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Universidade Federal de Gois Instituto de Cincias Biolgicas Departamento de Morfologia

Disciplina: Biologia Celular

MTODOS DE ESTUDO DAS CLULAS

Profa. Mara Rubia Marques

2010

MICROSCOPIA
Microscpio um instrumento que produz imagens ampliadas de objetos de tal ordem pequenos que no podem ser vistos a olho nu.

Tipos de microscopia: Microscopia de Luz - o espcime atravessado por feixes de luz. Microscopia Eletrnica - o espcime atravessado por eltrons.

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PODER DE RESOLUO
Menor distncia entre duas partculas para que sejam vistas como unidades separadas.
ML
0,2 m

MET
3 nm

PODER DE RESOLUO
1 cm = 10-2 m 1 mm = 10-3 m 1m = 10-6 m 1 nm = 10-9 m 1 = 10-10 m

Clula animal tpica: 10 a 20 m (1/5 da menor partcula visvel a olho nu).

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MICROSCPIO ELETRNICO
Varredura Transmisso

MICROSCPIO ELETRNICO DE VARREDURA

uma tcnica que permite a visualizao das superfcies de espcimes no seccionados. A amostra fixada, dessecada e revestida com a camada fina de um metal pesado. A micrografia obtida tem um aspecto tridimensional.

http://universoemequilibrio.blogspot.com/2009_02_01_archive.html

http://www.ufmt.br/bionet/conteudos/01.09.04/varredura.htm

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MICROSCPIO ELETRNICO DE TRANSMISSO

MICROSCOPIA DE LUZ

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MICROSCPIO DE LUZ MODERNO

Vrias lentes na objetiva e na ocular

1 Condensadora 2 Objetiva 3 Ocular 4 Fonte luminosa

5

5 Platina 6 Charriot 7 Macro e micromanipuladores

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MODALIDADES DE OBSERVAO NA MICROSCOPIA DE LUZ

1. Campo claro 2. Campo escuro 3. Contraste de fase 4. Contraste interferencial 5. Polarizao 6. Fluorescncia 7. Microscpio invertido 8. Microscpio estereoscpico (lupa) 9. Confocal a laser

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Campo claro

Campo Escuro

A luz atravessa o material analisado.

Um sistema especial de condensador faz com que a luz fique de tal forma inclinada que no atravessa o material. Apenas os feixes desviados pelo objeto so observados.

Contraste de fase

Contraste Interdiferencial (Normarski)

Anis na lente condensadora e objetivas promovem retardo ptico no caminho do feixe luminoso.

Prismas pticos no caminho da luz modificam a fase de onda luminosa.

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Polarizao

Cndilo mandibular e disco articular. Corante: Picrossrus

Dois filtros (polarizador e analisador) que selecionam apenas um plano de direo de vibrao da luz: plano de luz polarizada (PPL).

Fluorescncia
As substncias absorvem a luz em um comprimento de onda e emitem luz com comprimentos maiores. Fonte luminosa: luz de mercrio Filtros: De excitao / barragem. Componentes autofluorescentes: colageno, lignina, clorofila, elastina. Fluorocromos permitem localizao de estruturas.

Clulas cancerosas coradas com Orange de acridina. RNA vermelho DNA - amarelo

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Confocal a laser

Cortesia de M. F. Santos

Microscpio invertido

Sans e Quevedo, 2007

O microscpio invertido tem o sistema de iluminao acima do estgio e o sistema de lentes embaixo. Permitem a visualizao atravs de espcimes espessos, como placas de cultivo de clulas, pela proximidade da lente ao fundo da placa.

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Microscpio estereoscpico

Observao de objetos opacos por onde a luz no passa, tais como: cristais, fsseis e moedas.

TIPOS DE PREPARO HISTOLGICO

Preparos a fresco (temporrio) vantagens / desvantagens Preparos permanentes vantagens / desvantagens.

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TCNICAS DE PREPARAO DE ESTUDO

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

COLETA DO MATERIAL FIXAO DESIDRATAO DIAFANIZAO INCLUSO/EMBEBIO MICROTOMIA COLORAO

TCNICAS DE PREPARAO DE ESTUDO

http://www.icb.ufmg.br/mor/biocelch/metodos_estudo/Figura%202.jpg

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COLETA
Tipos de coleta: Bipsia cirrgica Bipsia endoscpica Bipsia por agulha Cirurgias amplas Necrpsia

Tamanho do material: A amostra deve ser fragmentada a fim de permitir a penetrao do fixador por toda sua extenso. De 0,5 a 1 cm.

FIXAO
A fim de conservar as clulas ou tecidos no estado em que se encontravam em vida. O volume do fixador deve ser no mnimo 10X o volume do material fixado.

Qualidades dos fixadores: 1. Alto poder de penetrao 2. Manter as caractersticas do tecido e conservar os detalhes estruturais da clula 3. Favorecer a observao das estruturas 4. Conservar ou aumentar a afinidade dos tecidos pelos corantes.

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FIXAO

Formol 10% fixador mais comum na MO. Tempo de fixao: conforme tamanho e natureza da pea. Em geral de 12 a 24 horas.

PROCESSAMENTO
Incluso da amostra em um material que permita a realizao de cortes finos desta amostra. Geralmente em Parafina ou seus derivados.

- Desidratao ( lcool) - Diafanizao (Xilol) - Incluso (parafina lquida a 58-600C)

LCOOL

XILOL

PARAFINA

DESIDRATAO

DIAFANIZAO

INCLUSO

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MICROTOMIA
Micrtomo rotativo tipo Minot Espessura de 3 a 7 m

CONFECO DE CORTES HISTOLGICOS

Distenso do corte em gua fria

Distenso do corte em gua quente 400 C

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PROCESSAMENTO PARA COLORAO

1. DESPARAFINIZAO: Retirada da parafina do material Xilol I ... 20 min Xilol II ... 20 min Xilol III ... 20min 2. HIDRATAO lcool a 100% I ... 1 min lcool a 100% II ... 1 min lcool a 100% III ... 1 min lcool a 95% ... 1 min lcool a 70% ... 1 min lcool a 50% ... 1 min Dois banhos em gua destilada de 05 min cada.

PROCESSAMENTO PARA COLORAO

3. COLORAO Hematoxilina e eosina (HE) o corante de rotina

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PROCESSAMENTO PARA COLORAO

4. MONTAGEM DA LMINA lcool a 95% ... 1 min lcool a 100% I ... 1 min lcool a 100% II ... 1 min lcool a 100% III ... 1 min Xilol I ... 1 min Xilol II ... 1 min Xilol III ... 1 min iniciar a montagem.

Proteo por Lamnulas de vidro Meios de montagem: Blsamo do canad, Permount, Entelan

CULTURA DE CLULAS
Forma de estudo das clulas mantendo-as isoladas, fora do organismo de origem, sem perder suas caractersticas naturais.

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CULTURA DE CLULAS

TIPOS DE CULTIVO CELULAR

Cultura primria tecidos obtidos diretamente do animal e tratados com enzimas (tripsina) que dissocia as clulas que sero cultivadas em placas com meio de cultivo especial. Cultura secundria obtida de uma cultura primria tratada enzimaticamente e cultivada em outra placa. Linhagem celular As clulas podem proliferar indefinidamente devido s caractersticas cancerosas. Linhagens amplamente usadas: HeLa obtida a partir de carcinoma humano L embrio de rato 3T3 - embrio de rato BHK rim de Hamster rem nascido CHO ovrio de Hamster adulto

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CITOQUMICA
Usada para identificar, in situ, diferentes compostos qumicos das clulas. Reaes qumicas ajudam a mostrar estruturas intracelulares com coloraes especficas. Podem ser usadas amostras frescas. Coloraes mais usadas: Azul da prssia identificao de ferro (ferritina/hemossiderina) Peroxidase deteco da enzima mieloperoxidase distino entre clulas de origem mielide e linfide. Sudan Black B revelao de lipdios cido Reativo de Schiff (PAS) evidenciao de carboidratos Fosfatase alcalina neutrfilos maduros, osso, fgado, rins, placenta. Ajuda a determinar a atividade da clula.

Clulas tumorais (*Astrcitos).

Hemossiderina evidenciada por Azul da Prssia (Pearls)
http://anatpat.unicamp.br/nptganglioglioma7a.html

Clulas sanguneas Peroxidase evidenciada em neutrfilos

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Leucemia crnica Lipdios evidenciados por Sudan Black

Glndulas intestinais Carbohidratos evidenciados por PAS

Msculo esqueltico Evidenciao de mATPase

Osso Evidenciao de ions clcio

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Raiz de cebola Evidenciao DNA por Feulgen

http://fotos.sapo.pt/tw3PfHMLey2fi8BjuDAT

Peciolo de Geranium dissectum Fluorescncia natural da clorofila

www.milcores.pt

IMUNOCITOQUMICA
Uso de anticorpos acoplados a marcadores visveis ao microscpio. HIQ direta HIQ indireta

Desmina

Receptor de laminina

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FRACIONAMENTO CELULAR E MOLECULAR

Fraes: 1. 2. 3. 4. Nuclear ncleos e citoesqueleto Mitocondrial mitocndrias, peroxissomos, lisossomos Microssmica RE, CG, membranas Solvel ribossomos, macromolculas, vrus (ultracentrfuga analtica)

ULTRACENTRIFUGAO ANALTICA

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ELETROFORESE
Separao de molculas por diferena de potencial. Gel de Agarose Gel de Poliacrilamida Visualizao com brometo de etdio.

CROMATOGRAFIA
Mtodo fsico-qumico de separao de protenas. Baseia-se na migrao diferencial dos componentes de uma mistura entre uma fase fixa (papel filtro, resinas carregadas, lquido depositado num slido inerte) e outra mvel (solvente). Maior quantidade de protenas Menor pureza Tipos: Cromatografia de filtrao por gel Cromatografia de intercmbio inico Cromatografia de afinidade.

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