TOXINAS DE BACILLUS
Pesquisa THURINGIENSIS
Pesquisa
Laura Massochin Nunes Pinto
Biloga (PUCRS) e Mestre e Doutoranda
em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida
Silvestre (UNISINOS).
Diouneia Lisiane Berlitz
Biloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia:
Diversidade e Manejo de Vida Silvestre
(UNISINOS).
Raquel Castilhos-Fortes
Biloga (UNISINOS) e Mestre em
Microbiologia Agrcola e do Ambiente
(UFRGS)
Lidia Mariana Fiuza
Engenheira Agrnoma (UPF), Mestre em
Fitotecnia Fitossanidade (UFRGS),
Doutora em Cincias Agronmicas
(ENSAM-Montpellier) e Ps-Doutora em
biotecnologia Vegetal (CIRAD-Montpellier).
24 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 38
toxicidade de B. thuringi-
ensis est relacionada sn-
tese das protenas Cry que
atuam especificamente no
intestino mdio dos insetos,
as quais so codificadas por
genes cry. Essas protenas tm atividade
inseticida a diferentes ordens de insetos-
praga, de acordo com a presena dos ge-
nes cry, nas cepas bacterianas. Alm des-
sas protenas, o entomopatgeno produz
outros tipos de toxinas, como exotoxinas,
protenas Vip, endotoxinas, entre outras.
Sendo assim, esse artigo apresenta a atual
classificao dos genes cry, as ordens de
insetos-alvo das protenas Cry e outros fa-
tores de toxicidade da bactria.
1.1 Protenas Cry
Juntamente com a esporulao, B. thu-
ringiensis libera incluses cristalinas para-
esporais que podem conter uma ou mais
protenas inseticidas, denominadas Cry, as
quais so codificadas por genes tambm
denominados cry. Estas protenas apresen-
tam peso molecular entre 40 e 140kDa e
tornam-se txicas a insetos, aps sua in-
gesto e solubilizao, no intestino mdio
das larvas (Bravo, 1997).
Estudos sobre a seleo de B. thurin-
giensis tm identificado diferentes cepas
desta bactria, as quais mostram ao so-
bre diversas ordens de insetos, como Lepi-
doptera, Coleoptera, Diptera, Hymenopte-
ra, Homoptera, Hemiptera, Isoptera, Or-
thoptera, Siphonaptera, Thisanoptera e
Mallophaga (Feitelson et al., 1992; Maagd
et al., 2001; Cavados et al., 2001; Castilhos-
Fortes et al., 2002; Pinto et al., 2003; Ma-
agd et al., 2003), alm de nematides (Mar-
roquim et al., 2000).
Assim, sabe-se que diversos grupos de
insetos so suscetveis aos cristais txicos
de B. thuringiensis e que uma espcie de
inseto pode ser afetada por mais de uma
cepa da bactria, pois estas freqentemen-
te produzem diferentes protenas insetici-
das. Isso significa que um cristal protico
pode ser txico a uma grande variedade
de insetos, principalmente lepidpteros.
Alm disso, as protenas Cry de B. thurin-
giensis podem ter seu efeito alterado de
acordo com a radiao solar, temperatura
e pH (Nishiitsutsuji-Uwo et al., 1977; Ro-
sas-Garca et al., 2008).
A busca por novos genes cry, que sin-
tetizem novas protenas Cry, com diferen-
tes efeitos inseticidas tem sido uma das
grandes metas na pesquisa com B. thurin-
giensis, desde os primeiros trabalhos pu-
blicados sobre a manipulao gentica de
B. thuringiensis (Schnepf & Whiteley, 1981).
As toxinas Cry tm sido classificadas de
acordo com sua homologia na seqncia
de aminocidos (Figura 1), na qual a de-
nominao Cry apresenta quatro ranques
hierrquicos de nmeros e letras (mais-
culas e minsculas), como por exemplo,
Cry3Aa2. As protenas Cry (Tabela 1) com
cerca de 45% de homologia em sua seqn-
cia so colocadas no primeiro ranque e
quando apresentam 78 e 95% de identida-
de, constituem o segundo e terceiro ran-
que, respectivamente.
Cinco blocos de seqncias so comuns
a maioria das protenas Cry. Quando se
analisa o tamanho destas protenas tambm
fica evidente sua diversidade entre as dife-
rentes protoxinas. A extenso C-terminal,
encontrada nas protenas mais longas, no
faz parte da toxina ativa, pois digerida
pelas proteases no intestino dos insetos,
mas pode ter ao na formao do cristal
(Schnepf et al., 1998).
A estrutura tridimensional das formas
ativas das toxinas Cry1 (Grochulski et al.,
1995), Cry2 e Cry3 (Li et al.,1991), quando
analisadas em cristalografia de raio X, mos-
traram-se muito similares, cada uma apre-
sentando trs domnios. As incluses cris-
talferas ingeridas por larvas susceptveis
dissolvem-se no intestino dos insetos e as
protoxinas inativas so solubilizadas e cli-
vadas na longa regio C-terminal, por pro-
teases intestinais, originando fragmentos re-
sistentes a proteases com cerca de 60 kDa
(Maagd et al., 2003).
O domnio I, N-terminal, consiste em sete
alfa-hlices e participa na insero da mem-
brana intestinal e formao do poro. O do-
mnio II, ou beta-prisma, apresenta trs
folhas dobradas simtricas, formando as
beta-folha. O domnio III C-terminal con-
siste em duas beta-folha antiparalelas. Es-
tes dois domnios esto envolvidos no re-
conhecimento dos receptores e ligao,
alm do domnio III tambm ter sido asso-
ciado formao de poros (Maagd et al.,
2001).
Figura 1. Dendograma de protenas Cry
de Bacillus thuringiensis (Fonte http://
www.lifesci.susx.ac.uk/home/
Neil_Crickmore/Bt. Acesso em 19/11/
2008).

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 38 25

 Tabela 1. Classificao e caracterizao das protenas Cry de Bacillus thuringiensis.

26 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 38

L- Lepidoptera; C- Coleoptera; D- Diptera; H- Hymenoptera; N- Nematoda; Le- leuccitos cancerosos humanos.
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 38 27

Figura 2. Dendograma das protenas Vip sintetizadas por Bacillus thuringiensis
(Fonte: http://www.lifesci.susx.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt)
Atualmente, existem 428 protenas Cry
descritas, que esto classificadas em 55 clas-
ses Cry (Tabela 1). O autor Crickmore man-
tm um site na internet, o qual rene as
informaes sobre todas as toxinas Cry j
publicadas, alm de permitir o acesso s
caractersticas moleculares de cada uma.
Estes dados so atualizados periodicamen-
te e podem ser acessados no endereo:
http://www.lifesci.susx.ac.uk/home/
Neil_Crickmore/Bt.
Este nmero tem crescido regularmen-
te, pois a descoberta de novos genes im-
plica na obteno de novas toxinas que
possam ter maior especificidade ou toxici-
dade. Dentre os grupos de genes cry mais
estudados, destacam-se cry1, cry2, e cry9,
os quais j foram descritos com amplo es-
28 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 38
pectro inseticida aos lepidpteros.
Dentre estes grupos, os genes cry1 so
os mais freqentes na natureza, represen-
tando mais de 43% dos genes cry caracteri-
zados e freqentemente as bactrias que quecimento dos insetos. Esses dados sugerem
possuem genes deste grupo codificam pro-
toxinas entre 130 e 140kDa, que so arma-
zenados em cristais bipiramidais (Hofte &
Whiteley, 1989; Rosas-Garca et al., 2008;
Thammasittirong & Tipvadee, 2008).
O dendograma da Figura 1 mostra os
grupos de protenas Cry, que so classifi-
cados de acordo com a similaridade entre
a seqncia de genes que codificam as re-
feridas toxinas bacterianas.
De acordo com Crickmore et al. (1998),
o primeiro domnio apresenta em torno de
45% de similaridade entre si, ao passo que
o segundo domnio mostra-se entre 45 e 75%
similares e o terceiro domnio a partir de 75%
de similaridade, quando se trata da seqncia
de aminocidos.
Carlson et al. (1994) relatam que B. thu-
ringiensis apresenta em seu genoma de 2,4 a
5,7 milhes de pares de bases, e a maioria dos
isolados apresentam elementos extra cromos-
smicos lineares ou circulares. Os genes cry
esto localizados em plasmdios e muitos iso-
lados de B. thuringiensis possuem diversos ge-
nes cry responsveis pela sntese de diferen-
tes protenas inseticidas (Lereclus et al., 1993).
Durante seu desenvolvimento, B. thuringien-
sis passa por duas fases, a fase vegetativa e a
estacionria, semelhantes ao desenvolvimento
de Bacillus subtilis.
A primeira fase caracteriza-se pelo cresci-
mento exponencial das clulas de B. thuringi-
ensis, momento em que h grande disponibili-
dade de nutrientes no meio. A fase estacion-
ria ocorre quando o meio se torna hostil e a
bactria adapta-se diminuio de nutrientes
atravs de mecanismos genticos. A expres-
so dos genes cry de B. thuringiensis geral-
mente ocorre na fase estacionria da clula,
acumulando seu produto na clula me, na
forma de uma incluso cristalfera, a qual
liberada no meio ao final da esporulao (Le-
reclus et al., 2000). Esta incluso pode repre-
sentar cerca de 25% do peso seco de clulas j
esporuladas (Agaisse & Lereclus, 1995). Esses
autores relatam que apesar da expresso dos
genes cry estarem estreitamente relacionada
ao evento da esporulao, existem genes cry
que so expressos independentemente da es-
porulao.
A quantidade de protena produzida por
uma clula de B. thuringiensis no est direta-
mente relacionada com o nmero de cpias
de genes cry, pois a capacidade de produo
de protena pela clula, mesmo com apenas
uma cpia de um determinado gene cry, pode
ser elevada. Por exemplo, a cepa B. thuringi-
ensis kurstaki HD73, possui apenas uma cpia
de gene cry1, mas sintetiza cristais bipirami-
dais em quantidades semelhantes quelas pro-
duzidas por cepas que apresentam trs ou qua-
tro diferentes genes cry1. Desta forma, a snte-
se protica atinge um limite mximo, com cer-
to nmero de cpias de genes cry na clula e
acima deste no h acrscimo na produo de
toxinas (Agaisse & Lereclus, 1995).
As toxinas Cry so as mais proeminentes
de uma srie de fatores que permitem o desen-
volvimento de sua virulncia morte ou enfra-
que muitas estirpes de B. thuringiensis podem
ser consideradas como patgenos oportunistas
de insetos. Seria de grande importncia uma
compreenso mais profunda das verdadeiras
funes ecolgicas de B. thuringiensis, tanto
para melhorar a confiabilidade da avaliao dos
riscos e para o desenvolvimento de mtodos
eficientes de isolamento de estirpes de B. thu-
ringiensis, contendo genes cry ativos.
1.2 Protenas Vip
As protenas VIP foram descritas por Estru-
Tabela 2. Protenas Vip com efeito txico a diferentes insetos
ch et al. (1996) e recebem essa denomina- subdivididos em cinco grupos menores, de
o por serem produzidas na fase vegetati- acordo com essa seqncia gentica. Per-
va de crescimento de B. thuringiensis. Sua cebe-se, claramente que esses cinco gru-
concentrao tambm permanece alta an- pos similares so formados por protenas
tes e depois da fase de esporulao. da mesma classe, ou seja, Vip1, Vip2 e Vip
Vrios estudos foram realizados aps 3. A diferena entre a seqncia de genes
sua descoberta visando a caracterizao, que codificam essas protenas que define
identificao de novos tipos, ao insetici- sua classificao, como Vip1Aa, Vip1Ab, en-
da e tambm produo de plantas com ca- tre outras.
pacidade de express-las. Estes estudos, po- De acordo com Rang et al. (2005), as
rm, so incipientes quando comparados protenas Vip2 exibem entre 21 e 22% de
com as endotoxinas. similaridade com a protena Vip3Ba1, en-
A localizao dos genes responsveis quanto as protenas da classe Vip1 so en-
por sua produo ainda no foi determina- tre 8 e 22% similares Vip3Ba1.
da, embora existam vrios conjuntos de Segundo Fang (2007) estas protenas
primers que podem ser utilizados para iden- representam uma das maiores descobertas
tific-las como vip1 e vip2 (Rice, 1999; Fang de toxinas com capacidade inseticida, sen-
et al., 2007; Selvapandiyan et al., 2001 ) do extremamente relevante a ausncia de
vip3A (Rice, 1999), vip3Aa (Seifinejad et al., similaridade nas seqncias de aminoci-
2008), vip5 e vip6 (Loguercio et al., 2002). dos destas protenas com as seqncias de
A Figura 2 apresenta um dendograma aminocidos das endotoxinas, especialmen-
com as protenas Vip, j identificadas e ca- te, em termos de manejo e evoluo da
talogadas, no site: http:// resistncia.
www.lifesci.susx.ac.uk/home/ De acordo com o dendograma da Fi-
Neil_Crickmore/Bt. Esse dendograma mos- gura 2, estas protenas so classificadas em
tra primeiramente dois grandes agrupamen- trs subfamlias diferentes (Crickmore et al.,
tos de protenas onde so encontradas se- 2005), sendo que ocorrem em torno de 15%
qncias genticas semelhantes entre si, das cepas de B. thuringiensis avaliadas por
Estruch (1996) e 23% das cepas avaliadas
por Rice (1999). As subfamlias Vip1 e Vip2
(Tabela 2) so componentes de uma pro-
tena binria com atividade inseticida con-
tra Diabrotica virgifera e D. longicornis
(Han et al., 1999; Warren, 1997). As prote-
nas Vip 3 so ativas contra lepidpteros
(Tabela 2), como Spodoptera frugiperda e
Helicoverpa zea. Seu modo de ao est
relacionado formao de poros na mem-
brana do epitlio do intestino mdio (Yu
et al., 1997; Loguercio et al., 2002; Lee et
al., 2003). Ao mesmo tempo que a Vip 3
apresentou toxicidade sobre lepidpteros
e no mostrou efeitos sobre insetos no-
alvo (Whitehouse, 2007).
Devido a sua atividade inseticida rela-
cionada a Heliothis zea, as protenas Vip
3A esto sendo expressas em plantas de
algodo, conferindo resistncia ao inseto.
Nesse sentido, Bommireddy et al. (2007),
avaliaram plantas de algodo modificadas
somente com a protena Vip 3A, ou com a
combinao de Vip 3A e Cry 1Ab (Vip Cot)
nos lepidpteros H. zea e H. virescens. Con-
siderando o comportamento das lagartas,
os resultados desses autores mostram que
houve maior ndice de infestao em plan-
tas no modificadas em relao s demais
(Vip 3A e Vip Cot).
O conjunto desses dados demonstra
que s protenas Vip so promissoras no
controle de insetos-praga, uma vez que pos-
suem diferenas estruturais em relao s
demais protenas de B. thuringiensis, o que
pode retardar o processo de resistncia nas
populaes de insetos.
1.3 Demais fatores de virulncia
de B. thuringiensis
Alm das protenas Cry e Vip, os isola-
dos de B. thuringiensis podem sintetizar
protenas denominadas Cyt, que possuem
atividade citoltica in vitro e especificidade
in vivo aos dpteros (Hfte & Whitheley,
1989; De Maagd et al., 2003). De acordo
com esses autores fazem parte desse gru-
po as protenas Cyt1Ca e Cyt2Aa e seu
modo de ao tambm pode estar relacio-
nado a um sinergismo com outras toxinas
produzidas pelos isolados.
O entomopatgeno tambm produz
outros fatores de virulncia, como as -
exotoxinas, -exotoxinas, hemolisinas, en-
terotoxinas, quitinases e fosfolipases (Hf-
te & Whiteley, 1989; De Maagd et al., 2001).
Esses autores declaram desconhecida a
exata contribuio de cada fator na viru-
lncia da bactria, sendo uma dificuldade
determinar o espectro txico de um isola-
do que sintetiza mais de uma protena. Isso
porque, quando os fragmentos txicos vo
se ligar aos receptores da membrana do
intestino mdio do inseto, ocorre uma com-
petio pelos stios de ligao, que pode
interferir na toxicidade do isolado.
Guttmann & Ellar (2000) identificaram
isolados de B. thuringiensis com a presen-
a de hemolisinas, quitinases e lecitinases,
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 38 29

Tabela 3. Subespcies de Bacillus thuringiensis produtores da -exotoxina da em seus ensaios de toxicidade. Porm, de-
sendo eles: Bt kurstaki, Bt israelensis, Bt
fukuokaensis Bt kyushuensis, Bt darmasta-
diensis, Bt thompsoni, Bt tolworthii e Bt os-
trinae. J as subespcies Bt galleriae, Bt ai-
zawai e Bt wuhanensis apresentaram so-
mente hemolisina e quitinase.
Os mesmos autores tambm relatam a
presena do gene que codifica a enteroto-
xina, uma toxina produzida por diferentes
cepas de B. thuringiensis, com peso mole-
cular em torno de 45kDa, e que pode ser
txica a vertebrados, uma vez que anlo-
ga toxina produzida por B. cereus. Con-
siderando a anlise de 13 isolados de B.
thuringiensis avaliados, 9 foram positivos
para o gene entS que codifica a enterotoxi-
na. No mesmo sentido, Rivera et al. (2000)
avaliaram 74 isolados do entomopatgeno,
em relao a presena dos genes bce, hbl e
nhe para a enterotoxina. Os seus resulta-
dos mostram que o gene nhe foi o mais
freqente, seguido de hbl e bce mostrando
assim, uma pequena diferena na distribui-
o desses genes entre B. thuringiensis e
B .cereus.
Outros dados de pesquisa sobre ente-
rotoxina (Ngamwongsatit et al., 2008), re-
velaram a presena dos genes hbl, nhe, cytK
e entFM em 205 isolados de B. thuringien-
sis e 411 isolados de B. cereus. Os dados
desses autores mostram que, em 149 isola-
dos de B. thuringiensis todos os genes ocor-
reram simultaneamente, sendo os genes nhe
e entFM aqueles de menor freqncia. Es-
ses autores relatam a importncia desse
conhecimento uma vez que a enterotoxina
30 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 38
pode causar intoxicao alimentar, quan-
do relacionada ao patgeno B. cereus.
Em relao -exotoxina, tambm cha- Bravo, A. 1997. Phylogenetic Relationships of Ba-
mada thuringiensina, uma protena com
peso molecular de 0,7 kDa (Gohar & Per-
chat 2001), insespecfica, termoestvel,
identificada por inibir a sntese de rRNA
(Mackedonski & Hadjilov, 1972) e prejudi-
car a formao do fuso mittico, dentre
outros efeitos observados em ensaios in vi-
tro com Alium cepa (Sharma & Sahu, 1977).
Por ser inespecfica e txica a vertebrados,
a thuringiensina avaliada em testes labo-
ratoriais, utilizando roedores como cobai-
as.
Os dados de Ohba et al. (1981) mos-
tram que, de 740 isolados de B. thuringi-
ensis avaliados quanto a presena da -exo-
toxina, 28 produziram essa toxina. Alm
desses, dois isolados da espcie B. subtilis,
um isolado de B. natto e dois isolados da
espcie B. megaterium tambm foram pro-
dutores da thuringiensina.
Nesse sentido, Hernandz et al. (2003)
revelam que 79% dos isolados de B. thu-
ringiensis thuringiensis so produtores des-
sa toxina, seguidos de 20% para B. thurin-
giensis kenyae, 13% para B. thuringiensis
kurstaki, contrastando com 0% de produ-
o para B. thuringiensis aizawai.
Na Tabela 3 constam dados sobre a pro-
duo da -exotoxina pelas diferentes su-
bespcies de B. thuringiensis.
A thuringiensina tambm apresenta ati-
vidade inseticida a diferentes espcies de
insetos-praga, como demonstra o trabalho
de Barreto et al. (1999) utilizando S. frugiper-
vido as suas propriedades no especficas aos
insetos, ou seja, pode tambm afetar organis-
mos no-alvo, os isolados bacterianos que so
produtores dessa toxina no podem ser co-
mercializados para serem utilizados na agri-
cultura visando o controle de insetos-praga.
1.1 Referncias
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