SEO II

ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS
Com Provas bioqumicas
ISOLAMENTO, CARACTERIZAO E IDENTIFICAO DE BACTRIAS
Identificar um dado organismo como espcie baseia-se no preenchimento das caractersticas atribudas
quela espcie. O reconhecimento da fonte ou origem do espcime (ambiente, espcie animal, tipo de
patologia e localizao) do organismo s vezes fundamental para identificao. A execuo inadequada
de um teste preliminar pode confundir e prejudicar todo processo de identificao. Na rotina laboratorial
so utilizados certos testes chaves para reduzir o trabalho, o custo e abreviar o tempo requerido para
diagnstico.
O processo de identificao dos microrganismos efetuado atravs da determinao de um nmero
mnimo de propriedades. Portanto, quanto menor o nmero de observaes efetuadas, maior o risco de
erros de identificao. Usualmente necessrio utilizar organismos como controles positivos e negativos
para a execuo de cada teste.
A correta caracterizao cultural do organismo em meios de isolamento primrio, assim como a
execuo e interpretao da colorao e reao ao Gram so vitais para esse sistema de identificao. O
perodo de incubao varia usualmente com o organismo que est sendo isolado, mas a maioria dos
organismos pode apresentar crescimento visvel aps 48 horas. Para a atmosfera de incubao tambm se
aplica o mesmo princpio, i.e., para organismos aerbios e anaerbios facultativos utiliza-se a atmosfera
ambiente, e para o isolamento de microrganismos microaerbios e anaerbios obrigatrios torna-se
necessrio obter a atmosfera adequada atravs de mtodos especiais, conforme visto no captulo anterior.
O objetivo deste experimento fornecer os meios e mtodos de semeadura, contagem, isolamento
e identificao de microrganismos encontrados no ambiente e processos infecciosos do homem e animais.
Desta forma, no pretende ser completo e, quando necessrio, trar as referncias bibliogrficas que o
aluno deve consultar para obter informaes mais detalhadas.
Isolamento e caractersticas culturais

Aps escolher ou receber o espcime a ser estudado procede-se ao isolamento em meios slidos
apropriados. Para exemplificar usaremos o gar simples e uma cultura mista composta de bactrias
conhecidas. Para isolar o microrganismo efetua-se a inoculao ou semeadura, utilizando a tcnica do
esgotamento do inculo por estrias, tendo-se o cuidado de usar inteiramente toda a rea do meio para
garantir a separao das bactrias, de modo que aps a incubao cada clula separada origine uma
colnia. Tambm so empregadas as tcnicas de semeadura por disseminao com ala de Drigalsky ou a
tcnica de pour-plate quando, alm do isolamento, pretende-se quantificar a populao microbiana
presente originalmente na amostra.

O processo de identificao propriamente dito comea com a observao das caractersticas das
colnias isoladas (a olho nu, com lupa ou microscpio, usando a objetiva de menor aumento). Os
seguintes critrios so utilizados para a caracterizao colonial:
1. Forma - punctiforme (at 1 mm de dimetro); circular, com mais de 1 mm de dimetro; irregular;
filamentosa; radiada, dentre outras;
2. Tamanho - ...em milmetros;
3.

Elevao - achatada (alta, baixa), espraiada, convexa, umbilicada ou umbonada, mamilonada,

papilfera, etc.;

4.

Bordos - inteiros, ondulados, lobados, denticulados, franjados, etc.;

2.

Superfcie - lisa, rugosa;

3.

Estrutura - amorfa, granulosa, filamentosa;

4.

Caracteres pticos - opaca, translcida e transparente;

5.

Cromogenia ou Pigmentao - amarela, branca, preta, rsea, etc.;

Em outros meios podem ser observadas outras caractersticas como hemlise (gar Sangue),
reduo de telurito (meio para corinebactrias, estafilicocos), fermentao de acares (meio de
MacConkey, gar SS, dentre outros.
As caractersticas culturais podem ser observadas tambm em meios lquidos e slidos inclinados
(em tubos).
As principais caractersticas observadas em meio lquido so:
1. Tipo de crescimento na superfcie - sem crescimento, pelcula, grumosa, membranosa, anel (circular);
2. Opacidade ou turvao - nula, ligeira ou suave, regular, intensa, transitria, persistente;
3. Cheiro - nenhum, pronunciado, semelhante a ...;
4. Sedimento - compacto, grumoso, viscoso, granular, escamoso, quantidade do sedimento (abundante,
escasso, nulo);
5.

Pigmentao.

As principais caractersticas observadas em meio slido inclinado so:

1. Crescimento - nulo, escasso, abundante;
2. Pigmentao - cor ....;
3. Lustro ou brilho - fosco, luzidio;
4. Caracteres pticos - transparncia, translcido ou opaco;
5. Fluorescncia - positiva, negativa (em fonte de luz UV);
2

6. Consistncia - butirosa, viscosa, membrancea, quebradia;

7. Emulsionabilidade - nula, fcil, difcil;
8. Odor - ausente, presente, semelhante a ....
Aps a observao dessas caractersticas devem ser feitos esfregaos para coloraes especiais,
para observao da morfologia microscpica (forma, arranjos, tamanho e reao ao Gram), presena ou
ausncia de esporos (forma e localizao, com deformao ou no do corpo bacteriano), flagelos (nmero
e localizao), cpsulas, granulaes metacromticas (comum em corinebactrias) e colorao bipolar
(freqente nas pasteurelas e yersinias). Tambm pode ser verificada a motilidade por exame a fresco. A
motilidade verdadeira consiste no deslocamento do organismo em diferentes direes, no devendo ser
confundido com o movimento Browniano ou metablico, i.e., o organismo vibra mas no se desloca. Os
procedimentos seguintes envolvem a caracterizao metablica, tolerncia a agentes qumicos e fsicos, a
antimicrobianos e fagos (fagotipagem), bem como propriedades antignicas ou sorolgicas e
patogenicidade atravs da inoculao em espcies animais susceptveis (apropriadas).

SEO III
METABOLISMO MICROBIANO

METABOLISMO BACTERIANO (PROVAS BIOQUMICAS)

A investigao das atividades metablicas das bactrias in vitro chamada de Provas
Bioqumicas e servem para auxiliar o microbiologista a identificar grupos ou espcies de bactrias ou
leveduras atravs da verificao das transformaes qumicas, que ocorrem num determinado substrato,
pela ao das enzimas de um dado microrganismo. Como muitas vezes um determinado microrganismo
possui um sistema enzimtico especfico, promovendo transformao bioqumica especfica, as provas
bioqumicas podem ser utilizadas na prtica para a sua caracterizao.
Para a realizao das provas bioqumicas necessrio utilizar meios de cultivo especiais contendo
o substrato a ser analisado e fornecer ao microrganismo as condies nutritivas e ambientais necessrias
ao seu desenvolvimento.
Objetivos: executar e interpretar os resultados e as transformaes metablicas ocorridas em
algumas provas bioqumicas empregadas para identificao de bactrias.
As principais e mais utilizadas provas bioqumicas so:

1. Produo de catalase - Esta enzima atua sobre a gua oxigenada (perxido de hidrognio 3 a 5%)
desdobrando-a em oxignio e gua. A prova feita colocando uma gota de soluo aquosa de perxido
de hidrognio a 3-5% numa lmina e, em seguida, com uma ala de platina, colocar uma poro do
3

crescimento bacteriano sobre a gota. Ou de outra forma, adicionando-se 0,5 ml da mesma soluo a
uma cultura em meio lquido ou em gar inclinado. A prova considerada positiva quando h
borbulhamento ou efervescncia devido liberao do oxignio. A catalase produzida por muitos
microrganismos e usualmente empregada para diferenciar Staphylococcus, que so catalase positivos
de Streptococcus, catalase negativos, ou os bacilos Gram positivos catalase negativos Lactobacillus e
Erysipelothrix de Listeria e a maioria dos Corynebacterium catalase positivos.

CATALASE

2H202

2H20

Perxido

gua

de Hidrognio

2.

O2
Oxignio
Livre

Prova da citocromo-oxidase - Este sistema enzimtico est relacionado com os citocromos da cadeia
respiratria de alguns microrganismos. A prova consiste em colocar uma gota do reagente incolor
tetrametil p-fenileno de amina, recm preparado e protegido da luz, em um papel de filtro. Em
seguida, vrias colnias do microrganismo em estudo so espalhadas sobre a rea do papel de filtro
contendo o reagente, utilizando uma ala de platina ou um basto de vidro. A prova considerada
positiva quando na mistura do reagente com a massa bacteriana desenvolve-se a cor prpura em at 1
minuto. Na reao negativa no h desenvolvimento de cor prpura. As enterobactrias so oxidase
negativas e podem ser diferenciadas de outros bacilos Gram negativos. A prova pode ser feita tambm
em culturas em meios slidos, adicionando-se o reagente oxalato de p-aminodimetilanilina. A reao
inicia-se com o desenvolvimento de cor rsea, marrom e finalmente uma colorao negra na superfcie
das colnias indicativa da produo de citocromo-oxidase, representando um teste positivo. O teste
negativo se no ocorrer alterao da cor ou houver o desenvolvimento de uma cor rsea plida.

E. coli

e. C e.e. COLI

Figura 22.
4

Pseudomonas

3.

Utilizao do citrato como nica fonte de carbono - Alguns microrganismos como a E. coli no
possuem a permease do citrato, que faz o transporte do citrato para o interior da clula, no
conseguindo portanto crescer no meio contendo como nica fonte de carbono o citrato, embora
possuam as enzimas, intracelulares, que degradam o citrato. A prova feita semeando-se a bactria no
meio slido inclinado de citrato de Simmons, contendo azul de bromotimol como indicador, o qual em
pH 6,8 a 7,0 apresenta-se verde. A prova positiva resulta no transporte do citrato pela permease e a sua
utilizao pela enzima citratase resulta na formao de oxaloacetato e acetato. O consumo do citrato
induz a clivagem do fosfato de amnia, alcalinizando o meio. Tambm, com o metabolismo do citrato
h formao de carbonatos que alcalinizam o meio, de modo que a cor do indicador vira para azul. Na
prova negativa o meio no se altera pois no h crescimento microbiano. Por esse motivo a inoculao
deve ser feita com agulha e em linha reta para no haver influncia de ingrediente do meio de onde se
originou a cultura, dando resultados falso-positivos.

Ac. Citrico

citrase

oxaloacetato

cido actico

cido pirvico + CO2

(Excesso)

+ 2Na+

+ H2O

NaCO3

pH alcalino

cor se altera de verde para azul.

Figura 23. Resultado da prova do citrato. Direita: reao positiva. Esquerda: reao negativa

4. Prova da produo de urease - A urease uma enzima que degrada a uria em duas molculas de
amnia e uma de anidrido carbnico. A prova consiste em transferir uma poro do crescimento
bacteriano com uma ala para o meio contendo uria, pH neutro e um indicador de pH, o vermelho
fenol. Aps o crescimento a prova revelada positiva quando a urease ataca a uria alcalinizando o

meio que toma a colorao rosa choque. Na prova negativa no h alterao da cor do meio. Os
organismos do gnero Proteus so urease positivos diferentemente da maioria das enterobactrias.

4.

Prova da produo de indol - O indol resultante da degradao do aminocido triptofano pela

enzima triptofanase. A prova realizada inoculando-se o meio contendo excesso de triptofano. Aps a
incubao colocar 0,5 ml do reagente de Kovac ou o reativo de Ehrlich (soluo aquosa ou alcolica
de p-dimetil aminobenzaldedo, respectivamente) atravs da parede interna do tubo. A prova positiva
quando na poro superior, i.e. na interface da cultura e o reagente, desenvolve-se um anel de cor rsea
dentro de no mximo 5 minutos. Este resultado devido complexao do indol com o aldedo, em
meio cido, formando o composto colorido. A prova negativa com qualquer outra tonalidade de cor
(original do meio ou marrom)

Figura 24.

O indol reage com o reagente formando um composto colorido rseo.

triptofanase
Triptofano

Indol + piruvato e amnia

5. Prova da produo de gs sulfdrico ou sulfeto de hidrognio Existem duas vias fermentativas

principais atravs das quais alguns microrganismos podem produzir sulfeto de hidrognio. Pela primeira
via, o gs sulfdrico produzido por reduo do enxofre orgnico presente no aminocido cistena (reao
de hidrogenao), o qual um componente das peptonas contidas no meio. Essas peptonas so degradadas
pelas enzimas microbianas a aminocidos. Atravs da ao da enzima desulfurase da cistena o
aminocido cistena perde o tomo de enxofre, que por sua vez reduzido pela adio de hidrognio da
gua para formar o gs sulfeto de hidrognio, conforme ilustrado abaixo. Uma tira de papel de filtro
impregnada com soluo saturada de acetato de chumbo colocada suspensa sobre o meio contendo o
aminocido sulfurado. Esteriliza-se o meio, inocula-se com a cultura teste e incuba-se apropriadamente.
Na prova positiva, o H2S produzido voltil e incolor, mas ao reagir com o acetato de chumbo forma-se
sulfeto de chumbo, que enegrece a extremidade do papel de filtro. Na prova negativa a fita permanece
branca.

Pela segunda via, o gs sulfdrico tambm pode ser produzido pela reduo de compostos
inorgnicos de enxofre tais como o tiossulfato, sulfato ou sulfito. Os microrganismos capazes de produzir
a enzima redutase do tiossulfato convertem o tiossulfato em sulfito com liberao de sulfeto de
hidrognio. Os tomos de enxofre atuam como aceptores de hidrognio durante a oxidao do composto
inorgnico conforme abaixo. Para esse teste pode ser empregado o meio de TSI (trplice sugar and iron) ou
o de meio de SIM (sulfito, indol e motilidade). Utilizando o meio de SIM, que tem o tiossulfato como
fonte de enxofre e o sulfato ferroso como indicador da produo de sulfeto de hidrognio. O meio semislido para permitir a respirao anaerbia. Nesse caso, inocula-se o meio por punctura e incuba-se em
aerobiose por 24h a 35oC.

Nas duas vias, o sulfeto de hidrognio produzido reage com o metal pesado formando sulfetos que
apresentam colorao negra.

Tiossulfato (3S2O3= ) + 4H++ 4e-

Redutase do tiossulfato

2SO3= + 2H2S +( metal pesado)

(Precipitado preto)

Cistena

Cistena desulfurase

cido pirvico + amnia + H2S (+ metal pesado)

(Precipitado preto)

Prova positiva

Figura 25

6. Prova da fermentao de carboidratos - Esta prova pode ser realizada de vrias maneiras. A mais
usual envolve a utilizao de um meio com glicose ou outro acar e/ou lcool com pH neutro e um
indicador de pH (Indicador de Andrade, prpura de bromocresol). Alm disso utiliza-se um tubo de
Durham, invertido, imerso no meio. O meio inoculado com a cultura teste e incubado. A prova positiva
indicada pela viragem da cor do meio de incolor com Indicador de Andrade ou prpura com prpura de
bromocresol, para vermelho ou amarelo, respectivamente, devido a produo de cidos, com abaixamento
do pH do meio. Alm disso, se a bactria possuir o sistema enzimtico hidrognio-frmico-liase, o cido
frmico transformado em C0 e Hidrognio, os quais so coletados pelo tubo de Durham, expulsando o
meio e ficando a extremidade superior desse tubo transparente, cheia dos gases citados. A prova negativa
7

revelada pela ausncia de mudana de cor ou at mesmo pela acentuao da cor prpura quando o reativo
o prpura de bromocresol, indicando utilizao dos aminocidos, com alcalinizao do meio. Deve-se
lembrar que, para produzir esse meio bem como aquele usado para pesquisa da produo de urease, os
acares e a uria devem ser esterilizados previamente por filtrao e, posteriormente, colocados
assepticamente no meio bsico. Enterobactrias produzem cido e gs da glicose (exceto Shigella, que s
produz cido). As pseudomonas no fermentam carboidratos. Algumas vezes necessrio verificar se a
bactria produz vrios cidos (fermentao cido mista), comum para E. coli, atravs do teste chamado de
vermelho de metila (VM) ou se apresenta fermentao butileno-gliclica revelada pela deteco de
acetona atravs do teste conhecido como VP ou Voges-Proskauer, comum em Enterobacter, mas no em
E.coli, permitindo diferenciar essas bactrias muito parecidas biolgica e bioqumicamente.

Figura 26.

7.

Prova do Vermelho de metila (VM) prova efetuada para determinar a capacidade do

microrganismo de oxidar a glicose com produo e estabilizao de altas concentraes de produtos
finais cidos. Serve para diferenciar organismos entricos, em particular E. coli de E. aerogenes

E. coli

Glicose + H20

cidos ltico, actico e frmico + CO2 + H2 + Vermelho de metila cor vermelha

Enterobacter aerogenes
Glicose + O2

cido actico

Acetilmetilcarbinol + naftol

(2,3-butanodiol e Acetilmetilcarbinol) + CO2 + H2 (pH 6,0)

40% KOH

diacetil (CH3-CO-CO-CH3 + Guanidina NH2-C=NH

(Oxidao)
8.

(grupo de peptona)
Rosa

Prova de Voges-Proskauer (VP) -

NH-R

9.

Reduo de nitratos

11. Prova da Motilidade - A prova da motilidade indica indiretamente a produo de flagelos. No uma
prova bioqumica e sim fisiolgica, mas auxilia a identificar bactrias. A prova efetuada inoculando-se
em linha reta, atravs da tcnica da punctura (com agulha), 2/3 de um meio semi-slido. A prova indica
motilidade quando os microrganismos crescem deslocando-se da linha de inoculao, turvando o meio. A
prova negativa quando os microrganismos ficam restritos ao local da inoculao sem, contudo, turvar o
meio.

As provas bioqumicas so utilizadas rotineiramente para identificar enterobactrias como E. coli,

Salmonella, Shigella, Yersinia, dentre outras. A diferenciao dos gneros da familia Enterobacteriaceae
feita atravs de provas bioqumicas ao passo que a diferenciao das espcies ou tipos feita sobretudo
com base em caracteres sorolgicos (sorotipos), embora tambm possa ser baseada em caracteres
bioqumicos ou na combinao de ambos. Finalmente, certos sorotipos podem subdividir-se
bioquimicamente constituindo os biotipos ou ento serem agrupados em lisotipos (fagotipos) de acordo
com suas reaes frente a bacterifagos especficos (Fagotipagem).
Para identificar um determinado microrganismo, a rotina bacteriolgica consiste da coleta
adequada da amostra e sua semeadura em meios de cultura (enriquecimento e meios seletivos diferencias,
se necessrio). As colnias suspeitas sero semeadas em determinados meios chamados de triagem (p/
identificao preliminar, p.ex. TSI, LIA, Kliger, dentre outros), i.e., que oferecem concomitantemente
vrias informaes de natureza bioqumica, permitindo estabelecer um diagnstico presuntivo imediato. A
depender dos resultados obtidos nesses meios de triagem pode-se caracterizar imediatamente alguns
grupos atravs de provas sorolgicas (aglutinao em lmina) ou proceder a sua identificao bioqumica,
complementada pela tipificao sorolgica quando necessrio.
O meio de TSI fornece uma srie de reaes bioqumicas que do uma viso geral do metabolismo
bacteriano. Por esse motivo, vamos apresentar esse meio e as transformaes que ocorrem. O TSI ou
trplice acar e ferro um meio slido distribudo de tal sorte que apresenta uma base e uma inclinao.
constitudo de glicose (0,1%), lactose (1,0%) e sacarose (1,0%), peptonas, aminocidos, incluindo
sulfurados, tiossulfato de sdio e citrato frrico amoniacal (indicador da produo de H 2S), com pH neutro
e um indicador de pH, o vermelho de fenol. O meio semeado com agulha por punctura na base e estrias
na superfcie. Aps o crescimento da bactria pode-se observar os seguintes resultados: A bactria no
fermenta qualquer dos acares, ficando inalterado o meio, ou at mesmo utiliza os aminoidos
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respirando-os com produo de aminas que alcalinizam o meio; fermenta somente a glicose de tal sorte
que os cidos formados mudam o pH do meio apenas na base, que se torna amarela e a inclinao
vermelha por utilizao dos aminocidos (por respirao), alcalinizando a mesma e neutralizando a
pequena quantidade de cidos, pois a concentrao de glicose baixa - assim o resultado expresso como
K/A (inclinao alcalina e base cida); fermenta a lactose ou a sacarose com viragem do indicador de
todo o meio para amarelo, tanto a base como a inclinao permanecem cidas, pois os lcalis
produzidos na inclinao so facilmente neutralizados pela grande quantidade de cidos produzidos
na base, tendo em vista que a concentrao desses acares dez vezes maior que a da glicose - o
resultado expresso como A/A (inclinao e base cidas). Nos dois ltimos casos, existe a possibilidade
de detectar gases resultantes da degradao do cido frmico em hidrognio e anidrido carbnico, se a
bactria possuir o sistema hidrognio frmico liase - os gases so indicados ou visualizados indiretamente
por levantar ou fragmentar o meio - o resultado representado como A/A com gs. H tambm a
possibilidade da bactria produzir H2S por respirar anaerobiamente o tiossulfato, captando eltrons
atravs da tiossulfato redutase, resultando em gs sufdrico e sulfito. O sulfeto de hidrognio na presena
de sais de ferro forma sulfeto ferroso, originando um precipitado negro insolvel - dessa forma o
resultado dado como A/A com gs e H2S.
Desse modo, pode-se observar num nico meio os processos fermentativos, respirao aerbia e
anaerbia. A utilizao dos acares e aminocidos na inclinao se d apenas por respirao aerbia,
enquanto que na base os processos so realizados por fermentao (incluindo tambm putrefao, quando
da utilizao dos aminocidos bsicos, sulfurados, triptofano, com produo de gs sulfdrico,
mercaptanas, aminas, dentre outras). J a utilizao do tiossulfato ocorre por respirao anaerbia,
gerando tambm gs sulfdrico.
Figura 28.

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