UNIVERSIDADE TUIUTI DO PARAN

Curso: Biotecnologia 4o perodo Professora: Maria Luiza F. Rodrigues Disciplina : Microbiologia Industrial

AULA PRTICA 03, 04, 05 E 06: ANLISE MICROBIOLGICA DA GUA E INDICADORES

Amostragem :Para a anlise microbiolgica, as amostras devem ser tomadas do ponto representativo do sistema de distribuio ou do reservatrio a ser examinado. TESTE PRESUNTIVO (COLIFORMES TOTAIS): Inocule uma srie de trs tubos contendo 10 ml, sendo 9 ml do meio Caldo Lauryl Sulfato Triptose (LST) ou Caldo Peptona e 1 ml da amostra de gua. Incube a 37C por 48 horas. A presena de gs no tubo de Duhran, indica teste presuntivo positivo. Anote o nmero de testes positivos. TESTE PARA O GRUPO DE COLIFORMES FECAIS: Transfira 1,0 mL de todos os tubos do teste presuntivo que deram resultado positivo para tubos contendo 9 ml do meio E.C (Escherichia coli). Incube os tubos na estufa a 44,5 oC por 48 horas. A presena de gs no tubo de Duhran indica teste positivo. Anote os nmeros de tubos positivos. DIFERENCIAO DE BACTRIAS DO GRUPO COLIFORME: Inocule atravs da ala de platina, a partir de um dos tubos positivos de meio E.C, uma placa com meio EMB (Agar Eosina Azul de Metileno), meio SS e meio Mac Conkey. Incube as placas invertidas de 24-48 horas 37 0C. Colnia tpica: nucleada com ou sem brilho metlico. Colnia atpica: anucleada, opaca, rosada e de consistncia gomosa. Colete uma colnia da placa e faa uma colorao de Gram.

COMPOSIO DOS MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS PARA ANLISE DE GUAS

Meio Caldo Lauryl Triptose Triptose...............................20g Lactose.................................5g Fosfato de potssio dibsico.............................2,75g Fosfato de potssio monobsico......................2,75g Cloreto de sdio....................5g Lauryl sulfato de sdio........0,1g gua destilada...............1000ml PH final = 6.8 Meio EC Triptose...............................20g Lactose.................................5g Fosfato de potssio dibsico.................................4g Fosfato de potssio monobsico........................1,5g Cloreto de sdio....................5g Sais biliares...........................5g gua destilada...............1000ml PH final = 6.9 EMB Agar peptona...............................10g Lactose.................................5g Sacarose .............................5g Fosfato de potssio dibsico...................2g Eosina .............................13,5g Azul de metileno............0,065g Agar .....................................2g gua destilada...............1000ml PH final = 6.8

EMB agar: este meio utilizado para a diferenciao de E. coli e Enterobacter aerogenes. Aspecto das colnias: Escherichia coli: colnias esverdeadas, com brilho metlico e geralmente com centro mais escuro. Enterobacter aerogenes: colnias com aspecto mucide, com o centro amarreonzado. Patgenos que no fermentam a lactose: colnias transparentes. SSA: este meio seletivo para o isolamento de Salmonella e Shigella de alimentos ou outras fontes. Os microrganismos gram positivos e os coliformes so inibidos pela ao dos sais biliares. Aspecto das colnias: Salmonella e Shigella: organismos no fermentadores da lactose presentam colnias incolores e transparentes. Escherichia coli: apresentam colnias de cor vermelha. Enterobacter sp e Proteus sp: apresentam colnias de cor rosa, creme ou branca. McConkey agar: este meio seletivo para bactrias gram negativas e serve para o isolamento de coliformes, Salmonella e Shigella de alimentos e outras fontes. Aspecto das colnias: Qualquer organismo capaz de fermentar a lactose com a produo de cidos, forma colnias vermelhas em meio agar McConkey (agar vermelho neutro-sais biliares), devido viragem do indicador em pH baixo.

Resultados Aps o crescimento das colnias nos meios seletivos descritos acima (48 horas), faa a colorao de gram com as culturas para notar as formas celulares e anote na tabela abaixo as suas observaes. Resultados obtidos aps 48 horas de crescimento em meio seletivo
Meios seletivos EMB SSA McConkey Aspecto das colnias Observaes

Caractersticas dos microrganismos nos meios EMB, SSA e MacConkey

Microrganismo Escherichia coli Meio EMB Meio SSA Meio MacConkey pequenas Colnias de cor rosapois

Colnias pequenas, de cor Colnias verde metlico brilhante

redondas de cor rsea

avermelhada fermentam a lactose

Enterobacter aerogenes

Colnias cor rosa escuro

grandes, Colnias

de

aspecto Colnias

de

cor

rosapois

nucleadas e espalhadas, de cremoso de cor rsea

avermelhada fermentam a lactose

Salmonella sp

Colnias

pequenas

e Colnias transparentes Colnias transparentes ou que podem apresentar amareladas preta pois no ncleo central de cor fermentam a lactose

transparentes

Klebsiella sp

Colnias grandes, gomosas, Colnias com ncleo central escuro espalhadas, que se espalham na placa

gomosas, Colnias de

de

cor

rosapois

cor avermelhada fermentam a lactose

rsea a alaranjado

Serratia marcerans

Colnia gomosas,

roxo

azuladas, Colnias com transparentes leitosas e Colnias podem ter

pequenas, Colnias transparentes ou ou amareladas pois no fermentam a lactose espalhadas Colnias transparentes ou que amareladas o pois no ncleo fermentam a lactose

planas,

cresciemnto espalhado Proteus morgani Colnias pequenas

transparentes

transparentes mais escuro

COLORAO DE GRAM 1 - Introduo 3

A colorao de Gram um mtodo de colorao de bactrias desenvolvido pelo mdico dinamarqus Hans Christian Joachim Gram (1853 - 1838), em 1884, e que consiste no tratamento sucessivo de um esfregao bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina bsica. Essa tcnica permite a separao de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinao da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. O mtodo da colorao de Gram baseado na capacidade das paredes celulares de bactrias Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta no citoplasma durante um tratamento com etanol-acetona enquanto que as paredes celulares de bactrias Gram-negativas no o fazem. A colorao de Gram um dos mais importantes mtodos de colorao utilizados em laboratrios de microbiologia e de anlises clnicas, sendo quase sempre o primeiro passo para a caracterizao de amostras de bactrias. A tcnica tem importncia clnica uma vez que muitas das bactrias associadas a infeces so prontamente observadas e caracterizadas como Gram-positivas ou Gram-negativas em esfregaos de pus ou de fluidos orgnicos. Essa informao permite ao clnico monitorar a infeco at que dados de cultura estejam disponveis. possvel a anlise de vrios esfregaos por lmina, o que facilita a comparao de espcimes clnicos. As lminas podem ser montadas de forma permanente e preservadas como documentao. 2 - Descrio da tcnica O mtodo consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio slido ou lquido, com um corante primrio, o cristal violeta, seguido de tratamento com um fixador, o lugol. Tanto bactrias Gram-positivas quanto Gram-negativas absorvem de maneira idntica o corante primrio e o fixador, adquirindo uma colorao violeta devido formao de um complexo cristal violeta-iodo, insolvel, em seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um solvente orgnico, o etanol-acetona (1:1 v:v). O solvente dissolve a poro lipdica das membranas externas das bactrias Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo removido, descorando as clulas. Por outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactrias Gram-positivas e provoca a contrao dos poros do peptidoglicano, tornando-as impermeveis ao complexo; o corante primrio retido e as clulas permanecem coradas. A etapa da descolorao crtica, pois a exposio prolongada ao solvente ir provocar a remoo do cristal violeta dos dois tipos de bactrias, podendo produzir resultados falsos. A reteno ou no do corante primrio , portanto, dependente das propriedades fsicas e qumicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura, densidade, porosidade e integridade. Em seguida, a amostra tratada 4

com um corante secundrio, a fucsina bsica. Ao microscpio, as clulas Gram-positivas aparecero coradas em violeta escuro e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro. Clulas de bactrias Gram-positivas, clulas velhas, mortas ou com envelopes danificados por agentes fsicos ou qumicos, tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as clulas coradas como Gram-negativas. Portanto, o uso de material fresco importante. Por outro lado, resultados do tipo "falso Gram-positivo" s so obtidos se o tratamento com etanol-acetona for omitido. O corante cristal violeta pode ser substitudo, com os mesmos resultados, pelo azul de metileno e a fucsina bsica pode ser substituda pelo corante vermelho safranina. A fucsina cora muitas bactrias Gram-negativas mais intensamente que a safranina, que por sua vez no cora prontamente algumas espcies de bactrias. O solvente etanol-acetona pode ser substitudo por lcool 95%. A tcnica da colorao de Gram no infalvel e podese fazer o teste do hidrxido de potssio (KOH). Em uma lmina de microscopia adicionam-se duas gotas de uma soluo de KOH a 3%. Com o auxlio de uma ala de semeadura coletase uma colnia isolada da bactria e mistura-se com a soluo de KOH na lmina por 30 segundos. Se a bactria for verdadeiramente Gram-negativa, o KOH ir romper sua parede celular e liberar seu DNA que ser observado como fios viscosos. Se a bactria for Grampositiva no haver a formao de fios. 3 - Procedimentos 3.1 - Preparo do esfregao Suspender uma pequena poro da amostra bacteriana a ser corada em uma gota de gua ou soluo salina 0,85%, sobre uma lmina de microscpio, espalhando a gota. Este procedimento deve ser feito com um ala bacteriolgica flambada ou um palito de madeira esterilizado. Deixar o material secar e, em seguida, fix-lo com calor, flambando rapidamente a lmina acima da chama de um bico de Bunsen. 3.2 - Aplicao do corante primrio Cobrir toda a sua superfcie da lmina com o corante cristal violeta; deixar em repouso por um minuto. Remover o corante da lmina com gua destilada, com auxlio de um contagotas. 3.3 - Aplicao do fixador Cobrir toda a sua superfcie da lmina com lugol; deixar em repouso por um minuto. Remover o fixador da lmina com gua destilada, com auxlio de um conta-gotas. 5

3.4 - Descolorao Com a lmina inclinada, despejar algumas gotas de lcool-acetona 1:1 v:v (descolorizador) para remover o complexo cristal violeta-lugol de clulas Gram-negativas. Este procedimento deve ser realizado at o momento que no desprenda mais a cor violeta do esfregao. 3.5 - Aplicao do corante secundrio Cobrir toda a sua superfcie da lmina com o corante fucsina bsica (safranina); deixar em repouso por um minuto. Enxaguar a lmina com gua, com auxlio de um contagotas, e tocar as bordas com papel absorvente para remoo do excesso de gua. 3.6 - Microscopia Examinar a amostra ao microscpio ptico.