MINISTRIO DA EDUCAO E DO DESPORTO

UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRAS

DEPARTAMENTO DE AGRICULTURA






REVISO DE MICROSCOPIA


















Com a ajuda do microscpio no h nada to pequeno que possa escapar s
nossas investigaes; portanto h um novo e visvel mundo descoberto a ser
entendido. Robert Hookie (Micrographia, 1664).






Edilene C.S. Marchi
Prof. Daniel Melo de Castro
Disciplina DBI Anatomia vegetal




2005
Tipos de microscopia

Histrico
Desde a antiguidade povos como os egpcios, gregos e romanos
conheciam a arte de talhar e polir cristais de rochas e usam essas primeiras lupas
primitivas como objetos decorativos. No entanto, somente em meados do sculo
XIII, um monge chamado Alejandro Spina divulgou o segredo e a construo da
fabricao de lentes corretivas. Os primeiros estudos cientficos datam do sculo
XVII conduzidos por Johanes Kepler que estudou os fenmenos ticos e a
formao de imagens no olho.
Atansio Kircher (1601-1680) foi o primeiro a usar a palavra
microscopium nome dado ao microscpio daquela poca (Gato, 2005).
Muitos atribuem a inveno do microscpio a Galileu, porm foi Antonie
van Leeuwenhoek, (1632-1723), quem realmente aperfeioou o instrumento e o
utilizou na observao de seres vivos. Seu microscpio era dotado de apenas
uma lente de vidro, permitindo um aumento de at 300 vezes. Com este
instrumento Leeuwenhoek estudou os glbulos vermelhos do sangue e constatou
a existncia dos espermatozides (Embrapa, 2005).
Robert Hooke, em 1665 publicou seu livro intitulado Micrographia
onde descreveu o microscpio e como ele havia descoberto a circulao do
sangue nos peixes. Em seu microscpio, Robert Hooke incorporou o ajuste fino
e acrescentou mais uma lente (Embrapa, 2005).
Aps o aprimoramento, os microscpios ficaro constitudos por 2
sistemas de lentes de cristal (oculares e objetivas) que produzem ampliaes de
imagem que vo em geral de 100 a 1000 vezes (Embrapa, 2005).
Em 1932, surgiu o microscpio eletrnico permitindo aumentos de 5 mil
a 500 mil vezes. A diferena bsica entre os microscpios tico e eletrnico
que neste ltimo no utilizada a luz, mas sim feixes de eltrons. No
microscpio eletrnico no h lentes de cristal e sim bobinas, chamadas de lentes
eletromagnticas. Estas lentes ampliam a imagem gerada pela passagem do feixe
de eltrons no material e a projetam em uma tela onde formada uma imagem
de pontos mais ou menos brilhantes. No entanto, impossvel observar material
vivo neste tipo de microscpio. O material a ser estudado passa por um
complexo processo de desidratao, fixao e incluso em resinas especiais,
muito duras, que permitem cortes ultrafinos por meio das navalhas de vidro de
ultramicrtomo (Embrapa, 2005).
Na histria da microscopia, 200 anos foram necessrios para que o
microscpio deixasse de se ser um instrumento extico e pouco acessvel para
ser usado em uma escala mais ampla. Ento, a partir do sc. XIX, graas aos
estudos realizados por microscopistas puderam afirmar o conceito de clula
como verdade cientfica, surgindo a cincia da biologia celular (Melo, 2002).

Unidades de medida utilizada em microscopia
Em geral, podem-se dividir as unidades de estruturas biolgicas em
macroscpicas e microscpicas, sendo essa ltima invisvel a olho humano nu.
As unidades de medida em microscopia compreende o micrmetro (m), em
microscopia tica e (m) e o angstrom (), na microscopia eletrnica.

As unidades de medida geralmente usadas em microscopia so as seguintes:
Unidade de medida Smbolo Valor
Micrmetro m 0,001 mm (milsima parte do milmetro)
Nanmetro nm 0,001m (milsima parte do micrmetro)
Angstrom 0,0000001 mm (10
-7
mm)

O aumento total do objeto observado calculado multiplicando-se os valores do
aumento da objetiva e da ocular.
Ocular Objetiva Aumento Dimetro do Campo
10 x 10x (pequeno aumento 100x 1.500m
10 x 40x (grande aumento a seco) 400x 375m
10 x 100x (imerso em leo) 1.000x 150m


Microscopia de luz
Microscpios so aparelhos nos quais lentes de vidro so associadas de
tal forma que se consiga reproduzir para o olho humano, uma imagem
aumentada e detalhada de objetos, clulas, tecidos e rgos, que vista
desarmada no seria possvel de se observar mais detalhes (Taboga, 2001).
O microscpio de luz assim chamado devido sua fonte luminosa que
uma luz branca oriunda de um filamento de tungstnio (Melo, 2002). O conjunto
de lentes formado pelas objetivas e oculares. A objetiva, a primeira lente e a
que est mais prxima do objeto, capta a luz filtrada pelo condensador e projeta
uma imagem real, invertida e aumentada da estrutura. A lente ocular, presta-se a
aumentar a imagem projetada pela objetiva, para ser captada pelo olho do
observador (Parreira, 2005) (Figura 1).


Figura 1. Esquema da formao da imagem num microscpio ptico. AB
objeto iluminado e colocado sobre a platina; AB imagem real e invertida,
formada ao nvel do foco da ocular; AB imagem captada na retina do
observador (na realidade forma-se uma imagem virtual no infinito); F foco da
objetiva; fobj distncia focal da objetiva; foc distncia focal da ocular.
(Adaptado de Mello e Vidal, 1980 citado por Parreira, 2005).

Adicionalmente, o microscpio apresenta uma base mecnica (base,
brao, revlver, platina, charriot, parafusos macro e micromtrico e parafuso de
regulagem do condensador) e um sistema de iluminao (fonte luminosa,
diafragmas, condensador e filtros) (Figura 2). O p ou Base suporta o
microscpio, assegurando a sua estabilidade; brao ou Coluna pea fixa base,
na qual esto aplicadas todas as outras partes constituintes do microscpio; Tubo
ou Canho cilindro que suporta os sistemas de lentes, localizando-se na
extremidade superior a ocular e na inferior o revlver com objetivas; Platina
pea circular, quadrada ou retangular, paralela base, onde se coloca a
preparao a observar, possuindo no centro um orifcio circular ou alongado que
possibilita a passagem dos raios luminosos concentrados pelo condensador;
Parafuso Macromtrico engrenagem que suporta o tubo e permite a sua
deslocao a da platina, indispensvel para fazer a focagem; Parafuso
Micromtrico imprime ao tubo ou platina movimentos de amplitude muito
reduzida, completando a focagem. Permite explorar a profundidade de campo do
microscpio; Revlver disco adaptado zona inferior do tubo, que suporta
duas a quatro objetivas de diferentes ampliaes: por rotao possvel trocar
rpida e comodamente de objetiva (Reis, 2003).


Figura 2. Partes constituintes do microscpio de luz, em que (A) compem o
sistema tico e (B) o sistema mecnico (Reis, 2003).

No microscpio tico, a luz que chega aos nossos olhos para formar a
imagem, atravessa primeiro o objeto em estudo. Por isto, o material a ser
observado no pode ser opaco. Muitas vezes, para se obter material biolgico
translcido o suficiente para ser bem observado ao microscpio, preciso
preparar convenientemente o material que quer estudar. Para isto so feitos
cortes muitos finos, de preferncia com uma mquina, chamada micrtomo. O
material a ser cortado recebe um tratamento de desidratao e incluso em
parafina que facilita o manuseio e permite que sejam cortadas fatias muito finas
(Embrapa, 2005).
Na microscopia de luz existem vrios tipos de aparelhos, os quais
apresentam sistemas de lentes e filtros que selecionam um ou outro tipo de luz,
diversificando as imagens formadas. Estes aparelhos so chamados microscpios
especiais e so chamados: microscpio de campo claro, campo escuro,
fluorescncia, invertido, confocal (microscopia de varredura confocal) e de
polarizao.

a. Microscopia de campo claro
O microscpio de campo claro o mais comum microscpio de luz
(Melo, 2002). Nesse microscpio, o campo de viso aparece iluminado e os
objetos que esto sendo observados apresentam-se mais escuros (Reis, 2003).
Segundo Weiss et al. (1991), a microscopia de campo claro apresenta
algumas vantagens como menor toxicidade por necessitar de menores
concentraes de corantes; baixo contraste, devido ao uso de baixas
concentraes de cromforos naturais ou especialmente corantes vitais, pode ser
grandemente aumentados; observaes feitas no comprimento de onda de
mxima absoro aumentam o contraste. Entretanto, apresenta algumas
limitaes como objetos de fase exibem mnimo contraste em foco e mostra
contraste oposto por cima e abaixo do foco.

b. Microscopia de campo escuro
Microscpio utilizado para visualizar materiais muito pequenos como
plncton, bactrias e cristais (Melo, 2002). As imagens obtidas no campo escuro
apresentam grande contraste e este pode ser ampliado pelo uso de sinal de vdeo
(Weiss et al., 1991).
Baseia-se no princpio de que a luz dispersa pela superfcie dos
materiais que possuem diferentes ndices de refrao. A luz dispersada entra na
objetiva e o objeto aparece iluminado e brilhante sobre um fundo escuro. Tal
consegue-se pela utilizao de um tipo especial de condensador que ilumina o
objeto obliquamente (Reis, 2003). A luz atinge o espcime a ser analisado e
somente os feixes desviados pelo objeto percorrem o resto do sistema, isto ,
objetivas e oculares, formando a imagem (Taboga, 2001) (Figura 3).



Figure 3. Esquema da configurao do
microscpio de campo escuro
(Davidson e Abramowitz, 2005).
um tipo de microscopia utilizada na observao de microorganismos
no corados, suspensos em lquidos, preparaes a fresco e em gota pendente
(Reis, 2003), plnctons, bactrias, gros de plen (Taboga, 2001).

c. Microscopia de contraste de fase
Esse tipo de microscopia foi desenvolvida pelo holands Zernik, na
dcada de 50, baseada nos princpios de difrao da luz, isto , o caminho do
feixe luminoso, na formao da imagem por esse tipo de microscpio, sofre um
retardo ptico, permitindo assim que se possa observar materiais biolgicos sem
a colorao (Taboga, 2001). Portanto, o microscpio de contraste de fase dispe
de certos recursos especficos para estudar clulas vivas e no coradas (Melo,
2002), particularmente til para o estudo da mitose em clulas cultivadas in vitro
(Reis, 2003), e exames rpidos de culturas de clulas, sangue, bactrias, algas,
protozorios de ambientes aquticos, contedo estomacal de animais, anlise de
materiais cermicos, txteis e minerais (Taboga, 2001). Ento, grande parte dos
detalhes de clulas vivas no so detectados no microscpio de campo luminoso
devido ao fato de as estruturas celulares serem transparentes e incolores, no
apresentando contraste suficiente. Contudo, o microscpio de contraste de fase
tem um sistema ptico especial que torna possvel a distino de materiais
biolgicos que diferem ligeiramente no que se refere aos seus ndices de
refrao. A luz que passa atravs de materiais com densidades ligeiramente
diferentes refratada ou desviada do seu trajeto original. Variaes mnimas de
fase, devidas s diferenas de ndice de refrao dentro do objeto, so ampliadas
e transformadas em mudanas de amplitude (intensidade) as quais so
visualizadas como diferenas de contraste na imagem (Reis, 2003) (Figura 4).

Figura 4. Aspecto de clulas vivas observadas com microscpio ptico de
campo luminoso (a) e microscpio ptico de contraste de fase (b) (Reis, 2003).

O microscpio de contraste de fase apresenta sistemas de anis metlicos
postos no caminho da luz. Um na lente condensadora e outro nas objetivas. Uma
singular particularidade que as objetivas de fase apresentam a designao Ph,
oriunda da palavras phase, diferenciando-a das demais. Esses anis, aps
centralizados, promovem o retardo ptico, permitindo assim a visualizao do
espcime sem colorao (Taboga, 2001) (Figura 5).



Figure 5. Esquema da configurao do
microscpio de contraste de fase (Davidson
e Abramowitz, 2005).



d. Microscopia de contraste interferencial
A microscopia interferencial mais conhecida a chamada de
microscopia de Normarski. A gerao do contraste a uma alta abertura de
trabalho limitada em uma profundidade de campo raso, resultando na
habilidade de tornar a seo com alto contraste de 200 a 300 nm de espessura
(Weiss et al. et al., 1991). Esse tipo de contraste interferencial trabalha com a
defasagem dos comprimentos de ondas. Assim, a defasagem gera uma
deformao na imagem, permitindo o contraste interferencial, aumentando a
superfcie do material analisado. A aplicao dessa microscopia permite a
observao de materiais biolgicos sem colorao, sendo til no monitoramento
de culturas celulares, estudo de morfologia, taxonomia de pequenas larvas e
caros e outros ectoparasitos (Taboga, 2001).
Esse tipo de microscopia utiliza-se de prismas pticos posicionados na
passagem da luz. Esses prismas modificam as fases luminosas que contrastaro
com o meio em que se encontra o material a ser observado. Esse microscpio
requer uma construo especfica, apesar de no utilizar lentes objetivas
especiais, ele necessita de um revlver com ranhuras para alojar os prismas de
interferncia, ento as cores de interferncia promovero a visualizao da
imagem (Taboga, 2001) (Figura 6).




Figure 6. Esquema da configurao do
microscpio de contraste de fase
interferencial (Davidson e
Abramowitz, 2005).



e. Microscopia de fluorescncia
A microscopia de fluorescncia , provavelmente, a mais verstil e
poderosa tcnica para localizar protenas dentro da clula pela microscopia de
luz (Lodish et al., 2003).
Fluorescncia a propriedade de algumas substncias para, aps serem
excitadas com radiao de baixo comprimento de onda, emitirem radiao de
maior comprimento de onda. Algumas substncias absorvem a energia da
radiao ultravioleta emitindo depois radiao dentro do espectro de luz visvel.
Microorganismos corados por um corante fluorescente aparecem como objetos
luminosos quando observados com luz ultravioleta. com os recursos desta
tcnica que se evidenciam, por exemplo, os antgenos quando associados a
anticorpos acoplados a molculas fluorescentes, e quantifica-se pelo processo de
fluorometria os objetos de estudo da citoqumica normal e patolgica (Taboga,
2001).
O mais fluorescente corante chamado de fluorocromo, capaz de emitir
luz visvel (Lodish et al., 2003). Dois exemplos de fluorocromo o corante
alaranjado de acridina que se liga aos cidos nuclicos conferindo uma
fluorescncia amarelo esverdeada ao DNA e avermelhada ao RNA, e a eosina,
que apesar de no ser um fluorocromo se comporta como tal, aumenta a
fluorescncia natural da elastina (Taboga, 2001). Os fluorocromos, quando
conjugados com anticorpos, torna possvel a identificao de clulas individuais
que reagem com o anticorpo (aplicao designada de imunofluorescncia) (Reis,
2003). Os fluorocromos podem se combinar com estruturas celulares, tornando-
as fluorescentes, tornando-as passveis de identificao e localizao, como
protenas ou estruturas celulares (Melo, 2002).
O microscpio de fluorescncia utiliza um sistema ptico que interage
pouco com a luz. Utiliza-se uma luz de mercrio de alta presso, cujos picos
variam entre 312 e 579 nm. Nessa microscopia tambm h filtros especiais
chamados de filtros de excitao e filtros de barragem (Taboga, 2001). Os filtros
de excitao localizam-se logo aps a sada de luz antes do condensador,
selecionando o comprimento de onda desejado. J, os filtros de barragem
localizam-se entre a objetiva e a ocular, aps o objeto, deixando passar somente
a luz fluorescente, ento o material fluoresce contra um fundo escuro (Taboga,
2001) (Figura 7).




Figure 7. Esquema da configurao
do microscpio de fluorescncia
(Davidson e Abramowitz, 2005).



Na microscopia de fluorescncia pode-se detectar compostos
naturalmente fluorescentes, como a clorofila, lignina de paredes celulares,
elastina e colgeno (Taboga, 2001).

f. Microscopia de varredura confocal
A microscopia de varredura confocal representa um dos mais importantes
avanos da microscopia de luz j desenvolvida, principalmente, porque uma
tcnica capaz de visualizar em profundidade clulas e tecidos vivos e fixados
(Fellers e Davidson, 2005). O espcime escaneado com uma srie de muitos
estreitos campos de viso, as imagens destes campos so recuperadas
individualmente, e depois de estocadas, a imagem completa construda como
um mosaico de partes combinadas (Lacey, 1991).
O microscpio de varredura confocal indicado para estudos de
materiais espessos, sem colorao prvia, vivos ou pr-fixados. Essa
microscopia permite o detalhamento de estruturas subcelulares que no
apresentam limite de resoluo compatvel ao da microscopia de luz fluorescente
convencional, como microtbulos, elementos fibrilares do citoesqueleto e
elementos finos da matrix celular (Taboga, 2001). Nesse microscpio, a imagem
pode ser obtida de planos focais especficos ou cortes pticos. Os cortes pticos
so transferidos para um computador e so reconstrudos tridimensionalmente de
forma a obter uma imagem no total. Logo, os microscpios tradicionais
trabalham com imagem analgica, e os confocal a laser trabalham com imagens
digitais (Taboga, 2001).
O microscpio de varredura confocal utiliza como fonte de luz o laser,
sendo seu funcionamento complexo. Seu sistema ptico o mesmo da de
fluorescncia tradicional, com exceo de que a iluminao se d somente em
pequenos pontos iluminados pelo laser. Acima da objetiva existe um orifcio
chamado pinhole ou ris que elimina a luz proveniente de objetos que estejam
fora do plano focal (Figura 8) (Albert et al., 1994).

Figura 8. Esquema geral de um microscpio de varredura confocal, mostrando
as principais partes constituintes (Fellers e Davidson, 2005).

Graas sensibilidade dos detectores fotoeltricos e o controle eletrnico
da intensidade dos sinais, imagens pouco evidentes na microscopia de
fluorescncia so observadas com mais nitidez na microscopia confocal
(Taboga, 2001) (Figura 9).

Figura 9. Comparao de imagens obtidas do microscpio de fluorescncia (a, b
e c) e do confocal de varredura (d, e, f) (Fellers e Davidson, 2005).

Na letra a e d, tem-se uma espessa seo de tecido de medula humana.
Nota-se um significante grau de detalhe estrutural nas imagens obtidas com a
microscopia confocal de varredura. Na letra b e c, tem-se fibras musculares de
ratos. Na imagem obtida pela microscopia confocal percebe-se uma topografia
estriada no visvel na imagem b (microscopia de fluorescncia). Nas letras c e
d, tem-se gro de plen de girassol. Existe uma dramtica diferena entre as
imagens obtidas pelas duas tcnicas, a microscopia confocal revela diferena de
cor e um envelope envoltrio (Fellers e Davidson, 2005).

g. Microscopia de polarizao
Esse microscpio apresenta dois prismas, ou filtros, chamados de
polarizador e analisador. Esses filtros se posicionam entre a fonte de luz e o
condensador (filtro polarizador) e entre a objetiva e a ocular (filtro analisador)
(Figura 10). Os filtros polarizadores promovem a seleo de apenas um plano de
direo de vibrao de ondas luminosas, conhecido por plano da luz polarizada
(PPL). Sob o efeito do PPL, os componentes macromoleculares birrefringentes
(anisotrpicos) apresentam brilho colorido ou no, promovendo um realce destes
materiais em detrimento a outros no birrefringentes (isotrpicos), que se
distinguem em fundo escuro (Taboga, 2001).



Figure 10. Esquema da configurao
do microscpio de luz polarizada
(Davidson e Abramowitz, 2005).

Os materiais biolgicos mais estudados na microscopia de polarizao
citam-se clulas musculares estriadas, espermatozides, paredes celulares,
amido, colgenos e DNA (Taboga, 2001). Em estudos com o colgeno, pode-se
aumentar sua birrefringncia utilizando-se de corantes como, Xylidine Ponceaus
ou Picrossrus. Um outro corante, que se presta a estudos anisotrpicos, o azul
de toluidina, permitindo estudos de ordem e agregao molecular da cromatina,
da matrix extracelular e outros componentes (Taboga, 2001).

Microscopia eletrnica
A construo do microscpio eletrnico foi de suma importncia para a
observao de organelas e estruturas celulares que at ento eram desconhecidas,
pois se encontravam abaixo do limite de resoluo do microscpio tico (Melo,
2002).
Como foi mencionado anteriormente, o poder de resoluo do
microscpio ptico est limitado pela abertura numrica e pelo comprimento de
onda da radiao. No sendo possvel aumentar a abertura numrica, a soluo
passou pela utilizao de radiao de menor comprimento de onda () (Reis,
2003).
Em 40 anos a microscopia eletrnica foi inventada, sendo que 2
princpios bsicos, propostos no incio do sculo XX, foram primordiais para a
construo do microscpio eletrnico (Melo, 2002). O primeiro, estabelecido,
em 1924, por Louis de Broglie, um fsico francs, demonstrou que os eltrons
tm propriedades ondulatrias, semelhana da luz visvel, ultravioleta e raios x.
O comprimento de onda de um eltron em movimento depende da sua
velocidade e esta da energia de acelerao que lhe imposta (Reis, 2003). O
segundo foi do ingls Bush, que em 1926, demonstrou que um campo
magntico, adequadamente estruturado, poderia ser usado como lentes de
aumento para um feixe de eltrons (Melo, 2002). Ento, o comprimento de onda
de um eltron dado por:


Nesta frmula representa o comprimento de onda, h a constante de Planck
(6,62559 x 10
-34
J.s
-1
), m a massa da partcula e v a velocidade da partcula.
Os eltrons podem ser acelerados por uma diferena de potencial, sendo
a velocidade diretamente proporcional a essa diferena de potencial (tabela 1).

Tabela 1. Comprimento de onda de um eltron em funo da diferena de
potencial aplicada.
Diferena de potencial (V) - Comprimento de onda (m)
150 0,1
50000 0,0053
100000 0,0038
1000000 0,00087

Para efeitos de clculo, valores aproximados para o comprimento de onda dos
eltrons podem ser obtidos pela seguinte frmula:

onde V a diferena de potencial em volts.
Os eltrons acelerados por diferena de potencial de 50 000 a 100 000
volts tm um comprimento de onda cerca de 100 000 vezes menor que o da luz
visvel. Graas ao reduzido valor de possvel aumentar o poder de resoluo.
O limite de resoluo do microscpio eletrnico de transmisso atinge 0,4 a 0,5
m (excepcionalmente 0,2 m) o que representa, relativamente ao microscpio
ptico, um poder resolvente cerca de 500 vezes maior. Em objetos biolgicos o
limite de resoluo situa-se perto de 1 m (10 ) (Reis, 2003).
O primeiro microscpio foi construdo em 1932, na Alemanha, na
Universidade Tcnica de Berlim, por Max Knoll e Ernst Ruska (Melo, 2002).
Outros nomes como Porter, Claude e Fullam introduziram, em 1945, tcnicas de
microscopia utilizando tetrxido de smio para observar clulas; Pearse e Baker,
em 1950, forma os pioneiros na observao de cortes de material biolgico com
espessura muito pequena, chamados de cortes ultrafinos, com cerca de 0,1 a 0,2
nm de espessura e Palade Porter, Sjostrand e Blum que promoveram avanos nos
processo de fixao e microtomia (Melo, 2002).
As lentes do microscpio eletrnico so de natureza eletromagntica,
sendo constitudas por uma bobina, formada por milhares de voltas de fio,
atravs da qual passa uma corrente eltrica. Enquanto que no microscpio ptico
a focagem da objetiva faz-se pelo deslocamento mecnico da lente ou do objeto,
no microscpio eletrnico a focagem feita por variao da corrente que passa
na bobina, a qual afeta a distncia focal da objetiva. A variao da ampliao
feita por variao da distncia focal das lentes intermdias (Reis, 2003).
Existem vrios tipos de microscpios eletrnicos, que variam de acordo
com suas especificidades: o de transmisso (MET), o de varredura (MEV), o de
alta voltagem e de tunelamento quntico e de fora atmica.

a. Microscopia eletrnica de transmisso

No microscpio eletrnico de transmisso, forma-se uma imagem
bidimensional do interior desta sobre uma tela, pela passagem de um o feixe de
eltrons atravs de cortes extremamente finos da amostra. A imagem formada
diretamente a partir da impresso do feixe de eltrons na tela de observao,
aps a passagem pela amostra (Melo, 2002). Os eltrons quando so emitidos
so absorvidos pelos tomos de ar, ento, um tubo inteiro, entre a fonte de
eltrons e o detector, mantido sob um grande vcuo (Lodish et al., 2003). O
pequeno comprimento de onda de eltrons significa que o limite de resoluo do
microscpio de transmisso de 0,0002 m, sendo maior do que o de varredura
(Melo, 2002).
A parte essencial do microscpio eletrnico de transmisso uma coluna
vertical a qual percorrida por um feixe de eltrons (Figura 11). Na parte
superior da coluna existe uma fonte de eltrons, o canho eletrnico. No canho
eletrnico existe um gerador de eltrons que freqentemente um filamento de
tungstnio. A voltagem aplicada entre o filamento e o nodo situa-se entre 40
000 e 100 000 V e provoca a acelerao dos eltrons (Figura 12) (Reis, 2003).

Figura 11. Aspecto exterior de um microscpio eletrnico de transmisso (JEOL
mod. JEM1230).



Figura 12. Esquema do canho eletrnico.

Para alm do canho eletrnico, a coluna constituda por uma ou mais
lentes condensadoras, uma lente objetiva, uma ou mais lentes intermedirias
(sem correspondente no microscpio ptico e que servem para variao da
ampliao), uma lente projetora, um porta-objetos em platina mvel que
controlado do exterior, um cran (por vezes dois) e uma cmara fotogrfica
(Figura 13) (Reis, 2003). As imagens ampliadas pelas lentes projetoras so
lanadas para um anteparo fluorescente, uma chapa fotogrfica ou um monitor
de TV (Taboga, 2001).


Figura 13. Aspecto da coluna do microscpio eletrnico de transmisso (TEM);
A -Seco da coluna (Philips, EM 200); B Aspecto exterior (Leo, Libra 120)
(citado por Reis, 2003).

A imagem final obtida pode ser interpretada como eletrodensa, ou escura,
quando os eltrons encontram elementos como o ferro, smio, chumbo ou ouro e
eletrolcida ou clara, quando os eltrons encontram-se com hidrognio, carbono,
nitrognio ou oxignio. Os materiais vegetais na maioria das vezes se
comportam como materiais eletrolcidos implicando na necessidade de contraste
com metais pesados para se conseguir uma boa imagem (Taboga, 2001).



b. Microscopia eletrnica de varredura
O microscpio eletrnico de varredura revela imagens topogrficas da
superfcie com grande riqueza de detalhes (Taboga, 2001). Este aparelho forma
uma imagem tridimensional da superfcie de amostras no seccionadas e a
imagem visualizada em um monitor acoplado ao microscpio, nesse caso, os
eltrons varrem apenas a superfcie externa do material biolgico (Melo, 2002)
(Figura 14 e 15). Ento, esse microscpio permite somente uma observao da
superfcie da amostra. A imagem formada a partir de eltrons secundrios que
partem da amostra quando a mesma atingida pelo feixe de eltrons. Os eltrons
secundrios so captados e, aps passagem por um amplificador, so
transformados em imagem visvel em um monitor. As fotografias so obtidas
indiretamente, a partir da imagem gerada no monitor. O limite de resoluo
nesse microscpio de 0,02 m sendo menor do que o de transmisso (Melo,
2002).




Figura 14. Aspecto tridimensional de
uma diatomcea observada com
microscpio eletrnico de varredura
(ampliao 5000x) (Reis, 2003).


Figura 15. Aspecto do microscpio
eletrnico de varredura.

A microscopia eletrnica de varredura pode fornecer imagens
tridimensionais de objetos relativamente grandes, como vermes e insetos, quanto
de clulas livres, como tecidos animais e vegetais, embries, fragmentos
geolgicos em anlises de granulometria e textura de solos (Taboga, 2001). No
entanto, o pr-tratamento das amostras essencial para se conseguir uma boa
observao da superfcie podendo causar algumas alteraes fsicas. Por
exemplo, na observao de bactrias e outros organismos vivos, o vcuo obtido
da coluna de eltrons pode provocar alteraes morfolgicas (Englert et al.,
2001).

c. Microscopia eletrnica de alta voltagem
a microscopia eletrnica que acelera seus eltrons entre 500 e 1000
KV, ento, seus microscpios so conhecidos como de alta voltagem ou de alta
acelerao. Seu funcionamento e estrutura so semelhantes ao do microscpio
eletrnico convencional, porm, so aparelhos extremamente grandes, chegando
a ocupar edifcios de 3 andares (Taboga, 2001).
A utilizao desse microscpio revolucionou a biologia estrutural
permitindo que pudesse, por exemplo, observar a organizao tridimensional dos
componentes do citoesqueleto (Taboga, 2001).

d. Microscopia eletrnica de tunelamento quntico
A microscopia eletrnica de tunelamento quntico tem a capacidade de
ampliar a potncia visual do olho humano cerca de 1 milho de vezes.
Desenvolvida nos anos 80, essa tcnica aumenta em 100 vezes a capacidade dos
microscpios eletrnicos (Taboga, 2001).
O microscpio eletrnico de tunelamento quntico resultou dos esforos
de dois cientistas suos, Benning e Rohrer, prmio Nobel de fsica, em 1986.
Seu princpio pressupe que todos os corpos apresentam caractersticas
ondulatrias emitem energia. O aparelho possui uma agulha que dista da amostra
em 1 (10
-6
mm). Pelo caminhamento da agulha na superfcie da amostra se
forma uma corrente energtica chamada de tunelamento. Os eltrons do material
so atrados para a agulha formando um tnel. Ento, quando a agulha passa
sobre um tomo, a corrente aumenta e quando ela percorre sobre os espaos
entre os tomos ela diminui. Os sinais de aumento e diminuio so transmitidos
para a tela de um computador formando imagens semelhantes a vales e
montanhas (Taboga, 2001).



e. Microscopia eletrnica de fora atmica
A inveno do microscpio de fora atmica contribuiu
significativamente para a nanotecnologia e recebeu o prmio Nobel em 1986. O
microscpio de fora atmica assemelha-se ao de tunelamento quntico, porm
apresenta um microespelho e um feixe de laser sobre a agulha (Taboga, 2001).
O princpio de funcionamento de um microscpio de fora atmica
baseado na reflexo da luz de um feixe de laser por um espelho. Aps a reflexo,
a luz do laser passa por uma lente e incide sobre um fotodetector (Figura 16).


Figura 16. Esquema do princpio de funcionamento do microscpio de forca
atmica (http://www.fis.puc-rio.br).

A incidncia do feixe de laser no fotodetector provoca o aparecimento de
uma diferena de potencial (ddp) em suas extremidades. Esta ddp depende da
rea iluminada pelo feixe de laser que por sua vez depende da altura da ponta de
prova. A posio da ponta de prova varia conforme o relevo da superfcie em
estudo e com isso a ddp gerada pelo fotodetector traduz os deslocamentos da
ponta durante a varredura. Estes deslocamentos so medidos com a amplificao
da ddp gerada no fotodetector. O fotodetector funciona como uma bateria
varivel (dependendo da incidncia de luz) e seu sinal serve de entrada para o
amplificador operacional cujo ganho, A, definido pelas resistncias R
1
e R
2
. A
sada do amplificador operacional conectada a um computador ou a um
registrador grfico (plotter) para a coleta de dados (http://www.fis.puc-rio.br).
Isto permite uma menor agressividade sobre a amostra e a deteco de
superfcies, por exemplo, de uma bactria viva, em que as informaes so
transmitidas para a tela do computador, incluindo movimentos e forma. Nesse
aparelho tambm possvel avaliar a estrutura atmica de biomolculas
(Taboga, 2001).
Nessa microscopia, as amostras podem ser observadas sem qualquer
tratamento superficial, sendo capaz de obter informaes complementares em
situaes reais sem interferncia ou artefatos (Englert et al., 2001).
As tcnicas de microscopia eletrnica de varredura e a de fora atmica,
em trabalhos conduzidos por Englert et al., (2001), foram ferramentas
complementares na observao de diferenas morfolgicas em bactrias com e
sem bio-filme.

Fotomicrografia
O uso da fotografia para capturar imagens advindas de um microscpio
data da inveno do processo de fotografia. As primeiras fotografias foram
memorveis devido qualidade que apresentavam, mas a tcnica era muito
trabalhosa e sobrecarregava com longas exposies e era considerado um
processo difcil. O primeiro meio para fotomicrografia foi o filme que at a
dcada passada era o principal, porm com os avanos da cmera eletrnica e a
tecnologia computacional a imagem digital tornou-se mais barata e mais fcil
para o uso do que a fotografia convencional (Abramowitz, 2005).
A qualidade da fotomicrografia seja digital ou gravada em filme, depende
da qualidade do microscpio. O filme um severo juiz de quo bom o
microscpio tem sido priorizado para capturar a imagem. essencial que se
tenha um microscpio bem configurado usando Khler iluminao e que o
campo e o diafragma condensador estejam ajustados corretamente e que a altura
do condensador esteja otimizada. Ento, propriamente ajustado, o microscpio
mostrar imagens do campo todo de viso com boa iluminao e fornecer o
melhor contraste e resoluo (Abramowitz, 2005) (Figura 17).



Figura 17. Exemplo de um microscpio capaz de
observar e fotografar simultaneamente as imagens
atravs do microscpio com sistema de fotomicrografia
incorporado (microscpio biolgico trinocular QUIMIS
Q-106F).
(http://www.oticacientifica.com.br/q_106f.htm)




Fotomicrografia por meio do uso de filmes
Filmes fotogrficos utilizados em fotomicrografia so revestidos com
uma emulso sensvel a luz de sais de prata e ou corantes (tintas). Quando a luz
incidida para expor a emulso, centros ativos combinam para formar uma
imagem latente que deve ser desenvolvida pelo uso de qumicos fotogrficos, em
ambiente escuro.
O filme dividido em categorias dependendo se branco e preto ou
colorido. Os filmes fotogrficos so divididos em transparncias de campo
positivo (as cores so aquelas da imagem que esta sendo observada) e cores
negativas (cores complementares da imagem que esta sendo observada).
Filmes positivos apresentam sufixo chrome e negativos color. Os filmes,
geralmente, vem acompanhados de informaes como ISO, e se o filme para
dia com luz (Daylight) ou um para interiores com menor iluminao. A
temperatura de lmpadas de tungstnio encontradas nos microscpios esto entre
2900 e 3200 K dependendo da voltagem aplicada no filamento da lmpada. Os
fabricantes de filmes oferecem filmes balanceados para esta iluminao e
usualmente indicam se o filme indicado para interiores ou uso cientfico.
Filmes balanceados para dias com luz (Daylight) o mais comum filme
disponvel e pode tambm ser usado no microscpio desde que seja adicionado
um filtro conversor de luz apropriado para a rota da luz. Filmes polaroides so
usados na fotomicrografia, e so encontrados em trs tamanhos 35 mm
Polachrome (colorido ou transparente), pacotes Polapan (preto e branco) em 3
1/4 x 4 e filmes 4 x 5 individuais.

Fotomicrografia digital
O principal mecanismo de gravar as imagens vistas atravs do
microscpio, por muito anos, foi a produo de fotomicrografia por meio do uso
de filmes, porm na ltima dcada, os cientistas tm comeado a capturar as
imagens por meio de cmeras eletrnicas (Abramowitz, 2005).
As cmeras digitais operam capturando a imagem projetada diretamente
em um chip de computador sem o uso de filmes. Nestes ltimos anos, o nmero
de pixels de informaes capazes de serem capturados e estocados pela melhor
cmera digital prximo, mas ainda pequeno, comparando com a resoluo do
filme tradicional (Davidson e Abramowitz, 2005).
A seleo da cmera digital deve ser realizada com muito cuidado,
incluindo exame de espcimes fixados ou vivos, necessidade de imagens em
escala de cinza ou cor verdadeira, sensibilidade a baixo nvel de luz como
fluorescncia, resoluo, velocidade de aquisio de imagem, uso em
investigaes qualitativas e quantitativas, taxa de alimentao de vdeo para o
computador ou VCR. Em geral, dois tipos de cmeras esto disponveis para uso
na microscopia so as cmeras tubo (famliaVidicon ) ou CCD (dispositivo
duplo de mudana) (Davidson e Abramowitz, 2005).
Um critrio para seleo de uma cmera eletrnica para microscopia
inclui sensibilidade da cmera, eficincia quntica, resposta espectral,
capacidade de alcance dinmico, velocidade de aquisio de imagem e leitura
externa, resposta, velocidade de resposta em relao a mudanas na intensidade
da luz, acercea geomtrica e adaptabilidade de leitura ao microscpio. Um
importante critrio para a mais nova cmera digital CCD a resoluo, sendo a
preferida para pesquisa (Davidson e Abramowitz, 2005).
O alcance dos chips disponveis est entre 64 x 64 pixels at 2048 x 2048
e acima quando se trata de condies bem especificas. Sua grande capacidade de
resoluo de imagem a torna a cmera digital uma poderosa rival para as
cmeras de filme (Davidson e Abramowitz, 2005).

Referncias bibliogrficas

ABRAMOWITZ, M.;, SPRING, K.R.; FLYNN, B.O.; LONG, J.C.;
TCHOURIOUKANOV, K.I; DAVIDSON M.W. Disponvel em:
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/photomicrography/index.html (Acesso em
10/04/2005).

ALBERTS, B.; BRAY, D.; LEWIS, J.; RAFF, M. ROBERTS, K.; WATSON,
J.D. Molecular biology of cell. Chap.4. p-139 a 157. 1994.

DAVIDSON, M.W.; ABRAMOWITZ, M.Optical microscopy.
http://microscopy.fsu.edu. (Acesso em 17/04/2005).

Embrapa. Disponvel em
http://www.cnpab.embrapa.br/servicos/baby/microsco.htmlOMicroscpiotico.
(Acesso em 10/04/2005).

GATO, J.V. Recursos de Fsica. Nuevo tema: ptica geomtrica. Disponvel em
http://www.edu.aytolacoruna.es/aula/fisica/fisicaInteractiva/OptGeometrica/Instr
umentos/Microscopio/Hist_microscopio.htm. (Acesso em 10/04/2005).

ENGLERT, G.E.; LEN, A. DE; TESSELE, F.; LOCATELLI, C. Atomic Force
Microscopy Scanning Electron Microscopy: comparative evaluation on solid
surfaces. Acta Microscopica, vol.12, n.1, p.107-110. December, 2003.

FELLERS, T.J.; DAVIDSON, M.W. Disponvel em:
http://www.olympusconfocal.com/theory/confocalintro.html. (Acesso em
14/04/2005).

LACEY, A.J. The principles and aims of light microscopy.In: Light microscopy
in biology a practical approach. Edited by LACEY, A.J. Chapter 8, p.1 a 24.
1991.

LODISH, H.; BERK, H.; MATSUDAIRA, P.; KAISER, C.A.; KRIEGER, M.;
SCOTT, M.P.; ZIPURSKY, S.L.; DARNELL, J. Molecular cell biology.
Chapter 1, p.147 a 196. 2003.

MELO, R.C.N. Clulas & Microscopia: princpios bsicos e prticas. Juiz de
Fora: Ed. UFJF, 144p. 2002.

Microscopia de forca atmica. Disponvel e: http://www.fis.puc-
rio.br/fis_intr/microscopia/AFM.html. (Acesso em 16/04/2005).

PARREIRA, G.G. Mtodos e tcnicas para o estudo de clulas, tecidos e
rgos. Disponvel em:
http://www.icb.ufmg.br/~biocelch/metodos_estudo/metodos.html#1.%20.
(Acesso em 10/04/2005).

REIS, C.M.G. Microscopia Disciplina de Biologia Celular.Escola Superior
Agrria, Instituto Politcnico de Castelo Branco, Laboratrio de Biologia
Vegetal. 24p. Apostila. 2003

TABOGA, S.R. Micoscopia. In: RECCO-PIMENTEL, S.M.; CARVALHO,
H.F. A clula 2001. cap. 2.. p. 06-14. 2001

WEISS, D.G.; MAILE, W.; WICK, R.A. Video microscopy. In: Light
microscopy in biology a practical approach. Edited by LACEY, A.J. Chapter
8, p.221 a 278.1991.