MANUAL DE TCNICAS DE DIAGNSTICO PARASITOLGICO

Disciplina Parasitologia clnica laboratorial

Profa. Gentilda K. F. Takeda

EXAME PARASITOLGICO DO SANGUE HEMOSCOPIA

Obteno do sangue

A- Da micro-circulao superficial.

Finalidade: Preparao de esfregaos em lminas ou outros processos que usem pequenas quantidades de sangue.

Material: Lanceta Algodo ou gaze lcool 70% iodado

Local da puno: Ponta do dedo anelar esquerdo ou lbulo da orelha. Em crianas pequenas, punciona-se a polpa do grande artelho.

Tcnica de puno: Limpar, massageando o local com lcool iodado, deixando secar espontaneamente. Puncionar firmemente com a agulha ou lanceta. Repetir a operao caso no atinja a profundidade desejada (2 a 3 mm). Desprezar a primeira gota de sangue, aproveitando as seguintes para fazer o esfregao.

B- Do sangue venoso.

Finalidade: Colhem-se, quando for necessrio usar, volumes da ordem de mililitros.

Material: Seringa descartvel com dimenso adequada quantidade de sangue a ser colhido. Agulha com calibre e comprimentos adequados. Tubo estril (com anticoagulante: citrato, heparina ou EDTA). Algodo ou gaze. lcool iodado a 70%.

Soluo de citrato de sdio

Citrato de sdio (Na3C6H5O7.2H2O) Soluo salina a 0,85%

3,8 g 100 ml

Dissolver o citrato de sdio na soluo salina fisiolgica. Autoclavar (15 a 121C). Usar 0,5 ml de citrato para 4,5 ml de sangue.

Soluo de heparina

Heparina Soluo salina a 0,85%

6,4 mg 100 ml

Usar 0,25 ml da soluo para 5 ml de sangue.

Soluo de EDTA

cido etilenodiaminotetractico (EDTA) gua destilada deionizada

5g 100 ml

Dissolver o anticoagulante em gua; distribuir em alquotas de 0,4 ml e deixar secar. Este volume de EDTA suficiente para 10 ml de sangue.

MTODOS E TCNICAS UTILIZADOS NO DIAGNSTICO DE PARASITOS DO SANGUE

Diferentes espcies de protozorios e helmintos em diferentes estgios de desenvolvimento so identificadas no sangue perifrico humano. Assim podem ser encontrados protozorios como T. cruzi, P. vivax, P. falciparum, P.

malariae, B. bigemina e espcies de filrias (helmintos) como: W. bancrofti, M. ozzardi, O. volvulus.

Parasitas como os tripanossomos e as filrias podem ser visualizados vivos devido suas motilidade, deste modo para a pesquisa destes parasitas pode-se fazer o exame a fresco que consiste na coleta de uma gota de sangue que colocada entre lmina e lamnula. A tcnica do

microhematcrito, tambm permite a observao de parasitas vivos e indicada nos casos de baixa parasitemia.

Esfregaos de sangue e colorao de parasitas do sangue .

A identificao de todos os parasitas sanguneos pode ser feita usandose dois tipos de esfregaos de sangue: esfregao em camada delgada ou a gota espessa. No esfregao de camada delgada a distoro do parasita mnima (vantagem), mas h a desvantagem de ter que examinar muitos campos para se encontrar parasitas quando estes esto em pequeno nmero. Na gota espessa, apesar da distoro das formas parasitrias a probabilidade de deteco de parasitas aumenta porque a quantidade de sangue a ser examinada cerca de trs ou quatro vezes maior do que o

esfregao e a rea examinada (1cm2) menor. Esfregaos de sangue ou gota espessa, com sangue capilar, devem ser feitos com gota de fluxo espontneo e no contaminado com lcool. Estas tcnicas so utilizadas para a pesquisa e o diagnstico dos parasitas da malria, tripanossomos, microfilrias, babsias, tripanossomas e

Leishmania chagasi.

Esfregao em camada delgada

Esta tcnica a mesma empregada na Hematologia; consiste na distenso seguida da secagem de uma gota de sangue obtido por puno da polpa digital ou do sangue venoso. Fixar com lcool metlico e corar com Giemsa ou Leishman.

Gota espessa

Esta tcnica deve ser usada quando os parasitas so pouco abundantes porque as chances de encontrar os parasitas aumentam, pois em vez de examinar uma gota de sangue, so colhidas e examinadas trs a quatro gotas que ficam estiradas em uma pequena rea. Podem-se fazer vrias gotas espessas em uma lmina de vidro que, depois de secas so mergulhadas em gua destilada ou filtrada para que as hemcias sejam lisadas, tornando a gota mais transparente. Deixa-se secar a lmina, fixa-se com lcool metlico puro e leva-se para corar com Giemsa. A gota espessa a tcnica utilizada na rotina diagnstica da Malria, muito til principalmente nos casos onde a parasitemia baixa.

Tcnica do Microhematcrito

Esta tcnica, descrita por Woo para o diagnstico das formas sangneas de

Trypanosoma

spp,

consiste

na

centrifugao

do

sangue

com

anticoagulante durante trs minutos, em tubos capilares. Os parasitas do sangue (tripanossomas e microfilrias) podem ser visualizados, quando presentes, na regio acima da camada leucocitria, em microscpio ptico. Nestes exames podem-se observar os movimentos dos flagelados ou das microfilrias. Porm, para observao da morfologia dos parasitas faz-se necessria preparao de lminas fixadas e coradas. Para isso quebra-se a parte superior do capilar e, com auxlio de uma seringa de insulina aspira-se o contedo (constitudo de plasma e parasitas) que fica logo acima do creme leucocitrio. Com o contedo aspirado faz-se esfregao em lmina de vidro que deve ser fixado e corado com Giemsa.

CORANTES
Os derivados do Romanowsky so os mais utilizados; Destes os mais comuns so o Giemsa e o Leishman.

Giemsa (soluo estoque)

Azur II eosina

0,30g

Azur II Glicerina P.A. lcool metlico P.A.

0,08g 12,50 ml 37,50 ml

Esta soluo pode ser preparada em laboratrio ou adquirida pronta. Ao us-la, esta deve ser diluda em gua da seguinte forma: trs gotas de corante-estoque para cada 2 ml gua.

Leishman

O corante de Leishman uma mistura de azul de metileno e eosina em p, que pode ser adquirido no comrcio.

Azul de metileno e eosina (p) lcool metlico P. A

0,15g 100 ml.

Para preparar o corante, o p dissolvido em lcool metlico agitando-se freqentemente, durante trs dias. Devem-se guardar ambos os corantes (Giemsa e Leishman) em vidros mbar e mant-los em ambiente escuro. Para a confeco de esfregao (em camada delgada e gota espessa) devem-se utilizar lminas de vidro limpas e desengorduradas

Esfregao em camada delgada

Uma pequena gota de sangue colocada prximo de uma extremidade da lmina; com auxlio de outra lmina (segurar por cima com a mo direita), em

ngulo de 30, colocada adiante da gota, o sangue vai se espalhar pela superfcie de contato das duas lminas. Com suavidade e rapidez deslizar esta segunda lmina para frente de modo a espalhar o sangue at o fim da lmina. Deixar secar ao ar. Fixar e corar.

Esfregao em gota espessa

Colher 2 a 3 gotas de sangue em uma lmina. Utilizando o canto de outra lmina, espalhar o sangue numa camada circular com 15 mm de dimetro. Deixar secar ao ar por uma noite. Colocar a lmina com a gota espessa num recipiente com gua para a desemoglobinizao (lise) das hemcias. Com a ruptura das hemcias a cor vermelha da hemoglobina desaparece da mancha de sangue e d lugar a uma rea esbranquiada. Retirar a lmina com cuidado e deixar secar. Fixar e corar.

Fixao do material e colorao

Existem vrios fixadores disponveis, porm o mais utilizado o lcool metlico. Para a fixao deve-se cobrir a lmina com lcool metlico (PA) e deixar fixando por um minuto. Em seguida cobrir o esfregao com corante Giemsa diludo, deixando-o agir por 30 minutos. Escorrer o corante e lavar em gua corrente; deixar secar e examinar em microscpio. Se o corante utilizado for o de Leishman proceder da seguinte maneira: cobrir o esfregao com sete ou oito gotas de corante; deixar o corante agir durante 15 segundos (no mximo), em seguida adicionar 15 gotas de gua;

com auxlio de uma pipeta homogeneizar (soprando o corante) a mistura. Deixar corar por 20 minutos, escorrer o corante, lavar em gua corrente, deixar secar e examinar em microscpio.

O esfregao corado pelo Leishman no necessita de fixao prvia pelo lcool metlico, pois este j faz parte da frmula do corante. As lminas coradas por este mtodo no so to boas e durveis quanto pelo mtodo de Giemsa, no entanto, uma tcnica muito utilizada devido rapidez e facilidade de execuo.

PESQUISA DE MICROFILRIAS.

Tcnica de Knott

Nesta tcnica os eritrcitos so lisados; as microfilrias ficam concentradas no sedimento.

1- Retirar 02 ml de sangue total por puno venosa e colocar imediatamente em um tubo contendo 10 ml de formol a 2%. O sangue total pode ser colhido com anticoagulante. 2- Fechar o tubo e misture completamente, invertendo-o e agitando-o. O formol hemolisa as hemcias; mata, fixa e distende as microfilrias. 3- Centrifugar o sangue a 1500 rpm por 5 minutos. 4- Decantar o sobrenadante.

5- Retirar o sedimento com uma pipeta Pasteur e em uma lmina de vidro fazer um esfregao do sedimento. 6- Deixar secar bem, fixar e corar com Giemsa. 7- Examinar com objetiva de imerso.

Tcnica da filtrao em membrana de policarbonato

Este um mtodo muito sensvel porque permite o exame de pequenos volumes de sangue perifrico e a total recuperao das microfilrias quando presentes em infeces leves.

1. Colher o 1 ml de sangue com EDTA, heparina ou citrato de sdio. 2. Diluir o sangue com soluo salina tamponada* na proporo 1: 10 3. Montar a membrana de policarbonato (13 ou 25 mm de dimetro e poros de 3 a 5 m) em um suporte de filtro apropriado, 4. Filtrar a suspenso com ou sem bomba a vcuo 5. Em seguida lavar o filtro com salina tamponada (10 ml) 6. Lavar novamente, agora, com gua destilada, para promover a lise das hemcias que ficaram retidas no filtro 7. Remover o material retido na membrana e coloc-lo em uma lmina de vidro fazendo um esfregao. 8. Deixar secar, fixar com lcool metlico por 2 minutos e corar com Giemsa. 9. Examinar no microscpio.

Soluo salina tamponada*

Cloreto de sdio Hidrogeniofosfato dissdico heptaidratado Diidrogeniofosfato de potssio anidro Cloreto de potssio gua destilada deionizada q.s.p.

8,0 g 2,17 g 0,20 g 0,20 g 1.000 ml

Esterilizar em autoclave e armazenar a 4 C.

EXAME PARASITOLGICO DAS FEZES

1- Receber as fezes em recipiente adequado.

2- As amostras devem ser correta e completamente identificadas com: o nome do paciente; idade, nmero de identificao do laboratrio; hora da colheita e hora da chegada da amostra ao laboratrio. As instrues, sobre a coleta de fezes devem ser claras e passadas ao paciente. importante verificar se o paciente as entendeu, pois na coleta adequada que se inicia a qualidade do exame parasitolgico.

3- Para um trabalho rotineiro em Parasitologia recomendvel que se realize trs exames parasitolgicos.

4- Todos os parasitas observados devem ser relatados pelo nome cientfico, incluindo gnero e espcie, quando possvel, e o estgio que esto. Determinados elementos celulares (GV, GB ou outras clulas), fungos ou cristais de Charcot-Leyden devem ser assinalados de modo semiquantitativo como: poucos cristais, moderados ou muitos. Tambm, devero constar os mtodos executados e a consistncia das fezes.

5- Fezes lquidas devem ser examinadas dentro de 30 minutos; semi-slidas dentro de 1 hora e formadas dentro de 24 horas. Se o exame for realizado depois de 24 horas a amostra deve ser mantida em

preservadores/conservadores tais como: formol a 10%, lcool polivinlico (APV); o MIF conservador muito difundido composto de mertiolato ou mercurocromo, iodo e formol e o SAF que um fixador usado para preservar cistos e trofozotos. Para preservar a morfologia dos protozorios e evitar o desenvolvimento de algumas larvas e de ovos de helmintos, as amostras fecais devero ser preservadas em fixadores ou mantidas temporariamente sob refrigerao (3 0C a 50C).

A proporo utilizada de trs partes de qualquer um dos fixadores para uma parte de fezes. Essa mistura deve ser bem homogeneizada.

* O formol e o MIF preservam ovos, cistos e trofozoitos para exames a fresco; Schaudinn, APV e o SAF preservam trofozoitos para colorao permanente.

6- Rejeitar fezes contendo meio de contraste para Raios X (sais de brio), somente colher as fezes 5 a 10 dias aps a ingesto de sais de brio.

7- No administrar purgativos tais como: leo mineral, leo de castor ou supositrios, porque impossvel pesquisar protozorios.

FIXADORES
1. Formol a 10%

Formol comercial Soluo salina a 0,85%

10 ml 90 ml

2. Fixador de Schaudinn

Este fixador utilizado para preservar protozorios encontrados em fezes lquidas (diarricas ou disentricas) ou amostras da superfcie da mucosa intestinal e, usado na preparao de esfregaos permanentes corados, principalmente, com a hematoxilina frrica. Como na sua frmula contm HgCl 2 (cloreto de mercrio-II, bicloreto de mercrio ou cloreto mercrico), deve-se tomar cuidado ao manusear esta soluo pois txica para o homem e o meio ambiente. Os frascos contendo este fixador devero ser etiquetados como VENENO.

Para a preparao do fixador so utilizados os seguintes reagentes: Cloreto de mercrio-II, lcool etlico a 95%, cido actico glacial e glicerina.

Preparao das solues A, B e C

A. Soluo aquosa saturada de cloreto de mercrio-II

Cloreto de mercrio-II

110g 1.000 ml

gua destilada deionizada

Preparar o bicloreto de mercrio dissolvendo em gua destilada quente. Aquea em banho Maria at dissolver o sal, aps o resfriamento filtre e estoque em recipiente de vidro com tampa esmerilhada.

B. Soluo estoque

Soluo A

600 ml 300 ml

lcool etlico a 95%

C. Soluo fixadora*

Soluo estoque(B) cido actico glacial

100 ml 5 ml

*Adicionar a soluo fixadora imediatamente antes do uso.

3. Fixador lcool Polivinlico (APV)

O PVA (EVANOL) uma resina solvel em gua que incorporada ao fixador de Schaudinn; utilizada para conservar e transportar fezes lquidas. O p APV age como um adesivo para o material fecal e um excelente preservador de trofozotos e cistos ao quais so conservados durante anos.

Preparao do fixador APV segundo Burrows (Burrows, R.B. Improved preparation of polyvinyl alcohol-HgCl 2 , fixative used for fecal smears. Stain Technol. 42: 93-95, 1967).

Fixador de Schaudinn cido actico glacial Glicerina APV p

93,5 ml 5 ml 1,5 ml 5g

Misture, em um recipiente de vidro (boca larga), o fixador, o cido actico e a glicerina adicionando lentamente sem agitao o APV p. Cubra o recipiente com papel alumnio ou com a tampa de placa de Petri. Deixe a mistura em repouso de 18 a 24 h para que o APV fique embebido pelos lquidos. Em seguida, aquea a soluo lentamente at 75C. Uma vez atingida a temperatura remova o recipiente do aquecimento e agite at obter completa homogeneizao da mistura. Em cerca de 30 segundos obtm-se uma soluo viscosa clara, levemente esbranquiada.

Estoque a soluo APV em frasco plstico com tampa de rosca ou em frasco de vidro com tampa esmerilhada. A proporo adequada usar, aproximadamemte, trs partes do fixador para uma parte de fezes.

4. MIF

O MIF uma mistura de corante e fixador que contm Mertiolato ou Mercurocromo, iodo e formaldedo. Este fixador preserva e cora quase todos os estgios dos protozorios, de ovos e larvas de helmintos. O corante-fixador MIF composto por duas solues estoques, mantidas em separadas em frascos mbar, que so misturadas imediatamente antes do uso.

Soluo I

Formol Glicerina

37% a 40%

10 ml. 2 ml 80ml. 100 ml.

Sol. mercuriocromo a 1:500/Sol. mertiolate 1:1 000 gua destilada

Soluo II (LUGOL)

Iodo, cristais Iodeto de potssio gua destilada

5g 10 g 100 ml

Dissolver o iodeto de potssio na gua destilada e adicionar lentamente os cristais de iodo agitando at a completa dissoluo dos cristais. Filtrar e manter a soluo em vidro mbar.

5. SAF

O fixador SAF um mistura de formaldedo, acetato de sdio e cido actico glacial. Esta soluo estvel e no txica e assegura uma excelente fixao dos organismos com a preservao de suas caractersticas

morfolgicas.

Acetato de sdio cido actico glacial Formol 37% a 40% gua destilada

1,5 g 2 ml 4 ml 92 ml .

Estocar a soluo em frasco plstico com tampa de rosca ou em frasco de vidro com tampa esmerilhada. Para preservar a amostra fecal misturar uma parte de fezes com trs partes de fixador.

EXAME MACROSCPICO
Procedimentos

1- Observar a consistncia da amostra. Fezes moles ou lquidas sugerem a possvel presena de trofozotos de protozorios intestinais. Cistos de protozorios so encontrados com mais freqncia em fezes formadas. Ovos e larvas de helmintos podem ser encontrados tanto em fezes lquidas quanto em fezes formadas.

2- Examinar a superfcie da amostra para observar a presena de proglotes de tnias, ancilostomdeos ou oxiros adultos, por exemplo.

3- Examinar a amostra fecal com auxlio de um palito (sorvete) para verificar a presena de outros helmintos adultos.

4- Examinar as fezes quanto presena de sangue e/ou muco. a) sangue fresco (vermelho vivo) indica hemorragia aguda no trato intestinal. b) muco sanguinolento sugere ulceraes e uma poro desse material deve, de preferncia, ser examinada, ao microscpio, para a procura de trofozoitos.

Os vermes adultos, quando encontrados, devem ser imediatamente examinados e identificados. As tnias so identificadas especificamente pelo exame das proglotes grvidas. As proglotes devem ser fixadas em formol a 10% e depois clarificadas por imerso em glicerina ou soluo de lactofenol (1:1).

EXAME MICROSCPICO
Permite a visualizao de trofozoitos, cistos e oocistos de protozorios e de ovos e larvas de helmintos. recomendvel, quando se tratar de fezes diarricas ou disentricas, o emprego dos seguintes procedimentos:

a) exame direto a fresco para observao dos movimentos dos trofozoitos, b) seguido de feitura de esfregao de fezes com colorao permanente para observao morfolgica dos trofozotos, especialmente, de amebas e girdias.

O exame de fezes pode ser quantitativo ou qualitativo. Os mtodos quantitativos so aqueles nos quais se faz contagem de ovos para avaliao da carga parasitria. O mais conhecido o de Stoll, mas, o mais empregado atualmente o de Kato-Katz. Os mtodos qualitativos so os mais utilizados para a demonstrao da presena das formas parasitrias. Freqentemente o nmero das formas parasitrias pequeno, assim necessrio recorrer a processos de enriquecimento dessas formas para concentr-las.

PESQUISA DE TROFOZOTOS NAS FEZES

Esfregaos de fezes permanentes corados.

Os esfregaos so preparados com fezes recm colhidas (diarricas ou desintricas) ou preservados pelos fixadores como o lquido de Schaudinn, fixador APV ou SAF. A colorao mais comum e a mais satisfatria a utilizada no mtodo longo da hematoxilina frrica. Para se obter um bom esfregao permanente deve-se evitar a utilizao de amostra fecal muito velha, a feitura de esfregaos muito espessos e, proceder a colorao aps os esfregaos estarem secos e fixados

adequadamente. A hematoxilina corante de ncleos de parasitas que permite evidenciar estruturas nucleares muito delicadas (cariossomo, cromatina perifrica). H dois procedimentos quando se utiliza a hematoxilina: A) Colorao progressiva: usa-se o corante bem diludo que deve ser deixado durante algum tempo em contato at que o organismo adquira colorao, neste caso no se deve usar diferenciador; B) Colorao regressiva: o corante no diludo, deixa-se corar em excesso, em seguida remove-se o corante com o diferenciador. O mtodo longo da hematoxilina frrica, segundo Heidenhain, o melhor processo de colorao onde se usam a hematoxilina como corante e o sulfato frrico amoniacal (NH4 Fe [SO4]2.12H2O) como mordente e diferenciador.

Colorao de trofozotos intestinais pela hematoxilina frrica

Reagentes

1- Lquido de Schaudinn lcool a 95%

200 ml 100 ml

No momento de uso adicionar 2,5 ml de cido actico para cada 50 ml.

2- Almen de ferro (sulfato de ferro amoniacal) a 2,5%

Triturar os cristais de almen de ferro em Graal e diluir aos poucos com gua destilada. Completar o volume. Essa soluo mordente deve ser preparada fresca imediatamente antes do uso e estocada temperatura do refrigerador.

3- Soluo de hematoxilina a 0,5%

a) Soluo estoque de Hematoxilina a 10%.

Hematoxilina (cristal) lcool a 95% (v/v)

10 g 100 ml

Diluir a hematoxilina em pequenas quantidades no lcool e acrescentar a gua destilada. Deixar a soluo maturar durante seis semanas antes de diluir para uso. Aps este tempo o corante apresenta uma colorao de

vinho do Porto ou marrom alaranjada forte. Estocar em frasco mbar com tampa esmerilhada.

b) soluo corante de hematoxilina a 0,5%

Soluo estoque de Hematoxilina amadurecida gua destilada deionizada

5 ml 95 ml

Esta soluo diluda a 0,5 % no estvel e deve ser preparada quando o seu uso for necessrio.

4- lcool-salicilato

lcool absoluto P.A. Salicilato de metila (xilol)

100 ml 100 ml

Colorao Tcnica (segundo Correia e cols, 1984).

1) Filtrar as fezes, conservadas em Schaudinn ou SAF, em gaze dobrada quatro vezes. 2) Transferir cerca de 2 ml para um tubo e centrifugar por um minuto a 1.500 rpm. 3) Desprezar o sobrenadante, acrescentar soluo salina a 0,85%, homogeneizar e centrifugar novamente. 4) Repetir a operao at obter um sobrenadante lmpido

5) Desprezar o sobrenadante e acrescentar, ao sedimento, duas gotas de soro humano inativado. 6) Misturar bem e fazer esfregaos finos sobre lamnulas. A lamnula deve ser presa a um suporte de borracha pequeno (pode ser utilizada a borracha que serve de rolha) por meio de um entalhe, para facilitar o manuseio e a identificao do material. Desta forma, possvel a colorao de vrias amostras ao mesmo tempo. Para manusear as lamnulas usam-se pinas de madeira, pois o fixador de Schaudinn ataca metais. 7) Sem deixar secar o esfregao, colocar a lamnula com o esfregao voltado para baixo, em uma placa de Petri contendo o fixador de Schaudinn com 5% de cido actico por 10 minutos. 8) Passar a lamnula com o esfregao voltado para cima para as placas de Petri subseqentes, contendo os seguintes reagentes: a) lcool 70% (para retirar o excesso de fixador) 2 minutos b) lcool 70% iodado, isto , contento algumas gotas de tintura de iodo at atingir a cor de vinho do porto (para reagir com o mercrio) 5 minutos c) lcool 70% (para precipitar o mercrio) 2 minutos

d) lavar em gua destilada (para retirar o excesso de mercrio) 1 minuto e) almen de ferro 2,5% (mordente que fixa o corante) 10 minutos

f) lavar em gua destilada (para retirar o excesso de ferro) 1 minuto g) hematoxilina 0,5% (corante) 5 minutos h) lavar em gua destilada (para retirar o excesso do corante) 5 minutos

i) almen de ferro 2,5% (diferenciador). Obs: O esfregao deve permanecer nessa soluo at atingir uma colorao lils clara azulada. j) lavar em gua destilada k) lcool 70% (desidratar) l) lcool 80% (desidratar) m) lcool 95% (desidratar) n) lcool absoluto (desidratar) 1 minuto 2 minutos 2 minutos 2 minutos 2 minutos

o) lcool-salicilato (para preparar o material para diafanizar) 2 minutos p) salicilato de metila (duas trocas) um minuto cada

9) Montar em lmina de vidro com blsamo-do-Canad ou em resina sinttica com a lamnula, contendo o esfregao, voltada para baixo. 10) Deixar secar e examinar com objetiva de imerso.

Os organismos apresentam o citoplasma de cor azulada ou acinzentada; as estruturas do ncleo na cor preta, bem como os corpos cromatides dos cistos de amebas e as incluses citoplasmticas como bactrias e hemcias.

PESQUISA DE HELMINTOS NAS FEZES

PESQUISA DE OVOS NAS FEZES

Sedimentao espontnea: mtodo de Hoffmann, Pons e Janer ou mtodo de Lutz. Este mtodo permite o encontro de ovos e larvas de helmintos, cistos e

oocistos de protozorios. usado na rotina e em inquritos epidemiolgicos por sua simplicidade e baixo custo.

Sedimentao por centrifugao: Mtodo de Blagg, conhecido por MIFC; Mtodo de Ritchie, e o Coprotest. Usados para a pesquisa de cistos de protozorios e de ovos e larvas de helmintos.

Flutuao: Mtodo de Willis. Indicado para pesquisa de ovos leves (ancilostomdeos).

Centrfugo-flutuao: Mtodo de Faust. Utilizado para pesquisa de cistos e oocistos de protozorios e de ovos leves.

Mtodo de Kato quantitativo ou de Kato-Katz: A tcnica consiste no exame de um esfregao espesso de fezes, sob uma lamnula de celofane embebido em glicerina. A glicerina promove a clarificao da matria fecal, permitindo melhor visualizao dos ovos. O mtodo torna-se quantitativo quando se examina uma quantidade de fezes conhecida (por ex. 50 mg) e se conta o nmero de ovos encontrados. O resultado dado calculando o nmero de ovos por grama de fezes; com isto pode-se calcular a quantidade de ovos que o indivduo est eliminando e indiretamente a sua carga parasitria.

PESQUISA DE LARVAS NAS FEZES

Concentrao de larvas de helmintos : Mtodo de Baermann-Moraes e o mtodo de Rugai usados para pesquisa de larvas de Strongyloides stercoralis.

Observao: As fezes enviadas ao laboratrio clnico devem ser submetidas a um desses mtodos citados porque no existe um mtodo muito sensvel capaz de diagnosticar, ao mesmo tempo, todas as formas parasitrias. O que se faz na rotina o emprego de um mtodo geral como o de Lutz ou de Hoffmann, Pons e Janer que de fcil execuo e pouco dispendioso. Para melhorar a sensibilidade deve-se usar um mtodo geral, um especfico para cistos de protozorios e um para a pesquisa de larvas de helmintos.

Tamizao

Consiste em colocar a amostra fecal em uma peneira metlica e lev-la em uma pia utilizando um jato de gua corrente. Este processo utilizado para encontrar proglotes de T. solium e T. saginata . Ocasionalmente podem ser encontrados vermes adultos de A. lumbricoides, E. vermicularis ancilostomdeos. e de

Identificao de proglotes de Taenia sp.

So utilizados dois mtodos; O do cido actico glacial e o da tinta da China.

Em uma placa de Petri contendo cido actico glacial, colocar as proglotes a serem identificadas deixando-as por 15 a 20 minutos. Aps este tempo comprimi-las entre duas lminas. Examinar em microscpio de luz. O cido actico clarifica as proglotes permitindo a visualizao das ramificaes uterinas. A injeo da tinta da China (tinta nanquim) nas proglotes grvidas cora as ramificaes uterinas das tnias. A T. solium possui poucas ramificaes (7 a 12) dendrticas, enquanto que T. saginata possui em mdia 18 (15 a 20) ramificaes do tipo dicotmico

Colorao com tinta da China

Procedimento

1. Colocar a proglote de tnia em gua gelada, durante vrias horas para que haja afrouxamento da proglote. 2. Secar a proglote com pano seco e coloc-la em uma lmina de vidro. Com auxlio de uma pina injetar com a seringa (agulha hipodrmica) a tinta nanquim, no poro genital. 3. Lavar, rapidamente, em gua corrente e secar bem a proglote (molhada escorregadia). Colocar a proglote entre duas lminas de vidro, comprimindo e amarrando as extremidades das lminas com linha. 4. Desidratar a proglote mergulhando as lminas em lcool (50%, 70%, 90% e lcool absoluto). Quando necessrio deixar o segmento

aproximadamente 24 h no lcool a 70%. 5. Clarificar a proglote atrav de passagens em xilol ou toluol.

6. Montar com resina sinttica.

Exame direto a fresco

1- Colocar duas a trs gotas de salina a 0,85% em uma lmina de vidro. 2- Tocar com a ponta de um palito em vrios pontos das fezes, transferindo uma pequena poro para a lmina de microscopia. 3- Espalhar as fezes, fazendo um esfregao e examinar ao microscpio. A espessura do esfregao no deve impedir a passagem de luz. 4- Este mtodo indicado principalmente para a pesquisa de trofozoitos de protozorios em fezes diarricas recm emitidas; para a identificao de cistos de protozorios e larvas de helmintos cora-se a preparao com Lugol. O uso de lamnula facultativo.

Mtodo

de

Lutz

ou

de

Hoffmann,

Pons

Janer

(Sedimentao

espontnea).

1- Colocar aproximadamente 2g de fezes em um frasco de Borrel ou em um copo plstico descartvel, com cerca de 5 ml de gua e dissolver bem com auxlio de um palito de sorvete descartvel. 2- Acrescentar mais 20 ml de gua 3- Coar a suspenso (para isto, usa-se gaze cirrgica umedecida, dobrada em quatro, e colocada em um coador de plstico pequeno) num clice cnico de 200 ml de capacidade. Os detritos retidos na gaze so lavados co mais 20 ml de gua.

4- Completar o volume do clice com gua. 5- Deixar essa suspenso em repouso durante duas a 24 horas. 6- Desprezar o lquido sobrenadante cuidadosamente, homogeneizar o sedimento e coletar uma poro do mesmo. 7- Colocar parte do sedimento numa lmina, corar com Lugol e cobrir com lamnula (facultativo). Examinar no mnimo duas lminas de cada amostra.

Mtodo de MIFC ou de Blagg (sedimentao por centrifugao).

1- Coletar as fezes recm emitidas em lquido conservador de MIF. 2- Homogeneizar bem. 3- Coar a suspenso em gaze cirrgica dobrada em quatro num copo descartvel. 4- Transferir 1 a 2 ml do filtrado para um tubo cnico com capacidade para 15ml. 5- Acrescentar 4 a 5 ml de ter sulfrico e agitar vigorosamente (desengordura a amostra fecal). 6- Centrifugar por um minuto a 1.500 rpm. 7- Com auxlio de um basto, descolar a camada de detritos gordurosos da parede do tubo. 8- Inverter o tubo para desprezar o lquido e limpar as paredes com um basto contendo algodo na extremidade. 9- Acrescentar ao sedimento gotas de Lugol. 10- Coletar 2 a 3 gotas do sedimento, cobrir com lamnula e examinar com as objetivas 10x e/ou 40x.

Mtodo de Ritchie modificado ou formol-acetato de etila.

1- 5 a 15g de fezes (uma colher de ch) de fezes recentes so homogeneizados em 10 a 15 ml de formol a 10%, em um frasco Borrel, com auxlio de um basto ou palito. 2- Coe a mistura com gaze umedecida e dobrada em quatro e a transfira para um tubo cnico de centrfuga. (No coar amostra que contenha grande quantidade de muco. Neste caso, centrifugar a mistura a 1500 rpm por 10 minutos, desprezar o sobrenadante e examinar o sedimento). 3- A suspenso centrifugada, vrias vezes, a 500g (1500 rpm.) 1 minuto, at se obter um sobrenadante claro. 4- O sobrenadante desprezado e o sedimento ressuspenso em 4 ml de acetato de etila. Arrolhe o tubo e agite o tubo vigorosamente por 30 segundos. Retire cuidadosamente a rolha do tubo, pois o vapor formado pode provocar um jato de detritos fecais. Esta etapa remove as gorduras das fezes. 5-Centrifugar o tubo novamente. H formao de 4 camadas: a de acetato de etila (a mais superficial); detritos fecais; formol e o sedimento contendo os parasitas (no fundo do tubo). 6- Depois que a camada de detritos for retirada com um basto, todo sobrenadante descartado, virando o tubo de centrfuga com movimento suave, mas de uma s vez. 7- O sedimento homogeneizado, agitando o tubo entre os dedos. Uma gota de sedimento fecal misturada com uma gota de Lugol e levada para exame ao microscpio.

 importante ressaltar que o acetato substitui o ter. mais seguro por no ser inflamvel, porm, ele pode dissolver tubos de plstico. O acetato em excesso aparece como bolhas quando se faz a lmina.

Coprotest

um processo simplificado e seguro de sedimentao por centrifugao. O paciente adquire na farmcia o Coprotest que j vem com o conservador (formol a 10%), coloca as fezes no coletor, fecha o frasco e agita por 2 minutos para homogeneizar e as envia para o laboratrio. A amostra de fezes homogeneizada recolhida em um tubo de centrfuga, acrescenta-se 3 ml de acetato de etila ou ter, agita-se e a mistura centrifugada por 3 minutos. Desprezando-se os detritos e o lquido sobrenadante e acrescenta-se uma gota de Lugol ao sedimento. Duas ou trs gotas do sedimento so recolhidas numa lmina, cobertas com lamnula e examinadas ao microscpio.

Mtodo de Faust (centrfugo-flutuao em sulfato de zinco)

1- Diluir 10g de fezes em 20 ml de gua 2- Homogeneizar bem. 3- Filtrar em gaze dobrada em quatro, num copo plstico, e transferir para um tubo de Wasserman. 4- Centrifugar por um minuto a 2.500 rpm. 5- Desprezar o lquido sobrenadante e ressuspender o sedimento em gua 6- Repetir as operaes 4 e 5 at que o sobrenadante fique claro.

7- Desprezar o sobrenadante claro e ressuspender o sedimento com uma soluo de sulfato de zinco a 33%, densidade de 1,18 g/ml. 8- Centrifugar novamente por um minuto a 2.500 rpm. 9- Os cistos e os ovos leves presentes estaro na pelcula superficial; a mesma recolhida com ala de platina, colocada numa lmina junto com uma gota de Lugol e coberta com lamnula. O material deve ser examinado imediatamente. O sulfato de zinco pode deformar os cistos.

Mtodo de Willis

1- Colocar 10g de fezes num frasco de Borrel ou no prprio recipiente onde esto as fezes 2- Homogeneza-las com um pouco de soluo saturada de sal (NaCl) ou de acar 3- Completar o volume at a borda do frasco. 4- Colocar na boca do frasco uma lmina, que dever estar em contato com o lquido. 5- Deixar em repouso por 5 minutos. 6- Findo esse tempo, retirar rapidamente a lmina, deixando a parte molhada voltada para cima. 7- Cobrir com lamnula, corar com Lugol e examinar com objetiva 10x.

Mtodo de Baermann-Moraes

1- Colocar 8 a 10g de fezes numa gaze dobrada em quatro sobre um funil de vidro, contendo um tubo de borracha conectado extremidade inferior de sua haste. 2- Obliterar o tubo de borracha com um pina de Hoffman e adicionar, ao funil, gua aquecida (45C) em quantidade suficiente para entrar em contacto com as fezes. 3- Deixar uma hora em repouso. 4-Colher 5 a 7 ml da gua em um tubo de centrfuga, abrindo-se a pina. 5- Centrifugar um minuto a 1.000 rpm. 6- Coletar o sedimento, corar com Lugol e examinar ao microscpio com objetiva 40x.

Mtodo de Rugai

1- Retirar a tampa do recipiente que acondiciona as fezes e envolv-lo em gaze, fazendo uma pequena trouxa. 2- Colocar o material assim preparado, com a abertura voltada para baixo, num clice de sedimentao, contendo gua aquecida (45C), em quantidade suficiente para entrar em contato com as fezes. 3- Deixar em repouso por uma hora 4- Coletar o sedimento no fundo do clice, com ajuda de uma pipeta. 5-Corar as larvas com Lugol e observ-las com o maior aumento para identificlas.

Fezes diarricas (as larvas morrem muito rapidamente) ou coletadas em conservador no se prestam para esses mtodos.

Mtodo de Kato-Katz (Mtodo de Kato modificado por Katz e cols.).

1- Preparar uma soluo de verde de malaquita de acordo com a seguinte frmula:

Glicerina gua destilada Verde malaquita a 3%

100 ml 100 ml 1 ml

Essa soluo conserva as fezes e clarifica as formas parasitrias.

2- Cortar papel celofane semipermevel em pedaos de 24 mm por 30 mm e deix-los mergulhados na soluo de verde-malaquita por pelo menos 24 horas. 3- Colocar, sobre um papel, uma pequena quantidade da amostra fecal. 4- Comprimir as fezes com um pedao de tela metlica (marca Ibras, n 120, fios e trama: 0,09mm) ou similar de nilon. 5- Retirar as fezes que passaram para a parte superior da tela e transferi-la, com o auxlio de um palito, para o orifcio (6 mm de dimetro) de um carto retangular de plstico, colocado sobre uma lmina de vidro. 6-Aps encher completamente o orifcio, retirar o carto cuidadosamente, deixando as fezes (42 mg) sobre a lmina. 7- Cobrir as fezes com o papel celofane. Inverter a lmina sobre uma folha de papel e comprimi-la.

8- Aps uma hora, examinar ao microscpio contando os ovos presentes na preparao. 9- O nmero de ovos encontrados, na preparao fecal, multiplicado por 23, corresponder ao n de ovos por grama de fezes. Na rotina laboratorial usa-se, com maior freqncia, o mtodo qualitativo. Assim, no h necessidade de se utilizar o carto retangular. Este mtodo indicado para pesquisa de ovos de S. mansoni, A.

lumbricoides, T. trichiura e Ancilostomideos. Cistos de protozorios no so

visualizados nessa preparao. No possvel a execuo deste mtodo em fezes diarricas.

OUTROS PROCEDIMENTOS DE DIAGNSTICO

Mtodo de Henriksen e Pohlenz (pesquisa de oocistos)

Nos ltimos anos, parasitas intestinais como: Cryptosporidium parvum,

Isospora belli, Cyclospora cayetanensis e os microspordeos vm causando

doenas diarricas graves em pacientes imunodeprimidos. Como esses parasitas podem ser de difcil identificao pelos mtodos usuais de rotina, impe-se utilizao do mtodo de colorao cido-resistente para a sua pesquisa. Para execuo desse mtodo, as fezes (frescas, preservadas em formol a 10% ou em SAF) devero ser previamente concentradas pelo mtodo de MIFC ou de acetato de etila, aumentando-se o tempo de centrifugao para 10 minutos. Fezes preservadas em PVA no apresentam bons resultados. Mtodos de sedimentao pelo formol-ter ou centrfugo-flutuao com soluo

saturada de sacarose ou soluo de Sheather tambm so utilizados para concentrar os oocistos.

1- Preparar um esfregao delgado com parte do sedimento obtido aps centrifugao. 2- Deixar secar a temperatura ambiente. 3- Fixar com lcool metlico por 5 minutos. 4- Deixar secar a temperatura ambiente. 5- Corar com o corante de Kinyoun (a frio), durante uma hora. 6- Lavar em gua corrente. 7- Diferenciar com soluo aquosa de cido sulfrico a 2% (30 segundos a um minuto) at que no saia mais corante da lmina. 8- Lavar em gua corrente. 9- Corar o fundo com soluo de verde malaquita a 5%, por 8 minutos. 10- Lavar em gua corrente e secar. 11- Examinar com objetiva de imerso.

Corante de Kinyon (soluo salina de fucsina fenicada)

Soluo A Fucsina bsica lcool etlico a 95% (v/v) 1,5 g 100 ml

Soluo B Fenol (fundido a 44C) gua destilada deionizada q.s.p. 5g 100 ml

Soluo corante Soluo A Soluo B 10 ml 90 ml

Filtrar a soluo e armazenar a temperatura ambiente. Estvel por um ano.

PESQUISA DE TROFOZOTOS DE T. VAGINALIS

Trichomonas vaginalis encontra-se entre os mais prevalentes dos

protozorios, propagando-se pelo contato sexual. Geralmente, o diagnstico da vaginite por T. vaginalis feito identificando o parasito na secreo vaginal. Os trofozotos apresentam-se com movimentos de contoro com auxlio dos flagelos muito ativos. So vistos em preparaes, fresco, de secrees vaginais em cerca de 60% das mulheres infectadas. A tcnica empregada consiste na coleta de um pouco de secreo vaginal, recolhida preferivelmente com pipeta grossa e aps colocao do especulo. A secreo misturada com soro fisiolgico em uma lmina, cobrir com lamnula e examinar ao microscpio. Nos homens, uma preparao a fresco do material obtido por raspado com uma ala de platina da uretra anterior revela o microorganismo em cerca de 60% dos casos. A pesquisa tambm feita no sedimento urinrio. A massagem prosttica antes da coleta da urina para a cultura da Trichomonas a abordagem diagnstica mais sensvel.

Se os parasitos forem pouco abundantes e o exame a fresco negativo, deve-se semear o material no meio de cultura. Como os flagelados sobrevivem pelo menos 24 h na secreo vaginal diluda com soluo de Ringer, no necessrio fazer a semeadura imediatamente. Inocular no tubo de cultura o sedimento obtido por centrifugao. Aconselha-se suspender a aplicao local de quaisquer desinfetantes ou de anticoncepcionais de natureza qumica alguns dias antes da coleta. A cultura o mtodo mais sensvel de diagnstico e existem, atualmente, kits comerciais.

Meio de Kupferberg

Empregado na cultura e isolamento de Trichomonas vaginalis. Tripticase (BBL) Cistena (cloridrato) Maltose gar gua destilada 20,0 g 1,5 g 1,0 g 1,0 g q.s.p. 950 ml

1- Aquecer a mistura em banho-maria, at a dissoluo do gar, acertar o pH a 6. 2- Filtrar ( quente) em papel de filtro de porosidade adequada (Reeve-Angel n 845, p. ex.) e juntar 0,6 ml de uma soluo de azul de metileno a 0,5% para servir de indicador. 3- Depois de resfriar ligeiramente (em torno de 45 C), reajustar o volume para 50 ml, com gua destilada, em pH 6.

4- Distribuir o meio em tubos de ensaio (colocando 9,5 ml em cada um) e esteriliz-los em autoclave. 5- Depois de resfriarem naturalmente, adicionar a cada tubo 0,5 de soro humano estril.

PESQUISA DE LEISHMANIA SPP.

Nas Leishmanioses Tegumentares devem ser pesquisados os parasitos mediante bipsia ou raspagem das leses cutneas ulceradas, especialmente na borda da lcera, junto base, aps a completa limpeza da leso. Melhor ainda e mais cmoda a puno da borda inflamada, bem como das leses no ulceradas, mediante aspirao com agulha fina. Tambm se pode injetar um pouco de soro fisiolgico no tecido lesado e aspir-lo, em seguida, para preparar uma lmina fixada e corada. As lceras novas so ricas de parasitos que, depois, vo se tornando raros. Os amastigotas sero vistos no interior dos macrfagos ou espalhados na lmina, quando estes se rompem. Com o material de bipsia faz-se impresso ou imprint (por aposio) sobre lminas de microscopia e cor-la com Giemsa, para exame ao microscpio ou se utiliza para a preparao de cortes histolgicos. Na Leishmaniose visceral o encontro do parasito constitui requisito bsico para o diagnstico. A sorologia til para uma triagem de casos, quando for difcil demonstrar a presena de leishmnias, geralmente, no incio da infeco ou em formas benignas e autolimitantes. O material para exame pode ser coletado de vrios rgos como:

1- Puno das vsceras. Os parasitos podem ser encontrados no material aspirado do bao (98% dos casos do resultados positivos), da medula ssea (54 a 86% de positivos) ou de linfonodos aumentados de volume (64% dos casos). Alguns autores recomendam a puno do bao como mtodo de escolha, porm a maioria prefere a puno do esterno (em adultos) ou da crista ilaca (em crianas), para evitar os riscos de ruptura do bao e hemorragia interna. Com o material aspirado, preparar esfregao em camada delgada na lmina de vidro, fixar e corar com Giemsa ou por mtodo equivalente. 2- Sangue. Elas podem ser encontradas, eventualmente, no interior de moncitos, devendo a pesquisa ser feita no creme leucocitrio, obtido por centrifugao de amostras de sangue em tubo capilar. Fixar e corar com Giemsa. 3- Pele. Esta pesquisa no faz parte da rotina diagnstica, devido escassez de parasitos na pele, exceto nos casos de leishmaniose drmica ps calazar (difusa). Com o material obtido faz-se um esfregao ou, no caso de bipsia, uma impresso sobre lmina de microscopia. O material fixado com lcool metlico e corado com Giemsa.

Cultura em meio NNN.

A escassez de parasitos sempre dificulta a sua busca ao microscpio assim, o material suspeito como raspado de leso, sangue ou aspirado de puno (nos casos de Leishmaniose Tegumentar e Visceral) deve ser semeado no meio NNN. Os meios de cultura (incubados a 24 - 26C) devero ser examinados 5, 7, ou 10 dias depois; mas, caso sigam negativos, repicar para novo meio aps 15

dias. A inoculao em animal de laboratrio (hamster) bastante sensvel, porm no prtica porque requer meses para positivar. Meio de NNN (Novy, McNeal e Nicolle) para leishmnias.

um meio difsico, compreendendo uma base nutritiva slida e inclinada de gar-sangue de coelho e uma poro lquida, resultante da gua de condensao que se acumula durante o resfriamento do meio, onde crescem os flagelados. Em um balo de vidro, misturar: Cloreto de sdio Agar gua destilada 6g 14 g 900 ml.

Aquecer at dissolver o gar. Distribuir a mistura em frascos de cultura e esteriliz-los. Assim podem ser mantidos temperatura ambiente at a ocasio de usar, quando cada recipiente ser colocado em banho-maria para que a gelose se funda. Deixar que a temperatura do meio de cultura atinja cerca de 50C e adicionar sangue de coelho desfibrinado na proporo de 15%, agitando suavemente para assegurar mistura completa. Deixar solidificar, mantendo os tubos inclinados. Ao lquido de condensao deve-se adicionar antibitico (gentamicina p.ex.) para prevenir contaminao bacteriana.

Meio LIT

Este meio, que serve para tripanossomos e leishmnias, designado pelas iniciais de Liver Infusion Tryptose. Quando usado para cultura de leishmnias, ele deve constituir a fase lquida do meio, sobre uma base slida do meio NNN.

Em um balo de vidro de 1.000 ml, colocar:

NaCl KCl Na2 PO4 Glicose Triptose Infuso de fgado gua destilada

4,0 g 0,4 g 8,0 g 2,0 g 5,0 g 5,0 g 800 ml

A infuso de fgado (Liver infusion da Difco ou Oxford) dissolvida em banho-maria, durante 10 minutos em ebulio. Filtrar em papel de filtro. Acertar o pH para 7,2 com soluo de HCl 2N. Ao filtrado, juntar 100 ml de soro bovino e colocar em banho-maria a 68C durante uma hora. Deixar esfriar e adicionar 20 ml de hemoglobina de boi. Para conserv-lo, conveniente distribuir o meio em frascos de Erlenmeyer de 125 ml (30 ml por frasco) e guard-lo em freezer. Antes de us-lo, descongelar temperatura ambiente e fazer o teste de esterilidade em estufa a 28C.

Mtodo de Graham ou da fita gomada (swab anal)

Este mtodo utilizado para pesquisa de ovos de Taenia solium, T.

saginata e de Enterobius vermicularis. Esta tcnica deve ser feita pela manh,
antes que o paciente defeque ou tome banho, e repetida, em dias sucessivos, caso d negativo.

1- Fixar, em uma lmina, uma tira de 5 a 6 cm de fita durex transparente, colocando, nas duas extremidades, tiras de papel de aproximadamente 4cm. (as quais serviro de suporte para segurar e para identificao do material). 2- Destacar a fita da lmina e colocar sobre o fundo de um tubo de ensaio ou ao redor de um abaixador de lngua com o lado aderente voltado para fora. 3- Afastar as ndegas e aplicar a superfcie aderente da fita na regio perianal, fazendo movimento de vaivm para tocar o mximo possvel na mucosa perianal. 4- Remover a fita e distend-la sobre uma lmina de microscopia, com o lado aderente voltado para baixo. Pressionar firmemente para evitar que fiquem bolhas de ar. 4- Examinar ao microscpio com objetivas 10x e 40x.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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