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I – Introdução 08
IV – Reagentes e soluções 09
V – Procedimentos 09
V.II – Inóculo 10
VI – Cálculos 11
VII – Figuras 11
I – Introdução 13
IV – Reagentes e soluções 14
V – Procedimentos 15
VI – Cálculos 16
I – Introdução 19
IV – Reagentes 21
V – Procedimentos 21
V. I – Preparo de soluções 21
V. II – Determinação de DMM 21
VI – Cálculos 22
I – Introdução 25
IV – Reagentes 26
V – Procedimentos 26
V.II – Inóculo 27
VI – Cálculos 28
VII – Figuras 29
I – Introdução 31
IV – Reagentes 32
V – Procedimentos 32
VI – Cálculos 34
I – Introdução 36
IV – Reagentes 38
V – Procedimentos 39
VI – Cálculos: 41
I – Introdução 43
IV – Reagentes 46
V – Procedimentos 46
V. I – Preparo de soluções 46
V. II – Curva de calibração 47
VI – Cálculos: 49
I – Introdução 51
II – Amostragem e estocagem da amostra 51
III – Equipamentos e materiais 51
IV - Procedimentos 52
IV.I – Preparo da cápsula de porcelana 52
IV.II – Análise da amostra 52
V- Cálculos 52
VI – Referências Bibliográficas 53
I – Introdução 54
II – Amostragem e estocagem da amostra 54
III – Equipamentos e materiais 54
IV - Procedimentos 55
IV.I – Preparo do filtro 55
IV.II – Escolha do filtro e tamanho da amostra 55
IV.III – Análise da amostra 55
V- Cálculos 57
VI – Referências Bibliográficas 58
BIODEGRADABILIDADE AERÓBIA
MÉTODO DE ZAHN-WELLENS
I – Introdução
As amostras devem ser filtradas por membranas de 0,45 µm e sua estocagem pode ser
realizada em frascos de plástico. Caso não seja possível a análise da amostra no dia de coleta, deve-
se estocar sob refrigeração de 2-4°C por, no máximo, 48 horas ou a -18°C por longos períodos.
Entretanto, a estocagem por longos períodos não é aconselhável.
V – Procedimentos
Observações: sempre utilizar água destilada e deionizada e para que se evite o preparo
dessas soluções imediatamente antes do uso, adicione uma gota de HCl concentrado ou 0,4g
V.II – Inóculo
Utilizar lodo ativado da Estação de Tratamento de Esgoto (ETE) até, no máximo, 6h após a
coleta do mesmo. É necessário que o lodo seja lavado duas ou três vezes com água corrente,
deixando-o, em seguida, em repouso para decantação. Após isso, deve-se retirar o sobrenadante e
centrifugar o decantado.
VI – Cálculos
em que:
OECD. Guideline for Testing of Chemicals, 302 B. Adopted by the Council on 17th July
1992. Zahn-Wellens/EMPA Test.
CARBOIDRATOS
MÉTODO DE DUBOIS
I – Introdução
IV – Reagentes e soluções
Fenol 5% m/v: Medir 5,00 g de Fenol, utilizando uma balança semi - analítica, com o
auxílio do vidro de relógio e uma espátula. Transferir quantitativamente para um béquer
de 100 mL, adicionar aproximadamente 50 mL de água deionizada e homogeneizar com o
auxílio de um bastão de vidro, até total dissolução. Transferir a solução já homogeneizada
para um balão volumétrico de 100 mL, completar o volume e homogeneizar novamente.
Todo este procedimento deve ser realizado em capela de exaustão.
Solução de glicose 1 g.L-1: Pesar aproximadamente 1,0 g de glicose em balança semi-
analítica. Solubilizar em béquer de 250 mL, transferir para balão volumétrico de 1L e
completar o volume.
Soluções de glicose 0, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500 e 750 mg.L-1: Diluir a solução de
glicose 1 g.L-1 para as concentrações citadas. Utilizando balões volumétricos de 50 mL,
realizar as diluições conforme a tabela abaixo:
0 ------------------ 50
10 0,5 49,50
25 1,25 48,75
50 2,50 47,50
75 3,75 46,25
Retirar 0,5 mL de cada solução padrão e transferir para tubos de ensaio. Adicionar 0,5 mL
da solução de Fenol 5% m/v, utilizando pipeta graduada. Adicionar 2,5 mL de Ácido
VI – Cálculos
DUBOIS, M.; GILLES, K. A.; HAMILTON, J. K.; REBERS, P. A.; SMITH, F. Colorimetric
Method for Determination of Sugars and Related Substances. Division of Biochemistry, University
of Minnesota, St. Paul, Minn. 1956.
I – Introdução
Célula de ultrafiltração;
Membranas de ultrafiltração de 1, 5, 10 e 100 kDa (o diâmetro de corte das membranas
dependerá da finalidade da quantificação);
Agitador magnético;
Kitassato;
Filtro de vidro AP40;
Nitrogênio (N2);
Balança analítica;
Béquer de 250 mL (polietileno);
Bastão de vidro;
Balão volumétrico de 1000 mL;
Bomba de vácuo;
Proveta 100 mL.
V – Procedimentos
V. I – Preparo de soluções
Solução de NaOH 0,1 N: Pesar 4,0 g de Hidróxido de sódio e transferir para béquer de
250 mL (polietileno). Solubilizar e transferir para balão volumétrico de 1 litro. Aferir e
homogeneizar. Transferir para frasco de polietileno.
V. II – Determinação de DMM
Lavar as membranas com água destilada, com três banhos de uma hora cada. A cada
banho a água destilada deverá ser trocada.
Filtrar previamente um volume de 40 mL da amostra do lixiviado bruto, utilizando filtros
de fibra de vidro AP40.
Preparar a célula de ultrafiltração: Posicionar a membrana sobre o suporte, com a
superfície brilhante para cima. Colocar o anel de vedação inferior sobre a membrana,
empurrando-o com cuidado para baixo, de forma que a superfície da membrana fique
uniformemente em contato com o fundo do suporte. Sempre manusear a membrana pelas
bordas, evitando arranhá-las ou contaminá-las.
Encaixar o suporte da membrana no corpo cilíndrico da célula.
Rosquear a base firmemente no fundo do corpo cilíndrico.
Membrana Pressão
1 kDa 30 psi
5 kDa 30 psi
10 kDa 30 psi
O gás utilizado para a ultrafiltração é o nitrogênio gasoso (N2) por ser um gás inerte.
VI – Cálculos
Em que:
MM = massa molar;
DQO INERTE
MÉTODO DE GERMILI
I – Introdução
V – Procedimentos
Solução de nutrientes:
Adicionar 2 mL da solução de micronutrientes a 200 mL da solução de macronutrientes e
completar o volume para balão volumétrico de 1 litro..
V.II – Inóculo
Utilizar lodo ativado da Estação de Tratamento de Esgoto (ETE) até, no máximo, 6h após a
coleta do mesmo deixando-o, em seguida, em repouso para decantação por cerca de 30 minutos e
posterior retirada do sobrenadante. Lavar o lodo duas ou três vezes com água corrente.
Antes de se iniciar a preparação dos reatores, faz-se necessário conhecer o valor de DQO
do efluente a ser testado;
Utilizar Erlenmeyers de 2 L para a montagem dos reatores;
Realizar a análise de sólidos suspensos voláteis (SSV) para o lodo decantado (ver Anexo
2). Um volume de 2 mL é suficiente para a análise;
Introduza 1 litro de lixiviado com a concentração de DQO conhecida em um reator e 1
litro de solução de glicose com valor de DQO próxima ao valor do lixiviado em outro
reator;
Acrescentar, em cada reator, volume de inóculo correspondente para se atingir uma
concentração de 100 mg.L-1 de SSV (C1 x V1 = C2 x V2 => SSV x V1 = 100mg/L x
1000mL) e 100 mL de solução de nutrientes;
Acoplar o aerador e o difusor de bolhas, tal como representado na Figura 1;
Obs.: na etapa (c), aconselha-se que as coletas sejam realizadas as segundas, quartas e sextas-
feiras, não sendo necessário coletas aos sábados e/ou domingos.
VI – Cálculos
Assumir que a fração de DQO inerte da glicose é nula. Com isso, a diferença entre as
DQOs finais do efluente e da glicose, em que a atividade biológica foi encerrada, revela a
quantidade de DQO inerte do efluente e;
Os dados devem ser dispostos graficamente, tal como representado na Figura 2 e os
mesmos devem ser registrados.
GERMILI, E., ORHON, D., ARTAN, N. (1991). Assessment of the initial inert soluble COD
in industrial wastewaters. Water Science and Technology. v. 23, pp. 1077-1086.
LIPÍDIOS
MÉTODO DE POSTMA ADAPTADO
I – Introdução
Tubos de ensaio;
Pipetas graduadas de 0,5 e 5 mL;
Espectrofotômetro UV / Visível;
Estufa;
Pipeta automática;
Balão volumétrico de 1000 mL;
Béqueres de 100 mL e 250 mL;
Banho-maria.
IV – Reagentes
V – Procedimentos
V. I – Preparo de soluções
Solução de vanilina (Serve para a promoção da cor ao reagir com o ácido sulfúrico):
pesar 6 g de vanilina e transferir para béquer de 100 mL. Solubilizar em água. Transferir
para balão de volumétrico de 1 litro. Aferir com água destilada ou deionizada e
homogeneizar.
15,68 2 0
Pipetar 2,0 mL da amostra e transferir para um tubo de ensaio. Levar à estufa a 100 ºC até
a secagem da amostra. O branco não é feito nesta etapa
No tubo com a amostra seca, adicionar 0,1 mL de água destilada e 2,0 mL de ácido
sulfúrico concentrado ao resíduo sólido. Aquecer por 10 minutos em banho-maria à
100ºC.
Fazer um branco utilizando 0,1 mL de água destilada e 2,0 mL de ácido sulfúrico
concentrado.
Medir 0,1 mL dessa solução formada e transferir para um tubo de ensaio. Fazer duplicata.
Adicionar 2,0 mL de ácido fosfórico e 0,5 mL de solução de vanilina.
Agitar os tubos e deixar em repouso por 15 minutos em banho de água à 37,0ºC.
Fazer a leitura das absorbâncias com comprimento de onda ajustado para 537nm logo
após o preparo das soluções (máximo 10 min).
Lembrar que as amostras foram concentradas 20X (dividir o resultado por 20) no
momento do cálculo da concentração.
VI – Cálculos
Os cálculos são feitos através da curva de calibração, a partir da qual são obtidas as
concentrações relativas às absorbâncias encontradas.
POSTMA, T., STROES, J.A.P. (1968) Lipid screening in clinical chemistry .Clin. Chim.Acta,
v.22, p.569-578.
PROTEÍNAS
MÉTODO DE LOWRY
I – Introdução
Os lixiviados de aterro sanitário são basicamente constituídos por uma mistura de substâncias
orgânicas e inorgânicas, compostos em solução e em estado coloidal e diversas espécies de
microrganismos (ANDRADE, 2002).
As proteínas compõem uma fração considerável da matéria orgânica depositada em aterros
sanitários, principalmente em resíduo doméstico. Logo, estão presentes nos lixiviados em
concentrações variáveis, dependendo da fase de decomposição na qual o aterro se encontra. Durante
a decomposição no aterro, as proteínas são biodegradadas e geram compostos amoniacais e ácidos
graxos voláteis. Em caso de morte bacteriana, podem ser excretadas substâncias poliméricas
extracelulares (SPE) contendo proteínas, polissacarídeos, lipídeos (PAIVA, 2004). Portanto, a
quantificação de proteínas em lixiviado de aterro é muito importante para a escolha do método mais
adequado para o tratamento do mesmo.
Para a determinação do teor de proteínas presentes em lixiviado, este ensaio emprega o
método de Lowry et al., (1951).
O princípio do método baseia-se numa mistura contendo molibdato, tungstato e ácido
fosfórico (reagente Folin-Ciocalteau), que sofre uma redução ao reagir com proteínas, em meio
alcalino e na presença do catalisador cobre (II), produzindo um composto azul escuro, com
absorbância máxima em 750 nm.
Primeiramente, os íons cobre (II) interagem com as proteínas em meio alcalino e na presença
de tartarato de sódio, resultando na formação de um complexo tetradentado de cobre, de coloração
azul claro, com absorbância máxima no comprimento de onda 550 nm (Figura 1). Ocorre a perda de
1 próton por cada grupo amino substituído (reação do Biureto).
A presença de tartarato de sódio é necessária devido ao efeito quelato dos íons tartarato,
responsáveis por estabilizar o cobre em solução.
IV – Reagentes
Adicionar, com uso de pipeta automática, 0,5 mL de amostra no tubo de ensaio. Proceder
em duplicata.
Adicionar 5 mL de solução “D com cobre” em cada tubo de ensaio. Homogeneizar bem.
Deixar os tubos em repouso por 10 minutos à temperatura ambiente. Acrescentar 0,5 ml
da solução de Folin na proporção 1:2.
Homogeneizar bem os tubos e, em seguida, deixá-los em repouso por 30 minutos à
temperatura ambiente.
Fazer a leitura das absorbâncias no espectrofotômetro no comprimento de onda 550 nm.
A concentração de proteínas é determinada com base na curva padrão para a proteína
BSA.
VI – Cálculos:
Branco: 0,5 mL água + 5,0 mL solução “D com Cu” + 0,5 mL solução Folin 1:2
Proteínas: 0,5 mL de lixiviado + 5,0 mL solução “D com Cu” + 0,5 mL solução Folin 1:2
Os cálculos para a obtenção do teor de proteínas presentes na amostra de lixiviado são feitos através
da curva de calibração Absorbância x concentração de proteína (mg.L-1), a partir da qual são obtidas
as concentrações relativas às absorbâncias encontradas.
LOWRY, O.H.; ROSENBROUGH, N.J.; FARR, R.L.; RANDALL, R.J. Protein measurement
with the Folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry, v.193, p.265-275, 1951.
ZAIA, D. A. M.; ZAIA, C. T. B. V.; LICHTIG, J. Química Nova, v. 21, n.6, São Paulo, 1999.
SUBSTÂNCIAS HÚMICAS
MÉTODO DE LOWRY MODIFICADO
I – Introdução
As substâncias húmicas podem ser definidas como uma série de polímeros amorfos de
coloração amarela-marrom a preta, de massa molar relativamente alta, formados por reações de
oxidação e subsequente polimerização da matéria orgânica, durante o processo de decomposição de
resíduos vegetais e animais presentes no ambiente. Apresentam-se como uma mistura heterogênea de
moléculas polidispersas com elevadas massas molares e grupos funcionais distintos contendo
oxigênio na forma de carboxilas, hidroxilas fenólicas e carbonilas (STEVENSON, 1994 apud
MORAVIA, 2010; BRUM, 2005).
A classificação das substâncias húmicas é meramente operacional e baseia-se nas
propriedades de solubilidade em soluções extratoras aquosas em diversos valores de pH. Os termos
ácidos húmicos (AH), ácidos fúlvicos (AF) e huminas (HU) referem-se às principais frações até hoje
usadas para descrever componentes húmicos. A fração AH, de coloração escura, é aquela solúvel em
meio alcalino e insolúvel em meio ácido (pH < 2); a fração AF, de coloração mais clara, é aquela
que, após solubilização em álcali, se mantém solúvel a qualquer valor de pH e a fração HU é
insolúvel em qualquer condição de pH (MORAVIA, 2010).
Estruturalmente, as três frações húmicas são similares, mas diferem em massa molar e
conteúdo de grupos funcionais. Os ácidos fúlvicos possuem a menor massa molar, menos carbono e
nitrogênio e tem o mais alto conteúdo de grupos funcionais possuidores de oxigênio (CO2H, OH,
C=O) por unidade de peso que as outras duas frações húmicas (Figura 1). A estrutura química e
propriedades da fração humina parecem ser similares àquelas dos ácidos húmicos (MORAVIA,
2010). A insolubilidade da humina pode ser resultado de sua adsorção ou ligação à constituintes
inorgânicos do solo.
No caso de lixiviado de aterro sanitário, diversos autores (ZOUBOULIS et al., 2004; KANG
et al., 2002; EL FADEL e KHOURY, 2000) afirmam que a recalcitrância pode ser associada com a
presença de compostos de elevada massa molar com estruturas muito complexas, como é o caso das
substâncias húmicas (MORAVIA, 2010). Segundo Kang et al., 2002, com o aumento da idade do
aterro, aumentam também a quantidade de componentes aromáticos e o tamanho molecular das
substâncias húmicas, o que sugere que em aterros mais antigos, o grau de humificação é maior.
A resistência à degradação microbiana dos materiais húmicos parece também ser em grande
parte devido à formação de complexos metálicos e/ou argilo-orgânicos estáveis (SCHNITZER e
KHAN, 1978 apud MORAVIA, 2010).
A recalcitrância da matéria orgânica e a cor adquirida nos lixiviados de aterro sanitário
tornam a quantificação de substâncias húmicas uma importante etapa de caracterização, para a
escolha do método mais adequado de tratamento dos lixiviados.
IV – Reagentes
V – Procedimentos
V. I – Preparo de soluções
Preparo dos padrões de ácido húmico comercial 17, 52 e 101 mg.L-1 : Medir as massas de
ácido húmico comercial em vidro de relógio. Transferir para um béquer de 250 mL e
dissolver em água deionizada. Transferir quantitativamente para balão volumétrico de 1 L
e completar o volume com água deionizada.
Preparar quatro padrões de proteína BSA 120 mg.L-1, empregando como água de diluição
os padrões 0 (água deionizada), 17, 52 e 101 mg.L-1 de ácido húmico comercial. A partir
de cada padrão BSA 120 mg.L-1 preparado, efetuar as diluições para 0, 20, 40, 70, 100
mg.L-1 de BSA.
Transferir, com o uso de pipeta automática, 0,5 mL de cada padrão para um tubo de
ensaio destinado a ensaio com cobre, e para tubo destinado a ensaio sem cobre. Proceder
em duplicata.
Adicionar 5 mL de solução “D com cobre” em cada tubo de ensaio para os ensaios com
cobre. Adicionar 5 mL de solução “D sem cobre” em cada tubo de ensaio para os ensaios
comparativos sem cobre. Homogeneizar bem.
Deixar os tubos em repouso por 10 minutos à temperatura ambiente. Acrescentar 0,5 ml
da solução de Folin 1:2.
Homogeneizar bem os tubos e, em seguida, deixá-los em repouso por 30 minutos à
temperatura ambiente.
Fazer a leitura das absorbâncias no espectrofotômetro nos comprimento de onda 550 nm e
750 nm.
Calcular o fator de redução F da absorbância dissociada de proteínas nos ensaios
comparativos sem cobre, na ausência de substâncias húmicas (0 mg.L-1 de ácido húmico),
a λ = 550 nm e λ = 750 nm. (Ver item VI – Cálculos).
Calcular a absorbância dissociada de substâncias húmicas para cada padrão de proteína e
ácido húmico. Calcular a absorbância média de SH para cada concentração de ácido
húmico. (Ver item VI – Cálculos).
Criar uma curva de Absorbância de SH x Concentração de SH (mg.L-1), a partir da qual
são obtidas as concentrações relativas às absorbâncias encontradas para cada caso (λ =
550 nm e λ = 750 nm), como os exemplos a seguir:
A absorbância medida para cada padrão de proteína e substâncias húmicas pode ser
representada pelas equações 1 e 2, na presença e ausência de CuSO4, respectivamente.
Sendo que:
Ac/Cu = absorbância com a adição CuSO4;
As/Cu = absorbância sem a adição CuSO4;
Aproteínas = absorbância dissociada para proteínas;
Asubstâncias húmicas = absorbância dissociada para substâncias húmicas;
F = Fator de redução de absorbância na ausência de CuSO4.
BRUM, M. C. Remoção de ácido húmico da água por precipitação e flotação com a utilização de
surfatantes catiônicos. Rio de Janeiro, 2005.
FROLUND, B.; GRIEBE, T.; NIELSEN, P.H. Enzymatic activity in the activated-sludge floc matrix.
Applied Microbiology and Biotechnology, v.43, n.4, p.755-61, 1995.
KANG, K.H.; SHIN, H.S.; PARK, H. Characterization of humic substances present in landfill
leachates with different landfill ages and its implications. Water Research, v.36, n.16, p.4023-
4032, 2002.
MCBRIDE, M.B. Environmental chemistry of soils. New York: Oxford University Press,
406p., 1994.
SHARMA, O. P.; KRISHNAN, P. S. Calorimetric Estimation of Humic Acid with the Phenol
Reagent of Folin and Ciocalteu. Analytical Biochemistry, v. 14, p. 11-16, 1966.
SCHULTEN, H.R. e SCHNITZER, M. Chemical model structure for soil organic matter and
soils. Soil Science, Baltimore, v.162, p.115-130. 1997
STEVENSON, J.F. Humus chemistry - Genesis, composition, reactions. 2. ed. John Wiley & Sons,
496p. New York, 1994.
ZOUBOULIS, A.I.; CHAI, X.L.; KATSOYIANNIS, I.A. The application of bioflocculant for
the removal of humic acids from stabilized landfill leachates. Journal of Environmental
Management. v.70, p.35-41, 2004.
ANEXO 1
SÓLIDOS TOTAIS, FIXOS E VOLÁTEIS
I – Introdução
Lavá-la cuidadosamente;
Secá-la em estufa;
Aquecê-la em mufla a 500 ± 50 ºC por 20 minutos;
Resfriar em dessecador e pesar a cápsula imediatamente antes do uso.
Em uma cápsula de peso conhecido, medir massa conhecida da amostra (1,0 grama de
lodo centrifugado, para análise de biodegradabilidade de lixiviado);
Secar a 103 – 105 ºC durante 1 hora em estufa;
Esfriar em dessecador;
Pesar em balança analítica;
Para a determinação de sólidos fixos, queimar o resíduo obtido após passagem pela estufa
(sólidos totais) em mufla a 500 ± 50 ºC durante 15 minutos;
Resfriar em dessecador e pesar após meia-hora.
A fração orgânica (sólidos voláteis) é obtida pela diferença entre sólidos totais e sólidos
fixos.
V – Cálculos:
Sólidos totais:
ST (mg.L-1) = (A – B) x 1000
Vol. Amostra (mL)
Sólidos fixos:
SF (mg.L-1) = (C – B) x 1000
Vol. Amostra (mL)
APHA (1992) Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 17th Edition.
American Public Health Association, Washington, DC.
ANEXO 2
SÓLIDOS SUSPENSOS, FIXOS E VOLÁTEIS
I – Introdução
IV – Procedimentos
Inserir o disco com a face enrugada voltada para cima no equipamento de filtração;
Aplicar vácuo e lavar o filtro com três porções sucessivas de 20 mL de água destilada.
Continuar a sucção até remover toda a água, e descartar estas águas de lavagem;
Remover o filtro e transferir para uma cápsula de porcelana;
Secar em estufa a 103 – 105 ºC durante 1 hora;
Se os sólidos voláteis forem também medidos, passar pela mufla a 500 ± 50 ºC durante 15
a 20 minutos.
Resfriar em dessecador e pesar. Obs.: Pesar imediatamente antes de usar.
Escolher um volume de amostra que proporcione entre 2,5 a 200 mg de resíduo seco.
Se forem necessários mais que 10 minutos para filtração, usar filtro maior ou reduzir o
volume da amostra, devendo o resíduo seco obtido ter peso superior a 2,5 mg.
A = massa da cápsula + massa do filtro + resíduo seco após passagem pela estufa (mg)
B = massa da cápsula + massa do filtro (mg)
C = massa da cápsula + massa do filtro + resíduo seco após passagem pela mufla (mg)
B = massa da cápsula + massa do filtro (mg)
APHA (1992) Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 17th Edition.
American Public Health Association, Washington, DC.