, a fuso dessas com conexo citoplsmica e con
sequente troca de ncleos.
De acordo com Husband etal. (2002), a aparente baixa diversidade
dos FMAs comparada com a variedade de comunidades de plantas
associadas a eles leva a acreditar que esses fungos constituem um
grupo homogneo e que as espcies so funcionalmente redundan
tes. A simbiose micorrzica considerada no especfica, mas existe
entre fungos e planta hospedeira o que se denomina habilidade dis
criminatria, que o que ir determinar as variaes de infectividade,
eficincia e efetividade para as combinaes fungo, planta e condi
es ambientais (PAULA etal., 1988). Entretanto, vrios estudos tm
demonstrado que espcies individuais de FMAs podem apresentar
286
uma gama de efeitos em diferentes plantas hospedeiras, promovendo

o crescimento de algumas e retardando o desenvolvimento de outras
(TALUKDAR; GERMIDA, 1994; STREITWOLFENGEL etal., 1997;
VAN DER HEIJDEN etal., 1998). A resposta em crescimento das
plantas tambm pode variar em funo da colonizao por espcies
diferentes de FMAs (SANDERS; FITTER, 1992; BEVER etal., 1996).
O certo que os FMAs so determinantes potenciais da estrutura
das comunidades vegetais e sua diversidade determina a biodiversi
dade vegetal, bem como a variabilidade e produtividade dos agro e
ecossistemas (VAN DER HEIJDEN etal., 1998). Da a enorme impor
tncia do conhecimento da diversidade dos fungos micorrzicos e seu
comportamento e organizao em condies de campo, tais como
os fatores ambientais que determinam a esporulao dos fungos, a
relao entre a populao e a colonizao das razes, a identificao
de quais espcies esto colonizando razes de determinadas plantas,
entre outros aspectos importantes.
Parte desses estudos dificultada pelo biotrofismo obrigatrio que
caracteriza essa relao simbitica, bem como pela natureza hip
gea do micosimbionte (FORTIN etal., 2002). Enormes esforos vm
sendo dispensados nas ltimas dcadas para a obteno da simbiose
in vitro, com estudos que envolvem culturas de razes (transformadas
geneticamente ou no), escolha de espcies hospedeiras, tcnicas de
inoculao e preservao e meios de cultura.
Fortin etal. (2002) realizaram uma reviso sobre o assunto, ver
sando sobre o potencial da cultura de razes no avano de estudos
sobre morfologia dos FMAs, taxonomia, filogenia, entendimento dos
processos de colonizao radicular e desenvolvimento micelial, envol
vendo descobertas nos nveis fisiolgicos, bioqumicos e moleculares.
Vrias espcies de FMAs, representativas das famlias Acaulosporaceae,
Gigasporaceae e Glomaceae tm sido cultivadas com sucesso em cultu
ras de razes e existe uma coleo internacional de FMAs cultivados in
vitro, a Ginco (Glomales In Vitro Collection), resultado de parcerias
de universidades e centros de pesquisa da Blgica e Canad (FORTIN
etal., 2002). No obstante esses avanos, ainda no se conseguiu o
cultivo desses fungos em meios de culturas artificiais na ausncia de
clulas vivas do hospedeiro (MIRANDA, 2008).
287
biotecnologia
Mtodos de avaliao de fungos micorrzicos

arbusculares em razes e solos
Colorao das razes e quantificao da infeco
As razes das plantas no sofrem alteraes morfolgicas em decor
rncia da colonizao pelos fungos micorrzicos arbusculares. Assim,
observaes ao microscpio so necessrias para determinar e quan
tificar a infeco micorrzica, aps as razes finas serem clarificadas
e coradas. Sieverding (1991) ressalta a necessidade da colorao pelo
fato de o miclio e outras estruturas fngicas serem hialinas ou trans
parentes e de difcil deteco, passveis de serem confundidas com
estruturas de fungos saprofticos ou parasitas. A colorao facilita a
caracterizao das estruturas e sua diferenciao, mas estruturas de
outros fungos alm dos FMAs podem ser coradas tambm, reque
rendo certa experincia do observador.
O mtodo clssico de colorao foi desenvolvido por Phillips e
Hayman (1970), sendo relativamente simples. Essa metodologia ainda
utilizada, com modificaes propostas para reduo de uso de pro
dutos txicos como o fenol, componente da soluo corante de azul
de tripano (KOSKE; GEMMA, 1989; MIRANDA, 2008) e para a cla
rificao e colorao de razes mais lignificadas (SCHENCK, 1984),
para espcies lenhosas e para espcies arbreas exticas e nativas
do Cerrado, entre outras. Essas ltimas foram desenvolvidas no
Laboratrio de Micorrizas da Embrapa Cerrados e so descritas deta
lhadamente em Miranda (2008).
Aps a colorao, a avaliao da colonizao radicular em percenta
gem de segmentos de razes que contenham estruturas fngicas se d
por meio da tcnica da intercesso radicular proposta por Giovannetti
e Mosse (1980).
Extrao de esporos
A diversidade dos FMAs a campo tem sido tradicionalmente esti
mada pelo nmero de esporos das diferentes espcies encontradas. A
identificao dos fungos se d aps os mesmos terem esporulado no
288
incio de sua fase reprodutiva, pela separao dos esporos do solo ou

do substrato onde est se cultivando a planta hospedeira.
Os procedimentos para a separao dos esporos do solo so sim
ples e se baseiam em suspenso do material (solo e razes) em gua,
com posterior peneiramento, decantao e centrifugao. A meto
dologia clssica de extrao de esporos por peneiramento mido foi
descrita por Gerdemann e Nicolson (1963), e desde ento vem sendo
utilizada com algumas variaes. Descries detalhadas de outros
procedimentos so encontradas em Schenck (1984); Pacioni (1994) e
Tommerup (1994).
O material de solo e razes, em massa e (ou) volume conhecido,
(geralmente 50g) suspenso em gua por tempo suficiente para
a sedimentao de partculas grosseiras e a suspenso decantada
em uma srie de peneiras acopladas com gradiente decrescente de
malhas. Esse procedimento repetido vrias vezes (Figura1). O mate
rial retido nas peneiras inferiores submetido centrifugao em
gua e caulim ou em soluo de sacarose para a separao dos espo
ros das partculas mais pesadas do substrato. Quando a centrifugao
feita em soluo de sacarose, os esporos permanecem na camada
superficial, enquanto as partculas de solo se mantm na parte infe
rior do tubo de centrfuga. J quando a suspenso de solo centri
fugada com a adio de caulim, os esporos se prendem no fundo do
tubo da centrfuga.
A metodologia adaptada e utilizada no Laboratrio de Micorrizas
da Embrapa Cerrados uma combinao daquelas estabelecidas por
Gerdemann e Nicolson (1963) e Coolen (1979), utilizando duas penei
ras, de 710 m e 53 m. A centrifugao feita com caulim tende a
preservar a integridade dos esporos, j a soluo de sacarose pode
provocar o rompimento das paredes e vazamento do contedo cito
plasmtico, desde que os esporos permaneam na mesma. Esses pro
cedimentos e particularidades metodolgicas so descritos detalhada
mente em Miranda (2008).
Uma vez extrados, os esporos so contados em placas de petri espe
ciais e observados em lupas e microscpios, para identificao a par
tir de suas caractersticas morfolgicas.
289
biotecnologia
Figura 1. Etapas da tcnica de peneiramento mido: (A) peneira metlica;

(B) decantao atravs do conjunto de peneiras; e (C) remoo dos esporos
para a placa de Petri.
Fonte: Extrado de Pacioni (1994).
Determinao do potencial de inculo pelo mtodo do

nmero mais provvel (NMP )
Os esporos so estruturas de sobrevivncia dos FMAs e, em deter
minadas situaes, constituem a nica forma de propgulo infectivo
desses fungos no solo. Esse o caso de longos perodos de seca e (ou)
de solo sem vegetao. Nesses casos, de acordo com Sieverding (1991),
o nmero de esporos por unidade de massa ou volume de solo repre
senta a extenso dos propgulos dos fungos no campo.
290
Entretanto, o nmero de esporos frequentemente usado para

quantificar a populao de FMAs durante os perodos de crescimento
das plantas, em reas normalmente vegetadas ou cultivadas. Embora
a densidade de esporos possa se correlacionar bem com o total de pro
pgulos infectivos dos FMAs nos solos em certas situaes (TORO;
SIEVERDING, 1986; GAVITO, 1988, citado por SIEVERDING, 1991),
cuidados devem ser tomados ao interpretar esses dados como medi
das efetivas do potencial de inculo, visto que a esporulao depende
do fungo propriamente dito, do hospedeiro, das caractersticas do
solo e das condies climticas. Assim, o potencial de inculo pode
ser subestimado, j que o miclio fngico uma importante fonte de
inculo que no quantificada pela contagem de esporos, bem como
as taxas de infeco radiculares, que constituem medidas indiretas da
infectividade da populao dos FMAs.
O nico mtodo que quantifica todos os propgulos infectivos dos
FMAs e estima a populao dos mesmos, fornecendo nmero de pro
pgulos por unidade de volume ou massa de solo, inclusive com limi
tes de intervalo de confiana, o mtodo do nmero mais provvel
(NMP), adaptado do mtodo de Porter (1979) para os estudos de FMAs.
Diluies seriadas do solo que se pretende estudar so feitas nesse
mesmo solo esterilizado, constituindo bioensaios com repeties e
sries de diluies recomendadas para situaes especficas. Nos reci
pientes em que o substrato nas diversas diluies colocado (tube
tes, em geral), plantase uma espcie encontrada na rea em estudo,
ou uma planta teste padro, como Brachiaria decumbens, por exem
plo (Figura2). Aps 6 a 8 semanas, a infeco radicular dessas plan
tasteste verificada, estimandose, por frmulas especficas, o poten
cial de propgulos infectivos daquele solo, em termos de densidade e
efetividade das populaes.
Esse mtodo relativamente de fcil execuo, mas existem algu
mas limitaes. Podem ocorrer subestimativas pela no colorao de
algumas micorrizas, conforme descreve Morton (1985). Outros auto
res, como Miranda (2008), consideramno trabalhoso para uso em
rotina de laboratrios de micorrizas, em face ao volume de amostras
decorrentes das sries de diluio e do nmero de repeties.
291
Foto: Ccero Donizeti Pereira
biotecnologia
Figura 2. Ensaio de NMP, com tubetes contendo as diluies de solo e a

planta teste.
Embrapa Cerrados, setembro de 2009.
Glomalina
A estimativa da biomassa fngica pela determinao da produo
de hifas externas (SYLVIA, 1994), considerada difcil e morosa por
alguns autores (JAKOBSEN etal., 1992; MILLER etal., 1995; RILLIG
etal., 1999 citados por ROSIER etal., 2006), evoluiu para o uso de
marcadores bioqumicos como ergosterol, quitina e glomalina como
indicadores dos FMAs (NYLUND; WALLANDER, 1994; WRIGHT
etal., 1996). Posteriormente, verificouse que vrios outros organis
mos produzem ergosterol e quitina (FREY etal., 1994), bem como
que existem FMAs que no contm ergosterol (OLSSON etal., 2003).
Assim, a determinao da glomalina vem sendo usada para identi
ficar a presena (WRIGHT etal., 1996) e estimar a biomassa desses
fungos (KRIVTSOV etal., 2004; LOVELOCK etal., 2004). Tratase de
uma glicoprotena insolvel (WRIGHT; UPADHYAYA, 1996) pro
duzida pelas hifas de todos os FMAs, mas no por outros grupos
de fungos do solo (WRIGHT etal., 1996), que atua efetivamente na
cementao das partculas do solo (WRIGHT; UPADHYAYA, 1998),
incrementando a estabilidade dos agregados, j promovida pelo efeito
292
fsico das redes de hifas fngicas extraradiculares que envolvem e

interligam as partculas do solo.
Na condio de glicoprotena, a glomalina possui quantidades
expressivas de carbono (C), representando elevada proporo do C
orgnico do solo e perfazendo quantidades muito superiores daquele
armazenado na biomassa microbiana (RILLIG etal., 2001), consti
tuindo, portanto, um indicador sensvel das mudanas nos teores de
C dos solos advindas das prticas de manejo e uso das terras, estando
tambm envolvida no sequestro de C (RILLIG etal., 1999; RILLIG
etal., 2003).
A determinao da glomalina se d mais frequentemente pela extra
o em citrato de sdio e anlise pelo reagente de Bradford ou por
Elisa (WRIGHT; UPADHYAYA, 1998; ROSIER etal., 2006; JANOS
etal., 2008).
Identificao e classificao e dos fungos

micorrzicos arbusculares (FMAs)
A base da taxonomia dos FMAs a formao dos esporos, seguida
de caractersticas dessas estruturas, tais como tamanho, cor e espe
cificidades das paredes internas e externas, como nmero de cama
das, ornamentao, reaes a corantes especficos entre outras.
Atualmente so conhecidas 5 famlias e 7 gneros de fungos micor
rzicos, nas quais se distribuem aproximadamente 200 espcies des
ses fungos, listados na pgina do Invam (http://invam.caf.wvu.edu).
Os fungos micorrzicos arbusculares pertencem ao filo
Glomeromycota, um filo monofiltico (SCHBLER etal., 2001). A
classificao atual, proposta por Morton e Redecker (2001), foi esta
belecida a partir de consenso entre caractersticas morfolgicas dos
esporos e mtodos moleculares. Nessa nova classificao, foram incor
poradas duas novas famlias com dois gneros: Archaeosporaceae
e Paraglomaceae, com os respectivos gneros Archaeospora e
Paraglomus. Essas novas famlias foram descritas com base em carac
teres morfolgicos atpicos, distncias entre padres imunolgicos e
de cidos graxos e divergncias na sequncia 18S do DNA ribosso
mal (INVAM, 2008).
293
biotecnologia
As classificaes anteriores datam de 1974, estabelecida por

Gerdemann e Trappe (citados por MIRANDA, 2008), e 1990, pro
posta por Morton e Benny. Essa se deu com nfase na filogenia, na
teoria do ancestral comum, destacandose por remover os FMAs da
ordem Endogonales (vigente por mais de duas dcadas desde a propo
sio na classificao de 1974), inserindoos na nova ordem Glomales
e definindo duas subordens: Glomineae e Gigasporineae. A famlia
Gigasporaceae, com os gneros Gigaspora e Scutellospora, pertencem
subordem Gigasporineae e as famlias Glomaceae (com os gneros
Glomus e Sclerocystis) e Acaulosporaceae (com os gneros Acaulospora
e Entrophospora) pertencem subordem Glomineae. Na classificao
seguinte, de 2001, o gnero Sclerocystis foi extinto.
As principais caractersticas que diferenciam as subordens, seus
gneros e as respectivas espcies so sumarizadas no Tabela 1.
Tabela 1. Diferenas entre as subordens Glomineae e Gigasporineae.
Subordem Glomineae
Subordem Gigasporineae
Arbsculos e vesculas dentro das razes

fungos micorrzicos vesculo arbusculares
Arbsculos fungos
micorrzicos arbusculares
Hifas cilndricas com ramificaes

perpendiculares
Clulas auxiliares
Esporos com camadas evanescentes

envolvendo a camada laminar da parede
Esporos em clula bulbosuspensora;

com camadas permanentes envolvendo
a camada laminar da parede
Propgulos infectivos: esporos,

hifas e vesculas
Propgulos infectivos: esporos
As famlias da subordem Glomineae, com seus respectivos

gneros, Glomaceae (Glomus) (Figura3); Acaulosporaceae (gne
ros Acaulospora e Entrophsopora); Archaeosporaceae (Archaeospora)
(Figura4); e Paraglomaceae (Paraglomus), possuem caractersticas
bastante peculiares que as diferenciam entre si e dos gneros da fam
lia Gigasporaceae (Figura5). Essas caractersticas so as seguintes:
294
Famlia Glomaceae
Fotos Valter Lopes
Gnero Glomus
a) Esporos desenvolvidos terminalmente na hifa, presena de
pedicelo.
b) Esporos menores, com maior nmero de camadas e em cores
variadas.
c) Esporos isolados, em agregados ou em esporocarpos, podendo
se formar dentro das razes.
d) Hifa contnua parede do esporo.
e) Ausncia de paredes germinativas.
f) Vesculas podem ou no se formar.
Figura 3. (a) e (b) Glomus clarum; (c) Glomus intraradices; e (d) Glomus
etunicatum.
295
biotecnologia
Famlia Acaulosporaceae
Paredes germinativas, formao de sculo esporfero antes do
desenvolvimento dos esporos, esporos formados na hifa do sculo
esporfero.
Gnero Acaulospora:
a) Esporos formados na lateral da hifa do sculo esporfero.
Fotos: Valter Lopes.
Gnero Entrophospora:
a) Esporos formados dentro da hifa do sculo esporfero.
a
Figura 4. (a) Acaupospora denticulata e (b) Entrophopora colombiana.
Famlia Archaeosporaceae
Gnero Archaeospora
a) No formam vesculas.
b) Arbsculos se colorem muito pouco; distribuio irregular em
cereais e gramneas hospedeiras.
c) Formao de esporos glomo e acaulosporoides 3 modos:
sculo esporfero larteral, semelhante a Acaulospora; termi
nalmente na hifa, como Glomus e com formao de pedicelo
no sculo esporfero que se desprende.
296
Famlia Paraglomaceae
Gnero Paraglomus
a) Vesculas pobremente caracterizadas.
b) Arbsculos tambm no se colorem bem.
c) Formao de esporos semelhante ao gnero Glomus.
d) Duas espcies: P. occultum e P. brasilianum.
A famlia Gigasporaceae, da subordem Gigasporineae, possui dois
gneros, Gigaspora e Scutellospora. Essa famlia tem por caracters
tica principal a formao de esporos em clula bulbo ou esporgena.
As peculiaridades que diferem os gneros dessa famlia so listadas
a seguir.
Famlia Gigasporaceae
Formao de esporos em clula bulbo ou esporgena
Gnero Gigaspora
a) Esporos gigantes.
b) Esporos sem ornamentao.
c) Tubo germinativo emerge a partir de camada fina e verrugosa
da parede laminar interna.
d) Paredes dos esporos possuem duas camadas.
e) Clulas auxilares com ornamentao equinulada.
Gnero Scutellospora
a) Esporos com escutelo, escudo ou placa de germinao
b) Placa de germinao persistente formada a partir da parede
interna, de onde emergem os tubos de germinao
c) Clulas auxiliares com ornamentao nodosa ou lobada
d) Paredes do esporo: camadas permanente e laminar (at 30)
e) Esporos com ou sem ornamentao
297
Fotos: Valter Lopes.
biotecnologia
Figura 5. (a) Gigaspora decipiens e(b) Scutellospora cerradensis.
Aplicao de mtodos moleculares em estudos

com fungos micorrzicos arbusculares
A identificao dos fungos micorrzicos arbusculares (FMAs)
essencial para pesquisas com esses organismos, sendo feita base
andose na ontogenia e morfologia dos esporos. um processo com
plexo, dependente da utilizao de chaves de identificao e altamente
dependente de profissionais especialistas e experientes em taxonomia.
Alguns autores consideram que a identificao por mtodos mor
folgicos pode ser imprecisa devido grande homogeneidade morfo
lgica e anatmica das estruturas desses fungos, ao fato de algumas
espcies formarem tipos muito similares de esporos, dificultando a
diferenciao de espcies, bem como pela ocorrncia de alteraes
morfolgicas em funo das condies ambientais a campo (CLAPP
etal., 1995; SALES; SOUZA, 1998; REDECKER etal., 2000; RENKER
etal., 2003; MA etal., 2005).
Assim, o emprego de mtodos moleculares em anlises de comu
nidades de FMAs baseados na extrao, amplificao e caracterizao
de cidos nucleicos ganhou notoriedade nas ltimas dcadas, com
298
plementando os at ento utilizados extrao direta de esporos e cul

tivo armadilha (GOI; SOUZA, 2006). A maioria das tcnicas molecu
lares utilizadas na identificao de FMAs baseada na utilizao da
reao em cadeia da polimerase (PCR Polymerase Chain Reaction),
que tem como finalidade produzir uma quantidade efetiva de um
segmento especfico de DNA, a partir de uma quantidade mnima de
DNA molde associado a molculas iniciadoras (primers) de sequn
cias especficas, s regies de DNA que se deseja amplificar.
A primeira sequncia de DNA de FMAs obtidas de razes infec
tadas por esses fungos foi apresentada por Simon etal. (1992). Eles
afirmaram que a possibilidade de se amplificar sequncias da subu
nidade menor do rRNA (SSU), regio codificadora 18S, fornecia
uma nova abordagem para a deteco rpida, identificao e quan
tificao dos FMAs, alm de maior facilidade em estudos de filoge
nia desses organismos. No ano seguinte, os estudos dessa regio
foram ampliados usando uma quantidade maior de primers espe
cficos para FMAs associados tcnica Single Strand Conformation
Polymorphims (SSCP), para identificar diferenas nas sequncias
amplificadas (SIMON etal., 1993).
Utilizando a tcnica de Random Amplification of Polymorphic DNA
(RAPD) e como molde DNA genmico de FMAs, Wyss e Bonfante
(1993) identificaram polimorfismos entre espcies desses fungos,
sugerindo um possvel desenvolvimento de sondas especficas para
estudo de biodiversidade para espcies desse filo. Longato e Bonfante
(1997) compararam a tcnica de microsatlites com RAPD e verifi
caram vantagens na utilizao de microsatlites, pois produziram
fingerprints nicos, mesmo em genomas heterogneos como os de
FMAs, quando comparados s amplificaes por RAPD. Entretanto,
genes que codificam para rDNA so os mais utilizados nesse tipo de
estudo por atenderem alguns critrios, entre os quais, a alta varie
dade que possibilita o desenvolvimento de primers para inmeras
classes taxonmicas (BRUNS; GARDNES, 1993). Nesses genes, as
regies codificadoras (18S, 5,8S e 25S) so as mais conservadas, as
regies internas (ITS) mostram uma variao relativamente mediana
e as regies intergnicas (IGS) so as mais variveis (LANFRANCO,
1998; citado por NOVAIS, 2008).
299
biotecnologia
Clapp et al (1995), utilizando a tcnica denominada enriqueci

mento seletivo de DNA amplificado Selective Enrichment of
Amplified DNA (SEAD), identificaram FMAs a partir de DNA extrado
diretamente de razes. Nessa tcnica, o DNA foi amplificado com os
primers universais para eucariotos, SS38 e NS21, e, associando a um
mtodo baseado no princpio de hibridao subtrativa para a remo
o de produtos amplificados de DNA de plantas pela PCR, selecio
naram sequncias especficas para FMAs. Nesse mesmo estudo, os
autores comentam sobre a importncia de utilizao de mtodos que
possam revelar diretamente a taxa de colonizao de FMAs em razes,
de grande importncia na elucidao de biodiversidade e ecologia des
ses. Apesar de outras tcnicas como o uso de isozimas (ROSENDAHL;
SEN, 1992) e mtodos imunolgicos (WRIGHT et al, 1987) terem sido
inicialmente aplicados nesses estudos, Clapp et al (1995) consideram
o PCR o mais promissor dos mtodos.
A amplificao de DNA de um nico esporo para estudar a diver
sidade de FMAs em populaes naturais foi realizada por Sanders
etal. (1995). Nesse estudo, foram utilizados os primers ITS1 e ITS4
na PCR, tendose realizado a subsequente restrio do produto de
amplificao por enzimas de restrio. Essa tcnica, conhecida como
Restriction Fragment Length PolimorfismPCR (RFLPPCR), detec
tou diferentes padres de bandeamento obtidos de diversos isolados.
A associao de caracteres morfolgicos a resultados molecula
res, entretanto, deuse pela primeira vez em um trabalho realizado
por Morton e Redecker (2001), que, na ocasio, propuseram duas
novas famlias na rvore filogentica dos FMAs: Archaeosporaceae e
Paraglomaceae. Posteriormente, estudos moleculares similares, base
ados na regio 18S do rDNA, demonstraram a natureza monofil
tica do grupo de espcies dos FMAs, incluindoos em um novo filo:
Glomeromycota (SCHLER etal., 2001).
Tonin et al (2001) caracterizaram esporos de FMAs de solo rizosf
rico e razes de Viola alaminaria, planta tolerante a metais pesados, por
meio de PCR para a regio 18S rDNA. O estudo da diversidade des
ses e de outros fungos foi avaliada por TerminalRestriction Fragment
Length Polymorphism (TRFLP), utilizando as enzimas de restrio
HinfI, HaeIII. Os resultados confirmaram que a anlise por TRFLP
300
uma ferramenta muito til para avaliao da diversidade microbiana

de comunidades complexas, inclusive, podendo ser utilizada para a
identificao de espcies de FMAs, quando primers universais forem
utilizadas para o filo glomeromicota. Anos mais tarde, em uma revi
so de literatura, Dickie e Fitzjohn (2007) mostraram a ampla utiliza
o desta tcnica em estudos da ecologia de FMAs, relatada em vrios
trabalhos sobre o assunto (TONIN et al, 2001; JOHNSON et al, 2003;
MUMMEY et al, 2005; RBERG et al, 2005).
Um nested PCR foi desenvolvido por Renker etal. (2003) para
amplificar espao interno de transcrito (ITS) de FMAs a partir de ra
zes, possibilitando a identificao de espcies desse fungo por meio
de uma tcnica molecular. Essa tcnica e algumas variaes dela so
frequentemente usadas para anlises filogenticas entre espcies
estreitamente relacionadas e de populaes de uma mesma espcie
(MA et al, 2005; RENKER et al, 2005; RODRGUEZECHEVERRA;
FREITA, 2006; WU et al, 2007; APPOLONI etal., 2008; NOVAIS,
2008; OLIVEIRA, 2009; ZHANG et al, 2010).
Cornejo et al (2004) utilizaram nested PCR associada tcnica
Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TTGE) para
sequncias da regio codificadora 18S de FMAs. Essa tcnica usa
o mesmo princpio do Single Strand Conformation Polymorphism
(SSCP), permitindo a migrao diferenciada do segmento de DNA
de acordo com a sua sequncia de nucleotdeos, possibilitando, neste
estudo, a identificao de espcies de Glomus colonizando razes de
diferentes espcies de plantas.
A variao inter e intraespecfica da regio codificadora 18S do
gnero Gigaspora foi explorada por Souza etal. (2004). Um screening
sobre 48 isolados por PCRDenaturing Gradient Gel Electrophoresis
(PCRDGGE) revelou que a regio V3V4 do gene 18S contm variao
suficiente para discriminar diferentes espcies do gnero Gisgaspora.
Esses autores mostraram que a identificao via DGGE mais con
fivel que a identificao morfolgica para algumas espcies desse
gnero, mas afirmaram que, apesar dos avanos em estudo molecula
res, houve pouco progresso na identificao e caracterizao de esp
cies, ainda muito dependentes de anlises morfolgicas.
Outros estudos foram conduzidos por Ma et al (2005), que descreve
ram a PCR com primers especficos para a regio 18S associada a um
301
biotecnologia
DGGE como uma ferramenta importante para se caracterizar comuni

dades complexas de FMAs em agroecossistemas e por Appoloni et al
(2008), que, realizando sequenciamento dos produtos amplicados por
nestedPCR, determinaram diferenas entre comunidades de FMAs
em solos geotrmicos do Parque Nacional Yellowstone (EUA), iden
tificando filotipos especficos para aquele tipo de solo.
Novais (2008) fez uma caracterizao molecular com base na dis
criminao especfica da regio V9 da regio codificadora 18S, por
PCRDGGE, que permitiram a diferenciao de espcies de FMAs
inclusive das espcies Gisgapora albida, G. margarita e G. gigantea,
pertencentes a um mesmo gnero, corroborando com a identificao
fenotpica. Zhang et al (2009) usaram essa mesma tcnica para estu
dar a interao entre FMAs e bactrias na rizosfera de duas espcies
vegetais dominantes numa regio de Zhifanggou, noroeste da China.
Os resultados das anlises moleculares indicaram que as plantas tm
um efeito seletivo na estrutura da comunidade bacteriana, mas os
FMAs no tiveram estrita especificidade com a planta hospedeira.
Essa tcnica tambm foi usada com sucesso por Oliveira et al (2009),
na anlise da estrutura da comunidade de FMAs na rizosfera de gen
tipos de milho contrastantes quanto a eficincia de fsforo.
Estabelecimento da associao micorrzica

O estabelecimento da associao micorrzica resulta de uma sequ
ncia de eventos coordenados pelo fungo e pela planta e por suas inte
raes. Na Figura 6, ilustramse essas fases, de forma simplificada,
mostrando que a regulao do micotrofismo, ou seja, do fluxo de
nutrientes do fungo para as plantas o que determina a resposta das
mesmas colonizao, enquanto a regulao do biotrofismo (fluxo de
fotoassimilados das plantas para os fungos) controla o grau de coloni
zao, produo de propgulos e sobrevivncia dos micosimbiontes.
Os esporos so unidades biolgicas em processo de quiescncia
que precisam ser ativados para desencadear os processos e funes
metablicas que sustentam a germinao e o crescimento da fase fila
mentosa (das hifas) (MOREIRA; SIQUEIRA, 2002). No se conhece o
mecanismo exato da ativao, mas sabese que a germinao dessas
estruturas geralmente no requer a presena da raiz do hospedeiro,
302
sendo um estgio no simbitico (FORTIN etal., 2002). Entretanto,

apesar dos esporos dos FMAs serem capazes de germinar na ausn
cia das plantas hospedeiras, esses microganismos so biotrficos
obrigatrios que dependem de um parceiro fotoautotrfico vivo para
completar seu ciclo de vida e produzir a prxima gerao de esporos
(PARNISKE, 2008).
Uma das possibilidades relatadas em Moreira e Siqueira (2002)
que o incio da germinao se d pela ativao de proteases at ento
inativas das membranas dos esporos, resultante da absoro de gua e
consequente aumento de volume. A partir dessa modificao nas con
dies biofsicas da membrana, ocorre a ativao das enzimas proteo
lticas armazenadas, hidrlise de protenas de reserva com o aumento
da concentrao de aminocidos livres, que, por sua vez, sintetizaro
novas protenas com funes enzimticas especficas, dependentes
do cdigo gentico do esporo, iniciando o processo de germinao.
Fungo
Germinao, crescimento micelial
Planta
Reconhecimento, aderncia
raiz, formao do apressrio
Relao fungo-planta
Penetrao da raiz,
colonizao do crtex
Produo de
propgulos
Resposta em
crescimento
Estabelecimento na raiz
Crescimento e diferenciao
do miclio (arbsculos)
Fotoassimilados
Relao simbitica
Nutrientes
Integrao morfolgica, fisiolgica,

bioqumica e funcional
Figura 6. Estabelecimento da relao simbitica.

Fonte: adaptado de Moreira e Siqueira (2002).
Ainda de acordo com Moreira e Siqueira (2002), que revisaram em

sua obra os estudos conduzidos nessa linha, o estabelecimento da
relao segue a partir da ativao e crescimento assimbitico no s
dos esporos, mas dos segmentos de razes infectados e das hifas do
solo, que constituem as demais formas de propgulo dos FMAs. A
etapa seguinte o crescimento micelial na rizosfera, com a propaga
303
biotecnologia
o das hifas infectivas e o contato destas com as razes. Nesse ponto,

formase o apressrio, uma diferenciao da hifa infectiva, que a
primeira e mais importante resposta fenotpica do reconhecimento
entre os hospedeiros. Plantas nohospedeiras dos FMAs no formam
apressrios funcionais.
Em seguida, ocorrem a colonizao do crtex e a penetrao intra
celular e o estabelecimento da micorriza, com a formao das ves
culas e arbsculos, iniciando o mutualismo. Como comentado ante
riormente, arbsculos so estruturas de troca e transferncia de
nutrientes e carbono (C), a partir dos quais os fungos acessam o supri
mento de fotoassimilados das plantas. Surgem da diferenciao das
hifas e so efmeros, durando de 4 a 5 dias. J as vesculas ocorrem
apenas em membros da famlia Glomaceae e so estruturas globosas,
tambm resultantes da diferenciao de hifas, que possuem funo
de reserva, sendo ricas em lipdeos (MOREIRA; SIQUEIRA, 2002).
A penetrao decorre da presso mecnica e da degradao enzim
tica parcial da parede do hospedeiro pela ao de pectinases, celula
ses e hemicelulases do fungo. A quantidade de enzimas, entretanto,
muito menor que a produzida por fungos fitopatognicos. A menor
quantidade de enzimas produzidas localizadamente garante a inte
gridade do tecido hospedeiro e evita a ativao do sistema de defesa
vegetal (MOREIRA; SIQUEIRA, 2002).
A partir das razes colonizadas, o miclio externo se expande for
mando uma rede de hifas que ir garantir a absoro de nutrientes
e gua, bem como os eventos de colonizao secundria e formao
de novos esporos.
Para cada estdio, ocorrem estmulos, como a liberao de exudatos
radiculares (flavonoides, isoflavonoides, cidos fenlicos, hormnios
vegetais), respostas especficas e mecanismos de controle das plantas
(FORTIN etal., 2002; PARNISKE, 2008). Todas essas fases esto sobre
estrito controle gentico dos simbiontes. J em 1990, Toth e colabo
radores afirmavam que o controle gentico, tanto nos vegetais como
nos fungos, era provavelmente a caracterstica mais importante na
determinao da condio micorrzica, sendo os fatores ambientais
de importncia secundria.
Atualmente sabese que ocorrem sucessivos ciclos de germinao
de esporos e retrao de ncleo e citoplasma, os quais podem ocorrer
304
nos FMAs, e tambm que o desenvolvimento das hifas se modifica

na presena de sinais derivados das plantas. Os efeitos estimulat
rios dos exudatos radiculares so estudados h tempos, mas a iden
tificao molecular dos chamados fatores de ramificao recente.
Entre esses, os hormnios vegetais estrigogalactonas. Os fungos tam
bm possuem molculas sinalizadoras que induzem respostas espe
cficas na raiz hospedeira, chamados genericamente de fatores Myc
(PARNISKE, 2008).
Principal efeito nutricional da simbiose

nas plantas absoro de fsforo
A colonizao pelos fungos micorrzicos arbusculares (MA) pro
move a tolerncia a estresses biticos ou abiticos, aumentando o cres
cimento e produtividade das plantas. Enquanto as plantas fornecem
ao fungo carboidratos, os fungos exploram gua e minerais do solo
mais eficientemente, e os fornece efetivamente s plantas, particu
larmente sob condies de limitao de nutrientes (SMITH; SMITH,
1990; KOTHARI etal., 1990).
Os benefcios da associao simbitica das plantas com os fungos
micorrzicos na nutrio fosfatada, principalmente aumentando a efi
cincia de aquisio do P, so extensivamente descritos na literatura.
Outros nutrientes ou formas menos mveis no solo tambm tm
sua aquisio potencializada pela associao micorrzica, como zinco
(Zn), cobre (Cu) (LIU etal., 2000) e nitrognio amoniacal (NNH4+)
(AMES etal., 1983; JOHANSEN etal., 1994; PEREIRA et al, 1996). A
rede de hifas fngicas, pela sua dimenso, chegando at a 100 m de
hifas/cm3 (MILLER etal., 1995), est em posio ideal para absorver
eficientemente gua e nutrientes do solo. Os fungos possuem tam
bm transportadores especficos envolvidos nesse processo, entre os
quais, os de P, NH4+ e Zn j foram identificados e at mesmo clona
dos (PARNISKE, 2008).
De acordo com Smith e Read (1997), as possveis explicaes para
os benefcios na nutrio fosfatada so as seguintes: (a) as hifas dos
fungos micorrzicos so capazes de absorver o P da soluo do solo e
transloclo para as razes, em processo muito mais rpido que a difu
so desse elemento pelo solo, sendo capazes de transpor as zonas de
305
biotecnologia
depleo de P que se formam em volta das razes. A produo de hifas

envolve um menor consumo de carbono (C) por unidade de compri
mento ou rea de absoro, e seu menor dimetro permite que elas
penetrem em poros do solo de dimetro menor que as razes, aumen
tando assim o volume de solo explorado; (b) as hifas so mais efeti
vas, em consequncia de seu tamanho e distribuio espacial, em
competir com os microrganismos de vida livre do solo pelo P recen
temente mineralizado ou solubilizado; (c) a cintica de absoro de
P nas hifas difere da apresentada pelas razes, com valores mais bai
xos de Km, possibilitando, portanto, absoro mais efetiva do P em
concentraes nas quais a aquisio pelas razes j tenha cessado; (d)
razes micorrizadas podem usar fontes de P que no estejam dispo
nveis para as razes.
Em funo dessas caractersticas, a simbiose micorrzica constitui
um mecanismo adaptativo que permite maximizar a aquisio do P
de uma forma que dispende menos energia que a prpria produo
de razes (CHAPIN III, 1980).
A colonizao das razes pelos fungos micorrzicos aumenta quando
as concentraes de P do solo e das razes so baixas e a fertilizao
fosfatada afeta adversamente o desenvolvimento de arbsculos, ves
culas, hifas externas e esporos (SYLVIA; NEAL, 1990), reduzindo os
benefcios e a dependncia micorrzica de uma planta, que certamente
esto relacionados com a fertilidade do solo (PLENCHETTE etal.,
1983). Atributos da planta, como comprimento e massa de razes e
relao raiz/parte area, tambm controlam a dependncia micor
rzica, apresentando com essa ltima uma relao inversa (KOIDE
etal., 1988). Outros fatores ambientais podem influenciar a coloni
zao como pesticidas, umidade do solo, pH e at mesmo a intensi
dade de luz (AZCN; OCAMPO, 1981).
Avanos em pesquisas em fungos

micorrzicos na Embrapa Cerrados
A pesquisa em fungos micorrzicos na Embrapa Cerrados cen
trouse, principalmente, em micorrizas arbusculares, tendose ini
ciado em 1977 com trabalhos sobre alternativas ao manejo da fer
306
tilidade do solo e maior eficincia na utilizao dos fertilizantes

fosfatados. Esses estudos, conduzidos com diferentes espcies vege
tais, demonstraram que as respostas das culturas a adubos fosfatados
podem ser maximizadas pela presena de fungos micorrzicos no solo,
dependendo das doses (MIRANDA, 1982; MIRANDA etal., 1984) e
fontes utilizadas (REIN; MIRANDA, 1995; MIRANDA; MIRANDA,
2003). Nessa linha, foram conduzidos estudos com fontes de fsforo
(P) de granulometria e solubilidade variadas. Em todas as reas de
pesquisa com FMAs na Embrapa Cerrados, os projetos pautaram em
duas linhas principais: o manejo dos fungos micorrzicos arbuscula
res nativos nos sistemas de produo e o processo de sua inoculao.
O efeito dos fungos micorrzicos arbusculares (FMAs) no uso de
outros fertilizantes tambm foi estudado, verificandose que a pre
sena de micorriza potencializa, igualmente, a resposta aos adubos
potssicos solveis ou de rochas. Para as rochas potssicas modas, o
efeito seria consequncia da dissoluo das mesmas, acelerada pela
remoo de nutrientes e adio de cidos pela micorriza arbuscular
(ANDRADE etal., 2005).
Confirmouse tambm que os fungos micorrzicos alteram a efi
cincia de corretivos. Miranda e Miranda (1997) mostraram que a
presena dos (FMAs) maximiza a resposta das culturas ao calcrio,
e tambm que a condio micorrzica natural do solo pode interferir
diretamente na resposta das culturas calagem e alterar interpreta
es e recomendaes quanto ao manejo do calcrio para a correo
da acidez do solo.
Estudando o efeito da calagem sobre a comunidade micorrzica do
solo, Miranda e Miranda (2003) tambm mostraram a variao quan
titativa (nmero de esporos) em funo das doses de calcrio aplica
das, com aumento gradativo da esporulao da comunidade micor
rzica at a dose de 4 t/ha e decrscimo da populao a partir dessa
dose. Em outro importante estudo, Miranda etal. (2005) verificaram o
comportamento diferencial das espcies de FMAs Acaulospora scrobi
culata, Glomus etunicatum e Glomus manihotis em funo da elevao
na saturao de bases proporcionada por diferentes nveis de calagem.
O efeito das micorrizas arbusculares no processo de fixao biol
gica de nitrognio tambm foi estudado, verificandose benefcios sob
307
biotecnologia
condies de extrema deficincia de P (FARIA, 1998). Outros resulta

dos interessantes nessa linha versam sobre a influncia da condio
micorrzica da planta na competio entre estirpes eficientes de riz
bio pela ocupao dos ndulos nas razes (OLIVEIRA, 1998).
Os efeitos no crescimento de diferentes culturas e espcies forra
geiras (sorgo, soja, mandioca, estilosantes, andropogon, entre outras)
e no aumento da produo de gros de cereais como milho, feijo e
soja pela inoculao das reas ou pelo aumento da comunidade nativa
dos FMAs por prticas de manejo especficas tambm foram descritos
em estudos conduzidos entre as dcadas de 1980 e 2000 (MIRANDA,
1982; 1992; MIRANDA; MIRANDA, 1997, 2000, 2002, 2004, 2007;
MIRANDA etal., 2001).
Outra importante linha de trabalho conduzida na Embrapa
Cerrados trata do efeito dos FMAs na produo de mudas. A maioria
das espcies arbreas tropicais, frutferas e florestais, nativas e ex
ticas regio do Cerrado passa pela fase de formao de mudas em
canteiros ou viveiros antes de serem transplantadas para o campo. O
benefcio da associao micorrzica e da inoculao, bem como a com
binao FMAs e planta hospedeira mais adequada, foram determina
dos para diferentes espcies, tais como pequi, mangaba, buriti, gue
roba, manga, graviola, maracuj, acerola, entre outras (MIRANDA;
MIRANDA, 2000; 2001).
Alguns estudos com FMAs foram conduzidos tambm nos temas
de recuperao reas degradadas e controle biolgico. A contribuio
determinante de fungos nativos no estabelecimento de uma gramnea
tambm nativa (Aristida setifolia) em reas degradadas no Cerrado foi
descrita, com efeitos altamente significativos no crescimento dessa
planta (MARTINS etal., 1999).
O efeito dos fungos como agentes de controle biolgico foi
demonstrado especificamente com o nematoide Meloidogyne java
nica (DIEDERICHS, 1987), que parasita diversas plantas cultivadas
em solos de Cerrado, como soja, feijo, milho, mandioca e arroz,
entre outras. A ao dos FMAs como agentes de biocontrole, ame
nizando os danos causados por fitopatgeno, pode ser pela melho
ria do estado nutricional das plantas e (ou) pela maior resistncia do
sistema radicular.
308
Estudos valiosos para o manejo das populaes de FMAs foram rea

lizados com identificao da dependncia micorrzica e capacidade
de multiplicao desses fungos por parte de vrias culturas anuais ou
perenes, entre gramneas e leguminosas em solos com baixa disponi
bilidade de P (MIRANDA; MIRANDA, 2004). Estratgias de utilizao
de culturas multiplicadores desses fungos e dependentes da simbiose
so muito importantes em situaes onde se necessita aumentar as
populaes dos mesmos.
Nesse perodo, foram encontradas nos solos de Cerrado e descritas
duas novas espcies de fungos micorrzicos arbusculares: Scutellospora
cerradensis (SPAIN; MIRANDA, 1996a) e Paraglomus brasilianum
(SPAIN; MIRANDA, 1996b). Essas espcies esto depositadas e regis
tradas na Coleo Internacional de Culturas de Fungos Micorrzicos
Arbusculares e VesculoArbusculares, no Banco europeu de Glomales
e no Banco Ativo de Glomales da Embrapa Agrobiologia.
Outras importantes pesquisas realizadas e avanos alcanados nas
trs primeiras dcadas de micorrizologia da Embrapa Cerrados encon
tramse bem descritos e documentados em Miranda (2008).
As atividades de pesquisa atuais tm se concentrado em estudos de
ocorrncia de fungos micorrzicos arbusculares e avaliao do poten
cial de inculo desses importantes microrganismos em sistemas de
produo agroecolgicos e de baixo uso de insumos externos e em
ecossistemas naturais em reas de agricultores familiares do estado de
Gois e no norte de Minas, em rea de transio dos biomas Cerrado
e Caatinga. Essas avaliaes esto sendo conduzidas em projetos em
andamento, considerando a grande contribuio dos FMAs na aqui
sio de nutrientes em baixas concentraes ou em formas menos
disponveis para as plantas.
Paralelamente temse avaliado a ocorrncia de fungos micorrzi
cos arbusculares e o potencial de inculo de reas de solos ultramfi
cos com diferentes disponibilidades de nquel (Ni), colaborando em
projetos que objetivam estudar as relaes entre metais do solo e a
biodiversidade no Cerrado visando conservao ambiental e a recu
perao de reas degradadas. Com esse estudo, pretendese estimar
as diferenas quantitativas na populao de FMAs em reas distintas
quanto disponibilidade de Ni e sob o efeito de plantas hiperacumu
309
biotecnologia
ladoras ou no do metal, que ocorrem na regio. Os padres de colo

nizao micorrzica dessas plantas tambm esto sendo avaliados.
Os estudos sobre o potencial desses fungos como agentes de con
trole biolgico de nematoides ter continuidade, enfocando agora os
do gnero Pratylenchus. A determinao da glomalina em estudos de
parmetros bioindicadores de qualidade de solo ser iniciada em 2010
e pretendese tambm incluir as tcnicas moleculares de forma com
plementar s identificaes morfolgicas dos FMAs, enriquecendo
enormemente os estudos de ecologia desses organismos nos diferen
tes agroecossistemas do Bioma Cerrado.
Consideraes finais
As pesquisas sobre fungos micorrzicos arbusculares e sua sim
biose com as plantas terrestres tiveram incio h mais de um sculo
e se desenvolveram dentro das mais variadas vertentes das cincias
biolgicas e agrrias. As temticas no se esgotam e os fundamentos
e benefcios dessa associao seguem instigando os cientistas, apesar
das limitaes metodolgicas decorrentes do carter biotrfico obri
gatrio da simbiose.
As biotecnologias, incluindo os mtodos enzimticos e molecula
res, representam ferramentas importantes para o progresso das pes
quisas em micorrizas, permitindo elucidar desde aspectos evolucio
nrios e ecolgicos da simbiose, at a participao desses importantes
fungos na eficincia e sustentabilidade ambiental de sistemas de pro
duo agroalimentares.
A identificao de genes e sinais envolvidos na infeco e estabele
cimento da colonizao, a diversidade da populao dos FMAs asso
ciados s diferentes espcies vegetais e os padres de colonizao
das plantas representam um universo enorme para as pesquisas em
ecologia, e estudos nessa linha vem sendo conduzidos em todo o
mundo. A funo dessa simbiose no aproveitamento dos fertilizantes
e nutrientes, bem como nos aspectos de conservao de solo e armaze
namento de carbono pela glomalina, apresentamse como estratgias
de manejo de agroecossistemas condizentes com as demandas atuais
da agricultura em aliar a produtividade com a conservao ambiental.
Nesse sentido, a potencializao dessa associao pelo uso de espcies
310
vegetais que a promovam e a combinao dessas com novas fontes de

nutrientes de inestimvel valor. Esses desafios e as aplicaes dessa
simbiose mantm as pesquisas em micorrizas bastante atuais e moti
vadoras, pelo potencial de agregao das diferentes reas de conhe
cimento e pelos importantes avanos que ainda se pode conseguir.
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319
Captulo11
Captulo
5
Biotecnologia aplicada
engenharia de alimentos
Sonia Maria Costa Celestino
Klecius Renato Silveira Celestino
Introduo
A tecnologia da fermentao est concernida com a conduo de
processos biolgicos em escala industrial, fazendo a ligao entre a
biologia, a microbiologia, a engenharia qumica e a engenharia de ali
mentos. Os processos na tecnologia de fermentao so catalisados
ou por clulas vivas, ou por seus substratos.
O uso da microbiologia para a obteno de alimentos antecede a Era
Crist; e h milhares de anos, sem saber da existncia dos microrganis
mos, fabricavase po, vinho, cerveja, leite fermentado, queijos e outros.
A tecnologia da fermentao iniciouse com Pasteur, em 1857. Esse
descobriu que certas doenas eram causadas por microrganismos e
que fermentaes alcolicas tambm ocorriam na presena deles.
Em 1921, o primeiro antibitico foi fabricado por Piocianases; em
1928, ocorreu a descoberta da penicilina por Fleming; e, na Segunda
Guerra Mundial, houve grande avano na rea de biotecnologia, como
a fabricao de antibiticos e solventes por meio da conduo de pro
cessos microbiolgicos.
H cerca de 50 anos, poucos produtos, como bebidas alcolicas e
lcool etlico, eram produzidos em escala industrial, hoje essa produ
o abrange reas mais amplas como tratamento de resduos, obten
o de alimentos e raes, protenas, enzimas, vitaminas, hormnios,
antibiticos, solventes orgnicos, cidos, polmeros, soros e vacinas.
Engenharia bioqumica
A engenharia bioqumica o ramo da engenharia que se concentra
na conduo de processos biolgicos em escala industrial, utilizando
conhecimentos de microbiologia, bioqumica, termodinmica, fen
menos de transporte e operaes unitrias.
321
biotecnologia
O objetivo da engenharia bioqumica a aplicao dos conheci

mentos at aqui adquiridos na soluo de problemas que se apresen
tam na implantao de processos biotecnolgicos em larga escala, e
em sua otimizao.
O incio da engenharia bioqumica se deu aps a Segunda Guerra
Mundial, quando ocorreu o desenvolvimento em larga escala de pro
cessos de produo de alimentos e medicamentos de origem biotec
nolgica.
Microrganismos e meios de cultura

para utilizao industrial
Neste tpico, descrevemse as caractersticas gerais que microrga
nismos e meios de cultura devem apresentar, para que seja possvel
utilizlos em processos de larga escala, ou seja, em biorreatores de
grande volume.
O sucesso de um processo biotecnolgico depende da combinao
de quatro elementos/operaes importantes (Figura1):
a) Microrganismo.
b) Meio de cultura.
c) Conduo do processo.
d) Recuperao do produto.
Conduo do processo
Recuperao do produto
Meio de cultura
Microrganismo
Sucesso do Processo
Fermentativo
Figura 1. Os pilares do sucesso da tecnologia da fermentao.

322
Captulo 11 Biotecnologia aplicada engenharia de alimentos
O microrganismo ter preferencialmente de apresentar as seguin

tes caractersticas:
1) Ser capaz de produzir o produto desejvel e com cintica rpida.
2) Converter altas concentraes de produto.
3) Produzir poucos subprodutos.
4) Ter a possibilidade de ser reutilizvel e de uma forma barata.
5) Poder ser estocado em condies no extremas.
6) Trabalhar em condies de fcil conduo.
7) Suportar situaes de estresse.
8) No ser patognico.
9) No exigir meios de culturas dispendiosos.
As combinaes desses fatores devem ser levadas em considera
o na escolha do melhor microrganismo para o seu processo bio
tecnolgico.
Microrganismos que possam ter interesse industrial podem ser
obtidos basicamente das seguintes formas:
1) Isolamento a partir de fontes naturais.
2) Compra em colees de culturas.
3) Obteno de mutantes naturais.
4) Obteno de mutantes induzidos por mtodos convencionais.
5) Obteno de microrganismos recombinantes por tcnicas de
engenharia gentica.
J o meio de cultura tem de ter as seguintes caractersticas:
1) Atender s necessidades nutricionais do microrganismo.
2) Ser o mais barato possvel.
3) No provocar problemas de recuperao do produto.
4) Auxiliar no controle do processo.
5) Os componentes devem permitir algum tempo de armazena
gem, a fim de estarem disponveis todo o tempo.
6) Ter composio razoavelmente fixa.
7) No causar dificuldades no tratamento do efluente.
Todas essas caractersticas so importantes, enfatizandose o custo,
que deve ser o menor possvel, de forma a atender as necessidades
nutricionais do microrganismo.
323
biotecnologia
Na Figura 2, apresentase a sequncia de desenvolvimento de um

processo fermentativo, desde a adaptao do microrganismo, at a
fermentao em larga escala no biorreator industrial.
Microrganismo
selecionado
Matrias-primas
Meio de cultura selecionado
Preparo do inculo:
etapa de laboratrio
Esterilizao
Preparo do inculo:
etapa industrial
(germinadores)
Ar
Compressor
Esterilizao
do ar
Biorreator
industrial
Figura 2. Desenvolvimento de um processo fermentativo.
Estequiometria e cintica microbiana e enzimtica

O estudo cintico de um processo fermentativo consiste inicial
mente na anlise da evoluo dos valores de concentrao de um ou
mais componentes do sistema de cultivo, em funo do tempo de fer
mentao. Entendemse como componentes o microrganismo (ou
biomassa), os produtos do metabolismo (ou metablitos) e os nutrien
tes ou substratos que compem o meio de cultura.
324
X (n de clulas/mL)
S (substrato)
P (produto)
Esses valores experimentais de concentrao (X, P e S, respectiva

mente), quando representados em funo do tempo, permitiro os
traados das curvas de ajuste, conforme ilustrados na Figura 3.
0:00
2:00
4:00
6:00
8:00
10:00
Tempo (h)
Figura 3. Curvas de ajuste dos resultados de uma experincia idealizada de

fermentao (X, P e S so as concentraes do microrganismo, do produto
e do substrato residual no meio, respectivamente).
325
biotecnologia
Cintica das fermentaes

Microrganismos crescem em um largo espectro de ambientes fsi
cos e qumicos; seu crescimento e outras atividades fisiolgicas so
de fato uma resposta ao seu ambiente fsicoqumico. A cintica das
fermentaes descreve o crescimento e a formao de produtos por
microrganismos, e no somente o crescimento de clulas ativas, mas
tambm as atividades de clulas em repouso, j que muitos produtos
de fermentao de interesse comercial so produzidos aps o cresci
mento ter parado.
Crescimento microbiano
O crescimento microbiano usualmente caracterizado pelo tempo
requerido para duplicar massa celular ou nmero de clulas. Tempo
de duplicao de massa difere do de duplicao de clulas, pois a
massa celular pode aumentar sem um acrscimo no nmero de clu
las. Todavia, se, em dado ambiente, o intervalo entre duplicaes de
massa celular ou do nmero de clulas constante com o tempo, o
microrganismo est crescendo a uma velocidade exponencial.
Nessas condies, o crescimento dado por:
Em que:
X = concentrao celular em g/L.
N = concentrao celular em clulas/L.
t = tempo.
= velocidade especfica do crescimento em h1.
n = velocidade especfica de crescimento em h1.
Na maioria das circunstncias, crescimento medido pelo aumento
de massa. O valor .X a taxa de crescimento volumtrico (produti
vidade volumtrica) em g/L.h.
326
Integrando:
Considerando constante, temos o seguinte resultado:
Quando t = td, isto , o tempo requerido para que x2=2x1, cha

mado de tempo de gerao ou tempo de duplicao, temos a seguinte
expresso;
Crescimento bacteriano
Bactrias se dividem por fisso ou diviso simples; durante o cresci
mento, a clula duplica a sua massa e a quantidade de todos os cons
tituintes da mesma. Algumas bactrias, em dadas condies, divi
demse em 15 a 20 minutos, porm os tempos de duplicao tpicos
so de 45 a 60 minutos.
Crescimento de leveduras
Normalmente as leveduras se multiplicam por brotamento, algu
mas, por exceo, crescem (multiplicam) por fisso ou por formao
de hifas.
Em condies maximizadas, leveduras podem se dividir a cada 45
minutos, porm os tempos de 90 a 120 minutos so os mais tpicos.
Descrio qumica do crescimento microbiano

O crescimento de microrganismos pode ser visto como uma srie
de reaes qumicas, levando sntese da massa celular. A estequio
327
biotecnologia
metria generalizada para o crescimento celular pode ser descrita de

acordo com a reao abaixo:
Em que A, B, D, M, P e Q so os moles dos respectivos compostos;

CaHbOc uma fonte de carbono genrica; o M o nmero de moles
de uma unidade de clula CHON. Por exemplo, uma levedura
tpica pode ser representada por C6H11NO3. Assim a frao orgnica
da clula tem um peso molecular unitrio de 145. Se a clula 90%
orgnica e 10% cinzas, o peso molecular global de uma clula unit
ria 145/0,9 = 161.
A partir dessa relao estequiomtrica, podese ver que a relao
de massa celular formada pela massa de substrato consumido (M/A),
referido como rendimento celular, dependente da eficincia da uti
lizao da fonte de carbono para a incorporao na massa celular e
para a combusto a CO2 e H2O, na obteno de energia para o cresci
mento (multiplicao).
Exemplo:
Numa fermentao sobre ntetradecano com vistas produo de
massa celular, uma levedura, Cndida lipolytica M12, apresentou os
seguintes valores mdios dos principais elementos de sua composi
o celular:
C 43,76%
H 6,63%
N 8,26%
P 2,25%
O 33,22%
Calcule a frmula bruta do microrganismo, considerando que a sua
massa molecular igual a 100.
Resoluo:
Para uma unidade de clula CHON, temos de calcular a nova
composio celular em funo de C, H, O e N.
328
Composio celular em relao ao carbono:
Composio celular em relao ao Hidrognio:
Composio celular em relao ao oxignio:
Composio celular em relao ao nitrognio:
Ento a formula bruta do microrganismo : C4H7O2N
Cintica do crescimento microbiano

Aps a inoculao de um meio de cultura favorvel ao desenvol
vimento do microrganismo em estudo, sob condies adequadas,
observase um comportamento nos valores da concentrao celular
(crescimento celular), que caracterizado por um acrscimo de massa
e (ou) nmero de clulas.
Uma curva de crescimento descontnuo tpico, para um microrga
nismo que cresceu em um meio quimicamente definido, mostrado
na Figura 4.
329
biotecnologia
X - Conc. celular (n clulas/mL)
Xm
Xd
Xc
Xi
X0
0
Tempo
Figura 4. Curva de crescimento do microrganismo em cultivo descontnuo.
As seguintes fases no crescimento so observadas:

Fase 1 (Intervalo de tempo entre 0 e 1 Figura 4): conhecida como
fase lag ou de latncia, que segue imediatamente aps a inoculao
do meio com microrganismo em questo. Tratase de um perodo de
adaptao durante o qual a clula sintetiza as enzimas necessrias ao
metabolismo dos componentes presentes no meio.
Durante essa primeira fase, no h reproduo celular e, assim,
X=X0=constante. A durao dessa fase varia principalmente com a con
centrao do inculo (e, portanto, com o valor de X0), com a idade do
microrganismo (tempo de prcultivo) e com o seu estado fisiolgico.
Quando uma cultura microbiana mudada de um ambiente a
outro, necessrio reorganizar ambos os seus constituintes, micro
e macromoleculares; isso pode envolver a sntese ou represso de
enzimas ou constituintes. A fase lag, como consequncia, pode ser
muito curta ou mais extensa. Pode haver uma aparente ou pseudo
fase lag quando o inoculo pequeno ou tem baixa viabilidade, j
que crescimento somente pode ser registrado acima do nvel de sen
sibilidade do mtodo de anlise.
330
In (X)
A durao da fase lag bastante difcil de estimar, sendo mais fcil

sua determinao experimental. O objetivo geral de um bom processo
seria minimizar a fase lag.
Fase 2 (Intervalo de tempo entre 1 e 5 Figura 4): conhecida como
fase logartmica ou exponencial.
Uma vez completadas as alteraes necessrias, termina o perodo
de adaptao e as clulas comeam a crescer, normalmente em cres
cimento exponencial ou logartmico.
A fase exponencial caracterizada por uma linha reta em um gr
fico semilog de ln X por tempo. Esse um perodo de crescimento em
estado estacionrio, durante o qual a velocidade de crescimento espe
cfico constante. Durante a fermentao, a composio qumica
do meio est variando, j que os nutrientes esto sendo consumidos
e os produtos formados. Como consequncia, o ambiente no est
em estado estacionrio. Num intervalo de concentrao de nutrien
tes, a taxa de crescimento independente da concentrao. Tambm,
durante a fase log, a composio macromolecular da clula perma
nece constante (Figura5).
Reta da fase log
Figura 5. Fase exponencial caracterizada por uma linha reta em um grfico

semilog (crescimento de microrganismo por tempo em cultivo descontnuo).
331
biotecnologia
Na fase exponencial, podemos aplicar a equao abaixo descrita:
Fase 3 (Intervalo de tempo entre 5 e 8 Figura 4): fase estacio

nria. Em algum momento, a velocidade de crescimento comea a
diminuir, ou devido ao desaparecimento de um nutriente essencial ou
devido ao acmulo de um produto inibidor. A clula passa por uma
transio at que a velocidade de crescimento seja zero.
Essa fase estacionria ocorre quando todas as clulas alcanaram
equilbrio com clulas mortas, isto , com a velocidade de morte.
Durante a fase estacionria e de morte, ou de declnio, algumas clu
las esto se dividindo, enquanto outras morrem. Frequentemente
as clulas mortas sofrem autlise, e os carboidratos, aminocidos e
outros componentes liberados da clula rompida so ento usados
como nutrientes pelas clulas remanescentes da populao. Esses
eventos canibalsticos ajudam a manter a populao durante a fase
estacionria. Devido falta de nutrientes e presena de produtos txi
cos, a populao no pode sustentarse e a fase de morte se inicia.
Relativamente, poucos estudos tm sido feitos sobre a fase de morte
de culturas de clulas, talvez porque a maioria dos processos micro
biolgicos descontnuos industriais terminada antes da fase de
morte comear.
Velocidade de crescimento versus

concentrao de nutrientes
Durante a maioria das fermentaes descontnuas, a velocidade
especfica de crescimento () constante e independente da concen
trao de nutrientes que est variando. Porm, a velocidade de cres
cimento, como uma velocidade de reao qumica, uma concen
trao de produtos qumicos. Os produtos qumicos nesse caso so
nutrientes essenciais ou substratos para crescimento. A forma de
relao entre velocidade de crescimento e concentrao de substrato
foi observada em 1949 por Monod. O modelo de Monod tem a forma:
332
Em que:
= velocidade especfica de crescimento.
m = velocidade especfica de crescimento mximo.
S = concentrao do substrato.
KS = constante, igual a S quando = 0,5.m
(velocidade especfica)
Na Figura 6, est representado graficamente em funo de S; e, na

Figura 7, o grfico de LineweaverBurk correspondente, utilizando
para a determinao dos parmetros cinticos de m e KS.
max
max
2
Ks
S (concentrao de substrato)
Figura 6. Representao grfica do modelo de Monod.
1/
Grfico de Lineweaver-Burk
-10
16
14
12
10
8
6
4
2
0
-5
KS / m
1/ m
0
10
15
20
25
KS 1
1
+
m S m
1/S
-1/Ks
1
Figura 7. Representao grfica da equao:
333
biotecnologia
Na Tabela 1, apresentamse valores de KS do modelo de Monod para

o crescimento de microrganismos no substrato glicose.
Tabela 1. Alguns valores de KS do modelo de Monod para crescimento.
Substrato
KS (mg/L)
Microrganismo
Glicose
1,0
Enterobacter aerogenes
Glicose
2,0 4,0
Escherichia coli
Glicose
25,0
Saccharomyces cerevisiae
Observaes:
a) Os valores de Ks so muito pequenos em relao concentra
o do substrato nas fermentaes industriais.
b) m, quando S>10.KS.
c) Para S<10.KS, uma forte funo da concentrao de substrato.
d) Durante a fase exponencial, =constante.
Muitos outros modelos tm sido propostos para relacionar veloci
dade de crescimento com concentrao de substrato, mas o modelo
de Monod mais comumente usado.
Exerccios:
1) Foi verificado em laboratrio que um certo microrganismo a
25 C e tendo como substrato a maltotriose segue a cintica de
Monod, determine os parmetros cinticos KS e m a partir da
tabela abaixo.
334
(h1)
S de maltotriose(g/L)
0,05
2,04
0,10
4,50
0,15
7,50
0,20
11,25
0,25
16,07
0,30
22,50
0,35
31,50
0,40
45,00
0,45
67,50
0,50
112,50
0,55
247,50
2) O mesmo microrganismo do item anterior, fermentando nas

mesmas condies, porm utilizando a maltose. Determine os
parmetros cinticos KS e m a partir da tabela abaixo.
(h1)
S de maltose (g/L)
0,05
2,00
0,10
4,50
0,15
7,70
0,20
12,00
0,25
18,00
0,30
27,00
0,35
42,00
0,40
72,00
0,45
162,00
O microrganismo tem afinidade maior pela maltotriose ou mal

tose? Explique a sua resposta.
Aerao e agitao
A velocidade de agitao e a taxa de aerao so importantes para
o suprimento de oxignio ao microrganismo no processo fermenta
tivo, sendo o oxignio normalmente suprido cultura microbiana na
forma de ar. Entre os processos biotecnolgicos de interesse indus
trial, envolvendo culturas de clulas microbianas, os de aerobiose
encontramse em maior destaque: produo de antibiticos, enzimas,
vitaminas, tratamento biolgico de resduos, etc; assim um adequado
dimensionamento do sistema de transferncia de oxignio necess
rio para uma alta produo da biomolcula de interesse.
Transferncia de oxignio
O objetivo central de um sistema de aerao e agitao o forneci
mento de oxignio para a manuteno de uma dada atividade respira
tria de um certo conjunto de clulas. Assim o que se visa transferir
o oxignio da fase gasosa (bolha de ar) para o lquido, fazer com que
335
biotecnologia
esse oxignio dissolvido chegue s clulas suspensas e, finalmente,

seja consumido.
Nesse caminho a ser percorrido pelo oxignio, existem muitas
resistncias, porm devemos considerar a resistncia de uma pel
cula lquida (meio de cultura) ao redor da bolha de ar. A taxa de trans
ferncia de oxignio pode ser descrita pela equao abaixo:
dC = KL.a (CsC)
dt
Em que:
C = concentrao de O2 dissolvido no meio de cultura.
Cs = concentrao de saturao de O2 dissolvido no meio de cultura.
KL.a = coeficiente de transferncia de massa.
= variao da concentrao de O2 dissolvido no meio de cul
tura com o tempo durante a aerao.
O parmetro KL.a deve ser determinado experimentalmente, e
usado para avaliar a capacidade de aerao de um fermentador.
Para a determinao de KL.a, devese obter dados sobre a concen
trao de O2 dissolvido no meio de cultura ao longo do tempo at a
saturao. O sinal de resposta de um eletrodo especfico para a medi
o de oxignio dissolvido uma tcnica muito utilizada. Consiste
em inicialmente borbulhar nitrognio no lquido (meio de cultura),
a fim de retirar todo o O2 dissolvido, at que a sonda indique zero. A
seguir, iniciase a aerao e a agitao do meio lquido nas condies
em que se pretende obter KL.a, passando ento a registrar o sinal da
sonda. Esse sinal sair do valor zero, aumentando at atingir a con
centrao de saturao Cs . Na Figura 8, a concentrao de saturao
(8 ppm) atingida aps 25 minutos.
336
Concentrao de Oxignio
(ppm)
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
10
20
30
40
50
Tempo (min)
Figura 8. Valores de concentrao de oxignio ao longo do tempo em um

processo de aerao.
Integrando a equao anterior com as condies iniciais de t=0 e C=0:

Ln(1C/Cs) = KL.a.t
Graficandose Ln(1C/Cs) versus tempo t, temse uma reta cujo coe
ficiente angular KL.a.
Biorreatores e sistemas para suprimento de oxignio

O valor de KL.a depender de variveis como taxa de aerao, velo
cidade de agitao e configurao das ps do agitador.
A taxa de aerao fornecida ao fermentador dada em VVM [volume
de ar/ (volume de meio de cultura x minuto]. Antes da entrada do ar
no fermentador, medidores de vazo registram o volume de ar/minuto
e ocorre a esterilizao por meio de filtros que apresentam material
filtrante com poros de dimenses menores do que os microorganis
mos a serem retidos. Normalmente, utilizamse membranas com
poros de 0,2 m a 0,22 m.
A agitao incrementa o valor de KL.a por diminuir a resistncia de
transferncia entre as bolhas de ar e o meio de cultura, entretanto a
mesma causa tenses de cisalhamento que podem destruir os micro
organismos.
337
biotecnologia
O detalhe A na Figura9 um biorreator agitado e aerado (Stirred

Tank Reactor STR), constituindo 93% das aplicaes na indstria
de alimentos. Os tanques agitados e aerados so projetados com as
seguintes relaes: a altura do lquido igual ao dimetro do tanque; e o
agitador do tipo turbina constitudo por seis ps planas (detalhe C da
Figura 10), apresentando um dimetro igual a um tero do dimetro do
tanque. Usase um sistema de quatro chicanas, para evitar a formao
do vrtice, diametralmente opostas, apresentando cada uma largura
de 1/10 ou 1/12 do dimetro do tanque. Os detalhes B e C na Figura9
sugerem a possibilidade de se transferir oxignio apenas por borbu
lhamento de ar. No detalhe B (coluna de bolhas), so instalados distri
buidores de bolhas de ar comprimido no fundo do biorreator de modo
que possam ser distribudas uniformemente em todo meio de cultura.
No detalhe C (air lift), o ar introduzido no biorreator atravs de uma
coluna material cermico sintetizado de pequenos poros, ocorrendo a
difuso das bolhas de ar do interior da coluna para o meio de cultura.
As vantagens dos sistemas exclusivamente de borbulhamento so:
menor cisalhamento das clulas; economia de energia por no neces
sitar de agitao mecnica; construo do reator ser facilitada. As des
vantagens so as vazes de aerao elevadas par um bom nvel de agi
tao e gastos de energia na compresso do ar.
Figura 9. Tipos de biorreatores: (A) Stirred Tank Reactor (STR); (B) coluna
de bolhas; (C) air lift.
338
Figura 10. Principais tipos de agitadores: (A) tipo hlice marinha (propeller);
(B) tipo lmina (paddle) verticail; (C) turbina com seis ps.
Tenso cisalhante na agitao

A tenso de cisalhamento funo da geometria das ps do agitador
e de sua velocidade rotacional. Na Figura 10, so apresentados alguns
modelos de ps de agitadores mais utilizados.
Os agitadores promovem um turbilhonamento axial e (ou) radial.
Os agitadores do tipo propeller so de escoamento axial, usados para
agitar meios de baixa viscosidade; opera a velocidades elevadas e so
tambm de menores dimenses (geralmente < 50 cm). As paddles
operam a velocidades baixas ou moderadas (20150 rpm) e o seu di
metro da ordem de 50% a 80% do dimetro do tanque do fermen
tador; o escoamento radial, se as lminas forem verticais, ou axiais,
se as lminas forem inclinadas. Os agitadores tipo turbina com seis
ps so os mais utilizados.
A tenso de cisalhamento mdia em um tanque agitado pode ser
calculada pelas seguintes equaes:
= kN
=
Em que:
: viscosidade dinmica do meio de cultura (Pa.s).
N: velocidade rotacional do agitador (rps).
k: constante que depende da geometria do sistema (k=15 para agita
dor tipo turbina com 6 ps e k=11 para agitador tipo hlice marinha).
: tenso cisalhante mdia (Pa).
: taxa de deformao.
339
biotecnologia
Para o crescimento de microrganismos aerbios e a produo do

metablito de interesse, no somente o suprimento apropriado de oxi
gnio importante, mas tambm o grau de cisalhamento na agitao,
que pode ser determinante para o sucesso do processo fermentativo.
Produo de alimentos e aditivos por fermentao

Fermentao ltica de frutas e hortalias
A fermentao ltica utilizada na conservao de alimentos por
meio do preparo de picles. Alm do pepino, outras matriasprimas
podem ser utilizadas, como cebola, cenoura, couveflor, brcoli, chu
chu, pssego, figo, pra, morango e outras. A fermentao representa
economia de energia, pois no so necessrias operaes como refri
gerao ou pasteurizao para a conservao do alimento.
A microbiologia da fermentao composta por bactrias lti
cas, enterobactrias e leveduras. Os dois ltimos so indesejveis,
pois so as primeiras as responsveis pela produo do cido ltico
e pelas caractersticas desejveis do produto. Durante a fermenta
o, com a produo de cido ltico, o pH diminui e o desenvolvi
mento das enterobactrias inibido a partir de pH 4,5. O pH cido
no inibe o desenvolvimento de leveduras, as quais formam pelculas
na superfcie das hortalias em fermentao, consomem cido ltico,
aumentando o pH, e permitindo que outros microrganismos cresam.
Amolecimento, mudanas de cor e aparecimento de manchas bran
cas em hortalias so consequncias do crescimento de leveduras.
A microbiota da fermentao est presente na superfcie das horta
lias, assim como bactrias aerbias indesejveis. As condies da fer
mentao na ausncia de ar e na presena de sal (cloreto de sdio) so
desfavorveis s bactrias aerbias e favorveis s bactrias lticas. A
concentrao de sal no incio da fermentao deve ser de 12Brix. A
temperatura ideal de fermentao para as bactrias lticas est entre
18C e 20C. A relao entre salmoura e hortalia deve ser de 1,8:1.
No final da fermentao, os valores de pH e acidez total apresentamse
praticamente constantes, e os tecidos das hortalias tornamse transl
340
cidos, com colorao de tonalidade mais clara. A fermentao requer

de 4 a 6 semanas. As bactrias lticas produzem compostos antimi
crobianos (bacteriocinas), garantindo a inocuidade e extenso da vida
de prateleira dos produtos fermentados.
Em vez da fermentao natural, podese utilizar fermentos lticos
inoculados na salmoura. Nesse caso, permitido um tratamento tr
mico do vegetal (branqueamento) antes da fermentao para a mini
mizao da carga de microrganismos indesejveis. O branqueamento
pode ser feito pela imerso do vegetal em gua a 90 oC por 5 minutos,
ou tratamento com vapor. Esse procedimento tambm auxilia na pre
veno do escurecimento enzimtico do vegetal.
Os picles fermentados, antes de serem consumidos, devem ser lava
dos com gua morna (45 C a 50 C) por algumas horas, podendo
tambm ser matriasprimas para o picles em vinagre. A maioria das
agroindstrias produtoras de picles no utiliza a fermentao ltica, o
produto obtido com a imerso da matriaprima em vinagre condi
mentado; no entanto o picles preparado com matriaprima fermen
tada possui sabor agradvel e possui qualidades fsicas de cor e tex
tura superiores ao tradicional picles em vinagre.
Produo de vinho
No contexto geral, podese destacar que o vinho uma bebida ela
borada a partir da fermentao alcolica dos acares de frutas ss e
maduras, estimuladas pela ao de leveduras, que so responsveis
diretas pela transformao dos acares (glicose e frutose) em lcool e
gs carbnico. Ao referirse a bebida como apenas vinho, predizse que
a matriaprima uva, logo vinhos elaborados de outras frutas devem
ser rotulados com a denominao vinho acompanhado do nome da
fruta que lhe deu origem: vinho de laranja, vinho de pera, vinho de
manga, etc. A composio do vinho no s se origina em funo da
variedade e qualidade da matriaprima, mas tambm de outros fato
res do produto acabado, como sua idade, safra e conservao. Porm
todos os compostos que o constituem so desenvolvidos pelo processo
fermentativo, em que h uma decomposio parcial de cidos diver
341
biotecnologia
sos, lcool, vitaminas, glicerol, composto fenlico, substncias aro

mticas, sais minerais e taninos.
O teor de acar das frutas (glicose, frutose, sacarose) varia em fun
o de vrios fatores, tais como o estgio de maturao, o clima, o solo
e a variedade. Os vinhos sempre apresentam uma frao de frutose
e um pouco de glicose. A sacarose hidrolisada em glicose e frutose
pela enzima invertase produzida pelas leveduras. Nos vinhos, a gli
cose provm tambm da hidrlise de certos glicdios durante a con
servao. O lcool etlico o constituinte mais importante do vinho
depois da gua, que representa cerca de 85% a 90%. O grau alcolico
dos vinhos varia entre 9 oGL e 15 oGL; existem, entretanto, vinhos de
mais baixo teor e os com concentrao alcolica que chega a 18 oGL
(vinhos licorosos).
Os principais cidos orgnicos de vinhos so: o cido mlico, tart
rico e ctrico, provenientes das prprias frutas; e os provenientes da
fermentao: succinico, ltico e actico. A maior parte dos cidos org
nicos encontrase nos vinhos na forma livre e constitui a acidez total.
Os compostos fenlicos so denominados matrias corantes ou
matrias tnicas. Apresentam uma importncia muito grande, pois
conferem aos vinhos a colorao e grande parte do sabor. Os gostos de
vinhos de uva tintos e brancos so diferentes pela presena de com
postos fenlicos em propores mais elevadas nos primeiros. Os com
postos fenlicos so constitudos de cinco grupos qumicos: antociani
nas, flavonas, feniscidos, taninos condensados, taninos catequicos.
Os steres so normalmente formados durante a fermentao pelas
leveduras, bactrias lcticas e acticas, durante o envelhecimento na
madeira ou na garrafa. Em baixa concentrao, considerado como
constituinte favorvel ao aroma do vinho.
Em geral, entre a colheita do fruto e expedio do vinho engarra
fado, h um conjunto de etapas. Na Figura 11, apresenta um fluxo
grama ilustrativo do processo de produo de vinho.
342
Recepo e Seleo
Extrao da polpa
Chaptalizao da polpa
Fermentao tumultuosa
Inculo
Trafega
Fermentao Lenta
Afinamento
Figura 11. Processo de obteno do vinho.
Classificao dos frutos (ou seleo dos frutos )

As frutas devem ser selecionadas de acordo com grau de matura
o; fase em que se eliminaram, observandose a aparncia dos fru
tos, aqueles mais defeituosos, estragados, inclusive os que apresen
taram algum estgio de fermentao.
Extrao da polpa
A extrao do suco a partir da parte comestvel da fruta pode ser
efetuado em despolpador munido de peneiras, importante principal
mente para frutas com polpa fibrosa, como manga e abacaxi, visto que
as fibras insolveis prejudicam a fase de fermentao, e dificultam as
etapas de filtrao. No caso de uva, devese romper as bagas por com
presso em uma esmagadeira que separa as sementes, as cascas e o
343
biotecnologia
suco para a fermentao e elimina os engaos, os quais podem con

ferir caractersticas indesejveis ao vinho.
Chaptalizao da polpa
Uma correo (chaptalizao) do teor de acar da polpa pode ser
realizada a partir da adio de sacarose, para se obter uma bebida com
graduao alcolica entre aproximadamente 9% e 15% (V/V). A adio
de sacarose permitida at que o Brix duplique seu valor em relao
ao medido na polpa in natura.
Inoculao de leveduras (inculo )

O mosto pode ser inoculado com leveduras selecionadas, que domi
nam rapidamente os microrganismos selvagens que esto presentes
nas superfcies das frutas, se for utilizado um meio preparado previa
mente com anidrido sulfuroso, o qual protege o mosto da oxidao
e exerce uma funo inibidora sobre os microrganismos selvagens.
Fermentao tumultuosa, trafega e fermentao lenta

A fase tumultuosa ocorre no incio do processo fermentativo, apre
sentando acentuadas variaes das propriedades do mosto. Quando
a temperatura se eleva para acima de 33 oC, necessria a refrigera
o do mosto pra preservao das leveduras. Um dispositivo simples
para a refrigerao o mosto circular no interior de um tubo met
lico disposto em forma de serpentina, mergulhado dentro de uma
cuba com gua fria.
Aps a fermentao tumultuosa, realizase a trafega do vinho, o
qual passa por um processo de eliminao de resduos, ou seja, par
tes slidas com fermentos, a partir de um filtro. O filtrado pode ser
transferido a uma nova dorna iniciandose assim a fermentao lenta.
Durante as fases de fermentao, realizase o acompanhamento de
parmetros fsicoqumicos: temperatura, grau Brix, acidez, pH e den
sidade fatores importantes para determinar o padro de identidade
e qualidade do novo produto.
344
No decorrer da fermentao, o Brix, a densidade e o pH diminuem,

enquanto a acidez e a temperatura aumentam.
Afinamento
Aps o fim do processo fermentativo, centrifugase o vinho para
eliminar todos os resduos, o que facilita o processo de filtrao. Em
todo processo de fabricao de vinho, ele deve passar por um estgio
de filtrao, pois, ao trmino da fermentao, a sua caracterstica com
relao aparncia turva.
Produo de cido ctrico

O cido ctrico um dos aditivos de alimentos produzidos por
microorganismos. O cido ctrico responsvel pelo sabor azedo de
frutas ctricas. Poderia ser obtido delas, mas necessitaria de milhares
de frutos para produzir a quantidade de cido ctrico atualmente feita
pela fermentao de melado com o fungo Aspergillus niger.
Ao contrrio das principais fermentaes de alimentos e de bebi
das cujas origens remontam antiguidade, os processos de produo
desse cido s comearam a ser desenvolvidos nos ltimos 100 anos.
Cerca de 70% da produo utilizada pela indstria de alimentos e
bebidas; 12% pela indstria farmacutica; e 18% por outras indstrias.
Na indstria de alimentos, usase em larga escala como acidulante e
antioxidante por apresentar sabor agradvel, baixssima toxicidade e
alta solubilidade. usado em refrigerantes, sobremesas, conservas,
vinhos, refrescos em p e doces. Alm disso, esse cido tem capaci
dade de complexao com metais pesados como o ferro e o cobre. Essa
propriedade tem conduzido a crescente utilizao como estabilizante
de leos e gorduras para reduzir a sua oxidao catalisada por esses
metais. Tambm, essa propriedade, aliada ao baixo grau de corrosivi
dade a certos metais, tem permitido seu uso na limpeza de caldeiras
e instalaes especiais.
O principal processo fermentativo utilizado na produo de cido
ctrico por cultura submersa: o fungo se desenvolve inteiramente
submerso no meio de cultura lquido sobre agitao (que serve para
345
biotecnologia
assegurar a homogeneidade tanto da distribuio dos microorganis

mos quanto dos nutrientes).
Fontes de carboidratos para a produo de cido ctrico

Maltose (dois monmeros de glicose), sacarose, manose, gli
cose e frutose so os acares mais apropriados para a produ
o de cido.
Na prtica, o cido ctrico produzido a partir de carboidrato
purificado (sacarose) ou da fonte de carboidrato bruto, de preo
mais conveniente, como melao de cana de acar, melao de
beterraba, sacarose bruta, caldo de cana e hidrolisado de amido.
Estudos apresentam o resduo bagao de mandioca como fonte
de carboidrato previamente tratado com enzimas amilolticas.
Glicerina tambm um susbtrato adequado para a produo de
cido ctrico por Yarrowia lipolytic. Esse fermento produziu at
35 g/L de cido ctrico quando uma concentrao inicial alta de
glicerol foi usada no mdio de cultura. Parmetros de produo
cidos ctricos em glicerol foram semelhantes aos obtidos com
glicose como susbtrato.
Bioqumica da fermentao do cido ctrico

Essencialmente a glicose transformada em piruvato pela via glico
ltica. O piruvato transformado em acetil CoA, que entrar no ciclo
de Krebs para a formao do citrato.
Separao do produto
O meio fermentativo dever ser filtrado. O citrato precipitado da
soluo por adio de suspenso de hidrxido de clcio (que deve ter
um baixo teor de magnsio para no haver formao de citrato de
magnsio, que solvel em gua). Em seguida, o citrato de clcio
filtrado e a massa, transferida para um tanque, onde ela vai ser tra
tada com cido sulfrico para precipitar o sulfato de clcio. O sobrena
dante contendo cido ctrico purificado por tratamento com carvo
ativado e desmineralizado (retirada de ons) por sucessivas passagens
346
atravs de colunas com resina de troca inica, e a soluo purificada

ento cristalizada por evaporao, sendo os cristais removidos por
centrifugao.
Produo de carotenoides
Microorganismos produzem pigmentos como carotenoides, mela
ninas, flavonas, quinonas, etc. Os carotenoides so pigmentos (coran
tes) e apresentamse na cor amarelo, laranja, vermelho. Possuem
a funo de antioxidantes, protegendo as clulas contra os radi
cais livres; so precursores de vitamina A (caroteno, caroteno e
criptoxantina); e esto presentes como aditivos em diversos alimen
tos como manteigas, queijos, compotas e cereais.
Os corantes carotenoides podem ter preparao sinttica, extrao
de fontes naturais (extrato de pimento, tomate, cenoura) ou obten
o por processo fermentativo.
O uso de corante sinttico em alimentos altamente controverso
devido sua avaliao negativa, mas permitido pela legislao. Um
substituto natural (biocorante) mais bem aceito devido ao apelo de
vida saudvel. Plantas e microorganismos so fontes dessas subs
tncias, no entanto, no que se refere produo por fermentao,
ainda so necessrios estudos sobre a segurana do uso alimentar.
Os carotenoides licopeno e caroteno provenientes de fontes vege
tais esto disponveis no mercado como suplementos na forma far
macutica. Os principais microrganismos produtores desses carote
noides so algas unicelulares e fungos: Blakeslea trispora (caroteno)
e Erwinia uredovora e Fusarium sporotrichioides (licopeno). Em adio
a isso, outros microrganismos, incluindo Serratia e Streptomyces, pro
duzem outros carotenoides em grande quantidade.
A biotecnologia poder permitir uma produo eficiente e massiva
de corantes alimentcios, mas o sucesso de qualquer pigmento pro
duzido por fermentao depende de sua aceitabilidade no mercado,
aprovao pela legislao e o investimento requerido para o desenvol
vimento da produo contnua.
347
biotecnologia
Produo e purificao de extratos enzimticos

A produo de enzimas microbianas em escala industrial ocorre
prioritariamente por fermentao submersa. Poucos so os proces
sos prvios fermentao e um dos mais importantes o preparo do
inculo. Podese partir de um cultivo em frasco agitado, inoculado
com a cultura estoque. Quando em fase de crescimento exponen
cial, esse cultivo pode ser inoculado em fermentador de escala piloto
de 100 L a 500 L de capacidade, que contm meio de cultivo similar
ao da escala de laboratrio. Decorrido um tempo conveniente, essa
cultura inoculada no fermentador principal, que em geral tem de
10.000 L a 100.000 L de capacidade e so em geral operados em bate
lada. Esses fermentadores so encamisados ou possuem serpenti
nas internas para as necessidades de aquecimento e refrigerao e de
sistemas de medidas (sensores de pH, temperatura, oxignio dissol
vido). O parmetro de controle mais representativo para determinar
o trmino da fermentao a atividade enzimtica. No entanto, algu
mas vezes a sua determinao demorada; acarretando tempos de
resposta longos. Nesse caso, a variao de outros parmetros de pro
cesso, como pH e oxignio dissolvido, pode ser usada para caracteri
zar o fim do processo.
Os meios de cultura so formulados pela utilizao de compostos
quimicamente conhecidos ou de matriasprimas naturais. Para a
escala industrial, os compostos qumicos so onerosos e a opo geral
mente feita por meios que contenham apreciveis quantidades de
matriasprimas provenientes da agricultura (Tabela 2) por serem de
baixo custo.
Tabela 2. Resduos agrcolas utilizados como substrato para a produ
o de enzimas.
Microrganismo
Substrato (resduo agrcola) Enzima produzida
Penicillium simplicissimum
farelo de soja
lipase
Thermoascus auranticus
palha de trigo
celulase
Trichoderma reesei
gro de trigo
celulase
Trichoderma harzianum
bagao de frutas
endo ou exopoligalacturonase
(pectinase)
Humicola grisea var. thermoidea engao de bananeira
348
xilanase (hemicelulase)
As operaes que seguem ao processo fermentativo dependem da

localizao da enzima de interesse (intra ou extracelular). Enzimas
extracelulares so recuperadas do caldo fermentativo e etapas de sepa
rao e purificao so utilizadas. A purificao de enzimas intrace
lulares mais complexa, pois envolve as etapas de ruptura celular e
posterior separao dos constituintes intracelulares.
No caso de enzimas extracelulares, ao trmino do processo fermen
tativo, o caldo (extrato bruto) resfriado a cerca de 5 C para assegu
rar as condies de estabilidade do produto e evitar o crescimento de
microrganismos contaminantes. O pH geralmente ajustado para o
valor timo de atuao da enzima produzida.
A separao das clulas pode ser feita por centrifugao ou filtra
o. Fungos filamentosos podem ser separados por centrifugao,
no entanto bactrias e leveduras podem necessitar de uma prvia flo
culao com sulfato de alumnio ou polieletrlitos. A filtrao uma
alternativa para a centrifugao, sendo, em geral, conduzida em fil
trosprensa ou filtros rotativos a vcuo. O extrato bruto deve ser con
centrado em mdulos de ultrafiltrao que utilizam membranas de 2
a 300 kDa. A soluo concentrada, uma vez diluda a nveis convenien
tes, pode ser embalada para ser comercializada com grau comercial
ou tcnico, ou, por diversas razes (aplicao, transporte, estocagem),
tornase uma opo vivel a obteno de um preparado enzimtico
bruto na forma slida. A secagem ocorre a vcuo, por liofilizao, ou
por atomizao em equipamento conhecido como spray dryer, onde
a soluo enzimtica injetada atravs de bico atomizador como got
culas e entra em contato com ar em contracorrente.
Os preparados enzimticos com grau comercial so utilizados em
indstria alimentcia, txtil, papel, etc; mas, se for para uso analtico
ou farmacutico, processos mais sofisticados de purificao, como
o caso das separaes cromatogrficas (troca inica, filtrao em gel),
devem ser utilizados. Assim o grau de purificao exigido est asso
ciado aplicao do produto.
Aplicao de enzimas na produo de alimentos

leos de citrus ou azeite de oliva podem ser extrados mais facil
mente, e com maior rendimento, utilizandose pectinases em substi
349
biotecnologia
tuio aos solventes. O uso da amostra enzimtica com atividade de

pectinase resulta em uma melhor qualidade organolptica dos leos,
pois a extrao de polifenis, ofenis e de outras substncias de sabo
res aromticos tambm incrementada, contribuindo para a estabi
lidade oxidante do leo.
O despolpamento de gro de caf envolve a remoo da casca da
cereja, que obtida por processos mecnicos. Aps o despolpamento,
ocorre a mucilagem, que se constitui no processo pelo qual o meso
carpo mucilaginoso aderente ao gro, rico em pectina, degradado
por enzimas (preparaes de pectinases, celulases e hemicelulases). A
mucilagem do caf alcana dois objetivos importantes: remove a ade
rente camada mucilaginosa, permitindo a rpida secagem dos gros,
e melhora a torrefao, o que refletido na qualidade da bebida.
A mucilagem por ao enzimtica substitui a remoo qumica que
pode ser feita pelo uso de lcalis, cidos ou gua morna. Hidrxido
de sdio um dos lcalis sugeridos. As desvantagens do uso de soda
ou cidos referemse ao uso cuidadoso e descarte dos produtos que
podem afetar o meio ambiente. A utilizao de enzimas substitui tam
bm a remoo mecnica, em que so utilizadas mquinas desenvolvi
das para esse processo, no entanto apresentam a desvantagem de alto
consumo de gua e de energia. H tambm possibilidade de danos
fsicos nos gros e possveis efeitos na qualidade da bebida.
Os oligogalacturondeos so conhecidos como ingredientes de ali
mentos bioativos. Essas molculas, provenientes da ao de endo
e exopolimetilgalacturonases sobre pectina, so nodigestveis e
podem, dessa maneira, ser usados como componentes na nutrio
humana e animal, em analogia s molculas de frutooligossacar
deos (inulina). A inulina quando ingerida chega ao intestino grosso
quase integralmente. Ela no hidrolisada nas suas unidades monos
sacardicas na parte superior do intestino, como consequncia, no
aumenta a glicemia e nem os nveis de insulina no sangue, sendo
ideal para diabticos.
Um preparado enzimtico com atividade de pectinase e glucanase
utilizado pela indstria do vinho para decompor seletivamente os
glucanos e as substncias pcticas no mosto, e melhorar o envelhe
cimento e a filtrao dos vinhos jovens. Para uma melhor liberao
350
dos valiosos compostos de aroma e cor contidos nas cascas das uvas
e no engao, estes, aps a macerao, sofrem um tratamento enzi
mtico com um complexo de pectinases, celulases e hemicelulases.
O resultado um vinho tinto de melhor qualidade e mais apreciado
pelo mercado.
Consideraes finais
Os processos fermentativos na indstria de alimentos represen
tam mtodos de conservao, obteno de alimentos mais saborosos
e aditivos cada vez mais necessrios a outros processos industriais. A
biotecnologia aplicada Engenharia de Alimentos tem por finalidade,
alm da obteno de produto, o desenvolvimento de processos indus
triais, com a determinao de parmetros que permitam clculos e
dimensionamentos. Tratase de um campo de trabalho multidiscipli
nar, que necessita da colaborao em diversas reas do conhecimento
(bioqumica, microbiologia, gentica, engenharia). Com o envolvi
mento de tantos ramos da cincia, a biotecnologia em alimentos apre
senta constante agregao de profissionais atuantes e inovaes.
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352
Captulo12
Captulo
5
Interaes moleculares
plantapatgeno
Magnlia de Arajo Campos
Mrio Lcio Vilela de Resende
Marilia Santos Silva
Introduo
A evoluo de plantas na terra tem sido compartilhada por intera
es moleculares com microrganismos simbiticos e patognicos,
sendo estas constantemente expostas a eles. A interao entre plantas
e seus patgenos fruto de relacionamento coevolucionrio entre eles
e a resistncia da planta, logo a patogenicidade do patgeno resul
tado dessa interao. Portanto, a interao entre plantas e seus pat
genos ntima (gentica, gene a gene), complexa (ativao de reaes
bioqumicas em cascatas, acmulo de protenas de defesa e mudan
as citolgicas e morfolgicas na planta) e antiga (desde a evoluo
das plantas na terra). Numa batalha coevolutiva, plantas respondem
ao ataque de patgenos e pragas, fazendo uso de mecanismos efeti
vos de resistncia a doenas.
Frente ao ataque de patgenos, esses mecanismos so acionados no
momento em que elas reconhecem a agresso. Se o reconhecimento
for rpido, uma resistncia eficiente contra doenas e ferimentos pode
ser induzida, impedindo o seu alastramento e alertando a planta sobre
agresses posteriores. Um reconhecimento tardio pode conduzir a
uma resistncia induzida atrasada, quando o patgeno j se insta
lou, mas que pode, ainda, prevenir a planta contra futuras infeces.
Este captulo apresenta uma sntese da viso global emergente
de descobertas importantes sobre as interaes entre plantas e seus
patgenos, numa abordagem que envolve terminologia e eventos
envolvidos, tais como barreiras prformadas, o reconhecimento dos
patgenos e as diferentes respostas imunes inatas de hospedeiras e
nohospedeiras eliciadas por eles.
355
biotecnologia
Bases para o entendimento do

relacionamento plantapatgeno
Os termos plantas nohospedeiras e plantas hospedeiras refe
remse ao fato de que patgenos tm um limitado espectro de plan
tas sobre as quais eles conseguem causar doenas (THORDAL
HRISTENSEN, 2003). A resistncia de nohospedeira a mais comum
e durvel forma de resistncia a doenas exibida por plantas contra a
maioria de microrganismos potencialmente patognicos. Essa resis
tncia descreve a imunidade de todos os membros de uma espcie de
planta contra todos os variantes genticos de uma espcie de parasita
ou patgeno especfico, no adaptado (Figura1).
Patgeno
Hospedeira
Raas
No patgeno
Espcie
Cultivares
Espcie
Resistncia de hospedeira (susceptvel ou resistente)
No hospedeira
Resistncia de no hospedeira (imune)
Susceptibilidade
Resistncia
raa-no especfica
(RH)
Resistncia
raa-especfica
(R V)
Imunidade inata
Doena
Doena
Doena
Doena
Figura 1. Viso geral do resultado da interao plantapatgeno. A interao

denominada compatvel quando resulta em doena e incompatvel quando
resulta em resistncia.
A patognese de patgenos fngicos noadaptados, por exemplo,

termina muitas vezes com a tentativa de penetrao deles dentro das
clulas de plantas nohospedeiras, tambm referidas como hospe
deiras em potencial. Um patgeno que no pode causar doena numa
planta nohospedeira referido como um potencial patgeno de
nohospedeira ou nopatgeno. Somente aps um longo perodo de
coevoluo que uma raa ou espcie de um patgeno tem a possibili
dade de adaptarse a certas plantas nohospedeiras, fazendo com que
356
Captulo 12 Interaes moleculares plantapatgeno
elas se tornem hospedeiras especficas e que os genes alvos de patoge

nicidade delas evoluam fenmeno chamado compatibilidade bsica
(MYSORE; RYU, 2004; OH et al., 2006; THORDALCHRISTENSEN,
2003).
Compatibilidade bsica , portanto, uma adaptao evolucion
ria especializada, e a evoluo de hospedeiras e de patgenos acon
tece acompanhada por mudanas na expresso de genes de defesa.
Quando a compatibilidade bsica existe, o patgeno deve ser capaz
de: (1) crescer eficientemente dentro do ambiente da hospedeira; e
(2) superar ou burlar as defesas da hospedeira. Entretanto, patgenos
de uma espcie vegetal esto bem adaptados s defesas da hospedeira
especfica, mas no s defesas de outras plantas. Ento, alteraes na
hospedeira criam condies insustentveis (fenmeno resistncia
especfica de hospedeira) para o patgeno. Da mesma forma, altera
es no patgeno podem levar a quebra dessa resistncia (suscetibili
dade). No caso da resistncia de nohospedeiras, que uma resistn
cia multignica, a inativao de qualquer um dos seus componentes
pode no ser suficiente para levar a uma planta suscetvel.
Patgenos bemsucedidos evoluram estratgias especializadas para
suprimir as respostas de defesa da planta e induzir susceptibilidade
doena em hospedeiras resistentes por vias diferentes. No entanto,
o que se observa que alguns gentipos da planta apresentam uma
imunidade raaespecfica, agora referida como Imunidade Disparada
por Efetores (IDE), tambm conhecida como resistncia de hospedeira.
Essa resistncia especfica de uma cultivar, ou um acesso, de uma
espcie de planta a uma raa de uma determinada espcie de patgeno
(Figura1), por isso essa resistncia especfica de hospedeira tambm
conhecida como resistncia vertical. Alm disso, diferentes nveis
de resistncia podem ser observados em diferentes cultivares de uma
mesma espcie de planta em resposta aos diferentes nveis de viru
lncia de diferentes raas de um patgeno. Porm, quando se trata da
resistncia referida como resistncia horizontal ou quantitativa, uma
mesma cultivar responde igualmente aos diferentes nveis de viruln
cia de diferentes raas de um patgeno (Figura1).
Nesse contexto, entendese por resistncia a capacidade da planta
em evitar ou atrasar a entrada e (ou) subsequente atividade de um
357
biotecnologia
patgeno. Na natureza, a resistncia a regra. Por outro lado, a colo

nizao de patgenos dentro de tecidos vegetais, assim como fatores
ambientais adversos, causa alteraes prejudiciais no estado fisiol
gico normal da planta, as quais caracterizam doena em plantas. As
anormalidades detectveis ou visveis denominamse sintomas. A
essa habilidade de os patgenos interferirem com uma ou mais fun
es essenciais da planta, dita hospedeira suscetvel, e causarem doena
denominase patogenicidade.
Como patgenos atacam plantas?

Patgenos atacam plantas porque, durante a evoluo de seu desen
volvimento, eles adquiriram a habilidade de viver das substncias pro
duzidas pelas plantas hospedeiras. Como muitas substncias esto
contidas no protoplasma das clulas vegetais, para acesslas os pat
genos primeiro precisam transpor as barreiras estruturais externas
da planta, a cutcula e a parede celular(AGRIOS, 1997).
A maioria dos patgenos tem acesso ao interior das plantas direta
mente, via penetrao da superfcie foliar (ex.: fungos) ou radicular
(ex.: nematoides), por meio de ferimentos (ex.: fungos, vrus, bactrias
e nematoides) ou por meio de aberturas naturais, tais como estma
tos e hidatdios (ex.: fungos, bactrias e vrus). Os fungos geralmente
secretam um coquetel de enzimas hidrolticas, incluindo cutinase,
celulase, pectinase, poligalacturonase e proteases, e alternativamente,
ou em combinao, tambm formam um rgo de penetrao na
ponta de seu tubo germinativo, denominado apressrio (KNOGGE,
1996). Alm desses, j foi relatada a produo de inibidores de prote
nas PR do tipo inibidores de quitinase, inibidores de glucanase e inibi
dores de proteinases, em resposta ao relacionamento coevolucionrio.
Uma vez que o interior da planta tenha sido violado, microrga
nismos precisam vencer o prximo obstculo, que a parede celu
lar, rgida, baseada em celulose, ao redor de todas as clulas. Seja por
meio de enzimas, toxinas ou hormnios, patgenos bemsucedidos
conseguem penetrar a parede celular e o interior das clulas vegetais.
Entretanto, j na membrana plasmtica, o microrganismo encontra
os receptores de superfcie extracelular capazes de reconhecer mol
culas especficas de micrbios.
358
Como plantas se defendem de patgenos ?

Plantas se defendem de patgenos por meio de mecanismos de
defesa constitutivos e induzidos. A resistncia gentica, dentro do
conceito de fisiologia do parasitismo, pode ser definida como a habi
lidade da hospedeira em prevenir ou retardar o estabelecimento do
patgeno em seus tecidos, num processo altamente dinmico, coorde
nado e dependente da existncia de mecanismos constitutivos e (ou)
psformados. A ativao dos genes ou fatores responsveis pela indu
o de sistemas de defesa psformados no momento, local e magni
tude adequados, aps o reconhecimento do patgeno pela hospedeira,
constituise num sistema de mltiplos componentes em que seu nvel
de expresso resultado do somatrio das contribuies individuais
de diferentes mecanismos de defesa e o nvel de resistncia a soma
das contribuies de um nmero desses mecanismos de resistncia.
Mecanismos de defesa prformados ou constitutivos

Algumas defesas esto presentes na planta antes mesmo do con
tato com o patgeno, e certas estruturas determinaro o avano ou
no desse microrganismo na planta. Teoricamente, existem duas
amplas categorias de defesa: a estrutural, morfolgica ou anatmica
e a bioqumica ou fisiolgica. Os mecanismos ou fatores estruturais
da planta atuam como barreiras fsicas, impedindo a entrada do pat
geno e a colonizao dos tecidos, enquanto as reaes qumicas que
ocorrem nesses tecidos produzem substncias que se mostram txi
cas ao patgeno ou criam condies adversas ao crescimento deste no
interior da hospedeira (PASCHOLATI; LEITE, 1994). O grau de envol
vimento dos mecanismos estruturais e bioqumicos, pr ou psfor
mados, nas respostas de resistncia varia de acordo com a interao
patgenohospedeira e, numa mesma interao, em funo da idade
da planta, do rgo ou tecido afetado, do estado nutricional e das
demais condies ambientais (Figura2).
359
biotecnologia
Estruturais (Fsicos)
Atraso na penetrao
Pr-formados
Ps-formados
Bioqumicos
Inibio do crescimento
Condies adversas para a sobrevivncia
Pr-formados
Ps-formados
- Cutcula
- Halos
- Fenis
- Fitoalexinas
- Estmatos
- Papilas
- Alcaloides
- Pilosidade
- Lignificao
- Lactonas insaturadas
- Protenas PR
(Pathogenesis-Related )
- Vasos condutores
- Camadas de cortia
- Glicosdeos fenlicos
- Camada de absciso
- Glicosdeos cianognicos
- Tiloses
- Fitotoxinas
- Espcies reativas
de oxignio
- Outros
Figura 2. Representao esquemtica de mecanismos de defesa estruturais

e bioqumicos prexistentes em plantas e psformados durante interaes
com patgenos.
Mecanismos de defesa psformados ou induzidos

As respostas de defesa induzidas podem ser localizadas ou sistmi
cas e so mais sofisticadas, pois envolvem o reconhecimento do pat
geno pela planta hospedeira, a transduo de sinais e a expresso de
vrios genes de defesa (MONTESINOS et al., 2002), etapas bsicas do
processo de sinalizao desenvolvido pelas clulas vegetais para per
ceber e responder a estmulos intrnsecos e (ou) extrnsecos ao orga
nismo vegetal.
A ativao dos genes ou fatores responsveis pela induo de sis
temas de defesa psformados no momento, local e magnitude ade
quados, aps o reconhecimento do patgeno pela hospedeira, consti
tuise num sistema de componentes mltiplos cujo nvel de expresso
resultado do somatrio das contribuies individuais de diferentes
mecanismos de defesa (Figura 2). O processo de sinalizao desen
volvido pelas clulas vegetais para perceber e responder aos estmu
los intrnsecos e (ou) extrnsecos apresenta certa analogia com o dos
animais, embora possua caractersticas estruturais e funcionais pecu
liares, e pode ser dividido em trs etapas bsicas: (1) o reconhecimento
ou percepo do sinal, realizado por receptores celulares especficos
ou inespecficos que reconhecem um determinado sinal (nesse caso,
360
molcula de origem do patgeno); (2) a transduo do sinal, que con

siste na transmisso do mesmo para seu stio de ao dentro da clula,
podendo ser feita de forma direta ou indireta (via mensageiros secun
drios, alteraes na fosforilao de protenas e atravs de protenasG;
e (3) a traduo do sinal, que consiste na converso do sinal em res
postas celulares especficas (CT et al., 1995), como, por exemplo,
a ativao de genes que induzem a sntese de protenas relacionadas
patognese (protenasPR) e de certas enzimas regulatrias do pro
cesso de produo de fitoalexinas (Figura 3).
Citoplasma
a
bran
Mem mtica
Plas
Reconhecimento ou
Percepo do Sinal
Transduo do Sinal
Deteco do Patgeno:
receptores de PAMPs/MAMPs
Efetores, Eliciadores
Sinalizao:
MAP Cinases (MAPKs),
Fatores de Transcrio,
cido Saliclico (SA),
cido Jasmnico (JA),
Etileno (ET)
Ncleo
a
bran
Mem clear
Nu
Traduo do Sinal
Resposta:
Hypersensitive Response (HR),
Espcies Ativas de Oxignio (AOS),
Resistncia Sistmica (SAR, ISR),
Transcrio de Genes relacionados
a Defesa (Protenas PR)
Figura 3. Viso geral das etapas envolvidas na resistncia de plantas a pat

genos.
Cronologicamente, a transduo de sinais para respostas de defesa

em plantas pode assim ser resumida, aps o reconhecimento do(s)
eliciador(es) pelo(s) receptor(es): abertura de canais de ons acidi
ficao do citoplasma ativao de quinases no citoplasma ativa
o do complexo NADPHoxidase produo de espcies ativas de
oxignio ativao de outros mensageiros secundrios (cido sali
clico, cido jasmnico e etileno) ativao de fatores de transcrio
transcrio de genes de defesa (protenas PR, enzimas de fitoalexi
nas, lignificao de tecidos, calose e outros reforos da parede celular)
resistncia local (reao de hipersensibilidade) e, subsequentemente,
imunidade sistmica (resistncia sistmica adquirida ou resistncia
sistmica induzida) (GRANT; LAMB, 2006) (Figura 4).
361
biotecnologia
Figura 4. Panorama geral das rotas de transduo de sinais ativando e coor

denando as respostas de defesa da planta. ACC oxidase: cido 1aminoci
clopropano1carboxlico oxidase; BAG: glucosdio do cido benzico; cido
benzico; BA2H: cido benzico2hidrolase; CA: cido cinmico; cGMP:
guanosina 5monofosfato cclica; CHS: chalcona sintetase; EFE: enzima for
madora de etileno; GP: glutationa peroxidase; GST: glutationa Stransferase;
HMGR: 3hidroxi3metilglutarilCoA redutase; HO2: radical hidroperoxil;
HPDase: hidroxiperxido dehidrase; interao de sinais; MAP: protena ati
vada por mitgeno; NO: xido ntrico; OGA e OGAR: fragmentos de oliga
lacturondeos e respectivos receptores; OH: radical hidroxil; PAL: fenilala
nina amnialiase; PGases: poligalacturonases; PM: membrana plasmtica;
SA: radical cido saliclico; SAG: glucosdio do cido saliclico; SIPK: pro
tena cinase induzida pelo cido saliclico; WIPK: protena cinase induzida
por ferimento.
Fonte: HammondKosack, K. & Jones, J. D. G. Chapter 21, Responses to Plant Pathogens. Pagina
1143. Editores. Buchanan, B.; Gruissem, W.; Jones, R. Titulo do livro: Biochemistry & Molecular
Biology of Plants, 1367 paginas, ano 2000.
362
Com base nessa Figura 4, protenas receptoras da planta (Rp) inter

ceptam sinais derivados do patgeno ou dependentes de interao.
Esses sinais incluem produtos diretos ou indiretos dos genes Avr, con
tato fsico e componentes gerais de cada organismo, tais como qui
tina, enzimas e fragmentos da parede celular das plantas. Protenas
receptoras da planta podem ser ou no produtos dos genes R. Os even
tos de sinalizao mais prximos do downstream no so conheci
dos, mas envolvem quinases, fosfatases, protenasG e fluxos de ons.
Vrios resultados distintos e rapidamente ativados so reconhecidos,
incluindo a produo de espcies reativas de oxignio (ROS) e xido
ntrico e a induo indireta da transcrio de genes de defesa (ou pos
sivelmente genes de apoptose). A amplificao da resposta inicial de
defesa ocorre atravs da gerao de molculas sinalizadoras adicio
nais, que so outras ROS, perxidos de lipdeos, cido benzico (BA),
cido saliclico (SA), cido jasmnico (JA) e etileno. Estes, por sua
vez, induzem outros genes relacionados defesa e modificam pro
tenas de defesa e enzimas. Alteraes simultneas do estado redox
das clulas ou danos celulares ativam mecanismos prformados
para a proteo da clula (por exemplo, o ciclo de HalliwellAsada,
a enzima superxido dismutase [SOD] localizada no plastdio e a
enzima catalase) e induzem genes que codificam vrios protetores
celulares. Estresses relacionados defesa tambm podem induzir a
morte celular. A comunicao entre as vrias rotas induzidas parece
coordenar as respostas. Em todos os processos de preparo das res
postas de defesa, os mensageiros secundrios tm um papel funda
mental. Os fitohormnios cido saliclico (AS), cido jasmnico (AJ) e
etileno (ET) esto envolvidos em uma rede de defesa refinada, eventu
almente, levando a um timo portflio de respostas contra invasores.
Outros mensageiros secundrios importantes a serem abordados na
presente reviso so: protenasG, inositol1,4,5trifosfato (IP3), cido
diacilglicerol (DAG), clcio (Ca2+), perxido de hidrognio (H2O2) e
xido ntrico (NO).
Como parte do resultado dessas estratgias, clulas de plantas sob
invaso muitas vezes desenvolvem uma resposta de hipersensibili
dade (HR, hypersensitive response), que uma morte celular rpida loca
lizada no stio de infeco; uma aumentada expresso de genes rela
363
biotecnologia
cionados com a defesa, p.ex.: genes PR (PR, pathogenesisrelated), e a

exploso oxidativa (VAN LOON et al., 2006). Na resistncia de hospe
deira, as respostas de defesa so, em geral, governadas por genes de
resistncia (R) nicos, cujos produtos cognatos reconhecem e inte
ragem direta ou indiretamente com eliciadores especficos produzi
dos por genes de avirulncia (Avr) de raas de patgenos especficos
(FLOR, 1971; MARTIM, 1999; HEATH, 2000).
Ao contrrio da resistncia de hospedeira, a qual tem sido bem estu
dada, a resistncia de nohospedeira opera sob mecanismos ainda
no bem entendidos, apesar dos enormes progressos nas cincias de
plantas. No est claro por que um patgeno altamente virulento sob
uma espcie de planta nopatognico em outras.
Alguns dos mecanismos j conhecidos que contribuem com a resis
tncia de nohospedeira so: (1) mecanismos de defesa passivos ou
prformados, os quais funcionam como uma barreira prformada,
presente na planta antes da tentativa de penetrao do patgeno; e (2)
mecanismos de defesa induzveis; (3) componentes de sinalizao de
defesa e (4) genes de resistncia de amplo espectro (MYSORE; RYU,
2004). O citoesqueleto de plantas possui papel significativo durante a
resistncia de nohospedeira. J foi demonstrado que microfilamen
tos de actina de plantas atuam na defesa contra a penetrao de fun
gos e sua inativao levou a perda da resistncia de nohospedeira a
inmeros fungos (KOBAYASHI et al., 1992; YUN et al., 2003). Alm
do citoesqueleto, metablitos secundrios e protenas antimicrobia
nas tambm so partes da defesa prformada (MYSORE; RYU, 2004).
Resistncia de nohospedeira a bactrias, fungos e oomicetos pode
ser de dois tipos: o Tipo I, que no apresenta qualquer sintoma visvel
(necrose do tipo HR), e o Tipo II, que est sempre associado a uma
necrose do tipo HR. O tipo de resistncia de nohospedeira que pode
ser disparado contra um dado patgeno depende de ambas as espcies
que esto interagindo, da planta e do patgeno, de tal forma que uma
determinada espcie de planta nohospedeira pode responder com a
resistncia Tipo I contra uma espcie de patgeno e com a do Tipo II
contra outra espcie. Por exemplo, Nicotiana benthamiana exibe uma
resistncia de nohospedeira Tipo I contra Xantomonas campestris pv.
campestris e Tipo II contra P. syringae pv. tomato (PEART et al., 2002;
364
MYSORE; RYU, 2004; OH et al., 2006). Existem fortes similaridades

entre as respostas de resistncia de hospedeira e a de nohospedeira,
no entanto ainda no est claro se o mesmo mecanismo est envolvido
na gerao dessas respostas de resistncia (Revisados por Mysore &
Ryu, 2004; Oh et al., 2006). Entretanto, por ser uma resistncia alta
mente eficiente e durvel, tem sido sugerido que os mecanismos de
resistncia de nohospedeira poderiam ser explorados para gerar
resistncia em plantas agriculturveis.
O sistema imune de plantas

Plantas, assim como animais, possuem mecanismos de defesa ina
tos para resistirem infeco causada por micrbios. Uma resistncia
de planta eficiente est baseada em duas formas evolucionariamente
ligadas de Imunidade Inata. A primeira resposta imune de plantas
referida como Imunidade Disparada por PAMPs/MAMPs (IDP). Nela,
as plantas evoluram protenas PRRs (receptores de reconhecimento
especfico de padres) para reconhecer estruturas microbianas inva
riantes conhecidas como eliciadores gerais, atualmente denominadas
padres moleculares associados patgenos (PAMPs) ou a micrbios
(MAMPs), j que todos os micrbios possuem PAMPs e no apenas
patgenos, os quais esto ausentes em seus hospedeiros eucariti
cos. Alm desses, padres moleculares tambm tm sido associados
a herbvoros (HAMPs) em respostas de defesa disparadas por herb
voros. Ainda, tecidos danificados liberam eliciadores endgenos de
plantas, atualmente referidos como DAMPs. Esses padres molecu
lares associados a danos mediam respostas de defesa a herbvoros e
patgenos e, assim como os PAMPs/MAMPs, so reconhecidos por
PRRs localizados na membrana plasmtica.
Por outro lado, durante a coevoluo, fitopatgenos bemsucedidos
adquiriram a habilidade de direcionar protenas efetoras para den
tro das clulas da planta, as quais contribuem para sua virulncia e
podem mascarar/suprimir essa imunidade primria IDP, permitindo
o seu crescimento e o aparecimento de doena. Em contrapartida, cul
tivares (individuais) de espcies de plantas adquiriram protenas R
(receptores de resistncia especfica) que reconhecem determinados
efetores, codificados por genes de avirulncia (Avr) de patgenos e
365
biotecnologia
ditos fatores de virulncia, para restaurar a resistncia a doena. Esse

tipo de mecanismo mais especializado de defesa de plantas para detec
tar patgenos referido como Imunidade Disparada por Efetores (IDE).
Reconhecimento de PAMPs e Imunidade Disparada por

PAMPs (IDP )
A imunidade disparada por PAMPs, imunidade basal, iniciada
aps o reconhecimento de estruturas microbianas conservadas pelos
receptores de superfcie celular de plantas (PRRs), e sua induo est
associada com sinalizao de MAP cinases, induo transcricional
de genes responsivos a patgenos, produo de espcies reativas de
oxignio e deposio de calose para fortalecer a parede celular no
stio de infeco, todos contribuindo para impedir o crescimento do
microrganismo tanto em plantas hospedeiras quanto nohospedei
ras (Figura 5).
De acordo com a demonstrao esquemtica da Figura 5, o reconhe
cimento de PAMPs por PRRs dispara prontamente a imunidade basal,
que requer sinalizao por meio de cascata de MAPKs e reprograma
o transcricional mediada por fatores de transcrio do tipo WRKY.
Patgenos secretam protenas efetoras, que so introduzidas por
algum mecanismo no citosol da planta, as quais tm como alvo mlti
plas protenas hospedeiras para suprimir a resposta imune basal, per
mitindo o crescimento do patgeno no apoplasto. Protenas de resis
tncia de plantas, representadas pelos domnios NBLRR, reconhecem
a atividade de efetores e restauram a resistncia por meio de uma res
posta imune disparada por efetores. Um limitado acmulo de pat
geno pode ocorrer antes das respostas imunes disparadas por efetores.
366
SDE
IDP
IDE
PAMPs
Patgeno
Membrana
Plasmtica
Receptor
PRR
Protena R
(NB-LRR)
Citoplasma
Efetor
Cascata de
MAPKs
disparada
Cascata de
MAPKs
disparada
MAPK
MAPK
Cascata de
MAPKs
disparada
MAPK
Ncleo
Membrana
Nuclear
Ativao
de Genes
Resposta
Imune
disparada
por PAMPs
RESISTNCIA
Ativao
de Genes
SUSCETIBILIDADE
Ativao
de Genes
Resposta
Imune
disparada
por Efetor
RESISTNCIA
Figura 5. Modelo para a evoluo do sistema imune de plantas. IDP: imuni

dade disparada por PAMPs; PAMPs: padres moleculares associados a pat
genos; PRR: receptores de reconhecimento de padres moleculares; MAPKs:
protenas ativadas por mitgenos (MAP) cinases; SDE: suscetibilidade dis
parada por efetores; IDE: imunidade disparada por efetores; NBLRR: dom
nios de ligao a nucleotdeos (NB) e de repeties ricas em leucina (LRR ).
Adaptado do modelo descrito por Chisholm et al. 2006 e Bent e Mackey 2007
para resistncia a bactrias.
Muitos PAMPs tm sido identificados como essenciais para o meta

bolismo ou para a penetrao e invaso de uma clula hospedeira e
so, portanto, amplamente conservados entre as diversas espcies de
patgenos (Tabela 1) (PARKER, 2003). Entre eles esto includos polis
sacardeos de bactrias Gramnegativas, peptdeoglucanas de bactrias
Grampositivas, flagelinas eubacteriais, bem como glucanas, quitinas
e protenas derivadas de parede celular de fungos (NRNBERGER;
BRUNNER, 2002).
A deteco de PAMPs pode ser extracelular ou intracelular e parece
ser um importante componente da resistncia de nohospedeira e
serve como a primeira linha de defesa contra a presena de patgenos
em potencial. Diferentes PAMPs so muitas vezes percebidos pelos
distintos receptores de reconhecimento padro de superfcie celu
367
biotecnologia
lar e ativam convergentes vias de sinalizao intracelular em clulas

de plantas para obteno de imunidade de amplo espectro, tambm
conhecida como resistncia basal.
Tabela 1. Padres moleculares associados patgenos (PAMPs) e suas
atividades na induo de defesa em plantas.
Estrutura mnima
requerida para
ativao de defesa
Resposta biolgica
LPS
Xanthomonas
Pseudomonas
Lipdeo A?
Exploso oxidativa, produo

de enzimas antimicrobianas
em pimenta, fumo, aumento
do potencial de defesa da
planta infeco bacteriana.
Flagelina
Bactrias Gram
negativas
flg22 (fragmento
do amino terminal
da flagelina)
Induo das respostas de

defesa em Arabidopsis,
arroz e solanceas.
Fator de
elongao
(EFTu)
Bactrias Gram
negativas
Efl18 (fragmento
amino terminal
Nacetilado
do EFTu)
Induo das respostas

de defesa em Arabidopsis
e outras brssicas.
Harpina (HrpZ)
Pseudomonas
Erwinia
Indefinido
HR, induo de resposta de

defesa em vrias plantas,
resistncia sistmica adquirida.
Bacillus spp.
Protena indutora Fusarium spp.
Indefinido
de necrose
Phytophthora spp.
Pythium spp.

defesa em vrias dicotiledneas.
Motivo Pep13
Transglutaminase Phytophthora spp. (epitopo exposto da
transglutaminase)
Induo de resposta de
defesa em salsa e batata.
PAMP
Patgeno

defesa em fumo e resistncia
sistmica adquirida.
Elicitinas
Phytophthora spp.
Indefinido
Pythium spp.
Xylanase
Trichoderma spp.
Pentapeptdeo
TKLGE (epitopo
exposto da xilanase)
HR, produo de etileno

em fumo e tomate.
Fermento
Peptdeo
Nmanosilado
(fragmento da
invertase)
Ativao da rota dos

fenilpropanoides e produo
de etileno em tomate.
Invertase
Continua
368
Estrutura mnima
requerida para
ativao de defesa
PAMP
Patgeno
Resposta biolgica
glucanas
Tetraglicosil glucitol,
Pyricularia oryzae
hepta glucosdeo
Induo de resposta de defesa
Phytophthora spp.
ramificado, oligo
em legumes, fumo e arroz.
Algas marrons
glucosdeo linear
Algas marrons
Oligossacarideos
de fucanas
Induo de resposta
de defesa em tomate
e resistncia sistmica
adquirida infeco viral.
Quitina
Vrios fungos
Oligossacardeos
de quitina (grau de
polimerizao > 3)
Induo de resposta de defesa

em tomate, Arabidopsis,
arroz, trigo e cevada.
Ergosterol
Vrios fungos
Indefinido
Induo de fluxo de
ons em tomate.
Cerobrosdios
A,C
Magnaporthe spp.
Base esfingoide
Produo de fitoalexinas
em arroz.
Glicoprotenas
fngicas
Vrios fungos
Nacetilglicosamina
Induo de resposta de
defesa em salsa.
Fucanas
sulfatados
Adaptado de Nrnberger e Lipka, 2005.
Embora um crescente nmero de componentes do tipo PAMPs

tenha sido identificado, os receptores em potencial para a maioria
deles ainda so desconhecidos. Entre os receptores de PAMPs de
plantas publicados, citamse o receptor de flagelina em Arabidopsis
(AtFLS2), a protena de ligao glucana (GnGBP) e o receptor de
xilanase (LeEIX) em arroz (KUNZE, 2005).
Reconhecimento de efetores e Imunidade Disparada por

Efetores (IDE )
A imunidade disparada por efetores envolve o reconhecimento
direto ou indireto por protenas R das muitas protenas microbia
nas usadas para subverter IDP (Figura 5). Esse reconhecimento de
um efetor pelas protenas NBLRR pode ser direto, explicado pelo sis
tema genea gene, em que protenas R reconhecem diretamente pro
dutos de genes AVR, ou indireto, explicado pela Hiptese Guarda,
em que protenas R estariam guardando, como um sensor, impactos
369
biotecnologia
sobre outras protenas para responder (JONES; TAKEMOTO, 2004).

No reconhecimento indireto, protenas R reconhecem efetores liga
dos a protenas de planta chamadas alvos de efetores de patgenos.
A ativao de resistncia mediada por protena R tambm suprime
o crescimento do patgeno, mas no antes que o invasor tenha tido
uma oportunidade para proliferao limitada. No surpreendente
que patgenos tenham adaptado efetores para interferirem com a
Imunidade Disparada por Efetores, fenmeno bem conhecido sob
condies de campo como quebra da resistncia.
Os efetores secretados por patgenos so introduzidos no citosol da
planta hospedeira por algum sistema de secreo, tal como o sistema
de secreo Tipo III, a exemplo de algumas bactrias (CHISHOLM et
al., 2005), ou sistema de secreo baseado em motivos presentes na
sequencia primria do efetor, a exemplo dos motivos RXLREER de
Phytophthora spp. (KAMOUN, 2006). Na Tabela 2, contm uma com
pilao de efetores caracterizados bioquimicamente e suas protenas
R correspondentes.
370
Tabela 2. Atividade enzimtica de efetores caracterizados bioquimicamente e eliciadores selecionados .

Efetores
Organismo
Funo Bioqumica
Gene R
RIN4
RPS2
AvrRpt2
Pseudomonas syringae
AvrB
RIN4
RPM1
AvrRpm1
HopPtoD2
AvrPphB
RIN4
RPM1
PBS1
RPS5
AvrPtoB
EPI10
EPI1
Ecp2
PWL1 e
PWL2
Fosfatase*
Protease*
E3 ligase, uma enzima
conjugada a ubiquitina
Xanthomonas campestris Cistena protease*
Xanthomonas campestris Cistena protease
Xanthomonas campestris Cistena protease
Cladosporium fulvum
Inibidor de Protease
Cladosporium fulvum
Ligao quitina*
Cladosporium fulvum
Inibidor de protease
Phytophthora infestans
Kazallike*
Inibidor de protease
Kazallike*
Cladosporium fulvum
Magnaporthe grisea
Fentipo
Referncia
Quebra RIN4, interfere na defesa
mediada por genes R, inibe a
1
defesa basal, e manipula a rota
do cido jasmnico (AJ)
Fosforilao do RIN4, manipula a rota do
1
AJ
Fosforilao do RIN4, inibe a defesa basal
1
Suprime a HR e a expresso de PRP**
1
Quebra a PBS1, manipula a rota do AJ
1
2
Pto
SUMO
SUMO
SUMO
Rcr3
Chitinase
XV4
Cf2
Cf4
Cf9
Subtilisina A,
P69B subtilase
Inibe a atividade de RCR3
Interage e interfere na PRP**

P69B de tomate e subtilisina A
Interage e interfere na
PRP P69B de tomate
P69B subtilase
CfECP2
1
1
1
3
4
5
6
7
5
8
371
Continua
XopD
AvrXv4
AvrBsT
Avr2
Avr4
Avr9
Protease*
Alvo na planta
AvrP123
Melampsora lini
Nip1
Phynchosporium secalis
AvrL567
Melampsora lini
ATR1NdWsB
ATR13
Avr3a
Avr1b
AvrPita
Hyaloperonospora
parasitica
Hyaloperonospora
parasitica
Magnaporthe grisea
Funo Bioqumica
Alvo na planta
Gene R
M
P4
P1, P2,
P3
Rrs1
L5, L6,
L7
RPP1
Fentipo
Referncia
8
9
9
9
8
10
11
12
Metaloprotease
R3a
Rps1b
Pita
13
14
15
*Funo bioqumica demonstrada in vitro; **PRP: protena relacionada patognese. ***Referncias: (1) Revisado por Mudgett (2005): (2) Janjusevic
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Efetores
Organismo
AVR2YAMO Magnaporthe grisea
Melampsora lini
AvrM
Melampsora lini
AvrP4
biotecnologia
372
Jones e Dangl (2006) e Bent e Mackey (2007) representaram a evo

luo do sistema imune de plantas em quatro etapas (Figura 6). Na
primeira fase, PAMPs/MAMPs so reconhecidos por PRRs, resul
tando na IDP que pode impedir futura colonizao. Na segunda fase,
patgenos bemsucedidos secretam efetores que contribuem para a
virulncia do patgeno e podem interferir com a IDP. Isso resulta na
suscetibilidade disparada por efetor (SDE). Na terceira fase, um dado
efetor especificamente reconhecido direta ou indiretamente por uma
das protenas R contendo domnios NBLRR (nucleotide bindingleucin
rich repeat), resultando na imunidade disparada pelo efetor (IDE). A IDE
uma resposta de IDP amplificada e acelerada, resultando em uma
resistncia a doena e, normalmente, uma resposta de morte celu
lar hipersensitiva (HR) no stio da infeco. Na quarta fase, a seleo
natural direciona patgenos para se esquivarem da IDE por meio de
mudana ou diversificao do gene efetor reconhecido por uma pro
tena R, ou pela aquisio de efetores adicionais capazes de suprimir
a IDE. A seleo natural resulta em novas especificidades de modo
que a IDE possa ser eliciada novamente.
Alta
IDP
SDE
IDE
SDE
IDE
Amplitude da Defesa
Limiar para HR
Efetores do
Patgeno
Efetores do
Patgeno
Avr-R
Avr-R
Limiar para
Resistncia Efetiva
Baixa
PAMPs
Figura 6. Modelo em ziguezague do rendimento quantitativo da evoluo do

sistema imune de plantas, proposto por Jones e Dangl (2006).
373
biotecnologia
No esquema mostrado na Figura 6, a amplitude mxima de resis

tncia e suscetibilidade proporcional a [IDP SDE + IDE], e a IDE
ultrapassa o limiar de induo da morte celular hipersensitiva (HR).
Os isolados do patgeno so selecionados para aqueles que perderam
o efetor (rseo) que levou a primeira IDE, e talvez tenham ganhado
novos efetores atravs de fluxo gnico horizontal (em verde) os quais
podem ajudar patgenos a suprimir a IDE. A seleo favorece novos
alelos NBLRR em plantas que podem reconhecer um dos efetores
recmadquiridos, resultando novamente em IDE.
Nesse contexto, a resistncia basal pode ser definida como aquela
ativada por patgenos virulentos sobre plantas suscetveis. con
siderada a Imunidade Disparada por PAMPs menos os efeitos da
Suscetibilidade Disparada por Efetores, ou pode ser ainda uma SDE
fraca eliciada pelo fraco reconhecimento de efetores. Portanto, uma
definio mais acurada poderia ser resistncia basal = IDP + fraca
IDE SDE (JONES; DANGL, 2006).
Dessa forma, possvel notar que plantas, apesar de no possurem
clulas mveis para se defenderem, nem um sistema imune adapta
tivo, de memria, como ocorre em animais, elas contam com a imu
nidade inata de cada clula e com sinais sistmicos que emanam de
stios de infeces.
Consideraes finais
Nos ltimos anos, foi possvel observar um incremento em nossos
conhecimentos a cerca da natureza, elicitao e regulao de defesas
de plantas a micrbios, e muitas descobertas so aplicveis ao nosso
entendimento da resistncia de nohospedeira. Entretanto, a identi
ficao inequvoca de caractersticas que realmente impedem o desen
volvimento de patgenos em uma determinada planta nohospedeira
ainda rara, assim como para plantas hospedeiras. Portanto, novas
questes esto sempre surgindo na elucidao do Dogma Central
da resistncia de plantas a doenas e sobre quais seriam as estratgias
mais eficientes para se obter visando resistncia durvel e de amplo
espectro contra micrbios em espcies economicamente importantes.
Em virtude da conhecida durabilidade da resistncia de nohospe
deiras ao longo dos tempos, comumente especulase que essa resis
374
tncia possa ser explorada por melhoristas de plantas para aumen

tar a resistncia a doenas em espcies hospedeiras. Por engenharia
gentica, estudos tm focalizado o uso de genes R ou genes de defesa
oriundos de espcies heterlogas, ou combinaes deles. Ou seria
melhor o uso de genes de origem do patgeno? A superexpresso de
individuais componentes de defesa no especficos em plantas trans
gnicas tem sido testada com vrios graus de sucesso, incluindo pept
deos antimicrobianos nativos ou engenheirados. Entre as novas estra
tgias para se obter resistncia a doena de amplo espectro est o uso
de genes de eliciadores no especficos de origem de patgenos sob
comando de promotores induzveis por patgenos.
De qualquer forma, a elucidao de mecanismos que controlam a
evoluo de interaes plantamicrbios ser enormemente impac
tada pelas novas tecnologias, que incluem sequenciamento rpido de
genomas e o desenvolvimento de mtodos computacionais para ana
lisar a riqueza e a abundncia de informao genmica. Por fim, um
completo entendimento da base molecular da resistncia de plantas
a doenas permitir a aplicao dessas novas descobertas para cons
truir plantas que contenham novas combinaes de vias de resistn
cia a doenas que sejam durveis e reconheam um amplo espec
tro de patgenos. Estudos concomitantes que empregam tecnologias
psgenmicas, incluindo estratgias de sistemas biolgicos, iro per
mitir o entendimento da expresso de todos os genes e protenas em
uma planta que so simultaneamente expressos durante a expresso
de resistncia. Essas tecnologias iro permitir nosso entendimento
sobre as interaes complexas que ocorrem entre vias mltiplas que
so expressas durante a resistncia.
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378
Captulo13
Captulo
5
Controle biolgico de
insetospraga
Roberto Teixeira Alves
Introduo
De uma maneira geral, segundo Gallo etal. (2002), os meios de con
trole de insetospraga so os seguintes:
Mtodos legislativos: quarentena, medidas obrigatrias, fiscali
zao do comrcio.
Mtodos mecnicos: barreiras, esmagamento, sulcos armadi
lha, frasco caamosca, etc.
Mtodos culturais: rotao, arao, poca de plantio, destruio
de restos de cultura, cultura no limpo, adubao, poda, irriga
o, plantio direto.
Mtodos de controle fsico: fogo, drenagem, inundao, som,
temperatura, armadilhas luminosas, radiao, etc.
Resistncia de plantas: no preferncia ou antixenose, antibiose
e tolerncia.
Mtodos de controle por comportamento: atraentes, repelen
tes e feromonas.
Mtodo qumico: inseticidas, fungicidas, nematicidas e herbi
cidas.
Mtodos de controle biolgico: patgenos, parasitoides e pre
dadores.
Como se observa, o controle biolgico um dos vrios mtodos
existentes de controle de insetospraga.
importante entender bem o conceito de controle biolgico e que
existem vrias formas de conceitulo; no entanto, neste captulo, ele
ser conceituado como o mtodo que consiste no controle de pragas
por meio de inimigos naturais, que so os organismos que mantm
os nveis de populao dessas pragas em equilbrio. O controle bio
lgico deve ser considerado como um componente de programas de
381
biotecnologia
Manejo Integrado de Pragas (MIP), ao lado de outros mtodos de con

trole de insetos e caros (GALLO etal., 2002) citados anteriormente.
Como exemplos de organismos denominados inimigos naturais,
podemse citar os vrus, bactrias, fungos, nematoides, caros, ara
nhas, insetos, peixes, anfbios, rpteis, aves e mamferos, em que se
inclui o homem.
Alguns organismos possuem maior potencial para o controle bio
lgico de pragas, como os fungos, bactrias, vrus, alguns predadores
e insetos parasitoides, por ser possvel multipliclos em maior escala
em laboratrios e ser fcil apliclos ou liberlos no campo.
Podese entender como predadores os organismos benficos, ini
migos naturais, que geralmente consomem mais de uma presa para
completarem seu desenvolvimento, podendo atacar uma grande varie
dade de insetospraga. O predador pode mudar sua preferncia ali
mentar de acordo com a abundncia populacional da praga (GALLO
etal., 2002; VAN DRIESCHE; BELLOWS, 1996). So exemplos: ara
nhas, peixes, anfbios, rpteis, aves, mamferos e insetos predado
res como Cycloneda sanguinea, Nabis spp., Calosoma granulatum, etc.
J os parasitoides so insetos que necessitam, na maioria das vezes,
de apenas um indivduo do hospedeiro para completar o seu desen
volvimento. Eles matam seu hospedeiro. Geralmente so mais espe
cficos que os predadores (GALLO etal., 2002; VAN DRIESCHE;
BELLOWS, 1996). So exemplos: Cotesia flavipes, Trissolcus basalis,
Neodusmetia sangwanis, Trichogramma pretiosum, etc.
Os patgenos so microorganismos causadores de doenas em
insetos; neles se desenvolvem com certa rapidez, terminando por
causar a morte da praga. Alguns patgenos so facultativos e outros
so obrigatrios. Os facultativos se desenvolvem tanto no insetohos
pedeiro como em meio de cultura artificial. So exemplos: fungos
como Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana, Nomuraea rileyi,
bactria como Bacillus thuringiensis, etc. Os obrigatrios, por sua vez,
s se desenvolvem no insetohospedeiro, como o Baculovrus anticar
sia e o B. erinnys (ALVES, 1986).
Segundo Gallo etal. (2002), sempre que se trabalha com controle
biolgico de insetospraga, devese adotar os seguintes procedimen
tos: introduo, conservao e multiplicao dos inimigos naturais no
382
Captulo 13 Controle biolgico de insetospraga
ambiente. Cada um desses procedimentos representar um tipo de

controle biolgico: o controle biolgico clssico, o natural e o aplicado.
O controle biolgico clssico consiste na importao e colonizao
de parasitoides ou predadores, visando ao controle de pragas exticas
ou nativas. As liberaes desses inimigos naturais eram ou so ino
culativas, em pequeno nmero de insetos, como medida de controle
no longo prazo mais utilizada em culturas perenes ou semiperenes
(GALLO etal., 2002; VAN DRIESCHE; BELLOWS, 1996). Os ento
mopatgenos tambm podem ser introduzidos em pequena escala,
dentro de um programa de controle biolgico clssico.
O controle biolgico natural referese populao de inimigos natu
rais que ocorre naturalmente. Visa a uma conservao dos inimigos
naturais que devem ser preservados e at aumentados por meio de
manipulao do seu ambiente de alguma forma favorvel como o
uso de inseticidas seletivos, uso de doses reduzidas de agrotxicos,
manuteno do habitat e de fontes de alimentao para esses inimigos
naturais (GALLO etal., 2002; VAN DRIESCHE; BELLOWS, 1996). Os
entomopatgenos tambm podem ser conservados por meio da mani
pulao adequada do ambiente, conforme explicado anteriormente.
O controle biolgico aplicado trata de liberaes de parasitoides ou
predadores, aps sua produo massal em laboratrio, visando redu
o rpida da populao da praga para seu nvel de equilbrio (GALLO
etal., 2002; VAN DRIESCHE; BELLOWS, 1996). nele que se encai
xam, com maior intensidade, os patgenos mais utilizados como pro
dutos microbianos no controle de pragas.
Somente os patgenos e os parasitos sero enfatizados neste cap
tulo, por serem mais fceis de ser multiplicados e utilizados em maior
escala no Brasil.
Vantagens e desvantagens do controle

biolgico de insetospraga
Segundo Alves (1986) e Gallo etal. (2002), existem vantagens e des
vantagens em se utilizar o controle biolgico, assim como acontece ao
se utilizar outros mtodos de controle, como o qumico.
383
biotecnologia
Vantagens
Apresenta especificidade na maioria das vezes, isto , controla ape
nas a praga visada sem afetar outros insetos e inimigos naturais.
Apresenta capacidade de multiplicao e disperso natural no
campo.
Os patgenos provocam efeitos secundrios benficos: dimi
nuem a oviposio e a viabilidade dos ovos e aumentam a sen
sibilidade da populao da praga a outros agentes biolgicos e
qumicos.
Controle mais duradouro.
Liberao simples no campo ou aplicao com equipamento
convencional.
No causa poluio ou toxicidade.
Pode ser utilizado em cultivos orgnicos, que produzem alimen
tos mais saudveis e um mercado que est em franca expanso.
Os insetospraga dificilmente podero se tornar resistentes aos
patgenos ou ao ataque de predadores e de parasitos.
Normalmente so mais baratos que os produtos qumicos.
Desvantagens
A especificidade no permite que o inimigo natural tenha um
largo espectro de ao sobre diferentes pragas ao mesmo tempo.
Determinados patgenos necessitam de condies climticas
favorveis.
Exigem maiores cuidados no armazenamento.
Exige certo grau de conhecimento de tecnologia, s vezes de dif
cil implementao, por causa do nvel cultural de alguns agri
cultores.
Entomopatgenos
Os entomopatgenos so os microrganismos causadores de doenas
em insetos e alguns deles podem ser multiplicados em laboratrio e
aplicados racionalmente no campo ou em casas de vegetao, visando
baixar a populao de insetospraga a nveis economicamente no pre
384
judiciais (ALVES, 1986). Vale lembrar que eles devem sempre ser uti
lizados como parte de um programa de manejo integrado de pragas.
Entomopatgenos a base de fungos, bactrias e vrus so os mais
utilizados no Brasil e sero comentados neste captulo.
Desenvolvimento da doena no insetopraga

Alguns conceitos e informaes so necessrios para uma com
preenso maior de como os entomopatgenos agem sobre as pragas
e como os fatores ambientais e fatores biticos afetam o desenvolvi
mento da doena sobre a praga visada.
Podese conceituar epizootia como a ocorrncia de uma doena, de
forma generalizada, na populao de uma ou mais espcie de inseto
em um determinado ambiente.
A epizootiologia, segundo Alves (1986), envolve os estudos dos fato
res que determinam e controlam a dinmica de doenas em popula
es de insetos.
O desenvolvimento de uma doena em uma populao de insetos
pode ser demonstrado por uma curva denominada curva epizotica
(TANADA, 1963). Segundo o mesmo autor, a fase prepizotica se
caracteriza por um baixo nmero de hospedeiros doentes. A fase epi
zotica se caracteriza por elevado ndice de doena em consequncia
da multiplicao e disseminao do inculo produzido nos focos pri
mrios, e a psepizotica se caracteriza pela diminuio do nmero
de insetos atacados em relao fase anterior, conforme a Figura 1,
adaptada de Alves (1986).
385
biotecnologia
(%)
Adultos
Ninfas
60
Mortalidade
50
40
30
Epizotica
20
10
Psepizotica
Pr-epizotica
Abr.
Jun.
Ago.
Out.
Dez.
Fev.
Acme de
Adultos
Figura 1. Nmero de adultos e ninfas de Mahanarva posticata contaminadas

por Metarhizium anisopliae nas condies do Nordeste do Brasil, mostrando
as diferentes fases da doena .
Fonte: Alves (1986).
Segundo Tanada (1963), os fatores que determinam a ocorrncia

ou no de uma epizootia podem ser classificados como biticos ou
abiticos.
Fatores biticos
a) Condies do hospedeiro: quanto maior a densidade, a capa
cidade de migrao e a predisposio do hospedeiro mais fcil
ser a ocorrncia de epizootias.
b) Condies dos patgenos: alta virulncia, alta capacidade de
reproduo, alta capacidade de sobrevivncia e de dissemina
o no ambiente so caractersticas importantes que o pat
geno necessita apresentar para que ocorram epizootias.
386
c) As vias de infeco de alguns patgenos, segundo Alves (1998),

so as seguintes:
Fungos normalmente penetram no inseto atravs do tegu
mento, com atuao enzimtica ou atravs da presso mec
nica exercida pelo tubo germinativo e apressrio.
Bactrias normalmente penetram via oral, com o inseto
as ingerindo juntamente com o alimento.
Vrus normalmente penetram via oral, com o inseto os
ingerindo juntamente com o alimento.
d) Potencial de inculo: o nmero de propgulos viveis sobre
os rgos suscetveis dos hospedeiros capaz de iniciar o pro
cessodoena (ALVES, 1998).
Na Tabela 1 (MOSCARDI; CORSO, 1980), podese observar como
a dose do patgeno influencia na mortalidade e no tempo necess
rio para matar a praga. Quanto maior a dose, maior a mortalidade e
menor o tempo necessrio para que isso ocorra, porm devese ava
liar a dose que seja eficiente e mais econmica para baratear a produ
o e o valor do produto final, a fim de que seja economicamente vi
vel e utilizado em grande escala pelo produtor rural.
Tabela 1. Mortalidade de Anticarsia gemmatalis em relao a diferen
tes doses de Baculovirus anticarsia aplicadas a campo. Embrapa Soja.
Londrina, PR. 1980.
Dose de vrus (1) (LE/ha)
Mortalidade (2,3) (%)
Tempo letal mdio (dias)
0,0
10
20
40
80
160
320
2,60 e
72,40 d
79,30 cd
84,60 c
93,10 b
98,90 a
100,00 a
8,13
7,57
7,23
6,67
6,68
6,59
1LE = 1 lagarta grande (> 2,5 cm) morta pelo vrus ou cerca de 1,3 x 109 poliedros do vrus.
Mdia de 3 repeties = 30 lagartas (3 4 nstar)/repetio.
3
Mdias seguidas pela mesma letra no diferem estatisticamente entre si (Duncan a 5%).
1
2
Fonte: Moscardi e Corso (1980)
Ao se analisar a Tabela 1, podese dizer que a dose de 80 LE/ha

bastante eficiente e mata a lagarta da soja em 6,67 dias, que se asse
387
biotecnologia
melha ao resultado obtido na dose mais alta. Por isso, pode ser a dose
escolhida para uso em maior escala.
Fatores abiticos
a) Temperatura: um dos fatores de grande importncia e atua
sobre os patgenos afetando principalmente a estabilidade e,
subsequentemente, sua aplicao e eficincia no campo.
Podese observar na Figura 2 a faixa mdia de temperatura favor
vel aos patgenos.
Patgeno
-20
Hibernao
temporria
0
Favorvel a
preservao
10
Desfavorvel
Estivao
temporria
15
20
25
28 30 38
Estivao
permanente
48
52 C
Bactrias
Desfavorvel
Fungos e Vrus
Desfavorvel
Favorvel aos
patgenos
Inseto
Hibernao
permanente
Faixa favorvel
aos insetos
Letais
Patgeno
Inseto
Desfavorvel
Figura 2. Escala de temperatura para insetos e patgenos.

Fonte: Alves (1986)
Existe uma faixa de temperatura entre 20C e 30C que favor

vel ao desenvolvimento dos insetos e, ao mesmo tempo, tambm
favorvel ao desenvolvimento dos patgenos. Observase que tempe
raturas acima de 30C so desfavorveis ao desenvolvimento desses
entomopatgenos e essa uma das vrias razes de eles no serem
patgenos dos seres humanos.
b) Umidade: afeta pouco os vrus (Baculovirus anticarsia e outros),
afeta pouco as bactrias esporulantes (Bacillus thuringiensis e
outros), os quais podem ser armazenados por mais de trs anos
a 30% de umidade e continuam viveis. Com relao aos fun
gos, afeta tanto no armazenamento como no desenvolvimento
em campo, porm a umidade, para ser favorvel ou desfavor
vel, vai depender de sua associao com a temperatura.
388
Com base no trabalho de Alves (1986), utilizando climogramas

sobre um tringulo contendo condies favorveis de temperatura e
umidade para uma alta produo de condios viveis determinadas
em laboratrio, observase na Figura 3 que, na regio de Belm, PA,
durante os 12 meses do ano, podese aplicar o fungo M. anisopliae
que a probabilidade de ocorrer epizootia maior do que na regio de
Cuiab, MT, e bem maior que na regio de Quixad, CE. Em Cuiab,
os meses favorveis vo de novembro a julho do ano seguinte (Figura
4), pois esto dentro da zona favorvel (tringulo) e, em Quixad,
todos os meses do ano esto fora do tringulo (Figura 5).
A condio mais comum no Brasil, onde ocorrem ataques de cigar
rinhas na canadeacar e em pastagens, semelhante ao que ocorre
na regio de Cuiab, isto , uma parte dos meses dentro da zona cli
mtica favorvel e outra parte fora.
32
31
30
Temperatura (C)
29
28
27
11
26
10
8
12
7
5
1
25
24
96
2
3
Zona
favorvel
23
22
21
45 50
60
70
80
90
100
Umidade relativa do ar (%)
Figura 3. Climograma comparativo entre a regio de Belm, PA, e a zona

favorvel a uma alta produo de condios viveis dos isolados E9, PL27 e
PL43 de M. anisopliae.
389
biotecnologia
32
31
30
Temperatura (C)
29
28
10
27
11 12
26
2
3
25
24
23
Zona
favorvel
6
7
22
21
45 50
60
70
80
90
100
Figura 4. Climograma comparativo entre a regio de Cuiab, MT, e a zona

32
31
30
Temperatura (C)
29
11 12 1
28
10
27
9
8
26
4
5
25
24
Zona
favorvel
23
22
21
45 50
60
70
80
90
100
Figura 5. Climograma comparativo entre a regio de Quixad, CE, e a zona

390
c) Radiao: a radiao ultravioleta afeta as partculas de vrus, o

complexo cristalesporos das bactrias esporulantes e a germi
nao de condios de fungos. O efeito prejudicial da radiao
pode ser amenizado com uma formulao adequada e horrio
de aplicao adequado.
Alves etal. (1998) avaliaram a capacidade de proteo de diferen
tes formulaes aos condios de M. anisopliae contra os efeitos dele
trios da radiao ultravioleta, e obtiveram resultados positivos com
algumas formulaes em leos minerais e vegetais puros e em leos
emulsionveis minerais e vegetais.
Os efeitos negativos da radiao sobre entomopatgenos podem
ser bastante amenizados com o emprego de formulaes apropriadas
para cada tipo de patgeno a ser utilizado no campo em maior escala.
d) Outros fatores: algumas substncias qumicas na folhagem
ou no solo podem ser txicas aos patgenos, como fungicidas,
por exemplo.
Fungos entomopatognicos
Modo de ao
Conforme pode ser visto na Figura 6 (ALVES, 1986), primei
ramente, ocorre a adeso dos condios do fungo no tegumento do
inseto e, logo em seguida, iniciase a germinao desses condios (12
horas em temperaturas entre 23C e 30C). O processo de penetra
o se d com atuao enzimtica (lipases, proteases, amilases, etc)
ou pela presso mecnica exercida pelo tubo germinativo e apressrio
sobre o tegumento do inseto. A colonizao tem incio com a pene
trao das hifas que engrossam e se ramificam inicialmente no tegu
mento do inseto e depois no hemocele. A reproduo pode ser sexu
ada ou assexuada. Os condios assexuais so os principais propgulos
de Deuteromycotina, em que se incluem os gneros Metarhizium,
Beauveria e Nomuraea. A disseminao a ltima fase, quando os pro
pgulos infectivos, como os condios de M. anisopliae, dispersamse
no ambiente com o auxlio do vento, chuva, homem e outros animais
(ALVES, 1998).
391
biotecnologia
SS
DI
Tubo
Germinativo
EM
A
IN
O
vento
chuva
animais
insetos
homem
Apressrio
Esporo
Grampo de
Penetrao
AO
GERMIN
PE
epicutcula
prcuticula
epiderme
NE
Histlise
(enzimas)
TRA
O
hemolinfa
distrbios
fisiolgicos
morte
Traqueias
Produo de
Micotoxinas
Corpos
gordurosos
Msculos
Aparelho
Digestivo
Sistema nervoso central
Bloqueio
Mecnico
Tubos de
Malpighi
Figura 6. Esquema do ciclo das relaes patgenohospedeiro (M. anisopliae

x cigarrinha).
Utilizao de fungos no controle de insetospraga no Brasil

a) Metarhizium anisopliae para o controle da cigarrinhada
folhadacanadeacar, Mahanarva posticata, no Nordeste;
e da cigarrinhadaraizdacana, M. fimbriolata, no Sudeste e
CentroOeste do Brasil. Esse controle j vem sendo utilizado
392
Fotos: Jos Francisco Garcia/www.cultivar.inf.br (2005)
em grande escala desde a dcada de 1970 e est sendo cada vez

mais aperfeioado e eficiente ao longo do tempo (Figura7).
Praticamente todas as reas de produo de cana orgnica uti
lizam esse tipo de controle.
Figura 7. (A) Espumas provocadas pela suco da seiva da cana pelas nin
fas da cigarrinhadaraizdacana, M. fimbriolata.; (B) ninfa da cigarri
nhadaraizdacana; (C) adultos da cigarrinhadaraizdacana.
b) M. anisopliae para controle de cigarrinhadaspastagens dos

gneros Deois, Notozulia e Mahanarva nas regies Norte,
CentroOeste e Sudeste do Brasil (Figura 8). bastante utili
zado por alguns pecuaristas que no necessitam retirar o gado
da pastagem durante a aplicao e que produzem carne de qua
lidade, sem resduos de agrotxicos.
393
Fotos: (A, B e C) Silvana PaulaMorais; (D e F) Roberto Alves ; (E) Mrcio A. Naves
biotecnologia
Figura 8. (A) Pastagem seca provocada pela suco da seiva pelas ninfas e
adultos da cigarrinhadaraiz, Mahanarva spectabilis; (B) Adulto da cigar
rinhadaraiz, M. spectabilis, saindo da espuma; (C) Adulto da cigarri
nhadaraiz, M. spectabilis, sugando folha de Brachiaria; (D) Espumas de
cigarrinhadaspastagens, Deois flavopicta em Brachiaria; (E) Adulto da cigar
rinhadaspastagens, D. flavopicta, sugando folha de Brachiaria; (F) Adultos
da cigarrinha D. flavopicta, mortos pelo fungo M. anisopliae.
394
Fotos: (A) Michel Lecoq; (B) Claudio Melo
c) M. anisopliae var. acridum para controle de gafanhotos no Mato

Grosso e no Nordeste do Brasil (Figura 9). utilizado em reas
protegidas como reservas indgenas onde no se pode aplicar
produtos qumicos (MAGALHES; LECOQ, 2007).
Figura 9. (A) Ninfas do gafanhoto Rhammatocerus schistocercoides; (B) Adulto

do gafanhoto R. schistocercoides mortos pelo fungo M. anisopliae var. acridum .
d) Sporothrix insectorum para controle do percevejoderendada

seringueira, Leptopharsa heveae, no Sudeste e CentroOeste
do Brasil (Figura 10). Possui uma grande eficincia con
forme demonstrado por Alves etal. (2003), pois a cultura da
seringueira proporciona um microclima altamente favor
vel ao desenvolvimento de epizootias do fungo sobre o perce
vejoderenda.
395
Fotos: Nilton T. V. Junqueira
biotecnologia
Figura 10. (A) Ninfas e adulto

do percevejoderendadaserin
gueira, L. heveae; (B) Ninfas do
percevejoderendadaseringueira
mortas pelo fungo S. insectorum;
(C) Adulto do percevejoderenda
parasitado pelo fungo .
Foto: Pesagro em Foco
e) Beauveria bassiana no controle do molequedabananeira,

Cosmopolites sordidus, com iscas de pseudocaule pulverizadas
com fungo, no Sudeste e Sul do Brasil (Figura 11).
Figura 11. Adultos do besouro molequedabananeira, C. sordidus, mortos

pelo fungo B. bassiana .
396
Fotos: (A) Fernanda B. Sarro; (B) Fernando L. D. Cintra;

(C) Ricardo P. C. Arajo; (D) Joana M. S. Ferreira.
f) O fungo B. bassiana utilizado no controle de algumas pra

gas do coqueiro (Figura 12) como Rhinostomus barbirostris
(brocadoestipedocoqueiro), Rhynchophorus palmarum
(brocaolhodocoqueiro), Homalinotus coriaceus (brocadopedn
culo-floral) e Brassolis sophorae (lagartadasfolhasdocoqueiro).
Figura 12. (A) Adulto do besouro R. barbirostris, morto pelo fungo B. bassiana.
(B) Adulto do besouro R. palmarum, morto pelo fungo B. bassiana; (C) Adulto
do besouro H. coriaceus, morto pelo fungo B. bassiana; (D) Lagartas de
B.sophorae contaminadas pelo fungo B. bassiana .
g) Nomuraea rileyi controla a lagartadasoja, Anticarsia gemmata

lis, naturalmente com grande eficincia, quando o clima est
favorvel, no Sul, Sudeste e CentroOeste do Brasil (Figura 13).
397
Foto: Dcio L. Gazzoni (1994)
biotecnologia
Figura 13. Lagartadasoja, A. gemmatalis, morta pelo fungo N. rileyi.
Foto: Roberto Alves
Aplicao em campo
h) Via area: avio equipado com barra pulverizadora com volume
de aplicao entre 20 L/ha e 30 L/ha com doses entre 1 e 5 x
1012 condios viveis/ha (Figura 14).
Figura 14. Avio agrcola equipado com barras pulverizadoras e bicos hidru
licos .
398
Fotos: (A) Mquinas Agrcolas Jacto; (B, C e D) Roberto Alves.
i) Via terrestre: pulverizadores costais manuais ou motorizados,

trator equipado com atomisador ou barra pulverizadora com
doses entre 1 e 5 x 1012 condios viveis/ha (Figura 15).
Figura 15. Tipos de pulverizadores. (A) Costal manual; (B) Costal motori
zado; (C) Atomisador tratorizado; (D) Pulverizador de barras tratorizado .
Obs.: devese colocar espalhante adesivo a 0,1% do volume total de

gua para formulaes tipo p molhvel.
Bactrias entomopatognicas
Entre as bactrias, a espcie Bacillus thuringiensis se destaca como
a mais utilizada para o controle de pragas, principalmente da Ordem
Lepidoptera.
399
biotecnologia
As diferentes variedades de B. thuringiensis produzem toxinas com

as quais afetam o inseto durante o processo da doena. As principais
toxinas so:
delta endotoxina (B. thuringiensis var. kurstaki)
beta exotoxina (B. thuringiensis var. israelensis)
Reproduo vegetativa
CB
CB
E
Liberao
Ingesto
Dissoluo (pH 9,5 a 10,5)
CP
Formao do esporo e cristal
CP
7
Figura 16. Ciclo evolutivo do B. thuringiensis em uma lagarta; CB, clula bac
teriana; E, esporo; CP, cristal proteico.
Fonte: Alves, 1986.
Aps a ingesto dos esporos da bactria, esses esporos germinam

e as formas vegetativas se multiplicam no intestino, passando poste
riormente cavidade geral do hospedeiro, onde se multiplicam outra
400
vez, produzindo uma septicemia e posteriormente causando a morte

do mesmo.
Utilizao de Bacillus thuringiensis no controle de pragas

a) B. thuringiensis var. kurstaki utilizada no controle de lagartas
desfolhadoras de grandes culturas e reflorestamentos.
b) B. thuringiensis var. israelensis para controle de larvas de perni
longos e borrachudos.
Existem vrios produtos a base de B. thuringiensis var. kurstaki
venda no Brasil como: Agree, BacControl, Bactur WP, Dipel SC,
Dipel WG, Dipel WP, Ecotech Pro, Thuricide e Xentari.
Na sade pblica, existem alguns biolarvicidas a base de B.
thuringiensis var. israelensis para o controle de pernilongos e borrachu
dos como: Aquabac XT, Bactivec, Bthorus SC, Teknar HPD, Vectobac
AS, Vectobac CG e Vectobac WDG.
Existem tambm biolarvicidas que utilizam a bactria Bacillus sphae
ricus, e tmse no mercado brasileiro os produtos Grislesf, o Sphaerus
SC e o Spherico SC e Vectolex CG.
No Brasil, o B. thuringiensis pode ser utilizado em vrias culturas
no controle de diversas pragas, conforme a Tabela 2.
Tabela 2. Utilizao do Bacillus thuringiensis var. kurstaki em vrias cul
turas para controle de diferentes insetospraga.
Culturas
Soja
Algodo
Gramneas (pastagens, milho, cana, arroz)
Crucferas (couve, couveflor, repolho, brcolis)
Tomate
Fumo
Mandioca
Caf
Eucaliptus
Insetospraga
Lagartadasoja
Lagartafalsamedideira
Lagartadasmas
Curuquer
Lagartadoscapinzais
Lagartamilitar
Curuquerdacouve
Lagartamedepalmo
Traadascrucferas
Brocagrande
Lagartamedepalmo
Lagartaverde
Mandarov
Lagartamagnfica
Lagartadoseucaliptus
Continua
401
biotecnologia
Culturas
Alfafa
Citrus
Maracuj
Seringueira
Abacaxi
Amendoim
Coqueiros
Cucurbitceas (abbora, pepino, melo, melancia)
Insetospraga
Lagartadaalfafa
Lagartamilitar
Curuquerdoscapinzais
Automeris
Lagartadomaracuj
Mandarov
Brocadofruto
Lagartadasoja
Lagartadoscapinzais
Lagartadaspalmeiras
Brocadascucurbitceas
Vrus entomopatognicos
Existem estudos que demonstram a existncia de mais de 700 viro
ses que atacam insetos e caros, porm s as mais promissoras so
utilizadas no controle de pragas (Figura 17).
Estrutura de um vrus entomopatognico
Granulina
Poliedrina
Virion
Envelope ou
Membrana
0,5 a 15 m
0,5 m
Nucleocapsdeo
Capsdeo
DNA + Protena
Nucleocapsdeo
individualizado
em 1 envelope
(SEV)
(a)
Diversos nucleocapsdeos
por envelope (MEV)
(b)
Figura 17. Corpos de incluso de Baculovirus: (a) Cpsula de granulose; (b)

Vrus da poliedrose nuclear.
Fonte: Alves (1986)
402
Modo de ao e disseminao
O vrus s atua sobre as lagartas quando ingerido, isto , via oral.
Segundo Moscardi (1983), os poliedros localizados sobre as folhas de
soja, ao serem ingeridos, atingem o intestino do inseto e ali so dis
solvidos, propiciando a liberao das partculas de vrus, os virions
(Figura 18). Estes penetram na membrana da parede do intestino e
atingem a hemolinfa, multiplicando-se no ncleo das clulas de dife
rentes tecidos, inicialmente no tecido gorduroso e epiderme; depois
na epiderme da traqueia e nos rgos reprodutivos.
Adsoro, Penetrao
12 a 24h
Sntese de
Partculas
Colonizao
2 Dias
Insetos
Parasitos
Virion
Ncleo (NPV)
1 Dia
Morte (odor)
Inoculao
Ocasionalmente
o
in
st ,5
te
7
>
Ph
In
po
P
(N lant
PV
a
)
Moribundo
To
Vento
gua
Insetos
Virion
Folhas
Poliedro
Disseminao
Liberao de
Partculas
Homem
Solo
Figura 18. Ciclo das relaes de Baculovirus com o inseto hospedeiro.

O processo, desde a infeco at a morte da lagarta, dura em mdia

sete dias.
Os sintomas so descolorao da parte ventral do corpo (3 e 4 dia)
e depois em todo o corpo. Aps o quarto dia, a lagarta infectada tem
pouca mobilidade e praticamente cessa sua alimentao, indo para
403
biotecnologia
a parte superior da planta, onde morre pendurada pelas patas abdo

minais.
A lagarta, nessa fase, possui uma colorao amareloesbranquiada,
no se rompendo com facilidade, mas posteriormente tornase preta
e se rompe facilmente.
Utilizao de viroses no controle biolgico de pragas
Fotos: Flvio Moscardi
Baculovirus anticarsia no controle da lagartadasoja

Baculovirus spodoptera no controle da lagartadocartuchodomilho
Baculovirus erinnys no controle de mandarovdamandioca
Atualmente existem vrios produtos biolgicos a base de Baculovirus
no Brasil (Figura 19), como: Baculovirus AEE, Baculovirus Nitral,
Coopervrus PM e Protege. A maioria das biofbricas est localizada
no Paran e Rio Grande do Sul.
Figura 19. (A) Potes contendo dose de lagartas mortas por vrus para um
hectare; (B) B. anticarsia formulado como p molhvel; (C) Lagarta-da-soja
morta por Baculovirus.
404
Parasitoides
Microhimenpteros
Cotesia flavipes
O microhimenptero Cotesia flavipes (Hymenoptera: Braconidae)
utilizado no controle da broca-da-cana-de-acar, onde parasita na
fase de lagarta de piraldeos e noctudeos. A fmea oviposita seus ovos
no interior do corpo da lagarta, onde se desenvolvero as larvas e se
empupam em forma de casulo na parte externa do corpo do hospe
deiro, de onde sairo novos adultos. O seu ciclo dura, em mdia, 23
dias na temperatura de 25C. utilizado em larga escala na regio
canavieira do Estado do So Paulo.
Trichogramma sp.
Trichogramma sp. (Hymenoptera: Trichogrammatidae): um para
sita de ovos de lepidpteros que possui grande potencial para as con
dies de nosso pas.
Segundo Parra et al. (1987), esto sendo utilizados em liberaes
inundativas na Rssia (10 milhes de hectares), China, Taiwan,
Mxico, EUA, Europa Ocidental, ndia, frica e Amrica do Sul
(Colmbia e Peru).
No Brasil, j est se utilizando o Trichogramma em larga escala
para o controle biolgico de Diatraea saccharalis, Alabama argillacea e
Heliothis virescens. O ciclo de vida do Trichogramma sp. pode ser visto
na Figura 20.
405
biotecnologia
Ovo do
parasito
Oviposio
do parasito
Ovo do
inseto-praga
A
B
Larva do
parasito
Larva do
parasito
D
Pupa do
parasito
Emergncia
do parasito
Figura 20. Ciclo de vida do Trichogramma sp.

Fonte: De Bach; Rosen (1991)
Trissolcus basalis (Hymenoptera: Scelionidae)

So parasitos de ovos de percevejosdasoja, tambm com grande
potencial para as condies do Brasil (Figura 21).
406
Fotos: (A) Bayer do Brasil;

(B) Antonio H. Barbosa.
Figura 21. (A) Adulto do percevejoverdedasoja, Nezara viridula. (B) Adultos

da vespinha T. basalis parasitando ovos de N. viridula.
Dpteros
Moscas taquindeas Metagonistylum minense (moscadoAmazo
nas) e Paratheresia claripalpis: so parasitos da brocadacanadea
car. Os adultos so liberados no campo, onde procuraro ovipositar
na brocadacana. As larvas se desenvolvem no interior do corpo do
hospedeiro e empupam no orifcio feito pela broca, de onde sairo
os adultos.
Consideraes finais
Com base nas informaes contidas neste captulo, observase que o
controle biolgico de insetospraga j vem sendo utilizado no Brasil h
vrios anos em diferentes culturas agrcolas e na pecuria e que apre
senta um potencial enorme para ser cada vez mais utilizado, pois novos
resultados de pesquisa tm ajudado a aperfeioar tcnicas de produo
e liberao de predadores e parasitos e principalmente de patgenos,
onde envolve novas tcnicas de produo em larga escala, formula
o, armazenamento e de aplicao no campo visando a um aumento
da eficincia desses inimigos naturais contra diferentes pragas.
Apesar deste captulo visar, apenas, dar uma viso geral e resumida
da utilizao dos principais inimigos naturais utilizados no controle
biolgico de insetospraga no Brasil, esperase que o leitor possa com
preender um pouco mais sobre esse mtodo e sobre os diferentes
inimigos naturais, seus modos de ao e que seja mais um colabora
407
biotecnologia
dor na difuso de informaes tcnicas sobre o assunto, colaborando

assim para o aumento do uso adequado do controle biolgico de inse
tospraga, o que evitar resduos qumicos nos alimentos, contamina
o dos recursos naturais e haver menos intoxicaes dos trabalha
dores rurais brasileiros.
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409
Captulo14
Captulo
5
Cultura de tecidos vegetais:

princpios e aplicaes
Sebastio Pedro da Silva Neto
Introduo
O termo cultura de tecidos vegetais utilizado para definir a cul
tura assptica in vitro de clulas, tecidos, rgos e seus componen
tes sob condies fsicas e qumicas definidas. A cultura de tecidos
constitui uma importante ferramenta para estudos bsicos, como a
compreenso dos fatores responsveis pelo crescimento, metabo
lismo, diferenciao e morfognese das clulas vegetais, bem como
para estudos aplicados, como micropropagao, produo de com
postos secundrios, transformao gentica, manuteno de germo
plasma in vitro e limpeza clonal (SMITH, 2000). O desenvolvimento
da tcnica tem uma longa histria. Os esforos iniciais se concentra
ram na compreenso dos vrios aspectos do crescimento, desenvol
vimento e diferenciao vegetal, do papel dos reguladores de cresci
mento, dos tipos de nutrientes necessrios, entre outros fatores. To
logo os princpios e mtodos bsicos foram estabelecidos (primeiro
quarto do sculo XX), verificou-se o valor prtico para a agricultura e
para a indstria da propagao de plantas, bem como na conservao
de germoplasma (RAZDAN, 2003). Atualmente, a cultura de tecidos
desempenha papel importante nos mtodos moleculares utilizados
em biotecnologia. A base fundamental da cultura de tecidos a capa
cidade de clulas, tecidos ou rgos se desenvolverem e regenera
rem plantas completas, idnticas planta-me. A disponibilidade de
mtodos adequados de cultura de tecidos para um crescente nmero
de espcies vegetais permite ampliar o leque de aplicaes da biotec
nologia vegetal.
411
biotecnologia
Princpios da cultura de tecidos

O termo in vitro um termo latino que significa dentro do
vidro. Dessa forma, em condies de assepsia, dentro de recipien
tes de vidro, sob o efeito de fatores qumicos (meio de cultura) e fsi
cos (luz e temperatura), um ambiente artificial criado, visando pro
porcionar condies adequadas para o processo de desenvolvimento
de clulas, tecidos e rgos de plantas, previamente extrados de uma
planta completa (matriz). O efeito dessas intervenes pode induzir
diferenciao e multiplicao de rgos a partir de meristemas ou
desdiferenciao de tecidos determinados e induo de formao
de pr-meristemas (GAHAN; GEORGE, 2008).
O cultivo in vitro baseia-se nos seguintes princpios: totipotncia e
competncia celular. A totipotncia se refere ao potencial das clulas
vegetais de reproduzirem um organismo inteiro uma vez submetidas
a estmulo apropriado (HARBERLANDT, 1902). No entanto, para as
clulas vegetais reagirem a esse estmulo, precisam apresentar com
petncia celular, que se refere capacidade das clulas em reagir a
sinais especficos de desenvolvimento, ou seja, expressar o potencial
inerente sua carga gentica.
A cultura de tecidos comumente usada para descrever todos os
tipos de cultura in vitro de plantas. Didaticamente, George etal. (2008)
a separa em duas categorias de acordo com a organizao do cresci
mento in vitro: (a) cultivos com crescimento organizado e (b) cultivos
com crescimento no organizado.
a) Cultivos com crescimento organizado:
Cultura de meristemas: cultura de pices caulinares muito
pequenos, consistindo do domo meristemtico apical com ou
sem primrdios foliares, com tamanho entre 0,1 mm e 0,3 mm,
dependendo da espcie. Originam eixos caulinares unipolares.
Cultura de pices caulinares ou gemas: inicia-se a partir de
gemas ou brotos de tamanho maior que os meristemas, con
tendo vrios primrdios foliares, que so conduzidos de forma
a produzir mltiplas brotaes ou multigemas.
Cultura de segmentos nodais: inicia-se a partir de gemas laterais
existentes nos ns da planta, cada um tendo anexo um pequeno
412
Captulo 14 Cultura de tecidos vegetais: princpios e aplicaes
pedao de tecido do ramo. Entrens contendo uma ou vrias

gemas podem ser cultivados.
Cultura de razes isoladas: cultura de razes desconectadas da
parte area, resultando na produo de um sistema de razes
ramificadas.
Cultura de embries (resgate): embries zigticos so excisados
e cultivados para dar origem a plntulas.
b) Cultivos com crescimento no organizado:
Cultura de calos: induo do crescimento e manuteno de uma
massa de clulas desorganizada, a partir do crescimento desco
ordenado de pequenos rgos, pedaos de tecidos ou de clulas
previamente cultivadas.
Culturas em suspenso: cultura de populaes de clulas indivi
duais e pequenos grupos de clulas, dispersas em meio lquido
sob agitao e aerao.
Cultura de protoplastos: cultura de clulas vegetais, sem parede
celular.
Cultura de anteras e plen: cultura de anteras completas con
tendo micrsporos imaturos, com o objetivo de formar embri
es somticos diretamente sobre o plen, ou algumas vezes por
organognese passando pela fase de calo.
Cultura de plen: culturas iniciadas de gros de plen que foram
removidos das anteras.
O processo de desenvolvimento de uma nova plntula pode ocorrer
via organognese ou embriognese somtica. Os fatores que influen
ciam na determinao da rota morfogentica so: o tipo de explante
escolhido, estdio fisiolgico da planta e o ambiente do meio de cul
tura (reguladores de crescimento, nutrientes, luz, etc). A organog
nese o processo de formao de uma nova plntula, a partir de um
explante, j, na embriognese somtica, ocorre a formao de embri
es a partir de clulas somticas, sem a fecundao zigtica. Ambas
as rotas podem ocorrer de forma direta ou indireta. O processo de
organognese/embriognese direta ocorre quando as plntulas/
embries surgem a partir de meristemas pr-existentes nos tecidos
413
biotecnologia
do explante, enquanto pela via indireta, ocorre primeiro a formao

de calos, seguida da formao de meristemoides e finalmente pln
tulas/embries (ANDRADE, 2002). O esquema simplificado da cul
tura de tecidos pode ser visto na Figura 1.
Explante meteristemtico
Embries
Somticos
Explantes maduros
Desinfestao
Planta
Enraizamento
Brotos
Explante
Calo
Explante meteristemtico
Meio de cultura
Matriz
Razes
Suspenso
celular
Figura 1. Etapas da cultura de tecidos .

Fonte: Kerbauy, 1997.
Aplicaes da cultura de tecidos

Baseado na disponibilidade das vrias tcnicas in vitro j citadas,
a partir de meados da dcada de 1960 houve um significativo cresci
mento das aplicaes da cultura de tecidos em pesquisas nos campos
da biologia, agricultura e engenharia florestal. As aplicaes na agro
pecuria podem ser divididas em cinco reas: (a) melhoramento gen
tico; (b) limpeza clonal; (c) conservao de germoplasma; (d) propaga
o clonal; e (e) produtos do metabolismo secundrio.
Melhoramento gentico
O papel da cultura de tecidos no melhoramento gentico de plan
tas tem sido reconhecido de forma crescente. Variaes herdveis
podem ser observadas nas colnias de clulas ou em plantas regene
radas in vitro, as quais podem posteriormente se expressar por meio
414
de reproduo vegetativa ou sexual. Mtodos in vitro tm sido usa

dos de forma crescente em associao com os mtodos tradicionais
de melhoramento de plantas. As principais aplicaes da cultura de
tecidos so destacados abaixo.
Gerao de variabilidade gentica
Pesquisas pioneiras sobre cultura de tecidos mostraram que clu
las cultivadas in vitro durante longos perodos podem apresentar
variaes genticas inditas. Muitos pesquisadores tm confirmado
que um tecido um mosaico de diferentes tipos de clulas. Algumas
delas, quando cultivadas separadamente, produzem colnias orga
nizadas, enquanto outras regeneram plantas frequentemente afeta
das por variaes morfolgicas. Em virtude disso, as culturas in vitro
so fontes diretas de variabilidade gentica. Estudos citogenticos de
clulas cultivadas in vitro revelaram mitose anormal, o que uma das
causas da variabilidade. Nmeros de cromossomos instveis resul
tam em variabilidade na cultura de tecidos, possibilitando a seleo
de variantes (RAZDAN, 2003).
A cultura de clulas tem desempenhado papel importante no
melhoramento de plantas, uma vez que permite o isolamento de
variantes somaclonais (FLICH, 1983). Embora a produo de varian
tes por cultura de tecidos seja conhecida desde longa data, foi somente
nos anos 1970 que passou a ser utilizada no melhoramento de plantas.
A variao somaclonal dependente da variao natural que ocorre
numa populao de clulas, podendo ser pr-existente ou induzida
pela cultura in vitro, e usualmente observada nas plantas regenera
das (LARKIN; SCOWCROFT, 1981). A variao pode ser gentica ou
epigentica, sendo complexa quanto origem (LARKIN etal., 1985;
SCOWCROFT etal., 1987). As variaes observadas nas plntulas
regeneradas podem ter importncia agrcola. tambm possvel pro
duzir um amplo espectro de clulas mutantes em cultura (JACOBS
etal., 1987), nas quais incluem-se clulas apresentando diferenas
bioqumicas, algumas conferindo caractersticas teis do ponto de
vista econmico como resistncia a herbicidas, antibiticos e estres
ses. A seleo in vitro, mediante a aplicao de um agente seletivo na
presena do mutante, permite a seleo de plantas com sistemas de
415
biotecnologia
desenvolvimento alterados, podendo manisfestar resistncia a sais,

produtos qumicos e toxinas. Entretanto, somente em poucos casos,
tem sido possvel regenerar plantas com as caractersticas desejveis,
por exemplo, plantas de fumo resistentes a herbicidas e Datura inno
xia resistente ao metil-triptofano (SMITH, 2000).
Polinizao in vitro
A tcnica da polinizao controlada in vitro tem sido utilizada na
produo de hbridos interespecficos e intergenricos, superando
a autoincompatibilidade sexual (YEUNG etal., 1981; ZENKTELER,
1984). A tcnica foi desenvolvida por Kanta e colaboradores (1962), e
envolve o cultivo de vulos e gros de plen no mesmo meio de cul
tura, facilitando assim a germinao do gro de plen e a fertilizao
do vulo sob condies in vitro. Por meio da aplicao dessa tcnica,
as barreiras de incompatibilidade sexual existentes, especialmente
aquelas em que a reao ocorre no estilo ou no estigma, podem ser
superadas. Esse mtodo tem sido utilizado com sucesso na superao
da autoincompatibilidade em Petunia axillaris. Similarmente, hbri
dos interespecficos (Melandrium album x M. rubrum) e intergenricos
(M. album x Silene schafta) foram obtidos. A obteno de embries ger
minveis, desenvolvidos in vitro, a partir da fuso dos gametas mas
culino e feminino, tem sido a marca dessa tcnica (RAZDAN, 2003).
Culturas de embries, ovrios e vulos tm sido utilizadas para
superar problemas como a inviabilidade do embrio, produo de
monoploides, dormncia de sementes e outros problemas relaciona
dos (RAGHAVAN, 1980; YEUNG etal., 1981). De forma particular, o
resgate de embries tem desempenhado um papel muito importante
na produo de hbridos interespecficos e intergenricos (COLLINS;
GROSSER, 1984).
Induo de haploidia
A aplicao da cultura de tecidos na produo de haploides tem
chamado a ateno pelo seu potencial de uso no melhoramento de
plantas. Normalmente, as clulas somticas de plantas superiores
tm nmero de cromossomos diploide, enquanto clulas reprodu
tivas (gametas) so haploides. Guha e Maheswari (1966) cultivaram
416
anteras imaturas de Datura innoxia (Solanaceae) e foram capazes de

gerar embrioides e plntulas. Essas plntulas tornaram-se haplides.
Aparentemente elas surgiram a partir de micrsporos dentro das ante
ras; isso abriu o caminho para a andrognese. Bourgin e Nitsch (1967)
confirmaram a totipotncia dos gros de plen conseguindo regene
rar plantas haploides completas de tabaco, arroz e trigo. De acordo
com Hu e Guo (1999), a obteno de haploides por cultura de ante
ras foi relatada em 247 espcies, pertencentes a 34 famlias vegetais.
Evidncias experimentais indicam que as populaes de plen so pra
ticamente dimrficas e que somente aqueles gros de menor tamanho
so capazes de formar haploides. Esses tipos de gros de plen ocor
rem em baixa frequncia e aparentemente so diferentes da maioria
daqueles destinados a formao de gametas (GEORGE etal., 2008).
A induo de plantas haploides a partir de ovrios e vulos no
polinizados (ginognese) outro avano na cultura de tecidos. San e
Gelebart (1986) relataram seu primeiro resultado em cultura in vitro
de ovrio isolado de Hordeum vulgare e, subsequentemente, mui
tos outros pesquisadores obtiveram plantas haploides ginognicas
de ovrios e vulos cultivados in vitro de tabaco, trigo, arroz, lrio,
milho e outras plantas (THOMAS etal., 1999). Isso demonstra que
no somente o micrsporo, mas tambm o megsporo ou gametfito
feminino de angiospermas, podem ser cultivados in vitro at o desen
volvimento esporoftico, abrindo uma via alternativa para o melhora
mento de plantas por meio de haploides (SMITH, 2000).
O valor dos haploides grande nos programas de melhoramento,
uma vez que eles podem ser utilizados para detectar mutaes e para
recuperar combinaes genticas nicas, tendo em vista que, por
meio dos haploides duplicados, regeneram-se plantas completamente
homozigotas, onde se visualiza a expresso de alelos recessivos, o que
tem grande aplicao nos estudos genmicos. Alm disso, a produ
o de duplos haploides tem permitido a produo de hbridos e sua
integrao em programas de melhoramento.
Hibridao somtica
Isolamento, regenerao e fuso de protoplastos (clulas cuja
parede celular foram digeridas) de plantas in vitro so tecnologias
417
biotecnologia
com potencial para manipulao gentica. A hibridao somtica,

uma hibridao assexual que utiliza protoplastos somticos isolados
(Figura 2), uma ferramenta a mais no melhoramento de plantas
(RAZDAN, 2003). O produto da fuso de dois protoplastos (hetero
carion) pode ser cultivado para regenerar um hbrido somtico com
o gentipo desejado. Novas variaes genticas podem tambm ser
introduzidas com consequncias nas interaes citoplasmticas
durante o processo de fuso nos protoplastos. A tcnica de hibrida
o somtica evoluiu tremendamente aps se ter demonstrado a via
bilidade de isolar um largo nmero de protoplastos por meio da incu
bao de uma pequena quantidade de tecido com a enzima celulase.
Protoplastos isolados entram em processo de diviso celular e rege
neram plantas (NAGATA; TAKEBE, 1971), comprovando a totipotn
cia em protoplastos. Centenas de espcies de angiospermas podem
ser regeneradas a partir de protoplastos (BINDING, 1986). A possibi
lidade de fundir protoplastos de plantas por mtodos qumicos (por
exemplo, PEG) e fsicos (por exemplo, eletrofuso) permite a produ
o de hbridos somticos. Carlson etal. (1972) obtiveram o primeiro
hibrido somtico interespecifico por fuso de protoplastos isolados de
Nicotiana glauca com N. langsdorffii. No Brasil, Matsumoto etal. (2001)
conseguiram a hibridao interespecfica de bananeira (Musa spp.)
por meio de hibridao somtica (Figura 3). A fuso de protoplastos
comprovou ser uma forma de se obter hbridos somticos entre plan
tas sexualmente incompatveis. O maior gargalo na tcnica de fuso
de protoplastos a regenerao de plantas a partir das clulas hibri
das (EVANS etal., 1984; SCHIEDER; KOHN, 1986).
A fuso de protoplastos tem sido utilizada para produzir combi
naes ncleo-citoplasma nicas. Como exemplo, pode-se citar a
combinao de cloroplastos de Brassica campestris que codificam
para resistncia atrazina (obtida de protoplastos) com protoplas
tos de Brassica napus possuindo citoplasma de Raphanus sativus
(que confere macho esterilidade a partir de sua mitocndria). As
plantas selecionadas continham ncleo de B. napus, cloroplastos de
B. campestris e mitocndria de R. sativus; tinham as caractersticas
desejadas em um fentipo de B. napus; e so atualmente utiliza
das para a produo de sementes hbridas (CHETRIT etal., 1985).
418
Foto: Kazumitsu Matsumoto
Figura 2. Protoplastos de bananeira .
Figura 3. Fuso de protoplastos de bananeira.
419
biotecnologia
Transformao gentica
A atual importncia da transformao gentica de clulas por meio
da introduo de DNA exgeno tem gerado enorme interesse pelas
tcnicas de regenerao oferecidas pela cultura de tecidos. A trans
formao gentica consiste basicamente de quatro passos: insero,
integrao, expresso e replicao do DNA exgeno dentro da clula
hospedeira (TORRES etal., 1998).
O princpio da transformao baseado no mecanismo de infec
o por vrus. Desde 1976, muitos trabalhos tm relatado que vrios
genes eucariticos introduzidos em bactria so capazes de expres
sar sua atividade especfica no hospedeiro e que isso possibilita obter
uma transformao similar de clulas eucariticas. Na natureza,
Agrobacterium tumefaciens pode transferir informao gentica para
clulas de plantas na forma de um plasmdeo que promove forma
o tumoral (galha). Usando a tecnologia do DNA recombinante, foi
possvel introduzir o gene para resistncia kanamicina no DNA do
plasmdeo do A. tumefasciens, e o plasmdeo modificado foi poste
riormente incorporado em protoplastos de tabaco. Plantas do tabaco
transformado expressaram resistncia kanamicina. Atualmente
tem-se obtido xito em modificar geneticamente plantas por meio da
introduo de outros genes teis, como resistncia a insetos, ervas
daninhas, herbicidas, doenas, ou para estudos do mecanismo da
ao gnica (Figura 4).
Plantas geneticamente modificadas podem ser obtidas por mto
dos vetores-dependentes (transformao indireta) ou vetores-indepen
dentes (transformao direta). A transformao gentica de plantas
por transferncia direta de DNA por meio de mtodos vetores-inde
pendentes pode ser utilizada para transformar protoplastos e clulas
bacterianas, e incluem eletroporao (POTRYKUS etal., 1985), fuso
de liposoma (DESHAYES etal., 1985), microinjeo (CROSSWAY
etal., 1986), bem como bombardeamento de micro partculas (biols
tica) (KLEIN etal., 1987). O mtodo da biolstica pode ser executado
com clulas, tecidos e rgos.
420
Figura 4. Calo geneticamente modificado .
Na transferncia de genes mediada por vetor, os genes de inte

resse so inseridos em vetores de expresso binria em orienta
o senso e antissenso e essas construes gnicas inseridas na
Agrobacterium para transformao de clulas, tecidos, culturas de
rgos, ou partes de plantas. O uso de Agrobacterium em transfe
rncias mediadas por vetores tem progredido muito rapidamente
desde os primeiros relatos de transformao estvel (DEBLOCK
etal., 1984; HORSCH etal., 1984). Grande parte da atividade de
pesquisa que utiliza essas ferramentas tem focalizado o desen
volvimento de importantes caractersticas agronmicas como o
controle de insetos, plantas daninhas e doenas, resultando em
plantas transgnicas com crescente uso na agricultura.
Limpeza clonal
A habilidade de eliminar vrus, bactrias e fungos de plantas por
cultura de meristemas tem sido utilizada desde a dcada de 1960
(Figura 5). A tcnica comeou quando White (1934) observou que
subcultivos de razes infectadas com vrus frequentemente resulta
vam em culturas que eram isentas do vrus. Isso mostrou que, mesmo
421
biotecnologia
Foto: Solange Rocha Monteiro de Andrade
em plantas infectadas, as clulas das extremidades meristemticas ou

so livres do vrus ou possuem uma concentrao muito pequena do
mesmo. Fato que se d porque os tecidos meristemticos no sendo
vascularizados dificultam o acesso do vrus, que necessita dos vasos
para se movimentar de forma sistmica na planta. A tcnica particu
larmente importante para espcies de propagao vegetativa e quando
o material vegetal est infectado por vrus (BHOJWANI; RAZDAN,
1983). A cultura de meristemas frequentemente associada com ter
moterapia ou quimioterapia para a erradicao de vrus na limpeza
clonal (RAZDAN, 2003).
Figura 5. Meristema de maracuj na ponta de uma agulha .
Conservao de germoplasma
Tradicionalmente, os germoplasmas de plantas cultivadas tm sido
mantidos na forma de materiais propagativos como sementes, tubr
culos, razes, bulbos, rizomas, gemas, estacas, etc. Canteiros, estufas
e casas de vegetao so outras formas de se manter os germoplas
mas ou bancos genticos. Entretanto, algumas dificuldades podem ser
encontradas na utilizao dessas formas de conservao. Entre elas,
est o fato de que importantes espcies produzem sementes recalci
trantes, com degenerao rpida do embrio (SMITH, 2000). Alm
disso, a manuteno de colees a campo pode ser cara e ter como
422
Foto: Sebastio Pedro da Silva Neto
desvantagem o fato de as plantas serem vulnerveis a insetos, patge

nos e variaes do clima. Milhares de espcies de plantas superiores
so consideradas ameaadas de extino e necessitam ser mantidas
em bancos de germoplasmas visando preservao e utilizao de
fontes de genes para futuros projetos de melhoramento gentico. A
habilidade de regenerar plantas completas a partir de clulas embrio
nrias e gamticas, e pices caulinares, tem levado ao seu uso na con
servao de germoplasma (RAZDAN, 2003) (Figura 6).
Figura 6. Conservao in vitro de mandioca .
Trs tcnicas in vitro tm sido desenvolvidas a partir do uso de

componentes que retardam o crescimento (por exemplo: hidrazida
malica, B995, e ABA; Dodds, 1989), baixas temperaturas (1C a 9C;
RAZDAN, 2003), e criopreservao (KARTHA, 1981). Nessa ltima
tcnica, suspenses celulares, pices caulinares, embries assexuais e
plntulas jovens, aps o tratamento com um crioprotetor, so conge
lados e conservados em baixas temperaturas (-196C), em nitrognio
lquido (KARTHA, 1981; WITHERS, 1985). A cultura de tecidos con
siderada como uma forma efetiva de conservao de germoplasma,
desde que a manuteno do germoplasma in vitro seja vivel econo
micamente em relao s demais alternativas.
423
biotecnologia
Propagao clonal (micropropagao )
O uso da cultura de tecidos para propagao vegetativa de plantas

a mais largamente utilizada aplicao dessa tecnologia. Ademais,
tem sido bem sucedida em todas as classes de plantas (GEORGE etal.,
2008). H trs formas por meio das quais a micropropagao pode
ser realizada. Essas so: (i) a intensificao da quebra de dormncia
de gemas axilares; (ii) produo de gemas adventcias diretamente
ou indiretamente sobre calos; e (iii) embriognese somtica direta ou
indireta sobre explantes (MURASHIGE, 1974, 1978). O princpio da
tcnica usada para propagao in vitro baseada na multiproliferao
e crescimento de gemas axilares, que normalmente permanecem dor
mentes na presena da gema terminal por causa da dominncia api
cal. O uso exgeno de citocininas no meio de cultura libera as gemas
da dominncia apical tanto no ramo original, como nos subsequen
tes ramos laterais que so formados. Consequentemente numerosas
brotaes so formadas (Figura 7).
Figura 7. Micropropagao de bananeira .
Aps sucessivos subcultivos sob efeito do adequado balano de

reguladores de crescimento para multiplicao in vitro, os explantes
424
so enraizados e aclimatados, dando origem a plantas completas que

so utilizadas como material propagativo de qualidade superior por
serem livres de patgenos, serem geneticamente uniformes e fisio
logimente mais ativas (Figura 8).
Figura 8. Mudas micropropagadas de abacaxi em aclimatao .
Esse mtodo de propagao explorado intensivamente na hor

ticultura e na indstria de mudas para a propagao clonal de mui
tas espcies dicotiledneas, monocotiledneas e gimnospermas. A
micropropagao tem sido crescentemente utilizada na produo de
material propagativo de espcies ornamentais (SANTOS, 2009), fru
teiras, como a bananeira (MATSUMOTO; SILVA NETO, 2003), e flo
restais, como eucaliptus e pinus (ARENHART; ZAFFARI, 2008). A
limitao de uma aplicao mais ampla da micropropagao reside
no custo de produo, que ainda se apresenta alto para algumas esp
cies. Os itens que mais oneram os custos so a necessidade do uso
intensivo de mo-de-obra para as repicagens e as perdas por contami
nao, que podem ser muito altas dependendo da espcie e da infra
estrutura laboratorial disponvel.
Com vistas a superar problemas de custo e a falta de adaptao de
algumas espcies, sobretudo as lenhosas, s metodologias de organo
425
biotecnologia
Foto: Joo Batista Teixeira
gnese anteriormente relatadas, a embriognese somtica tem sido

utilizada em sistemas direcionados propagao massal de plantas
(NOMURA; KOMAMINE, 1985). A rpida multiplicao de embri
es somticos (Figura 9) possvel em bioreatores automatizados,
diminuindo sensivelmente o custo de produo de plantas clona
das in vitro devido ao efeito escala e reduo de custo em mo-de
-obra (TEIXEIRA, 2002). Esses embries somticos podem, ainda, ser
encapsulados individualmente para uso como sementes sintticas
(TEIXEIRA; TORRES, 1999). Diferentes tipos de bioreatores tm sido
testados e usados com sucesso para aumentar a escala da embriog
nese (GEORGE etal., 2008).
Figura 9. Embries somticos de caf (Coffea arbica ).
Por meio de gemas axilares, alcana-se o menor nmero de pln

tulas, mas elas so geralmente geneticamente mais padronizadas,
enquanto a embriognese somtica tem o potencial para produzir
quantidade infinitamente superior de plntulas, mas comparativa
mente vivel em menor nmero de espcies. Comercialmente,
numerosas espcies so produzidas, principalmente via cultivo
de gemas axilares (MURASHIGE, 1990; MATSUMOTO; SILVA
NETO, 2003). Existem protocolos de larga escala para outras clas
426
ses de plantas, incluindo culturas agrcolas e florestais, mas o custo

de produo o fator limitante para a ampliao do seu uso comer
cial (ZIMMERMAN, 1986). A evoluo dos estudos de embriog
nese somtica associados e seu cultivo em bioreatores para um maior
nmero de espcies tender a viabilizar comercialmente a micropro
pagao em larga escala (Figura 10).
Figura 10. Explantes de bananeira (Musa spp.) sendo cultivados em bioreator.
Produo de metablitos secundrios

As plantas superiores produzem uma grande quantidade de subs
tncias qumicas, as quais podem ser de interesse farmacutico e
industrial. A primeira tentativa de cultivar clulas em larga escala para
a produo de frmacos foi na dcada de 1950 na companhia Pfizer,
com pouco sucesso inicialmente. Entretanto as pesquisas permitiram
que a partir de 1978 a tcnica fosse considerada vivel, com base em
pesquisas feitas na Alemanha e Japo, principalmente (ZENK, 1978).
Em 1987 havia 30 sistemas de cultura estabelecidos que foram consi
derados melhores produtores de metabolitos secundrios que as res
pectivas plantas (SMITH, 2000).
427
biotecnologia
Muitos dos produtos qumicos vegetais considerados impor

tantes tm possibilidade de serem formados em cultura de clu
las vegetais. Diferentes metodologias tm sido desenvolvidas
para melhorar a produtividade de metabolitos secundrios. Estes
incluem a clonagem de clulas e seleo repetida de linhagens
altamente produtivas a partir de populaes de clulas hetero
gneas (ZENK, 1978; DOUGALL, 1987) e pelo uso de Elisa e
tcnicas de radioimunoensaio (KEMP; MORGAN, 1987). Outra
metodologia envolve a seleo de linhas mutantes de clulas
superprodutoras do produto desejvel (WIDHOLM, 1987). Da
mesma forma que fatores abiticos, como radiao UV, expo
sio ao calor ou frio, e sais de metais pesados e estimulantes
de natureza vegetal ou microbiolgica tm sido utilizados para
melhorar a produtividade de produtos secundrios (EILERT, 1987;
KURZ, 1988).
O fator principal para o sucesso da produo em escala comer
cial de substncias biologicamente ativas a capacidade de cres
cer clulas em larga escala. Isso tem sido conseguido com o uso
de bioreatores sob agitao e vrios tipos de bioreatores com sis
temas de ar forado (FOWLER, 1987). Para muitos sistemas, o
processo de cultivo em dois estgios (ou duas fases) tem sido tes
tado (BEIDERBECK; KNOOP, 1987; FOWLER, 1987). No pri
meiro estgio, rpido crescimento de clulas e acumulao de
biomassa enfatizado, enquanto, no segundo estgio, focaliza
-se a sntese de produto com mnima diviso celular. Fujita e
Tabata (1987) relataram a produo comercial em larga escala do
metablito secundrio shikonina, que um derivado da nafto
quinona com ao similar da insulina, por cultura de clulas.
As pesquisas continuam sendo realizadas com novas espcies
vegetais e outras tecnologias, e podem ser viabilizadas medida
que as pesquisas avancem.
Consideraes finais
A ferramenta biotecnolgica da cultura de tecidos vegetais tem
papel relevante em vrias linhas de pesquisa de natureza bsica e
aplicada, e seu uso tem sido largamente empregado na indstria da
428
propagao de plantas. Isso confere ao sistema produtivo de muitas

espcies agrcolas e florestais vantagens qualitativas do ponto de vista
gentico e fitopatolgico, resultando em maior produtividade com
menor demanda por defensivos, refletindo nos custos e na susten
tabilidade econmica e ambiental do sistema produtivo. As tcnicas
de melhoramento gentico por transgenia tm na cultura de tecidos
uma ferramenta bsica, sem a qual no se alcana a regenerao da
planta transgnica completa e funcional a partir da clula genetica
mente modificada. Muitas outras metodologias importantes no campo
da cultura de tecidos vegetais tm sido diariamente implementadas
e tem trazido novas possibilidades para o desenvolvimento e aplica
o da biotecnologia na agropecuria. A intensificao das pesquisas
no campo da cultura de tecidos possibilitar a aplicao dos benef
cios acima mencionados em um maior nmero de espcies vegetais,
incluindo muitas das espcies nativas brasileiras, que at o momento
foram pouco estudadas.
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434
Captulo15
Captulo
5
Engenharia gentica: princpios

cientficos e aplicaes
Fbio Gelape Faleiro
Introduo
O melhoramento gentico iniciou entre 8 e 10 mil anos atrs, basi
camente com a mudana de comportamento do homem, que deixou
de ser nmade e se fixou em locais mais protegidos e com maior faci
lidade de coleta de alimentos. Esse comportamento gerou a necessi
dade de plantar espcies vegetais a partir da identificao e seleo de
indivduos mais saborosos, saudveis, produtivos, resistentes e teis.
Durante esse processo, domesticamos grande parte das espcies, sele
cionando empiricamente os indivduos que apresentavam caracte
rsticas agronmicas reproduzveis, maior uniformidade e produti
vidade (ORGANIZATION FOR ECONOMIC COOPERATION AND
DEVELOPMENT, 1993). Entretanto, no incio do sculo XX, aps a
redescoberta das leis de Mendel, do desenvolvimento dos estudos
bsicos da hereditariedade e do uso de estatstica para seleo e cru
zamento de indivduos, esses estudos passaram a ser realizados com
base cientfica, aumentandose a eficincia do melhoramento gen
tico (ANDRADE; FALEIRO, 2009; ARAGO, 2009).
O melhoramento gentico vegetal visa obteno de plantas mais
produtivas, adaptadas a diferentes agroecossistemas, resistentes a
doenas e pragas e com maior qualidade nutricional. O grande desa
fio atual produzir alimentos em quantidade e qualidade e ao mesmo
tempo minimizar o impacto ambiental e reduzir o uso de defensivos
agrcolas. Grandes avanos foram obtidos pelo melhoramento gen
tico no sentido de aumentar a produtividade das culturas e consequen
temente diminuir o preo dos alimentos.
Esses resultados de produtividade foram obtidos devido pes
quisa agrcola, nas reas de melhoramento gentico vegetal e tam
bm melhoramento ambiental com o desenvolvimento de tcnicas
de manejo das culturas. No entanto, apesar dos grandes avanos
437
biotecnologia
obtidos, o melhoramento convencional apresenta algumas limita

es, como, por exemplo, a ligao gnica entre genes de interesse e
genes indesejveis e a incompatibilidade interespecfica. Para elimi
nar essas limitaes, a engenharia gentica surgiu como uma ferra
menta extremamente til, pois permite a identificao de genes de
interesse, manipulao desses genes, a construo e introduo de um
nico gene de interesse diretamente em cultivares elite e a seleo das
plantas que possuem esse gene. O gene a ser introduzido pode ser
oriundo da mesma espcie ou de outras espcies, permitindo assim
a quebra das barreiras impostas pela incompatibilidade sexual entre
as diferentes espcies, alm de eliminar o efeito das ligaes gnicas
indesejadas (ANDRADE, 2003).
Neste captulo, so apresentados os princpios cientficos da enge
nharia gentica como aspectos conceituais e histricos, enfocando a
transformao gentica e suas diferentes etapas. Aspectos tecnolgi
cos e aplicados da engenharia gentica envolvendo a obteno de orga
nismos geneticamente modificados tambm so discutidos e exem
plificados neste captulo.
Conceito de engenharia gentica

Para entender melhor o assunto discutido neste captulo, preciso
diferenciar a engenharia gentica da biotecnologia. muito comum
tratar biotecnologia como sinnimo de engenharia gentica. Os con
ceitos relatados abaixo ajudam a entender que a engenharia gentica
um conjunto de tcnicas ligado biotecnologia.
1) Engenharia gentica referese ao conjunto de tcnicas de biolo
gia e gentica molecular que resulta na construo de molcu
las de DNA quimricas ou recombinantes.
2) O DNA recombinante o resultado da ligao, em laboratrio,
de fragmentos de DNA oriundos de diferentes vetores, clu
las, organismos ou espcies.
3) Transformao gentica a introduo e integrao de DNA em
uma clula hospedeira; processo usual em laboratrios aps o
desenvolvimento da engenharia gentica.
4) Biotecnologia um conjunto de tcnicas que gera produtos e
processos de origem biolgica sendo a engenharia gentica
438
Captulo 15 Engenharia gentica: princpios cientficos e aplicaes
um exemplo dessas tcnicas (Conselho de Informaes sobre

Biotecnologia, 2009). Existe tambm o conceito de biotecnolo
gia moderna, a qual est mais relacionada engenharia gen
tica (confira Cap. 1, desta obra).
A histria da engenharia gentica

A engenharia gentica surgiu em 1972 com a associao de Stanley
Cohen da Universidade de Stanford e Hebert Boyer da Universidade
da Califrnia. Cohen e colaboradores (1972) haviam obtido a transfe
rncia e clonagem de plasmdios contendo genes de resistncia ml
tipla a antibiticos para a bactria Escherichia coli. Boyer havia desco
berto enzimas de restrio que cortavam DNA em regies especficas
produzindo finais coesivos que permitiam a ligao com outras sequ
ncias de DNA. Jackson e colaboradores (1972) criaram uma mol
cula hbrida de DNA contendo o genoma completo do Vrus Simian40
e um segmento de DNA responsvel pelo metabolismo da galactose
em Escherichia coli C600 (ANDRADE; FALEIRO, 2009; ARAGO,
2009). Esse trabalho foi o pioneiro da tecnologia do DNA recombi
nante, surgindo como importante ferramenta para analisar a estru
tura e funo de genes de mamferos, sendo a base para o recebimento
do prmio Nobel em Qumica de 1980 (BERG, 2004), juntamente
com Walter Gilbert (EUA) e Frederick Sanger (Inglaterra) (Figura1).
Figura1. Ganhadores do Prmio Nobel de Qumica em 1980: (A) Paul Berg;

(B) Walter Gilbert; (C) Frederick Sanger.
Fonte: Wikipedia, 2009.
439
biotecnologia
Com base nesses trabalhos pioneiros, foram desenvolvidos e otimi

zados protocolos para extrao, restrio, ligao, clonagem e recom
binao de fragmentos de DNA. Essa engenharia gentica resultou
no desenvolvimento de uma importante ferramenta cientfica e tecno
logia: a transformao gentica. Por meio da transformao gentica,
est sendo possvel a obteno dos chamados organismos genetica
mente modificados ou organismos transgnicos. O primeiro orga
nismo transgnico foi a bactria Escherichia coli contendo sequncia
do anfbio Xenopus laevis e o primeiro organismo comercial geneti
camente modificado foi uma bactria expressando gene da insulina
humana (ARAGO, 2009).
Transformao gentica
A transformao gentica a introduo controlada de cidos
nucleicos utilizando ferramentas de engenharia gentica. Um dos
objetivos da transformao gentica a obteno dos organismos
geneticamente modificados. Para efeito didtico, podemos dividir a
transformao gentica em cinco etapas:
1) Identificao, isolamento e caracterizao do gene de interesse.
2) Construo de um cassete de expresso e clonagem.
3) Transformao propriamente dita.
4) Regenerao e seleo das clulas transformadas.
5) Testes dos organismos transformados.
Na Figura2, ilustramse as principais etapas envolvidas na obten
o de organismos geneticamente modificados. Essas etapas so dis
cutidas a seguir.
440
Identificao
do gene
de interesse
Isolamento
Enzimas de
restrio
Clonagem
Insero do
gene
Multiplicao
do gene
Gene de interresse
Agrobacterium
Bactria incubada
com clulas vegetais
Bombardeamento
insero do gene
no plasmdio Ti
Replicao do
gene
DNA adsorvido em
Micropartculas
Transformao
Clulas bombardeadas
e insero do gene
no genoma da planta
Transferncia do
gene para o
genoma da planta
Seleo das clulas

contendo o
transgene
Clulas selecionadas
para o transgene
1 2 3
Testes finais
4 5 6 7
Clulas transformadas
selecionadas por
um marcador
Planta transgnica
regenerada de um a
clula transformada
Anlises
moleculares
Anlise
da prognie
Testes em casa de
vegetao e no campo
Figura2. Etapas da transformao: identificao dos genes, isolamento, clo

nagem, transformao gentica e avaliao da transformao.
Fonte: Andrade, 2003.
441
biotecnologia
Identificao, isolamento e caracterizao do gene de interesse

A identificao (prospeco), localizao e isolamento dos genes de
interesse so os procedimentos iniciais do processo de transforma
o gentica. Os genes podem ser prospectados em microrganismos,
plantas e animais. Existem diversos processos para identificao de
genes, sendo a extrao de RNA mensageiro (mRNA) e formao de
bibliotecas de DNA complementar (cDNA) o mtodo mais utilizado.
No entanto, tambm podese prospectar genes em Bibliotecas consti
tudas com o genoma completo (bibliotecas de DNA) e por diagnstico
utilizando sondas de protenas (CORDEIRO, 2003). Aps o sequen
ciamento dos cidos nucleicos ou protenas, procuramse homologias
em bancos na Internet (ARAGO, 2009). Informaes mais aprofun
dadas sobres os mtodos podem ser obtidas nos captulos Prospeco
Gnica e Bioinformtica (confira Cap. 4, desta obra) e Biotecnologia e
Diagnsticos Moleculares (confira Cap. 7, desta obra).
Os principais genes procurados para transformao gentica

so aqueles associados a caractersticas de produtividade, resis
tncia a estresses biticos e abiticos e qualidade nutricional. A
identificao, isolamento e caracterizao desses genes ainda
so grandes gargalos da engenharia gentica, pois, alm do
longo tempo necessrio para essa etapa, tambm existem ques
tes relacionadas propriedade intelectual de vetores, promo
tores, mtodo de transformao e do prprio gene. Programas
de sequenciamento de genomas de diversas espcies vegetais,
animais e microorganismos tm sido realizados em todo o
mundo com o intuito de identificlos. No entanto, notamos a
dificuldade desse processo pela baixa disponibilidade de genes
caractersticos de interesse econmico, como os citados acima
nos bancos de genes mundiais (ANDRADE, 2003; FERREIRA;
FALEIRO; 2008).
Construo do cassete de expresso e clonagem
Nessa fase, aps a identificao e caracterizao do gene de inte
resse, ele passa por uma srie de modificaes antes que seja utilizado
442
na transformao propriamente dita. Nesse processo, empregamse

enzimas de restries e DNA ligases para manipular o DNA e cons
truir o cassete de expresso (ANDRADE, 2003).
Enzimas de restrio so endonucleases que cortam o DNA origi
nando fragmentos de tamanho idntico e formando pontas adesivas
(Figura3). Esses cortes geralmente ocorrem em regies palindrmi
cas, ou seja, mesma sequncia em ambos os sentidos. Existe uma
especificidade das enzimas de restrio, pois o DNA sempre cor
tado em locais precisos, em uma determinada sequncia com 4 a 6
pares de bases nitrogenadas, chamados stios de restrio (Tabela 1).
Essas enzimas existem naturalmente em bactrias e esto relaciona
das ao sistema de proteo, no entanto podem reconhecer o stio de
corte no DNA de qualquer espcie, tanto vrus, bactrias, plantas ou
animais. A descoberta dessas enzimas foi crucial para o desenvolvi
mento da engenharia gentica.
MOLCULA A
MOLCULA B
5'------ G G A T C C -------- 3'

:
: : : :
:
3'------ C C T A G G -------- 5'
5'------ G G A T C C -------- 3'

:
: : : : :
3'------ C C T A G G -------- 5'
Enzima de restrio
5'------ G
:
3'------ C C T A G
G A T C C ---- 3'
:
G ---- 5'
Pontas
adesivas
Mix
5'------ G --- G A T C C -------- 3'

:
: : : :
:
3'------ C C T A G --- G -------- 5'
DNA Ligase
5'------ G G A T C C --------- 3'

:
: : : :
:
3'------ C C T A G G --------- 5'
DNA Recombinante
Figura3. Esquema da sntese de uma molcula de DNA recombinante

demonstrando a atuao da enzima de restrio cortando o DNA nas regies
palindrmicas e formando as pontas adesivas seguida da atuao da DNA
ligase colando uma ponta outra.
443
biotecnologia
Tabela 1. Principais enzimas de restrio utilizadas na Engenharia

Gentica. As setas vermelhas indicam os stios de restrio, e as
regies sublinhas indicam as pontas adesivas.
Enzimas
EcoRI
PstI
SmaI
HaeIII
HpaII
Organismo fonte
Stio de restrio
Escherichia coli
5'GAATTC
CTTAAG5'
Providencia stuartii
5'CTGCAG
GACGTC5'
Serratia marcescens
5'CCCGGG
GGGCCC5'
Haemophilus aegyptius
5'GGCC
CCGG5'
Haemophilus parainfluenzae
5'CCGG
GGCC5'
Outro grupo de enzimas importantes para a engenharia gentica

so as DNAs ligases. Essas enzimas promovem a unio de molculas
de DNA pela formao de pontes de hidrognio entre os pares de base
e de uma ligao covalente (fosfodister) entre a extremidade 3OH e
outra 5PO (Figura3). Esse processo ocorre facilmente quando exis
tem fragmentos coesivos (pontas adesivas). Na ausncia desses frag
mentos, a eficincia dessa ligao diminuda. Nesses casos, podese
utilizar um dos seguintes mtodos:
a) Adio de polidesoxi (A) na extremidade 3 do fragmento de
DNA e polidesoxi (T) na extremidade 3 do outro fragmento de
444
DNA, utilizando a DNA transferase, uma enzima incomum

que adiciona nucleotdeos extremidade de fragmentos fita
simples proeminente de uma cadeia de DNA.
b) Adio de oligonucleotdeos sintticos e complementares que
contm stios de clivagem para uma ou mais enzimas de res
trio. Eles so unidos ao DNA com o auxlio da DNA ligase.
O cassete de DNA obtido deve conter pelo menos uma sequncia
promotora, o gene de interesse, uma sequncia terminadora e um
gene marcador de seleo ou reprter (Figura4). A sequncia promo
tora necessria para a correta expresso do gene, pois as enzimas
responsveis pela transcrio do gene reconhecem essa regio e se
acoplam a ela para que ocorra o processo. A sequncia terminadora
necessria para finalizar o processo de transcrio do gene. Por fim,
para seleo das clulas transformadas, necessrio um gene repr
ter como o GUS ( glucoronidase) ou o Green Fluorescent Protein
(GFP), ou um gene de seleo como resistncia a antibiticos, herbi
cidas (ANDRADE, 2003; SOUZA JNIOR etal., 2001).
Gene de interesse
P1
P1
P2
T1
P3 = regio promotora
P2
Gene de seleo
T1
P3
Gene reprter
T1
T1
= regio terminadora
Gene de interesse X gene de seleo X gene reprter

Figura4. Cassete de expresso contendo o gene de interesse, contendo
regies promotoras, terminadoras e genes de seleo .
Antes de ser utilizado para a transformao gentica propriamente

dita, o cassete de expresso precisa ser multiplicado, assim, so utili
zados vetores para a clonagem. O vetor uma pequena molcula de
DNA que pode ser usada para introduzir o cassete de expresso em
uma clula hospedeira (CONSELHO DE INFORMAES SOBRE
BIOTECNOLOGIA, 2009). Esses vetores precisam ter algumas carac
tersticas: (i) devem ter origem de replicao; (ii) conter stios de clo
445
biotecnologia
nagem para a insero do DNA exgeno; (iii) habilidade de se dupli

car na clula hospedeira; (iv) marca gentica para selecionar a clula
contendo o vetor (resistncia a drogas ou marcas auxotrficas). Os
vetores mais utilizados so: plasmdios, bacterifagos (fagos), cos
mdios, cromossomos artificiais de levedura (YAC), vetores especiais
para plantas, clulas de insetos e mamferos. Uma vez multiplicados
pelas clulas hospedeiras, o DNA clonado pode ser utilizado para a
transformao gentica.
Transformao gentica propriamente dita

A transformao gentica ocorre em dois estgios: (i) a transfern
cia do DNA e (ii) a integrao do DNA no genoma. A integrao um
processo com menor eficincia que a transferncia, assim, somente
uma parte das clulas que receberam o DNA obtm uma transforma
o estvel (ALTPETER etal., 2005). As demais clulas apresentam
somente uma expresso transiente, ou seja, o DNA transferido, mas
no integrado e finalmente degradado por nucleases. Embora no
ocorra a integrao do DNA nem transformao estvel, clulas com
expresso transiente so estudadas para avaliar a eficincia da trans
formao e a funcionalidade do cassete de expresso (SANTARM,
2000; ALTPETER etal., 2005).
Existem diversos mtodos de transformao, sendo que a esco
lha depende da espcie a ser transformada, do tipo de explante utili
zado (clula, tecido, protoplastos), da capacidade de regenerao do
explante e da disponibilidade de materiais. Os mtodos de transfor
mao podem ser agrupados em duas categorias (Figura5): (i) transfe
rncia indireta, que tem como principal metodologia a transformao
mediada por Agrobacterium; e (ii) transferncia direta, que pode utili
zar a transformao por biobalstica (bombardeamento de micropar
tculas), eletroporao ou microinjeo (ANDRADE, 2003). Embora
todos os mtodos tenham suas vantagens e desvantagens, atualmente
a biobalstica e o Agrobacterium so os mais conhecidos e utilizados
para a transformao gentica de plantas (RAO etal., 2009).
446
Gene de interresse
Agrobacterium
Bombardeamento
DIRETA
INDIRETA
Bactria incubada
com clulas vegetais
Insero do gene
no plasmdio Ti
Replicao do
gene
DNA adsorvido em
Micropartculas
Transferncia do
gene para o
genoma da planta
Clulas bombardeadas
e insero do gene
no genoma da planta
C
Seleo das clulas
contendo o
transgene
Clulas selecionadas
para o transgene
Clulas transformadas
selecionadas por
um marcador
Planta transgnica
regenerada de uma
clula transformada
Figura5. Modelo esquemtico de transformao direta (bombardeamento)

e indireta (Agrobacterium).
Adaptado de: http://www.kicsforum.net/docsweb/images/BasicsGeneticModification2.jpg
Transformao indireta
a transformao por meio de um vetor biolgico para intermediar
a transferncia do DNA. O mtodo mais eficiente a transformao
mediada por Agrobacterium tumefaciens, mas tambm se pode utili
zar A. rhizogenes e vrus vegetais com capacidade de transferncia de
DNA (SANTARM, 2000; RAO etal., 2009).
As bactrias do gnero Agrobacterium so fitopatgenos e possuem
a capacidade natural de transferir DNA para algumas espcies de
dicotiledneas, induzindo a formao de um tumor conhecido como
galhadacoroa (crown gall) ou a sndromedaraizemcabeleira (hairy
root) (Figura6). A infeco ocorre em algum tipo de ferimento da
planta, onde a agrobactria reconhece o mesmo, acoplase a planta e
inicia a transferncia do DNA (Figura7). Estudos demonstraram que,
mesmo aps a desinfeco das plantas, os sintomas permaneciam,
sugerindo a presena de um fator determinante nas plantas infecta
das. Mais tarde, foi identificado que a agrobactria transferia um frag
447
biotecnologia
mento do DNA, denominado TDNA ou DNA de transferncia. Esse

fragmento era integrado ao genoma vegetal e se expressava de maneira
estvel. Assim, atravs de manipulao gentica do TDNA, foi desen
volvido o primeiro mtodo de transformao gentica de plantas
(PERMYOKOVA etal., 2009; ANDRADE, 2003; BRASILEIRO, 1993).
Figura6. Evidncias de infeco por Agrobacterium: (A) galhadacoroa; (B)

sndromedaraizemcabeleira.
Foto: Solange Andrade
Fonte: Wikipedia, 2009.
Figura7. Infeco por Agrobacterium: (A) Agrobacterium em fissura de folha

de feijo (M.E.); (B) Detalhe da infeco por Agrobacterium em folha de fei
jo (M.O.). Seta indica local da fissura.
448
O mtodo possui as vantagens de ser natural, apresentar alta pro

babilidade de integrao do gene e a transferncia de um pequeno
nmero de transgenes. Por ser um mtodo muito conveniente, tem
sido bastante estudado e aprimorado. Foi demonstrado que o TDNA
coberto por protenas Vir antes de ser transferido, para evitar a degra
dao do DNA por endonucleases da planta (CYTOVSKY etal., 2007).
Pesquisas recentes tm demonstrado que ocorre transferncia no
somente do TDNA, mas tambm das regies limites da esquerda e
direita deste TDNA. Segundo Permyiakova e colaboradores (2009),
esse cuidado estaria ligado ao reconhecimento da rea de replicao
do TDNA, proteo deste TDNA contra endonucleases da planta e
ao processo integrao do TDNA ao genoma da planta.
A desvantagem da transformao indireta que ela dependente da
suscetibilidade do vegetal infeco por Agrobacterium. No entanto,
com o avano no conhecimento dos mecanismos de transfern
cia, j possvel obter em laboratrio a transferncia de genes para
vrias espcies de dicotiledneas, fungos e at para clulas huma
nas (CYTOVSKY etal., 2007; PERMYAKOVA etal., 2009). Segundo
Permyakova e colaboradores (2009), atualmente a integrao do
TDNA em monocotiledneas varia de 26% a 62%.
Transformao direta
a transformao por mtodos que no utilizam bactrias como
mediadoras. Esses mtodos foram desenvolvidos com o intuito de
obter a introduo de DNA em clulas de qualquer espcie ou reino
(vegetal, animal ou microrganismo), utilizando meios qumicos ou
fsicos. Nesse caso, o cassete de expresso introduzido nas clu
lasalvo atravs de modificaes nas paredes e membranas celulares.
Atualmente, as principais metodologias utilizadas so a biobalstica
(bombardeamento ou acelerao de micropartculas), eletroporao
de protoplastos (choques eltricos), politileneglicol PEG ou fosfato
de clcio (agentes permeabilizantes) e microfibras de carboneto de
silcio (processos fsicos) (ANDRADE, 2003; SANTARM, 2000; RAO
etal., 2009; ALTPETER etal., 2005). Entre esses mtodos, a transfor
mao por bombardeamento de micropartculas a mais eficiente e
de maior sucesso. Os demais mtodos apresentam baixa eficincia ou
449
biotecnologia
no so reproduzveis em vrias espcies e situaes (SANTARM,

2000; ALTPETER etal., 2005).
Biobalstica ou bombardeamento de micropartculas
O mtodo foi desenvolvido por Sanford e colaboradores (SANFORD
etal., 1987) e consiste em bombardear clulas ou tecidos com micro
partculas de tungstnio ou ouro carregando o DNA exgeno, lana
das a partir de um acelerador que produz uma onda de choque atra
vs de uma cmara especial em condio de vcuo (Figura8). Os
sistemas que utilizam gs hlio sob alta presso e descarga eltrica
tm demonstrado maior eficincia na obteno dos transformantes
(RECH; ARAGO, 1998; LACORTE etal., 1999).
Figura8. Transformao por bombardeamento de micropartculas.

(A)Aparelho de bombardeamento de micropartculas por presso de gs
(BioRad); (B) Desenho esquemtico do processo de interno do aparelho de
bombardeamento por presso de gs.
Fonte: http://depts.washington.edu/genomelb/BiolisticBombardment&MiscV3.html
A grande vantagem da biobalstica que permite a transformao

de clulas, tecidos e espcies de forma direta, simples e rpida, sendo
aplicvel para transferncia de genes a espcies nas quais os outros
mtodos so falhos. a nica tcnica que permite a transformao de
450
plastdios e mitocndrias, embora os mtodos ainda estejam sendo

aprimorados. , tambm, uma tcnica til na introduo e expresso
de genes em animais in vivo, e na induo da resposta imune utili
zando DNA, atravs do processo denominado imunizao gentica
(ANDRADE, 2003; ALTPETER etal., 2005; RECH; ARAGO, 1998;
LACORTE etal., 1999).
Outra vantagem do bombardeamento de micropartculas que ele
facilita a transferncia mltipla de genes, pois permite a cotransfor
mao pela mistura de diferentes construes de DNA, o que evita
estratgias complexas de clonagem (ALTPETER etal., 2005). No
entanto, apresenta a desvantagem de haver integrao de mltiplas
cpias, que, em geral, esto fortemente ligadas. Alm disso, as cpias
podem estar fragmentadas com os genes e vetores em diferentes posi
es no genoma, podendo alterar ou silenciar a expresso dos genes
exgenos (ANDRADE, 2003; SANFORD, 1990; De BLOCK, 1993).
Inicialmente, a eficincia de obteno de transformantes estveis
cerca de 1% a 5%, com o aprimoramento da tcnica foram obti
dos at 18% de eficincia em arroz (DANILOVA, 2007; SANFORD,
1990; POTRYKUS, 1990). O explante bombardeado tem que ser cri
teriosamente selecionado. Para isso, utilizase um gene reprter que
possa ser facilmente detectado. Esse cuidado deve ser tomado, pois,
em geral, so obtidas quimeras dos genes introduzidos por causa do
bombardeamento randmico de um pequeno nmero de clulas num
sistema mltiplo (SANFORD, 1990).
Eletroporao
A tcnica foi desenvolvida inicialmente para transformao de pro
toplastos, posteriormente foi aprimorada para tecidos organizados
como plen, micrsporos, fragmentos de folhas, embries somti
cos, callus, sementes e gemas (RAO etal., 2009). O objetivo inicial
era obter a transformao de cereais, como alternativa transforma
o via Agrobacterium, entretanto, posteriormente, a metodologia foi
estendida s outras espcies vegetais.
A tcnica consiste no emprego de pulsos eltricos curtos de alta vol
tagem para uma alterao reversvel da estrutura da membrana plas
mtica, induzindo a formao de poros ao longo de sua superfcie.
451
biotecnologia
Dessa maneira, possvel aumentar a permeabilidade da membrana,

possibilitando a entrada macromolculas (Figura9). Na eletropora
o, podese introduzir molculas de vrios tamanhos em protoplas
tos ou clulas intactas, como, por exemplo, DNA e RNA. Alm disso,
essa tcnica, pode ser utilizada para a extrao de metablitos secun
drios de uma suspenso celular (ANDRADE, 2002; SANTARM,
2000; RAO etal., 2009; POTRYKUS, 1990).
Figura9. Transformao por Eletroporao. (A) Desenho esquemtico da for

mao dos poros na membrana plasmtica; (B) Aparelho de eletroporao.
A principal limitao da tcnica a regenerao do protoplasto, e

mesmo quando obtida a regenerao, as plntulas apresentam pro
blemas (ALTPETER etal., 2005; SANTARM, 2000). Alm disso, a
eficincia da tcnica pode ser afetada pelo tampo de transferncia,
pH do meio, presso osmtica, digesto da parede celular e a sobre
vivncia do protoplasto (ALTPETER etal., 2005; SANTARM, 2000;
ANDRADE, 2002). A parede celular, embora no impea a permea
bilidade da membrana, uma barreira para molculas maiores que
5 kb (LINDSEY; JONES, 1990). No entanto, os mtodos esto sendo
aprimorados para transformao de clulas intactas, ou digeridas par
cialmente. Com isso, tem sido reportado a transformao de tabaco,
trigo e milho. Entretanto, apesar de ser simples e eficiente, no tem
sido largamente utilizada para transformao gentica (ALTPETER
etal., 2005; SANTARM, 2000).
Microinjeo
um processo preciso e especfico para a introduo de macromo
lculas no citoplasma, ncleo ou outro compartimentoalvo da clula.
452
A operao utiliza um micromanipulador acoplado a um microscoc

pio e, por meio de uma micropipeta de vidro, dentro de uma cmara
assptica que no sofra vibraes e com temperatura e umidade rela
tiva controlada, podese inserir macromolculas na clula de maneira
no letal (Figura10). As clulas podem estar intactas, ou desprovidas
parcial ou totalmente de suas paredes celulares (ANDRADE, 2003;
ALTPETER etal., 2005).
As principais vantagens da tcnica so: a introduo de macromo
lculas dentro da clula ou de um compartimento celular de maneira
precisa; a possibilidade de controlar o volume introduzido na clula
e a alta frequncia de transformao (15% a 26%). A desvantagem
do mtodo ser trabalhoso, requerer instrumentos caros e grande
habilidade de manuseio. um mtodo que consome muito tempo,
no sendo indicado quando desejado um grande nmero de trans
formantes. Em razo disso, a microinjeo pouco utilizada para
transformao vegetal, porm uma importante metodologia para
a transformao de clulas animais (ANDRADE, 2003; ALTPETER
etal., 2005).
Figura 10. Microinjeo de clulas. (A) Etapas da microinjeo de macromo

lculas em clulas; (B) Aparelho de microinjeo.
fonte: http://sols.asu.edu/labs/bioimaging_facility/keck_lab/equip.php
Microfibras de carboneto de silcio (SCMT)

a metodologia de transformao mais simples desenvolvida.
Consiste da adio de microfibras de carboneto de silcio a uma sus
penso de tecidos vegetais (clulas, embries imaturos, callus) e
DNA, seguida da agitao por vortex ou agitadores. Com isso, so
criadas pequenas fissuras na parede celular e membranas permitindo
453
biotecnologia
a entrada do DNA. Embora a metodologia seja simples e barata, a efi

cincia de transformao ainda baixa e os danos causados s clulas
diminuem a viabilidade das mesmas e consequentemente a regenera
o da planta. No entanto, existem relatos de obteno de vrias esp
cies transformadas por essa metodologia, que pode ser uma boa alter
nativa para espcies recalcitrantes ao Agrobacterium e na ausncia de
um aparato de bombardeamento de partculas (ALTPETER etal., 2005).
Seleo e regenerao das clulas transformadas
Essa etapa fundamental para a obteno de organismos transg
nicos, sendo a regenerao das clulas transgnicas uma das prin
cipais etapas limitantes para a transformao de protoplastos e de
alguns cultivares comerciais (LAMB etal., 2001). Estudos demons
traram que, embora em muitos casos seja possvel a transformao
estvel das clulasalvo, se no houver um mtodo criterioso de sele
o e um protocolo completo de regenerao dessas clulas, no ser
possvel obter uma planta transgnica (SANTARM, 2000). O pro
cesso de seleo depender do gene reprter ou de seleo utilizado
no cassete de expresso.
O gene de seleo, em geral, induz uma vantagem seletiva, que
permitir s clulas transgnicas crescerem de forma rpida, elimi
nando as clulas no transgnicas. O mtodo de seleo dos transge
nes pode utilizar estratgias diferenciadas que so conhecidas como
seleo positiva ou negativa. A seleo positiva permite a identificao
e o desenvolvimento das clulas transgnicas sem eliminar as clulas
no transgnicas, pela introduo de um gene que permite o meta
bolismo de substncias que so inseridas no meio de crescimento.
Como exemplo, podemos citar o sistema manA/manose, que confere
s plantas a capacidade de metabolizar manose como fonte de acar.
Um sistema similar utiliza xylA/xylose. Por fim, o uso do gene gus,
que mais utilizado como gene reprter, mas que tambm confere
clula transgnica capacidade de produzir citocinina e se desenvolver
mais rapidamente que as no transgnicas. Embora no sejam os sis
temas mais comuns, existem relatos de sucesso na obteno de trans
gnicos utilizando essas estratgias (ARAGO; BRASILEIRO, 2002).
454
Foto: Solange Rocha Monteiro de Andrade
A seleo negativa realizada com a utilizao genes que conferem

resistncia a algum produto, como herbicidas ou antibiticos, permi
tindo a regenerao da clula transgnica e eliminando a notransg
nica. Essa a principal estratgia utilizada para a seleo de transge
nes, sendo os mtodos mais comuns o nptII/canamicina ou geneticina
e o bar/herbicida imidazolinona. Existe muita controvrsia quanto
ao uso de antibiticos para selecionar clulas transgnicas, assim,
o uso de herbicidas tem sido o mtodo mais utilizado. Importante
salientar que, para cada protocolo de regenerao de transgnicos,
necessrio determinar a dose adequada do agente seletivo que seja
mais adaptada para a espcie e tipo celular usados (Figura11). Uma
dosagem muito alta pode provocar a morte de todas as clulas, inclu
sive as transgnicas, e uma subdosagem pode levar ao aparecimento
de escapes, isto , o desenvolvimento de plantas no transformadas.
Figura11. Explantes de feijo cv. Olathe Pinto submetidos ao teste de sobre

vivncia geneticina (Gen) ou canamicina (Kan), aps 30 dias de exposi
o ao agente seletivo.
O domnio das tcnicas de regenerao de plantas inteiras a par

tir de uma nica clula condio sine qua non para o sucesso na
obteno de plantas transgnicas. Como cada espcie de planta tem
455
biotecnologia
diferentes exigncias hormonais, nutricionais e ambientais para a

regenerao, essa etapa ainda representa o maior gargalo na criao
de plantas transgnicas, embora essa tcnica j esteja estabelecida
para inmeras plantas de interesse (ANDRADE, 2002; GANDER;
MARCELLINO, 1997).
Conforme visto no Captulo 14, Cultura de Tecidos Vegetais: princpios
e aplicaes, deste livro, o processo de regenerao e desenvolvimento
de uma nova plntula pode ocorrer via organognese ou embriog
nese somtica. Os fatores que influenciam na determinao da rota
morfogentica so: o tipo de explante escolhido, estdio fisiolgico da
planta e o ambiente do meio de cultura (reguladores de crescimento,
nutrientes, luz, etc). A regenerao de plantas transgnicas inclui a
integrao da tcnica de transformao com um sistema funcional
de regenerao para uma dada espcie ou cultivar, e um sistema de
seleo (Figura12). Porm, nem todas as tcnicas de transformao
so compatveis com os sistemas de regenerao, pois o processo de
regenerao geralmente espcieespecfico e frequentemente culti
var especfico. Ento, ter o sistema de regenerao estabelecido para
a espcie, mas no para a cultivar a ser transformada, ou uma tcnica
de transformao para um tipo de explante, mas que no tem processo
de regenerao estabelecido, no garantir o sucesso da regenerao
e da obteno da planta transgnica (RITCHIE; HODGES, 1993).
Assim, antes de iniciar um processo de transformao de uma esp
cie, necessrio o entendimento de muitos mecanismos bsicos ine
rentes aos processos de desenvolvimento da planta a ser transfor
mada. O correto entendimento desses mecanismos essencial para
o desenvolvimento de uma metodologia de regenerao do transg
nico, e para o sucesso de obteno da planta transgnica, uma vez que
a maioria das metodologias de transformao necessita de uma fase
de cultura in vitro (ANDRADE, 2002).
456
Clulas alvo
Transgnico
Calo
Organogenese
Alongamento
Aclimatao
Enraizamento
Seleo
Figura12. Esquema das etapas de seleo e regenerao de plantas transg

nicas. A seta amarela indica o momento da transformao.
Testes dos organismos transformados

Tratase da ltima etapa do processo de transformao gentica.
Aps o processo de seleo e regenerao in vitro, as plantas obti
das so transferidas para casa de vegetao. Em seguida, so subme
tidas avaliao molecular para confirmao da transformao, por
meio de amplificao por Polymerase Chain Reaction (PCR), para
isso utilizamse primers especficos para o cassete de expresso uti
lizado (Figura13). Uma vez confirmada a presena do transgene nas
plantas regeneradas, essas so multiplicadas, e a progenie subme
tida a diversas anlises agronmicas e de biossegurana alimentar e
ambiental. Antes da liberao e utilizao comercial do organismo
geneticamente modificado, importante conhecer e certificar a sua
biossegurana. No Captulo 16, deste livro, discutese a biossegurana
e os diferentes testes aos quais so submetidos os organismos gene
ticamente modificados.
457
biotecnologia
Anlises moleculares
1 2 3 4 5 6 7
Anlise
de prognie
Avaliaes em casa de vegetao

e campo experimental
Figura13. Etapas da seleo e identificao das plantas regeneradas.
Aplicaes de plantas transgnicas

A transformao gentica abriu inmeras possibilidades tanto para
a pesquisa bsica como aplicada. Os transgnicos podem ser utiliza
dos para o melhoramento gentico vegetal, melhoria da qualidade
nutricional dos alimentos, desenvolvimento e produo de medica
mentos e vacinas comestveis, produo em larga escala de molculas
secundrias, estudos da funo e expresso de genes e promotores e
outros (ANDRADE, 2003; FALEIRO; ANDRADE, 2007). Acreditavase
que, com o desenvolvimento e com os avanos do uso da tecnologia
do DNA recombinante, a disponibilizao de organismos transgni
cos ocorreria em ondas primeiro transgnicos com caractersticas
de interesse agronmico, seguido modificaes na qualidade de ali
mentos, produo de frmacos e outros (Figura14). A engenharia
gentica tem tido muito sucesso na obteno de plantas expressando
caractersticas qualitativas controladas por apenas um gene. Entre
essas, as caractersticas de interesse agronmico, como resistncia a
herbicidas e tolerncia a insetos, dominam o mercado de transgni
458
cos desde o incio de sua produo. Considerase que a grande adoo

dessas tecnologias pelos produtores ocorreu principalmente porque
os produtos tecnolgicos lanados facilitam sobremaneira o manejo
das culturas, diminuindo os custos de produo (ANDRADE, 2003;
FERREIRA; FALEIRO, 2008).
Novos produtos
Qumicos especiais
Farmacuticos
Qualidade de alimentos
Tratos Agronmicos
1995
2000
2005
2010
Figura14. Probabilidade de liberao de organismos transgnicos com o

passar dos anos.
O desenvolvimento de transgnicos expressando outras caracte

rsticas, alm de agronmicas, est um pouco atrasado em relao
ao previsto. Os motivos para isso so diversos, entre eles o pequeno
pool de genes disponvel, questes de regulamentao e biossegu
rana, bem como de propriedade intelectual de vetores, promoto
res (FERREIRA; FALEIRO, 2008). No entanto, esperase para 2012
o lanamento comercial do arroz dourado, com maior quantidade de
caroteno, e do milho tolerante seca. Existem estudos para o desen
volvimento de vacinas comestveis e outros tipos de frmacos, mas
ainda precisa avanar nos estudos de biossegurana e regulamenta
o da liberao comercial desses produtos (FERREIRA; FALEIRO,
2008; JAMES, 2008).
Os principais pases produtores dos produtos biotecnolgicos e cul
turas plantadas esto descritos na Tabela 2 e na Figura15.
459
biotecnologia
Tabela 2. rea global das culturas biotecnolgicas em 2008: por pas

(milhes de hectares)
Posio
Pas
rea (milhes/ha
Culturas biotecnolgicas
*1*
EUA*
62,5
Soja, milho, algodo, canola, abbora,

papaia, alfafa, beterraba
*2*
Argentina*
21,0
Soja, milho, algodo
*3*
Brasil*
15,8
Soja, milho, algodo
*4*
ndia*
7,6
Algodo
*5*
Canad*
7,6
Canola, milho, soja, beterraba
*6*
China*
3,8
Algodo, tomate, lamo, petnia,

papaia, pimento
*7*
Paraguai*
2,7
Soja
*8*
frica do Sul *
1,8
Milho, soja, algodo
*9*
Uruguai*
0,7
Soja, milho
10*
Bolvia*
0,6
Soja
11*
Filipinas*
0,4
Milho
12*
Austrlia*
0,2
Algodo, canola, cravo
13*
Mxico*
0,1
Algodo, soja
14**
Espanha*
0,1
Milho
15*
Chile
<0,1
Milho, soja, canola
16*
Colmbia
<0,1
Algodo, cravo
17*
Honduras
<0,1
Milho
18*
Burkina Faso
<0,1
Algodo
19*
Repblica
Tcheca
<0,1
Milho
20*
Romnia
<0,1
Milho
21*
Portugal
<0,1
Milho
22*
Alemanha
<0,1
Milho
23*
Polnia
<0,1
Milho
24*
Eslovquia
<0,1
Milho
25*
Egito
<0,1
Milho
* 14 megapases biotecnolgicos produzindo 50.000 hectares, ou mais de culturas biotecno

lgicas
Fonte: James (2008).
460
180
Caracterstica
Total
Indstria
Desenvolvimento
25 Cultura biotecnolgica
160
140
120
100
80
60
40
20
0
1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008
Figura15. Crescimento da rea global de plantio das culturas biotecnolgi

cas, de 1996 a 2008 (Milhes de hectares).
Transformao gentica de animais

O processo de transformao gentica de animais ocorreu de forma
mais lenta que a transformao de plantas. A tcnica foi desenvolvida
no final da dcada de 1970, para estudos sobre cncer que utilizavam
camundongos, mas os primeiros resultados pareceram no incio da
dcada de 1980, com o desenvolvimento da microinjeo pronuclear
de zigotos (BRESSAN etal., 2008).
Existem diversos mtodos para a transformao de animais: bom
bardeamento de vulos micropartculas contendo DNA, microinje
o pronuclear de DNA exgeno em zigotos, fertilizao in vitro por
espermatozoide modificados, transferncia de DNA para clulas ou
embries mediada por lipossomos, eletroporao de DNA em esper
matozoides, zigotos ou embries, injeo de clulas embrionrias
previamente modificadas em blastoceles e a transferncia nuclear de
clulas somticas ou embrionrias tambm previamente genetica
461
biotecnologia
mente modificadas. Os principais mtodos utilizados so: (i) microin

jeo pronuclear de genes em vulos fertilizados; (ii) injeo de clu
las embrionrias previamente modificadas em blastoceles (Figura16)
(PEREIRA, 2008).
Transformao das clulas tronco
DNA
Seleo das
clulas
expressando o
DNA desejado
Injeo das clulas

transformadas na
camada interna da
massa celular
Blastocisto
Clulas tronco
embrionrias
Clulas da
camada
interna
Microinjeo pronuclear
Pr ncleos
Implante no
tero
Gene de
interesse
vulos
fertilizados
Implante no
tero
Fmea
parideira
Teste da prognie para a presena do gene
Acasalamento dos heterozigotos para a

formao de linhagem homozigota
Figura16. Desenho esquemtico dos mtodos de transformao de animais.
O primeiro animal transgnico foi obtido em 1982, pela microinje

o do gene do promotor de crescimento de ratos em vulos fecunda
dos de camundongo, produzindo o supercamundongo (PALMITER
etal., 1982). Esse trabalho foi um marco para a transgenia animal, por
demonstrar a possibilidade de produo de grandes quantidades de
protenas por um animal, e um futuro uso dos mesmos como biorea
tores (Figura17). Em 2001, o segundo marco foi obtido pelo Oregon
Regional Primate Ressearch Center, que desenvolveram o primeiro
primata transgnico. Nomeado como ANDi, o macaco Rhesus foi
obtido pela injeo de um gene fluorescente de medusa em vulo
maduros, posteriormente fecundados e implantados em teros de
uma receptora (CHAN etal., 2001). Esse estudo abriu espao para o
462
uso da transformao gentica para estudos e, talvez, a cura de doen

as humanas, como, por exemplo, Alzeimer.
Figura17. (A) Supercamundongo obtido 1982 pela expresso do gene de

crescimento de ratos; (B) ANDi, macaco Rhesus contendo gene de medusa.
Fonte: (A) Palmiter etal., 1982; (B) Chan etal., 2001.
463
biotecnologia
No Brasil, em 2001, nasceu Christian, o primeiro camundongo

transgnico, desenvolvido no Laboratrio de Gentica Molecular do
Instituto de Biocincia da USP. O projeto liderado pela Dra. Lygia
Pereira tinha objetivo de obter animais mutantes para estudo da
Sndrome de Marfan a partir de linhagens de clulas tronco utili
zando a tcnica de nocaute. No mesmo ano, tambm nasceu Vitor,
obtido por microinjeo pronuclear, em projeto liderado pelo Dr.
Joo Bosco Pesquero, no Laboratrio de Animais Transgnicos do
Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais em Medicina e
Biologia (Cedeme) da Unifesp (PESQUERO etal., 2002; PESQUERO,
2007; PEREIRA, 2008).
As principais aplicaes de animais transgnicos so: (i) estudo
de doenas; (ii) desenvolvimento de rgo para transplante (xeno
transplantes); (iii) produo de protenas e hormnios de interesse
humano; (iv) animais ornamentais; (v) melhoria da qualidade nutri
cional; (vi) alteraes fisiolgicas diversas.
Consideraes finais
O vasto conhecimento sobre as tecnologias de engenharia gentica
adquirido durante as quatro ltimas dcadas trouxe grandes avanos
para a medicina, e agropecuria, alm significativos impactos econ
micos e sociais para diferentes setores da sociedade. Ainda existe um
amplo campo a ser estudado, considerando todas as potencialidades
que a engenharia gentica pode oferecer. Nesse sentido, estratgico
o investimento em cincia e tecnologia e na formao de recursos
humanos para atender crescente demanda do mercado.
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468
Captulo16
Captulo
5
Biossegurana ambiental
e alimentar de OGMs
Fbio Gelape Faleiro
Introduo
A preocupao com a biossegurana de organismos geneticamente
modificados (OGMs) surgiu na dcada de 1970, aps a divulgao dos
primeiros trabalhos sobre a construo de genes (JACKSON etal.,
1972) e a transferncia de genes entre espcies diferentes via engenha
ria gentica (COHEN etal., 1972). Nesse momento, acendeu o sinal
de alerta na comunidade cientfica em relao s possibilidades ilimi
tadas que as novas ferramentas estavam trazendo e seus imprevisveis
impactos na sade humana e ambiental. Assim, de maneira volun
tria, houve mobilizao da comunidade cientfica para estabelecer
um sistema legal com fundamentao cientfica para normatizar os
assuntos referentes biossegurana (ANDRADE; FALEIRO; 2009a).
Resumidamente, a biossegurana de OGMs compreende as nor
mas necessrias para minimizar os impactos das tecnologias gera
das pela biotecnologia por meio de leis, procedimentos e diretivas
discutidas mundialmente, porm aplicadas de modo especfico em
cada pas. Essas normas e regulamentaes so importantes para o
desenvolvimento e utilizao das tcnicas de biotecnologia (FALEIRO;
ANDRADE, 2009; JESUS etal., 2006).
Neste captulo, so abordados aspectos histricos, conceituais e tc
nicos sobre a biossegurana de OGMs. Os principais riscos e anli
ses de OGMs relacionados biossegurana ambiental e alimentar so
discutidos e exemplificados.
Um pouco da histria da biossegurana

A biossegurana de OGMs surgiu juntamente com a engenharia
gentica, considerando as potencialidades da tecnologia na gerao de
produtos tecnolgicos, mais os riscos ambientais e alimentares que
471
biotecnologia
esses produtos poderiam apresentar. Para discutir esses riscos, foi

realizado um primeiro encontro da comunidade cientfica em 1974,
chamado de Conferncia de Asilomar sobre as Molculas de DNA
Recombinante. Nessa reunio, foram discutidos os critrios de segu
rana, principalmente barreiras biolgicas e fsicas, para os experi
mentos com OGMs, bem como os critrios ticos para regular esses
experimentos, alm de recomendaes para o controle de descartes
de material e padronizao da metodologia. Esse foi o incio de diver
sas discusses mundiais a respeito das regras de biossegurana, como
fundamento bsico para assegurar o avano dos processos tecnol
gicos e proteger a sade humana, animal e ambiental (ANDRADE;
FALEIRO, 2009a; BERG, 2004).
Em 1992, na Conveno de Diversidade Biolgica (CBD), que
ficou conhecida como ECO92, foi reconhecida a soberania de cada
pas sobre seus recursos genticos. Tambm foi ratificado que deve
ria haver uma diviso justa e equitativa dos benefcios gerados pelo
uso dos recursos genticos (BRAUN, AMMAN, 2002; ANDRADE,
FALEIRO; 2009a; MINAR, 2005). Na Carta da Terra, o Princpio
15, tambm conhecido como Princpio da Precauo, diz o seguinte:
Com o fim de proteger o meio ambiente, o princpio da precauo dever
ser amplamente observado pelos Estados, de acordo com suas capacidades.
Quando houver ameaa de danos graves ou irreversveis, a ausncia de cer
teza cientfica absoluta no ser utilizada como razo para o adiamento
de medidas economicamente viveis para prevenir a degradao ambien
tal, traduzindo, melhor prevenir do que remediar (UNITED
NATIONS, 1992; BORM, 2005; ANDRADE; FALEIRO, 2009a).
Assim, a preocupao em manter o risco ambiental dentro de
um grau de segurana aceitvel levou a comunidade internacional
a adotar o Princpio da Precauo como princpio tico orientador e
jurdico motivador da ao humana. Nesses casos, os pases devem
seguir procedimentos para prevenir e evitar esses danos. Isto , deter
minar o nvel de risco aceitvel por meio de avaliaes cientficas e
polticas, caso a caso e por cada pas (MINAR, 2005; BORM 2005;
ANDRADE; FALEIRO, 2009a).
Em 2000, na Venezuela, foram estabelecidas as bases para a nor
matizao internacional do desenvolvimento dos OGMs, principal
mente no que tange transferncia desses organismos entre pases,
472
Captulo 16 Biossegurana ambiental e alimentar de OGMs
bem como a manipulao e utilizao dos mesmos. O Protocolo de

Cartagena sobre Biossegurana em Biotecnologia, como ficou conhe
cido, regulamenta a transferncia, manipulao e uso de OGMs que
podem ter efeito na biodiversidade e sade humana e, fazendo refe
rncia explicita ao princpio da precauo, considerao como princ
pio guia para transferncia de OGMs em situaes consideradas de
potencial risco de reduo ou perda da biodiversidade (UNEP, 2003).
O protocolo foi ratificado por 103 pases e est em vigor desde 11 de
setembro de 2003. O Brasil ratificou sua participao em 24 de novem
bro de 2003, e o Protocolo passou a vigorar no pas em 22 de fevereiro
de 2004 (JESUS etal., 2006).
Com isso, diversas instituies internacionais discutiram e
desenvolveram mtodos para avaliao de riscos de Organismos
Geneticamente Modificados referentes s avaliaes dos possveis
impactos sobre a sade humana, animal e ambiental (ILSI, 2001; IFT,
2000; FAO/WHO, 1996, 2000, 2001; WHO, 2000). Existem alguns
Acordos Internacionais para a Regulamentao da Biossegurana que
do suporte a cada pas para desenvolver OGMs, desde que respeitem
esses acordos. Alm da Carta da Terra e do Protocolo de Cartagena,
tambm existem:
1) Organizao para a Cooperao e o Desenvolvimento
Econmico (OECD): os pases membros desenvolveram
Documentos de Consenso que so utilizados como ferramen
tas tcnicas para a tomada de decises baseadas na avaliao
de inocuidade de maneira cientfica.
2) Compromisso Internacional sobre Recursos Fitogenticos da
FAO: aprovado em Conferncia da FAO, em 1983, o primeiro
documento que se refere utilizao de recursos fitogenticos
para agricultura e alimentao. Como instrumento de harmo
nizao, tem o objetivo de garantir que os recursos fitogenticos
de interesse social e/ou econmico, particularmente para a agricul
tura, sejam explorados, preservados, avaliados e se tornem acessveis
para a criao de novas variedades e para a pesquisa.
3) Codex Alimentarius: como a maior autoridade internacional
em inocuidade alimentar, em 1989 decidiu avaliar as aplica
es da biotecnologia ao sistema existente do Codex. O Codex
atua em diversas reas de avaliaes, sendo que recentemente
473
biotecnologia
foi criado um Grupo especial em Biotecnologia com o objetivo

de estabelecer modelos de segurana de alimentos derivados
da biotecnologia, e tambm regulamentar a rotulagem desses
alimentos (JESUS etal., 2006).
Alguns conceitos importantes

Para facilitar a leitura, introduzimos abaixo alguns conceitos impor
tantes que sero citados neste captulo:
Anlise de risco: procedimento realizado para analisar a natu
reza e os efeitos adversos sade humana e animal ou ao
ambiente. Consiste de trs etapas: avaliao do risco, adminis
trao do risco e comunicao do risco.
Avaliao de risco: combinao de procedimentos ou mtodos,
por meio dos quais se avaliam, caso a caso, os potenciais efei
tos da liberao planejada do OGM e seus derivados sobre o
ambiente e a sade humana e animal.
Biossegurana: matria que estuda os riscos potenciais da bio
tecnologia para a sade humana e animal, bem como para o
ambiente. s Comisses de Biossegurana compete regulamen
tar e monitorar esses riscos.
Conteno: em Biossegurana, conjunto de medidas e protoco
los aplicados para minimizar o risco de organismos genetica
mente modificados ao ambiente ou sade humana e animal.
Derivado de OGM de origem vegetal: produto obtido de OGM de
origem vegetal e que no possua capacidade autnoma de repli
cao ou que no contenha forma vivel de OGM.
Fluxo gnico horizontal: quando a troca de informao gentica
se d entre indivduos de espcies diferentes, distantes geneti
camente.
Fluxo gnico vertical: quando a passagem da informao gen
tica ocorre entre indivduos da mesma espcie, produzindo des
cendentes frteis e viveis.
Liberao controlada: no contexto da Biotecnologia, a libera
o intencional de organismos geneticamente modificados no
meio ambiente.
474
Liberao planejada: liberao no meio ambiente de OGM de

origem vegetal ou seus derivados, para avaliaes experimentais
sob monitoramento, de acordo com as disposies da Resoluo
Normativa n 6, de 6 de novembro de 2008.
Organismo Geneticamente Modificado de origem vegetal: vege
tal cujo material gentico (ADN/ARN) tenha sido modificado
por qualquer tcnica de engenharia gentica.
Perigo: agente nocivo capaz de causar algum efeito adverso.
Poluio gentica: disperso descontrolada de genes para esp
cies ou indivduos nos quais esses genes no estavam presentes.
Conceito associado a escape gnico a partir de OGMs.
Princpio da precauo: estratgia pela qual qualquer possvel
risco associado com a introduo de uma tecnologia nova evi
tado, at a completa compreenso do seu efeito sade e ao
ambiente.
Protocolo de biossegurana: conjunto de procedimentos aceitos
internacionalmente para proteger a sade humana e animal e o
ambiente de potenciais riscos do uso da biotecnologia e de seus
produtos; Protocolo de Cartagena.
Requerente: qualquer pessoa jurdica com Certificado de
Qualidade em Biossegurana CQB que se proponha a efetuar
liberao planejada, de acordo com a Resoluo Normativa n
6, de 6 de novembro de 2008.
Responsvel Legal: indivduo sobre o qual recai a responsabi
lidade pela conduo da liberao planejada, conforme as nor
mas da CTNBio.
Risco: probabilidade de ocorrncia de efeito adverso.
Segurana alimentar: significa garantir, a todos, condies de
acesso a alimentos bsicos de qualidade, em quantidade sufi
ciente, de modo permanente e sem comprometer o acesso a
outras necessidades essenciais, com base em prticas alimenta
res saudveis, contribuindo, assim, para uma existncia digna,
em um contexto de desenvolvimento integral da pessoa humana
(Conselho de Informaes Sobre Biotecnologia; Comisso
Tcnica Nacional de Biossegurana).
475
biotecnologia
Anlise de risco
A anlise de risco um processo reproduzvel que envolve vrias
etapas de avaliao prvia visando obteno de resultados com um
nvel aceitvel de incerteza, pois a certeza absoluta ou risco zero em
uma avaliao de segurana nunca possvel. Assim, a incerteza
um aspecto incontornvel de todos os processos de avaliao e gesto
de riscos, sendo que o nvel de incerteza aceitvel depende de fatores
sociais, econmicos e polticos. O processo geralmente consiste de um
conjunto prescrito e prplanejado de avaliaes de risco de dados e
de recursos. Por exemplo, quando certo potencial de efeito adverso
considerado em uma avaliao de risco, necessrio apresentar uma
descrio do cenrio aceitvel dentro de uma cadeia causal de even
tos por meio da qual o efeito especfico pode ocorrer, bem como uma
avaliao do estado de conhecimento sobre a plausibilidade de cada
etapa acontecer, e, finalmente, uma deciso sobre a aceitabilidade das
consequncias (CRAIG etal., 2008).
A anlise de risco de OGMs composta das seguintes etapas: (i) a
avaliao do risco; (ii) o gerenciamento do risco; e (iii) a comunicao
do risco (LAJOLO; NUTTI, 2003). Essa anlise baseada em metodo
logias cientficas que buscam a sistematizao das informaes sobre
um determinado perigo e auxiliam no processo de avaliao de risco
e na adoo de medidas para minimizlo ou eliminlo (LAJOLO;
NUTTI, 2003). Ela realizada tanto para biossegurana ambiental
quanto alimentar.
O processo se inicia com a identificao do possvel efeito adverso
ou perigo que o OGM possa causar ao ambiente ou sade animal e
humana, seguido das consequncias potenciais e, por fim, da deter
minao da probabilidade que isso ocorra. O risco dessa caracters
tica especfica do OGM pode ento ser estimado, e, assim, subsidiar a
tomada de decises necessrias para evitlo ou minimizlo (CRAIG
etal., 2008).
Biossegurana ambiental de OGMs

Nos anos 1980, existia um consenso de que, com a liberao de
organismos transgnicos, havia um risco potencial ao ambiente.
476
Considerando que esto sendo produzidos animais, vegetais e micror

ganismos transgnicos expressando genes com diferentes caracters
ticas, desde agronmicas, passando por ornamentais at medicinais,
a liberao desses organismos no ambiente requeria cautela e cui
dados de avaliao de risco. As avaliaes risco deveriam ser realiza
das caso a caso, considerando o transgene, o organismo receptor, a
inteno de liberao no ambiente, a frequncia e escala da introdu
o. Essa discusso envolveu ecologistas, bilogos, epidemiologistas,
geneticistas e outros (ANDOW; ZWAHLEN, 2006; JESUS etal., 2006;
ANDRADE; FALEIRO, 2009b).
Desde 1990, vm ocorrendo graduais, porm substanciais, altera
es no processo de avaliao de risco de liberao de um organismo
transgnico no ambiente. As avaliaes de risco atualmente seguem
quatro etapas: (i) identificao do perigo; (ii) avaliao da exposio ao
perigo; (iii) avaliao dos possveis efeitos da exposio e (iv) caracte
rizao do risco. Essas quatro etapas providenciaram uma estrutura
conveniente para relacionar os avanos cientficos dos anos 1990 e os
possveis riscos ao ambiente (ANDOW; ZWAHLEN, 2006).
Segundo Craig e colaboradores (2008), dois tipos de riscos podem
ocorrer em consequncia da liberao de OGMs no ambiente: (1) efei
tos inesperados na populaoalvo, como, por exemplo, a evoluo da
resistncia em pragasalvo/populaes do patgeno quando o trans
gene confere resistncia a uma praga ou patgeno; e (2) efeitos inespe
rados, em populaes noalvo, por exemplo, alteraes na biodiversi
dade local associada direta ou indiretamente com a planta transgnica,
ou aqueles associados com a integrao e posterior expresso do trans
gene individual em um organismo diferente (fluxo gnico).
Quando se considera o risco ambiental, as ferramentas utilizadas
devem ser capazes de avaliar as caractersticas agronmicas do trans
gnico, sua estabilidade no ambiente, as caractersticas ecolgicas do
ambiente no qual ele ser inserido, incluindo os possveis efeitos no
intencionais resultantes da insero do gene, e o risco potencial ao
ambiente, podendo utilizar, caso necessrio, o Princpio da precau
o. (ANDRADE; FALEIRO, 2009b).
As avaliaes ocorrem caso a caso e, no momento, as preocupaes
sobre o impacto de OGMs no ambiente se referem principalmente s
plantas que contm as tecnologias Bt (resistncia a insetos) e HT (tole
477
biotecnologia
rncia a herbicidas). Esses materiais tiveram grande aceitao pelos

produtores desde o incio e tm sido largamente utilizados (Figura1).
As plantas expressando tolerncia a herbicida so as mais utilizadas,
respondendo por 63% da rea de produo biotecnolgica, seguidas
das plantas contendo os genes combinando ambas as caractersticas,
com 22%, e, por fim, plantas expressando somente resistncia a inse
tos, com 15% (JAMES, 2008).
Ha
Acres
222
90
198
80
Tolerncia a herbicida (HT)
173
70
Resistncia a insetos (Bt)
148
60
Tolerncia a herbicida /
Resistncia a insetos
124
50
99
40
74
30
49
20
25
10
0
1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008
Figura1. rea global de produo de culturas biotecnolgicas de 1996 a 2008:

trato cultural (milhes hectares, milhes acres ).
Fonte: adaptado de James, 2008.
Segundo Carpenter e colaboradores (2002), so nove as principais

consideraes a respeito dos possveis impactos ambientais das lavou
ras de soja, milho e algodo transgnicos: (a) risco da variedade cul
tivada ou silvestre transformada tornarse uma espcie daninha
invasora; (b) desenvolvimento de resistncia pelo uso macio da tec
nologia; (c) possibilidade de escape gnico (transferncia vertical e
horizontal); (d) alteraes na populao de pragas e plantas daninhas;
(e) efeito adverso sobre espcies noalvo e benficas; (f) impactos
nos sistemas de produo vegetal; (g) alterao no padro de uso de
pesticidas; (h) manejo e conservao do solo; e (i) impactos sobre a
sade humana.
478
J Sanvido e colaboradores (2006) consideram que os efeitos dos

transgnicos no ambiente podem ser divididos em diretos ou indi
retos. O efeito direto aquele resultante da ao do transgene, isto ,
da consequncia da transformao gentica no gentipo e fentipo
do organismo modificado. Os efeitos indiretos seriam decorrncia
de efeitos em organismos que no eram alvos iniciais do organismo
transgnico (Figura2).
Efeitos ambientais
Efeitos diretos
Fluxo gnico
para parentes
silvestres
Disperso das
culturas OGMs
Impacto ambiental
dos produtos
transgnicos
Efeito em
organismos no
alvo
Desenvolvimento
de resistncia
Transferncia de plen
para parentes silvestres
e formao de hbridos
Sobrevivnci a
fora das reas
cultivadas
Persistncia,degradao
e disperso dos
produtos transgnicos
Absoro direta ou
indireta de produtos
transgnicos pel a
alimentao
Desenvolvimento de
resistnci a
Sobrevivncia e
reproduo dos
hbridos
Reproduo
fora das reas
cultivadas
Acmulo dos
produtos
transgnicos do solo
Efeito nos
organismos no alvo
Efeitos indiretos
Populao transgnica (hbridos/culturas)

com aumento do aptido comparado
populao silvestre
Lixiviao dos
produtos
transgnicos do solo
Efeito na
dinmica da
populao
Disperso e persistncia das plantas

transgnicas (hbridos/culturas) fora
da rea cultivada
Emisso dos
produtos transgnicos
para a gua
Efeito na funo dos

ecossistemas
Efeitos indiretos
Efeito nos sistemas produtivos e mtodos agrcolas
Desenvolvimento de resistnci a
Desenvolvimento
de resistncia nas
pragas e doenas
alvo
Seleo de
plantas silvestres
tolerantes a herbicidas
Alterao nas
prticas de cultivo
Perda da eficci a
do produto transgnico
Reduo da eficcia
do herbicida especfico
Alterao nos tipos de

pragas, doenas e
organismos benficos
Alteraes nas estratgias de controle de pragas e doenas
Alterao nos
intervalos e reas
de cultivo
Alterao no
uso dos recursos
Alteraes nas
caractersticas fsicas, qumicas
e biolgicas dos solos
Depreciao da
qualidade do sol o
Efeito na biodiversidade
Efeitos econmicos
Efeitos ambientai s
Figura2. Efeitos potenciais diretos e indiretos dos organismos geneticamente

modificados no ambiente.
Fonte: adaptado de Sanvido etal., 2006
479
biotecnologia
A seguir, discutiremos alguns pontoschave desse impacto poten

cial dos OGMs ao ambiente.
Fluxo gnico e recombinao

O fluxo gnico ou introgresso a transferncia de um gene ou
genes de uma planta doadora para outra sexualmente compatvel e
genotipicamente diferente por meio da polinizao, seguida de cru
zamentos entre o hbrido dentro da populao at a estabilidade do
gene na populao. Essa introgresso pode ocorrer entre espcies,
variedades ou bitipos diferentes, desde que sejam compatveis sexu
almente. um processo natural que ocorre desde o incio da agricul
tura, no entanto o advento da transgenia suscitou preocupaes adi
cionais, pois o fluxo entre a planta transformada geneticamente e as
espcies silvestres, ou mesmo as cultivares convencionais, poderia
trazer alguma vantagem seletiva ou contaminar uma produo no
transgnica (ANDRADE; FALEIRO; 2009b; SILVA etal., 2007).
No entanto, o fluxo gnico vai ocorrer se as plantas doadoras e
receptoras crescerem perto o suficiente para haver a troca de plen,
pois, embora o plen possa viajar longas distncias, seja por meio do
vento, insetos ou por outros animais polinizadores, sua viabilidade
decresce com o tempo e as condies ambientais. Alm disso, para
ocorrer o fluxo gnico, necessrio que ambas as espcies/variedades
estejam na poca de florao e os estigmas estejam receptivos para
o plen (CERDEIRA; DUKE; 2006; ANDRADE; FALEIRO, 2009b).
Segundo Sanvido e colaboradores (2006), existe um consenso den
tro da comunidade cientfica de que pode haver fluxo gnico entre as
variedades transgnicas e as espcies selvagens compatveis sexual
mente. Estudos no Canad com canola demonstraram essa hiptese,
porm tambm verificaram que o fluxo gnico ocorre na mesma pro
poro apresentada pelas cultivares no transgnicas. A inquietao
que surge saber se esse transgene poderia causar um impacto rele
vante na populao selvagem. No caso da canola resistente a herbicida,
cultivada h anos no Canad, no foram encontradas evidncias de
que esse cultivo tenha espalhado resistncia na populao selvagem
de canola. No caso especfico de resistncia a herbicidas, no espe
rado que a introgresso dessa caracterstica confira algum benefcio
480
de seleo, pois dificilmente esses genes teriam caractersticas sele

tivas dentro do ambiente natural. No entanto, a resistncia a insetos
poderia aumentar a adaptao s pragas naturais da populao sel
vagem. Entretanto, em ambientes naturais, aps mais de 10 anos de
plantio de OGMs, no foi observado nem a introgresso expressiva
dentro das espcies silvestres compatveis, nem a extino de esp
cies selvagens pela introgresso de resistncia de transgenes dentro
da populao (SANVIDO etal., 2006; ANDRADE; FALEIRO; 2009b).
Independente de o fluxo gnico causar ou no uma vantagem sele
tiva para espcies silvestres, pesquisas tm sido realizadas no sen
tido de desenvolver mecanismos para impedir ou minimizar esse
risco. So elas: (i) a restrio geogrfica dos cultivos transgnicos;
(ii) a construo de plantas transgnicas com genes letais ativados
por um agente qumico ou pelo ambiente para evitar a disperso de
transgenes (terminator); (iii) a transformao de organelas (mitocn
drias e cloroplastos) ou de linhagens machoestreis; (iv) o desenvol
vimento de bionanomolculas que permitem o biomonitoramento
in vivo do fluxo gnico em tempo real; e (v) o manejo para coexistn
cia entre cultivos transgnicos e no transgnicos (SILVA etal., 2007;
CHAPMAN; BURKE; 2006). Muitas dessas tecnologias ainda esto
em estudo, entre elas, as bionanomolculas e a transformao de
organelas e linhas machoestreis; outras causam muita controvr
sia, como o uso de genes terminadores, ou suicidas. No entanto, algu
mas j esto em uso e apresentando bons resultados, permitindo, em
alguns casos, a liberao de OGMs para plantios comerciais no Brasil
e no mundo, os quais sero discutidos abaixo.
Algodo resistente a inseto
No Brasil podem ser encontradas trs espcies de algodo:
Gossypium hirsutum L., Gossypium barbadense L. e Gossypium muste
linum Miers ex Watt. Todas so sexualmente compatveis e os cruza
mentos so mediados por insetos polinizadores. A introduo de cul
tivares transgnicas, resistentes a insetos, trouxe preocupaes, pois
o fluxo gnico a partir de cultivares transgnicas, assim como con
vencionais, pode afetar a estrutura gentica das demais populaes.
Alm disso, o algodo no apresenta barreiras sexuais completas, ou
481
biotecnologia
seja, pode haver cruzamento entre diferentes espcies de um mesmo

gnero. Assim, o isolamento geogrfico entre cultivares e as popula
es que se deseja proteger pode ser utilizado para reduzir a proba
bilidade de cruzamentos. Nos Estados Unidos e na Austrlia, essa
estratgia foi adotada para evitar a ocorrncia de fluxo gnico entre
populaes transgnicas e selvagens. Nos EUA, apenas G. tormento
sum, uma planta daninha, compatvel com G. hirsutum, porm s
cresce no Hava. Existem populaes de G. hirsutum na Flrida, Ilhas
Virgnia e Porto Rico, e G. barbadense, em Porto Rico. Assim, por
medidas de precauo, essas so reas de restrio para o plantio de
algodo transgnico experimental ou comercial (WOZNIACK, 2002;
BARROSO etal., 2005).
No Brasil, o Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento
(MAPA) definiu as reas de excluso de algodo transgnico, na
Portaria 21 de 2005. Essa portaria foi baseada no Comunicado Tcnico
242 da Embrapa (BARROSO etal., 2005), e nos Pareceres Tcnicos
Prvios Conclusivos n 480, de 2004, e n 513, de 2005, da Comisso
Tcnica Nacional de Biossegurana (CTNBio). Esses estudos levaram
em considerao a distribuio das espcies de Gossypium, a impor
tncia biolgica das populaes e o zoneamento agrcola. Com base
nessas informaes, foram identificadas quatro grandes reas que
compem a zona de excluso (Figura3). Nas zonas de excluso, alm
da proibio do plantio de algodoeiros transgnicos, tambm dever
ser impedida a circulao de sementes, gros, algodo em caroo e
outras partes propagativas, salvo excees analisadas pela autoridade
competente (BARROSO etal., 2005).
482
No restrio ao GM
Zona de excluso ao GM
Figura3. Localizao das reas propostas como zonas de excluso para o

plantio de cultivares de algodoeiro geneticamente modificado no Brasil.
Fonte: Barroso etal., 2005.
Alm desses cuidados, o CTNBio, no Comunicado 04 de 24 de

junho de 2008, visando a aumentar a segurana, determinou, para
pesquisa, as seguintes condies de isolamento para concesso de
autorizao de liberao planejada no meio ambiente de algodoeiro
geneticamente modificado:
a) Manter distncia mnima de 800m de quaisquer outras esp
cies de algodoeiro caso haja algodoeiros silvestres ou varieda
des locais nas proximidades.
b) Manter distncia mnima de 250m de qualquer algodoeiro e
implantar bordaduras de conteno de trinta linhas de algodo
eiro convencional e de dez linhas de milho ao redor das par
celas experimentais na ausncia de plantas silvestres ou varie
dades locais.
483
biotecnologia
As bordaduras so barreiras fsicas que visam diminuir a pos

sibilidade de o gro de plen alcanar uma cultivar convencional
ou um indivduo da populao silvestre. No entanto, nos EUA, o
USDAAPHIS demanda uma distncia de isolamento de 12m entre o
cultivar de algodo transgnico e os cultivares no transgnicos e esp
cies selvagens (MNSTER; WIECZOREK, 2007). Estudos demonstra
ram existir 1% de polinizao cruzada nas linhas com 7m de distncia
do plantio transgnico, e abaixo de 1% a 25m (UMBECK etal., 1991).
Soja tolerante a herbicida
O Brasil o segundo maior produtor mundial de soja, e, como
no resto do mundo, a soja resistente a herbicida teve tima aceita
o pelos produtores. Essa rpida adoo e crescimento do plantio
trouxeram questionamentos sobre a possibilidade da coexistncia
entre a soja transgnica e no transgnica, principalmente a orgnica.
Existiam dvidas sobre a possibilidade de haver fluxo gnico das cul
tivares transgnicas para as demais, gerando contaminao dos diver
sos sistemas de produo de soja (ANDRADE; FALEIRO; 2009b).
A soja uma planta autgama, isto , reproduzse preferencial
mente por autofecundao, apresentando um mecanismo chamado
de cleistogamia, no qual a fecundao ocorre antes da abertura da
flor. Apesar desse mecanismo, pode ocorrer a polinizao cruzada
em soja, a qual est em torno de 1%, podendo chegar a 2,5% em algu
mas cultivares. Em razo dessa caracterstica, nos EUA, as Agncias
Reguladoras no exigem distncia mnima para o plantio de soja
transgnica e no transgnica, devido ao baixo ndice de transfe
rncia de genes entre as cultivares (CARPENTER etal., 2002). At
o momento, no foram verificados ou comprovados maiores proble
mas com a ocorrncia de fecundao cruzada entre a soja genetica
mente modificada e a soja no transgnica nos plantios comerciais
do Brasil e do mundo.
No Brasil, no existe exigncia mnima para o plantio comercial de
soja. Entretanto, a Lei n 11.460, de 21 de maro de 2007, estabelece
que a distncia mnima de plantio de OGMs ser estabelecida caso a
caso, e est proibido o plantio de qualquer OGM em reas indgenas
e unidades de conservao, exceto em reas de proteo ambiental
484
(APA) com plano de manejo para regulamentar o plantio do OGM.

Assim, o plantio comercial ou para pesquisa da soja transgnica deve
seguir essa regulamentao.
Pesquisadores da Embrapa realizaram estudos para avaliar o fluxo
gnico da soja transgnica e demonstraram que a maior frequncia
de disseminao de plen transgnico foi de 0,45%, nas linhas com
0,5m distncia do cultivo transgnico (ABUD etal., 2003). Essa fre
quncia foi reduzida para no mximo 0,14% na distncia de 1 m, atin
gindo 0% aos 6,5m do cultivo transgnico (Figura4). Esses resulta
dos foram corroborados em um novo experimento realizado na regio
do Cerrado, o qual demonstrou que a polinizao cruzada em soja
tende a zero em distncias maiores que 8 m. Assim, os autores suge
riram uma distncia de isolamento de 10m para garantir a pureza
das sementes (ABUD etal., 2007).
30
Nordeste
Eventos de polinizao com transgenes
Sudoeste
25
20
15
10
0
0,5
1,5
2,5
3,5
4,5
5,5
6,5
7,5
Distncia (metro)
Figura4. Distribuio dos eventos de fecundao entre plantas transgnicas

da parcela central e no transgnicas na direo nordeste e sudoeste.
Fonte: adaptado de Abud etal., 2003.
485
biotecnologia
Milho resistente a insetos

O problema do fluxo gnico maior em plantas algamas, ou
seja, que apresentam fecundao cruzada, como no caso do milho.
No Brasil, houve muita controvrsia principalmente a esse respeito
desde que a empresa Monsanto entrou na CTNBio, em 1999, com
um pedido para a liberao comercial do plantio do milho resistente
a insetos da ordem lepidptera (Milho Gardian, MON810). O pare
cer tcnico conclusivo favorvel ao plantio comercial s foi publicado
em 2007. No Parecer Tcnico N 1.100/2007 de 16 de agosto de 2007,
a CTNBio se refere da seguinte maneira ao fluxo gnico:
Estudos sobre disperso de plen de milho tm sido condu
zidos, sendo que alguns deles mostram que o plen de milho
pode deslocarse a longas distncias. Porm, a maioria do
plen liberado depositada prxima cultura, com taxa de
translocao muito baixa fora da cultura fonte. O agente
de polinizao predominante no milho o vento e a distn
cia que o plen vivel pode percorrer depende dos padres de
vento, umidade e temperatura... Os resultados indicam que
a viabilidade do plen mantida por 2 h e que a poliniza
o cruzada no foi observada em distncias de 300 metros
da fonte de plen. Comparandose as concentraes a 1m da
cultura fonte sob ventos baixos a moderados estimouse que,
aproximadamente, 2% de plen so anotados a 60 m, 1,1%
a 200m e 0,750,5% a 500m de distncia. A 10m de um
campo, em mdia, o nmero de gros de plen por unidade
de rea dez vezes menor que o observado a 1m da borda.
Portanto, se as distncias estabelecidas de separao desen
volvidas para produo de sementes de milho so observadas,
esperase que a transferncia de plen s variedades adjacen
tes seja minimizada, sendo improvvel a presena de mate
riais genticos com resistncia a insetos (CTNBio).
A Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (Anvisa) e o Instituto
Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renovveis
(Ibama) entraram com recurso no Conselho Nacional de Biossegu
rana (CMBS) contestando o parecer da CTNBio. No entanto, na Reso
486
luo CBSN n 3, de maro de 2008, considerouse improcedente o

recurso impetrado e ratificouse o parecer 1.100/2007 da CTNBio.
Por fim, para regulamentar os plantios comerciais, a CTNBio, na
Resoluo Normativa n 4 de 16 de agosto de 2007, estabelece que,
para haver a coexistncia de plantios comerciais de milho transgni
cos e no transgnicos, o agricultor deve respeitar a distncia mnima
de 100m entre os plantios. Tambm existe a possibilidade de uma
distncia de 20 m, desde que haja uma bordadura de no mnino 10m
de milho convencional de porte e ciclo vegetativo similar ao genetica
mente modificado. Em relao a estudos experimentais em campo, o
Comunicado 01, de 9 de agosto de 2006, determinou que
as instituies ou entidades interessadas em obter autoriza
o de liberao planejada no meio ambiente de milho gene
ticamente modificado devero adotar, pelo menos, uma das
duas alternativas abaixo estipuladas:
a) Isolamento espacial: estabelecer bordadura de conten
o com dez linhas de milho no geneticamente modi
ficado ao redor das parcelas experimentais e manter
distncia de 400 metros de outros plantios com milho.
b) Isolamento temporal: estabelecer bordadura de con
teno com vinte linhas de milho no geneticamente
modificado ao redor das parcelas experimentais, man
tendo distncia de 10 metros de outros plantios de
milho, e respeitar perodo mnimo de 40 dias entre
datas de florescimento de outros plantios de milho.
Nos casos de cultivo de variedades crioulas de milho nas pro
ximidades da rea experimental, as instituies ou entida
des interessadas devero estabelecer, ao redor das parcelas
experimentais, bordadura de conteno com dez linhas de
milho no geneticamente modificado, manter distncia de
400 metros de outros plantios com milho (isolamento espa
cial) e respeitar perodo mnimo de 40 dias entre datas de flo
rescimento de outros plantios de milho (isolamento tempo
ral) (CTNBio, Comunicado 21, 2006).
487
biotecnologia
Nos EUA, Goggi e colaboradores (2006) realizaram um experi

mento para determinar o potencial de fluxo gnico de um campo de
produo transgnico quando rodeado por campos de produo con
vencional (no transgnicos), em duas safras 2003 e 2004. Os resulta
dos demonstraram que a percentagem de polinizao cruzada entre
variedades de milho transgnicas e no transgnicas decresciam expo
nencialmente em distncias de 1m, 10m, 35m, 100m, 150m, 200m
e 250m, chegando a 0,05% a 100m e 0,002% a 250m. No entanto,
houve variao da frequncia de polinizao em funo dos anos de
plantio e no houve zero por cento de polinizao mesmo a 250m.
Os autores sugerem que, para haver coexistncia entre transgni
cos e no transgnicos, necessrio haver uma separao temporal
de semeadura ou o plantio de uma barreira de no transgnico com
alta densidade de produo de plen ao redor do cultivo transgnico.
Luna e colaboradores (2001) avaliaram a durao da viabilidade do
plen e a distncia efetiva de isolamento em estudos realizados no
Mxico. Os resultados demonstraram que a polinizao cruzada ocorre
a uma distncia mxima de 200m e nenhuma polinizao cruzada
aconteceu em distncias iguais ou superiores a 300m em relao s
fontes de plen. Tambm demonstraram que, nas condies de poten
cial hdrico atmosfrico, o plen perdia sua viabilidade ps 2 horas
de coleta. Esses resultados so importantes, pois o Mxico o cen
tro de origem de vrias espcies de milho e relativos, e existem muita
discusso e dvidas a respeito do fluxo gnico das cultivares trans
gnicas para as espcies nativas e crioulas do pas (DALTON, 2008).
No Brasil, entendese que o fluxo gnico s ocorrer dentro da
mesma espcie independente de ser crioula ou cultivada, pois aqui
no ocorrem outras espcies que cruzam com o milho. Assim, a
Embrapa considera que possvel a coexistncia entre as varieda
des Bt e no transgnicas, desde que seja mantido um espaamento
espacial e temporal. A Embrapa tambm sugere a criao de zonas
de excluso para aumentar as possibilidades da coexistncia de milho
transgnico e no transgnico (EMBRAPA, 2006).
488
Efeito em espcies no alvo e benficas

O efeito de plantas transgnicas sobre espcies noalvo tem sido
bastante debatido, existindo uma controvrsia sobre se devemos
avaliar o efeito no ecossistema ou apenas selecionar algumas esp
cieschave ou indicadoras (ARPAIA etal., 2007). Espcies noalvo
so definidas como as espcies que no so propsito direto do uso
de um pesticida particular (SANVIDO etal., 2006). Assim, um grupo
de estudos formado por 403 pesquisadores de diferentes instituies,
formaes e pases desenvolveu um projeto visando definir as dire
trizes de como realizar uma anlise de risco referente ao efeito de
OGMs sobre o ambiente (GMOERA, 2008). Esse estudo ocorreu em
duas fases de 2002 a 2007, e, para avaliaes de risco sobre espcies
noalvo, foi proposta uma metodologia em quatro etapas (Figura5).
Existem muitas espcies com potencial de serem afetadas pelos
OGMs. Em razo disso, era essencial avaliar, ranquear e selecionar
as espcies e os processos ecolgicos para identificar os mais afetados
pelo OGM para futura anlise de risco. As quatro etapas da metodo
logia de anlise de risco de OGMs em espcies no alvo ilustrado na
Figura5 so explicadas abaixo:
1 Etapa Identificao dos grupos ecolgicos funcionais: espcies
e processos ecolgicos podem ser divididos em grupos ecolgicos e
funcionais que so relacionados a possveis danos ambientais. Grupos
de alta prioridade podem ser identificados e selecionados, por exem
plo, predadores, polinizadores e decompositores.
2 Etapa Associao com a culturaalvo e significncia: ranquear
em importncia todas as espcies relevantes associadas ao OGM den
tro de cada grupo funcional selecionado na 1 etapa e avaliar:
Qual o grau de associao entre a espcie ou processo ecol
gico e o OGM? Caso a espcie ou processo seja afetado negati
vamente, qual o grau de significncia das consequncias negati
vas; caso a espcies seja benfica, poderia se tornar praga futura
ou causar problemas na sade do produtor?
489
biotecnologia
Grupo Funcional
Associao
com a cultura
Importncia funcional
no sistema agrcola
1 etapa
2 etapa
Espcies ou processos prioritrios
O que exposto ao
produto do transgene?
Qual os outros
impactos ecolgicos?
3 etapa
Espcie ou processo
prioritrio
Vias de
efeitos
trficos
mediados
Via de
outros
efeitos
ecolgicos
Hipteses
4 etapa
Experimentos
Hipteses podem
ser descartadas
Deciso baseada
em dados
Hipteses podem
ser confirmadas
Figura5. Metodologia de anlise de risco do efeito de um OGM sobre esp

cies noalvo.
Fonte: adaptado de GMOERA, 2008..
490
3 Etapa Vias de exposio e de efeitos adversos: avaliao preli

minar e hipteses de risco: (i) para espcies e processos ecolgicos
mantidos na etapa 2, avaliar quo prximo o contato entre eles e o
produto do OGM; (ii) na ocorrncia de exposio, quais so os pos
sveis impactos negativos, incluindo impactos devido alterao do
manejo da cultura; e (iii) elaborao da hiptese de risco das vias de
exposio e efeitos adversos, priorizao baseada na probabilidade,
reversibilidade, escala espacial e magnitude.
Essas etapas analisam e sintetizam a informao existente, uti
lizando o conhecimento local. Isso ajuda a identificar e priorizar
falhas de conhecimento chaves na biodiversidade da regio ou pas
de estudo.
4 Etapa Espcies e processos prioritrios podem ser testados para
avaliar o efeito real. importante utilizar mtodos que so relevantes
ao ambiente local (GMOERA, 2008).
As principais preocupaes do efeito de OGMs em espcies noalvo
so referentes s cultivares Bt. A resistncia a insetos, caracterstica
introduzida nas plantas Bt, expressa pelas protenas Cry do Bacillus
thuringiensis (Bt), e tem como alvo lagartas da ordem lepidptera. No
entanto, existem algumas dvidas se o uso indiscriminado e prolon
gado de cultivares Bt poderia afetar direta ou indiretamente esp
cies noalvo, principalmente inimigos naturais das pragas. Porm,
no caso especfico de toxidez de organismos noalvo, necessria a
ingesto da protena expressa pelas plantas Bt, seja pela alimentao
com amostras das plantas Bt, seja pela ingesto de insetosalvo ou
de resduos vegetais (SANVIDO etal., 2006; ANDRADE; FALEIRO,
2009b ).
Segundo Frizza e Oliveira (2006), os potenciais efeitos diretos das
cultivares Bt na dinmica populacional das pragas dependem de diver
sos fatores, como, por exemplo: (i) o nvel de resistncia da planta; (ii)
a especificidade da protena expressa; (iii) em quais tecidos o trans
gene expresso e por quanto tempo; (iv) a presena de outras plan
tas suscetveis prximas e (v) o manejo da cultura. Alm dos efeitos
diretos sobre a biologia e comportamento do inimigo natural devido
expresso de substncias qumicas, existem os efeitos indiretos, ou
seja, efeito da planta sobre o inimigo natural da praga, ou seja, sobre
espcies noalvo (FRIZZAS; OLIVEIRA; 2006).
491
biotecnologia
Resultados de vrios estudos realizados nos ltimos anos no

demonstraram evidncias de efeitos provenientes da toxidez direta
da protena Cry, expressa em plantas Bt sobre os inimigos naturais
noalvo em campos experimentais (SANVIDO etal., 2006). Segundo
os autores, existem mais evidncias de que as plantas Bt so mais
alvo especfico e apresentam menor efeito colateral sobre espcies
noalvo que os inseticidas utilizados atualmente (SANVIDO etal.,
2006). Efeitos indiretos sobre os inimigos naturais (predadores) nos
plantios de milho Bt ocorreram pela diminuio da disponibilidade
dos herbvoros alvos da tecnologia. No entanto, a maioria dos preda
dores naturais se alimenta de vrias espcies, e, no campo, buscam
outras espcies para se alimentarem quando h uma diminuio de
uma espcie particular. Assim, a ocorrncia de efeito indireto no est
somente relacionada ao plantio do OGM, mas a qualquer manejo para
controle da praga, pois todos reduzem a disponibilidade dos inse
tosalvo e consequentemente afetam a populao de inimigos naturais.
O parecer tcnico do CTNBio referente ao Milho Bt (MON810),
com base em estudos realizados no departamento de Entomologia
da Esalq, concluiu que:
1) A protena txica somente para os insetosalvo citados,
especificamente para lepidpteros (lagartas) que possuem,
exclusivamente, em seus intestinos, receptores especficos
para essa protena. Os mamferos no possuem esses recep
tores ou stios de ligao e, portanto, os seres humanos, os
animais e outros organismos noalvo no so afetados
pela protena Bt, incluindo outros artrpodes e tambm
inimigos naturais das pragasalvo...
2) Estudos de campo realizados no Brasil, sobre as popula
es de insetos presentes em plantaes de milho transg
nico derivado da linhagem MON810, mostraram que a
presena de inimigos naturais e de insetos noalvo, nes
tes campos, semelhante. Os ensaios de campo feitos para
a avaliao da dinmica populacional de insetos como
tesourinhas, joaninhas (Coleoptera), sirfdeos (Diptera),
percevejos (Hemiptera) no demonstraram impactos sig
nificativos na entomofauna das regies estudadas.
492
3) O milho MON810 no apresentou efeito sobre a din

mica populacional das espcies predominantes de ara
nhas e insetos benficos de diferentes guildas trficas,
incluindo pragas noalvo e insetos benficos (Carabidae,
Coccinellidae, Chrysopidae, Hemerobiidae, Syrphidae,
Tachinidae e Apidae). A populao de abelhas, A. melli
fera, foi maior nas reas avaliadas. Esse resultado pode
assim ser explicado: (1) a protena Cry1Ab no age no
aparelho digestivo das abelhas por ser especfico somente
para algumas espcies de lepidpteros; (2) as abelhas se
alimentam livremente de plen pelo menor uso de insetici
das nas plantaes de milho MON810 (CTNBIO, 2007).
Em relao ao Algodo WideStrike , que tambm expressa a prote
na Bt, o CTNBio conclui:
1) Numerosos experimentos com protenas Bt demonstram
a ausncia de toxicidade ao homem e aos animais verte
brados, ausncia de efeitos adversos a organismos noalvo
e ao ambiente.
2) Com relao aos artrpodes noalvo, no foram observa
dos efeitos na sobrevivncia mdia de abelhas expostas a 2
mg de plen do evento expressando Cry1F ou 1,98 g/ml
de protena Cry1F em combinao com a protena Cry1Ac.
A CL50 em dieta para larvas de crispa (Chryosperia car
nea) expostas protena Cry1F, pura ou em combinao
com a protena Cry1Ac, foi investigada em uma srie de
estudos com a protena microbiana administrada em uma
dieta de ovos de mariposa.
3) A ausncia de efeitos em testes de ecotoxidez em organis
mos noalvo mostra largas margens de segurana relati
vas s concentraes ambientais de exposio projetadas,
de maneira conservadora e essas observaes so corrobo
radas com monitoramento de campo da abundncia de
espcies.
4) O uso de tecnologia como o algodo Bt resistentes a insetos
pode impactar positivamente a preservao de populaes
de organismos noalvo e insetos benficos, facilitando o
manejo integrado de pragas da lavoura (CTNBio, 2009).
493
biotecnologia
As plantas tolerantes a herbicida so consideradas sem efeito direto

em espcies noalvo, pois a tolerncia a herbicida uma caracters
tica normalmente expressa em plantas e conhecidas por no terem
propriedades txicas. Entretanto, apresentam impactos ambientais
indiretos em virtude de alteraes nas prticas culturais (SANVIDO
etal., 2006). Um estudo da Farm Scale Evaluations (FSE) realizado na
Inglaterra demonstrou que houve uma queda da biomassa de plan
tas daninhas nos campos de beterraba e canola resistentes a herbici
das e, consequentemente, uma diminuio da densidade de insetos
que, por sua vez, afetaram negativamente a populao de pssaros
da regio. As concluses desse estudo consideram que o uso de plan
tas resistentes a herbicida afeta a biodiversidade das regies rurais
(SQUIRE etal., 2003; CHAMPION etal., 2003). No entanto, embora
o manejo de plantas resistentes a herbicidas permita um maior con
trole das plantas daninhas, qualquer sistema de manejo dessas pragas,
quando bem aplicados, tambm ter a mesma consequncia. Assim,
os resultados so devidos a um efetivo sistema de controle das plan
tas daninhas, podendo ocorrer com outros tipos eficientes de manejo
(SANVIDO etal., 2006).
Hawes e colaboradores (2009) realizaram um estudo com 20 esp
cies vegetais, tolerantes a herbicidas e suas cultivares convencionais,
e avaliaram seu efeito em 36 grupos funcionais de invertebrados. Eles
concluram que ocorrem alteraes nos grupos funcionais em funo
da cultura, poca de plantio e do sistema de manejo, e que essas alte
raes afetam a abundncia, a biomassa e a relao entre os diversos
nveis trficos. Por fim, concluram que o tipo de sistema de pro
duo que determina essas alteraes; ademais, propem que um
modelo de estudo poderia ser utilizado para desenvolver padres e
critrios de avaliao dos impactos ambientais da introduo de uma
nova cultivar, transgnica ou no.
Persistncia do gene aps a colheita da cultura

A preocupao de o transgene permanecer intacto aps a colheita
e degradao dos restos culturais existe em razo da possibilidade
de esse transgene ser incorporado por outros organismos, principal
mente microrganismos. Isso conhecido como transferncia hori
494
zontal, ou seja, a transferncia no sexual de material gentico para

organismos da mesma espcie ou espcie diferente. A possibilidade
de transferncia gentica entre espcies um processo conhecido e
possvel, embora raro, com exceo de bactrias e fungos. Esse pro
cesso faz parte da evoluo das espcies, contudo o fenmeno no
ocorre de maneira corriqueira, sendo necessria uma srie de fato
res para que ele acontea. Entre os fatores esto, a permanncia da
viabilidade do DNA intacto no solo em quantidade suficiente para a
transformao dos microrganismos; a presena de bactrias/fungos
competentes para a transferncia e sequncias homlogas entre o
microrganismo e o transgene para a integrao do DNA no genoma;
e uma vantagem seletiva que essa nova sequncia de DNA poderia
conferir ao microrganismo para que seja transmitido para as prxi
mas geraes (AZEVEDO; ARAJO, 2003; CRAIG etal., 2008). Com
isso, Keese (2008) conclui que a transferncia horizontal de um OGM
para outras espcies no motivo de maiores preocupaes, porque
so eventos raros e tem pequena chance de trazer uma caracterstica
vantajosa para o organismo receptor.
Nielsen e colaboradores (2008) determinaram que fragmentos de
DNA persistem no solo aps prolongados perodos de tempo, no
entanto os autores concluem que somente isso no causa impacto no
ambiente, pois so necessrios outros fatores para a transferncia hori
zontal. Assim, eles sugerem estudos aprofundados dos demais eventos
necessrios para a ocorrncia de transferncia horizontal, bem como
o desenvolvimento de mtodos mais adequados para essas avaliaes.
Outros aspectos importantes dos possveis impactos ambientais de
OGMs so discutidos por Andrade e Faleiro (2009b). Um ponto discu
tido pelos autores a reduo do uso de pesticidas em plantios comer
ciais de transgnicos. Segundo Brookes e Barfoot (2005), as lavou
ras OGM contriburam para uma significativa reduo no impacto
ambiental global da produo agrcola.
Biossegurana alimentar de OGMs

O termo Segurana Alimentar (Food Security) surgiu na Europa,
a partir da 1 Guerra Mundial, em razo da necessidade de formao
de estoques estratgicos de alimentos. Na 2 Guerra Mundial, foi agre
495
biotecnologia
gada a noo do direito humano alimentao. Com o tempo, foram

agregadas as preocupaes com a qualidade do alimento, no que se
referia segurana dos aditivos alimentares, dos resduos de agrot
xicos e da irradiao de alimentos. Iniciouse ento um processo de
desenvolvimento e padronizao de mtodos rpidos e eficientes para
deteco e quantificao de agentes biolgicos e qumicos, ou seja, a
inocuidade dos alimentos (Food Safety). Atualmente, a preocupao
se refere tambm segurana dos produtos transgnicos (Biosafety)
(ANDRADE; FALEIRO, 2009c; LAJOLO; NUTTI, 2002).
As avaliaes de produtos geneticamente modificados so reali
zadas por diferentes grupos, publicadas e submetidas anlise dos
pares. O processo bastante similar ao que ocorre com produtos far
macuticos. Isto , assim como ocorre com as fbricas de frmacos
que produzem os dados de segurana do produto e os submetem
s agncias reguladoras para reviso, as empresas que desenvolvem
um OGM devem repassar todos os dados para as agncias que regu
lam a liberao de produtos transgnicos. No caso do Brasil, as agn
cias reguladoras so a CTNBio, e, em algumas situaes, a Anvisa e
o Ibama (LEMAUX, 2008).
Segundo a FAO/WHO (1996), as consideraes em relao segu
rana alimentar de OGMs incluem:
1) As consequncias diretas de alterao nos nveis de expresso
de genes existentes pela introduo do novo gene ou modifi
cao genticas causadas por ele.
2) As consequncias diretas (por exemplo, efeitos antinutricio
nais, txicos ou alergnicos) da presena nos alimentos da pro
tena codificada pelo gene introduzido.
3) As consequncias indiretas dos efeitos de qualquer novo(s)
produto(s), ou nveis alterados de produto(s) j existentes, no
metabolismo do organismo levando presena de novos com
postos ou nveis alterados de compostos j existentes.
4) As consequncias das mutaes causadas no processo de
introduo gentica no organismo, tais como a interrupo de
sequncias codantes ou controle ou ativao de genes latentes,
levando presena de novos componentes ou nveis alterados
de componentes existentes.
496
5) As consequncias da transferncia do gene para a flora gas

trointestinal pela ingesto do alimento geneticamente modifi
cado (AGM) e (ou) alimentos derivados deles.
6) Potencial efeito adverso na sade associado ao microrganismo
geneticamente modificado pelo alimento.
Equivalncia substancial (ES )

O Princpio da Equivalncia Substancial considera que os orga
nismos existentes e seus produtos derivados podem ser utilizados
como parmetro comparativo na avaliao de segurana de OGMs,
uma vez que considerase que esses alimentos so seguros. Isto ,
todo alimento utilizado presumivelmente seguro a no ser que um
perigo significativo tenha sido identificado. Baseado nesse conceito,
avaliamse similaridades e diferenas entre os alimentos transgni
cos em comparao aos seus anlogos considerados saudveis (OECD,
1993; WHO, 2000). O objetivo garantir que os alimentos transgni
cos sejam to seguros quanto os anlogos convencionais (ANDRADE;
FALEIRO, 2009c). Essa comparao se refere equivalncia qualita
tiva e quantitativa de protenas, gorduras, amido, aminocidos, vita
minas, minerais e composio nutricional.
Entretanto, a ES apenas uma anlise preliminar que no garante a
segurana, mas auxilia na identificao de similaridades e diferenas
entre o alimento convencional e o OGM, que posteriormente sub
metido a anlises toxicolgicas adicionais. Essas anlises so impor
tantes porque podem ocorrer efeitos no intencionais que alteram a
composio e o valor nutricional do alimento, tambm podem ocor
rer efeitos antinutricionais ou txicos. Assim, todo alimento transg
nico submetido a um processo de anlise de risco antes de ser libe
rado para o consumo humano ou animal. A liberao de um alimento
geneticamente modificado ocorre caso a caso e para isso o alimento
em questo precisa ser analisado por meio da avaliao preliminar
de perigo, na qual se analisa, alm da Equivalncia Substancial (ES),
o aspecto nutricional e toxicolgico (ANDRADE; FALEIRO, 2009c;
WHO, 2000; WATANABE; NUTTI., 2002).
497
biotecnologia
Consequncias diretas de OGMs na alimentao humana

A Organizao Mundial de Sade (WHOWorld Health
Organization) juntamente com a Food and Agriculture Organization
(FAO) definiram perigo como a presena de um agente nocivo capaz de
causar algum efeito prejudicial; e risco como a probabilidade de ocor
rncia do agente. Com relao a OGMs, podemos considerar que a
introduo de uma sequncia nova no genoma de um organismo pode
causar efeitos intencionais e no intencionais, previsveis ou no, pois
a incorporao do DNA no genoma pode interferir na expresso de
outros genes, podendo alterar o metabolismo da planta. Alm disso,
o produto da expresso do DNA uma protena que pode ter efeito
txico, alergnico, antinutricional ou mesmo alterar o valor nutricio
nal do alimento (ANDRADE; FALEIRO; 2009c).
Considerando que DNA constitudo de nucleotdeos que apre
sentam uma base nitrogenada (adenina, guanina, citosina e timina),
um acar (pentose) e um radical fosfato e que o DNA recombinante
inserido nos alimentos no difere quimicamente do DNA constituinte
dos alimentos que ingerimos diariamente, concluise que a degrada
o do DNA recombinante no difere do DNA normalmente ingerido
atravs dos alimentos no transgnicos. Assim a FAO e Organizao
Mundial de Sade consideram que a simples ingesto do DNA recom
binante no perigosa, pois ingerimos DNA diariamente em nossa
dieta (FAO/WHO, 1996).
Consequncias indiretas de OGMs na alimentao humana

A introduo de um gene no genoma de um organismo pode alte
rar a expresso de genes constitutivos e afetar no intencionalmente a
expresso de algumas caractersticas. O transgene ao integrar dentro
ou em regies adjacentes dos genes de um organismo pode pertur
bar sua expresso, aumentando ou diminuindo a mesma. O seu rear
ranjo tambm pode criar novas sequncias abertas de leitura (Open
reading frames ORFs) alteradas que permitem ao transgene sinte
tizar produtos no intencionais (HALLSBERG, 2005).
Efeitos no intencionais podem ser a elevao dos nveis de consti
tuintes antinutricionais ou txicos em alimentos. Mas tambm podem
498
ser genticos, com usos para o melhoramento ou epigenticos, que

so alteraes induzidas pelo transgene que podem afetar a expresso
de outro gene, sem mudar a sequncia de DNA, e por fim algumas
instabilidades, como o silenciamento de genes. Esses efeitos podem
aumentar a probabilidade de efeitos pleiotrpicos, isto , efeitos de
um mesmo gene em mais de uma caracterstica fenotpica, assim
como de efeitos epistticos, que a interao do gene inserido com
os outros genes (FAO, 2000).
Os efeitos no intencionais podem ser consequncia da posio de
insero do gene de interesse, ou esto associados com a interao
entre os produtos expressos do gene introduzido e as protenas end
genas e metablitos. Mtodos adequados para a avaliao de efeitos
no intencionais precisam ser estudados caso a caso, considerando
fatores txicos e antinutricionais no intencionais, por meio de uma
anlise dos constituintes e de caractersticas GM. No entanto, por
mais rigorosos que sejam os mtodos para validao das variedades
transgnicas, no fcil distinguir alteraes no desejveis no meta
bolismo e a atividade de vrias protenas, pois existe grande variao
no nvel de expresso das protenas em funo da cultivar, ambiente,
poca de colheita e outros. Assim, para essas avaliaes, temse o cui
dado de comparar o transgnico com diversas cultivares da espcie
estudada.
Diversos estudos com animais, tanto com alimentos transgnicos
como com seus produtos, esto demonstrando ausncia de efeitos
no intencionais entre os alimentos transgnicos e sua contraparte
no transgnica. No foi encontrado efeito na composio, digestibi
lidade, sade animal e performance, apoiando a equivalncia subs
tancial desses alimentos (LEMAUX, 2008).
Alergenicidade
A alergia a um alimento uma reao adversa a algum componente
do mesmo que envolve uma resposta anormal do sistema imunol
gico do corpo. O tipo mais comum de alergia a alimentos o mediado
pela produo de anticorpos especficos, as imunoglobulinas E espe
cficas (IgE). Em uma resposta alrgica mediada por IgE, os primei
ros sintomas ocorrem alguns minutos ou horas aps a ingesto do
499
biotecnologia
alimento e exposio do corpo ao agente alergnico. Algumas alergias

comuns mediadas por IgE so as induzidas por plen, esporos, pelos
de animais, picadas de insetos e alguns tipos de alimentos. Existem
tambm respostas alergnicas mediadas por reaes celulares que,
em geral, ocorrem cerca de 8 horas aps a ingesto do alimento, por
exemplo, a alergia ao glten (ANDRADE; FALEIRO, 2009c; FAO/
WHO, 2001).
Um ponto importante que quase todos os alergnicos alimen
tares so protenas, as quais podem estar distribudas em diferen
tes partes da planta e serem influenciadas por fatores ambientais.
No entanto, no existe uma propriedade nica que caracterize um
alergnico potencial, embora a maioria dos alergnicos possua uma
srie de caractersticas comuns. So elas: (1) resistncia a digesto;
(2) resistncia ao processamento; (3) peso molecular de 10 a 70 kDa;
(4) presena no alimento em concentraes acima de 1%; e (5) sequ
ncia de aminocidos com homologia a outros alergnicos conheci
dos (ANDRADE;FALEIRO, 2009c).
Em funo da preocupao referente capacidade de um alimento
transgnico causar uma reao alrgica a um indivduo, o Conselho
Internacional de Biotecnologia de Alimentos e o International Life
Science Institute (ILSI) desenvolveram uma rvore de decises sobre o
potencial alergnico de um OGM, que tem sido adotada pelas empre
sas que desenvolvem OGMs. Os critrios relevantes na utilizao da
arvore de deciso so:
1) Fonte do gene transferido: ateno particular no caso da fonte
do gene conter alergnicos conhecidos.
2) Homologia da sequncia: a sequncia de aminocidos de mui
tas protenas alergnicas facilmente acessada.
3) Imunoreatividade da nova protena: caso a protena seja deri
vada de uma fonte alergnica conhecida ou tenha homologia
de sequncia com algum alergnico, ento a reatividade ao
IgE do soro sanguneo de indivduos alrgicos ao alimento
determinada.
4) Efeito do pH e (ou) digesto: a maioria dos alergnicos resis
tente ao suco gstrico e a proteases digestivas.
500
5) Estabilidade ao processamento ou aquecimento: alergnicos

de alimentos susceptveis ao calor ou processamento so con
siderados menos preocupantes (FAO/WHO 2000).
Transferncia Horizontal no trato gastrointestinal

A Organizao Mundial de Sade em um Workshop sobre Aspectos
relacionados sade dos genes marcadores de plantas geneticamente
modificadas, ocorrido em 1993, concluiu, com base na complexidade
de etapas necessrias para a transferncia horizontal, que no exis
tiam evidncias de transferncia de genes de plantas para microrga
nismos no trato gastrointestinal. Para suceder essa transferncia, seria
necessria a ocorrncia das seguintes etapas:
1) O DNA vegetal teria que ser liberado da clula/tecido vegetal e
no ser degradado (sobreviver) no ambiente gastrointestinal,
exposto ao cido gstrico e s nucleases.
2) O microrganismo receptor teria que estar competente para a
transformao.
3) O microrganismo receptor teria que se ligar ao DNA a ser
transferido.
4) O DNA teria que penetrar a parede celular e translocarse atra
vs da membrana celular do microrganismo.
5) O DNA teria que continuar ntegro ao sistema de restrio/
modificao desenvolvido pelo microrganismo para degradar
o DNA estranho.
6) O DNA teria que ser integrado ao genoma ou plasmdios do
hospedeiro, o que requer a homologia de pelo menos 20 pares
de base em ambas as extremidades do DNA a ser transferido,
possibilitando a recombinao gentica.
Assim, improvvel que o DNA exgeno se integre ao genoma
humano, pois a molcula de DNA desintegrada durante o processo
digestivo e dificilmente ficaria intacta para ser aproveitada pelas clu
las do corpo humano ou animal. Em 1996, um Conselho da FAO/
WHO corroborou essa deciso. No entanto, considerou que, embora a
transferncia do DNA para as bactrias do trato intestinal seja remota,
em caso de genes que poderiam afetar a sade humana ou animal,
como o caso da resistncia a antibiticos, estes no deveriam ser
501
biotecnologia
utilizados em plantas geneticamente modificadas para o uso comer

cial. Estudos recentes comprovaram que a transferncia horizontal de
genes para o trato gastrointestinal ou microrganismos no motivo de
maiores preocupaes (ANDRADE; FALEIRO, 2009c; KEESE, 2008).
Com relao biossegurana alimentar, j foram emitidos alguns
pareceres conclusivos do CTNBio em relao ao milho e algodo Bt
e soja RR.
Milho Bt
Segundo a CTNBio, o milho Bt (MON810) no apresenta risco
sade humana no que se refere composio nutricional:
A introduo do gene cry1Ab no resultou em aparente alte
rao de importncia nutricional, pois os perfis dos principais
nutrientes foram similares queles normalmente observados
em outras variedades ou sob distintas condies de cultivo.
Assim, os resultados sobre composio qumica e centesi
mal do milho MON810 esto de acordo com o Princpio da
Equivalncia Substancial.
Alm disso, um efeito secundrio benfico foi encontrado em rela
o ao milho Bt, pois:
em razo da menor infestao por insetos em relao s
variedades tradicionais de milho, h menor crescimento de
fungos associados, produtores de micotoxinas de importn
cia patolgica para seres humanos e animais e reduzindo, em
consequncia, de forma considervel, a contaminao e a pre
sena dessas toxinas, contribuindo para melhorar a qualidade
e o nvel de segurana alimentar dos gros (CTNBio, 2009).
A sequncia da protena foi comparada com bancos de dados de
protenas com propriedades alergnicas, no tendo sido demonstrada
homologia biologicamente significativa entre a protena Cry1Ab com
pleta e sequncias de protenas com essas propriedades. Em virtude
das caractersticas de digestibilidade da protena Cry1Ab nos fluidos
gstrico e intestinal, a probabilidade de que ela apresente ao aler
gnica extremamente baixa (CTNBio, 2009).
502
Algodo Bt
No parecer conclusivo do CTNBio n 5132005, referente ao Algodo
Bolgard, o relator pondera que:
A exposio de organismos vivos s protenas Cry produzi
das pelo B. thuringiensis um evento que ocorre abundante
mente na natureza e o modo de ao dessa protena j bem
conhecido. A Agncia de Proteo Ambiental dos Estados
Unidos (EPA), em 1998, concluiu a partir do grande volume
de dados de toxicologia submetidos que as subespcies de
B. thuringiensis no so txicas ou patognicas para mamfe
ros, incluindo seres humanos. Recentemente, a Organizao
Mundial da Sade (OMS) revisou os extensos bancos de
dados de segurana e concluiu que o Bt no causa efeitos
adversos na sade humana quando presente na gua pot
vel ou nos alimentos.
Baseado em avaliaes da equivalncia nutricional:
os estudos realizados no mostraram alteraes nos prin
cipais componentes e nos antinutrientes naturais presentes
no algodo. A segurana dos produtos alimentares do algo
do Bollgard evento 531 foi determinada pela equivaln
cia na composio de macro e micronutrientes em estudos
de salubridade com animais e concluiuse que este produto,
como componente de rao animal e as protenas Cry1Ac e
NPTII expressas nos tecidos da planta, mostrouse seguro e
com valor nutritivo equivalente para o consumo humano e
animal. Aps o processamento das fibras e do caroo, as pro
tenas expressas pela planta no so detectadas. Como o leo
e as fibras processadas so os nicos produtos do algodo usa
dos na alimentao humana e como vesturio, respectiva
mente, o consumo das protenas no esperado.
Diante do exposto, a Comisso Tcnica Nacional de
Biossegurana CTNBio aps a anlise de biosse
gurana do algodo Bollgard evento 531, processo
01200.001471/200301, delibera favoravelmente sua libe
rao para plantio comercial e consumo humano e animal.
503
biotecnologia
Soja RR
No Comunicado 54 de 1998, o CTNBio declarou que:
a introduo do transgene no altera as caractersticas da
composio qumica da soja, com exceo da acumulao da
protena transgnica CP4 EPSPS. Esta concluso de equi
valncia de composio qumica baseada em avaliaes
realizadas atravs de metodologia cientfica, publicadas em
revistas cientficas indexadas e de circulao internacional.
A segurana da protena CP4 EPSPS, quanto aos aspectos
de toxicidade e alergenicidade, tambm, foi comprovada.
importante registrar que, aps a utilizao da soja geneti
camente modificada e de seus derivados na Amrica do Sul,
Central e do Norte, na Europa e na sia, no foi verificado
um s caso de desenvolvimento de reaes alrgicas em huma
nos que no fossem previamente alrgicos soja convencional.
Adicionalmente, importante registrar que indivduos sens
veis soja convencional continuaro sensveis soja transg
nica e, portanto, no devero fazer uso deste produto.
A anlise dos resultados descritos na literatura no confirmou
um possvel aumento, na soja geneticamente modificada, da
concentrao de protenas que reagem com uma combina
o de soros de pacientes alrgicos soja convencional. De
fato, os artigos cientficos disponveis e citados sobre a mat
ria mostraram que a expresso do transgene no resultou
no aumento dos nveis de protenas reativas, especialmente
daquelas de peso molecular prximo a 30 kilodltons, a uma
combinao de soro de indivduos sensveis soja comer
cial (BURKS and FUCHS, 1995, Journal of Allergy and
Clinical Immunology, 96: 10081010). Os autores do artigo
cientfico acima mencionado afirmaram que nossos estudos
demonstram que a introduo do gene codificador da prote
na EPSPS, que confere tolerncia a Glifosate, no causou
modificao discernvel, qualitativa ou quantitativamente,
na composio de protenas alergnicas endgenas de soja
em qualquer dos cultivares resistentes a Glifosate analisados.
504
Consideraes finais
A engenharia gentica, o desenvolvimento de OGMs e o cultivo
comercial desses organismos geram preocupaes referentes bios
segurana ambiental e alimentar. Essas preocupaes esto sendo
alvo de trabalhos cientficos que tm subsidiado a tomada de decises
sobre a liberao ou no do cultivo e utilizao comercial dos OGMs,
ponderandose os riscos potenciais com os benefcios e efeitos posi
tivos da tecnologia.
Podese dizer que existem diversos estudos que geraram dados
substanciais a respeito do impacto ambiental de OGMs. Embora exis
tam alguns dados controversos, os resultados obtidos at o momento
no demonstram evidncia cientfica de efeito no ambiente. Do ponto
de vista alimentar, o nvel de segurana de AGMs muito alto, uma
vez que esses alimentos so submetidos a uma bateria de testes rela
cionados caracterizao da protena expressada, testes de digestibi
lidade in vitro, avaliao de toxicidade aguda oral em camundongos,
avaliao de homologia estrutural da protena com toxinas proteicas
conhecidas, avaliao do potencial alergnico e equivalncia nutri
cional. Com base nesses testes, podese dizer que o risco que um ali
mento transgnico oferece pode ser considerado menor que o de outro
tipo de alimento liberado para consumo humano que no passou por
uma bateria de testes to rigorosa.
importante salientar que as anlises caso a caso dos OGMs quanto
biossegurana ambiental e alimentar devem continuar sendo fei
tas com todo critrio tcnico e cientfico. Nesse contexto, as aes de
pesquisa e desenvolvimento assumem importncia estratgica, uma
vez que essas aes tm assumido uma importncia cada vez maior
nas tomadas de deciso sobre todos os assuntos relativos a transgni
cos, principalmente gerando informaes para subsidiar a liberao
comercial ou no dos OGMs.
505
biotecnologia
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510
Captulo17
Captulo
5
Recursos genticos: conservao,

caracterizao e uso
Fbio Gelape Faleiro
Nilton Tadeu Vilela Junqueira
Introduo
Quando pensamos na biotecnologia aplicada, a capacidade de con
servar, caracterizar e utilizar recursos genticos vegetais, animais e
microbianos para avanos tecnolgicos na agropecuria e na inds
tria assume importncia estratgica. Nesse sentido, as atividades rela
cionadas conservao, caracterizao e uso de recursos genticos
esto entre as mais relevantes da pesquisa agropecuria brasileira e
mundial.
A variabilidade gentica a essncia da vida, sendo o fator bsico
para a evoluo das espcies. A existncia da variabilidade gentica
permitiu a obteno, via melhoramento gentico, de variedades e
animais produtivos, resistentes a pragas e doenas e adaptados aos
mais diferentes ambientes. No caso dos vegetais, existem aproxima
damente 250 mil espcies de plantas superiores identificadas e 40%
delas podem ter importncia para a agricultura, considerando as esp
cies cultivadas e espcies relacionadas. Quando pensamos nos recur
sos genticos animais e microbianos, a variabilidade gentica tambm
riqussima, assim como sua utilizao atual e potencial nos mais
variados campos da atividade humana.
Atualmente, existe uma grande preocupao com a significativa
reduo da variabilidade gentica de plantas e animais, a qual repre
senta um srio risco para a sustentabilidade da agropecuria. Essa
perda de variabilidade gentica, tambm chamada eroso gentica,
significa a perda de genes ou combinaes gnicas de plantas ou
animais que possuem valor atual ou potencial para a agropecuria.
Entre as causas da eroso gentica, podese citar a perda do habi
tat dessas plantas e animais (desmatamento, desertificao, expan
so urbana, modernizao da agropecuria), distrbios no habitat
513
biotecnologia
(construo de rodovias e outras aes do homem), desastres naturais

(seca, enchente), substituio de variedades ou animais locais ou tra
dicionais por novas variedades e animais melhorados, mudanas nas
prticas culturais, etc. Embora o fenmeno da eroso gentica possa
ser irreversvel, aes devem ser tomadas para prevenir ou minimi
zar as suas causas. Uma das aes a conservao da variabilidade
gentica via formao de bancos de germoplasma (SILVA etal., 2007;
FALEIRO, 2010a; FALEIRO 2010b).
Paralelamente ao esforo de conservar os recursos genticos, ati
vidades de caracterizao so fundamentais para que a variabilidade
gentica conservada seja utilizada e aproveitada de forma prtica nos
sistemas de produo vegetal e animal. Diferentes grupos de carac
tersticas so utilizados na caracterizao de acessos conservados em
bancos de germoplasma, destacandose as caractersticas ecolgicas,
morfolgicas, agronmicas e moleculares. Essa caracterizao vai
subsidiar a utilizao desses acessos, fornecendo genes de interesse
para programas de melhoramento gentico e ou subsidiando seu uso
per se como alternativas para diversificao dos sistemas de produo
agropecuria e industrial.
Neste captulo, as principais estratgias de conservao, caracteri
zao e uso de recursos genticos so discutidas, bem como a situa
o atual no Brasil e no mundo. Experincias da Embrapa Cerrados
com as espcies nativas do Cerrado e, mais especificamente, com o
maracujazeiro, so apresentadas como estudo de caso.
A preocupao mundial com a conservao

e uso de recursos genticos
A conservao de recursos genticos essencial para o futuro da
sociedade, sendo uma preocupao mundial. Esses recursos so a
base da cadeia alimentar do homem e dos animais domsticos, alm
de atender outras necessidades relacionadas bioenergia, vesturio,
medicamentos e habitao. Considerando as mais variadas atividades
agropecurias, existe uma interdependncia mundial dos recursos
genticos, de modo que a conservao desses recursos em condies
514
Captulo 17 Recursos genticos: conservao, caracterizao e uso
ideais, mantendo sua integridade fsica e gentica, uma obrigao

de todos os pases.
Nos ltimos 15 anos, o desenvolvimento de acordos, convenes
e tratados internacionais tem influenciado de modo marcante a con
servao e uso dos recursos genticos. Merecem destaque a elabora
o de um marco legal internacional, com destaque para a Conveno
sobre Diversidade Biolgica (CDB), e o Tratado Internacional sobre
os Recursos Fitogenticos para Alimentao e Agricultura (TIRFAA).
Internamente, o Brasil editou importantes normas para regular o
tema, dentre elas a Medida Provisria 218616/01 e os Decretos
3.945/01 e 5.459/05.
A CDB um instrumento internacional que tem trs objetivos prin
cipais: (i)a conservao da diversidade biolgica; (ii)o uso sustentvel
de seus componentes; e (iii)a repartio equitativa dos benefcios deri
vados do uso dos recursos genticos. O TIRFAA reconhece os direi
tos soberanos dos Estados sobre seus prprios recursos fitogenticos
para a alimentao e a agricultura, contudo estabelece um sistema
multilateral, almejando que seja eficiente, eficaz e transparente tanto
para facilitar o acesso aos recursos fitogenticos para a alimentao e
a agricultura quanto para repartir, de forma justa e eqitativa, os bene
fcios derivados da utilizao desses recursos, em base complementar
e de fortalecimento mtuo. O marco legal brasileiro envolveu a cria
o de uma autoridade nacional, o Conselho de Gesto do Patrimnio
Gentico (CGEN), responsvel pelas autorizaes de acesso a recur
sos genticos e ao conhecimento tradicional associado e pela coorde
nao da implementao de polticas para a gesto destes recursos.
A partir da vigncia desses acordos, tratados e marcos legais, a pes
quisa brasileira relacionada conservao, caracterizao e uso de
recursos genticos que utiliza biodiversidade nativa e ou conhecimen
tos tradicionais associados est sendo induzida a profundas modifi
caes. Tanto as pesquisas que envolvem acesso a recursos genticos,
quanto aquelas que remetem material para o exterior com esta finali
dade, necessitam de uma autorizao governamental, a ser concedida
por uma autoridade nacional. Tambm o acesso ao conhecimento tra
dicional associado, bem como a sua disponibilizao, so regulados,
envolvendo a necessidade de anuncia prvia por parte dos detento
515
biotecnologia
res e autorizao governamental. Embora o princpio envolvido nos

acordos e tratados seja nobre, existe uma grande preocupao com a
excessiva burocratizao de todas atividades de acesso, conservao
e uso de recursos genticos, principalmente quando isso envolve as
estratgicas e essenciais atividades de pesquisa cientfica e tecnol
gica. Segundo Silva e Viccini (2009) preciso tomar cuidado para que
a produo cientfica no seja desestimulada face s exigncias da lei.
Alm das legislaes muito restritivas ou burocrticas para o acesso
a recursos genticos, outras preocupaes cientficas mundiais esto
relacionadas manuteno e situao atual dos bancos de germo
plasma como a existncia de colees inapropriadas (muito grandes e
pouco representativas da variabilidade gentica), problemas de dupli
cao (estimada em 33%), baixa qualidade das sementes conservadas
(baixo vigor, baixa germinao e presena de pragas e doenas), baixo
estoque de sementes por acesso, existncia de processos inadequados
de regenerao e multiplicao, problemas de infraestrutura (equipa
mentos falhos e ausncia de manuteno), falta de dados de caracte
rizao, falta de base de dados e documentao dos acessos, recursos
financeiros escassos, descontinuidade de polticas pblicas e institu
cionais relacionadas a recursos genticos e falta de viso estratgica
da importncia dos recursos genticos para o futuro da agricultura e
da sociedade.
Estratgias para a conservao

de recursos genticos
Os recursos genticos so conservados nos chamados bancos de
germoplasma, os quais so unidades conservadoras de material gen
tico de uso imediato ou com potencial de uso futuro. Nos bancos de
germoplasma, so conservadas as chamadas colees base e as cole
es ativas. As primeiras so colees abrangentes de acessos con
servadas a longo prazo. A coleo base ideal deve conter amostras
representativas dos estoques domesticados da cultura e suas formas
parentais silvestres. A coleo base vista como uma estratgia de
segurana, abrigando em seu acervo a coleo ativa duplicada, e com
seus materiais no sendo utilizados para intercmbio. As colees
516
base existentes so todas compostas de sementes ortodoxas, ou seja,

sementes que no perdem sua viabilidade quando conservadas em
baixa umidade (4% a 6%) e baixas temperaturas (15C a 18C). As
colees ativas so aquelas conservadas no curto e mdio prazos, roti
neiramente usadas para propsitos de pesquisa, caracterizao, avalia
o e utilizao de materiais. A coleo ativa multiplicada de acordo
com a demanda e regenerada periodicamente. Normalmente possui
menor tamanho que a coleo base. A coleo ativa, geralmente, fun
ciona em dois ciclos: plantas vivas crescendo no campo e sementes
armazenadas para regenerao ou multiplicao de materiais. A cole
o ativa normalmente corresponde a um subconjunto da coleo base
localizado prximo ao pesquisador.
Existem, basicamente, trs estratgias de conservao de germo
plasma: in situ, ex situ e on farm. Na conservao in situ, as plantas e
animais so conservados em suas comunidades naturais. Para reali
zar esse tipo de conservao, existem as chamadas unidades opera
cionais, destacandose parques nacionais, reservas biolgicas, reser
vas genticas, estaes ecolgicas, santurios de vida silvestre etc. Na
conservao ex situ, a variao gentica das espcies conservada fora
de suas comunidades naturais. Desdobrase em vrias modalidades,
entre as quais conservao in vitro, em colees a campo, em cmaras
frias, em nitrognio lquido etc. J a conservao on farm uma estra
tgia complementar conservao in situ, sendo uma das formas para
a conservao da agrobiodiversidade. Apresenta como particularidade
o fato de envolver recursos genticos cultivados pelas comunidades
locais e populaes indgenas, detentoras de grande diversidade de
recursos genticos e de um amplo conhecimento sobre eles. A con
servao on farm envolve, portanto, recursos nativos e exticos adap
tados s condies locais, que esto em contnuo processo de seleo
e de melhoramento pelas comunidades locais e populaes indgenas.
Conservao in situ
Com aproximadamente 50 mil espcies de plantas superiores (18%
do total mundial), o Brasil possui uma das mais diversas floras do
mundo (NASS etal., 2009). Na tentativa de conservar parte dessas
espcies em seu habitat, tm sido criadas e estabelecidas reas de pro
517
biotecnologia
teo, chamadas Unidades de Conservao (UC). A UC o nome dado

pela legislao brasileira s reas protegidas, fazendo parte do sistema
brasileiro de proteo ao meio ambiente, e so controladas pelo rgo
federal Instituto Chico Mendes de Conservao da Biodiversidade
(ICMBio), compondo o Sistema Nacional de Unidades de Conservao
da Natureza (SNUC). As unidades de conservao integrantes divi
demse em dois grupos: (i)Unidades de Proteo Integral (UPI), cujo
objetivo preservar a natureza, onde a interferncia humana limi
tada, sendo admitido apenas o uso indireto dos seus recursos natu
rais, com exceo dos casos previstos na Lei. (ii)Unidades de Uso
Sustentvel (UUS), cujo objetivo bsico compatibilizar a conserva
o da natureza com o uso sustentvel de parcela dos seus recursos
naturais, de modo que diferentes graus de interferncia humana so
permitidos (FREITAS etal., 2009).
O grupo das Unidades de Proteo Integral composto pelas
seguintes categorias de unidades de conservao: (i)Estao Ecolgica;
(ii)Reserva Biolgica; (iii)Parque Nacional; (iv)Monumento Natural;
(v)Refgio da Vida Silvestre. Por sua vez, o grupo das Unidades de Uso
Sustentvel composto por: (i)rea de Proteo Ambiental; (ii)rea
de Relevante Interesse Ecolgico; (iii)Floresta Nacional; (iv)Reserva
Extrativista; (v)Reserva de Fauna; (vi)Reserva de Desenvolvimento
Sustentvel; e (vii)Reserva Particular do Patrimnio Natural.
O Brasil possui um total de 1.343 reas protegidas ou Unidades
de Conservao, das quais, 292 so federais, 308 so estaduais e
743 so particulares. As reas particulares so designadas Reservas
Particulares do Patrimnio Natural (RPPN), sendo sua criao um
ato voluntrio do proprietrio de uma rea, que decide transformar
toda ou parte desta em uma RPPN, sem que isso ocasione a perda do
direito de propriedade. Esse tipo de reserva tem o objetivo de promo
ver a educao ambiental. Em termos de rea, as unidades federais
cobrem, aproximadamente, 8,2% do territrio nacional (3,9% com
UPI e 4,3% com UUS); as unidades estaduais cobrem 3,5% (1,0%
com UPI e 2,5% com UUS) e as unidades particulares (RPPN) 0,06%.
Dessa forma, aproximadamente, 11,7% do territrio brasileiro ou
100 milhes de hectares so dedicados a Unidades de Conservao
(FREITAS etal., 2009). O Bioma Amaznia o que apresenta maior
518
porcentagem de reas protegidas (~ 10%), seguida da Mata Atlntica

(~2%), e os demais biomas apresentam menos de 1% de reas prote
gidas (Figura1).
Figura1. Porcentagem do territrio dos biomas brasileiros sob proteo em

Unidades de Conservao .
Quando pensamos em reas para conservao da biodiversi

dade, devemos considerar, tambm, as reas de povos indgenas.
Atualmente existem 611 reservas de povos indgenas, cobrindo uma
rea total de, aproximadamente, 106 milhes de hectares o que cor
responde a 12,4% do territrio nacional. Segundo Freitas etal. (2009),
as reas de povos indgenas apresentam grande importncia para a
conservao in situ, porque, nestas terras, a populao indgena pre
serva suas tradies, incluindo o cultivo de vrios recursos genticos
vegetais e, alm disso, essas terras servem como unidades de manejo
in situ, onde recursos naturais tendem a ser manejados de forma mais
sustentvel.
A conservao in situ apresenta algumas vantagens, tais como:
(i)permitir que as espcies continuem seus processos evolutivos;
519
biotecnologia
(ii)favorecer a proteo e a manuteno da vida silvestre; (iii)apre

sentar melhores condies para a conservao de espcies silvestres,
especialmente vegetais e animais; (iv)oferecer maior segurana na
conservao de espcies com sementes recalcitrantes; e (v)conser
var os polinizadores e dispersores de sementes das espcies vegetais.
Devese considerar, entretanto, que esse mtodo oneroso, pois, por
ser dependente de eficiente e constante manejo e monitoramento,
pode exigir grandes reas, o que nem sempre possvel; alm disso,
a conservao de uma espcie em um ou poucos locais de ocorrncia
no significa, necessariamente, a conservao de toda a sua variabili
dade gentica (BRASIL, 2010).
Conservao ex situ
A conservao ex situ envolve a manuteno, fora do habitat, de
uma representatividade da biodiversidade, de importncia cientfica
ou econmicosocial, inclusive para o desenvolvimento de programas
de pesquisa e desenvolvimento, particularmente aqueles relaciona
dos ao melhoramento gentico. A conservao ex situ considerada
complementar conservao in situ, servindo tanto para conserva
o de espcies silvestres como para espcies cultivadas. Os princi
pais objetivos da conservao ex situ so: (i)permitir que, em apenas
um local, sejam reunidos recursos genticos de muitas procedncias,
facilitando as aes de pesquisa e desenvolvimento, especialmente o
trabalho do melhoramento gentico; (ii)assegurar a conservao e a
disponibilidade contnua e imediata de recursos genticos; (iii)pre
servar espcies que ocorrem em habitat ameaado; (iv)diminuir a
eroso gentica das espcies; (v)garantir melhor proteo diversi
dade intraespecfica, especialmente de espcies de ampla distribuio
geogrfica; (vi)conservar, no curto, mdio e longo prazos, recursos
gentico com importncia atual ou potencial, garantindo a sustenta
bilidade dos trabalhos de melhoramento gentico e, em consequn
cia, o futuro da sociedade.
Existem diferentes estratgias ou metodologias utilizadas para a
conservao ex situ, podendose citar: (i)conservao de sementes,
no longo prazo, em cmaras frias a 20C; (ii)conservao de semen
tes, no curto e mdio prazos, em cmaras frias a 5C; (iii)conser
520
vao in vitro, via cultura de tecidos; (iv)criopreservao (150C a

196C); (v)conservao a campo; (vi)conservao em laboratrios,
principalmente no caso de microorganismos; (vii)jardins botnicos;
(viii)ncleos de conservao, para o caso de espcies animais. Na
Figura2, ilustramse esses principais mtodos de conservao.
Figura2. Principais mtodos de conservao ex situ: (A) cmaras frias; (B)

conservao in vitro; (C) criopreservao; (D) conservao a campo; (E) con
servao em laboratrios; e (F) jardins botnicos.
Por um lado a conservao ex situ apresenta algumas vantagens:

(i)mantm os recursos genticos em um espao pequeno sob cuidado
intensivo; (ii)facilita a caracterizao e utilizao dos recursos gen
ticos em aes de pesquisa e desenvolvimento; (iii)garante a sobre
vivncia e a segurana dos recursos genticos por longos perodos;
(iv)garante a sobrevivncia e a segurana dos recursos genticos em
ambientes mais protegidos no sujeitos a ao antrpica e condies
adversas do meio ambiente; (v)disponibiliza a diversidade mxima
do germoplasma de espcies de importncia atual e potencial; (vi)em
alguns mtodos de conservao, mantm material indexado e livre de
patgenos, dispensando a quarentena na sua entrada ou sada do pas
ou da regio (ROSA, 2004; NASS etal.; 2001).
Por outro lado , dependendo da estratgia ou metodologia, a con
servao ex situ apresenta algumas desvantagens: (i)interrupo da
evoluo quando usadas tcnicas que reduzem drasticamente as ativi
dades vitais do germoplasma por longos perodos; (ii)risco de instabi
lidade gentica nas colees de sementes ortodoxas e in vitro; (iii)alto
custo de algumas tcnicas, como a regenerao no campo de colees
de sementes ortodoxas ou aquelas que requerem modeobra espe
cializada; (iv)alto consumo de eletricidade e equipamentos sofistica
dos ou o uso de grandes reas de campo de boa fertilidade por lon
gos perodos; (v)risco de perda de variabilidade gentica dos acessos
521
biotecnologia
conservados em virtude da deriva gentica (perda aleatria de genes

devido amostragem ou multiplicao de amostras muito peque
nas) ou presso de seleo (material geralmente multiplicado em
reas com condies edafoclimticas distintas do seu local de coleta)
(ROSA, 2004; NASS etal., 2001).
Praticamente, todas as espcies podem ser conservadas ex situ,
desde que seja possvel multipliclas, posteriormente. Geralmente,
so conservadas ex situ: espcies de plantas cultivadas e seus paren
tes silvestres; espcies que representam amplo e variado espectro de
genes que podem ser teis em programas de melhoramento ou outras
atividades tecnolgicas importantes para o homem, como as espcies
teis na alimentao e agricultura, incluindo variedades locais de cul
tura tradicional e variedades, cultivares, linhagens e materiais sint
ticos obtidos por programas de melhoramento gentico ou pela bio
tecnologia e engenharia gentica.
Entre os mtodos de conservao ex situ, o armazenamento de
sementes em cmaras frias merece um destaque especial, conside
rando a possibilidade de conservao de grande nmero de acessos
em um pequeno espao por um perodo de tempo praticamente ili
mitado. Para a conservao de sementes em longo prazo, necess
rio manter a atividade respiratria em nveis baixos, atravs da redu
o da temperatura ambiente e do grau de umidade das sementes.
As sementes so acondicionadas em embalagens hermticas e arma
zenadas em cmaras frias a 20C (conservao a longo prazo) ou a
+5C (conservao no curto e mdio prazos). Somente as sementes
ortodoxas (por suportarem reduo da umidade a 4% e 6% e exposi
o prolongada a temperatura subzero, 10C a 20C) podem ser con
servadas no longo prazo. No caso de espcies que possuem sementes
recalcitrantes ou intermedirias, outras estratgias, como a conser
vao a campo, devem ser utilizadas. Alm do caso das espcies com
sementes recalcitrantes e intermedirias, a conservao em campo
tambm indicada para a conservao de espcies de propagao vege
tativa, arbreas, silvestres, semidomesticadas, heterozigotas, alm
daquelas que produzem quantidades reduzidas de sementes como
as forrageiras (ROSA, 2004).
522
Segundo Silva etal. (2007), medidas efetivas visando conserva

o ex situ de recursos genticos iniciaram h aproximadamente 40
anos, quando a Organizao das Naes Unidas para a Agricultura e
Alimentao (FAO) reconheceu que a variabilidade de muitas esp
cies, especialmente cereais, estavam sob risco de perda. Estimativas
da FAO indicam que aproximadamente 6 milhes de acessos de
germoplasma so conservados em todo mundo e apenas 14% des
ses acessos so conservados no longo prazo. Os Estados Unidos e
a China so os pases que detm o maior nmero de acessos con
servados no longo prazo, com aproximadamente 450 mil e 300 mil,
respectivamente (WETZEL, 2006). Esses pases tambm apresen
tam a maior capacidade para armazenamento de sementes no longo
prazo, sendo 2 milhes e 1 milho, respectivamente (SILVA etal.,
2007). Recentemente, essa capacidade mundial de armazenamento de
sementes no longo prazo aumentou consideravelmente com a cons
truo do Banco Global de Sementes de Svalbard com capacidade para
quatro milhes e quinhentas mil amostras de sementes. O conjunto
arquitetnico conta com trs cmaras de segurana mxima situadas
ao final de um tnel de 125 metros dentro de uma montanha em uma
pequena ilha norueguesa do arquiplago de Svalbard, prximo ao Plo
Norte (Figura3). Essa localizao estratgica assegura as baixas tem
peraturas, mesmo se houver falha no suprimento de energia eltrica.
Figura3. Banco Global de Sementes de Svalbard.

Fotos: Global Crop Diversity Trust.
No Brasil, a criao da Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia

e a consolidao do Sistema Nacional de Pesquisa Agropecuria
(SNPA) nos anos 1970 (CABRAL, 2005) foi importante para organi
523
biotecnologia
zar os esforos voltados para a conservao, caracterizao e uso de

recursos genticos (GOEDERT, 2007). O SNPA formado em parte
pela Embrapa, com suas mais de 40 unidades de pesquisa, alm de
instituies federais e estaduais de pesquisa agrcola, universidades
e empresas pblicas ou privadas, direta ou indiretamente vinculadas
pesquisa agrcola. A maioria das iniciativas para a conservao de
recursos genticos vegetais, animais e de microorganismos no Brasil
foram integradas recentemente Plataforma Nacional de Recursos
Genticos, liderada pela Embrapa com a participao da grande maio
ria das outras instituies do SNPA localizadas em vrios estados
brasileiros (Figura4). Com a participao de todas essas instituies,
383 Bancos Ativos de Germoplasma Vegetal so mantidos no Brasil,
sendo 140 nas unidades da Embrapa e 243 em outras instituies do
SNPA (VALLS etal., 2009). De todos os bancos, 52% conservam ape
nas espcies exticas, mostrando a importncia dessas espcies para
a alimentao e agricultura no Brasil. Valls etal. (2009) realizaram
um levantamento de todas as espcies e seus respectivos nmeros
de acessos conservados no Brasil no longo prazo (coleo base) e no
mdio e curto prazos (bancos ativos). Com base nesse levantamento,
aproximadamente 170 mil acessos vegetais, incluindo duplicatas, so
conservados no Brasil, dos quais 107 mil so conservados no longo
prazo (VALLS etal., 2009).
A Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia possui a infraes
trutura responsvel pela conservao no longo prazo de sementes
de espcies de interesse agronmico, incluindo espcies cultivadas
e seus parentes silvestres. Essa coleo de base composta atual
mente por 212 gneros de 661 espcies diferentes, com um total de
107.249 acessos, sendo, dessa forma, o 6 maior banco de germo
plasma conservado em longo prazo do mundo. As culturas com maior
nmero de acessos conservados em longo prazo so a cevada (29.227),
feijo (14.069), arroz (9.989) e soja (9.177). Todo o acervo das cole
es exsitu gerenciado pelo Sistema Brasileiro de Informao de
Recursos Genticos (Sibrargen), que integra, compatibiliza, organiza
e disponibiliza dados e conhecimentos sobre recursos genticos estra
tgicos para o sistema de inovao agropecuria no pas (CAJUEIRO
etal., 2000).
524
Boa Vista
Macap
Soure
Belm
Manaus
Rio Preto da Eva
Sobral
Pacajus
Teresina
Pedro Avelino
Campina Grande
So Joo do Piau
Joo Pessoa
Petrolina
Cruz das Almas
Porto Velho
Aracaju
Conceio do Almeida
Braslia
Goinia
Sete Lagoas
Corumb
Campo Grande
Juiz de Fora
Campinas
animal
Londrina
vegetal
Curitiba
microrganismo
Passo Fundo
Bag
Vitria
Niteri
Itaguai
Florianpolis
Bento Gonalves
Porto Alegre
Pelotas
Figura4. Plataforma Nacional de Recursos Genticos no Brasil.

Fonte: Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia.
Conservao on farm
A conservao on farm uma estratgia semelhante conservao
in situ, uma vez que tambm permite que as espcies continuem o
seu processo evolutivo, sendo permanentemente submetidas a dife
rentes condies edafoclimticas. A conservao on farm uma das
formas para a conservao da agrobiodiversidade, que um termo
usado para referir diversidade de seres vivos, de ambiente terres
tres ou aquticos, cultivados em diferentes estgios de domesticao.
Apresenta como particularidade o fato de envolver recursos genti
cos, principalmente variedades crioulas, cultivados por agricultores
(pequenos agricultores de comunidades locais, tradicionais e popu
laes indgenas) detentores de grande diversidade de recursos gen
ticos e de um amplo conhecimento sobre eles.
525
biotecnologia
A conservao on farm envolve, portanto, recursos nativos e exti

cos adaptados s condies locais, que esto em contnuo processo
de seleo e de melhoramento gentico realizado pelos agricultores.
Esses recursos genticos so de grande importncia para a segurana
alimentar desses agricultores. Entre os principais recursos genti
cos mantidos a campo pelos pequenos agricultores brasileiros esto
a mandioca, o milho, o feijo, alm de uma srie de fruteiras nativas,
plantas medicinais e aromticas e raas locais de animais domestica
dos (sunos, caprinos e aves, entre outros). Na conservao on farm, a
estratgia consiste em monitorar e proteger diferentes acessos e dife
rentes espcies cultivadas em um agroecossistema (FALEIRO, 2010b),
podendo ser agrcola, hortcula, florestal, pastoril ou associaes entre
eles, como no sistema agrosilvopastoril. Acreditase que, ainda hoje, a
maioria dos recursos genticos nativos do Brasil conservada on farm,
ou seja, esto nas propriedades dos agricultores e no nos bancos de
germoplasma (CLEMENT etal., 2007).
Assim como a conservao in situ e ex situ, a conservao on farm
tambm apresenta vantagens e desvantagens (BRUSH, 2000; JARVIS
etal., 2000; CLEMENT etal., 2007). A principal vantagem est rela
cionada ao envolvimento dos agricultores no processo de conservao
de recursos genticos. Esse envolvimento vai gerar um comprome
timento e interesse dos agricultores, incluindo os jovens que, desde
cedo, passaro a se sentir responsveis pela conservao (CARVALHO
etal., 2001). Esse envolvimento e ao dos agricultores faro com que
a coleo on farm seja constantemente enriquecida com novos recur
sos genticos via a evoluo em seu meio natural e a domesticao em
seu meio social (CLEMENT etal., 2007). Outra vantagem dessa estra
tgia de conservao permitir que os recursos genticos conservados
na propriedade rural constituam uma fonte de renda e melhore a qua
lidade de vida do agricultor com a diversificao da produo e de sua
base alimentar. Esses recursos genticos estaro, assim, sendo con
servados com maior interesse e segurana ao longo do tempo, dimi
nuindo a dependncia de recursos financeiros limitados e inseguros
que, h muito tempo, esto ameaando todas iniciativas e esforos
relacionados conservao ex situ. Como principal desvantagem da
conservao on farm, podemos citar a sua natureza complexa e din
526
mica, o que faz com que sejam altos os riscos de eroso gentica e
perda de acessos (LOUETTE, 2001). A falta de controle sobre os recur
sos genticos relacionada ao dos agricultores e condies adversas
do meio ambiente tambm um alto risco manuteno da variabili
dade gentica das colees. Essas desvantagens fazem com que a con
servao on farm seja uma estratgia para complementar e no subs
tituir a conservao in situ e ex situ.
Algumas aes de instituies governamentais e sociais podem ser
implementadas para promover a conservao on farm. Freitas etal.
(2009) relatam algumas dessas aes implementadas no Brasil nos
ltimos anos: (i)melhoramento participativo uma metodologia
que preconiza a participao efetiva dos agricultores, extensionistas
e pesquisadores na seleo de variedades melhoradas para determi
nada regio (VIEIRA etal., 2008); nesse mtodo, vrios acessos desen
volvidos pela pesquisa e cultivados localmente pelos agricultores so
testados e conservados na propriedade; (ii)feira de sementes so
eventos onde pequenos agricultores de comunidades locais, tradi
cionais e populaes indgenas apresentam experincias com dife
rentes recursos genticos e trocam sementes e material propagativo;
(iii)Centros Irradiadores de Manejo da Agrobiodiversidade so ins
tituies implantadas em vrios estados do Brasil por iniciativa do
governo federal, em parceria com movimentos sociais e organizaes
nogovernamentais. Esses centros possuem como linhas temticas
a produo de sementes crioulas pelas prprias comunidades, o uso
de plantas medicinais e aromticas, a implantao de sistemas agro
florestais e agroextrativistas e o manejo animal alternativo, visando
proporcionar a segurana alimentar, a gerao de renda e a conserva
o da agrobiodiversidade; (iv)reconhecimento oficial de populaes
tradicionais esse reconhecimento oficial tem como objetivo pro
mover o desenvolvimento sustentvel dos povos e comunidades tra
dicionais com nfase no reconhecimento, fortalecimento e garantia
dos seus direitos territoriais, sociais, ambientais, econmicos e cul
turais. Entre outras expectativas, esperase, com tal reconhecimento,
aumentar a demanda pela conservao de recursos genticos de cul
tivo local com vistas produo sustentvel.
527
biotecnologia
Caracterizao de recursos genticos

Para que a variabilidade gentica de recursos genticos de esp
cies cultivadas e silvestres conservada nos bancos de germoplasma
seja utilizada e aproveitada de forma prtica, atividades de caracte
rizao e avaliao so essenciais, sendo uma importante demanda
para a pesquisa cientfica. A falta de dados de caracterizao e avalia
o dos recursos genticos conservados em bancos de germoplasma
uma das principais causas do baixo uso desses materiais genticos
(SLOTEN, 1987; VALLS, 2007). Estimativas de Holden (1984) mos
traram que 65% dos acessos no apresentavam dados de passaporte,
80% no apresentavam caracterizao morfolgica e 95% no apre
sentavam avaliao agronmica. Segundo Valls (2007), a falta de dados
pode ser contornada pela organizao da informao j disponvel,
pela tomada disciplinada de observaes de maior interesse dos usu
rios e pela divulgao adequada dessa informao.
Diferentes grupos de caractersticas so utilizados na caracteriza
o e avaliao de recursos genticos, destacandose as caractersticas
ecolgicas, morfolgicas, agronmicas e moleculares.
As caractersticas ecolgicas referemse quelas obtidas com base
no local de coleta de determinado acesso. Dados de passaporte podem
conter importantes caractersticas ecolgicas de cada material gen
tico. O conhecimento das condies ecogeogrficas dos locais de
coleta do germoplasma fornece um indicativo do processo de adapta
o a que o acesso foi submetido, e do seu possvel comportamento
agronmico e biolgico (HAWTIN etal. 1996). A idia de se utilizar
esse tipo de informao relativamente nova e os descritores obti
dos por essa via tem sido denominados, genericamente, de descrito
res ecolgicos (STEINER; GREENE, 1996). Com base no Sistema de
Informao Geogrfica, quando as coordenadas do local de coleta so
disponveis, possvel inferir sobre as informaes ecogeogrficas dos
acessos, pela possibilidade de associar os locais de coleta com dados de
clima, vegetao, solo, pluviometria local, entre outros dados geogr
ficos disponveis em forma de mapas que podem ser sobrepostos aos
locais de coleta (COSTA etal., 2005). Na Figura5, ilustrase o procedi
mento de obteno de descritores ecolgicos com base na sobreposi
o de mapas de informaes geogrficas ao ponto de coleta do acesso.
528
Figura5. Exemplos de mapas do Sistema de Informao Geogrfica do Brasil

utilizados para obteno de descritores ecolgicos baseados no ponto de
coleta: (A) tipos de vegetao; (B) solos; (C) bacias hidrogrficas; e (D) plu
viometria.
As caractersticas morfolgicas so aquelas relacionadas aos carac

teres botnicos de alta herdabilidade, facilmente visveis ou mensu
rveis e que se expressam consistentemente em todos os ambien
tes (WILLIAMS, 1984). Existe uma grande variabilidade morfolgica
entre as espcies e entre acessos da mesma espcie, considerando
o porte da planta e as caractersticas das razes, folhas, flores e fru
tos. Muitas vezes, caractersticas morfolgicas podem subsidiar o uso
prtico de determinado acesso ou espcie. Por exemplo, a beleza e a
natureza extica de uma flor pode dar uma boa ideia do seu poten
cial ornamental, a colorao mais intensa da polpa do fruto pode dar
529
biotecnologia
uma ideia do potencial funcional daquele material gentico e a forma

e tamanho do fruto pode dar uma ideia do seu potencial agronmico
para consumo in natura. Na Figura6, ilustrase uma pequena parte
da variabilidade gentica do gnero Passiflora, com base na morfolo
gia das flores e dos frutos.
Figura6. Exemplos de caractersticas morfolgicas de flores e frutos do

gnero Passiflora.
As caractersticas agronmicas compreendem aquelas que forne

cem informaes sobre o desempenho agronmico de uma espcie
ou de um acesso. Por exemplo, um acesso pode possuir maior desem
penho agronmico que outro porque mais resistente a vrias doen
as ou a vrias raas do patgeno causador daquela doena. Alm da
resistncia a doenas, outras caractersticas agronmicas apresentam
grande importncia como as relacionadas ao vigor vegetativo, produti
vidade, pocas de florescimento e sensibilidade ao fotoperodo, adap
tabilidade a diferentes ecossistemas, tamanho do fruto, rendimento
e caractersticas qumicas da polpa, resistncia e tolerncia a inse
tospraga, entre outras. Geralmente, as caractersticas agronmicas
so quantitativas, governadas por um conjunto de genes e fortemente
530
influenciadas pelas condies ambientais. Nesse sentido, a monta

gem de experimentos com repeties, em diferentes ambientes, uti
lizando delineamentos para o controle ambiental, de grande impor
tncia no processo de caracterizao e avaliao do recurso gentico.
Muitas vezes, a importncia prtica dos recursos genticos depende
de uma adequada caracterizao e avaliao das caractersticas agro
nmicas. Na Figura7, ilustramse algumas caractersticas agronmi
cas de acessos de maracujazeiro.
Figura7. Avaliao de caractersticas agronmicas do maracujazeiro.
As caractersticas moleculares pertencem a um grupo de carac

tersticas que teve um grande desenvolvimento nos ltimos anos.
Tecnologias modernas de anlise molecular permitem a gerao de
marcadores genticomoleculares diretamente no DNA. Entre as van
tagens dos marcadores moleculares, podese citar a obteno de um
nmero praticamente ilimitado de polimorfismos genticos, a iden
tificao direta do gentipo sem influncia do ambiente, a possibili
dade de deteco em qualquer estdio do desenvolvimento da planta
ou a partir de cultura de clulas ou tecidos e a possibilidade de gerar
531
biotecnologia
maior quantidade de informao gentica por loco no caso de marca

dores codominantes. Com base nas caractersticas moleculares gera
das pelos polimorfismos do DNA dos diferentes acessos ou espcies
do banco de germoplasma, vrias informaes podem ser obtidas
(FALEIRO, 2007). Na Figura8, ilustramse alguns marcadores molecu
lares e informaes geradas com base em caractersticas moleculares.
Figura8. Obteno de polimorfismos e informaes baseadas em marcado

res moleculares do DNA.
Alm dos marcadores moleculares do DNA, tambm podem ser

includas no grupo das caractersticas moleculares, aquelas obtidas
com base na caracterizao citogentica como as anlises de cari
tipo, bandeamento cromossmico e hibridizao in situ (PEALOZA;
POZZOBON, 2007) e aquelas obtidas com base na caracterizao qu
mica e bioqumica como compostos fenlicos, terpenoides, alcaloi
des, entre outros metablitos secundrios e substncias bioativas com
potencial econmico (VIEIRA; AGOSTINICOSTA, 2007).
532
Os diferentes grupos e as diferentes caractersticas so utiliza

dos nas diferentes etapas do processo de caracterizao e avaliao.
Segundo Valls (2007), esse processo passa por cinco etapas subse
quentes, correlatas e complementares:
a) Identificao botnica: dependendo da espcie, essa etapa
mais difcil do que geralmente considerada, uma vez que
a taxonomia das plantas , muitas vezes, confusa e exige alta
especializao, principalmente quando o germoplasma inclui
vrias espcies silvestres com diferentes taxa e variedades bot
nicas (VALLS, 2007).
b) Elaborao do cadastro de acessos disponveis: nessa etapa,
so obtidos os chamados descritores de passaporte para cada
acesso, os quais so baseados nas informaes de origem
(nome, procedncia, cdigos etc.) e local de coleta (coletor,
coordenadas geogrficas, caractersticas ecolgicas etc.).
c) Caracterizao: consiste na obteno das caractersticas mor
folgicas ou da lista de descritores. Existe, na literatura mun
dial, um grande nmero de listas e de descritores para as mais
diferentes espcies. A eficincia dessas listas na diferencia
o dos acessos e sua importncia na atribuio de valor pr
tico ao germoplasma tm sido discutida (ONYILAGHA, 1986;
FRANKEL; BROWN, 1984; VALLS, 2007).
d) Avaliao preliminar: nessa etapa, iniciase a obteno de carac
tersticas agronmicas, principalmente aquelas que podem ser
obtidas para maior nmero de acessos em determinada condi
o ambiental. A caracterizao reprodutiva da espcie (ocor
rncia de autogamia, alogamia, cleistogamia, apomixia etc.)
um exemplo. A caracterizao da fenologia ou das fenofases
da espcie (perodo de germinao, brotao, florescimento,
desfolhao, maturao etc.) tambm pode ser iniciada nessa
etapa e finalizada na etapa seguinte.
e) Avaliao aprofundada ou complementar: nessa etapa, so obti
das as demais caractersticas agronmicas ou no, relacionadas
a caractersticas adaptativas e de desempenho agronmico alta
mente influenciadas pelo ambiente. Nesse caso, so necess
rios experimentos de avaliao com delineamentos estatsticos,
533
biotecnologia
repeties, em vrios ambientes e em vrios anos, de modo que

o nmero de acessos a serem avaliados reduzido. As infor
maes obtidas nessa ltima etapa so mais caras e difceis de
serem obtidas, entretanto so aquelas que mais facilitam ou
do subsdios para a utilizao prtica dos recursos genticos.
Uso dos recursos genticos

Segundo Guimares (2006), a Organizao das Naes Unidas para
a Alimentao e a Agricultura (FAO) est realizando um levantamento
mundial das capacidades dos pases em utilizar recursos fitogenti
cos para a agricultura e alimentao. O resultado desse levantamento
no Brasil relatado por Albuquerque e Nass (2009). Segundo esses
autores, o uso de acessos disponveis em bancos de germoplasma
limitado em todo mundo, incluindo o Brasil, especialmente consi
derando a ampla diversidade disponvel. As principais causas dessa
baixa utilizao so a falta de adequada documentao e descrio das
colees, a falta de informao til aos programas de melhoramento
gentico, falta de atividades de avaliao preliminar e aprofundada dos
acessos, limitada adaptao dos acessos, nmero limitado de melho
ristas principalmente em pases em desenvolvimento, baixa quanti
dade e qualidade de sementes disponveis devido a inadequados sis
temas de regenerao e multiplicao, troca de germoplasma entre os
melhoristas, que, geralmente, utilizam apenas a variabilidade gentica
encontrada em materiais elite, dificuldade de identificao de genes
potencialmente teis em acessos silvestres e dificuldade de transfe
rncia desses genes para acessos elite em razo da falta de compati
bilidade gentica e necessidade de grande nmero de ciclos de sele
o e recombinao para recuperao do genoma elite, mantendose
o gene de interesse.
Essas ltimas causas da baixa utilizao de recursos genticos tm
sido amenizadas com as chamadas atividades de prmelhoramento.
A palavra prmelhoramento foi traduzida a partir de termos vindos
do ingls como prebreeding, introgression breeding, genetic base broade
ning ou germplasm enhancement (FVERO etal., 2008). Podese defi
nir prmelhoramento como sendo atividades que visam identifica
o de genes e caractersticas de interesse em germoplasma extico
534
ou em populaes que no foram submetidas a qualquer processo

de melhoramento (parentes silvestres e raas locais), e sua posterior
incorporao em materiais elites agronomicamente adaptados (NASS;
PATERNIANI, 2000). Podese dizer ento que o prmelhoramento
a ponte entre as atividades de recursos genticos e os programas
de melhoramento (NASS etal., 2001). usado para definir a fase do
desenvolvimento do germoplasma em materiais mais atrativos aos
melhoristas (FVERO etal., 2008).
Alm da importncia como elo entre os recursos genticos vege
tais e o melhoramento gentico, as atividades de prmelhoramento
podem identificar genes e caractersticas para composio de bancos
de caracteres e funes biolgicas (LOPES etal., 2007; NASS etal.,
2007). Esses bancos podem alimentar programas biotecnolgicos,
como aqueles baseados em genmica funcional, manipulao gnica
e transgenia e, tambm, alimentar programas envolvendo a diversi
ficao e agregao de valor agricultura, na forma de novos alimen
tos, de fibras, de aromas, de biomateriais e de novas variedades com
valor ornamental, funcional e medicinal.
O sucesso do prmelhoramento envolve, pelo menos, duas fases a
primeira, o conhecimento de genes ou caractersticas potencialmente
teis de espcies silvestres, germoplasma extico ou de populaes
nomelhoradas; e a segunda, a sua utilizao prtica com a incorpo
rao em materiaiselite agronomicamente adaptados com caracters
ticas comerciais prontamente utilizadas na agricultura. Faleiro etal.
(2008) relatam, de forma sinttica, algumas experincias de sucesso
do prmelhoramento de plantas, tendo como base os resultados apre
sentados no I Curso Internacional de Prmelhoramento de Plantas
(LOPES etal., 2006) e nas experincias do Programa de Melhoramento
do Maracujazeiro, cujas atividades tm contribudo de forma decisiva
para o lanamento de novas variedades e hbridos. Alm da experin
cia com o maracujazeiro, exemplos de sucesso so relatados com o
milho, caf, arroz, amendoim, mandioca, hortalias, citrus e fruteiras
nativas (FALEIRO etal., 2008). Importantes estudos de caso envol
vendo o uso de recursos genticos tambm so relatados no levanta
mento de Albuquerque e Nass (2009) para a soja (OLIVEIRA etal.,
2009), espcies do gnero Prunus (RASEIRA etal., 2009), maracuja
535
biotecnologia
zeiro (FALEIRO; JUNQUEIRA, 2009); pupunha (CLEMENT, 2009),

curcubitceas (QUEIROZ, 2009), arroz (PEREIRA, 2009; RANGEL
etal., 2009), mandioca (ALVES, 2009; FUKUDA, 2009; BRANCO,
2009) e fruteiras arbreas do Sul do Brasil (CASTRO etal., 2009).
Considerando os vrios exemplos de sucesso citados acima, existe
uma grande variabilidade gentica com utilidade atual e potencial para
programas de melhoramento gentico provenientes de acessos elite
e silvestres. Vrias caractersticas de interesse so encontradas nos
recursos genticos conservados em bancos de germoplasma como
resistncia a pragas e doenas; adaptao a baixas latitudes, colheita
mecanizada, diferentes sistemas de cultivo e condies edafoclimti
cas; arquitetura e porte da planta; cor, forma, sabor de frutos e gros;
eficincia na absoro e utilizao de nutrientes; qualidade nutricio
nal e funcional; qualidade e teor de protenas, leo e vitaminas; tole
rncia seca e ao alumnio; qualidade pscolheita; maiores produ
tividades etc.
Essa rica base gentica disponvel a munio para os programas
de melhoramento, os quais so de grande importncia para o agrone
gcio brasileiro e mundial. Queiroz e Lopes (2007) relatam os impor
tantes impactos da pesquisa em recursos genticos e melhoramento
vegetal na evoluo da agricultura brasileira nos ltimos 50 anos com
o desenvolvimento de cultivares e grande diversidade de plantas adap
tadas s condies tropicais, citando vrios exemplos em vrias cultu
ras como o milho, soja, feijo, olercolas, fruteiras temperadas e tro
picais, caf, eucalipto entre outras.
Experincias na Embrapa Cerrados com

a conservao, caracterizao e uso de
recursos genticos: estudo de caso
Na Embrapa Cerrados, existem vrias colees de germoplasma,
envolvendo colees ativas, colees nucleares e colees de trabalho.
Na Figura9, ilustramse alguns dos principais produtos cujos recur
sos genticos so conservados, caracterizados, avaliados e utilizados
na Embrapa Cerrados.
536
Figura9. Principais recursos genticos conservados, caracterizados, avalia

dos e utilizados na Embrapa Cerrados, envolvendo materiais exticos ou nati
vos de outras regies do Brasil [(A) mandioca; (B) manga; (C) feijo guandu;
(D) capim colonio; (E) capim elefante; (F) brachiaria; (G) trigo; (H) soja;
(I)cevada; (J) amaranto; (K) quinoa; e (L) seringueira (L)] e nativas do Cerrado
[(M) pequi; (N) mangaba; (O) araticum; (P) baru; (Q) cagaita; (R) pitaya; (S)
estilosantes; (T) amendoim forrageiro; (U) macaba; (V)faveira; (X) barba
timo; e (Y) maracujs silvestres].
A utilizao dos recursos genticos ilustrados na Figura9 est rela

cionada diversificao dos sistemas de produo com espcies exti
cas (amaranto, quinoa, entre outras) e com espcies da rica biodiversi
dade do Cerrado como as fruteiras nativas (pequi, mangaba, araticum,
baru, cagaita, pitaya, entre outras), como novas opes de forrageiras
(estilosantes, amendoim forrageiro, entre outras), como fontes alter
nativas para produo de bioenergia (macaba, entre outras), como
plantas medicinais (barbatimo, faveira, maracujazeiro silvestre, entre
outras), como plantas ornamentais (maracujazeiro silvestre, entre
outras). Alguns recursos genticos estudados na Embrapa Cerrados
so importantes para programas de melhoramento como vrios aces
sos de mandioca, manga, gramneas e leguminosas forrageiras, trigo,
cevada, soja, seringueira e maracuj.
537
biotecnologia
No caso das espcies nativas do Cerrado, a utilizao dos recursos

genticos est passando, primeiramente, por um processo de domes
ticao e ajustes de sistemas de produo (JUNQUEIRA etal., 2008b).
No caso do maracujazeiro, a utilizao dos recursos genticos envol
vendo a variabilidade gentica interespecfica e intraespecfica tem o
objetivo de diversificar sistemas de produo e fornecer genes impor
tantes para programas de melhoramento gentico, considerando a
uso diversificado do maracuj (FALEIRO etal., 2005; FALEIRO etal.,
2006; FALEIRO etal., 2008) (Figura10).
Figura10. Uso diversificado do maracujazeiro.
Para que a variabilidade gentica de espcies silvestres seja utilizada

e aproveitada em programas de melhoramento, tornase necessrio
a realizao de hibridaes intraespecficas ou o uso da biotecnologia
moderna na obteno de hbridos somticos ou na utilizao da tec
nologia do DNA recombinante e engenharia gentica. No programa
538
de melhoramento gentico do maracujazeiro realizado na Embrapa

Cerrados, hbridos interespecficos de P. edulis com P. setacea, P.
coccinea e P. caerulea, entre outras, tm sido obtidos com sucesso
(JUNQUEIRA etal., 2005; JUNQUEIRA etal., 2008a).
Avaliaes agronmicas de germoplasma silvestre de Passiflora tm
mostrado o potencial das espcies P. actinia, P. setacea e P. coccinea
para resistncia a viroses (Figura11A), das espcies P. odontophylla,
P. gibertii, P. caerulea, P. serratodigitata, P. actinia, P. mucronata e
alguns acessos de P. edulis e P. nitida para resistncia bacteriose e
das espcies P. serratodigitata, P. gibertii, P. coccinea, P. actinia, P. seta
cea, P. nitida, P. caerulea e alguns acessos de P. edulis para resistncia
antracnose. Alm da resistncia a doenas e a algumas pragas, h
espcies autocompatveis como a P. tenuifila, P. elegans, P. capsularis,
P. villosa, P. suberosa, P. morifolia e P. foetida. H espcies como a P.
setacea e P. coccinea que, nas condies da regio Central do Brasil,
comportamse como planta de dias curtos, pois florescem e fruti
ficam durante o perodo de dias curtos do ano, e a colheita ocorre de
agosto a outubro, poca da entressafra do maracujazedo comercial.
A tolerncia ao frio verificada em P. caerulea e P. incarnata tambm
uma caracterstica de grande interesse para o melhoramento gentico
do maracujazeiro. Outra caracterstica observada em algumas esp
cies silvestres, relatada por Junqueira etal. (2006a), a presena de
androginforo mais curto, que reduz a altura dos estigmas em rela
o coroa, facilitando a polinizao por insetos menores. Em alguns
acessos de maracuj roxo silvestre e P. odontophylla, no momento de
mxima curvatura do estilete, os estigmas chegam a tocar na coroa
(Figura11B), podendo, dessa forma, serem polinizados por abelhas
que so consideradas pragas importantes por transportarem todo o
plen e no fazerem a polinizao de forma eficaz. Espcies silvestres
tambm podem ser utilizadas quando se deseja melhorar caracters
ticas fsicas, qumicas ou sensoriais da polpa do maracuj para novas
opes de mercado, seja como fruta extica ou para incrementar pro
priedades funcionais. Nesse sentido, a P. caerulea e acessos silvestres
de P. edulis tm apresentado potencial para deixar mais avermelhada
a polpa do maracujazeiroazedo comercial, melhorando suas proprie
dades funcionais (Figura11C).
539
biotecnologia
Figura11. Caractersticas de espcies silvestres de maracujazeiro teis para

o melhoramento gentico: (A) resistncia a doenas; (B) androginforo mais
curto que reduz a altura dos estames e estigmas em relao coroa, facili
tando a polinizao por pequenos insetos; e (C) colorao vermelha da polpa
contendo maior quantidade de vitaminas e substncias antioxidantes.
Em pesquisas realizadas na Embrapa Cerrados, estudos sobre com

patibilidade gentica, ndices de cruzabilidade, perodo da antese,
perodo da viabilidade de plen e da receptividade do estigma tm
permitido, por meio de cruzamentos artificiais, a obteno de vrios
hbridos interespecficos frteis e promissores para o programa de
melhoramento gentico (JUNQUEIRA etal., 2008a). Hbridos envol
vendo trs ou mais espcies tambm tm sido obtidos com o objetivo
de piramidar diferentes genes de resistncia a doenas, sendo exem
plos o hbrido P. coccinea X P. setacea X P. edulis e o hbrido P. setacea
X P. coccinea X P. mucronata X P. edulis. Aps a obteno do hbrido
interespecfico, trabalhos de melhoramento gentico tm sido realiza
dos para recuperar as caractersticas comerciais mantendose os genes
de resistncia. O mtodo dos retrocruzamentos auxiliados por marca
dores moleculares do DNA tem sido utilizado (FALEIRO etal., 2007;
FONSECA etal., 2009). Na Figura12, ilustra a recuperao do genoma
recorrente a partir do cruzamento base entre P. edulis e P. setacea.
540
Figura12. Plantas RC do cruzamento inicial entre P. edulis e P. setacea, ilus

trando a recuperao do genoma recorrente.
Entre os hbridos interespecficos que esto sendo obtidos, desta

que especial deve ser dado ao hbrido P. coccinea X P. setacea. Esse
hbrido foi lanado como o primeiro hbrido ornamental de mara
cujazeiro no Brasil, BRS Estrela do Cerrado. Trabalhos de seleo
em populaes RC obtidas do retrocruzamento desse hbrido com
P. coccinea e P. setacea permitiram a obteno de mais dois hbridos
ornamentais de maracuj, BRS Rubiflora e BRS Roseflora, respec
tivamente (Figura13). Outros produtos tecnolgicos obtidos a par
tir do trabalho bsico de prmelhoramento do maracujazeiro so
os hbridos BRS Sol do Cerrado, BRS Gigante Amarelo e BRS Ouro
Vermelho. A utilizao de acessos silvestres de P. edulis na base dos
cruzamentos permitiu a obteno de materiais genticos com a colo
rao de polpa mais avermelhada e menos dependentes da poliniza
o artificial. Outro hbrido muito promissor obtido pelo programa
de melhoramento realizado na Embrapa Cerrados envolve as esp
cies P. caerulea e P. edulis. A partir do cruzamento base, trabalhos de
retrocruzamentos e seleo para colorao avermelhada da polpa esto
sendo feitos. Plantas RC tm apresentado a colorao da polpa mais
avermelhada e bons nveis de produtividade.
541
biotecnologia
Figura13. Capa dos folderes tcnicos dos hbridos de maracujazeiroorna

mental lanados em 2007 e hbridos de maracujazeiro azedo lanados em
2008.
Tambm merecem um destaque os hbridos interespecficos envol

vendo as espcies P. nitida, P. setacea e P. coccinea. O potencial des
ses materiais est relacionado sua utilizao como portaenxertos.
Esses portaenxertos podem ser obtidos por estaquia ou sementes.
Junqueira etal. (2006b) observaram aumentos de produtividade do
maracujazeiroazedo enxertados em P. nitida. Alm da utilidade dos
hbridos, algumas espcies silvestres tm potencial para consumo
in natura, considerando suas propriedades como alimento funcio
nal. Dentro dessa linha, o programa de melhoramento realizado na
542
Embrapa Cerrados tem trabalhado com seleo de populaes de P.

alata, P. setacea e de P. nitida (Figura14), objetivando o aumento do
tamanho do fruto para o mercado de frutas frescas (maracuj doce) e
para produo de matriaprima para produo de doces e sorvetes.
Figura14. Espcies de maracujs doce: (A) Passiflora alata; (B) Passiflora seta
cea; e (C)Passiflora nitida.
A explorao de todo potencial das espcies silvestres de maracuja

zeiro envolve trabalhos de pesquisa bsica nas reas de conservao,
caracterizao e avaliao dos recursos genticos e pesquisa aplicada
voltada para o melhoramento gentico. A integrao entre as ativida
des relacionadas conservao e caracterizao de recursos genti
cos, atividades de prmelhoramento e tambm atividades de melho
ramento e psmelhoramento esto permitindo a utilizao prtica
dos recursos genticos, contribuindo efetivamente para o desenvolvi
mento variedades, hbridos e outros produtos tecnolgicos.
Consideraes finais
As atividades relacionadas conservao, caracterizao e uso de
recursos genticos so estratgicas para a soberania nacional e para
toda humanidade, sendo um grande desafio para a pesquisa bsica e
aplicada, considerando a complexidade e o grande potencial dos recur
sos genticos para ampliar a base da cadeia alimentar do homem e dos
animais domsticos, alm de atender outras necessidades relaciona
543
biotecnologia
das bioenergia, vesturio, medicamentos, ornamentao, habitao

entre outras utilidades, muitas das quais subestimadas. Para o sucesso
das atividades relacionadas aos recursos genticos, essencial o forta
lecimento e a consolidao de redes de pesquisas transdisciplinares e
multinstitucionais para formao de recursos humanos, articulao
de parcerias, otimizao dos recursos financeiros e humanos e para
facilitar e intensificar o intercmbio de germoplasma e informaes.
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Captulo18
Captulo
5
Melhoramento gentico de
plantas e biotecnologia
Fbio Gelape Faleiro
Walter Quadros Ribeiro Jnior
Austeclnio Lopes de Farias Neto
Introduo
Segundo seu conceito amplo, a biotecnologia o uso de conheci
mentos sobre os processos biolgicos e sobre as propriedades dos
seres vivos, com o fim de resolver problemas e criar produtos de uti
lidade. Conceitualmente, o melhoramento de plantas no deixa de ser
uma biotecnologia, como cincia que visa modificao gentica das
plantas para tornlas mais teis ao homem.
O melhoramento de plantas pode ser definido de forma clssica
como a cincia e ou a arte de modificar as plantas para o benefcio
humano (BORM, 1998; BERNARDO, 2002). Tratase de uma cincia
multidicisplinar que aplica os princpios da gentica para o desenvol
vimento de cultivares melhoradas para utilizao humana e animal,
utilizandose de conhecimentos de agronomia, botnica, gentica,
gentica molecular, citogentica, fisiologia, patologia, entomologia,
bioqumica e estatstica (SCHLEGEL, 2003).
Aps a descoberta da hereditariedade por Gregor Mendel em 1865,
novas e grandes descobertas como a heterose, a mutagnese, a gentica
quantitativa, avanos na fisiologia e bioqumica, a cultura de tecidos,
a bioinformtica e os avanos na gentica e biologia molecular tive
ram influncia direta e muito positiva no melhoramento de plantas.
Nas ltimas dcadas, surgiram inmeras tecnologias baseadas em
anlises do DNA e na sua manipulao controlada e intencional por
meio das tcnicas de engenharia gentica. Essas tecnologias abriram
novas possibilidades para o melhoramento gentico por romperem a
barreira de cruzamentos entre diferentes espcies estabelecidas pela
compatibilidade sexual. Mediante a engenharia gentica, possvel
transferir, para plantas, genes isolados de plantas de outras espcies
553
biotecnologia
ou mesmo de microrganismos e animais, aumentando o conjunto

gnico disponvel para cada programa de melhoramento.
Neste captulo, apresentado um pouco da histria e da importn
cia do melhoramento gentico vegetal para a humanidade, abordando
aspectos gerais e exemplos do melhoramento clssico e do melhora
mento baseado em tcnicas da biotecnologia moderna relacionadas
engenharia gentica.
Histria do melhoramento gentico de plantas

Podemos dizer que o melhoramento de plantas nasceu com o incio
da agricultura, h aproximadamente 10.000 anos. A agricultura incen
tivou a prtica emprica do melhoramento de plantas pelos primeiros
agricultores, os quais selecionavam sementes das melhores plantas
para estabelecer novos plantios com melhor qualidade e maior pro
dutividade. Esse processo possibilitou a domesticao de vrias esp
cies de plantas pelo homem (Figura1).
Figura1. Ilustraes da origem do melhoramento gentico, do processo de

domesticao das plantas e de alteraes no tamanho da espiga e da arquite
tura da planta do milho e do tamanho do fruto do maracuj decorrentes do
melhoramento gentico.
Como cincia, o melhoramento de plantas comeou logo aps a

redescoberta das leis de Mendel no comeo do sculo XX. Desde
ento, vem evoluindo em diferentes reas, permitindo aos melho
ristas aumentarem a eficincia na seleo e explorarem mais racio
nalmente os recursos genticos. Dos primrdios da agricultura at
hoje, o melhoramento passou por muitas modificaes no exerccio
da sua prtica, mas poucas mudanas foram observadas, nos ltimos
50 anos, em seus princpios fundamentais de gerao de variabilidade
(BORM; MILACH, 1999).
554
Captulo 18 Melhoramento gentico de plantas e biotecnologia
Borm e Milach (1999) relatam alguns avanos importantes na rea

do melhoramento gentico de plantas que ocorreram no sculo XX, o
qual foi marcado por grandes descobertas ou desenvolvimentos que
tiveram profundo impacto na maneira de se fazer o melhoramento de
plantas (Figura2). A redescoberta das leis de Mendel e do princpio
da hereditariedade foi a base cientfica para a descoberta da heterose
(1910), para o desenvolvimento dos mtodos clssicos de melhora
mento (1920), para a descoberta da mutagnese (1930), para a utiliza
o de mtodos estatsticos e da gentica quantitativa (1940), fisiologia
(1950), bioqumica (1960), cultura de tecidos (1970), engenharia gen
tica e biologia molecular (1980), bioinformtica (1990) e interaes
das reas genmicas, protemicas e metabolmicas em alta escala e
de forma rotineira (2000).
Figura2. Ilustraes de avanos na cincia do melhoramento de plantas,

tendo como base os primeiros experimentos de Mendel, passando pelo
desenvolvimento dos mtodos clssicos de melhoramento, ferramentas
moleculares e engenharia gentica.
Com o avano da cincia, o melhoramento de plantas passou a

possibilitar aos melhoristas a criao de novos tipos de plantas, pela
modificao dirigida e controlada dos caracteres hereditrios de inte
resse. Hoje, vrias cultivares de vrias espcies so desenvolvidas a
cada ano com caractersticas de alta produtividade, qualidade, resistn
cia a estresses biticos e abiticos, adaptabilidade, etc. Logicamente,
os altos rendimentos das culturas atualmente utilizadas na produo
agrcola mundial somente foram possveis com a ajuda do melhora
mento do ambiente para as plantas, sendo exemplos a correo da
acidez e fertilidade dos solos, a irrigao, o controle fitossanitrio
e das plantas invasoras entre outras prticas de manejo fitotcnico.
Estimase que a contribuio do melhoramento de plantas ao nvel
555
biotecnologia
mundial responde por cerca de 50% dos aumentos em produtividade

nas espcies cultivadas (FEHR, 1984).
O melhoramento gentico convencional

O melhoramento gentico clssico possibilita a criao de novas
combinaes de genes por diferentes mtodos, desenvolvidos e aper
feioados no ltimo sculo (BORM, 1997), utilizandose o cruza
mento sexual entre plantas da mesma espcie e, quando possvel,
entre plantas de espcies prximas geneticamente. Por meio desse
cruzamento, possvel combinar caractersticas desejveis presentes
em diferentes plantas. As atividades de melhoramento envolvendo
a combinao de caractersticas e a fixao dos genes de interesse
em novas cultivares so feitas em sucessivas geraes envolvendo a
recombinao e seleo gnica baseada no fentipo. Esse processo de
desenvolvimento de uma nova variedade ou cultivar um processo
lento que pode demorar uma dcada ou mais. Nas primeiras gera
es de melhoramento, milhares de plantas so obtidas por meio de
cruzamentos; testadas e ao longo das geraes, as plantas com carac
tersticas desejveis (produtividade, resistncia a doenas, adaptabi
lidade, etc.) so selecionadas, culminando com o lanamento de uma
nova cultivar (Figura3). Essas atividades possibilitaram um notvel
avano do melhoramento gentico de plantas nos ltimos 100 anos.
Ferreira e Faleiro (2008) ilustram esse notvel avano com os resul
tados da to discutida Revoluo Verde, responsvel pelo aumento na
produo de cereais na segunda metade do sculo XX. A utilizao de
cultivares semians de trigo e de arroz pelo melhoramento clssico
resultou em grande aumento de produtividade dessas culturas, solu
cionando ou equacionando a escassez de alimentos e potencial fome
em escala que se intensificavam em vrios pases do mundo aps a
Segunda Grande Guerra (BORLAUG, 1969).
Conforme mencionado, as cultivares de plantas de diferentes esp
cies cultivadas foram desenvolvidas, em sua grande maioria, com base
na seleo fenotpica de caractersticas de interesse econmico. Essa
tarefa tornase complexa e menos eficiente quando a caracterstica de
interesse controlada por vrios genes (caracterstica quantitativa),
geralmente com pequeno efeito e significativa influncia ambien
556
tal. No obstante, os programas de melhoramento gentico tm tido

sucesso no desenvolvimento de cultivares superiores para caracte
rsticas qualitativas e quantitativas. Esse sucesso pode ser atribudo,
entre outros fatores, combinao de mtodos clssicos de melhora
mento gentico, avaliao do fentipo em diferentes anos e ambien
tes, e a sistemas sofisticados de experimentao, fitotecnia, estatstica
e estratgias de seleo (FERREIRA; FALEIRO, 2008).
Cruzamentos
Prognies
Avaliao - Seleo - Recombinao
Gerao 1
Gerao 1
Gerao n
Produo de
semente gentica
Nova cultivar
Figura3. Ilustraes do processo de avaliao, seleo e recombinao de

plantas com caractersticas desejveis ao longo de sucessivas geraes de
melhoramento, culminando com o lanamento de uma nova cultivar.
Fonte: adaptado de Souza etal. (2009).
557
biotecnologia
O melhoramento auxiliado pela biotecnologia

De um modo geral, as tcnicas relacionadas biotecnologia como a
cultura de tecidos, marcadores moleculares, anlises do DNA e enge
nharia gentica, alm de aumentarem a disponibilidade de genes
desejveis, tm auxiliado o melhoramento gentico das plantas, tor
nando o processo mais rpido, preciso e eficiente.
A cultura de tecidos, por meio das tcnicas de micropropagao,
produo de dihaploides, cultura de anteras e cruzamentos interes
pecficos pela fuso de protoplastos, tem sido uma ferramenta inte
ressante. As tcnicas de melhoramento gentico por engenharia gen
tica tm na cultura de tecidos uma ferramenta bsica, sem a qual no
se alcana a regenerao da planta transgnica completa e funcional
a partir da clula geneticamente modificada. Muitas outras metodo
logias importantes no campo da cultura de tecidos vegetais tm sido
diariamente implantadas e tm trazido novas possibilidades como fer
ramenta auxiliar para o melhoramento gentico. No captulo 14, deste
livro, so relatadas algumas dessas metodologias.
Marcadores moleculares e anlises do DNA esto, a cada dia, sendo
utilizados de maneira rotineira nos programas de melhoramento
gentico, auxiliando nas diferentes fases do programa, desde a caracte
rizao da variabilidade gentica do germoplasma, passando por dife
rentes atividades de prmelhoramento, melhoramento e psmelho
ramento. No captulo 3, nesta obra, so apresentadas as principais
aplicaes dos marcadores moleculares como ferramenta auxiliar em
programas melhoramento gentico vegetal.
A engenharia gentica tem aberto novas possibilidades para o
melhoramento gentico, sendo exemplos o desenvolvimento de cul
tivares de feijoeiro resistentes ao vrusdomosaico dourado, cultiva
res de mamoeiro resistentes ao vrusdamanchaanelar, cultivares de
milho, soja e algodo resistentes a insetos, cultivares resistentes a her
bicidas para reduzir custos e facilitar o manejo da cultura, cultivares
tolerantes a condies adversas como seca, frio, geada, alcalinidade e
acidez do solo, cultivares de alimentos com melhor qualidade nutri
cional, etc. Com a engenharia gentica, o conjunto gnico disponvel
para o melhorista foi ampliado. Essa possibilidade traz a esperana de
equacionar problemas de certas culturas, os quais no teriam soluo
558
utilizando apenas a variabilidade gentica limitada pela compatibili

dade sexual intraespecfica ou entre espcies relacionadas. No cap
tulo 15, deste livro, so discutidos os princpios cientficos da enge
nharia gentica e os aspectos tecnolgicos envolvendo a obteno de
plantas transgnicas geneticamente melhoradas.
Planejamento de programas de melhoramento

O planejamento e as decises sobre as estratgias a serem utiliza
das em programas de melhoramento so to importantes quanto a
sua execuo propriamente dita. As principais etapas do planejamento
de programas de melhoramento de plantas so descritas por Borm
(1998); e Ribeiro Jnior etal. (2008) fazem uma discusso dessas eta
pas, incluindo um estudo de caso sobre melhoramento gentico do
trigo (RIBEIRO JNIOR etal. 2006). O primeiro passo estratgico de
um programa de melhoramento a identificao de demandas e em
funo delas, a definio dos objetivos.
Para a identificao das demandas, costumase considerar somente
o mercado com sua cadeia produtiva e a possibilidade de lucro, o que
uma viso reducionista e limitada. Para uma viso sistmica, devese
considerar tambm impactos scios econmicos e ambientais de uma
possvel cultivar a ser gerada, que, em outras palavras, significa sus
tentabilidade. Em funo desse ponto de vista mais amplo, devese
definir as demandas, objetivos e metas do programa. importante
que as demandas, objetivos e metas sejam coerentes e exequveis
porque projetos muito ambiciosos podem fracassar. Devese consi
derar de forma realista a relao custo e benefcio das novas cultiva
res a serem obtidas.
Para a obteno das novas cultivares, a variabilidade gentica da
espcie alvo a mais importante ferramenta a ser utilizada. Essa varia
bilidade pode ser buscada no somente em cultivares modernas, mas
tambm em acessos obsoletos, raas locais, espcies selvagens de
gneros relacionados espciealvo, entre outros. Quando se con
sidera a espcie e seu sistema produtivo, podese prever os garga
los a serem enfrentados, ou seja, quais caractersticas de interesse
esto ausentes nas atuais cultivares comerciais. Nessa fase do pla
nejamento, possvel definir se haver necessidade de atividades de
559
biotecnologia
prmelhoramento, envolvendo a identificao de genes de interesse

em espcies silvestres e sua transferncia para acessos mais adapta
dos. As atividades de prmelhoramento so de grande importncia
para subsidiar a utilizao prtica dos recursos genticos e ampliar
a base gentica dos programas de melhoramento (DUVICK, 1990;
NASS; PATERNIANI, 2000), sendo vrias experincias de sucesso
relatadas por Faleiro etal. (2008a). A impossibilidade de atingir os
objetivos com a variabilidade gentica existente no pool gnico da
espcie ou de espcies relacionadas pode levar deciso de se utili
zar tcnicas biotecnolgicas, incluindo a transgenia.
As atividades do melhoramento propriamente dito envolvem basi
camente metodologias de avaliao, seleo e novas recombinaes
a cada gerao. Caso no se domine essas metodologias para a esp
ciealvo, um estudo prvio deve ser conduzido inicialmente antes do
melhoramento propriamente dito. O conhecimento prvio da forma
de reproduo e multiplicao da espciealvo imprescindvel para
se decidir a estratgia apropriada do melhoramento. Espcies autga
mas ou algamas, com reproduo via sementes ou assexuada, reque
rem metodologias distintas de melhoramento. Finalmente, as limita
es de manejo da espcie na regioalvo, como por exemplo, doenas
e problemas de adaptao s condies climticas, assim como neces
sidade de irrigao nas diferentes pocas de plantio, so determinan
tes no planejamento dos experimentos. O conhecimento das exign
cias do mercado auxilia na busca de produtos tecnolgicos com maior
valor agregado.
O programa de melhoramento no termina com a obteno da cul
tivar. Para atingir seu objetivo central, essa cultivar deve ser utilizada
pelos produtores e atingir o mercado com benefcios para toda cadeia
produtiva, envolvendo a indstria e os consumidores. Para isso, ati
vidades de psmelhoramento so essenciais. Essas atividades envol
vem a elaborao de planos de marketing, logstica de produo e
comercializao de sementes e difuso da tecnologia. A divulgao dos
ganhos no somente econmicos, mas tambm sociais e ambientais
podem ser importantes para a adoo das novas cultivares.
Para realizao de todas atividades de prmelhoramento, melho
ramento e psmelhoramento (FALEIRO etal., 2008b), o trabalho em
560
equipe envolvendo profissionais com vrias especialidades (gentica,

fitossanidade, fitotecnia, fisiologia vegetal, bioqumica, estatstica,
etc.) assume grande importncia. Toda equipe, por mais qualificada
que seja, possui limitaes e lacunas de conhecimento e, nesse sen
tido, parcerias multidisciplinares e interinstitucionais devem ser cri
teriosamente estabelecidas, aproveitandose as reas de maior dom
nio ou de maior experincia de cada instituio ou equipe parceira.
Importncia e exemplos do
desenvolvimento de novas cultivares
O melhoramento clssico tem contribudo de forma significativa
para o aumento da produo brasileira de plantas cultivadas, assim
como para a reduo dos custos de produo dessas culturas e para
a incorporao de novas reas de produo (RAMALHO, 2004). O
melhoramento de plantas de diversas espcies produtoras de gros,
fibras, frutos e energia foi fundamental para a ocupao agrcola
da regio, por meio da criao de cultivares adaptadas regio do
Cerrado. Hoje, essa regio responde por quantidades significativas da
produo nacional de carne, soja, milho, feijo, algodo, arroz, caf,
entre outras culturas.
O melhoramento baseado na biotecnologia e engenharia gentica
tambm tem contribudo significativamente na produo de alimen
tos no mundo, com um nmero crescente de pases que cultivam
plantas geneticamente modificadas e considervel aumento de reas
cultivadas com estas plantas. Um total de 25 pases cultiva plantas
geneticamente modificadas em aproximadamente 134 milhes de
hectares, dos quais 15 tem a rea cultivada superior a 50 mil hecta
res (Figura4) (JAMES, 2009). Os pases com maiores reas cultivadas
com plantas geneticamente modificadas so EUA, Brasil e Argentina
com 64; 21,4 e 21,3 milhes de hectares, respectivamente.
561
biotecnologia
5
Canad
8.2 milhes/ha
Canola, milho, soja
beterraba
20
Portugal
0.05 milho/ha
Milho
14
Espanha
0.1 milho/ha
Milho
19
Repblica Tcheca
0.05 milho/ha
Milho
22
Polnia
0.05 milho/ha
Milho
25
Eslovquia
0.05 milho/ha
Milho
6
China
3.7 milho/ha
Algodo, tomate,
papaia, pimento
1
EUA
64.0 milhes/ha
Soja, milho, algodo
canola, abbora,
papaia,alfafa,
beterraba
4
ndia
8.4 milho/ha
Milho
15
Mxico
0.1 milho/ha
Algodo, soja
11
Filipinas
0.5 milho/ha
Milho
18
Honduras
0.05 milho/ha
Milho
24
Egito
0.05 milho/ha
Milho
23
Costa Rica
0.05 milho/ha
Algodo, soja
12
Austrlia
0.2 milho/ha
Algodo, canola
17
Colmbia
0.05 milho/ha
Algodo
10
Bolvia
0.8 milho/ha
Soja
21
Romnia
0.05 milho/ha
Milho
13
Burkina Faso
0.1 milho/ha
Algodo
16
Chile
0.05 milho/ha
Milho, soja, canola
3
Argentina
21.3 milhes/ha
Soja, milho, algodo
9
Uruguai
0.8 milho/ha
Soja, milho
7
Paraguai
2.2 milhes/ha
Soja
2
Brasil
21.4 milho/ha
Soja, milho, algodo
8
frica do Sul
2.1 milho/ha
Milho, soja, algodo
Figura4. Pases que cultivam plantas geneticamente modificadas e respec

tivas reas de cultivo.
De acordo com o Servio Internacional para Aquisio de Aplicaes

em Agrobiotecnologia (ISAAA), o Brasil plantou 21,4 milhes de hec
tares com culturas geneticamente modificadas em 2009, um cresci
mento de 35,4% em relao a 2008 (equivalente a 5,6 milhes de hec
tares). Segundo o ISAAA, tratase do maior ndice de crescimento
entre os 25 pases produtores de transgnicos, especialmente em
razo da rpida adoo do milho geneticamente modificado. Do total
da rea cultivada com transgnicos no Brasil, 16,2 milhes de hecta
res correspondem soja tolerante a herbicidas, o que equivale a 71%
do total da cultura; 5,0 milhes de hectares correspondem ao milho
Bt em ambas as safras, de vero e inverno, o que corresponde a 31%
do total da cultura; e 0,15 milho de hectares de algodo Bt e tolerante
a herbicida, o que corresponde a 16% do total da cultura.
O melhoramento gentico convencional ou baseado na engenha
ria gentica um processo contnuo e vibrante com capacidade de
se reinventar, absorvendo novas tcnicas cientficas e metodologias
modernas, na busca do desenvolvimento de cultivares que contribuam
562
para uma agricultura sustentvel combinado produtividade, qualidade

nutricional, adaptao a estresses biticos e abiticos, manejo de solo
e manejo integrado de pragas, entre outros. So vrios os exemplos
de cultivares desenvolvidas, com inmeros benefcios econmicos,
sociais e ambientais.
Perspectivas do melhoramento de plantas

A cada ano surgem novos desafios e demandas para o desenvolvi
mento de novas cultivares, fazendo com que os programas de melho
ramento gentico convencional e baseado na engenharia gentica
tenham uma natureza dinmica e importncia estratgica atual
e futura. O grande potencial de uso da biotecnologia moderna no
melhoramento de plantas inegvel. Os resultados obtidos at o pre
sente momento refletem as contribuies atuais da biotecnologia
moderna e, para o futuro, certamente, novos produtos tecnolgicos
sero gerados.
Vrias oportunidades so citadas para gerao de produtos com o
auxlio da biotecnologia (NAS, National Academy of Sciences, 2010).
Entre elas, o aumento da produtividade de plantas cultivadas, atravs
de maior resistncia e tolerncia a estresses biticos (pragas, doen
as, ervas daninhas) e estresses abiticos (altas temperaturas, seca,
maior eficincia no uso de nutrientes); aumento do valor nutricional
das plantas, atravs do aumento da concentrao de vitaminas, mine
rais e protenas em plantas; gerao de plantas biofbricas, para pro
duo de vacinas e protenas teraputicas; aumento da segurana de
produtos, por intermdio da gerao de plantas com maior durabili
dade pscolheita; uso da biotecnologia com o objetivo da preserva
o da biodiversidade e na conservao dos recursos naturais e pro
duo de energia renovvel.
Entretanto, necessrio que sejam considerados pontos essen
ciais para o desenvolvimento de novos produtos como a identifica
o das demandas e prioridades de cada regio e dos diferentes sis
temas de produo existentes, tendo em vista que eles so diversos
entre regies e mesmo dentro de uma regio. James (2009) cita como
fator importante o fornecimento de tecnologias relevantes para satis
fazer as necessidades de pases em desenvolvimento na sia, Amrica
563
biotecnologia
Latina e frica. Tambm devem ser considerados fatores relaciona

dos definio clara dos beneficirios dos produtos a serem gerados
e o impacto que os mesmos iro causar e as questes de protocolos de
testes de campo necessrios para novos eventos tendo em vista as dife
renas ambientais, por exemplo, as regies temperadas e as regies
tropicais (PERSLEY, 1999). Da mesma forma, devem ser considera
dos os protocolos para regulao e liberao de novos produtos e o
engajamento da indstria de processamento e do consumidor, consi
derando que o sucesso de novos produtos geneticamente modificados
tambm depende da aceitao por parte do consumidor.
Consideraes finais
inquestionvel a grande importncia do melhoramento gentico
vegetal para a humanidade. So inmeros os exemplos de sucesso no
desenvolvimento de cultivares de plantas melhoradas geneticamente
que trouxeram grandes benefcios para o agronegcio, garantindo a
sustentabilidade econmica e ambiental da agricultura. Os exemplos
vo desde as primeiras atividades de domesticao de gentipos selva
gens, passando pelas inmeras cultivares desenvolvidas pelo melho
ramento clssico, at o uso de tecnologias avanadas de engenharia
gentica para o desenvolvimento de novas cultivares. Certamente,
essas tecnologias modernas podem beneficiar diferentes culturas e
programas de melhoramento gentico em algumas situaes, em
que o melhorista teria dificuldades utilizando apenas metodologias
convencionais de melhoramento. Logicamente, as novas tecnologias
como ferramentas auxiliares ao melhoramento gentico nunca iro
substituir as prticas essenciais do melhoramento como a avaliao
fenotpica das plantas contabilizando os efeitos ambientais e das inte
raes gentipo x ambiente.
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biotecnologia
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566
Captulo19
Captulo
5
Anlise genmica aplicada

a produo animal
Introduo
O genoma bovino consiste de 30 pares cromossmicos homlogos,
dos quais 29 so autossmicos e 1 sexual. O genoma de machos
heterogamtico XY e o de fmeas homogamtico XX, com aproxi
madamente 3.000 cM no total. Os cromossomos so classificados de
acordo com a posio do centrmero como metacntricos, submeta
cntricos ou acrocntricos, e numerados segundo o tamanho. O seg
mento curto do cromossomo denominado p e o longo q. Por
meio de colorao com Ginsa, possvel visualizar os cromossomos
com um padro de bandas caracterstico, que so ento numerados
(BandaG). Um determinado loci em um cromossomo pode ser loca
lizado no genoma pelo nmero do cromossomo, o segmento (p ou q)
e nmero da bandaG (FRIES etal., 1993) (Figura1). Dessa forma, o
gene do hormnio do crescimento est localizado no 19q17, o gene da
Betalactoglobulina no 11q28 e o da kapacasena no 6q26.
A partir da dcada de 1980, a genmica bovina progrediu de mapea
mento sintnico de genes codificadores de protenas ao sequencia
mento completo do genoma. O genoma bovino serve como um prot
tipo para estudos em outros bovdeos como cabras, ovelhas e bfalos,
que possuem os genomas altamente conservados em nvel citoge
ntico (WOMACK, 2006; DALRYMPLE, 2006), e ainda mais impor
tante para o entendimento da evoluo e funcionamento dos geno
mas de mamferos, especialmente o humano (GIBBS etal., 2002;
ADELSON, 2008).
569
biotecnologia
Figura1. Caritipo de bovinos. Fotografia dos cromossomos colorados com

Ginsa. So 60 cromossomos, metade herdado do pai e metade da me. Os cro
mossomos so arranjados em pares (um de cada progenitor), 1 a 29 e os X e Y.
Fonte: Adaptado de Kayser, 2001.
Para tanto, o genoma bovino foi sequenciado, possuindo, em 2009,

uma cobertura de aproximadamente 7,5X, objetivando melhorar a
compreenso da biologia e a evoluo dos mamferos. Ele possui um
total de aproximadamente 2,86 x109 pares de base, pelo menos 22.000
genes, sendo 14.345 ortlogos em sete espcies de mamferos, dos
quais 1.217 esto ausentes em genomas de noEuterianos (marsupial
ou monotremata). Alteraes cromossmicas especficas de bovinos
como duplicaes e enriquecimento com elementos repetitivos, assim
como SNPs espcieespecficos, podem ser encontrados em maior
densidade em genes relacionados lactao e ao sistema imune.
Genes envolvidos com metabolismo so geralmente mais conserva
dos, apesar de que cinco genes metablicos ortlogos a humanos esto
ausentes ou divergiram significativamente (ADELSON, 2008; BURT,
2009; CONNELLY etal., 2009; ELSIK etal., 2009; LEMAY etal., 2009;
LIU etal., 2009; TELLAM etal. 2009; ZIMIN etal., 2009) (Figura2).
570
Captulo 19 Anlise genmica aplicada a produo animal
Bovinos
Co
Cavalo
Morcego
Camundongo
Rato
Humanos
Preguia
Placentrios
Elefante
Marsupiais
Gamb
Cangur
Monotremados
Ornitorrinco
Figura2. rvore Filogentica simplificada ilustrando espcies de mamfe

ros existentes. Estimativas em milhes de anos atrs (MYA). As duas sepa
raes iniciais estabeleceram os monotrematas (166.2 MYA), e marsupiais
e placentrios (147.7 MYA). Por aproximadamente 50 milhes no foi origi
nado nenhum grupo com descendentes vivos, ento as quatro superordens
de mamferos surgiram em somente 2,4 milhes de anos.
Neste captulo, sero abordados os recentes avanos das anlises

genmicas no entendimento da evoluo e funcionamento do genoma
bovino e suas aplicaes ligadas ao aumento da produo animal com
nfase no melhoramento gentico. A utilizao de anlises genmicas
na seleo assistida e em estudos filogenticos e populacionais com
implicaes na conservao e manejo de recursos genticos tambm
ser discutida.
Sequenciamento genmico
Com o incio do projeto genoma humano, no incio dos anos 1990,
as sequncias do DNA do genoma humano e de diversas espcies
experimentais foram determinadas. Desde ento, os projetos de
sequenciamento incluram tambm animais domsticos de impor
571
biotecnologia
tncia para a agropecuria. O genoma de galinha foi completado em

2004 (WALLIS etal., 2004), o de bovinos em 2006 (GAO etal., 2007),
e o de sunos est em progresso (Tabela 1).
Tabela 1. Status dos projetos genomas de animais domsticos at 2007.
Mapa Gentico
Espcie
Marcadores
Nome do
Mapa
Projeto
BAC FPC
Mapa RH
Cobertura
ChickRH6
de 20X
Seq. Genmica
ESTs
UniGene
6.6X
Galinha
2110
WUR, NCBI
625.790
33.713
Porco
1283
USDAMARC, Cobertura INRAUMN,

Desenvolvimento 887.593
NCBI
de 15,3X UNR, UIUC
38.782
Vaca
3925
USDAMARC, 6604
NCBI
contigs
Ovelha
1411
Sheepmap4.7, Cobertura
USUoRH500
NCBI
de 5,4X
Pato
155
CAU
NA
Planejamento
NA
2.990
NA
Coelho
745
INRA
NA
NA
NA
49.300
6.413
SUNbRH,
TXAM_RH,
COMRAD
7.7X
Planejamento
1.506.587 41.891
187.701
12.142
Fonte: Adaptado de Hu etal., 2009. http://www.ncbi.nlm.gov/Genomes/
A primeira verso da sequncia do genoma bovino foi publicada

em banco de dados pblico em 2004. A segunda verso, Btau_2.0,
com uma cobertura de 6,2X, foi gerada pela montagem de sequn
cias ShotGun. Em 2006, a terceira verso Btau_3.1, com cobertura
7,15X montado a partir da combinao de sequncias geradas por
ShotGun e Bac library, foi publicado pela NCBI (http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/genome/guide/cow/) (GAO etal., 2007).
A sequncia do genoma bovino est disponvel ao pblico on line no
web site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/cow/, http://
www.ensembl.org/Bos_taurus/index.html, http://genome.ucsc.edu/
e http://bovinegenome.org/, onde est conectada a banco de dados
com informaes relacionadas estrutura dos genes (localizao,
regies codificadoras e regulatrias) e funo (bioqumica, biolgica,
regulatria e interaes com outros genes) (Gene Ontology GO),
QTL para as diferentes caractersticas, famlias de protenas, o mapa
integrado e outros recursos.
572
A ltima montagem Btau_3.1 possui 2,87 10x9pb gerados a partir

de 26 milhes de sequncias shotgun e BAClibrary. Mais do que
1 milho de Expressed Sequence Tags (ESTs) podem ser posiciona
dos no genoma, o que indica a qualidade da montagem. No web site
citada anteriormente, esto descritos aproximadamente 23.800 genes
e 24.800 modelos gnicos (WHEELER etal., 2007) e podem ser visu
alizados no site http://bovinegenome.org/. Caractersticas adicionais
e anotaes (GENE ONTOLOGY CONSORTIUM, 2006) associadas
sequncia de DNA, transcritos nocodificadores, famlias de pro
tenas, ESTs, regies repetitivas, polimorfismos e QTL tambm esto
disponveis (Figura3) (GENE ONTOLOGY CONSORTIUM, 2006;
UNIPROT CONSORTIUM, 2007; ADELSON, 2008).
A informao gerada pelos projetos genomas (sequncia completa
de DNA do genoma de diferentes indivduos das diversas espcies)
pode agora ser mais bem utilizada em investigao cientfica em gen
tica/genmica com a disponibilidade, em abundncia, de sequncia
de DNA, anotao estrutural e funcional, mapas de SNPs (polimor
fismos pontuais de DNA) (SNPs chip) e sondas de oligonucleotdeos
(expresso gnica, microarray), respectivamente, para se melhorar o
entendimento da contribuio dos componentes genticos, ambien
tais e suas interaes na determinao das caractersticas de herana
complexa (Figura4). A genmica aplicada ao melhoramento gentico
permitir avaliar o efeito da seleo natural e artificial sobre as popu
laes de animais domsticos, inferir a variabilidade gentica entre
indivduos ou raas, com implicaes sobre o controle de endogamia
e conservao de diversidade gentica, diagnstico e controle de doen
as genticas, assim como obter ganho gentico superior por seleo
auxiliada por marcadores (Figura5).
573
biotecnologia
Figura3. Informaes disponveis para uma regio de 1x106pb do cromos

somo bovino 1. Vrios recursos e anotaes so visveis, inclusive mode
los de gene, regies repetitivas, polimorfismos de nucleotdeo nico (SNP),
sequence tagged sites (STS) (principalmente microssatlites) e de loci de
caractersticas quantitativas (QTL). Outros recursos no esto exibidos
ara melhor visualizao. Note que variantes splicing de expressed sequence
tags ESTs so altamente informativos ao se decidir qual modelo gnico uti
lizar para continuao do estudo.
Fonte: Adaptado de Adelson, 2008.
574
Figura4. Anlise genmica aplicada a produo animal .

Genmica para melhoristas
Avaliao da variabilidade gentica entre indivduos, raas ou espcies
(controle de endogamia e conservao de diversidade).
Estudos evolucionrios (taxonomia, seleo natural e artificial).
Controle de pedigree, teste de paternidade
(Matriz de ParentescoBLUP).
Diagnstico e controle de doenas genticas.
Ganho gentico superior por GAS, MAS e GS.
Figura5. Aplicaes da genmica para melhoristas.
Mapas de SNPs, Expresso Gnica e QTL

Em razo da frequncia e importncia dos SNPs, a segunda fase
do projeto genoma bovino o projeto HapMap (KAPPES etal., 2006).
Esse projeto tem por objetivo a identificao de centenas de milha
res de SNPs, a partir dos quais podem ser selecionados aproximada
575
biotecnologia
mente 60.000 SNPs para desenvolvimento de plataformas de geno

tipagem de alta escala. At o presente, existem aproximadamente
1.728.285 SNPs no genoma bovino. O projeto HapMap bovino vem
validando uma coleo de SNPs para propsitos de genotipagem, de
maneira que a disponibilidade de marcadores no mais uma limi
tao. Apesar dos custos ainda serem elevados e da ausncia de con
senso a respeito do nmero de indivduos necessrios para estudos
de associao (WANG etal., 2005), essa tecnologia j se mostrou efi
ciente em mapear diversas caractersticas em humanos (BILLARS
etal., 2007; GARCIACLOSAS etal., 2007; GUDBJARTSSON
etal., 2007; GUDMUNDSSON etal., 2007; HELGADOTTIR etal.,
2007; LIU etal., 2007; SCHYMICK etal., 2007; STEER etal., 2007;
STEINTHORSDOTTIR etal., 2007), sugerindo sua aplicabilidade
para outras espcies.
Um microarray Illumina BovineSNP50 Beadchip foi desenvol
vido e avaliado por Wiggans etal. (2009) contendo aproximadamente
57.000 SNPs. Aps genotipagem de 12.591 touros e vacas, diversos
SNPs foram excludos por serem monomrficos (6.572), problemas de
genotipagem (3.213), frequncia allica inferior a 2% (3.649) e outros
660 por diversas razes, restando 40.874 SNPs. Aps verificao de
parentesco entre diversos indivduos, e o compartilhamento de ale
los, a concordncia estimada atingiu 99,96% a 100% dos gentipos.
A acurcia obtida para as genotipagens com o microarray Illumina
BeadChip fornece a base para avaliaes genmicas como estudos
de associao com caractersticas de importncia econmica em gado
de corte e leite (WIGGANS etal., 2009).
Apesar de experimentos visando caracterizar a expresso gnica
empregando microarrays de cDNA e oligonucleotdeos de primeira
gerao terem sido conduzidos (SMITH etal., 2005; CORCORAN
etal., 2006; ELSAYED etal., 2006; SOMERS etal., 2006), a dispo
nibilidade de microarrays mais abrangentes e melhor anotados cer
tamente prover informao adicional para se entender o programa
normal de controle da expresso gnica durante o desenvolvimento
embrionrio de bovinos. Alm dos impactos esperados na agricultura,
como clonagem, produo e transferncia de embries e seleo auxi
liada por marcadores (MAS), tambm aumentar o valor de bovinos
576
e ovinos como modelos biomdicos para desenvolvimento, uma vez

que estes fornecero estrutura conceitual para a construo de redes
regulatrias de expresso gnica, que so bastante conservados entre
mamferos (ADELSON, 2008; BURT, 2009; ELSIK etal., 2009; LEMAY
etal., 2009; LIU etal., 2009; TELLAM etal., 2009; ZIMIN etal., 2009).
Mapeamento gentico
Quando diferentes genes esto localizados prximos no mesmo
cromossomo, dizse que esses loci esto em ligao. O processo da
recombinao ou permuta, que ocorre durante a meiose, respons
vel pela troca de segmentos cromossmicos entre homlogos. A fre
quncia de recombinao proporcional distncia entre os loci. As
distncias so medidas em funo da frequncia de recombinao na
prognie e expressas em centiMorgan (cM). Um centiMorgan equi
vale a aproximadamente 106 pares de base (EMERY; MALCON, 1995).
O mapa gentico construdo a partir da frequncia de recombina
o gnica na prognie (FRIES, 1993) estimada por meio da anlise de
segregao de polimorfismos genticos em famlias informativas, em
que um parental heterozigoto para os dois loci (populao refern
cia) (WELLER etal., 1990) (Figura6). O mapeamento gentico tam
bm pode ser efetuado pela anlise de espermatozoides, avaliando a
frequncia de recombinao diretamente nos gametas, com impacto,
especialmente, em espcies que possuem intervalo entre geraes
muito longo ou outras restries gerao de famlias estruturadas
(ARNHEIN etal., 1994).
577
biotecnologia
M1
M2
M3
M4
M6
M5
- M7
m1
m2
m3
m4
m6
m5
Distncias genticas estimadas

a partir das taxas de recombinao
entre marcadores.
Quanto maior a distncia maior a
taxa de recombinao.
- m7
Parental
F1
- M8
- M10
- M12
M9
M11
- m8
- m10
- m12
m9
m11
- M13
- M15
M14
- m13
- m15
m14
Linhagem M
Linhagem m
F1
Gametas
F2
M1M1
M2M2
m1m1
m2m2
M1m1
M2m2
M1M2 parental
M1m2 recombinante
M1M2 recombinante
m1m2 parental
Figura6. Anlise de ligao entre marcadores (Mapa Gentico).
Um mapa gentico ilustra a ordem dos genes ou marcadores gen

ticos em um cromossomo, assim como a distncia relativa entre os
mesmos. Esse mapa consiste de marcadores altamente polimrficos,
distantes, no mximo, 40 cM um do outro, de modo que qualquer
locus possua uma distncia inferior a 20, cm do marcador (LANDER;
BOTSTEIN, 1989). Trs marcadores por cromossomo (90 marcado
res no total) seria um nmero inicial suficiente para cobrir, com baixa
densidade, todo o genoma bovino (FRIES etal., 1989).
Uma vez que a localizao um locus em um mapa gentico depende
da segregao de marcadores, os mapas genticos possuem preponde
rncia de marcadores polimrficos, e foram inicialmente construdos
primariamente com marcadores microssatlites. Os Microssatlites
apresentam, em geral, ampla distribuio e frequncia no genoma,
alto nvel de polimorfismo, alm da facilidade de deteco atravs de
PCR. Essas caractersticas fizeram dos microssatlites os marca
dores escolhidos para construo de mapas de ligao (LITT; LUTY,
1989; TAUTZ, 1989; WEBER; MAY, 1989; BECKMANN; SOLLER,
1990; LUTY etal.,1990).
O contedo de polimorfismo informativo, conhecido por PIC para
um determinado marcador, referese poro da prognie em que
possvel determinar exatamente a transmisso dos alelos parentais.
578
O PIC dependente no nmero de alelos por locus e das frequncias

dos alelos (BOTSTEIN etal., 1980). O polimorfismo encontrado em
populaes endogmicas geralmente menor do que em populaes
no endogmicas (COWAN etal., 1990). Entretanto, a variao encon
trada em diversas raas bovinas suficiente para o mapeamento gen
tico (SOLLER, 1990; GEORGES; MASSEY, 1991).
O primeiro mapa gentico publicado para animais domsticos foi o
de galinha (Gallus gallus) (BUMSTEAD; PALYGA, 1992; GROENEN
etal., 1998, 2000), e posteriormente para diversas espcies como de
bovinos (Bos taurus) por Bishop etal. (1994) com 306 marcadores
genticos, dos quais 290 microssatlites, e Barendse etal. (1994) com
mais de 200 loci descritos, cobrindo praticamente todo o genoma;
sunos (Sus scrofa) (ROHRER etal., 1994; ROHRER etal., 1996); ovi
nos (Ovis aries) (CRAWFORD etal., 1995; MAURCIO etal., 1998;
MADDOX etal., 2001); caprinos (Capra hircus) (VAIMAN etal., 1996);
coelhos (CHANTRYDARMON etal., 2006) e patos (Anas platyrhyn
chos) (HUANG etal., 2006).
Em virtude dos avanos obtidos em genmica e automatizao,
mapas genticos de alta densidade esto disponveis para diversas
espcies. A disponibilidade de mapas genticos pode fornecer infor
maes importantes a respeito da organizao e localizao de genes
clonados, assim como estrutura para identificao de regies cromos
smicas que interferem em caractersticas de importncia econmica
QTL (CRITTENDEN etal., 1993).
Identificao de loci que influenciam

caractersticas quantitativas QTL
Caractersticas quantitativas so aquelas sob controle polignico,
e frequentemente apresentam variao fenotpica entre e dentro de
populaes. Essas caractersticas so determinadas por vrios genes,
assim como fatores ambientais, sendo que cada gene contribui com
uma pequena poro da variao gentica (FALCONER; MACKAY,
1996).
O principal objetivo da aplicao da gentica molecular ao melho
ramento gentico animal consiste em identificar e mapear os genes
579
biotecnologia
que interferem na expresso de caractersticas quantitativas de impor

tncia econmica, visando melhorar a compreenso do controle gen
tico de caractersticas complexas como desenvolvimento ponderal,
idade ao primeiro parto, ganho de peso psdesmama, rendimento e
qualidade de carcaa, resistncia a doenas, adaptao e longevidade.
Os dois principais procedimentos utilizados com o propsito de
mapeamento de polimorfismos genticos associados variao feno
tpica em caractersticas quantitativas so o do Gene Candidato ou do
Scan Genmico, com base em mapa gentico ou ligao (SCHWERIN
etal., 1995, ANDERSSON, 2001; HU etal., 2009). Os resultados obti
dos das pesquisas em genmica e mapeamento de QTL foram com
pilados por Rocha etal. (2002) e Khatkar etal. (2004) para bovinos;
Rothschild (2003, 2004), Buske etal. (2006), Chen etal. (2007) e Otto
etal. (2007) para sunos; e Abasht etal. (2006) e De Koning etal. (2007)
para galinhas.
Abordagem do gene candidato

O procedimento do gene candidato referese ao estudo da relao
entre polimorfismos em genes relacionados a protenaschave de vias
metablicas de importantes processos fisiolgicos e diferenas no
desempenho animal, visando gerao de marcadores tipo I, ou seja,
polimorfismos determinantes de variao fenotpica (ANDERSSON,
2001) (Figura7). A implementao da abordagem do gene candi
dato consiste nas seguintes fases: (1) coleta ou gerao de populao
referncia; (2) coleta de dados fenotpicos de interesse; (3) seleo de
genes candidatos; (4) genotipagem dos animais e (5) anlise dos dados
fenotpicos e genotpicos (KADARMIDEEN etal., 2006). Apesar do
progresso alcanado pelo uso dessa abordagem (MACLENNAN etal.,
1990; TAYLOR etal., 1998; LIU; LAMONT, 2003; WANG etal., 2005;
GUYONNETDUPERAT etal., 2006), suas limitaes so evidentes.
580
Abordagens para desenvolvimento de ferramentas para MAS

Genes candidatos
para bovinos
Polimofismos genticos
causativos de variao
Crescimento - Eixo Hipotalmico-hipofisrio do hormnio do crescimento

(GH, RGH, SST, IGF-1, IGF-1R, IGF-2 e PIT1).
Qualidade de carcaa - GH, Esterides, Calpaina, Calpastatina e Miostatina,
Tiroglobulina, Leptina (Gene Star Quality Gradee Tenderness, Igenity Tender Gene).
Produo de leite Ccomponentes - GH, KpCn, B-LGB, Albumina, DGAT.
Fertilidade - GnRH, FSH, LH, ESR, PRL, PRLR, PMSG, Leptina.
Doenas genticas - BLAD, Dumps, Citrulinemia, Weaver...
Doenas infecciosas - MHC (Bola), Imunoglobulinas.
Figura7. Genes candidatos para bovinos.
Essa abordagem requer conhecimento da fisiologia da caracters

tica de interesse, que pode no estar disponvel ou estar incompleto
na maioria das vezes. Em geral, existem diversos genes candidatos
para todas as caractersticas quantitativas, e pode ser difcil a seleo
dos candidatos para estudos. Alm disso, genes que no so parte de
importantes processos fisiolgicos conhecidos podem ter efeito sig
nificativo sobre a expresso das caractersticas. Por outro lado, a abor
dagem do gene candidato eficiente somente quando ele apresenta a
variao gentica causativa de variao fenotpica. Os resultados devem
ser interpretados com cautela, uma vez que associaes significativas
podem ser obtidas por desequilbrio de ligao Linkage disequili
brium (LD) com genes causativos adjacentes (ANDERSSON, 2001).
Antes da disponibilidade da sequncia completa do genoma das
diversas espcies, genes candidatos eram selecionados por Anlise
Comparativa entre espcies, com srias limitaes, as quais se acen
tuam quanto maior a distncia filogentica entre as mesmas. Com a
disponibilizao de informao genmica, especialmente mapas de
SNPs, muitas dessas limitaes sero suplantadas (HU etal., 2009).
Desenvolvimento ponderal e qualidade da carne
O desenvolvimento ponderal, a eficincia alimentar, a maciez da
carne e a marmorizao so algumas das principais caractersticas
581
biotecnologia
avaliadas. Os avanos da Gentica Molecular permitem avaliar com

maior profundidade os genes e sistemas genticos envolvidos nas
vias metablicas relacionadas ao crescimento animal e repartio de
nutrientes para os diferentes tecidos (SCHWERIN etal., 1995).
Os animais com hipertrofia muscular (musculatura dupla) apre
sentam baixo contedo de gordura na carcaa e elevao da eficin
cia alimentar. Essa caracterstica determinada por um locus autos
smico com herana parcialmente recessiva (HANSET; MICHAUX,
1985). Georges etal. (1988) identificaram uma banda de DNA
Fingerprinting correlacionada com o fentipo da hipertrofia.
O hormnio do crescimento GH, por intermdio do IGFI, desem
penha importante funo na regulao do crescimento (SCHLEE
etal., 1994). O gene PITI codifica para fator ativador da pituitria
necessrio para secreo do GH. A somatostatina, potente inibidor
do GH, tambm pode ser considerada um gene candidato (THUE;
SCHMUTZ, 1994). Os genes Kapacasena, Betalactoglobulina so
expressos nos leite, podendo afetar o potencial de produo de leite,
expresso como habilidade materna em gado de corte, alm de carac
tersticas organolpticas do queijo (MOODY etal., 1996).
Beever etal. (1990) avaliaram o efeito de grupos sanguneos B, C e F,
transferrina srica e protena carreadora de vitamina D, alm de mar
cadores genticos antgeno leucocitrio bovino A BoLAA em carac
tersticas de carcaa (n=146) na raa Aberdeen Angus. Efeitos signifi
cativos entre grupo sanguneo B e peso ajustado para 205 dias, aos 365
dias, ganho dirio prdesmama e espessura da camada de gordura,
alm de Bola e rea de olho de lombo, foram obtidos pelos autores.
O efeito dos genes GH, hormnio paratireoidiano, prolactina, oste
onectina e keratina foram avaliados em caractersticas de desempe
nho ponderal e conformao em 677 animais puros e cruzados entre
as raas Aberdeen Angus, Brahman, Hereford, Holands e Jersey. Os
resultados evidenciaram uma associao entre alelos B, C e D do GH
e decrscimo do peso ao nascimento de 1,0 desviospadro nas raas
Brahman, cruzados AngusBrahman e BrahmanHereford e associa
es significativas entre hormnio paratireoidiano e peso a desmama
e tamanho corporal. Os autores sugerem que outros estudos deve
riam ser conduzidos com um nmero maior de animais para validar
os resultados.
582
Associaes entre polimorfismos dos genes Kapacasena,

Betalactoglobulina, GH, receptor do GH, PITI, IGFI e prolactina
PRL com caractersticas de crescimento e habilidade materna em
bovinos da raa Hereford foram avaliadas por Moody etal. (1996).
Os resultados obtidos indicaram efeito da Kcasena no peso ao nas
cimento e ganho de peso prdesmama, representando 15% e 8% da
variao total para essas caractersticas respectivamente.
A qualidade da carne influenciada por diversos fatores genti
cos e ambientais, alm da idade e sexo do animal e processamento
postmortem. A maturao do msculo em carne ocorre por ao de
sistemas enzimticos proteolticos. A enzima calpana afeta a prote
lise postmortem determinando aumento na maciez final da carne.
A regulao da atividade da protease calpana efetuada pelo inibi
dor de protease calpastatina, protena endgena que coexiste em todas
as clulas, configurando outro gene candidato para qualidade de car
caa. O efeito de polimorfismos do gene calpastatina sobre fora de
cisalhamento foi avaliado por Green etal. (1994), o que gerou resul
tados significativos.
Produo e qualidade do leite
As casenas principais protenas do leite , albuminas, lactoglobu
linas e tambm protenas sricas so consideradas genes candidatos
para produo de leite, seus componentes e, consequentemente, tam
bm para caractersticas de habilidade materna como peso desmama.
A casena dos bovinos subdividida em quatro grupos: Alfa,
Beta1, Beta2 e Kapa casenas (FLORES; RICHARDSON, 1988). A
Kapacasena responsvel pela estabilidade dos micelos, importante
determinante das propriedades organolpticas dos produtos lcteos
(KEMENES, 1996). O alelo B da Kapacasena est relacionado a ren
dimento e qualidade do queijo, provavelmente como resultado de
maior velocidade de coagulao produzindo cogulos mais firmes e
evitando perda de gordura (RAMPILLI etal., 1988). Est associado
maior concentrao de protena e reduo na produo total de leite
(BOVENHUIS etal., 1992). Os alelos A e B possuem frequncia 0,92 e
0,08, respectivamente, na raa Nelore (KEMENES, 1996; DEL LAMA,
1996).
583
biotecnologia
A Betalactoglobulina representa outra fonte de aminocidos para

os lactantes, possuindo dois alelos principais (A e B) (KEMENES,
1996). Efeitos positivos do gentipo BB na concentrao de gordura
e negativos na concentrao de protena e quantidade total de leite
foram encontradas por Bovenhuis etal. (1992). Esses autores demons
traram que o alelo B est associado a uma maior concentrao de
Kapacasena. Kemenes (1996) e Del Lama (1996) encontraram as fre
quncias semelhantes tambm para Betalactoglobulina, 0,33 para o
alelo 1 (A) e 0,77 para o 2 (B) na raa Nelore.
Os resultados encontrados na literatura nem sempre so consisten
tes, podendo ser contraditrios. Efeito significativo na produo de
leite, protena e gordura somente para interao entre os loci em gado
holands de Israel foi observado por Ron etal. (1993). Velmala etal.
(1995) no encontraram associao significativa entre hapltipos de
casena com nenhuma caracterstica de produo.
O efeito de substituio do polimorfismo obtido por restrio do
gene GH com a enzima de restrio Alu I em diversas raas de gado
de leite foi estudado por Lucy etal. (1993). Os resultados indicaram
indicao de superioridade do gentipo LL na produo de leite em
gado Holands, entretanto, na raa Jersey, o gentipo VV estava asso
ciado a uma maior produo. Schlee etal. (1994) encontraram frequ
ncia 0,8 e 0,71 do alelo L (leucina) em gado Holands e Simental res
pectivamente. Frequncias de 1,0, 0,93, 0,92 e 0,56 foram obtidas em
PardoSusso, Holands, Guernsey e Jersey respectivamente (LUCY
etal., 1993).
Polimorfismo de conformao de fita simples SSCP foi utilizada
para identificar variantes do GH encontrados em animais da raa
Holandesa criada em Israel, alm de animais de diversas raas zebu
nas e taurinas, e testar associaes com produo de leite e seus com
ponentes (LAGSIEL etal., 1996). Um dos hapltipos encontrados, de
origem zebuna, apresentou efeito significativo na concentrao de
protena.
O gene DGAT1 (acylCoA:diacylglycerol Oacyltransferase) codi
fica uma enzima cataltica responsvel pela produo de triglicer
dios. Seu potencial como gene candidato ficou evidente em estudos
com camundongos deficientes (Knockout) nas duas cpias do gene
584
DGAT1 (SMITH etal., 2000). DGAT1 foi recentemente identificado

em um QTL para produo de leite em bovinos, e diversas mutaes
j foram identificadas em diferentes posies do gene, sendo que a
substituio, lisina/alanina na posio 232 da protena (K232A) pos
sui efeito significativo na produo e composio do leite (GRISART
etal., 2002). Diversos estudos indicaram forte associao entre K232A
e aumento na porcentagem de gordura do leite e reduo da produo
de leite (WINTER etal., 2002; SPELMAN etal., 2002; HORIOSHIMA;
BARRERASSERRANO, 2003; KOMIZAREK etal., 2004).
Outro gene candidato para produo de leite o gene Pit1, em
razo de sua funo em mecanismos fisiolgicos relacionados com
crescimento. Esse responsvel pela regulao da expresso do gene
GH, e sua deficincia determina uma reduo da proliferao das
cluas produtoras de GH (MCCORMICK etal., 1990). Uma mutao
(A/G) no exon VI, auterando o stio de restrio da HinfI, foi obser
vada gerando dois alelos (WOOLLARD etal., 1994). Renaville etal.
(1997) observou associao entre esse polimorfismo e produo de
leite, assim como HoriOshima e BarrerasSerrano (2003), que obser
varam efeito significativo em produo de leite, alm de iterao com
gentipos de DGAT.
Fertilidade
O melhoramento gentico para fertilidade especialmente impor
tante em bovinos por possurem baixa prolificidade e alto custo de
manuteno das vacas em relao ao custo total do sistema produ
tivo. No entanto, o ganho gentico anual esperado menor do que
para caractersticas de desenvolvimento ponderal, rendimento de car
caa ou produo de leite devido, entre outros fatores, expresso limi
tada ao sexo, baixa herdabilidade e correlao negativa com outras
caractersticas. A seleo para fertilidade, normalmente, efetuada
objetivando a reduo da idade da vaca ao primeiro parto e intervalo
entre partos, alm de caractersticas conformacionais (tipo), como, por
exemplo, distncia entre squios e bere para vacas e aprumos para
touros, e ausncia de doenas reprodutivas (SCHWERIN etal., 1995).
A abordagem do gene candidato para estudos de fertilidade tem
sido utilizada para identificao de marcadores genticos. Os princi
585
biotecnologia
pais genes selecionados para estudos de associao so os hormnios

do eixo hipotalmicohipofisrio como: hormnio liberador de gona
dotropinas GnRH, prolactina, fator inibidor da prolactina PIF,
hormnio folculo estimulante FSH, hormnio luteinizante LH,
ocitocina, gonadotrofina srica de gua prenhe PMSG, seus respec
tivos receptores e enzimas das vias de biossntese (HAFEZ, 1988).
Bindon e Piper (1986) descreveram o fentipo conhecido por
Boroola em ovinos associado a um aumento no ndice de fertili
dade de aproximadamente 20%. Associao entre polimorfismo do
gene receptor de estrognio ESR e tamanho de leitegada foi eviden
ciado em sunos com efeito de substituio de 0,81,0 leites por lei
tegada (ROTHSCHILD etal., 1994).
A associao entre antgenos do complexo principal de histocompa
tibilidade MHC e fertilidade de bovinos da Noruega foi estudada por
Mejdell etal. (1994). Os autores obtiveram efeito significativo de alelos
BoLAA no aparecimento de cio. Os autores sugerem que esse efeito
devido a desequilbrio de ligao entre MHC e a enzima 21hidro
xilase, relacionada com a biossntese de glicocorticoides e mineralo
corticoides a partir de progesterona.
Doenas hereditrias
A utilizao de tcnicas de biologia molecular est aumentando
o entendimento da contribuio gentica em doenas hereditrias
de diversas espcies de animais. O procedimento do gene candidato
para uma doena tem por objetivo clonar e sequenciar para identifi
car variantes genticas que a determina, e, quando no estiverem dis
ponveis genes candidatos, as mutaes podem ser mapeadas utili
zandose de marcadores como os microssatlites (HOLMES, 1994).
A identificao de animais portadores de doenas genticas possvel
antes da produo de descendentes, evitando assim que o gene dele
trio seja transmitido s prximas geraes.
Associao entre produo de leite e a doena mieloencefalopatia
degenerativa progressiva Weaver disease, caracterizada em bovinos
da raa Pardosuio por paresia progressiva dos membros plvicos
e ataxia, foi descrita por Hoeschele e Meinert (1990). Georges etal.
(1994) mapearam esse gene prximo ao microssatlite TGLA116, o
586
que possibilitar avaliar se essa associao devido pleiotropia ou

ligao gentica.
A deficincia na adeso de leuccitos em bovinos BLAD resul
tado da substituio de uma glicina por um cido asprtico na posio
128 da regio extracelular da IntegrinaBeta2. Pode ser diagnosticada
por meio de PCRRFLP utilizando iniciadores especficos e enzima
de restrio TaqI. A frequncia gnica supera os 15%, em popula
es de gado holands, ocasionando perdas da ordem de 5 milhes
de dlares nos EUA (SHUSTER etal., 1992; HEALY; DENNIS, 1994,
KEHRLI etal., 1994).
A glicogenlise generalizada, conhecida por Pompes disease,
uma doena autossmica recessiva causada por uma insuficincia
da enzima Betaglucosidase cida, levando a um acmulo de glicog
nio nos tecidos. Essa doena foi citada primeiramente em humanos
e posteriormente em bovinos da raa Brahman por Jolly etal. (1977).
A doena se manifesta, geralmente, ao redor dos 6 meses de idade
com aumento progressivo de fraqueza muscular e falta de coordena
o e morte ocorrendo aos 912 meses (REICHMANN etal., 1994).
Outras doenas hereditrias mapeadas so: (1) Citrulinemia ine
ficincia da argininasuccinato sintetase (DENNIS etal., 1989), mani
festase pelo aumento da concentrao de amnia e diminuio de
arginina no plasma sanguneo ao redor de 24 horas aps o nasci
mento, com morte at uma semana de vida. A frequncia gnica
observada na raa australiana Friesien foi F(g) = 0,10 (SHANKS
etal., 1995); (2) Deficincia da Uridina Monofosfato Sintetase,
Dumps, descrita por Schwenger etal. (1993), resultado de uma
mutao pontual gerando um cdon terminal; (3) Deficincia na
coagulao sangnea devido a uma deleo de 20 pares de base no
gene Fator XI mapeado no cromossomo 17 (OVERTON etal., 1996).
Resistncia a doenas infecciosas
O Complexo Principal de Histocompatibilidade MHC Major
Histocompatibility Complex, tambm conhecido por Antgenos
Leucocitrios BoLA Bovine Leukocyte Antigen em bovinos ou por
HLA Human Leukocyte Antigen em humanos, desempenha impor
tante papel no sistema imunolgico de vertebrados, incluindo mam
587
biotecnologia
feros, aves, rpteis, anfbios e peixes. Atuam no reconhecimento de

molculas ou microrganismos estranhos ao organismo. A sua funo
se ligar a peptdeos derivados do metabolismo proteico extracelular
e apresentlos aos linfcitos T, desencadeando a resposta imunol
gica (ANDERSON, 1994).
Os antgenos MHC de bovinos, constitudos por 105 genes conti
dos em 4.000 Kb, so, geralmente, subdivididos em Classe I, apre
sentando 45 loci expressos em praticamente todos os tecidos; Classe
II expressos em clulas do sistema imune (macrfagos e clulas B);
Classe III, envolvidos com comunicao intercelular e biossntese de
esteroides; e Classe IV, presente em aves (KAUFMAN etal., 1990).
O polimorfismo nesses loci, aparentemente, deve ser mantido por
seleo balanceada balancing selection, uma vez que so observadas:
(1) frequncias allicas melhor distribudas do que o esperado para
alelos neutros; (2) frequncia relativa de substituies no sinnimas
(com alterao da sequncia de aminocidos da protena) superior s
substituies sinnimas (HUGHES; NEI, 1988, 1989); e (3) tempo de
persistncia dos alelos MHC, excede o esperado para alelos seletiva
mente neutros (TAKAHATA; NEI, 1990).
O balanceamento das frequncias allicas pode ser determinado
por interaes com patgenos. Dois mecanismos so utilizados por
Andersson (1994) para explicar esse tipo de seleo: (1) sobredomi
nncia, a frequncia de heterozigotos superior ao esperado; (2) valor
adaptativo dependente das frequncias allicas (vantagem seletiva
inversamente proporcional a frequncia allica populacional); e (3)
acasalamento preferencial, evitando o cruzamento entre indivduos
aparentados.
Andersson (1994) publicou uma reviso sobre polimorfismos de
MHC e associao com resistncia a doenas infecciosas, em que os
hapltipos Classe I esto frequentemente associados a um aumento
na resistncia, e os Classe II a uma maior resposta vacinao.
Associao entre polimorfismo do BoLAA e valor gentico estimado
para resistncia a mastite e ketose em gado da Noruega foi avaliada
por Mejdell etal. (1994). Associao entre o hapltipo 1 de DRB e mas
tite por Staphylococcus aureus foi observada por Berryere etal. (1994).
588
Associao entre suscetibilidade a linfocitose persistente e BolaDRB3

foi apresentada por Xu etal. (1993).
O aumento do valor gentico para resistncia a diversas doenas
simultaneamente, por meio da seleo de alelos especficos MHC,
improvvel, uma vez que a superioridade relativa de um determinado
gentipo varia entre famlias e raas, assim como entre cepas dos pat
genos. Alm disso, a seleo de determinados alelos poder aumentar
a resistncia a uma doena em particular, podendo acarretar em dimi
nuio da resistncia para outras, e a perda de diversidade de MHC
necessitaria de milhes de anos para ser restaurada. Esses argumen
tos demonstram a importncia de se conservar a diversidade do MHC
(ANDERSSON, 1994; MEJDELL etal., 1994). A melhor compreenso
da funo e mecanismos dos BoLA permitir o desenvolvimento de
vacinas mais eficientes (ANDERSSON, 1994).
Associao entre uma banda de 16 Kb do agrupamento gentico da
lisozima e sua atividade enzimtica em bovinos da Noruega foi iden
tificada por Olsaker etal. (1993). Essa enzima est presente no soro
sanguneo e colostro e possui ao bactericida uma vez que degrada
a camada peptidoglicana da parede celular bacteriana estimulando a
resposta imunolgica (JOLLS; JOLLS, 1984).
Abordagem do scan genmico

No procedimento baseado em mapa gentico, ou de ligao, diver
sos marcadores moleculares polimrficos (geralmente considera
dos seletivamente neutros) so empregados para identificar loci que
interferem em caractersticas quantitativas, conhecidos por QTL
(Quantitative Trait Loci), ou ainda Economic Traits Loci (ETL). Em
outras palavras, a abordagem do scan genmico analisa a relao entre
a varincia de uma caracterstica fenotpica e a segregao de mar
cadores selecionados devido s suas posies ao longo do genoma
(ANDERSSON, 2001) e permitir localizar no mapa gentico loci que
afetam a expresso da caracterstica.
Esses so chamados de marcadores tipo II, ou seja, polimorfismos
em ligao com marcadores tipo I (OBRIEN, 1991). A primeira publi
cao de mapeamento de QTL utilizando marcadores moleculares dis
tribudos ao longo de todo o genoma foi publicado por Paterson etal.
589
biotecnologia
(1988). Posteriormente, um mapeamento por intervalo para popu

laes experimentais foi desenvolvido por Lander e Botstein (1989).
A implementao da abordagem do scan genmico consiste nas
seguintes fases: (1) coleta ou gerao de populao referncia; (2)
coleta de dados fenotpicos de interesse; (3) seleo de marcadores;
(4) genotipagem dos animais; (5) construo de mapas de ligao;
e (6) anlise dos dados fenotpicos e genotpicos (KADARMIDEEN
etal., 2006).
Uma populao referncia uma populao gerada para realizao
de investigao cientfica com dados fenotpicos e suficiente quanti
dade de DNA para genotipagem. Geralmente so geradas pelo cru
zamento entre linhagens contrastantes ou por possurem alguma
caracterstica interessante com variao gentica. Alternativamente,
populaes em programas de melhoramento gentico que empregam
inseminao artificial em larga escala, como o caso de bovinos leitei
ros, geram delineamentos experimentais conhecidos por delineamen
tos de netas e delineamento de filhas (Daughter e GrandDaughter
designs), interessantes para aproveitar dados fenotpicos na identifi
cao de QTL.
Uma vez que o intercruzamento de linhagens contrastantes o
desenho experimental mais poderoso na identificao de QTL, este
tem sido amplamente utilizado para gerar populaes referncia,
como, por exemplo: sunos Large White e javalis (KNOTT etal., 1998;
JEON etal., 1999; NII etal., 2005, 2006), raas asiticas e europeias
de sunos (JUNGERIUS etal., 2004; STRATIL etal., 2006) e bovi
nos Angus (Bos taurus) e Brahman (Bos indicus) (JEON etal., 2003).
Mtodos eficientes e robustos que empregam regresso linear ml
tipla foram desenvolvidos para o mapeamento de QTL em pedigrees
simples ou complexos (HALEY; KNOTT, 1992; HALEY etal., 1994;
VISSCHER etal., 1996; SEATON etal., 2002).
O banco de dados de QTL de animais Animal Quantitative Trait
Loci (QTL) database (AnimalQTLdb) contm toda a informao, dis
ponvel ao pblico, de animais de importncia agropecuria da ltima
dcada, relacionada a localizao do QTL, marcadores adjacentes, tes
tes estatsticos, magnitude de efeito do QTL e caractersticas associa
das. At maio de 2007, havia 846 QTLs de 55 publicaes represen
590
tando 91 diferentes caractersticas de bovinos (Tabela 2), 1.675 QTL

de 110 publicaes representando 281 diferentes caractersticas de
sunos e 657 QTL de 45 publicaes sobre 112 diferentes caractersti
cas de galinha (http://www.animalgenome.org/QTLdb/) (HU etal.,
2007). Uma observao interessante que QTL identificados para por
centagem de gordura no leite em bovinos leiteiros esto localizados
nas mesmas regies que os QTL identificados para gordura corporal
em bovinos de corte (Figura8). Isso no de forma alguma inespe
rado, e acentua a ideia de que a arquitetura gentica controla a expres
so das caractersticas e interfere em diversos processos fisiolgicos.
Tabela 2. Nmero de QTL para algumas caractersticas de bovinos.
Caracterstica
QTL
Caracterstica
QTL
Score de marmoreio
33
Peso vivo
Rendimento em carne
16
Gordura ajustada
Peso da carcaa quente
23
Gordura do rim, pelvis e corao
Ganho psdesmama
Caracterstica Leiteira
Maciez da carne
Qualidade de aprumos e pernas
Expessura de gordura
Qualidade do bere
Rendimento de carcaa
14
Angularidade
rea de olho de lombo
Ligamentos posteriores do bere
Ganho prdesmama
13
Ligamentos anteriores do bere
Peso a um ano
12
Estatura
Rendimento em leite
71
Tamanho de tetas
Rendimento de gordura no leite
59
Colocao de tetas
Rendimento de protena no leite
55
Profundidade do bere
Porcentagem de gordura no leite
58
Velocidade de ordenha
Porcentagem de protena no leite
62
Temperamento
Durao d evida produtiva
Taxa de gmeos
Score de clulas somticas
20
Peso ao abate
Peso ao nascimento
37
Resistencia a tripanossonomiase
Taxa de ovulao
Distocia (Efeito direto)
Maciez da carne
Taxa de no retorno aos 90 dias
591
biotecnologia
592
Figura8. Resultado de QTL para bovinos de leite e corte relacionados a produo de gordura. Note que, na maioria
dos casos, QTL para carcaa e leite se sobrepem.
Diversos pesquisadores vm buscando identificar marcadores tipo

I e tipo II, resultantes da aplicao das abordagens do gene candidato
e scan genmico, em caractersticas como produo de leite, desen
volvimento ponderal, rendimento de carcaa, marmorizao e maciez
da carne, idade ao primeiro parto, intervalo entre partos, resistncia
a doenas e estresse, entre outras. Apesar de o mapeamento de QTL
ter identificado centenas de regies cromossmicas contendo genes
causadores de doenas genticas ou que afetam diversas caracters
ticas de herana simples em animais domsticos, o nmero de poli
morfismos genticos determinantes de variao fenotpica (muta
es causais) em caractersticas quantitativas detectados permanece
bastante reduzido, alm de explicar apenas uma frao pequena da
variao gentica (Tabela 3). Um scan genmico pode detectar QTL
para a caracterstica de interesse, se possuir marcadores distribudos
ao longo de todo o genoma, mas ainda bastante difcil detectar loci
com efeitos pequenos ou separar os efeitos de genes em desequilbrio
de ligao forte (GODDARD; HAYES, 2009; HU etal., 2009).
Tabela 3. Lista de QTL com mutao causal conhecida em animais
domsticos.
Gene
Espcie
Caracterstica
Mutao
KIT
Porco
Branco dominante
Duplicao
RYR1
Porco
Gene do alotano
R614C
PRKAG3 Porco
RN
R200Q
IGF2
Porco
Desenvolvimento e composio de carcaa Transio G/A
DGAT
Vaca
Porcentagem de gordura no leite
K232A
MSTN
Vaca
Musculatura dupla
Diversas
CLPG
Ovelha
Musculatura dupla
Substituio A/G
IGF1
Cachorro Tamanho corporal
Diversas
MITF
Cachorro Colorao de pelagem
Insero SINE
CBD103
Cachorro Colorao negra
Deleo de 3pb
PMEL17
Galinha
Branco dominante
Insero/deleo de 915pb
MC1R
Galinha
Colorao de pluamagem
E92K
SLC45A2 Galinha
Colorao de pluamagem
106delT
Fonte: Adaptado de Hu etal., 2009.
593
biotecnologia
Anlise de associao genomewide

Anlise de Associao com cobertura ampla do Genoma
Genomewide association analysis (GWA) uma abordagem que
utiliza alta densidade de marcadores localizados ao longo de todo
o genoma para a identificao de regies cromossmicas associa
das com um determinado fentipo, sem conhecimento da muta
o causal da variao gentica. GWA est baseada na suposio
de que uma mutao causativa para um determinado fentipo est
em desequilbrio de ligao com marcadores adjacentes nas diver
sas famlias de uma populao, mesmo aps diversas geraes de
recombinao. Para se capturar todos os segmentos cromossmi
cos em LD fraco e (ou) com pequeno efeito, fazse necessrio um
mapa de alta densidade, isto , grande nmero de marcadores loca
lizados a pequenas distncias. Entretanto, esses marcadores esto
hoje disponveis, tornando GWA possvel. Apesar de GWA ter sido
desenvolvida h pouco tempo, diversos estudos j foram publi
cados (DUERR etal., 2006; SAXENA etal., 2007; SCOTT etal.,
2007, VAN TASSELL etal., 2008; GODDARD; HAYES, 2009).
GWA pode contribuir para abrir novas fronteiras no entendimento
de caractersticas de herana complexa (HIRSCHHORN; DALY, 2005),
uma vez que existam populaes com grande nmero de indivduos e
muitas geraes de recombinao que permitem o mapeamento fino
de QTL empregando SNPs para gerar um mapa gentico de altssima
densidade (KARLSSON etal., 2007; ADELSON etal., 2009).
Predies genmicas combinam dados genotpicos, fenotpicos e
pedigree com o intuito de aumentar a acurcia de seleo. A avalia
o gentica tradicional emprega somente dados fenotpicos e proba
bilidades de compartilhamento de genes idnticos por descendncia
IBD gerados a partir do pedigree. Marcadores espaados ao longo
do genoma com baixa densidade permitiam a identificao somente
de regies cromossmicas muito longas que podem conter dezenas
de genes ou famlias de genes, mas no permitiam a deteco de
genes de pequeno efeito, muito menos separa os efeitos individu
ais dos diversos loci dentro do segmento cromossmico. Marcadores
genotipados para milhares de loci ao longo de todos os cromossomos,
utilizando platafomas de genotipagem de alta densidade de SNPs
desenvolvidas recentemente, podem gerar estimativas mais preci
594
sas (MEUWISSEN, 2007; VAN TASSELL etal., 2008; GODDARD;

HAYES, 2009).
A abordagem GWA foi empregada em bovinos leiteiros dos EUA
e Canad por Van Raden etal. (2009) para se avaliar o ganho em acu
rcia em predies genticas em comparao a avaliao tradicional
genticoquatitativa. Os autores utilizaram gentipos para 38.416 mar
cadores e avaliaes genticas de Janeiro de 2003 de 3.576 touros (tou
ros preditores) Holandeses nascidos antes de 1999 para efetuar a an
lise de associao. Os efeitos dos segmentos genmicos estimados nos
touros preditores foram testados em touros nascidos de 1999 a 2002
(touros preditos). A informao obtida foi utilizada para se predizer os
valores genticos genmicos de animais nascidos em Janeiro de 2008,
filhos(as) do touros preditos, e comparar com a acurcia estimada
como a mdia dos valores genticos dos progenitores, isto , valor gen
tico estimado sem incorporao de dados fenotpicos de descendentes.
O DNA foi obtido a partir de smen coletado e estocado ao longo
dos anos, e fornecido por centrais de inseminao dos EUA e
Canad, alm do Centro Nacional de Preservao de Germoplasma
dos EUA. Os gentipos foram gerados com a utilizao do microar
ray de SNPs Illumina BovineSNP50 BeadChip. As predies gen
ticas para 5 caractersticas de produo, 5 de adaptao e 16 carac
tersticas conformacionais; alm do mrito total, foram calculadas
empregando modelo nolinear e distribuio a priori heavy tai
led para considerar a presena de genes principais major genes.
As predies genticas obtidas com a utilizao de informao
genmica foram mais acuradas do que a avaliao tradicional para
todas as 27 caractersticas. Os coeficientes de determinao (R2)
foram de 0,05 a 0,38 superiores com predies genmicas noline
ares, com uma mdia de 23%. O ganho em acurcia foi equivalente
incorporao de dados relativos a 11 prognies. Os maiores bene
fcios entre as predies genmicas ocorreram para porcentagem de
gordura no leite devido ao conhecimento de um gene principal. As
acurcias aumentaram mais pela adio de indivduos do que pela
incorporao de marcadores. Os autores concluem que as acur
cias das predies genticas foram superiores devido ao acompanha
mento da segregao de alelos durante a herana de genes, mesmo
dos de pequeno efeito e recomendam o incio da utilizao de GS
para tourinhos e novilhas a partir de 2009 (VAN RADEN etal., 2009).
595
biotecnologia
Seleo auxiliada por marcadores moleculares MAS

O melhoramento gentico de bovinos de corte tem sido realizado
para caractersticas de importncia econmica como desenvolvimento
ponderal, fertilidade, rendimento e qualidade de carcaa, utilizando
avaliao fenotpica detalhada e princpios de gentica quantitativa. A
teoria dos ndices de seleo, com nfase em seleo dentro de reba
nhos em sua grande maioria, foi empregada at meados de 1980.
Posteriormente, a estimao do valor gentico dos animais, expresso
em termos de Diferena Esperada Na Prognie (DEP), ou Estimated
Breeding Value (EBV), utilizando a metodologia dos modelos mistos,
comeou a ganhar grande destaque (HENDERSON, 1988; QUASS;
POLLAK, 1980).
Entretanto, apesar dos resultados positivos, que podem ser obser
vados na conformao e desempenho dos touros campees nacio
nais dos EUA em 1960 e 1990 (Figura9), algumas restries limi
tam o ganho gentico anual em diversas caractersticas. A eficincia
de seleo bastante baixa em caractersticas de baixa herdabilidade
(fertilidade), de difcil mensurao ou que no podem ser diretamente
mensuradas (resistncia a doenas, rendimento de carcaa e eficin
cia alimentar), ou que apresentam correlaes genticas negativas
(ganho de peso psdesmama e idade ao primeiro parto) (Figura10).
Progresso gentico obtido em Angus
1960
1990
Melhoramento tradicional
Avaliao da variao fenotpica para
predizer o valor gentico (DEPs - diferena
esperada na progenie).
Figura9. Melhoramento gentico tradicional.
596
MAS Vantagens para bovinos de corte

Interessante para caractersticas de:
Mdia-baixa herdabilidade (ex.: fertilidade).
Limitadas ao sexo (ex.: produo de leite).
Avaliao tardia (ex.: intervalo entre partos).
Avaliao Post-Morten (ex.: qualidade e rendimento de carcaa).
Avaliao difcil/cara (resistncia a doenas, eficincia alimentar).
Figura10. Caractersticas interessantes para aplicao de MAS.
A aplicao da gentica molecular poder contribuir para suplan

tar algumas dessas limitaes. A capacidade de dissecar caracters
ticas complexas em entidades mendelianas e estimar os efeitos des
ses segmentos cromossmicos (QTL), ou genes mapeados, permitir
aumentar a eficincia de seleo pela utilizao dessas informaes
em programas de Seleo Assistida por Marcadores MAS (Marked
Seleo
Auxiliada
por Marcadores
Assisted Selection)
na predio
do valor
gentico (Figura11).
Genes
Fentipos
Marcadores
Variao em caracteres
de importncia econmica
Caixa Preta
Para se utilizar MAS necessrio identificar variao genotpica

determinante ou associada a variao fenotpica em
caractersticas de importncia econmica.
Figura11. Seleo auxiliada por marcadores.
O ganho gentico anual poderia ser elevado tanto pelo aumento da

acurcia quanto pela reduo do intervalo de gerao (Figura12). A
597
biotecnologia
acurcia dos valores gentico preditos poderia ser incrementada pelo

ao aumento na quantidade e qualidade de informao, especialmente
para o caso de irmos completos gerados por transferncia de embri
es, enquanto o intervalo poderia ser reduzido pela seleo precoce
dos animais ou at de embries (Figura13).
Seleo Auxiliada por Marcadores
G = Ganho gentico anual

j
R
L
j
j
ir
IH
j
r = Acurcia de seleo (informao)

L = Intervalo de gerao (pr-seleo ou seleo em idade jovem)
Figura12. Incremento no ganho gentico anual pelo aumento da acurcia

ou reduo do intervalo entre geraes.
MAS - Vantagens para bovinos de corte

Aumento da acurcia (mais informao) especialmente para animais jovens sem
dados de desempenho prprio ou prognie.
Pre-seleo para reduo do intervalo de gerao e (ou) reduo de custos.
Seleo de tourinhos jovens para teste de prognie.
Novilhas (pr-puberes) para FIV.
Embries (bipsia, genotipagem e transplante).
Irmos completos (sunos, aves, FIV, TE).
Figura13. Aplicao de MAS para aumentar ganho gentico anual.
598
Novas possibilidades para seleo concomitante para caractersti

cas correlacionadas, implementao de sistemas de acasalamento para
otimizar componentes genticos noaditivos (dominncia e epista
sia), introgresso de genes desejveis a partir de outras raas ou ban
cos de germoplasma (SOLLER; BECKMANN, 1983; BEEVER etal.,
1990; ROCHA etal., 1992; BINK; ARENDONK, 1994), utilizao de
marcadores genticos em gado de corte (RUSSO; KLEIN, 2007) e sele
o genmica em gado de leite (WIGGANS etal., 2009) esto sendo
avaliadas por diversos pesquisadores.
O termo Iluso Aditiva foi utilizado por Rocha etal. (1994) ao se
referir a um otimismo exagerado com relao possibilidade de utili
zao de MAS. Esses autores afirmam que os fenmenos biolgicos,
na maioria das vezes, no so aditivos, ou seja, genes no devem ser
classificados como bons ou ruins. Somente o gentipo pode ser clas
sificado dessa forma e, ainda assim, somente em relao determi
nada condio ambiental. A inconsistncia de resultados obtidos de
associao entre caractersticas importncia econmica d suporte a
esse ponto de vista.
A utilizao de marcadores moleculares deve ser avaliada distin
guindo os tipos I e os II. A seleo de polimorfismos genticos com
efeito direto na caracterstica de interesse (marcadores tipo I), gera
dos pela utilizao do procedimento do gene candidato, conhecida
por seleo auxiliada por genes (GAS). Esta possui potencial maior
de aplicao em relao aos marcadores tipo II, conhecido por MAS
verdadeira, com efeito indireto devido ligao entre o marcador e
o QTL (NOTTER, 1995).
Algumas limitaes ao uso de MAS verdadeira so:
1) Complexidade das metodologias estatsticas;
2) A associao entre um alelo marcador e o QTL pode variar
entre e dentro de populaes, e, por essa razo, a MAS verda
deira deve ser empregada primordialmente dentro de famlia
em que a associao foi avaliada (NOTTER, 1995);
3) O marcador deve estar distante do QTL entre 1 cM e 2 cM,
para evitar indivduos recombinantes. Quanto mais distante o
marcador, maior a necessidade de verificao da associao a
cada gerao (SMITH; SMITH, 1993);
599
biotecnologia
4) As caractersticas de importncia econmica possuem herana

polignica, ou seja, so controladas por um grande nmero de
QTL, de pequeno efeito cada. Entretanto, uma quantidade
considervel da variabilidade gentica pode ser determinada
por um nmero relativamente pequeno de QTL de grande
efeito, tambm conhecidos por Major Genes. Exemplos
incluem o gene Miostatina causativo da musculatura dupla
(hipertrofia muscular) em algumas raas bovinas (NOTT;
ROLLINS, 1979), gene DGAT para componentes do leite e gene
boroola em ovinos (PIPER; BINDON, 1988).
Apesar das limitaes, GAS est sendo empregada para identifi
car gentipos superiores e detectar portadores de doenas heredit
rias, como a Sndrome do Estresse em Sunos PSS (RASMUNSEN;
CHRISTIAN, 1976), Deficincia de Adeso Leucocitria BLAD
(SHUSTER etal., 1992), resistncia a doenas infecciosas, como tripa
nossonomase (DELESPAUX etal., 2003) em bovinos. Caractersticas
de herana simples, determinadas por um nmero pequeno de loci,
como presena de chifres e colorao de pelagem, tambm vm
sendo avaliadas por meio de marcadores (GEORGES etal., 1993 a, b;
SCHMUTZ etal., 1995), assim como para caractersticas de herana
complexa de importncia econmica em que GAS j comea a ser uti
lizada em sunos com a disponibilizao de marcadores como RyR1
receptor do alotano, RN Rendement Napole, ESR receptor de estr
geno, MCR4 receptor da melanocortina 4 e HFABP protena do
tipo cardaco acopladora de cido graxo (Tabela 4) (MATHUR, 2003);
em bovinos com a disponibilizao de marcadores, como, por exem
plo Miostatina (MSTN), Calpastatina (CALP) e Tiroglobulina para
melhoramento da maciez e marmorizao da carne (BROBET etal.,
1997, 1998; RUSSO; KLEIN, 2007) DGAT para componentes do leite
(GROBET etal., 1998, 1997) e GS para 27 caractersticas de interesse
em bovinos leiteiros (VANRADEN etal., 2009).
Tabela 4. Marcadores para sunos.
RYR1 (Alotano)
RN (Rendement Napole)
15 Glicognio, pH, perda de gua cozimento
Qualidade de carne (magra e PSS)
ESR (Rec. de Estrgeno)
PRLR (Rec. de Prolactina)
16 Tamanho de leitegada, habilidade materna
Retino Binding Prot.
14 Tamanho de leitegada
Tamanho de leitegada
Continua...
600
RYR1 (Alotano)
Qualidade de carne (magra e PSS)
MC4R (Rec. Melanocortina 4)
Apetite e deposio de gordura
IGF2
Leitegada e rendimento de carcaa
HFABP
Gordura intramuscular
CKIT rec.
Colorao de pelagem
Fonte: Mathur etal., 2003.
Seleo genmica
Seleo Genmica (Genomic SelectionGS) se refere seleo
de reprodutores com base somente em valores genticos genmi
cos (Genomic Estimated Breeding Values GEBV) e est revolucio
nando o melhoramento de gado de leite. Os GEBVs so calculados
como a soma dos efeitos dos marcadores, ou hapltipos desses mar
cadores, distribudos ao longo do genoma com altssima densidade,
e, dessa forma, permite, teoricamente, a captura de todos os QTL,
contribuindo para a varincia gentica de uma caracterstica. Os efei
tos dos QTL, inferidos a partir dos marcadores ou hapltipos, so pri
meiramente estimados em grandes populaes referncia com dados
fenotpicos e genotpicos coletados. Somente dados genotpicos so
necessrios para as geraes subsequentes. As acurcias dos GEBVs
preditos por GWA foram avaliadas em experimentos nos EUA, Nova
Zelndia, Austrlia e Holanda utilizando populaes referncia de
650 a 4.500 touros com teste de prognie e gentipos de aproxima
damente 50.000 marcadores. Os resultados indicam acurcias para
GEBV para tourinhos jovens, sem teste de prognie, variando de 20%
a 67% e so dependentes das herdabilidades das caractersticas, do
nmero de touros na populao referncia e do mtodo estatstico.
As acurcias dos GEBV foram significativamente superiores a valores
genticos estimados como a mdia dos EBVs dos progenitores, que
o critrio utilizado para seleo de tourinhos para entrar em teste
de prognie, gerando uma expectativa que a utilizao de GS poder
aumentar ganho gentico anual em mais de 100%.
Mtodos tradicionais de seleo, como as predies Best Linear
Unbiased Prediction (Blup) a partir de meioirmos e irmos comple
tos, que aumentam o ganho gentico pelo aumento da acurcia, leva
601
biotecnologia
ram tambm a um aumento na taxa de endogamia por gerao. Esse

no necessariamente o caso para a GS, que tambm aumenta o pro
gresso gentico pelo aumento da acurcia. A GS gera acurcias mais
elevadas para os valores genticos a partir de melhores predies dos
componentes mendelianos (segmentos cromossmicos segregando
nas diversas prognies da populao) dos valores genticos. Com isso
h um aumento na capacidade de diferenciao entre irmos e, con
sequentemente, reduo na cosseleo desses e no aumento da taxa
de endogamia por gerao. A alta acurcia da GS deve reduzir a vari
ncia entre famlias e reponderar os valores genticos dos indivduos
em direo a segregao dos componentes mendelianos. Alm disso,
as correlaes intraclasse de irmos induzida pela estimao devem
ser menores em GS levando a uma maior reduo da cosseleo de
irmos quando comparada a seleo com Blup. Os autores concluem
que a predio de GEBV permite um ganho gentico mais elevado e ao
mesmo tempo reduzem o aumento na taxa de endogamia por gerao,
quando comparada seleo com Blup (DAETWYLER etal., 2007).
Diversos desafios da GS e sua implementao continuam presen
tes, incluindo o aumento das acurcias das GEBV, integrao das
informaes genmicas e aumento da populao referncia, planeja
mento de ganho gentico no longo prazo e integrao com biotecno
logias da reproduo para se maximizar o ganho proveniente da sua
utilizao (HAYES etal., 2009; GODDARD; HAYES, 2009).
Introgresso gentica e velogentica

Marcadores moleculares podem ser utilizados para realizar intro
gresso gentica, reduzindo o nmero de geraes necessrias para
isolar o gene exgeno de interesse no genoma que se deseja melho
rar, alm do intervalo entre geraes (TANKSLEY; RICK, 1980;
COUTINHO; REGITANO, 1995). Introgresso gentica foi proposto
por Hillel etal. (1990), empregando DNA fingerprinting com son
das minissatlite, retrocruzamentos e seleo dos reprodutores que
possuam mxima semelhana no padro de bandas para a linhagem
receptora.
Introgresso Auxiliada por Marcadores, Marker Assisted Introgression
(MAI) foi conduzida por Koudand etal. (2003) para se transferir trs
602
QTL para tolerncia a tripanossonomase de uma linhagem doadora

de ratos (C57BL/6) em uma linhagem recipiente (A/J) e avaliar a efici
ncia do mtodo no tempo de sobrevivncia dos animais. Uma popula
o F2 foi gerada por retrocruzamento por quatro geraes para o QTL
da linhagem doadora. Aps essa fase, indivduos portadores dos QTL
de interesse foram acasalados por intercruzamentos para a seleo de
homozigotos tolerantes. Posteriormente, os animais foram agrupa
dos de acordo com os gentipos dos QTL nos cromossomos 1, 5 e 17 e
desafiados com Trypanosoma congolens. Animais que possuam os QTL
favorveis apresentaram melhor tempo de sobrevivncia em compara
o linhagem receptora, mas nenhuma delas atingiu o nvel de tole
rncia da linhagem doadora. Os efeitos estimados para os QTL aps
introgresso foram aproximadamente 30% inferiores que a popula
o original em que as associaes foram estimadas (Figuras 14 e 15).
Programa de introgresso de QTL
QQ
Populao
doadora
qq
Populao
receptora
Qq F1
qq R
Qq RC1
qq R
Qq RCn-1
qq R
Qq RCn
Qq RCn
Alelo Q = Resistncia
tripanossonomase
Zebu Africano
Europeu
Retrocruzamentos
-Recuperar genoma - R
-Manter QTL - D
MAS LD
IC 1
IC 1
IC 2
IC 2
Intercruzamentos
-Fixar o QTL - QQ
Populao receptora melhorada QQ*
Figura14. Programa de introgresso de QTL.

Fonte: Adaptado de Koudand etal., 2003.
603
biotecnologia
Programa de introgresso de QTL

Gentipos
Gentipos
Cruzamento
Prognie
Prognie
Freq. Q
Selecionados
% Genoma R
DXR
F1
Qq
0,5
Qq
50
F1 X R
BC1
Qq/qq
0,5
Qq
75
BC1 x R
BC2
Qq/qq
0,5
Qq
87,5
BC2 x R
BC3
Qq/qq
0,5
Qq
93,75
BC3 x R
BC4
Qq/qq
0,5
Qq
96,88
BCn X BCn
IC1
QQ/Qq/qq
0,5
QQ(+Qq)
99,?
IC1 x IC1
IC2
QQ/Qq/qq
>0,5
QQ(+Qq)
99,?
ICk X ICk
ICk+1
QQ/Qq/qq
>0,5
QQ(+Qq)
99,?
Populao receptora melhorada QQ*
Figura15. Cruzamentos, frequncia do QTL e porcentagem do genoma da

linhagem doadora.
Fonte: Adaptado de Koudand etal., 2003.
A introgresso, seja por MAS ou GAS, assim como a GS, podem

ser acelerada ainda mais com a aplicao de velogentica (MASSEY;
GEORGES, 1992), em que embries obtidos a partir de fetos, com
aproximadamente 180200 dias, podem ser avaliados por intermdio
de tcnicas de MAS, GAS ou GS, seus ovcitos coletados, maturados,
fertilizados in vitro e transferidos para se repetir o ciclo. Outra possi
bilidade a whizzogentica em que a avaliao genmica se d em
embries que so selecionados para produo in vitro de gametas.
Nesse caso, embries selecionados por MAS, GAS ou GS so estimu
lados, em cultivo in vitro, para entrar em meiose e gerar gametas, que
so ento fertilizados e os novos embries produzidos so novamente
selecionados empregando somente informao genmica. O processo
conhecido por Whizzogentica pode ser repetido at a obteno do
gentipo desejado quando se realiza clonagem para gerar embries
para implantao e permite a reduo do intervalo entre geraes ao
extremo de 7 dias (Figuras 16, 17 e 18) (HARLEY; VISSCHER, 1998).
604
Figura16. Cultivo celular e seleo auxiliada por marcadores. (a) Velogentica:

novilhas so selecionadas in tero por MAS, ovcitos coletados, maturados e
implantados e repetese o ciclo; (b) Velogentica nuclear: embries so culti
vados in vitro e selecionados por MAS, clonados, transferidos, ovcitos cole
tados in tero, maturados, fertilizados e implantados para repetir ciclo; (c)
Whizzogentica: embries cultivados in vitro, selecionados por MAS, cultivos
estimulados para entrar em meiose, gametas so ento fertilizados e embri
es selecionados por MAS. O processo repetido at a obteno do gentipo
desejado quando se realiza clonagem para gerar embries para implantao.
Fonte: Adaptado de Harley e Vischer, 1998.
605
biotecnologia
Velogentica e Whizzogentica
Estimar efeito de marcadores, hapltipos, ou Segmentos Genmicos.
1a gerao:
1 - Genotipar Embries
2 - Selecionar Embries Superiores
3 - Induzir MeioseOcitos e espermatozoides
4 - Fertilizao in vitro
5 - Maturao in vitro,
2a gerao:
Genotipagem, Seleo, Meiose, Fertilizao, entre outros.
Quantas Geraes? Linkage e Acurcia.
Repetir estimao de efeitos de marcadores, hapltpos ou segmentos
genmicos (densidade do mapa de SNPs, nmero de animais e
geraes na famlia referncia).
Figura17. MAS empregando velogentica ou whizzogentica.
Reduo do intervalo entre geraes

Monta natural L = mnimo 2,5 anos (> 4-5anos)
Velogentica L = 3 a 6 meses
Whizzogentica L < 1 semana!!!
Figura18. Intervalo entre geraes em bovinos em monta natural, empre

gando velogentica ou whizzogentica.
Estudos filogenticos e populacionais

O conhecimento e ferramentas gerados com o progresso da gen
tica molecular tm se mostrado muito eficientes em estudos filogen
ticos e populacionais, aumentando a capacidade de identificar novas
espcies, caracterizar a biodiversidade dos variados ecossistemas,
assim como inferir a variabilidade gentica intra e interpopulacional
de animais domsticos de importncia econmica, assim como de
animais silvestres. Adicionalmente, esse conhecimento e ferramentas
podem auxiliar no controle sobre os nveis de endogamia em deter
minada populao. O controle da endogamia de suma importncia
no planejamento de programas de conservao de espcies ou raas
adaptadas, ou em programas de melhoramento gentico animal que
visem tambm ao ganho gentico no longo prazo.
606
A anlise de variao gentica empregando mtodos de gentica

molecular , em muitos casos, mais eficiente na discriminao de
subdivises populacionais intraespecficos do que a biometria mor
folgica. Genes mitocondriais e Yespecfico, por possurem herana
exclusivamente materna e paterna respectivamente (so transmitidos
somente por fmeas ou machos), alm de apresentarem padro de
herana no Mendeliana (sofrerem eventos de recombinao), cons
tituem interessantes marcadores genticos em estudos filogenticos.
Esses marcadores podem fornecer informao necessria para verifi
cao da taxonomia, estimativas de distncias genticas, discrimina
o de subpopulaes, identificao de linhagens maternas e paternas,
assim como para investigar a histria biogeogrfica de determinado
txon ou populao. Por outro lado, marcadores nucleares microssa
tlites, em razo da alta frequncia, distribuio e polimorfismo, so
muito eficientes na estimao de distncias genticas, discriminao
de subpopulaes, mas, sobretudo, em estudos que envolvem segre
gao de alelos, como teste de paternidade e identificao individual
(ERIKSSON etal., 2006; GARRIGAN; HAMMER, 2006).
O uso combinado das diversas categorias de marcadores e sofistica
das metodologias estatsticas tem se mostrado bastante eficientes na
identificao de espcies, discriminao de subespcies, subpopula
es ou raas, estimao de distncia gentica entre populaes, esti
mao de relaes parentesco entre indivduos mantidos em cativeiro
ou em vida livre, estudos evolucionrios de biogeografia e padres
de migrao (LOFTUS etal., 1994; ZHIVOTOVSKY; GOODMAN,
1998; JOHNS; AVISE, 1998; ARBOGAST, 1999; SEIESTAD etal.,
1999; HAMMER etal., 2001; SPRINGER etal., 2001; TOZAKI etal.,
2001; ICHIKAWA etal., 2001; LANDRY etal., 2002, YU; PENG, 2002;
CAVALISFORZA; FELDMAN, 2003; DENISE etal., 2003; FOKIDIS
etal., 2003; WILDER etal., 2004a; WILDER etal., 2004b; GARRIGAN;
HAMMER, 2006; TORO etal., 2009).
Marcadores mitocondriais
Mitocndrias so organelas citoplasmticas encontradas na grande
maioria dos organismos eucariotos. Elas so usualmente descritas
como casa de fora celular, visto que so responsveis pela produ
o de ATP via fosforilao oxidativa. Os eucariotos surgiram da inte
607
biotecnologia
rao de comunidades de clulas, de maneira que essa organela pode

ter surgido a partir da captura e incorporao de uma protobact
ria endossimbionte por um hospedeiro eucaritico com ncleo, com
semelhana a um protista (LANG etal., 1997; GRAY etal., 1999).
O DNA mitocondrial (mtDNA) de mamferos um genoma cito
plasmtico (extra nuclear), que contm, basicamente, alguns dos
genes essenciais ao processo celular de fosforilao oxidativa. Os
genes mitocondriais apresentam uma taxa de fixao de mutaes
(modificaes) quatro vezes superior, quando comparados aos nucle
ares, alm de estarem presente em quase todos os eucariotos e possu
rem herana exclusivamente materna, e, por essas razes, tornaramse
comuns em estudos filogenticos e evolucionrios (MARGULIS,
1996; AVISE, 2000; GRAY etal., 2004; BULLERWELL; GRAY, 2004).
A regio controle, que inclui Dloop e a sequncia hipervarivel
(HVS), e os genes citocromo B (CytB) e citocromo C oxidase I (COI)
tm sido os mais empregados na identificao de espcies, discrimi
nao de subespcies, estudos de evoluo e domesticao, caracteri
zao de raas e alteraes demogrficas recentes em bovinos, sunos,
aves e ovinos, entre outras espcies animais (LOFTUS etal., 1994;
GIUFFRA etal., 2000; HIENDLEDER etal., 2002; LEONARD etal.,
2002; BRUFORD etal., 2003; WU etal., 2003; JOSHI etal., 2004;
MEADOWS etal., 2005).
Um projeto internacional conhecido DNA Barcoding of Live
(http://www.barcoding.si.edu/DNABarCoding.htm) foi implantado
recentemente com o objetivo de sequenciar 648 pb do gene citocromo
C oxidase, subunidade 1 (COI) como ferramenta de auxlio na cata
logao da biodiversidade e em taxonomia. Os cdigos de barra
baseados em sequncias COI so eficientes na identificao de esp
cies, uma vez que esse gene est presente em praticamente todos
os organismos eucariotos, bastante conservado entre organismos
dos mais diversos txons, e suficientemente diferenciado entre esp
cies para apresentam padro de sequncia barcode espcieespe
cficos (TAUTZ etal., 2003; WILSON, 2003; BLAXTER etal., 2005;
SCHINDEL etal., 2005; RUBINOFF etal., 2006).
Por esses motivos, alm de ferramenta para a catalogao de esp
cies, os cdigos de barra de DNA podem ser teis na identificao de
608
espcies em qualquer estgio de desenvolvimento e na separao de

espcies crpticas ou com taxonomias complexas ou pouco estuda
das (HEBERT etal., 2003b; MONAGHAN etal., 2005; SAVOLAINEN
etal., 2005; WITT etal., 2006, FOUQUET etal., 2007; TAVARES;
BAKER, 2008), como possivelmente o caso do veado mateiro
(Mazama americana) e do caititu (Pecari tajacu) (GROVES; GRUBB,
1993; GONGORA etal., 2006; DUARTE etal., 2008).
O desenvolvimento tecnolgico, por outro lado, possibilitou tam
bm um incremento significativo na escala de gerao de dados, com
a avaliao de um nmero maior de amostras com reduo de cus
tos e tempo, possibilitando avano importante em estudos de din
mica populacional em resposta a diversos estmulos ambientais. Os
cdigos de barras vm sendo utilizados inclusive para avaliar a din
mica populacional de peixes, insetos bentnicos, minhocas e crus
tceos, entre outros, em resposta contaminao do solo e gua por
resduos de herbicidas, fungicidas e minerao, com o objetivo de
identificao de bioindicadores para monitoramento ambiental, por
exemplo (GASTON; ONEIL, 2004; MARKMANN; TAUTZ, 2005;
MONAGHAN etal., 2005; HERRERA etal., 2007; FICETOLA etal.,
2008; BERKOV, 2009; OTOMO etal., 2009; VALENTINI etal., 2009).
A anlise da sequncia completa dos genomas mitocondriais de bovi
nos taurinos e zebunos permitiu a identificao de 237 polimorfismos
e estimao de um tempo de divergncia de aproximadamente 1,7
2,0 milhes de anos entre essas espcies (HIENDLEDER etal., 2008).
Quatro linhagens maternas de bovinos foram identificadas a partir
da anlise combinada de 248 sequncias Dloop de diversas raas,
alm de 32 exemplares arqueolgicos do bovino primitivo auroque
(Bos primigenius). Diversos eventos de domesticao e um status de
subespcie para as raas taurinas (Bos primigenius taurus) e raas
indianas (Bos primigenius indicus) foram inferidas a partir das distn
cias genticas estimadas.
Marcadores de mtDNA foram utilizados por Meireles etal. (1999)
para analisar a contribuio de gado taurino na formao das raas
zebunas Gir, Nelore e Brahman. Participao majoritria de matriar
cas de origem taurina na formao do Zebu PO americano foi
demonstrada pelos autores, uma vez que 79% dos animais Nelore,
609
biotecnologia
73% Gir e 100% Brahman analisados apresentaram mtDNA de ori

gem taurina. Os resultados so condizentes com a raa ter sido for
mada por cruzamentos absorventes mediados por machos zebunos
acasalados com fmeas de origem Ibrica. O mesmo no se pode
dizer dos resultados de 26% e 25% de mtDNA taurino obtidos para
animais Nelore e Gir POI, respectivamente, raas supostamente de
origem exclusivamente zebuna.
Comparao de sequncias de mtDNA foi aplicada a pratica
mente todas as principais espcies domsticas de produo (ex.:
FERNNDEZ etal., 2006; LARSON etal., 2007; MEADOW etal.,
2007; KANGINAKUDRU etal., 2008; NADERI etal., 2008). Foram
identificados cinco agrupamentos de hapltipos maternos (A, B, C,
D e E) em ovinos. Hapltipos A foram identificados, sobretudo, em
raas asiticas, hapltipos B predominantemente em europeias e
os haplogrupos restantes em menor frequncia no continente asi
tico (HIENDLEDER etal., 2002; WU etal., 2003; GUO etal., 2005;
MEADOWS etal., 2005; PEDROSA etal., 2005 e MEADOWS etal.,
2007), apesar de que alto nvel de migrao ser observado entre as
raas de diversas regies (MEADOWS etal., 2005).
Trs linhagens principais de ovinos (A, B e C), j descritas anterior
mente, foram identificadas pela Anlise do mtDNA, Dloop e HVS,
de 48 raas, e, alm dessas, foi identificada uma quarta linhagem
D (TAPIO etal., 2006). Paiva etal. (2005) observaram a presena
das quatro linhagens maternas principais no Cucaso, trs (A, B e C)
na sia central, duas (A e B) na Europa ocidental. Os autores pude
ram concluir que a linhagem A foi a primeira a ser domesticada no
oriente mdio, migrando posteriormente para todas as outras regies.
A expanso do hapltipo B envolveu populaes da Europa ocidental
aproximadamente 3.000 anos aps domesticao de A. A distribui
o de A indica que o Oriente Mdio foi a origem de domesticao
dos ovinos. Hapltipos B podem ser observados em ovinos selva
gens europeus mouflon, sugerindo domesticao independente ou
sua introgresso em populaes domsticas. Os haplogrupos C e
D, provavelmente, foram introduzidos posteriormente, mas uma
amostragem maior necessria para se inferir a origem geogrfica.
610
Cromossomo Y
Os cromossomos sexuais dos mamferos so bastante divergentes e
heteromrficos. O cromossomo X mais longo e denso em genes em
comparao com o cromossomo Y, que curto e degenerado. A teoria
atualmente mais aceita que o Y descende de um protocromossomo
Y, homlogo ao X. A falta de recombinao entre estes considerada o
fator determinante da perda de genes pelo cromossomo Y (degenera
o) (GVOZDEV etal., 2005; ELLIS; AFFARA, 2006; GRAVES, 2006).
O cromossomo Y consideravelmente menor do que os outros cro
mossomos (60Kb) e contm 178 genes em humanos (SKALETSKY
etal., 2003), sendo 45 destes codificadores de protenas, em que a
maioria controla funes machoespecficas como espermatognese,
e vrios pseudogenes (LAHN; PAGE, 1997). Ele possui sequncia de
DNA altamente repetitiva, mltiplas cpias do mesmo gene arranja
dos em sequncia (in tandem) e regies palindrmicas (TOURE etal.,
2005; BACHTROG, 2006; GRAVES, 2006). Segmentos sequencia
dos em diversos mamferos apresentaram baixo nvel de diversidade
nucleotdica (HELLBORG; ELLEGREN, 2004; MEADOWS etal., 2004;
MEADOWS etal., 2006).
A identificao de linhagens paternas, estudos de dinmica popu
lacional e biogeografia so facilitados, entre outros fatores, pela ava
liao do estado haploide dos alelos e na ausncia de recombinao
XY. Marcadores Yespecfcos se mostraram eficiente em estudos glo
bais de expanso e disperso de populaes humanas (DENG etal.,
2004). Anlise de mtDNA e cromossomo Y foi utilizada por Eriksson
etal. (2006) para avaliar a magnitude da disperso efetiva de machos e
fmeas e investigar a histria demogrfica de bonobos. Foi observada
uma diferenciao maior do cromossomo Y em relao ao mtDNA,
o que esperado para espcies em que a disperso mediada princi
palmente por fmeas.
A investigao de linhagens paternas tambm importante em
espcies domsticas, uma vez que a taxa reprodutiva muito mais
elevada em machos, e j revelou aspectos fascinantes relacionados
domesticao dos animais. Sondas Yespecfico desenvolvidas por
Bradley etal. (1994) permitiram a discriminao entre raas bovinas
zebunas e taurinas. Microssatlites localizados no cromossomo Y que
611
biotecnologia
apresentam alelos especficos para zebu, e consequentemente apro

priados para estudos evolutivos em gado e espcies relacionadas foram
desenvolvidos por Edwards etal. (2000). A utilizao desses marca
dores evidenciou padres de introgresso mediadas por machos em
populaes de gado da frica (MACHUGH etal., 1997; HANOTTE
etal., 2000; FREEMAN etal., 2004). Mannen etal. (2004) tambm
observaram padro similar de introgresso mediada por machos na
formao de vrias raas Japonesas, Coreanas e da Monglia.
Marcadores microssatlites
Microssatlites, tambm conhecidos por STRs short tandem
repeats ou VNTRs variable number of tandem repeats, so regies
do genoma extremamente repetitivas e polimrficas (MIESFELD
etal., 1981; HAMADA etal., 1982; JEFFREYS etal., 1985a; JEFFREYS
etal., 1985b; GEORGES etal., 1988). Microssatlites autossmicos,
por causa de sua heterozigosidade, disperso no genoma e facilidade
de genotipagem por PCR, foram muito empregados em estudos que
envolvem a anlise da transmisso de alelos de marcadores ou hapl
tipos. Mapas genticos contendo milhares de marcadores j esto
disponveis para diversas espcies, incluindo ovinos (VAIMAN etal.,
1996; MADDOX etal., 2001; BERALDI etal., 2006), bovinos (BISHOP
etal., 1994; BARENDSE etal., 1997; KAPPES etal., 1997) e sunos
(ARCHIBALD etal., 1995; ROHRER etal., 1996; GUO etal., 2009).
Esses marcadores moleculares continuam sendo extensivamente
utilizados em estudos de diversidade gentica, na identificao/ ras
treabilidade, testes de paternidade, assim como no mapeamento de
caracteres quantitativos de importncia econmica (ARRANZ etal.,
1998; DIEZTASCON etal., 2000; ARRANZ etal., 2001; COLTMAN
etal., 2001; MCRAE etal., 2002; DENISE etal., 2003; ALVAREZ etal.,
2004; BARRILET etal., 2005; TAPIO etal., 2005; ALVAREZ etal.,
2006; UZUN etal., 2006).
O polimorfismo de 14 marcadores microssatlites foi avaliado, em
238 animais, para inferir as relaes histricas e as contribuies exis
tentes entre seis raas de ovinos do norte da Espanha (ALVAREZ etal.,
2004). Os autores observaram uma populao bastante estruturada
em razo da origem ancestral distinta e da pequena taxa de migrao
recente. As raas Blackfaced, Latxa e Churra, independentemente da
612
similaridade fenotpica, apresentaram perfis genticos caractersti

cos, indicando origem ancestral independente. As raas Blondefaced
Latxa, Rubia Del Molar e Xalda, provavelmente mais relacionadas,
apresentaram coeficientes admixture negativos, indicando origem
comum e divergncia recente.
Microssatlites foram utilizados por Tapio etal. (2005) para ava
liar a contribuio de populaes nativas para a diversidade gentica,
diversidade de alelos e distncia gentica entre raas de ovinos do
norte da Europa, assim como o efeito da endogamia na contribuio
de cada raa para a variabilidade gentica total. Os resultados indica
ram uma populao fundadora fragmentada em populaes isola
das e um tamanho efetivo populacional (Ne) decrescente ao logo do
tempo especialmente para as raas Grey Finnish Landrace e Ruhnu.
Os autores sugeriram que poro considervel das raas com contri
buio para diversidade gentica acima da mdia so raas locais e
perifricas com tamanho mximo de 1.000 ovelhas. Esse resultado
indica que a conservao dessas raas seria a maneira mais eficiente
de se manter a diversidade gentica total.
As relaes genticas entre cinco raas de ovinos da Turquia foram
avaliadas por Uzun etal. (2006) a partir do polimorfismo observado em
225 animais. Os autores observaram alta variabilidade inter e intrarra
cial com separao evidente das raas fat tail Tuj, Morkaraman (Red
Karaman) e Akkaraman (White Karaman) em relao s outras raas
estudadas. Outra interessante inferncia foi proporcionada pela an
lise conjunta do mtDNA obtida de outros experimentos e microssa
tlites. As raas Morkaraman e Akkaraman apresentaram hapltipos
de mtDNA distintos, mas perfil de microssatlites muito similares.
A raa Akkaraman, nativa da Turquia, apresentou predominncia do
hapltipo C, enquanto, na Morkaraman, prevaleceu o hapltipo
mtDNA A (hapltipo asitico). Esses resultados indicam uma popu
lao fundadora distinta (origem materna), e cruzamentos posteriores
mediados por machos. As raas Tuj e Hemsin, por outro lado, dife
riram com relao s frequncias dos microssatlites, mas apresen
taram hapltipos de mtDNA semelhantes. A origem materna deve
ser similar, o que est de acordo com a localizao geogrfica, mas a
raa Tuj deve ter recebido considervel introgresso de outras raas
fat tail, alm de raas caucasianas, por cruzamentos mediados por
613
biotecnologia
machos. Os autores concluem que os microssatlites e mtDNA for

necem informaes complementares e, quando utilizados em combi
nao, podem ajudar na correta avaliao da origem e relaes gen
ticas entre as raas modernas de ovinos.
Mariante etal. (2009) avaliaram diversas raas brasileiras de esp
cies domsticas de produo e pode observar uma alta variabilidade
gentica das raas naturalizadas em relao s raas comerciais/espe
cializadas, alm de endogamia superior para as espcies sunas e equi
nas, quando comparadas as demais (Tabela 5).
Tabela 5. Diversidade Gentica observada em cinco estudos com raas
naturalizadas e comerciais brasileiras a partir de marcadores micros
satlites.
Espcie
Bubalinos
Bovinos
Eqinos
Ovinos
Sunos
N
382
915
328
383
182
No raas (raas naturalizadas)

05
10 (8)
07 (05)
10 (05)
05 (03)
No Locos
14
22
11
19
24
He
0.686
0.816
0.875
0.775
0.702
AM
10.07
13.18
14.36
10.84
10.00
FIS
0.224
0.086
0.204
0.015
0.114
Amova (%)
11.91*
11.87
12.37*
11.76*
15.73*
* p<0.001.
N= nmero indivduos; He= heterozigosidade esperada; AM= nmero mdio de alelos; FIS=
coeficiente de endogamia intrapopulacional; Amova (%)= Anlise varincia molecular, porcen
tagem de variao entre as raas analisadas em cada espcie.
Fonte: Adaptado de Mariante etal. (2009).
SNPs
Variaes pontuais na cadeia de nucleotdeo (SNPs) so polimor
fismos considerados muito promissores para estudos evolucion
rios, ecolgicos ou de conservao, uma vez que informao sobre a
sequncia genmica se torne disponvel para um nmero maior de
espcies (SEDDON etal., 2005; MARRIS etal., 2009).
Por serem marcadores geralmente biallicos, SNPs so menos poli
mrficos do que microssatlites, entretanto SNPs so extremamente
freqentes e, consequentemente, existe um aumento substancial no
nmero de loci disponveis para as diversas espcies (BRUMFIELD etal.,
2003). Alm disto, a dinmica mutacional mais simples dos SNPs gera
uma taxa menor de homoplasia, e, por outro lado, podem ser geno
614
tipados a baixo custo e em larga escala (SYVNEN, 2001; VIGNAL

etal., 2002; BRUMFIELD etal., 2003; CHEN; SULLIVAN, 2003;
SCHLTTERER, 2004).
O estudo de SNPs em populaes de organismos no modelo, como
animais silvestres, relativamente recente e pouco frequente (MORIN
etal., 2004). Apesar de alguns estudos terem avaliado o potencial te
rico de SNPs na inferncia da histria biogeogrfica e relaes entre
indivduos (KUHNER etal., 2000; GLAUBITZ etal., 2003), a aplica
o dos SNPs em estudos ecolgicos ou de conservao est limitado
a poucos exemplos com poucos loci marcadores (BENSCH etal., 2002;
BELFIORE etal., 2003). Entretanto, o recente desenvolvimento de pro
gramas de sequenciamento gentico que utilizam equipamentos de
segunda gerao vem aumentando significativamente a velocidade
de sequenciamento de genomas a um custo significativamente mais
baixo, o que pode levar a superao desse gargalo.
Os resultados apresentados na literatura evidenciam que mar
cadores moleculares diversos (microssatlites, SNPs, mtDNA e
Yespecfico) geram dados distintos e complementares que podem
ser utilizados para inferir diferentes aspectos da evoluo e funcio
namento dos genomas. Esses podem ser utilizados para inferir a ori
gem, identificar espcies, diferenciar subespcies ou raas, identificar
linhagens paternas e maternas, alm de permitir inferir variabilidade
gentica entre e intrapopulacional de animais domsticos adaptados
e tambm em vida livre.
Conservao e manejo de recursos genticos

A conservao de raas ou espcies ameaadas dependente pri
mordialmente da obteno de taxa reprodutiva adequada, e pode ser
maximizada pelo correto acasalamento entre indivduos, dentro de
subespcie ou raa, objetivando maximizar a diversidade total da esp
cie, e, ao mesmo tempo, minimizar o parentesco entre os mesmos
e consequentemente, a endogamia nos descendentes (FAO, 1998a;
RICHARDSON etal., 2004; RUSSELLO; AMATO, 2004; CSILLERY
etal., 2006; PEMBERTON, 2008; TORO etal., 2009). Diversas biotec
nologias reprodutivas foram desenvolvidas e aperfeioadas em huma
nos e animais domsticos, e vm sendo aplicadas ao melhoramento
615
biotecnologia
gentico e conservao de recursos genticos. Exemplos incluem

inseminao artificial, fertilizao in vitro, transferncia de embri
es, monitoramento hormonal no invasivo, clonagem, formao
de bancos de germoplasma, entre outras (FAO, 1998b; POPE, 2000;
PUKAZHENTHI; WILDT, 2004 e PUKAZHENTHI etal., 2006).
No obstante a tecnologia reprodutiva adotada, o correto manejo
reprodutivo visando ao controle da endogamia crucial na manuten
o da diversidade gentica e conservao do germoplasma no longo
prazo. Este deve, necessariamente, considerar a estrutura caracte
rstica de cada raa ou populao e sua diversidade gentica (TORO;
CABALLERO, 2005; FERNANDEZ etal., 2008; TORO etal., 2009).
Os recentes avanos da gentica molecular geraram ferramentas
para estudos populacionais e avaliao da variabilidade gentica inter
e intrapopulacional. Mtodos moleculares utilizados para anlise de
variao gentica so mais eficientes na discriminao de subdivises
populacionais intraespecficos, do que a biometria morfolgica tra
dicional. Genes mitocondriais e Yespecfico, que possuem herana
exclusivamente materna e paterna respectivamente (so transmiti
dos somente por fmeas ou machos), alm de padro de herana
no Mendeliana (no sofrer eventos de recombinao), podem ser
vir como marcadores genticos, fornecendo informao necessria
para discriminao de subpopulaes, estimao de distncias gen
ticas, assim como identificao de linhagens maternas e paternas.
Por outro lado, marcadores microssatlites, em razo da alta frequn
cia, distribuio no genoma e polimorfismo, so muito interessantes
para estimao de distncias genticas, discriminao de subpopula
es, mas, sobretudo, em estudos que envolvem segregao de ale
los, identificao individual e teste de paternidade (ERIKSSON etal.,
2006; GARRIGAN; HAMMER, 2006).
O uso combinado desses marcadores associado s sofisticadas
metodologias estatsticas tem se mostrado bastante eficiente para
estimar variabilidade gentica, discriminar subpopulaes, inferir
distncia gentica entre populaes, inferir parentesco (corrigir ou
reconstruir pedigree) entre indivduos mantidos em cativeiro ou em
vida livre, estudos de biogeografia e padres de migrao (LOFTUS
etal., 1994; ZHIVOTOVSKY; GOODMAN, 1998; JOHNS; AVISE,
616
1998; ARBOGAST, 1999; SEIESLTAD etal., 1999; HAMMER etal.,

2001; SPRINGER etal., 2001; TOZAKI etal., 2001; ICHIKAWA etal.,
2001; LANDRY etal. 2002; YU; PENG, 2002; CAVALISFORZA;
FELDMAN, 2003; DENISE etal., 2003; FOKIDIS etal., 2003; WILDER
etal., 2004a; WILDER etal., 2004b; GARRIGAN; HAMMER, 2006;
TORO etal., 2009).
Teste de paternidade
O parentesco inequvoco entre os indivduos de uma popula
o prcondio para um programa de melhoramento gen
tico eficiente (VAN VLECK, 1970; GELDERMANN etal., 1986;
GLOWATSKIMULLIS etal., 1995). A estimao dos parmetros gen
ticos populacionais e a predio do valor gentico dos indivduos so
dependentes de genealogia indubitvel (RON etal., 1995), uma vez
que dados de desempenho de animais aparentados so utilizados para
solucionar um modelo misto gerando valores genticos com proprie
dades (Best Linear Unbiased Prediction Blup), alm dos efeitos pre
judiciais no controle da endogamia.
Testes de paternidade em gado bovino, usando grupos sanguneos
e protenas do leite, evidenciaram uma alta frequncia de paterni
dade incorreta em pases como Israel (5%), Alemanha (4% a 23%),
Dinamarca (8% a 30%), Holanda (8%) e Irlanda (20%), justificando a sua
utilizao em programas de melhoramento gentico (GELDERMANN
etal., 1986; BEECHINOR; KELLY, 1987; RON etal., 1995).
Erros de identificao geram estimativas tendenciosas de parme
tros genticos populacionais (VAN VLECK, 1970). Por outro lado,
Geldermann etal. (1986) estimaram uma perda de 8,7% a 16,9% no
ganho gentico anual em bovinos de leite com 15% de erro de iden
tificao. Ron etal. (1995) sugerem que um aumento de aproxima
damente 5% no ganho gentico anual poderia ser obtido ao realizar
teste de paternidade na prognie dos 50 touros testados anualmente
em Israel.
As relaes de parentesco podem ser examinadas utilizando diver
sas categorias de marcadores genticos. Se o gentipo de um prov
vel touro for incompatvel com o gentipo da prognie, este exclu
do de paternidade, ou seja, a prognie deve apresentar um dos alelos
617
biotecnologia
paternais. Por outro lado, se os gentipos forem compatveis existem

duas possibilidades: (1) o touro o genitor biolgico; (2) o touro pos
sui gentipo compatvel por acaso. A probabilidade de se encontrar
um gentipo incompatvel denominada probabilidade de excluso
(PE). Em outras palavras, a PE a probabilidade de um touro selecio
nado aleatoriamente ser excludo de paternidade de uma prognie
tambm escolhida ao acaso (DODDS etal., 1996). A Probabilidade
de Excluso utilizando marcadores codominantes autossmicos foi
primeiramente calculada por Jamielson (1965) e posteriormente por
diversos autores (CHAKRABORTY etal., 1974; CRAWFORD etal.,
1993; JAMIELSON, 1994).
Diversos marcadores moleculares vm sendo aplicados com o
intuito de se inferir probabilidade de paternidade, cada um com suas
vantagens e desvantagens. Os RFLPs fornecem baixo contedo de
polimorfismo informativo e baixa heterozigose (LITT; LUTY, 1989).
Impresses Digitais do DNA DNA fingerprinting geradas pelo uso
de sondas minissatlites multilocais so geralmente bastante infor
mativas, sendo, entretanto, de difcil interpretao por apresenta
rem dominncia e, alm disso, alguns casos apresentam bandas de
diferentes loci com peso molecular semelhante e consequentemente
comigrao (JEFFREYS etal., 1991; PENA; CHAKRABORTY, 1994).
O parentesco avaliado pela utilizao de microssatlites locus espec
fico suplanta muitas das dificuldades inerentes a outros tipos de mar
cadores. Esses marcadores geralmente apresentam uma heterozigose
superior fornecida por RFLPs, sendo de interpretao mais simples
do que os padres de bandas geradas impresses digitais de DNA por
minissatlites multilocais (JAMIELSON, 1994; USHA etal., 1995). As
vantagens associadas aos microssatlites so codominncia, alto poli
morfismo, boa distribuio, alm de facilidade de serem genotipados
por PCR, o que facilita a padronizao de protocolos entre os diversos
laboratrios (GLOWATZKI MULLIS etal., 1995).
A abordagem locus especfico com microssatlites vem sendo
empregada na maior parte dos laboratrios que realizam teste de
paternidade em humanos nos EUA (PENA; CHAKRABORTY, 1994).
Microssatlites so utilizados para esse fim em animais domsticos
como bovinos (GLOWATZKIMULLIS etal., 1995; USHA etal., 1995;
618
VANKAN etal., 1994), sunos (HOHENHRST etal., 1994), caninos

(DOSTL; STRATIL, 1994 ), caprinos (AMIGUES etal., 1994) e ovi
nos (ROSA etal., 2011).
Paternidade, empregando marcadores moleculares, pode ser ava
liada a partir do ndice de paternidade (PI), que calculado pelo
mtodo de inferncia estatstica da razo de verossimilhana entre as
hipteses: (1) Ho: O candidato o pai verdadeiro e (2) H1: o pai ver
dadeiro um macho no relacionado da mesma populao, consi
derando a herana dos alelos marcadores, descrito em humanos por
Pena e Chakraborty (1994). O PI pode ser calculado para indivduos
com gentipo materno conhecido (BRENNER, 1997), e tambm para
indivduos com gentipo materno desconhecido (BRENNER, 1993;
MARSHALL etal., 1998; KALINOWSKI etal., 2007).
Perspectivas
Diversas abordagens genmicas, que incluem Genmica Estru
tural (sequenciamento genmico e mapas de SNPs), Funcional
(Transcriptmica, Protemica, Glicmica e Metabolmica e outras
micas) e Comparativa (Comparao de Sequncia de DNA, RNA,
Protena, Metablitos, etc.), devem ser utilizadas, de forma sistem
tica e integradas, para se elucidar os mecanismos genticos contro
lando a expresso de caractersticas de importncia econmica, uma
vez que podem ser reguladas em qualquer dos nveis de um sistema
biolgico (Figura19). Esse conhecimento servir de base ou con
tribuir para o desenvolvimento de diversas reas de pesquisa, das
quais se destacam: Estudos de Fertilidade/Reproduo, Nutrio/
Alimentao, Comportamento/Manejo e Adaptao/Rusticidade
de animais domsticos e silvestres, caracterizao da biodiversi
dade e diversidade gentica, assim como em estudos de Taxonomia,
Evoluo, Desenvolvimento, Simbiose e Ecologia.
619
biotecnologia
Integrao das omicas
Clula
Tecido
rgo
Organismo Populao
Genmica
Sequenciamento
genmico
Predio da
estrutura gnica
Transcriptmica
Coleo
de RNAs
Regulao
ps-transcrio
Ecossistema
Fisionmica
epigenmica
mRNA
Protemica
Traduo
Glicmica
Glicosilao
de protenas
Metabolmica
Concentrao
de metablitos
mRNA no-codificadores
Turnover
Regulao
protico
ps-traduo
Fenmica
Biologia
Evolucionria
Network
Figura19. Abordagens genmicas (sistemticas e integradas) para melho

rar o conhecimento da base gentica dos fentipos, nos diversos nveis de
um sistema biolgico.
Fonte: Adaptado de Hu etal., 2009.

Estudos avanados em Genmica Comparativa, Metagenmica e
Biologia de Sistemas podero auxiliar, por exemplo, no melhor enten
dimento da evoluo do sistema digestivo de artiodtilos, seu desen
volvimento embrionrio e funcionamento, assim como das complexas
interaes entre a microbiota do sistema digestivo e hospedeiro; e evo
luo da glndula mamria em mamferos, desenvolvimento embrio
nrio, fisiologia da lactao e resistncia a doenas como mastite. O
genoma bovino serve, portanto, como modelo animal para o enten
dimento da evoluo de mamferos assim como fornece subsdios
para o aumento da produtividade de leite e carne (WOMACK, 2006;
ADELSON, 2008; ELSIK etal., 2009; TELLAM etal., 2009).
As investigaes cientficas devem ser integradas e sistemticas
para se acessar, refinar e estender o conhecimento dos mecanismos
moleculares, controlando a formao, desenvolvimento e funciona
mento do organismo como um todo, integrado a um sistema produ
tivo ou ecossistema no caso de organismos silvestres. A viso inte
grada/holstica da Biologia de Sistemas auxiliar no aprofundamento
620
do entendimento de caractersticas complexas como desenvolvimento

ponderal, qualidade de carcaa, produo de leite, reproduo e resis
tncia a doenas.
Essas tecnologias genmicas empregadas como ferramentas suple
mentares no melhoramento abriram grandes oportunidades para se
aumentar significativamente o ganho gentico pelo aumento da acu
rcia e, alm disso, permitem um melhor controle sobre os nveis de
endogamia e consequentemente mantm o potencial de ganho gen
tico assim como a capacidade de adaptao. Por outro lado, infor
mao genmica pode ser empregada para predizer o fentipo que
um determinado gentipo produzir com implicaes em prticas
de manejo que visem desenvolver ou aumentar a eficincia produ
tiva e sustentabilidade dos sistemas produtivos existentes (Figura20).
Base genmica da diversidade biolgica
Biodiversidade = Qualidade de vida!!!
Seleo de
linhagens para
cruzamentos
Novos produtos,
melhoramento
qualitativo
por trasgnie
Clonagem de animais
altamente produtivos
Melhoramento
gentico
Desenvolvimento
sustentvel
Sistemas integrados
de produo (ILPe ILPS)
Consorciamento e
rotao de culturas
Controle biolgico
de pragas
Desenvolvimento
de vacinas
Tratamento e/ou
reciclagem de
resduos e gua
Figura20. Biotecnologia e desenvolvimento sustentvel.
Como resultados dos esforos internacionais, genes ou marcadores

em associao com efeito em caractersticas importantes vm sendo
identificados e utilizados em programas de melhoramento que empre
gam MAS para genes como MC4R, DGAT, CAST. Mais recentemente,
os progressos obtidos a partir do sequenciamento do genoma bovino,
anlise de associao Genome Wide e seleo genmica em bovinos
621
biotecnologia
de leite fazem jus s enormes esperanas depositadas na Genmica

e apontam perspectivas associadas a outras biotecnologias extrema
mente promissoras no somente no Melhoramento Gentico, mas
tambm em Biotecnologias da Reproduo (Figura21), em alimen
tao com a Nutrigenmica e no manejo profiltico e sanitrio com a
Farmacogenmica (Figura22).
Aplicaes associadas outras biotecnologias
FIV-TE (maturao de ocitos, cultivo e congelamento de
embries, etc) e clonagem.
Seleo e multiplicao de indivduos jovens (tourinhos, novilhas pr-pberes
ou ainda mais jovem velogenetics e WhizzoGenetics!!!!).
Cruzamentos (otimizao de herana no aditiva, seleo de
linhagens para cruzamentos).
Figura21. Biotecnologias da reproduo e MAS.
Genmica animal aplicada produo animal

MAS Seleo auxiliada por marcadores.
Nutrigenmica (efeito dos alimentos sobre o genoma).
Farmacogenmica (produo de vacinas para carrapato, desenvolvimento
defarmacuticos no antibiticos e outros).
Pr e probiticos, microorganismos metanognicos e outros.
Promotores decrescimento (hormnios, b-agonistas e outros).
Identificao de patgenos (antibiograma molecular);
Fertilidade/reproduo (foliculognese, oognese: taxa de ovulao,
sincronizao, FIV, clonagem e outros).
Identificao individual/rastreabilidade.
Transgnicos (biofbricas - imunoglobulinas e outros).
Figura22. Genmica animal aplicada produo animal.
622
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653
Captulo20
Captulo
5
Biotecnologia aplicada
a pecuria bovina
Carlos Frederico Martins
Luiz Gustavo B. Siqueira
Margot Alves Nunes Dode
Introduo
O aumento da exigncia mundial para produo de alimentos seguros e de forma sustentvel tem obrigado a pecuria bovina a sofrer
adaptaes, buscando o aumento da eficincia reprodutiva e produtiva dos animais em reas cada vez menores. Nesse sentido, as biotcnicas de reproduo animal tm contribudo para a produo de
animais com gentipos superiores e com eficincia produtiva destacada. Atualmente, a tecnologia de produo de embries bovinos tem
combinado a reproduo assistida com tcnicas celulares, moleculares
e genmicas, permitindo a multiplicao de animais geneticamente
valiosos, bem como a produo de animais transgnicos, com aplicao nas reas biomdica e agropecuria. Alm disso, os avanos na
criopreservao de espermatozides e embries tm facilitado o processo de multiplicao de animais superiores, devido a facilidade de
intercmbio de material gentico dentro e fora do pas.
A inseminao artificial e a transferncia de embries so as tcnicas que proporcionam os maiores ganhos genticos para bovinos,
pois, juntamente com os programas de teste de prognie, aumentam
a presso de seleo das raas. Atualmente, a tcnica de produo in
vitro de embries bovinos tem se incorporado fortemente ao setor produtivo, tornando o Brasil o maior produtor de embries por essa tecnologia. A tcnica de fecundao in vitro tambm tem auxiliado no
desenvolvimento do processo de clonagem animal, o qual tem sido
utilizado comercialmente no pas como uma tecnologia de multiplicao de animais geneticamente superiores e estratgicos dentro de
determinadas linhagens.
655
biotecnologia
Este captulo tem o objetivo de apresentar e discutir detalhes das

principais biotcnicas que impactam de forma prtica a multiplicao de bovinos. Dessa forma sero abordadas as biotcnicas de criopreservao de germoplasma, inseminao artificial, transferncia
de embries, fecundao in vitro e transferncia nuclear (clonagem).
Criopreservao de genomas
A preservao de clulas em baixas temperaturas denominada
de criopreservao, uma rea aplicada da criobiologia. Os avanos na
tecnologia de criopreservao tm desenvolvido mtodos que permitem manter uma variedade de clulas viveis a baixas temperaturas.
Nesse sentido, a criopreservao tem se tornado uma ferramenta fundamental para reproduo de bovinos, bem como para formao de
criobancos genticos para conservao animal ex situ, possibilitando
o armazenamento de espermatozides, ocitos, embries e clulas
somticas. Essas clulas conservadas podem oportunamente ser utilizadas pelas biotcnicas de reproduo, tais como a inseminao artificial, transferncia de embries, fecundao in vitro e transferncia
nuclear, e, dessa forma, promover a multiplicao de animais com
elevado mrito gentico, bem como de animais em risco de extino.
Criopreservao de espermatozides
O relativo sucesso alcanado com a criopreservao de smen tem
permitido avanos significativos no campo da agropecuria, tornando
possvel uma troca internacional de germoplasma de animais geneticamente superiores; da biotecnologia, por permitir uma eficiente
estocagem de linhagens de murinos cientificamente importantes;
da conservao de espcies em risco de extino, por meio do banco
de recursos genticos; e da medicina reprodutiva humana (WOODS
etal., 2004).
O espermatozide uma clula altamente polarizada e especializada com uma estrutura tripartida em cabea, pea intermediria e
cauda. Esse gameta perde a habilidade de biosntese, reparo, crescimento e diviso celular durante a fase final da espermatognese.
Dessa forma, a conservao de espermatozides requer uma reduo
656
Captulo 20 Biotecnologia aplicada a pecuria bovina
ou atraso do metabolismo das clulas espermticas para gerar um prolongamento de sua vida (YOSHIDA, 2000).
Uma estocagem efetiva de smen no estado congelado implica
em uma completa interrupo no processo de desenvolvimento das
clulas espermticas, que comeam no testculo e continuam atravs do epiddimo e aps a ejaculao. A criopreservao do smen
pode ser considerada como uma lacuna entre o perodo de suspenso da animao espermtica e o processo que demarca a continuidade do desenvolvimento, que eventualmente conduz a fecundao
(VISHWANATH; SHANNON, 2000).
A maioria dos mtodos de criopreservao de espermatozides
de mamferos ainda consiste de vrios passos no fisiolgicos, que
envolvem a adio hipertnica de um agente crioprotetor permevel
(ACP), resfriamento, aquecimento e a remoo do ACP (WOODS
etal., 2004). Teoricamente, tem sido possvel calcular a adio mnima
de ACP requerida antes do resfriamento para evitar os danos osmticos, bem como a taxa tima de resfriamento para evitar a formao
de gelo intracelular. Um dos mais importantes princpios da criopreservao reside na necessidade de remover o mximo possvel de
gua das clulas antes de proceder a sua congelao. Se essa desidratao no ocorrer, grandes cristais de gelo se formaro, lesando severamente a estrutura intracelular. No entanto, a remoo demasiada de
gua das clulas tambm pode ser deletria (SEIDEL JUNIOR, 1984).
A fortuita descoberta do glicerol (POLGE; SMITH, 1949) como um
efetivo agente crioprotetor introduziu um novo sistema de estocagem de smen, o qual prolonga a viabilidade espermtica e mantm o
potencial fecundante por longos perodos. Existe um argumento que
espermatozides estocados a -79C (gelo seco) ou a -196C (nitrognio lquido) mantm seu potencial fecundante indefinitivamente. No
entanto, outros especialistas consideram um perodo de tempo mais
curto para os espermatozides sobreviverem a baixas temperaturas
e manterem o potencial fecundante. Outras evidncias sugerem que
esse fato pode ocorrer devido inadequada manuteno da temperatura de estocagem.
Vrios aspectos da criopreservao espermtica tm sido estudados,
tais como a composio qumica dos diluentes e seus efeitos sobre a
657
biotecnologia
membrana plasmtica, limites de tolerncia osmtica, condutividade

hdrica e a permeabilidade dos crioprotetores (GILMORE etal., 1999).
Esses estudos sugerem que os espermatozides de cada espcie tm
diferentes propriedades criobiolgicas, bem como apresentam variao quanto sensibilidade a manipulao (ex, pipetagem, centrifugao), tolerncia osmtica, e sensibilidade ao resfriamento (KATKOV;
MAZUR, 1999; PHELPS etal., 1999).
De maneira geral, o sucesso da criopreservao da clula depende
da velocidade da congelao e da composio da soluo em que as
clulas so congeladas. Inicialmente, a gua extracelular congela no
momento em que a clula se aproxima do ponto de congelao, removendo o lquido extracelular, fato que acarreta um aumento de osmolaridade. Com esse desequilibro osmtico, a gua retirada da clula
para o compartimento extracelular, ocasionando uma diminuio do
volume celular. Uma adequada desidratao celular depende da velocidade de congelao, de forma a no provocar uma lise da clula. No
caso de um processo de congelao muito lento, o equilbrio permanecer constante e a clula ficar exposta ao crioprotetor e ao estresse
osmtico por tempo prolongado, fato que poder acarretar a morte
celular. Ao contrrio, no caso de uma congelao muito rpida, a desidratao ser insuficiente e causar a formao de gelo intracelular,
ocasionando a lise da clula na ocasio da descongelao (LOPEZBEJAR etal., 1994). Para evitar o dano celular, mesmo com uma velocidade de descongelao controlada, h necessidade do emprego de
crioprotetores. Mesmo com uma soluo crioprotetora empregada,
avaliaes citolgicas tm demonstrado leses na membrana plasmtica, regio acrossomal e na configurao da cauda espermtica
(WILLOUGHBY etal., 1996).
A criopreservao espermtica tem sido associada com sucesso com
a tecnologia reprodutiva humana e bovina. A maioria dos protocolos
utiliza uma curva lenta de resfriamento inicial (ex., 1C/min. a 5C/
min.), que comea a partir da temperatura corporal ou temperatura
ambiente, at atingir a temperatura de solidificao. Em seguida, aps
a formao inicial de gelo, faz-se necessria a adoo de uma taxa de
resfriamento mais rpida (ex., 100-200C/min.), na presena de glicerol tamponado com gema de ovo e citrato de sdio. Com esse procedi-
658
mento, a taxa de sucesso tem sido satisfatria nessas espcies quando

o smen congelado utilizado na inseminao artificial ou fecundao in vitro (HOLT, 2000).
Um protocolo padro tem sido idealizado para a criopreservao de
smen de todas as espcies. Entretanto, aqueles destinados a criopreservao de smen de mamferos apresentam limitaes e produzem
taxas de sucesso que variam entre as espcies e at individualmente
dentro da mesma espcie. Em algumas espcies, tais como suna,
um mtodo apropriado ainda est por ser determinado, enquanto em
outras espcies, como murina, um mtodo que parece ser apropriado
para uma linhagem falha em outra (CRITSER; MOBRAATEN, 2000).
Essas informaes indicam que um exame das propriedades criobiolgicas dos espermatozides, bem como um exame da exata natureza
da crio-injria espcie-especfica, deve ser realizada para se determinar um apropriado protocolo de criopreservao (HOLT, 2000).
Apesar dos possveis avanos na tecnologia de criopreservao de
smen bovino, essa metodologia j uma grande realidade para bovinocultura do Brasil. A maior aplicao da criopreservao de smen
bovino est na possibilidade de utilizao e disseminao de material gentico de touros superiores por meio da inseminao artificial,
melhorando o desempenho do rebanho de corte e de leite e trazendo,
dessa forma, maior lucratividade ao pecuarista.
Criopreservao de embries
No sistema de produo de bovinos, a criopreservao de embries
tem contribudo com o processo de seleo gentica e tem reduzido
significativamente os custos dos programas de cruzamentos, porque
os embries podem permanecer disponveis at que as fmeas receptoras estejam prontas naturalmente, evitando os custos com a sincronizao hormonal do cio (WOODS etal., 2004). A criopreservao de
embries permite uma melhor explorao da fmea doadora, pois os
embries excedentes dos programas de transferncia de embries e
fecundao in vitro podem ser estocados, formando um banco gentico que poder ser utilizado em momento oportuno. Alm disso,
essa tecnologia garante com mais facilidade a importao e exporta-
659
biotecnologia
o de germoplasma de interesse. Uma vez que os custos so menores, h segurana higinico-sanitria e menores riscos de transporte.
As tcnicas de criopreservao de embries bovinos produzidos in
vivo esto bem estabelecidas. Inicialmente, o glicerol foi o crioprotetor mais utilizado (BILTON; MOORE, 1979), entretanto, como os
embries devem ser lavados vrias vezes para remover o glicerol antes
da transferncia para as fmeas receptoras e, por causa da sua toxicidade, esse crioprotetor tem sido substitudo pelo etilenoglicol. O etilenoglicol se difunde para dentro ou para fora do embrio com rapidez, permitindo a transferncia direta dos embries (sem lavagem
fora da palheta), fornecendo taxas de prenhezes similares ao glicerol
(VOELKEL; HU, 1992). Nesse caso, os embries so resfriados a 0,3C
por minuto at -36C para garantir a formao de poucos locais de
gelo, seguido pela imerso em nitrognio lquido (TOMINAGA, 2004).
Aps um rpido aquecimento (>300C por minuto), os e mbries bovinos tm apresentado taxas de gestao superiores a 50%.
A aplicao comercial em grande escala da tecnologia de produo in vitro de embries bovinos altamente dependente de procedimentos adequados de criopreservao. A sobrevivncia dos embries produzidos in vitro e criopreservados pelo mtodo lento tem sido
bem menor do que os embries produzidos in vivo (DINNYS etal.,
1996; VAJTA etal., 1997). H muitas diferenas morfolgicas entre os
embries produzidos in vitro e os de origem in vivo, as quais podem
afetar a sobrevivncia aos procedimentos de criopreservao lenta
(WRIGHT JUNIOR; ELLINGTON, 1995; THOMPSON, 1997). O estgio de mrula produzida in vitro apresenta menos clulas compactas, a sensibilidade da zona pelcida digesto enzimtica alterada, e os embries produzidos in vitro so usualmente mais escuros
e mais leves, possivelmente devido ao aumento do contedo lipdico
(LEIBO; LOSKUTOFF, 1993). Alm disso, os embries produzidos
in vitro apresentam menos complexos juncionais, sendo encontradas diferenas na expresso do gene connexin 43 (protena de juno
tipo gap) (WRENZYCKI etal., 1996). A presena de soro fetal bovino
(SFB) no sistema de cultivo in vitro pode gerar vacuolizao, escurido e menor compactao dos embries. A reduo na temperatura
durante o processo de resfriamento pode causar mudanas fsicas nas
660
membranas celulares, tais como separao dos componentes lipdicos que resultam em alterao da funo da membrana plasmtica
(SCHIMSHICK; MCCONNELL, 1973).
Com as atuais tcnicas in vitro, um grande nmero de embries
pr-implantacionais podem ser produzidos relativamente a baixos
custos. Entretanto, os embries produzidos in vitro so caracterizados
pelo aumento da sensibilidade ao resfriamento e diminuio da tolerncia a criopreservao quando comparados com os embries produzidos in vivo (POLLARD; LEIBO, 1994). Nesse contexto, o maior
obstculo associado com essa tecnologia a carncia de mtodos adequados para preservar os embries provenientes do sistema in vitro.
Dessa forma, h, no mnimo, duas abordagens para superar esse problema: melhorar os mtodos de criopreservao ou melhorar a qualidade do embrio por meio da otimizao do ambiente para produo dos embries in vitro.
At o presente, a congelao lenta e a vitrificao so comumente
utilizados para preservar os embries bovinos. A congelao lenta, que
mais amplamente utilizada, tem a vantagem de utilizar baixas concentraes de crioprotetores e permite a transferncia do embrio na
receptora logo aps a descongelao (VOLKEL; HU, 1992). As taxas
de produo de bezerros so levemente mais baixas aps a transferncia de embries produzidos in vivo e criopreservados em comparao
com a transferncia de embries frescos. No entanto, a congelao
lenta de embries produzidos in vitro tem reduzido as taxas de sobrevivncia ps-descongelao, devido principalmente a sua susceptibilidade a formao de cristais de gelo (KASAI etal., 2002).
O processo da conservao embrionria por vitrificao tem surgido como grande alternativa para a criopreservao de embries bovinos produzidos in vitro. A vitrificao a solidificao da soluo,
no pela cristalizao, mas sim pela extrema elevao da viscosidade
durante a congelao rpida. Embora a vitrificao elimine as injrias
dos cristais de gelo, a alta concentrao de crioprotetores requeridos
aumenta o risco dos danos osmticos e txicos (KUWAYAMA et al,
1994). Comparaes entre os dois mtodos de criopreservao tm
levado a diferentes resultados, mas parece que a vitrificao mais
661
biotecnologia
adequada para a conservao de embries bovinos produzidos pela

fecundao in vitro (DYNNS etal., 1996).
Na vitrificao, a toxicidade das altas concentraes de crioprotetores determina que as clulas somente podem ser expostas a soluo crioprotetora por um curto perodo de tempo ou a um volume
mnimo de soluo (ARAV etal. 2002). Diferentes estratgias foram
aplicadas para diminuir o volume e para submergir a amostra rapidamente no nitrognio lquido, incluindo telas de microscpio eletrnico (MARTINO etal., 1996), open pulled straw (OPS) (VAJTA
etal., 1998), cryoloops (FUCHINOUE etal., 2004), cryotops e cryotips
(KUWAYAMA etal., 2005). Ambos os mtodos tm se tornado alternativas viveis em relao s abordagens tradicionais, especialmente
para embries produzidos in vitro, embries micromanipulados e
ocitos (CARVALHAIS etal., 2006; MARQUES etal., 2007).
Criopreservao de ocitos
A criopreservao de ocitos ainda ineficiente em bovinos, sendo
um dos grandes gargalos para a tcnica de fecundao in vitro (FIV).
O sucesso da criopreservao de ocitos tornaria a produo in vitro
de embries uma tcnica completa.
Os ocitos tm uma menor permeabilidade tanto gua quanto aos
agentes crioprotetores. Assim, os ocitos resfriados a baixa temperatura apresentam leses em elementos do citoesqueleto, grnulos corticais e membrana plasmtica (AMAN; PARKS, 1994). O rompimento
nos grnulos corticais e membrana plasmtica provavelmente conduzem a baixa taxa de fecundao e morte celular, respectivamente
(VINCENT; JOHNSON, 1992). Muitos problemas foram encontrados
e associados com o resfriamento e criopreservao de ocitos imaturos, maturados in vitro ou ovulados. Como exemplo possvel citar
as anormalidades no fuso meitico anormal, com desorganizao
dos microtbulos e cromossomos (ROJAS etal., 2004; SUCCU etal.,
2007), alterao na distribuio dos grnulos corticais e aumento da
poliespermia (MAVRIDES; MORROL, 2005; MORATO etal., 2008).
A criopreservao de ocitos em fase de vescula germinativa ou em
metfase II, utilizando mtodos de resfriamento lento, tem resultado
em baixa sobrevivncia.
662
O processo de vitrificao de ocitos vem sendo intensamente

estudado e tem se tornado o mtodo de eleio para conservao de
ocitos bovinos, mesmo com os resultados ainda incipientes. Vrias
tcnicas de vitrificao vm sendo desenvolvidas com o objetivo de
evitar as crioinjrias, aumentando as taxas de resfriamento e aquecimento. Alm disso, a aplicao de crioprotetores menos txicos, bem
como a combinao de dois ou trs crioprotetores tm sido utilizadas
(MORATO etal., 2008).
Vrios estudos vm apostando nas abordagens de vitrificao com
rpidas velocidades de resfriamento. A acelerao da velocidade de
diminuio das temperaturas pode reduzir as crioinjrias, permitindo
o uso de uma menor concentrao de crioprotetores e diminuindo o
tempo de exposio da clula ao crioprotetor. A utilizao de pequenos volumes de soluo de vitrificao permite um resfriamento mais
rpido e a reduo de fraturas celulares (ARAV etal., 2002).
Criopreservao de clulas somticas

A criopreservao de clulas somticas parece ser uma metodologia vivel para vrios tipos celulares. O procedimento prtico de criopreservao de fibroblastos tem sido realizado pela adio de 5% a
10% de crioprotetor, tais como glicerol ou dimetilsulfxido (DMSO)
nas clulas em suspenso em meio de cultura, alocadas em pequenos
tubos com poucos mL e em seguida depositado a -80C em freezer.
Apesar de emprico, este simples procedimento ainda efetivo. Com
esse procedimento, a taxa de resfriamento no pode ser controlada,
porm para fibroblastos bovinos essa metodologia tem sido suficiente.
Inseminao artificial
A tcnica de Inseminao Artificial (IA) , por definio, a deposio mecnica do smen no aparelho genital feminino por meio
de instrumentos especialmente desenvolvidos para este propsito.
Atualmente, a IA considerada a biotecnologia de reproduo assistida que causa o maior impacto em programas de melhoramento animal, como resultado da sua eficiente forma de disperso de genes de
animais de superior mrito gentico.
663
biotecnologia
Existem relatos de uso da inseminao artificial em equinos pelo

povo rabe ainda no sculo XIV. No entanto, o primeiro relato
cientfico de uso da IA ocorreu em 1784, quando o italiano Lazaro
Spallanzani obteve sucesso aps inseminar artificialmente cadelas.
Em bovinos, o primeiro nascimento de animais frutos de IA foi reportado em 1938 (PELI, 1938). A tcnica de IA iniciou sua difuso para
uso comercial a partir dos avanos em procedimentos de manipulao do smen e, principalmente, aps a demonstrao de que espermatozides poderiam ser conservados a baixas temperaturas por longos perodos pelos pesquisadores Polge, Smith e Parker, em 1949.
No Brasil, o uso comercial da IA teve incio na dcada de 1970 do
sculo passado, e atualmente comercializam-se mais de 8,2 milhes
de doses de smen no Pas, com uma evoluo de 210,66%, quando
comparados dados dos anos de 1989 e 2008 (ASBIA, 2008). Estatsticas
mundiais indicaram que mais de 232 milhes de doses de smen
congelado foram produzidas por ano em todo o mundo no incio da
atual dcada (THIBIER; WAGNER, 2000). Contudo, uma baixa porcentagem de matrizes do rebanho brasileiro inseminada artificialmente (cerca de 5% a 6%), o que coloca em evidncia a necessidade de
melhor divulgao e difuso da tcnica de IA para ser usada na grande
parte do rebanho ainda sob regimes de monta natural.
O sucesso de um programa de IA resulta de cinco fatores bsicos: eficincia de deteco de cios; habilidade do inseminador (mo
de obra treinada); correta aplicao da tcnica; fertilidade do smen;
e fertilidade da fmea. Nesse sentido, importante a observncia de
todos os detalhes inerentes correta aplicao da tcnica, visto que a
baixa eficincia em um destes cinco fatores bsicos poder implicar
em resultados insatisfatrios.
Vantagens da inseminao artificial

As principais vantagens da tcnica de Inseminao Artificial so de
carter zootcnico, econmico e cientfico. Vantagens de ordem zootcnica referem-se ao melhoramento gentico que pode ser alcanado
por meio da disseminao de smen de animais superiores para produo de leite ou de carne; a eficincia do ganho gentico pelo uso de
touros provados com base na sua prognie; a preservao de mate664
rial gentico raro que poder ser utilizado no futuro; a diminuio da

movimentao de animais entre fazendas, diminuindo assim a disseminao de doenas; e tambm ao pacote de melhorias na escriturao zootcnica de uma propriedade quando a inseminao artificial
implantada (anotaes de cios, acasalamentos, partos ocorridos, etc...).
J vantagens de ordem econmica so resultantes da rapidez no
melhoramento gentico do rebanho, o que resulta em ganhos de produtividade em um reduzido perodo de tempo; do melhor custo-benefcio da compra de smen e manuteno do botijo em relao compra e manuteno de touros; do uso de reprodutores de alto padro
gentico, que se tornaria economicamente invivel em muitas fazendas devido ao preo do reprodutor, ao passo que, a compra de doses
de smen deste mesmo animal pode ser economicamente vivel.
A terceira classe de vantagens, a cientfica, se justifica se considerarmos que a inseminao artificial a base para a aplicao de outras
biotcnicas de reproduo assistida, dentre as quais se destacam a
transferncia de embries e a fecundao in vitro. A inseminao artificial foi a primeira biotecnologia a ser aplicada em larga escala, e por
isso serve de base para o desenvolvimento tecnolgico futuro.
Observao de cios e horrio de inseminao

Considerando que a Inseminao Artificial ir substituir o uso de
touros em monta natural no rebanho, deve-se estar atento eficincia de deteco de estro (cio). Estudos que correlacionaram nmero,
horrio e durao de observaes de estro com a eficincia de deteco
indicaram que maiores taxas de deteco de estro so obtidas quando
so realizadas cinco observaes dirias, com trinta minutos de durao cada (VAN VLIET; VAN EERDENBURG, 1996). No entanto, por
questes operacionais, atualmente recomenda-se no mnimo duas
observaes dirias de 30 a 40 minutos cada.
O sinal principal ou primrio de estro o aceite a monta. A fmea
bovina em cio permanece imvel quando recebe monta do macho
ou de suas companheiras de rebanho. Para facilitar a identificao
da proximidade desse momento (o aceite a monta), existem alguns
sinais secundrios que devem ser observados. Entre esses se destacam: montar em outras fmeas, inquietao, nervosismo, mugido fre665
biotecnologia
quente, movimentar-se acima do normal, afastamento do rebanho,

vulva edemaciada (inchada), presena de muco saindo pela vulva,
cauda erguida, posio de lordose, urinar com frequncia, descansar o queixo sobre a regio lombar das companheiras, posio de luta
(cabea-a-cabea com outras fmeas). Todos esses fatores iro ajudar
o observador a identificar que animais esto prximos ao cio, ou seja,
prximos do aceite a monta.
Alm da correta observao e identificao dos sinais apresentados
pela fmea em estro, tcnicas auxiliares de deteco de cio podem ser
empregadas pelo profissional inseminador. Rufies, que so machos
no castrados, com libido normal, submetidos a cirurgias de desvio
lateral/aderncia peniana ou fmeas androgenizadas, podem ser usados como uma ferramenta importante para o aumento da eficincia
de deteco de estro. Uma ferramenta adicional ao uso de rufies
o uso de bual marcador, que um dispositivo colocado na regio da
mandbula do rufio que ir marcar com tinta as fmeas que eventualmente sofrerem montas pelo macho rufio. O uso de bual marcador representa grande importncia principalmente na diminuio
de perdas de cios curtos e (ou) noturnos. Com o avano das tecnologias, dispositivos eletrnicos tambm tm sido aplicados no auxlio
deteco de cios. Esses dispositivos identificam principalmente a
inquietao de animais que se movimentam acima do normal. Uma
terceira tcnica auxiliar para identificao de cios seria a sincronizao do estro em um grupo de animais. Embora os esforos de observao e identificao de cios ainda sejam necessrios quando h a
sincronizao, a presena de um maior nmero de fmeas em estro
facilita a observao e a manifestao do estro devido maior interao entre os animais em cio.
Aps a correta deteco de cio, faz-se necessria a inseminao artificial em momento apropriado. O horrio de inseminao definido
levando-se em conta os seguintes aspectos: (1) o momento da ovulao aps o incio do cio (24 a 30 horas): (2) o tempo de sobrevivncia
do ocito antes que comece a sofrer degenerao (6 a 8 horas); (3) a
necessidade de um perodo de tempo para que haja a capacitao de
espermatozides, afim de que se tornem aptos fecundao aps a IA
(6 a 12 horas); e (4) o tempo de sobrevivncia dos espermatozides no
666
interior do trato genital feminino (cerca de 24 horas) (HAFEZ, 1995).

Considerados todos esses fatores, a IA deve ser realizada prximo ao
final do estro (cerca de 12 horas aps aceitar a monta pela primeira
vez; Figura 1). De modo geral, recomenda-se a utilizao da regra
am-pm, na qual, animais observados em cio na parte da manh so
inseminados no final da tarde do mesmo dia, e animais observados
em cio na parte da tarde so inseminados no incio da manh do dia
seguinte (TRIMBERGER, 1948). Esse mtodo tem sido utilizado com
sucesso por vrias dcadas, o que no impede adaptaes do mtodo
ao manejo da fazenda em casos especficos.
Proestro - Entrando no cio
Durao: 8h (0-24)
Estro (Cio) - Aceita monta

Durao: 16h (3-30)
0
Horrio da Inseminao
Muito cedo
Metaestro - Saindo do Cio

Durao:8h (2-24)
12
Bom
18
timo
24 Horas
Bom
Muito Tarde
Figura 1. Ilustrao dos sinais que auxiliam a deteco de cio durante trs
fases do ciclo estral bovino (proestro, estro e metaestro); durao mdia (mn.
e mx.) de cada fase; e indicadores do melhor horrio para se realizar a
Inseminao Artificial.
Fonte: Adaptado de Wattiaux, 2009.
667
biotecnologia
A tcnica de IA propriamente dita

A tcnica de inseminao artificial em bovinos relativamente
simples de ser executada, o que no diminui a importncia de treinamento adequado do profissional responsvel. O inseminador o
maior responsvel pelo resultado da IA (gestaes), visto que est
envolvido na maioria das etapas do processo. Um inseminador eficiente um profissional muito bem treinado e submetido a constantes cursos de reciclagem e capacitao, dedicado, comprometido com
os resultados, e necessariamente interessado e motivado pelo servio
que est desempenhando.
A inseminao artificial propriamente dita inicia-se aps a deteco de uma fmea em estro e da definio do momento adequado a
insemin-la. Inicialmente, deve-se avaliar o histrico reprodutivo da
fmea e atentar para o nmero de dias ps-parto (no inseminar antes
de 45 dias ps-parto); nmero de inseminaes anteriores (avaliar
se houve excesso de repeties de cio); e verificar se no h gestao
confirmada para a matriz (possibilidade de cio falso/cio do encabelamento). O passo seguinte fazer a retirada de fezes do reto e higienizao da regio perineal do animal (ao redor do reto e vulva). No
momento da retirada de fezes, deve-se observar a caracterstica do
muco saindo pela vulva, que deve ter aparncia transparente, cristalina. A higienizao consiste em lavagem com gua abundante para a
limpeza de toda a rea externa vulva, seguida de secagem com papel
toalha ou um pano limpo.
Terminada a limpeza, o inseminador deve proceder preparao do
material e descongelao do smen. Para isso, deve-se aquecer gua
limpa at que atinja a temperatura de 35C a 37C. A temperatura
da gua para descongelao do smen de extrema importncia para
minimizar a morte e leses de espermatozides durante o processo
de descongelao (Figura 2). Para descongelao, abre-se o botijo de
nitrognio lquido e retira-se uma palheta de smen com o auxlio de
uma pina de disseco. A palheta deve ser imersa em gua morna
(35C a 37C) por um tempo mnimo de 30 a 50 segundos. A palheta
de smen deve ser retirada da gua e seca com o auxlio de papel toalha, antes que se prossiga a montagem do aplicador de IA. Com o aplicador montado, o inseminador ir introduzir o aplicador na vulva da
668
fmea a ser inseminada. Neste momento, importante a ajuda de uma

segunda pessoa, que ir auxiliar na abertura da vulva para que o aplicador no toque o seu exterior. O momento entre a retirada da palheta de
smen da gua morna e a introduo do aplicador pela vulva da fmea
de extrema importncia e deve ser realizado o mais rpido possvel.
importante que o smen no passe por grandes variaes de temperatura, portanto quanto antes o aplicador for colocado no interior da
vulva, a uma temperatura constante, melhor. O inseminador ento ir
segurar o aplicador de IA com uma das mos e introduzir a outra mo
no reto da vaca, manipulando cuidadosamente a crvix at atingir o incio do corpo uterino. O local de deposio do smen se localiza 1cm
a 3 cm aps o ltimo anel cervical, ou seja, no tero inicial do corpo
do tero. O smen deve ser lentamente depositado nesse local, o que
ir permitir a disponibilidade de espermatozides para a fecundao
em ambos os cornos/tubas uterinas. Encerra-se a tcnica de IA com
a retirada do aplicador e uma leve massagem no clitris do animal.
Acrossomas intactos (%)
70
60
b
50
bc
40
30
20
10
0
gua a 37 C
gua a 20 C
gua a 5 C
"Na vaca"
Mtodo de descongelao
Figura 2. Efeito do mtodo de descongelao na integridade do acrossoma de

smen bovino criopreservado em palhetas francesas de 0,5 mL. Colunas acompanhadas de letras diferentes (a, b, c), diferiram estatisticamente (P < 0,05).
Fonte: Adaptado de De Jarnette etal., 2000.
669
biotecnologia
Inseminao artificial em tempo fixo (IATF )

Considerando que as maiores limitaes difuso da Inseminao
Artificial em fazendas so a baixa eficincia de deteco de estros
(cio) e a realizao da IA no momento correto (LARSON; BALL,
1992), protocolos hormonais que permitem a inseminao artificial
em um momento pr-programado (tempo fixo) foram introduzidos
como uma alternativa vivel e eficiente para contornar esses entraves.
Estudos com inseminao artificial em tempo fixo (IATF) foram realizados inicialmente por pesquisadores americanos (PURSLEY etal.,
1995) e se difundiram rapidamente, chegando ao Brasil poucos anos
depois (BARROS etal., 2000).
Os protocolos hormonais de IATF levam em considerao a fisiologia hormonal e dinmica ovariana da fmea bovina, e objetiva sincronizar os principais eventos reprodutivos que ocorrem durante o
ciclo estral bovino: (1) incio do desenvolvimento folicular; (2) lutelise; e (3) ovulao. O estudo das inter-relaes entre os principais hormnios da reproduo (GnRH, FSH, LH, estradiol e progesterona)
permitiu a aplicao direta dos conhecimentos adquiridos, e um dos
exemplos de aplicaes prticas a IATF/sincronizao de ovulao.
Os efeitos do GnRH e do estradiol na emergncia de uma nova onda
folicular e na induo de ovulao; do FSH, no crescimento folicular;
do LH, na ovulao; e da prostaglandina F2, na regresso do corpo
lteo (lutelise) foram, e ainda so, levados em considerao no desenvolvimento de protocolos eficientes para IATF.
Os princpios bsicos da IATF so: (1) induzir/sincronizar a emergncia de uma nova onda de crescimento folicular pela aplicao exgena de estradiol ou GnRH (ou seus anlogos); (2) induzir lutelise,
interrompendo a fase luteal, por meio da aplicao de prostaglandina
F2; e (3) induzir a ovulao pela aplicao de GnRH, LH ou estradiol
(PURSLEY etal., 1995; BARROS, 2000). A exposio progesterona
durante a fase de desenvolvimento folicular resulta em melhores taxas
de gestao aps o protocolo e, por essa razo, fontes de progesterona
exgena (dispositivos intravaginais ou auriculares) foram incorporadas aos protocolos (MAPLETOFT etal., 2003). Uma representao
esquemtica dos princpios para definio de um protocolo de IATF
apresentada na Figura 3.
670
Induo de ovulao e/ou

emergncia de uma nova onda
de crescimento folicular
Induo de lutelise e
remoo da exposio
a progesterona exgena
Induo de do pico
pre-ovulatrio de LH para
sincronizar a ovulao
IATF
Exposio a progesterona exgena:

Implantes intravaginais ou auriculares
Dia 0
Principias hormnios utilizados:

GnRH, Benzoato de estradiol
Dias 7 ou 8
Principais hormnios utilizados:

PGF2 e seus anlogos
Dias 9 ou 10
Dias 10 ou 11
Principais hormnios utilizados:

GnRH, Benzoato de estradiol,
Cipionato de estradiol ou LH
Figura 3. Representao esquemtica dos princpios bsicos de protocolos

de sincronizao de cios/ovulao para permitir Inseminao Artificial em
Tempo Fixo (IATF ).
Estudos tm sido conduzidos no intuito de investigar os efeitos de

alguns hormnios adicionais ao protocolo bsico de IATF na induo
de ciclicidade em vacas em anestro ps-parto. Os principais hormnios que tm sido adicionados ao protocolo so base de FSH (FSH-V
ou FSHp) ou hormnios que mimetizam seus efeitos (gonadotrofina
corinica equina, eCG; ERENO etal., 2007). Os objetivos so induzir
o crescimento folicular com o auxlio de gonadotrofinas exgenas, a
fim de que o folculo ovulatrio alcance um tamanho tal que induza
a onda pr-ovulatria de LH, vencendo os bloqueios a hormnios da
reproduo (p.ex., o LH) tpicos da fase ps-parto, resultantes, por
exemplo, da amamentao de bezerros. Adequada condio corporal
no ps-parto, contudo, ainda um pr-requisito importante para que
se obtenham resultados satisfatrios em termos de taxa de gestao
(B etal., 2003). importante salientar que protocolos hormonais
no substituem cuidados com a alimentao e um correto manejo
nutricional das matrizes a serem inseminadas. Dessa forma, o uso
de protocolos de IATF em animais subnutridos e (ou) com baixa condio corporal provavelmente incorrer em resultados insatisfatrios.
Trasferncia de embries
A finalidade bsica da Transferncia de embries (TE) em bovinos
a multiplicao, de forma acelerada, do material gentico de uma
671
biotecnologia
doadora superior. Especificamente, procura-se aumentar o nmero

de descendentes de uma determinada fmea, aproveitando o seu
potencial gentico para produo. Resumidamente, assim como a
Inseminao Artificial potencializa o uso de material gentico de touros superiores, a TE difunde material gentico de fmeas superiores.
A transferncia de embries, assim como a IA, tambm se tornou um
grande nicho de mercado e opera em nveis comerciais atualmente
no Brasil. Alm do vis comercial, a TE fornece conhecimentos bsicos de desenvolvimento embrionrio inicial que podem ser aplicados
em outras biotecnologias da reproduo.
Datam do final do sculo XIX os primeiros relatos de sucesso em
transferncia de embries, em coelhos (HEAPE, 1891; citado por
BETTERIDGE, 2003; HASLER, 2003). Em bovinos, contudo, somente
em meados do sculo XX (1950) foi registrado o nascimento do primeiro bezerro fruto de transferncia de embries (WILLETT etal.,
1951). O uso da tcnica de TE em escala comercial comeou modestamente no incio da dcada de 1970, limitada por questes prticas
(coleta e transferncia cirrgicas, com a doadora sob anestesia geral).
Com a introduo dos mtodos de coleta e transferncia no cirrgicas e a disponibilidade de prostaglandina F2 para sincronizar doadoras e receptoras, a TE se tornou mais prtica e pde ser realizada na
prpria fazenda, o que aumentou bastante o potencial de difuso da
tcnica (HASLER, 2003).
Dados atuais registram cerca de 823.160 embries transferidos no
mercado mundial de TE em bovinos (THIBIER, 2008). No cenrio
nacional, o Brasil o segundo maior produtor de embries in vivo fora
da Amrica do Norte e Europa e se consolidou como o maior produtor
mundial de embries in vitro, respondendo por quase 80% das transferncias desses embries em 2007 (THIBIER, 2008).
Entre as principais aplicaes da TE, destacam-se: (1) planejamento
de acasalamentos e multiplicao de animais de gentipo superior;
(2) otimizao de programas de seleo e melhoramento gentico;
(3) conservao de recursos genticos (animais raros ou em risco de
extino); (4) controle de doenas no comrcio de material gentico;
(5) importao e exportao de material gentico a menor custo e com
672
menor risco sanitrio; e (6) fornece a base para adoo de outras biotecnologias.
A TE em bovinos se caracteriza por trs etapas principais: (1) induo da superovulao; (2) coleta, identificao e classificao dos
embries; e (3) transferncia ou congelao dos embries.
Superovulao de doadoras
A primeira etapa da TE diz respeito seleo de doadoras. Nesse
sentido, avalia-se o gentipo, o fentipo, a prognie (quando disponvel), aspectos sanitrios do animal, o histrico reprodutivo e ainda
realizado um exame ginecolgico completo visando a identificao de
eventuais patologias ou qualquer outra condio de restrio. A superovulao de doadoras de embries tem a finalidade de induzir o crescimento e a consequente ovulao de vrios folculos em uma espcie monovulatria (bovinos). Os protocolos de superovulao (SOV)
so baseados em conhecimentos da fisiologia reprodutiva dos bovinos, especificamente dinmica do crescimento de folculos ovarianos
e endocrinologia do ciclo estral. importante que se tenha em mente
alguns aspectos bsicos de fisiologia da reproduo, como por exemplo, a ocorrncia de, na grande maioria dos animais, duas ou trs
ondas de crescimento folicular durante um ciclo estral. A emergncia de cada onda precedida por uma elevao nas concentraes de
FSH, o que causa o desenvolvimento de um pool de folculos pequenos (3mm a 4mm em dimetro), que iro crescer simultaneamente
at que se estabelea o processo de divergncia e dominncia folicular. O folculo dominante passar a crescer a taxas maiores do que os
chamados subordinados e exercer um efeito negativo sobre eles, causando sua atresia. O folculo dominante se torna ovulatrio, pois produz estradiol a concentraes suficientes para induzir a ovulao, caso
no haja o bloqueio da progesterona produzida pelo corpo lteo (aps
a ocorrncia de lutelise; proestro). Havendo alta progesterona (diestro), o folculo dominante ir iniciar sua regresso (atresia), haver
uma elevao no FSH circulante e uma nova onda de crescimento folicular ir emergir (Figura 4) (GINTHER etal., 1996).
673
biotecnologia
Emergncia da
2 onda
Dimetro folicular (mm)
12
10
FD1
Fov
Fd2
FSH
P4
8
6
LH
4
0
9 10 11
15
20 21
Dias do ciclo
Figura 4. Representao esquemtica da dinmica folicular na vaca, em um

ciclo caracterizado por duas ondas de crescimento folicular. O folculo dominante da primeira onda (FD1) cresce em ambiente com alta progesterona,
o que impede a ovulao. J o folculo dominante da segunda onda (FD2) se
torna ovulatrio (Fov) aps a reduo na concentrao de progesterona causada pela lise do corpo lteo (CL) que, em geral, se inicia aps o 16-18 dia
do ciclo estral. As curvas representam concentraes plasmticas usuais de
hormnio folculo-estimulante (FSH), progesterona (P4) e hormnio luteinizante (LH).
O tratamento superovulatrio deve ser iniciado no momento em

que h um maior nmero de folculos aptos a responder ao tratamento, ou seja, um maior nmero de folculos pequenos (3mm a
4mm) em crescimento (MAPLETOFT etal., 2002). Considerando-se
o ciclo estral da vaca, de maneira geral, recomendado o incio do
tratamento por volta do 9-10 dia do ciclo, que coincide com o dia de
emergncia da segunda onda de crescimento folicular (GINTHER
etal., 1989). Neste momento, o folculo dominante da primeira onda
j est afuncional e em regresso, e h um pool de folculos crescendo,
aptos a responder ao tratamento. A ausncia de um folculo dominante funcional durante a SOV resulta em maior nmero de folculos ovulatrios e maior nmero de embries coletados (BUNGARTZ;
674
NIEMANN, 1993). Inicialmente, a superovulao era induzida por

meio de tratamentos a base de gonadotrofina corinica equina (eCG),
um hormnio que possui ao folculo estimulante (MONNIAUX
etal., 1983). No entanto, quando preparaes a base de FSH se tornaram disponveis comercialmente (principalmente de origem suna),
esse tipo de produto passou a ser utilizado em grande nmero de tratamentos superovulatrios (MONNIAUX etal., 1983).
Atualmente, o protocolo bsico para induo da superovulao em
bovinos consiste de seis a oito aplicaes de produtos a base de FSH
a intervalos de 12 horas, durante trs a quatro dias, em esquema de
doses decrescentes, ou seja, 40% da dose total no primeiro dia; 30%
no segundo dia; 20% no terceiro; e os 10% restantes no ltimo dia
de tratamento (Figura 5) (MONNIAUX etal., 1983). Dentro do protocolo, h ainda tratamentos (uma ou duas injees) com prostaglandina F2, para que se cause a lise do corpo lteo presente e permita-se
doadora manifestar cio e ovulao. Em geral, um ou dois dias aps
o trmino da SOV, a doadora de embries ir apresentar cio e dever
ser inseminada artificialmente (12 e 24 horas aps o incio do estro).
Obviamente, este protocolo pode ser adaptado e (ou) modificado, mas
deve-se sempre respeitar os eventos que ocorrem em nveis ovarianos
e endcrinos durante o ciclo estral da vaca.
Induo da superovulao
Estro
Dia 0
Cio base
Coleta
e
TE
FSH FSH FSH FSH
10
11
12
PGF2
13
14
15
Cio
e
IA
IA
Dia 21
Figura 5. Ilustrao do protocolo bsico de induo da superovulao em

bovinos, com base em observao de cio (Dia 0); estimulao com FSH exgeno a partir da emergncia da segunda onda de crescimento folicular (Dia
10); induo de lutelise com prostaglandina F2 (PGF2); e coleta de embries sete dias aps o estro e IA.
675
biotecnologia
Sincronizao de doadoras e receptoras

O resultado positivo da transferncia de embries (gestao)
depende, entre outros fatores, do grau de sincronia entre doadora e
receptora. O embrio recm transplantado ao tero de uma receptora
precisa encontrar um ambiente fisiologicamente compatvel, em termos endcrinos e de secreo, com a sua idade (sete dias) para que
continue o seu desenvolvimento normal. Melhores taxas de gestao
so encontradas quando h uma sincronia de 24 horas entre o cio da
doadora e da receptora (HASLER etal., 1987), sendo por isso recomendada a utilizao de receptoras no D7 1 do ciclo estral (D0 = estro),
levando-se em conta que a doadora se encontra no D7.
Os mtodos de sincronizao de cios so bastante conhecidos e
variados, podendo ser utilizados progestgenos para prolongamento
da fase luteal, prostaglandina F2 e seus anlogos para induo de
lutelise e reduo da fase luteal, ou sincronizao da onda de crescimento folicular pela aplicao de estradiol ou GnRH.
H diferentes formas comerciais de progestgenos, sendo as principais os implantes auriculares e os dispositivos intravaginais. Seu uso
na sincronizao apresenta as vantagens de no ser dependente da
fase do ciclo estral e possibilitar maior flexibilidade na programao.
Desvantagens desse mtodo incluem custo elevado e traumas (irritao vaginal ou implante auricular). J o uso de prostaglandina F2
tem baixo custo, maior praticidade e apresenta ainda a vantagem de
os produtos comerciais estarem amplamente disponveis em lojas.
No entanto, a eficincia de sincronizao aps a aplicao de PGF2
limitada, pois a lutelise induzida s ir ocorrer durante a fase de
diestro (dias 6 a 15 do ciclo estral), quando o CL tem sensibilidade ao
produto. Uma segunda limitao diz respeito ao grau de sincronizao dos animais, visto que h diferenas de tempo entre a aplicao
de PGF2 e a manifestao de estro, que pode ocorrer to cedo quanto
48 horas e to tarde quanto 96 horas aps o tratamento. Esses distintos intervalos PGF2-Estro existem em razo do estdio de desenvolvimento do folculo dominante no momento do tratamento, o qual
ainda necessita de crescimento e maturao at que ocorra a ovulao (KASTELIC etal., 1990).
676
Atualmente, assim como na inseminao artificial, possvel na

TE a sincronizao da emergncia da onda de crescimento folicular
e subsequente induo da ovulao, permitindo assim a induo de
superovulao e coleta de embries em momento pr-determinado
(tempo fixo; SOVTF) e tambm a transferncia de embries em tempo
fixo (TETF) para receptoras com ovulao sincronizada (B etal.,
2002). Os princpios de SOVTF e TETF so semelhantes aos da IATF,
dizendo respeito basicamente: (1) sincronizao da onda folicular por
induo da ovulao ou atresia do folculo dominante pela aplicao de
preparaes a base de estradiol ou GnRH, associados progesterona
exgena; (2) superovulao com tratamento a base de FSH (SOVTF);
(3) induo da ovulao dos vrios folculos ovarianos (SOVTF) ou do
folculo dominante (TETF) pela aplicao de preparaes a base de
estradiol, GnRH ou LH; e (4) IA em tempo fixo (SOVTF) ou transferncia de embries sete dias aps o estro induzido (TETF). Os protocolos de SOVTF e TETF so ferramentas bastante teis quando h a
necessidade de programao das coletas e transferncias. Ainda, protocolos de TETF podem ser essenciais em locais onde h carncia de
mo de obra treinada para observao de cio em receptoras.
Procedimentos de coleta e transferncia de embries

Aps a induo da superovulao e inseminao artificial da doadora, faz-se necessrio a coleta de embries. Devido ao desenvolvimento embrionrio inicial em bovinos, em geral, coleta-se os embries entre seis e oito dias aps o estro (Dias 6, 7 e 8 do ciclo estral)
quando os embries j se deslocaram das tubas uterinas em direo
ao lmen uterino e se encontram na fase de mrula ou blastocisto
(SENGER, 2005). A programao da coleta inicia-se com a escolha
e organizao do material de coleta. Nesse momento importante a
existncia de uma listagem de todo o material necessrio (check list),
principalmente se a coleta for feita na fazenda. Com o material organizado e separado, inicia-se a preparao da doadora (o que inclui a
retirada de fezes do reto, limpeza e higienizao da regio perineal
e anestesia epidural em animais bravios, pode ser necessria uma
leve sedao para tranquilizar o animal), que, depois de higienizada
e anestesiada, segue para a coleta em si.
677
biotecnologia
O processo de coleta iniciado com a passagem de um cateter de

Foley pela crvix e posicionamento no corpo do tero ou na entrada
de um dos cornos. Em seguida, um pequeno balo inflado na extremidade do cateter para que no haja retorno de lquido e inicia-se a
lavagem dos cornos uterinos (flushing) com meio apropriado (soluo
salino-fosfato tamponada, PBS), utilizando-se um circuito de coleta
em forma de Y para que haja entrada e o retorno da soluo. O contedo do lavado uterino direcionado diretamente para um filtro coletor de embries, que ir filtrar o excesso de lquido e no permitir a
passagem de possveis embries. Ao final da coleta, o filtro, contendo
pequena quantidade de lquido e as provveis estruturas embrionrias
coletadas, levado ao laboratrio, lavado com soluo PBS, e o seu
contedo colocado em placas de Petri para rastreamento, identificao
e manipulao dos embries recuperados. Os embries so ento classificados por grau de qualidade (STRINGFELLOW; SEIDEL, 1998),
transferidos para meio de manuteno (holding). Nesse momento
decide-se quanto transferncia ou criopreservao dos embries
coletados. No caso de criopreservao, os embries so transferidos
para placas de Petri contendo uma soluo crioprotetora (por exemplo, etilenoglicol ou glicerol), envasados em palhetas de 0,25 mL, e
ento iniciado o processo de congelao. No caso de transferncia
a fresco, os embries em meio de manuteno so envasados diretamente para palhetas de 0,25 mL para que possam ser transferidos
para receptoras.
A prxima etapa inclui a seleo de receptoras e a transferncia
de embries propriamente dita. A seleo de receptoras uma etapa
extremamente importante no processo de TE, pois influencia diretamente os resultados em termos de taxa de gestao (STROUD;
HASLER, 2006). Receptoras de embrio devem estar sob excelente
manejo nutricional (bom escore de condio corporal), sanitrio (livre
de doenas) e reprodutivo (ausncia de patologias), ou seja, devem ser
manejadas com a mesma ateno oferecida s doadoras (STROUD;
HASLER, 2006). A condio sine qua non para uma receptora ser considerada apta a receber um embrio estar em sincronia com o ciclo
estral da doadora (Dia 71) e apresentar um corpo lteo (CL) funcional no momento da transferncia (JONES; LAMB, 2008). Nesse con-
678
texto, alm da avaliao visual da aparncia externa do animal, se faz

necessrio um exame do aparelho reprodutivo (tero e ovrios) com
o intuito de identificar a existncia de qualquer anormalidade uterina
(p. ex. infeco) e tambm identificar e localizar o corpo lteo (ovrio
direito ou esquerdo). O uso de ultra-sonografia na seleo de receptoras pode ser encarado como uma ferramenta adicional para auxiliar a tomada de deciso, mas no condio essencial. Alguns estudos indicaram que, desde que a receptora tenha apresentado estro
em sincronia com a doadora e apresente um corpo lteo palpvel no
Dia 7, ela est apta a receber um embrio, independente da qualidade
ultrassonogrfica do CL e de concentraes plasmticas de progesterona (SPELL etal., 2001).
A transferncia dos embries para receptoras aptas pode ser feita
pelo mtodo cirrgico ou no cirrgico, o mais utilizado. O mtodo
no cirrgico realizado sob leve anestesia epidural, por via transcervical, com o auxlio de um aplicador de TE (inovulador). O embrio
deve ser transferido no tero final do corno uterino ipsilateral ao ovrio contendo o corpo lteo. O diagnstico de gestao pode ser feito
precocemente (aos 28-30 dias de gestao; i.e., 21-23 dias aps a TE)
por meio de ultrassonografia ou por palpao retal aps os 45 dias de
gestao.
Realidades e limitaes da TE
Dados mundiais de coletas de embries indicam um nmero mdio
de embries viveis por coleta de 6,22; considerando dados de 122 mil
coletas. Analisando-se os dados dos diferentes continentes, a variao
de 5,1 a 7,6 embries viveis/coleta (THIBIER, 2008). Esses dados
representam uma das grandes limitaes da TE, pois a mdia no
reflete a realidade, em que so observadas respostas excelentes (25-30
embries viveis) e respostas sofrveis (nenhum embrio coletado).
Essa grande variao na resposta pode ser explicada por alguns fatores: (1) diferenas no tratamento superovulatrio (preparao hormonal, durao e momento do tratamento); (2) fatores inerentes ao animal doador (variao individual na reserva de folculos ovarianos e,
consequentemente, na populao de folculos disponveis para recrutamento; o status ovariano no incio do tratamento; e resposta ao FSH
679
biotecnologia
exgeno); (3) fatores inerentes ao ambiente e histria do animal (condio nutricional, histrico reprodutivo, repetidas superovulaes,
idade e raa); e (4) erros no procedimento de coleta e preparao das
doadoras (MAPLETOFT etal., 2002).
Apesar dos grandes avanos em tecnologia, a mdia de embries
viveis/coleta pouco variou nas ltimas dcadas, como demonstrado
por um estudo com 1.733 doadoras, que foram coletadas nos anos
de 1979 ou 1999 (HASLER, 2003). Em um programa de TE, aproximadamente 1/3 (25% a 35%) das doadoras no respondero ao tratamento (sem produo de embries); 50% a 60% tero respostas
ruins ou intermedirias; e apenas um nmero reduzido de doadoras
ter respostas acima da mdia, ou seja, boas ou excelentes. Ainda,
cerca de 30% das doadoras produziro a maioria (~70%) dos embries (DONALDSON, 1984; MAPLETOFT etal., 2002).
Quando se inicia um programa de transferncia de embries, seja
ele de carter comercial ou no, deve-se ter em mente que para o
sucesso da manipulao hormonal do crescimento de folculos ovarianos necessrio um bom conhecimento da fisiologia reprodutiva e
endocrinologia da fmea bovina. Alm disso, importante saber que
a tcnica de TE apresenta limitaes inerentes fisiologia das doadoras (variao individual) e que a tcnica caracterizada por grande
varincia nos resultados. Embora um grande progresso tenha sido
feito em fisiologia da reproduo dos bovinos, fatores inerentes doadora que afetam a resposta superovulatria so apenas parcialmente
entendidos.
Produo in vitro de embries

A inseminao artificial (IA) em bovinos foi o primeiro passo para
acelerar a transferncia de caractersticas desejveis, permitindo a disseminao de genes de machos considerados superiores e a melhoria
do nvel zootcnico dos rebanhos. Um reprodutor bovino pode produzir milhares de bezerros durante sua vida produtiva pela IA, enquanto
que no mesmo perodo, uma fmea no capaz de produzir mais do
que 8 a 10 bezerros. Portanto, o possvel ganho gentico obtido pela
linhagem materna era extremamente limitado. Com o desenvolvimento de tcnicas de reproduo assistida em animais, ocorreu um
680
grande avano na otimizao e multiplicao de fmeas de interesse

no s para a produo animal, mas tambm para a conservao e
regenerao de espcies animais em perigo de extino.
A transferncia de embries (TE) proporciona um melhor aproveitamento de matrizes de elevado mrito gentico, podendo aumentar,
em mdia, 10 vezes o nmero de crias/ano. Com o advento da produo in vitro de embries (PIV) esse potencial de multiplicao se torna
ainda maior, pois aumenta consideravelmente, o nmero de produtos/vaca/ano. Alm disso, essa tcnica tambm abre a possibilidade
de utilizar bezerras pr-pberes, vacas em incio de gestao, vacas
com subfertilidade adquirida e vacas senis.
Embries produzidos in vitro so aqueles produzidos pela manipulao de gametas, fora de organismo materno. Essa tcnica, inicialmente, se resumia a fecundao in vitro (FIV), entretanto, aps o
nascimento do primeiro bezerro em 1981 (BRACKETT etal., 1982),
avanos considerveis foram obtidos. Atualmente, essa tecnologia se
refere combinao de vrios processos interdependentes, que vo
desde a obteno dos ocitos imaturos transferncia dos embries
para as fmeas receptoras que levaro a gestao a termo.
Obteno de ocitos imaturos para PIV

Ocitos bovinos imaturos juntamente com as clulas do cumulus
que o rodeiam, complexo cumulus-ocito (COC), podem ser recuperados dos ovrios in vitro quando se utiliza ovrios provenientes de
abatedouros ou de animais mortos e in vivo, que pode ser realizada
cirurgicamente ou por ultrassonografia transvaginal (OPU).
A recuperao in vitro de COC pode ser realizada por dissecao ou
fatiamento dos ovrios ou aspirao dos folculos ovarianos. A dissecao permite o isolamento mecnico de folculos individualmente,
sendo um processo trabalhoso e demorado. O fatiamento dos ovrios proporciona um maior nmero de estruturas recuperadas e,
importante quando se trabalha com ovrios isolados de vacas de elevado mrito gentico. Nesse caso, alm da puno dos folculos visveis na superfcie do ovrio, feita a dissecao desses ovrios maximizando o seu aproveitamento. A aspirao mtodo mais eficiente
681
biotecnologia
e mais utilizado, e pode ser realizada com uma seringa ou com uma
agulha acoplada a uma bomba a vcuo, com a qual se aspiram todos
os folculos presentes na superfcie dos ovrios cujas medidas variem
entre 2mm e 8mm de dimetro (GORDON, 2003). A quantidade e
qualidade dos COCs recuperados so influenciadas por vrios fatores, tais como: poca do ano; estado fisiolgico do animal; tamanho
do folculo aspirado (DODE etal., 2001); raa e idade das doadoras.
A recuperao de COCs in vivo pode ser realizada cirurgicamente,
quando animais muito jovens so utilizados, ou por OPU, em que a
obteno de ocitos feita pela puno folicular com uma agulha acoplada a uma sonda transvaginal, de forma que, os folculos a serem
puncionados so visualizados na tela do ultrassom. A aspirao dos
folculos realizada com auxlio de uma bomba a vcuo, sendo os
COCs, juntamente com o lquido folicular, transportados por um sistema de cnulas ao tubo coletor. A mdia de ocitos obtidos tambm
varia com a raa, a idade, o estgio fisiolgica da doadora e a estratgia de puno adotada. possvel puncionar os folculos de uma doadora duas vezes por semana, uma vez por semana ou uma vez a cada
duas semanas, sendo as duas ltimas alternativas possveis de dobrar
os resultados mediante a estimulao hormonal (GOODHAND etal.,
1999). Independente da estratgia, o resultado final esperado de pelo
menos uma gestao por semana por doadora (PEIXER etal., 1996;
BOUSQUET etal., 2000).
Independente do procedimento utilizado, aspirao in vivo ou in
vitro, os COCs coletados juntamente com o lquido folicular so depositados em um tubo estril, que se deixa decantar por em torno de 10
minutos. Aps esse perodo, o decantado transferido para uma placa
de Petri, em que ser realizada a busca e seleo dos ocitos.
Seleo de ocitos
Aps a recuperao, COCs devem ser classificados, utilizando como
critrio a homogeneidade e colorao do citoplasma e aparncia, compactao e nmero de camadas de clulas do cumulus. Essa morfologia dos CCOs tem sido utilizada como mtodo de seleo visual por
ter sido correlacionada com as taxas de blastocistos. Existem vrios
682
sistemas para avaliao da morfologia de ocitos, tais como o sistema

de Stojkovic et al. (2001) descrito abaixo:
Qualidade 1: Complexo cumulus ocito com citoplasma homogneo e com granulaes finas e mltiplas camadas compactas
de clulas do cumulus.
Qualidade 2: Ocito com citoplasma homogneo com pequenas reas mostrando pigmentaes irregulares, Cumulus compacto menor do que na categoria 1 com pelo menos 5 camadas
completas.
Qualidade 3: Ocito com citoplasma heterogneo/vacuolizado,
a zona pelucida coberta com pelo menos 3 camadas de clulas
do cumulus e (ou) com pequenas reas desnudas.
Qualidade 4: Citoplasma heterogeneamente pigmentado e o
cumulus completamente/parcialmente ausente ou expandido.
Maturao in vitro de ocitos

Durante a ovognese, os ocitos de mamferos permanecem retidos no estgio de diplteno da prfase da primeira diviso meitica,
desde a vida fetal at pouco antes da ovulao. A retomada da meiose
pode ser mediada por um estmulo hormonal in vivo, ou pela retirada do ocito de dentro do folculo (WASSARMAN; ALBERTINI,
1994). Portanto, quando os ocitos so aspirados dos folculos ovarianos (normalmente entre 2mm a 6mm de dimetro) para serem
utilizados na PIV, eles ainda so imaturos e necessitam sofrer o processo de maturao in vitro (MIV), que realizada cultivando os ocitos, logo aps a aspirao do folculo e seleo dos COCs, em meio de
maturao, com temperatura e atmosfera apropriada, por um perodo de 22 a 24 horas.
A maturao envolve mudanas nucleares e citoplasmticas que
devem ocorrer simultaneamente e que conferem aos ocitos a capacidade de serem fecundados, descondensarem a cabea do espermatozide, formarem os pr-ncleos e terem desenvolvimento embrionrio normal (DODE etal., 2000a).
Os eventos nucleares envolvem reorganizao da rede de microtbulos, rompimento do envoltrio nuclear, condensao dos cromossomos e progresso para metfase I, anfase I, telfase I, expulso do
primeiro corpsculo polar e reteno no estgio de metfase II (CHA;
CHIAN, 1998).
683
biotecnologia
No que se refere ao citoplasma, ocorre reprogramao na sntese

protica, mudana na atividade da protena quinase ativada por mitgenos (MAPK) e do fator promotor da maturao (MPF), desenvolvimento dos mecanismos de liberao de Ca++, e aquisio da capacidade de descondensar a cabea do espermatozide (SALAMONE
etal., 2001). Ainda durante esse perodo, ocorrem mudanas na organizao citoplasmtica, tais como: um contnuo desenvolvimento dos
estoques de lipdios;, reduo do aparelho de Golgi; redistribuio de
ribossomos; rearranjo das mitocndrias; e alinhamento dos grnulos
corticais prximos membrana plasmtica (DIELEMAN etal., 2002).
O aumento no estoque de lipdios pode estar associado com a formao de um pool de energia essencial para o ocito suportar o desenvolvimento aps a fecundao.
Outro evento que ocorre na maturao a expanso das clulas do
cumulus, que circundam os ocitos. Essas so clulas da granulosa
especializadas que esto metabolicamente associadas entre si e com
o ocito. No ocito imaturo, elas esto muito compactadas e durante
a maturao iniciam a secreo de cido hialurnico que se deposita
entre elas, separando-as e causando a expanso dessas clulas.
Fecundao in vitro
Para a fecundao in vitro, espermatozides e ocitos maturos so
co-incubados, em um meio especifico, por um perodo em torno de
18 horas, sendo possvel co-incubar por perodos menores sem afetar
as taxas de produo de embries (DODE etal., 2002a).
Para que a FIV ocorra com sucesso, necessrio que os ocitos
tenham sofrido uma maturao completa e que os espermatozides
tenham sido adequadamente preparados.
Para a preparao do smen a ser utilizado na FIV, vrios mtodos para remover o plasma seminal e (ou) crioprotetor e melhorar as
caractersticas seminais tem sido descritos. Entre eles, pode-se citar
a lavagem por centrifugao; gradientes de densidade; filtragem em
coluna de fibra de vidro; e migrao ascendente. Os mais utilizados
so gradiente de densidade utilizando percoll, e a migrao ascendente
conhecida por swim-up.
684
No Swim-up o smen depositado no fundo de um tubo contendo

meio de preparao de smen e deixado em repouso por aproximadamente 60 minutos. Os espermatozides vivos migram por motilidade ascendente para a poro superior do meio, os espermatozides
mortos, diluidor e demais constituintes do smen permanecem no
fundo do tubo. A poro superior recuperada e utilizada para a FIV.
No gradiente de percoll, os espermatozides tambm so selecionados pela motilidade atravs da passagem por diferentes gradientes. Para separao espermtica se utiliza duas concentraes, que
em geral so de 45% e 90%, depositadas em um tubo sendo o smen
colocado na superfcie do gradiente. Aps centrifugao, o sobrenadante retirado e o pellet lavado e utilizado para a FIV.
Alm da qualidade dos ocitos, do mtodo utilizado para preparao do smen e do tempo de co-incubao, outros fatores podem afetar a taxa de fecundao, tais como: a dose inseminante; a interao
touro-vaca; e a diferena entre touros na capacidade de fecundar e produzir embries, sendo a variao individual de touros um dos principais fatores que interferem produo comercial de embries PIV.
Cultivo de embries produzidos in vitro

Aps a fecundao in vitro, os embries so transferidos para o cultivo embrionrio onde permanecem por um perodo de sete dias, at
atingirem o estgio de blastocisto, quando ento podem ser transferido para o tero de fmeas receptoras que levaro a gestao a termo.
O cultivo in vitro de embries requer um sistema que suporte o
desenvolvimento embrionrio. Vrios sistemas de cultivo foram
desenvolvidos e utilizados. Esses sistemas incluem o cultivo em oviduto de hospedeiro intermedirio, co-cultivo com vrios tipos de clulas somticas e cultivo livre de clulas somticas.
Cultivo in vivo em oviduto de coelhas ou ovelhas at o estgio de
blastocisto foi inicialmente muito utilizado, mas caiu em desuso aps
o desenvolvimento dos sistemas de co-cultivo. Apesar de esse mtodo
requerer procedimento cirrgico e ser oneroso, ainda utilizado por
alguns grupos de pesquisa (LONERGAN etal., 2006; GALLI etal.,
2003).
685
biotecnologia
O co-cultivo com clulas somticas tornou possvel o cultivo totalmente in vitro de embries PIV. Sendo que vrios tipos de clulas
somticas tais como da granulosa, epiteliais de oviduto, uterinas e
clulas de linhagem estabelecidas para cultivo como clulas VERO e
clulas BRL (Buffalo rat Liver Cells) podem ser utilizadas.
Entretanto, com o desenvolvimento do meio SOF, que foi criado
baseado na constituio do fluido do oviduto de bovinos, foi eliminada a necessidade de co-cultivo (WATSON, 2000). Esse meio, contudo, requer uma atmosfera de 5% de 02, a qual difere da utilizada
para a MIV e FIV. Estudos tm demonstrado que o meio SOF tambm pode ser utilizado com alta tenso de O2 sem afetar o desenvolvimento embrionrio, desde que as clulas do cumulus remanescentes
no zigoto aps a FIV sejam mantidas (CORRA etal., 2008).
Diferena entre os embries in vivo e in vitro

Embries produzidos in vitro e os produzidos in vivo diferem em
vrias caractersticas, tais como: aspectos morfolgicos e metablicos; alteraes cromossmicas; nmero de clulas; e expresso de
RNAm especficos, assim como, uma maior sensibilidade a criopreservao (VAN SOOM etal. 1996; VIUFF etal., 1999; BERTOLINI
etal., 2002). Essas diferenas, possivelmente determinam o comeo
de uma srie de problemas que levam uma reduo na eficincia da
tcnica (FARIN etal., 2001).
Os embries PIV apresentam maior vacuolizao, menor nmero
de clulas, menor densidade de mitocndrias, maior densidade de
lipdios (CROSIER etal., 2001) e junes incompletas entre as clulas do boto embrionrio e trofoblasto (FARIN etal., 2001). Em estudos utilizando a tcnica de FISH para avaliar poliploidias, foi determinado que 72% dos embries produzidos in vitro eram mixoplides
e que apesar de a mixopolidia ocorrer tambm em embries in vivo
nos in vitro, ocorre com maior frequncia e em estgios mais precoces de desenvolvimento (VIUFF etal., 1999).
Na PIV cerca de 30% a 50% dos ocitos inseminados chegam ao
estgio de blastocisto e os ndices de gestao esto em torno de 40%
(VAN WAGTENDONK-DE LEEUW, 2006). As maiores perdas no
desenvolvimento embrionrio ocorrem nos estgios de 8 para 16 clulas (ativao do genoma do embrio) e ps-transferncia, em torno
dos dias 14 e 15 da gestao.
686
Aplicaes da PIV
A utilizao comercial dessa tcnica ainda est limitada ao custo, e
vai depender do balano entre o mrito gentico do produto (bezerro)
e o custo de sua produo. Entretanto, apesar do custo ainda ser alto,
a PIV est sendo gradualmente integrada a programas de melhoramento gentico, como uma ferramenta complementar para multiplicao animal.
Em termos prticos, o potencial da PIV fica mais evidente quando
se discute suas diferentes aplicaes. medida que o sistema PIV
melhora, novas alternativas surgem como a criopreservao do ocito
e do embrio para formao de bancos de germoplasma comercial ou
para preservao de espcies. No entanto, os maiores impactos da PIV
para a produo animal so: expanso gentica rpida pelo aumento
do nmero de produtos provenientes de fmeas geneticamente superiores; produo de embries de vacas com subfertilidade adquirida,
vacas em incio de gestao e vacas senis, bem como, bezerras pr-pberes; possibilidade de se estabelecer fbricas de embries com
grau de sangue definido segundo o ecossistema e sistema de produo; e sua aplicao associada sexagem de espermatozides produzindo vrias gestaes com apenas uma dose inseminante sexada.
Consideraes sobre a produo in vitro de embries bovinos

Apesar dos avanos observados nessa rea nos ltimos anos, vrios
aspectos precisam ser ainda esclarecidos. As questes esto associadas avaliao da competncia biolgica dos gametas e ao prprio sistema de cultivo. Estudos bsicos sobre os diversos mecanismos envolvidos esto sendo conduzidos a nvel mundial. Os resultados desses
estudos esclarecero os aspectos relativos maior susceptibilidade
dos embries PIV criopreservao, a menor viabilidade dos ocitos
de bezerras quando comparados aos de vacas e as baixas taxas de prenhez devido menor qualidade desses embries.
importante salientar que, por se tratar de uma tcnica relativamente nova, o monitoramento rigoroso das doadoras de ocitos,
dos ocitos, dos embries e dos produtos nascidos de fundamental importncia para que essa tcnica possa ser utilizada com segurana, de forma adequada e nas situaes mais indicadas.
687
biotecnologia
Transferncia nuclear (clonagem animal )

A transferncia nuclear ou clonagem com clula somtica uma
tcnica em que o ncleo (DNA) da clula transferido para dentro de
um ocito em fase de metfase II, com o objetivo de gerar um novo
indivduo, geneticamente idntico ao animal doador da clula somtica (TIAN etal., 2003)(Figura 6).
a) Animal doador
b) Cultura de clulas
doadoras
d) Enucleao
c) Ocitos
maturados
e) Transferncia
nuclear
i) Nascimento
dos clones
h) Transferncia
para receptoras
f) Fuso celular g) Desenvolvimento de

embrio clonado
Figura 6. Representao esquemtica do processo de transferncia nuclear.

As clulas so coletadas do animal doador (a) e cultivadas in vitro (b). Um
ocito maturado em metfase II (c) ento tem seu ncleo retirado (enucleado) (d) e a clula somtica do animal doador transferida para o interior
do ocito enucleado (e). A clula somtica e o ocito so fusionados (f) e os
embries se desenvolvem in vitro at a fase de blastocisto (g). Os blastocistos
podem ento ser transferidos para uma fmea receptora e os animais clonados nascem aps completarem o perodo de gestao (i).
Fonte: Adaptado de Tian etal. (2003).
O procedimento de transferncia nuclear tem demonstrado que

genes inativados durante a diferenciao tecidual podem ser completamente reativados pelo processo de reprogramao nuclear. Esse
evento se resume na reverso da diferenciao celular, fazendo que
a clula adquira novamente a condio de totipotncia. A transferncia nuclear com clula somtica pode ser utilizada para gerar mltiplas cpias de animais geneticamente superiores; para produzir
animais transgnicos; para produzirem protenas de utilidade farmacuticas ou para genotransplantes (STICE etal., 1998; POLEJAEVA;
CAMPBELL, 2000); ou para preservar espcies em extino.
688
Em geral, o primeiro passo do processo de clonagem envolve a

coleta das clulas somticas do animal a ser clonado. A escolha da
clula somtica para o uso na transferncia nuclear varia grandemente
(EDWARDS etal., 2003). Tem sido utilizadas clulas somticas doadoras provenientes de vrios tecidos e de animais de vrias idades
(fetos, recm nascidos, jovens, adultos e at de animais mortos a um
relativo curto perodo aps a morte). Animais clonados vivos tm sido
obtidos de aproximadamente 12 dos 200 tipos de tecidos adultos diferenciados que existem nos mamferos. As razes para isso permanecem desconhecidas. Uma leve suposio existente que os tecidos
de animais mais jovens e tecidos com menos diferenciaes seriam
a melhor fonte de clulas doadoras, mas nenhuma evidncia conclusiva suporta essa hiptese (VAJTA; GJERRIS, 2006). Aps a coleta, as
clulas somticas podem ser utilizadas imediatamente ou aps longo
tempo de cultivo (KUBOTA etal., 2000). Bovinos adultos tem sido clonados utilizando clulas do cumulus (TANI etal., 2001); fibroblastos
(HEYMAN etal., 2002); clulas da granulosa (PIEDRAHITA etal.,
2002); clulas da glndula mamria (KISHI etal., 2000); clulas musculares (SHIGA etal., 1999); clulas do oviduto (GOTO etal., 1999);
e clulas uterinas (KATO etal., 2000).
O Segundo passo, talvez o mais trabalhoso da transferncia nuclear,
requer a remoo do DNA materno (enucleao) de um ocito em
metafase II (MII). Esse processo exige o uso de micropipetas e se inicia aproximadamente 18 horas aps os ocitos terem sido depositados
no meio de maturao in vitro. A enucleao realizada usualmente
mecanicamente pela fixao do ocito em posio apropriada com
a ponta polida de uma pipeta de fixao com um vcuo suave e pela
aspirao da cromatina contida em parte do ocito por meio de uma
pipeta de enucleao afiada, que ultrapassa a zona pelcida (VADJA;
GJERRIS, 2006).
Para se evitar lises, os ocitos podem ser incubados em presena de
um inibidor de microfilamentos (cytochalasin B). Essa substncia relaxa
o citoplasma permitindo a remoo mecnica de 5% a 15% do citoplasma do ocito contendo o DNA materno. H vrias estratgias para
encontrar a cromatina no citoplasma do ocito, que devem ser realizadas com cautela para evitar danos e aumentar a eficincia do procedi-
689
biotecnologia
mento (VADJA; GJERRIS, 2006). Na maioria das metodologias, o DNA

pode ser visualizado pelo corante Hoechst e iluminao ultravioleta.
Para a clonagem de bovinos, os ocitos so geralmente obtidos de
fmeas abatidas em frigorficos ou de animais vivos, os quais tm seus
folculos aspirados com o auxlio do ultrassom (BRUGGERHOFF
etal., 2002).
O prximo passo da transferncia nuclear insero do ncleo da
clula somtica no interior do citoplasma do ocito, construindo uma
estrutura equivalente a um embrio de uma clula. Para isso, inicialmente, uma clula somtica inserida mecanicamente no espao
perivitelino (EPV) do ocito por meio de micropipetas e, em seguida,
a clula somtica integrada ao citoplasma do ocito pela aplicao de
pulsos eltricos (GIBBONS etal., 2002). A clula somtica no interior
do EPV alinhada entre dois eletrodos, e pulsos com uma corrente
eltrica (por exemplo: 2.2 kV/cm por 40 s) poder produzir mais de
70% de estruturas fusionadas (EDWARDS etal., 1999). A eletrofuso dependente do contato da clula somtica com o citoplasma do
ocito, em que as membranas de cada citoplasma podero interagir
aps a formao de poros (FIRST; PRATHER, 1991). Dentro de poucos minutos, aps a introduo da clula somtica no citoplasma,
ocorre a quebra da membrana nuclear e a condensao da cromatina
(CAMPBELL etal., 1996).
Em muitos casos, o pulso eltrico utilizado para fuso suficiente
para ativar o embrio clonado a se desenvolver. No entanto, o mtodo
de escolha de ativao nuclear do ocito reconstrudo por combinaes qumicas (GIBBONS etal., 2002) que mimetizam as aes
dos espermatozides aps a fecundao. Aps a ativao qumica,
os embries reconstrudos so cultivados e comeam a clivar. Nos
bovinos, uma transferncia no cirrgica do embrio para o tero da
fmea receptora pode ser realizada sete dias aps a ativao e o perodo cultivo.
Com a transferncia nuclear convencional tem sido relatado o nascimento de animais vivos de 11 espcies, incluindo bovinos, sunos,
ovinos e caprinos (EDWARDS etal., 2003).
690
Aplicaes da transferncia nuclear

A clonagem animal apresenta teoricamente ilimitadas aplicaes na
pesquisa, indstria e agricultura, apesar do baixo nvel de eficincia.
No entanto, esforos esto sendo empregados para aumentar a eficincia ou identificar situaes em que o presente nvel de eficincia
possa resultar em avanos na competncia (GABOR; GJERRIS, 2006).
Tem sido sugerido que as aplicaes da clonagem de animais de
fazenda sejam divididas em duas reas: (a) biomdica; e (b) agropecuria (LEWIS etal., 2004).
Aplicaes biomdicas
O maior potencial da clonagem de animais de fazenda parece ser
para as aplicaes biomdicas. Desde a dcada de 1980, tem sido
possvel modificar mamferos geneticamente por meio da injeo de
cpias de genes desejveis no interior dos pr-ncleos no zigoto. No
entanto, esse mtodo extremamente ineficiente, pois a maioria dos
embries injetados no se desenvolve, e menos de 1% dos animais
nascidos apresenta a mudana gentica desejada (GABOR; GJERRIS,
2006). Alm disso, o mtodo pode introduzir somente novos genes
no genoma e estes podem causar problemas, porque o local de integrao aleatrio (PATERSON etal., 2003).
Aps vrias tentativas, a transferncia nuclear de clula somtica
tem se configurado na forma mais eficiente de produzir animais geneticamente modificados. Pela introduo de modificaes genticas nas
clulas doadoras e escolha daquelas com a mudana desejada para o
procedimento de clonagem, modificaes genticas mais precisas no
genoma animal podem ser garantidas. Ademais, pela perspectiva econmica e aplicaes biomdicas, a ineficincia da tecnologia de clonagem um problema menor, uma vez que os animais que sero criados tero um valor comercial relativamente alto. Adicionalmente, a
transferncia nuclear com clula somtica pode ser utilizada para uma
rpida multiplicao dos animais transgnicos, os quais iro carregar
as mudanas desejadas (PATERSON etal., 2003).
As duas aplicaes da transferncia nuclear animal que parecem
ser mais realistas para os prximos anos so a criao de animais
691
biotecnologia
modelos para doenas humanas e os animais biorreatores (GABOR;

GJERRIS, 2006).
Modelos para doenas
Os modelos para doenas so animais preparados para expressar,
genotipicamente e fenotipicamente certa doena humana. Eles podem
ser utilizados tanto para o entendimento da doena, como para iniciar
testes para possveis tratamentos. No entanto, esses modelos apresentam limitaes devido s diferenas fisiolgicas com o humano, e tambm devido ao limitado tempo de vida dos animais, especialmente o
camundongo (GABOR; GJERRIS, 2006). Os animais geneticamente
modificados podem oferecer uma soluo para esse problema. Um
exemplo disso mencionado por Paterson etal. (2003), em que a
criao de uma ovelha que expressa fibrose cstica prevista. Os ovinos e especialmente os sunos so animais ideais para esse objetivo,
devido s similaridades na fisiologia e no tamanho dos rgos com
os humanos. Alm disso, esses animais so relativamente baratos,
a reproduo e manuteno so bem estabelecidas, e o longo tempo
de vida permite que as doenas se manifestem como nos humanos.
Um grande nmero de genes candidatos est disponvel para o possvel estabelecimento de doenas humanas, incluindo doenas neurodegenativas (Parkinson, Alzheimer), alteraes de pele (psoriase) ou
outras doenas com suspeita ou com gentica conhecida, tais como:
diabetes mellitus, arteriosclerose e cncer de mama.
Biorreatores
Os Biorreatores so animais transgnicos que apresentam genes
que produzem protenas humanas inseridas no genoma animal. Essas
protenas podem ser recuperadas do animal e utilizadas no setor biomdico para fins medicinais. A maioria das pesquisas nesse campo
tem sido desenvolvida para obter animais transgnicos para expressarem protenas desejadas no leite. Potencialmente, protenas para o
tratamento de vrias doenas humanas podem ser produzidas dessa
forma no futuro. Protenas tais como o fator de coagulao IX, antitrombina humana e alfa 1-antitripsina tm sido recuperadas experimentalmente de animais transgnicos e clonados. Entretanto, a
692
ineficincia das tecnologias e a rigorosa regulao da medicina so

obstculos para o desenvolvimento da tecnologia dos biorreatores. O
risco da introduo de novas doenas nos humanos (zoonoses) pelo
uso de animais tem criado a necessidade de amplos testes para esses
compostos biolgicos recuperados antes da comercializao. Ainda,
o custo de produo total incluindo a construo do gene, a produo do animal transgnico, a extrao e purificao do produto , deve
ser comparado com as oportunidades de renda para ampliar a viabilidade comercial (LEWIS etal., 2004).
Aplicaes agropecurias
Embora os problemas tcnicos e cientficos sejam similares a rea
biomdica, as aplicaes da clonagem na agropecuria tm sido altamente produtivas, por tornar eventualmente o procedimento vivel
com custo eficiente.
A clonagem tem sido utilizada para criar cpias de animais com
alto valor gentico, tais como vacas com alta produo de leite ou
touros com qualidade de carne superior (PATERSON etal., 2003).
Alternativamente, a clonagem pode ser utilizada para produzir cpias
de animais cuja linhagem so especialmente demandadas nos programas de cruzamento, e dessa forma, evitando a necessidade de repetir
vrios ciclos de cruzamento. Como exemplo, clonar um touro que tem
uma linhagem desejada e utiliz-lo para o cruzamento e aumentar o
nmero de filhos; ou clonar um grande nmero de animais para melhorar a qualidade gentica geral do rebanho (PATERSON etal., 2003).
A clonagem combinada com a modificao gentica animal tem
sido considerada uma melhor opo para competir com os esquemas
de cruzamentos tradicionais, uma vez que caractersticas que no
podem ser introduzidas de outra maneira nos animais podem, com
essa associao, ser disseminadas para uma populao. Nesse caso,
as principais estratgias de associao entre a clonagem e modificao gentica incluem o aumento da resistncia de uma animal a doenas, tais como a mastite (WALL etal., 2005), touros transgnicos que
produzem somente filhas fmeas ou somente filhos machos (FABER
etal., 2003), e vacas leiteiras que produzem casena modifica e alterao na sua proporo, melhorando desta forma a qualidade no leite
693
biotecnologia
(BROPHY etal., 2003). Uma outra possibilidade gerar animais que

podem produzir menos efeitos negativos ao meio ambiente. O exemplo mais conhecido desse caso o enviropigTM, ou seja, um suno que
tem a capacidade de digerir o fitato das plantas e, dessa forma, liberar menos fosfato nas fezes e consequente menos poluio ambiental (KUES; NIEMANN, 2004).
Uma das preocupaes na produo de animais clonados est relacionada ao possvel risco a sade humana devido ao consumo dos produtos desses animais. Porm, Takahashi e Yoshihio (2004) no encontraram diferenas biolgicas entre a carne de bovinos clonados com o
uso de clulas embrionrias e somticas em comparao com animais
no clonados. Da mesma forma, Tom etal. (2004) no encontraram
diferenas no valor nutricional do leite e da carne de produtos bovinos clonados em comparao aos no clonados. Embora, os produtos
de animais clonados paream no apresentar riscos a sade humana,
preciso levar em conta as limitaes na metodologia e quantidade
das pesquisas para confirmar a inocuidade dos produtos clonados.
Finalmente, uma das barreiras para implementao da clonagem
na agropecuria o fato de os clones no serem cpias exatas de um
animal j existente, pois o DNA mitocondrial proveniente do ocito
sempre representar uma pequena parte diferente no novo indivduo.
A importncia desse fato ainda no est clara. Alm disso, os efeitos
epigenticos influenciam tambm a similaridade no nvel do fentipo
entre o animal original e o animal clone (VADJA; GJERRIS, 2006).
Problemas ligados ao procedimento de transferncia nuclear

A maior limitao da clonagem de bovinos adultos utilizando a
transferncia nuclear de clula somtica a extrema ineficincia na
produo de descendentes vivos. A morte de embries e fetos clonados ocorre durante toda a prenhez. Alm disso, uma alta proporo
dos animais geralmente so maiores que o normal e morrem logo
aps o nascimento (EDWARDS etal., 2003).
Em geral, tem havido, no mnimo, cinco perodos de perdas observadas nos clones derivados de animais adultos. O primeiro, talvez o
mais drstico, ocorre durante o desenvolvimento pr-implantacional. Em bovinos (WELLS etal., 1998; HILL etal., 2000; EDWARDS
694
etal., 2001), assim como em outras espcies, incluindo caprinos, ovinos e coelhos, mais de 65% dos embries de uma clula falham em
se desenvolver em mrula compacta ou blastocisto.
Aproximadamente 50% dos embries clonados de bovinos estabelecem prenhez aps a transferncia de um nico embrio em fmeas
receptoras. Entretanto, prximo dos 30 dias e continuando at 60 dias
de prenhez, a morte embrionria pode ocorrer em 50 a 100% das prenhezes de clone (ausncia de batimento cardaco e destacamento das
membranas fetais), caracterizando o segundo perodo de perdas de
prenhezes (EDWARDS etal., 2003).
As perdas nas prenhezes de fetos clonados so significativamente
mais altas que o esperado para animais provenientes de forma natural (HASLER, 1998). A avaliao da placenta de embries clonados na
idade entre 40 e 50 dias de gestao, revela que as placentas so hipoplsicas, parcialmente desenvolvidas, com cotildones rudimentares,
ou eventualmente normais quando comparadas com placentas derivadas de embries de fecundao in vitro (HILL etal., 2000).
O terceiro perodo de perdas tem sido notado associado com o
aumento de abortos espontneos durante o segundo trimestre de prenhez (EDWARDS etal., 2001). Exames macroscpicos e histopatolgicos dos fetos abortados tem demonstrado poucas anormalidades,
porm, a placenta frequentemente se apresenta de forma anormal,
com uma marcada reduo dos cotildones (menos de 20 cotildones,
quando se espera para este perodo 70 a 120 estruturas). As membranas fetais tambm se apresentam delgadas e edematosas (SCHLAFER
etal., 2000).
O quarto perodo de perdas observadas para prenhezes de bovinos clonados ocorre durante o terceiro trimestre, entre os dias 200 a
265 de gestao. As perdas durante esse perodo so caracterizadas
pela grande incidncia de hidroalantide e morte fetal (CHAVATTEPALMER etal., 2002). Alm disso, o hidroalantide acompanhado
pela reduo do nmero de placentomas, hipertrofia de cotildones
e edema de membrana intercoltiledornria (EDWARDS etal., 2003).
Anasarca fetal com edema generalizado do umbigo so usualmente
presentes. Dessa forma, a morte de fetos clonados ocorre primariamente devido a inadequada placentao (EDWARDS etal., 2003).
695
biotecnologia
Lquido aminitico e mecnio esto geralmente presentes no pulmo de todos os fetos a termo, indicando algum grau de estresse no
tero antes da morte. A maioria dos bezerros derivados de uma placenta anormal necessita de monitoramento intensivo e terapia aps
o nascimento para tratar toda uma infinidade de complicaes. Os
principais problemas encontrados so imaturidade pulmonar, hipertenso pulmonar, dificuldade respiratria, hipxia, hipotermia, hipoglicemia, acidose metablica, aumento de veias e artrias umbilicais
(HILL etal., 2000). No entanto, a severidade das complicaes pode
no ser evidente por vrios meses aps o nascimento.
De acordo com Vadja e Gjerris (2006), as anormalidades relacionadas com a tcnica de transferncia nuclear podem ser causadas pelos
seguintes fatores: inapropriada clula doadora ou ocito receptor; inapropriada sincronia entre a fase do ciclo celular do ncleo doador e o
citoplasma receptor; inadequada reprogramao do genoma doador;
inapropriada manipulao dos ocitos, clulas somticas e dos embries durante o cultivo; vrias manipulaes mecnicas, osmticas, eltricas, trmicas e outros tipos de danos.
Apesar da extrema ineficincia da clonagem com clulas somticas, h clones nascidos normais e saudveis, requerendo poucos cuidados aps o nascimento (LANZA etal., 2001). Pace etal. (2002) tm
observado similares taxas de crescimento, desempenho reprodutivo
e caractersticas lactacionais dos animais clonados em comparao
com bovinos leiteiros no clonados.
O sucesso da transferncia nuclear parece ser devido a uma suficiente atividade de reprogramao presente no citoplasma do ocito
para mudar completamente a clula adulta, mas a natureza dos fatores
envolvidos no tem sido precisamente caracterizada (ALLEGRUCCI
etal., 2005).
Consideraes finais
As biotcnicas de reproduo animal se encontram em vrias fases
de desenvolvimento. A inseminao artificial e a transferncia de
embrio so as tecnologias mais consolidadas, porm a fecundao
in vitro j assume lugar de destaque no cenrio nacional, especialmente para o criador da raa Nelore, pois a raa possui caracterstica
696
privilegiada na produo de ocitos e consequentemente embries in

vitro. A produo in vitro de embries a abordagem mais nova e flexvel entre todas, entretanto requer mais cuidados tcnicos, uma vez
que exige equipamentos e conhecimentos laboratoriais especficos,
para garantir a qualidade do embrio in vitro. A clonagem animal por
transferncia nuclear de clulas somticas se constitui em uma rea
de rpido desenvolvimento e uma tcnica muito valiosa para produzir
animais com gentica superior, bem como cpias de animais transgnicos. No entanto, para melhorar a eficincia dessa tcnica so necessrios mais estudos sobre a reprogramao dos genes e sobre as alteraes epigenticas no embrio e ao longo da vida do animal clonado.
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Captulo21
Captulo
5
Biotecnologia agropecuria
e propriedade intelectual
Luciana Harumi Morimoto Figueiredo
Mnica Cibele Amncio
Chang das Estrelas Wilches
Introduo
A Propriedade Intelectual compreende os direitos conferidos, em
lei, para a proteo das criaes da mente humana, ou seja, proteo
do resultado do trabalho intelectual nos campos industrial, cientfico,
literrio e artstico. De acordo como o Artigo 2, Pargrafo VII, da
Conveno da Organizao Mundial da Propriedade Intelectual, assinada em Estocolmo, em 14 de julho de 1967, os direitos da propriedade intelectual dizem respeito s obras literrias, artsticas e cientficas; s interpretaes e s execues dos artistas; aos fonogramas e
s emisses de radiodifuso; s invenes em todos os domnios da
atividade humana; s descobertas cientficas; aos desenhos e modelos
industriais; s marcas industriais, comerciais e de servios, bem como
s firmas comerciais e denominaes comerciais; proteo contra
a concorrncia desleal e todos os outros direitos inerentes atividade
intelectual nos domnios industrial, cientfico, literrio e artstico.
As invenes so protegidas pelo sistema de patentes e esto relacionadas com uma ideia concretizada, nova e aplicvel industrialmente.
A inveno deve ser resultante de um experimento e pode estar relacionada a um processo ou a um produto, como uma mquina, um
artigo de manufatura, uma composio ou qualquer aperfeioamento
desses produtos.
No que diz respeito s protees das biotecnologias, vrios setores
da propriedade intelectual podem estar envolvidos. Um exemplo do
envolvimento dos diversos tipos de proteo na rea biotecnolgica
o famoso queijo Roquefort (legalmente reconhecido na Frana desde
1411), que depende da seleo e cultivo de um micro-organismo particular, Penicillium roqueforti, usado na fermentao do queijo. Esse
711
biotecnologia
queijo foi originado na vila Roquefort-sur-Soulzon na Frana e amadurecido nas cavernas calcrias dessa regio. O sistema de propriedade intelectual tem sido utilizado durante vrios anos para proteger
os interesses dos comerciantes de queijo no distrito de Roquefort.
Alguns aspectos do processo de se fazer o queijo usado no distrito
de Roquefort esto protegidos como segredo industrial. A Roquefort
Socit des Caves foi estabelecida em 1842 e formada por produtores locais e registrou uma marca distintiva oval em 1863. O governo
francs, em 1924, concedeu reconhecimento formal para o termo
Roquefort como uma proteo de denominao de origem (forma
de indicao geogrfica). Proteo similar foi adquirida no exterior,
por exemplo, a comunidade Roquefort registrou, em 1952, a palavra
Roquefort como uma marca de certificao para queijo nos Estados
Unidos, com a seguinte condio A marca de certificao usada
sobre os produtos para indicar que os mesmos foram manufaturados com leite de ovelha e que foram curados em cavernas naturais
da Comunidade de Roquefort, departamento de Aveyron, Frana.
(WIPO, 2007)1.
Enquanto a biotecnologia tem se desenvolvido rapidamente nos
anos recentes, as principais aplicaes da biotecnologia na agricultura foram identificadas h muito tempo e tm contribudo enormemente para o aumento na produo e qualidade do produto. A proteo de micro-organismos e processos relacionados pelo sistema
de patente tambm possui uma longa histria. Em 1873, o cientista
francs Louis Pasteur recebeu uma patente americana (US135245
Figura 1) pelo mtodo de purificar levedura para uso na indstria de
cerveja, para leveduras derivadas desse mtodo e para o equipamento
usado na purificao da levedura, com base no melhoramento significativo da tecnologia de produo da cerveja que foi revelada no documento de patente.
World Intellectual Property Organization (WIPO), 2007: Apostila do WIPO Advanced Course:
Biotechnology and Intellectual Property.
1
712
Captulo 21 Biotecnologia agropecuria e propriedade intelectual
Figura 1. Pgina de rosto da patente US135245.
713
biotecnologia
Para que uma inveno seja passvel de proteo por patente,

necessrio que ela seja nova (no pode ter sido revelada em nenhum
lugar do mundo sob qualquer maneira de divulgao), tenha aplicao industrial (finalidade de uso na produo econmica, seriada e
industrial) e envolva atividade inventiva (no seja bvia para um tcnico no assunto particular em que se insere a inveno). O TradeRelated Aspects of Intellectual Property Rights (TRIPS) permite que
sejam excludas de proteo as invenes que sejam contrrias
ordem pblica e moral, possibilitando tambm deciso, pelos pases membros, para excluir de proteo as invenes relacionadas a
mtodos diagnsticos, teraputicos e cirrgicos e a mtodos de tratamento de seres humanos ou animais, assim como a excluso de proteo de plantas e animais, exceto micro-organismos. O TRIPS tambm
permite a excluso de proteo de invenes que sejam necessrias
para proteger a vida humana, animal ou vegetal, bem como o meio
ambiente ou a moralidade.
A legislao sobre a propriedade intelectual

e as invenes biotecnolgicas
Cada pas possui sua prpria legislao sobre a propriedade intelectual, incluindo leis especficas correlatas, como a lei da inovao,
Conveno de Diversidade Biolgica, e outras que envolvam a proteo de tecnologias especficas, como, por exemplo, as criaes biotecnolgicas. A diretiva da Unio Europeia especfica para as invenes
biotecnolgicas d alguns exemplos de invenes que podem ser consideradas contrrias ordem pblica ou moralidade (WIPO, 2007)2:
Processos de clonar seres humanos.
Processos para modificar a identidade gentica da linhagem germinativa de seres humanos.
Uso de embries para propsitos industriais ou comerciais.
Processos para modificar a identidade gentica dos animais
que provavelmente causaro sofrimento sem qualquer bene-
2
714
fcio mdico substancial para o homem ou animal, e tambm

animais resultantes desses processos.
A Conveno de Patente Europeia (European Patent Convention,
1973), que estabelece a proteo de criaes tcnicas em mbito
regional, prev a excluso de proteo de invenes relativas a
variedades especficas de animais e vegetais [artigo 53 (b) da EPC].
Adicionalmente, o Escritrio Europeu de Patentes (EPO) faz objeo
proteo de invenes relacionadas com o tratamento de seres humanos sendo via biolgica ou outros meios.
Na Austrlia, por exemplo, a Lei de Patentes de 1990 permite o
patenteamento de invenes usando micro-organismos, plantas e
animais, mas no usando seres humanos e processos biolgicos para
sua gerao. Alm disso, o Escritrio Australiano de Patentes tambm
regulamenta que o organismo vivo, incluindo um animal ou gene,
precisa apresentar uso industrial. Portanto, os animais precisam possuir alguma funo, tal como modelo de pesquisa, ou ser produtor de
uma substncia utilizvel. No que se refere sequncia de DNA, ela
precisa codificar uma protena ou outro elemento funcional ou agir
como uma sonda para um alvo gnico especfico.
A Lei de Patentes dos Estados Unidos (United States Code Title
35 Patents, 2007) considera patentevel qualquer nova e utilizvel
manufatura ou composio de matria, independente de ser criada
ou descoberta pelo homem, em qualquer rea tcnica, no excluindo
seres humanos.
A Suprema Corte do Canad, por outro lado, tem como regra excluir
de proteo formas de vida desenvolvidas, tal como ratos transgnicos, porque esse tipo de criao no um produto manufaturado ou
composio relacionada dentro do significado de inveno. No Japo,
a lei exclui de proteo a mera descoberta de micro-organismos existentes na natureza e invenes de micro-organismos per se que so
incapazes de aplicao industrial (WIPO, 2007)3.
No Brasil, a Lei da Propriedade Industrial N 9.279, de 14 de maio
de 1996, no considera inveno o todo ou parte de seres vivos naturais e materiais biolgicos encontrados na natureza, ou ainda que dela
3
715
biotecnologia
isolados, inclusive o genoma ou germoplasma de qualquer ser vivo

natural e os processos biolgicos naturais (Art. 10, inciso IX). A lei
ainda no considera patentevel o todo ou parte de seres vivos, exceto
os micro-organismos transgnicos que atendam aos trs requisitos
de patenteabilidade novidade, atividade inventiva e aplicao industrial previstos no art. 8 e que no sejam mera descoberta (Art. 18,
inciso III). Em vista desses dois artigos (10 e 18) da Lei, podem ser
patenteveis aquelas invenes biotecnolgicas que estejam relacionados com processos envolvendo organismos vivos (p. ex.: mtodo de
produzir plantas transgnicas), construes gnicas (DNA recombinante, vetores de expresso), micro-organismos transgnicos (p. ex.:
vrus e bactrias transformadas), protenas recombinantes e composies envolvendo extratos de materiais biolgicos.
Apesar da Lei da Propriedade Industrial brasileira no permitir a
proteo de plantas transgnicas, essas plantas podem ser protegidas por meio de um mecanismo sui generis denominado Proteo
de Cultivar, regido pela Lei brasileira 9.456/97. Por essa legislao, a
proteo de cultivares tem vigncia de 15 anos, exceto para videiras,
rvores frutferas, florestais e ornamentais, para as quais a proteo
de 18 anos. O rgo internacional responsvel pela proteo de novas
variedades de plantas a Union Internationale pour la Protection des
Obtention Vegetales (UPOV). Nos Estados Unidos, as plantas com
reproduo assexuada (exceto tubrculos) so protegidas pelo sistema
de patentes, enquanto as plantas que possuem reproduo sexuada e
tubrculos so protegidas pelo mecanismo da UPOV.
Outra importante questo envolvendo a propriedade intelectual
relacionada ao setor agrobiotecnolgico o acesso a recursos genticos e ao conhecimento tradicional, que est regulamentada hoje pela
Medida Provisria n. 2.186-16, de 2001. De acordo com essa medida,
o Acesso ao Conhecimento Tradicional Associado a obteno de
informao sobre conhecimento ou prtica, individual ou coletiva,
associada ao patrimnio gentico, de comunidade indgena ou de
comunidade local, para fins de pesquisa cientfica, desenvolvimento
cientfico ou bioprospeco, visando a sua aplicao industrial ou de
outra natureza. importante tambm ter em mente a definio constante da Orientao Tcnica n. 1, de 24 de setembro de 2003, do
716
CGEN, qual seja: atividade realizada sobre o patrimnio gentico

com o objetivo de isolar, identificar ou utilizar informao de origem
gentica ou molculas e substncias provenientes do metabolismo dos
seres vivos e de extratos obtidos destes organismos (VASCONCELOS,
2010)4. A medida tambm conceitua o Acesso ao Patrimnio Gentico
como sendo obteno de amostra de componente do patrimnio gentico para fins de pesquisa cientfica, desenvolvimento tecnolgico ou
bioprospeco, visando a sua aplicao industrial ou de outra natureza
(Inc. IV do Art. 7 da M.p.n. 2.186-16, de 2001). Essa definio deve
ser lida em conjunto com a definio constante da Orientao Tcnica
n. 1, de 24 de setembro de 2003 do CGEN, qual seja: acesso atividade realizada sobre o patrimnio gentico com o objetivo de isolar,
identificar ou utilizar informao de origem gentica ou molculas e
substncias provenientes do metabolismo dos seres vivos e de extratos obtidos destes organismos (VASCONCELOS, 2010). Essas definies so importantes para que os pesquisadores saibam se seu objeto
de pesquisa se encaixa em algum desses casos e, em caso afirmativo,
eles devero solicitar autorizao aos rgos responsveis (CGEN ou
qualquer rgo ou instituio credenciado) para evitar problemas futuros. Encaixam-se dentro do escopo da Medida Provisria n 2.186-16
as pesquisas envolvendo: (1) qualquer espcie de material gentico,
seja ele animal, microbiano, fngico ou vegetal nativo ou domesticado; e(2) conhecimento tradicional associado detido por comunidade
indgena ou local. importante ressaltar algumas atividades de pesquisa que no necessitam de autorizao do CGEN, exceto se envolverem acesso a conhecimento tradicional (VASCONCELOS, 2010)5:
Pesquisas que visem avaliar ou elucidar a histria evolutiva de
uma espcie ou de grupo taxonmico, as relaes dos seres vivos
entre si ou com o meio ambiente, ou a diversidade gentica de
populaes.
Testes de filiao, tcnicas de sexagem e anlises de caritipos
ou de ADN que visem identificao de uma espcie ou espcime.
VASCONCELOS, R. M. 2010. Parecer AIT 080. Embrapa.

VASCONCELOS, R. M. 2010. Parecer AIT 080. Embrapa.
4
5
717
biotecnologia
Pesquisas epidemiolgicas ou aquelas que visem identificao de agentes etiolgicos de doenas, assim como a medio da
concentrao de substncias conhecidas cujas quantidades, nos
organismos, indiquem doena ou estado fisiolgico.
Pesquisas que visem formao de colees de ADN, tecidos,
germoplasma, sangue ou soro.
A autorizao de acesso e remessa de amostra de patrimnio gentico para fins de pesquisa cientifica concedida pelo Ibama ou CNPq,
na qualidade de instituio credenciada pelo CGEN, desde que no
haja acesso ao conhecimento tradicional associado. As autorizaes
de acesso e remessa de amostras de patrimnio gentico e (ou) conhecimento tradicional para fins de bioprospeco e de desenvolvimento
tecnolgico so concedidas, exclusivamente, pelo CGEN6.
Sistema de patentes
Conforme pode ser observado, o mecanismo de proteo das invenes biotecnolgicas pode envolver uma srie de segmentos da propriedade intelectual, mas um dos principais mecanismos de proteo atravs do sistema de patentes. O documento de patente de
extrema importncia para esse tipo de proteo e ele composto basicamente de: relatrio descritivo (descreve a inveno, de modo a ser
reproduzvel por um tcnico da rea, podendo incluir na maioria das
vezes, a citao de exemplos), reivindicaes (define a matria que o
inventor pretende proteger) e resumo (apresenta as informaes bsicas da inveno para efeito de divulgao). Dependendo do caso, o
documento de patente pode ter ainda desenhos (servem para facilitar
a compreenso da inveno) e listagem de sequncias (sero necessrias se, na inveno, estiverem contidas sequncias novas que sero
reivindicadas, quer se trate de sequncias de cidos nucleicos, quer
de aminocidos). Cada uma das partes do documento possui sua particularidade; no entanto, o relatrio descritivo e as reivindicaes so
fundamentais para esse tipo de proteo (FIGUEIREDO etal., 2008).
No relatrio descritivo de um documento de patente, a inveno
deve estar revelada de forma detalhada para que uma pessoa ver J est em andamento o credenciamento do CNPq para essas atividades (deliberao em
vias de publicao).
6
718
sada no assunto possa ser capaz de reproduzir a inveno por meio

das informaes descritas. Para o caso de invenes envolvendo
micro-organismo, deve haver um depsito do material biolgico em
Instituio Depositria Internacional (IDA) reconhecida de acordo
com o estabelecido pelo Tratado de Budapeste (Tratado Internacional
que regulamenta questes relativas a patentes e material biolgico),
uma vez que um micro-organismo no pode ser suficientemente descrito no relatrio. Esse depsito deixar o micro-organismo disponvel
para que um tcnico no assunto possa acessar e reproduzir a inveno.
As reivindicaes definem exatamente o que est sendo protegido
da inveno e devem ser fundamentadas no relatrio descritivo, caracterizando as particularidades do invento e definindo, de modo claro
e preciso, a matria objeto de proteo. A reivindicao deve se limitar claramente matria para a qual est sendo solicitada/concedida
exclusividade com o intuito de ser exercida uma futura atividade econmica. Atravs do que est descrito nas reivindicaes, o pblico
poder saber, com segurana, os produtos e processos que esto protegidos e, consequentemente, aqueles que esto fora dos limites de
proteo e que podero ser utilizados sem precisar pagar royalties.
De acordo com Macedo etal. (2001), a obteno de efetiva proteo para invenes biotecnolgicas pode ser dividida em reivindicaes de produto e de processo, que so agrupadas em diversos nveis
de importncia:
Primeiro nvel: reivindicaes dirigidas ao produto final, isto ,
o objeto patenteado que ser colocado no mercado (p. ex.: composio inseticida).
Segundo nvel: dirigido para o processo de produo do produto
final ou pelo menos de um ingrediente ativo do produto final (p.
ex.: processo de produo da dita composio inseticida).
Terceiro nvel: mtodos de uso (p. ex.: mtodo de matar insetos).
Quarto nvel: matrias-primas, intermedirios, ferramentas e
semelhantes (p. ex.: cDNAs, plasmdeos envolvidos na confeco da composio).
Quinto nvel: processos intermedirios (p. ex.: screening).
Quando uma sequncia de DNA inserida dentro de um organismo para expresso de determinada protena que naturalmente
719
biotecnologia
no era expressa por esse organismo, pode-se considerar tal evento

como uma inveno, uma vez que houve a formao de um efeito tcnico desejado (surpreendente) e inesperado. A extenso da proteo
nesses casos ser muito dependente do conhecimento pblico das
caractersticas da dita protena (p. ex.: nvel de purificao, sequncia de aminocidos, mRNA correspondente, mapeamento do gene,
entre outros) e o escopo das reivindicaes nesses casos depender
da quantidade de informao revelada ao pblico (MULLER, 2003).
No entanto, importante ressaltar que a proteo da matria descrita
nas reivindicaes ser analisada pelos examinadores de acordo com
a legislao de cada pas.
No Brasil, uma sequncia de DNA como encontrada na natureza
no seria passvel de proteo por patente mesmo que nova, pois, de
acordo com a legislao vigente, o isolamento de sequncias de cido
nucleico de organismos no dotado de novidade, uma vez que j
existe na natureza. Por isso, os redatores de patente utilizam ferramentas para fazer a proteo dessas sequncias, como, por exemplo,
reivindicar a proteo das sequncias de DNA atravs de uma construo gnica, que passvel de proteo no Brasil. O conhecimento
da matria descrita nas reivindicaes muito importante para que
possamos evitar infraes de direitos. Muller (2003) discrimina em
seu trabalho dois tipos de infraes das reivindicaes que podem
ocorrer por terceiros:
Infrao literal: em que cada elemento do produto infrator coincide com a definio contida na reivindicao.
Infrao por equivalncia: em que o elemento do produto infrator no se enquadra diretamente na definio do elemento da
reivindicao, no entanto ele constitui um equivalente tcnico
funcional desse ltimo.
Todos esses fatores mostram a importncia de se analisar um documento de patente, tendo especial ateno s reivindicaes para saber
como a tecnologia est protegida e tambm o alcance dessa proteo
no caso das invenes biotecnolgicas. O bom monitoramento das
tecnologias com vistas no que est protegido por meio das reivindicaes evitar possveis infraes das patentes e permitir aos pes-
720
quisadores ter conhecimento do que est livre para ser utilizado (freedom to operate).
Importncia da informao tecnolgica

nos documentos de patente
A revelao da inveno o corao do sistema de patente. Os direitos desse tipo de proteo so concedidos ao inventor para estimular
a pesquisa, desenvolvimento e inovao na indstria. A proteo de
patente possui um tempo limitado de durao, normalmente 20 anos,
e em troca a esse tempo de garantia de proteo (direito de exclusividade sobre a explorao da tecnologia protegida), o inventor deve revelar detalhes de como trabalhar a inveno para que a mesma possa ser
livremente utilizada pelo pblico no trmino de vigncia da proteo
da patente. A lei tambm possibilita que outros pesquisadores possam utilizar a tecnologia protegida em suas pesquisas e que a inveno esteja liberada para fins educacionais, at mesmo na vigncia
da patente. Toda inveno revelada no relatrio descritivo do documento de patente e as informaes se tornam acessveis ao pblico
a partir de 18 meses da data de depsito do pedido (Lei 9.279, 1996).
Da mesma forma como a pesquisa bibliogrfica, o levantamento
do estado da tcnica em documentos de patente deve ser realizado no
incio do projeto. Essa providncia evita desperdcios com a realizao de etapas de processo que j so conhecidas, ou com a obteno
de materiais que j existem, muitas vezes comercialmente.
A no-realizao do levantamento do estado da tcnica no incio de
um projeto de pesquisa poder, at mesmo, implicar a impossibilidade de uso de seus resultados, se houver coincidncia entre eles, total
ou parcialmente, e reivindicaes constantes em patentes de terceiros.
Atualmente, com o avano da cincia, principalmente na rea de
biotecnologia aplicada agricultura, esse problema tem ganho de
projeo, uma vez que muitos dos campos pesquisados j possuem
um representativo nmero de patentes cujas reivindicaes so to
amplas que englobam resultados de pesquisas sequer realizadas, o
que torna a busca tecnolgica imprescindvel para o pesquisador.
721
biotecnologia
Alm disso, quando o levantamento feito precocemente, h possibilidade de redirecionar a pesquisa para a obteno de um produto
ou de um processo passvel de proteo.
A busca de informaes tecnolgicas tambm permite a identificao de nichos no explorados, o que pode orientar linhas de pesquisa.
Oferece ainda uma noo do interesse mercadolgico ou do potencial
de mercado da tecnologia.
A organizao das informaes contidas nos documentos de patente
feita segundo uma normatizao estabelecida por um tratado internacional (Strabourg Agreement, 1971): a classificao internacional
de patentes (CIP). Essa classificao tem como objetivo a uniformizao do arquivamento de dados tecnolgicos, distribuindo-os em
oito sees do conhecimento, as quais esto divididas em subsees,
classes, subclasses, grupos e subgrupos. As oito sees da CIP so:
Necessidades humanas (A).
Operaes de processamento; transporte (B).
Qumica; metalurgia (C).
Txteis; papel (D).
Construes fixas (E).
Engenharia mecnica; iluminao; aquecimento; armas;
exploso (F).
Fsica (G).
Eletricidade (H).
A rea biotecnolgica abrangida pelas sees A e C. Mais especificamente, a subclasse C12N a que possui maior relao com a biotecnologia moderna Micro-organismos ou enzimas; composies
das mesmas; propagao, preservao ou manuteno dos micro-organismos; mutao ou engenharia gentica; meio de cultura. A busca
dos documentos de patente por meio da utilizao da classificao
internacional uma ferramenta extremamente til e eficiente para
recuperar os principais documentos protegidos na rea de interesse.
Alm da Classificao Internacional de Patentes (CIP), existem
classificaes locais utilizadas por algumas bases de patente, como
o caso da base do escritrio europeu (http://ep.espacenet.com), do
escritrio americano (www.uspto.gov) e da Derwent (http://apps.isiknowledge.com). A Derwent Innovations Index possibilita o acesso
722
a mais de 14,800,000 documentos de patente com links para patentes citadas e documentos citando determinada patente, artigos citados e o texto completo do documento de patente. A classificao da
Derwent que est mais relacionada com a rea agrobiotecnolgica
a C06, que diz respeito biotecnologia, incluindo gentica de plantas
e vacinas veterinrias.
Todas as informaes contidas no documento de patente possuem
um elevado valor tecnolgico. Segundo informaes do Instituto
Nacional da Propriedade Industrial (MAYERHOFF, 2005)7, cerca de
80% de toda informao sobre tecnologias encontra-se nos bancos
de dados sobre patentes. Isso significa que, ao se realizar uma busca
bibliogrfica, sem prvia consulta aos bancos de dados de patente, o
pblico ter acesso a apenas 20% da informao existente no mundo, o
que poder impactar negativamente os resultados de muitas pesquisas.
Dados da OECD (2006) mostram que patentes em biotecnologia
tm crescido mais rapidamente do que todos os depsitos de patente
ocorridos no escritrio europeu de patentes (EPO). Entre 1991 e 2002,
o nmero de patentes biotecnolgicas cresceu 8,3% ao ano, enquanto
o depsito de patentes na EPO cresceu cerca de 5%. A taxa de crescimento mundial de patentes na rea de biotecnologia comeou a
aumentar a partir de 1994. Depois de um crescimento constante na
dcada de 1990, o nmero de pedidos de patentes de biotecnologia
depositados sob o acordo internacional de patentes (PCT)8 diminuiu
de mais de 11 500 pedidos em 2000 para 8 700 em 2006 (-4,6% ao ano
OECD, 2009). Por outro lado, o nmero total de pedidos de patente
PCT aumentou uma mdia de 5,7% ao ano de 2000 a 2006. O surto de
patentes de biotecnologia no final dos anos 1990 foi, em parte devido
aos pedidos de patentes relativos ao genoma humano, enquanto a
recente diminuio explicada por muitas vezes mais rigorosas
MAYERHOFF, Z. D. v.L. Informao tecnolgica. Braslia, DF, 2005. Apresentao em

PowerPoint do Curso de Capacitao em Propriedade Intelectual para Gestores de Tecnologia.
8
PCT um Tratado de Cooperao em Matria de Patentes (Patent Cooperation Treaty) que foi
estabelecido em 19 de junho de 1970, em Washington, como a finalida de desenvolver o sistema
de patentes e de transferncia de tecnologia. O PCT tem como objetivo simplificar, tornando
mais eficaz e econmico, tanto para o usurio como para os rgos governamentais encarregados na administrao do sistema de patentes, o procedimento, no caso de uma solicitao
para proteo patentria em vrios pases. At junho de 2011 existiam 144 estados contratantes.
7
723
biotecnologia
critrios para a concesso de patentes de material gentico.

Conseqentemente, o peso relativo da biotecnologia em todos os
registros de patentes internacionais diminuiu entre meados dos anos
1990 e incio dos anos 2000 em muitos pases. Em mdia, patentes de
biotecnologia representaram 6,5% do portflio de patentes dos pases de 2004-06, em comparao com 10,3% em meados da dcada
de 1990. O escritrio de patentes dos Estados Unidos (USPTO) mostra um aumento significativo no nmero de solicitaes de proteo,
neste escritrio, na rea biotecnolgica agropecuria.
A Organisation for Economic Co-operation and Development/
OECD (2009) tambm mostra que a Dinamarca continua a ser um
pas ativo na rea de patenteamento de biotecnologia sendo responsvel por 15,7% de todos os pedidos de patente na rea depositados
pela Dinamarca no PCT. Estudos da OECD (2009) tambm mostram
que os Estados Unidos contriburam para 42% de todos os pedidos
de patente PCT na rea de biotecnologia entre 2004-2006. O Japo
e a Alemanha seguiram no ranking contribuindo com, respectivamente 13% e 7% dos pedidos de patente na rea de biotecnologia. Sete
regies dos EUA esto entre as dez regies lderes em patenteamento
em biotecnologia entre 2004 e 2006, juntamente com Tquio para o
Japo, regio Nordrhein na Alemanha e da regio de Copenhague, na
Dinamarca. Atravs de uma busca no exaustiva realizada no Instituto
Nacional da Propriedade Industrial em agosto de 2010, foi constatado
que o nmero de pedidos de patente depositados no Brasil na rea
biotecnolgica foi de:
529 pedidos na rea de mutao ou engenharia gentica; DNA
ou RNA, vetores.
208 pedidos da rea de tecnologia do DNA recombinante.
951 pedidos na rea de vetores ou sistemas de expresso especialmente adaptados para clulas vegetais.
150 pedidos para processos para modificao de gentipos de
plantas.
98 pedidos para reproduo de plantas por meio das tcnicas de
cultura de tecidos;
283 pedidos para genes que codificam protenas vegetais.
413 pedidos para genes que codificam protenas animais.
724
Figueiredo etal. (2006) demonstraram que a maior parte das protees biotecnolgicas no Brasil est na rea de preparaes medicinais,
e a Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria (Embrapa) lidera o
nmero de depsitos brasileiros na rea de composies biocidas,
repelentes ou atraentes de pestes e reguladores de crescimento de
plantas. Entre todos os pedidos de patente da Embrapa, a rea de controle biolgico foi a mais focada nos tipos de protees da empresa. O
trabalho tambm revelou que a maior parte dos pedidos da Embrapa
est centralizada principalmente na rea biotecnolgica agropecuria.
Como obter informaes em documentos de patente

O levantamento do estado da tcnica uma etapa fundamental que
antecede a redao do pedido de patente. Esse levantamento consiste
em identificar todas as informaes a respeito da rea de interesse
que j estejam disponveis ao pblico, em documentos de patente ou
no, e compar-las com as concretizaes da tecnologia que se deseja
proteger. Para que essa comparao de informaes possa ser realizada eficientemente, imprescindvel que o pesquisador delimite,
com estrita preciso, cada etapa do trabalho que propiciou a obteno dos seus resultados. Figueiredo etal. (2008) relatam os procedimentos para obter informaes em documentos de patentes, apresentados a seguir.
O primeiro passo a ser dado pelo pesquisador montar um diagrama para se assegurar da preciso da procura. Abaixo, um bom
modelo de esquema:
Problema tcnico
detectado com alto
potencial para possvel
soluo
Caractersticas do
Projeto ou Soluo
proposta
Resultado que se
espera alcanar
O diagrama proposto acima, por mais bvio que possa parecer,

ajuda a identificar o conceito inventivo ou cerne da inveno.
comum surgirem produtos secundrios do projeto inicial, ou seja,
resultados esperados que foram substitudos por outras concretizaes da ideia original e que se mostraram mais importantes. Portanto,
725
biotecnologia
o diagrama, ao identificar todas as caractersticas de possveis solues, deixa perceber possibilidades at ento no imaginadas, durante
a busca de informaes em documentos de patente.
Existem algumas bases de dados que so gratuitas e trazem informaes muito amplas. Algumas permitem acesso ao texto completo
da patente, incluindo as figuras. H tambm bases de dados privadas
que so bem qualificadas, mas, em geral, muito caras. As principais
bases gratuitas utilizadas para busca de documentos de patente so:
Escritrio brasileiro de propriedade intelectual (INPI): www.
inpi.gov.br (http://pesquisa.inpi.gov.br/MarcaPatente/jsp/servimg/servimg.jsp?BasePesquisa=Patentes) recuperao de
documentos de patente brasileiros com acesso ao documento
na ntegra atravs do escritrio europeu de patentes.
Escritrio norte-americano de patentes e marcas (USPTO):
www.uspto.gov (http://www.uspto.gov/patents/process/search/
index.jsp) recuperao de documentos de patentes americanos com acesso ao documento na ntegra.
Escritrio europeu de patentes (Espacenet): http://ep.espacenet.
com/ recuperao de documentos de patente do mundo todo
com possibilidade de acessar o documento na ntegra.
Para muitos Institutos de Pesquisa, atravs do portal da CAPES,
h a possibilidade de acessar a base da Derwent (apps.isiknowledge.
com), que uma tima base privada e possibilita o acesso aos documentos de patente do mundo todo.
A busca em documentos de patente pode ser realizada por: (i) cruzamento de palavras-chave; (ii) classificao internacional de patentes; e (iii) por combinao de (i) com (ii).
O primeiro tipo, cruzamento de palavras-chave, familiar aos pesquisadores que o utilizam para fazer o levantamento bibliogrfico,
especialmente quando recorrem a ferramentas de pesquisa (search
engines) da web (World Wide Web), tais como o Google, o Yahoo e
outros. O sucesso desse tipo de busca depende diretamente da qualidade da estratgia montada para encontrar a informao desejada.
Palavras de significado geral, como process, analysis, gene, apparatus
e semelhantes dificultam muito o direcionamento da busca.
726
Alm das possibilidades oferecidas pelo Google ou pelo Yahoo,

h outras ferramentas de pesquisa (search engines) especficas de
busca em documentos de patente, utilizando-se o cruzamento de palavras-chave.
A classificao internacional de patentes abrange todas as reas
do conhecimento e pode ser acessada a partir da pgina do Instituto
Nacional da Propriedade Industrial (http://pesquisa.inpi.gov.br/ipc/
index.php).
Se simularmos uma busca na base da Derwent (apps.isiknowledge.
com) pela classificao internacional C12N 15/29 (Genes que codificam protenas vegetais) e a palavra-chave DREB, podemos recuperar 21 documentos de patente (Figuras 2 e 3) e ainda fazer outros
estudos adicionais, como, por exemplo, saber quem so os detentores
dessas tecnologias (Figura 4) e os pases onde as tecnologias de interesse foram depositadas.
Figura 2. Estratgia de busca na base da Derwent utilizando palavra-chave e

classificao internacional de patentes.
727
biotecnologia
Figura 3. Resultados obtidos com a estratgia de busca na base da Derwent

utilizando palavra-chave e classificao internacional de patentes.
UNIV QINGHUA
UNIV TIANJIN NORMAL
BEIJING BEIFANG JIESHI BIOLOGICAL
BEIJING WANFUCHUN FOREST RESOURCE DEV
CO
BEIJING WEIMING KAITUO AGRIC BIO TECH CO
BEIJING YANGHUA BIOTECH CO LTD
BIO-ORIENTED TECHNOLOGY RES
ADVANCEMENT
BIOTECHNOLOGY RES INST CAAS
CHINESE ACAD SCI BOTANY INST
DOKURITSU GYOSEI HOJIN KOKUSAI
NORINSUIS
Figura 4. Principais titulares dos documentos de patente relacionados com o

gene DREB e a rea de genes que codificam protenas vegetais (C12N 15/29).
Esses estudos de monitoramento tecnolgico so muito importantes para formao de parcerias, conhecimento do portflio tecnolgico na rea de interesse, planejamento de pesquisa, entre outros.
728
Consideraes finais
O crescente volume de conhecimento gerado por intermdio da biotecnologia unido ao avano do sistema de patentes nos pases detentores desse conhecimento torna imprescindvel um monitoramento
das tecnologias de interesse para que o Brasil no fique eternamente
dependente do monoplio das empresas multinacionais e aumente
seu potencial tecnolgico. Estudos mostram a tendncia no aumento
do nmero de depsitos de pedido de patente no setor agrobiotecnolgico, o que intensifica a importncia de um melhor conhecimento
do sistema de proteo por patentes e sua utilizao como fonte de
informao tecnolgica.
Para que se obtenha xito no processo de internalizao do conhecimento de propriedade intelectual no meio acadmico, detentor do
conhecimento, importante que os pesquisadores incorporem em sua
metodologia de pesquisa a busca em bancos de patente. Dessa forma,
poderemos reduzir gastos com pesquisas em duplicata, evitar a infrao de tecnologias de terceiros e aumentar a formao de parceiras e
o portflio de tecnologias a serem utilizadas na pesquisa.
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729
biotecnologia
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730
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BOREM, A.; SANTOS, F. R. Biotecnologia Simplificada. 2. ed. Visconde do Rio

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VILLEN, R. A. Biotecnologia: histrico e tendncias. Disponvel em <http://www.

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gerando informaes importantes para subsidiar diferentes aes de

Princpio cientfico dos marcadores moleculares

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Infraestrutura necessria obteno

Fotos: Fbio Gelape Faleiro

Figura 2. Equipamentos utilizados na obteno e anlise de marcadores

Alm do tipo do marcador molecular, a infraestrutura tambm

estado da arte e aplicaes na agropecuria

Diferentes tipos de marcadores moleculares