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AULA PRÁTICA 03-06- ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ÁGUA 2010

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UNIVERSIDADE TUIUTI DO PARANÁ

Curso: Biotecnologia – 4o período Professora: Maria Luiza F. Rodrigues Disciplina : Microbiologia Industrial

AULA PRÁTICA 03, 04, 05 E 06: ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DA ÁGUA E INDICADORES

Amostragem :Para a análise microbiológica, as amostras devem ser tomadas do ponto representativo do sistema de distribuição ou do reservatório a ser examinado. TESTE PRESUNTIVO (COLIFORMES TOTAIS): Inocule uma série de três tubos contendo 10 ml, sendo 9 ml do meio Caldo Lauryl Sulfato Triptose (LST) ou Caldo Peptona e 1 ml da amostra de água. Incube a 37ºC por 48 horas. A presença de gás no tubo de Duhran, indica teste presuntivo positivo. Anote o número de testes positivos. TESTE PARA O GRUPO DE COLIFORMES FECAIS: Transfira 1,0 mL de todos os tubos do teste presuntivo que deram resultado positivo para tubos contendo 9 ml do meio E.C (Escherichia coli). Incube os tubos na estufa a 44,5 oC por 48 horas. A presença de gás no tubo de Duhran indica teste positivo. Anote os números de tubos positivos. DIFERENCIAÇÃO DE BACTÉRIAS DO GRUPO COLIFORME: Inocule através da alça de platina, a partir de um dos tubos positivos de meio E.C, uma placa com meio EMB (Agar Eosina Azul de Metileno), meio SS e meio Mac Conkey. Incube as placas invertidas de 24-48 horas á 37 0C. Colônia típica: nucleada com ou sem brilho metálico. Colônia atípica: anucleada, opaca, rosada e de consistência gomosa. Colete uma colônia da placa e faça uma coloração de Gram.

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..........10g Lactose............................2g Água destilada.5g Água destilada.. creme ou branca.5g Cloreto de sódio.......................... com o centro amarreonzado.... Enterobacter aerogenes: colônias com aspecto mucóide. Aspecto das colônias: Qualquer organismo capaz de fermentar a lactose com a produção de ácidos...............20g Lactose..............5g Azul de metileno......5g Fosfato de potássio dibásico...2.........5g Fosfato de potássio dibásico.... com brilho metálico e geralmente com centro mais escuro.........8 Meio EC Triptose.............20g Lactose.........75g Cloreto de sódio...........................2.... 2 ...............0...............5g Sacarose ..........0. Os microrganismos gram positivos e os coliformes são inibidos pela ação dos sais biliares.........1000ml PH final = 6..............5g Fosfato de potássio dibásico.......... Aspecto das colônias: Escherichia coli: colônias esverdeadas... Enterobacter sp e Proteus sp: apresentam colônias de cor rosa..... SSA: este meio é seletivo para o isolamento de Salmonella e Shigella de alimentos ou outras fontes....1.........COMPOSIÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS PARA ANÁLISE DE ÁGUAS Meio Caldo Lauryl Triptose Triptose...1g Água destilada.....2g Eosina ............................9 EMB Agar peptona... forma colônias vermelhas em meio agar McConkey (agar vermelho neutro-sais biliares)................................................... Patógenos que não fermentam a lactose: colônias transparentes.... Aspecto das colônias: Salmonella e Shigella: organismos não fermentadores da lactose presentam colônias incolores e transparentes.......................................4g Fosfato de potássio monobásico...... coli e Enterobacter aerogenes......................5g Lauryl sulfato de sódio............... devido à viragem do indicador em pH baixo.......................1000ml PH final = 6.........................75g Fosfato de potássio monobásico... Escherichia coli: apresentam colônias de cor vermelha...... McConkey agar: este meio é seletivo para bactérias gram negativas e serve para o isolamento de coliformes...1000ml PH final = 6.065g Agar ......13..............8 EMB agar: este meio é utilizado para a diferenciação de E..... Salmonella e Shigella de alimentos e outras fontes..................5g Sais biliares.............

de cremoso de cor rósea avermelhada fermentam a lactose Salmonella sp Colônias pequenas e Colônias transparentes Colônias transparentes ou que podem apresentar amareladas preta pois não núcleo central de cor fermentam a lactose transparentes Klebsiella sp Colônias grandes. Colônias com transparentes leitosas e Colônias podem ter pequenas. gomosas. de cor Colônias verde metálico brilhante redondas de cor rósea avermelhada fermentam a lactose Enterobacter aerogenes Colônias cor rosa escuro grandes. faça a coloração de gram com as culturas para notar as formas celulares e anote na tabela abaixo as suas observações. Resultados obtidos após 48 horas de crescimento em meio seletivo Meios seletivos EMB SSA McConkey Aspecto das colônias Observações Características dos microrganismos nos meios EMB. que se espalham na placa gomosas.Resultados Após o crescimento das colônias nos meios seletivos descritos acima (48 horas). Colônias transparentes ou ou amareladas pois não fermentam a lactose espalhadas Colônias transparentes ou que amareladas o pois não núcleo fermentam a lactose planas. cresciemnto espalhado Proteus morgani Colônias pequenas transparentes transparentes mais escuro COLORAÇÃO DE GRAM 1 . roxo azuladas. Colônias com núcleo central escuro espalhadas. Colônias de de cor rosapois cor avermelhada fermentam a lactose rósea a alaranjado Serratia marcerans Colônia gomosas.Introdução 3 . SSA e MacConkey Microrganismo Escherichia coli Meio EMB Meio SSA Meio MacConkey pequenas Colônias de cor rosapois Colônias pequenas. Colônias de aspecto Colônias de cor rosapois nucleadas e espalhadas.

a amostra é tratada 4 . e que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano. O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido. descorando as células. As lâminas podem ser montadas de forma permanente e preservadas como documentação. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gram-negativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador.A coloração de Gram é um método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1853 . adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo. Em seguida. Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. porosidade e integridade. lugol. sendo quase sempre o primeiro passo para a caracterização de amostras de bactérias. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico. densidade. A etapa da descoloração é crítica. podendo produzir resultados falsos. A coloração de Gram é um dos mais importantes métodos de coloração utilizados em laboratórios de microbiologia e de análises clínicas. Por outro lado. com os reagentes cristal violeta. em seus citoplasmas. portanto. o que facilita a comparação de espécimes clínicos. pois a exposição prolongada ao solvente irá provocar a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias. dependente das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura. o cristal violeta. o lugol. etanol-acetona e fucsina básica. com um corante primário. 2 . O método da coloração de Gram é baseado na capacidade das paredes celulares de bactérias Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta no citoplasma durante um tratamento com etanol-acetona enquanto que as paredes celulares de bactérias Gram-negativas não o fazem. A retenção ou não do corante primário é. É possível a análise de vários esfregaços por lâmina. seguido de tratamento com um fixador. insolúvel. Essa informação permite ao clínico monitorar a infecção até que dados de cultura estejam disponíveis.1838). o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Gram-positivas e provoca a contração dos poros do peptidoglicano. em 1884. fixado pelo calor. o etanol-acetona (1:1 v:v). o corante primário é retido e as células permanecem coradas. A técnica tem importância clínica uma vez que muitas das bactérias associadas a infecções são prontamente observadas e caracterizadas como Gram-positivas ou Gram-negativas em esfregaços de pus ou de fluidos orgânicos.Descrição da técnica O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido. tornando-as impermeáveis ao complexo.

Remover o corante da lâmina com água destilada. tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas como Gram-negativas. A fucsina cora muitas bactérias Gram-negativas mais intensamente que a safranina.85%.Aplicação do corante primário Cobrir toda a sua superfície da lâmina com o corante cristal violeta. 3. o uso de material fresco é importante. a fucsina básica. 5 . Células de bactérias Gram-positivas. Em uma lâmina de microscopia adicionam-se duas gotas de uma solução de KOH a 3%. Ao microscópio. O corante cristal violeta pode ser substituído. deixar em repouso por um minuto. Este procedimento deve ser feito com um alça bacteriológica flambada ou um palito de madeira esterilizado. com auxílio de um conta-gotas. Portanto. com os mesmos resultados. 3.3 . Se a bactéria for Grampositiva não haverá a formação de fios. mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos.Preparo do esfregaço Suspender uma pequena porção da amostra bacteriana a ser corada em uma gota de água ou solução salina 0. sobre uma lâmina de microscópio. em seguida. deixar em repouso por um minuto. Deixar o material secar e. espalhando a gota. que por sua vez não cora prontamente algumas espécies de bactérias. Por outro lado. 3 .com um corante secundário. Remover o fixador da lâmina com água destilada.2 . fixá-lo com calor. as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro. células velhas.Procedimentos 3. com auxílio de um contagotas. pelo azul de metileno e a fucsina básica pode ser substituída pelo corante vermelho safranina. Com o auxílio de uma alça de semeadura coletase uma colônia isolada da bactéria e mistura-se com a solução de KOH na lâmina por 30 segundos.Aplicação do fixador Cobrir toda a sua superfície da lâmina com lugol. O solvente etanol-acetona pode ser substituído por álcool 95%. Se a bactéria for verdadeiramente Gram-negativa.1 . A técnica da coloração de Gram não é infalível e podese fazer o teste do hidróxido de potássio (KOH). flambando rapidamente a lâmina acima da chama de um bico de Bunsen. resultados do tipo "falso Gram-positivo" só são obtidos se o tratamento com etanol-acetona for omitido. o KOH irá romper sua parede celular e liberar seu DNA que será observado como fios viscosos.

Este procedimento deve ser realizado até o momento que não desprenda mais a cor violeta do esfregaço.Microscopia Examinar a amostra ao microscópio óptico. e tocar as bordas com papel absorvente para remoção do excesso de água.6 .Aplicação do corante secundário Cobrir toda a sua superfície da lâmina com o corante fucsina básica (safranina). 6 .5 .3. Enxaguar a lâmina com água. deixar em repouso por um minuto. 3.4 . 3. despejar algumas gotas de álcool-acetona 1:1 v:v (descolorizador) para remover o complexo cristal violeta-lugol de células Gram-negativas. com auxílio de um contagotas.Descoloração Com a lâmina inclinada.

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