MÉTODOS DE COLORAÇÃO EM HEMATOCITOPATOLOGIA

MATERIAL: Distensão (esfregaço) de sangue ou de medula óssea ou imprints secos ao ar.

FIXAÇÃO: Durante a coloração com metanol.

COLORAÇÃO DE WRIGHT

Na preparação do corante, o azul de metileno é aquecido com bicarbonato de sódio, tornando-o policromático.
Pode ser adquirido em solução ou em pó. Pode-se dissolver, cuidadosamente, 1 grama em 600 mililitros de
metanol. Outra fórmula: 0,3 grama do corante de Wright em pó + 3,0 mililitros de glicerina + 97, 0 mililitros de
metanol puro.

PROCEDIMENTO:
1. Coloque as lâminas na posição horizontal com as distensões ou imprints voltados para cima.
2. Cubra as distensões ou os imprints com a solução corante não diluída e deixe por 1 minuto. O metanol irá
fixar a distensão ou o imprint.
3. Dilua com água destilada (aproximadamente com o mesmo volume) até que uma espuma metálica apareça.
Deixe o corante diluído agir por 2 minutos e meio a 5 minutos.
4. Sem deslocar a lâmina, enxágue com água destilada e lave até que as partes mais finas da distensão
(esfregaço) ou do imprint fiquem róseas-avermelhadas. Percebe-se, usualmente, que a água destilada não dá
diferenciação adequada. Neste caso, tampão fosfasto (pH 6,4 a 6,5) (veja ao final as tabelas de tampão) pode ser
usado, pelo menos na lavagem, e, possivelmente, também na diluição do corante.

COLORAÇÃO DE LEISHMAN

O corante é preparado pelo aquecimento de solução aquosa de azul de metileno a 1% com carbonato de sódio
(Na2CO3) a 0,5%, à 65oC, por 12 horas (tornando o azul de metileno policromático), após as quais é deixado
amadurecer por 10 dias, antes de ser misturado com igual volume de solução aquosa de eosina B a 0,1%. Após
esta mistura ficar descansando por 10 horas ela é filtrada e o precipitado é coletado e lavado com água destilada
até não mais liberar cor. O precipitado é, então, seco e triturado até virar pó fino. Para fazer a solução corante
uma pequena porção do pó fino é coletada com ponta de faca, bem amassada em 10 a 20 mililitros de metanol
absoluto, e deixada precipitar (1 minuto); sendo o sobrenadante da solução alcoólica do corante filtrada em uma
garrafa para estoque. Esta etapa é repetida até que 0,15 grama tenha sido dissolvidos em 100 mililitros de
metanol absoluto. Este corante melhora com a idade e não é satisfatório para o uso até que um mínimo de 3
semanas tenham passado, após a sua preparação. Adquirindo-se o corante em pó, pode-se prepará-lo no
laboratório segundo a fórmula: 0,2 grama do corante de Leishman em pó + 100 mililitros de metanol puro.

PROCEDIMENTO:
É semelhante ao usado na coloração de Wright, exceto na etapa 3. Com o corante de Leishman a diluição é feita
com, aproximadamente, 2 volumes de água destilada para 1 volume de corante (o melhor controle é o
aparecimento da espuma metálica). Se o tampão fosfato for requerido para a lavagem, use o com pH 6,8 que é o
melhor. Este pode ser substituído por água destilada, durante a diluição do corante.

RESULTADOS:
Após a coloração, uma vez que as distensões (esfregaços), ou imprints, tenham atingido o grau de diferenciação
desejável (usualmente em até 1 minuto), as lâminas são deixadas secarem. A aparência dos elementos celulares é
muito semelhante em ambas as colorações. A coloração de Leishman pode dar mais contraste às estruturas
nucleares. Em ambas, as hemácias ficam róseas; os grânulos eosinófilos róseos-avermelhados brilhantes; os
núcleos em tons variáveis do lilás ao púrpura; os grânulos neutrófilos na cor lilás.
Se as distensões, a olho nu, mostrarem-se róseas brilhantes, microscopicamente os eritrócitos devem estar
vermelho-vívido, os grânulos eosinófilos róseos-pálidos brilhantes, e os núcleos fracamente azulados. Estes
problemas na coloração podem ser devido à acidez do corante ou ao tampão ou lavagem excessiva. O corante de
Leishman não amadurecido pode também dar núcleos pálidos.
Por outro lado, se as distensões e imprints mostrarem-se, ao olho nu, azulados a violetas, microscopicamente os
eritrócitos mostrarão uma tonalidade, variável, de marrom-acinzentada até púrpura; os grânulos eosinófilos
serão cinza-metálicos e os núcleos e os grânulos dos neutrófilos mostrar-se-ão púrpura-escuros, sendo os
detalhes obscurecidos. As causas destes problemas podem ser uma excessiva coloração, pouca lavagem, ou
corante ou lavagem muito alcalinos. Lavar com solução tampão no pH 6,5 ou pH 6,8 pode melhorar a qualidade.
As distensões ou imprints recentemente corados, especialmente os pouco corados ou pálidos por terem sido
muito diferenciados, podem ser descorados com enxágues em etanol a 95%, lavagem em água destilada, e
novamente corados.
Deve-se ter em conta que os corantes de Wright e de Leishman são misturas empíricas de corantes
policromáticos, cujas bateladas podem variar. Também os processos de amadurecimento e policromização
continuam na solução-estoque do corante. Se esta tornar-se contaminada com água, resultados ruins ocorrerão.
Para que estes sejam evitados recomenda-se que todas as distensões ou imprints sejam fixados com metanol
absoluto, antes da coloração.

COLORAÇÃO DE GIEMSA

O corante de Giemsa na realidade é mistura de azur II (mistura equimolar de azur I e azul de metileno) e eosinato
de azur II (corante formado pela combinação equimolar de azur I, azul de metileno e eosina amarelada). Pode ser
adquirido em solução pronta, ou ser feito segundo a fórmula: 0,3 grama de Giemsa em pó + 25 mililitros de
glicerina + 25 mililitros de metanol puro.

PROCEDIMENTO:
1. As distensões (esfregaços) ou imprints devem ser pré-fixados em metanol por 3 minutos.
2. Após secos, devem ser imersos na solução corante de Giemsa diluída (1 volume do corante em 9 a 15 volumes
de água destilada ou de tampão fosfato no pH 6,8), em jarra de Coplin, e deixados por 15 minutos a 1 hora.
3. Após a coloração, devem ser lavados em água destilada e secas ao ar, sem montagem das lâminas.

Este corante não é usado comumente sozinho, porém é excelente na coloração de corpos de inclusão (por
exemplo, na conjuntivite por Chlamydia trachomatis), onde os esfregaços devem ser deixados corar na solução
de Giemsa diluída por 12 a 18 horas.

RESULTADOS:
Por este método as hemácias e os grânulos dos neutrófilos coram-se fracamente, porém os grânulos azurófilos
são bem corados em vermelho. Em combinação com os métodos de Jenner ou de May-Grünwald constitui o
método de coloração panóptico. Neste, a combinação dos corantes melhora a coloração dos grânulos
citoplasmáticos e outros corpos.

COLORAÇÃO DE JENNER-GIEMSA

PROCEDIMENTO:
1. As distensões ou imprints, secos ao ar, são fixados em metanol, por 10 a 20 minutos.
2. Deixe, por 4 minutos, no corante de Jenner (eosina-azul de metileno), adquirido em solução comercial,
diluído, na hora de usar, na proporção de 1 volume de corante para 4 volumes de tampão fosfato, pH 6,8.
3. Sem lavar, transfira as lâminas para o corante de Giemsa (1 volume do corante + 9 volumes do tampão
fosfato, pH 6,8) e deixe por 7 a 10 minutos.
4. Lave, rapidamente, em 3 passagens, em tampão fosfato, pH 6,8.
5. Deixe, por 3 a 12 minutos, para diferenciar, em quarto banho de tampão fosfato, pH 6,8. A diferenciação pode
ser controlada pelos aspectos macroscópico e microscópico, em pequeno aumento, segundo a experiência de
cada um.
6. Deixe secar.

COLORAÇÃO DE MAY-GRÜNWALD-GIEMSA

Este método dá resultados melhores que os de Jenner-Giemsa.

O corante de May-Grünwald pode ser adquirido em solução, ou feito dissolvendo-se 0,2 grama do corante em pó
em 100 mililitros de metanol puro.
O corante de Giemsa pode ser adquirido em solução, ou ser feito segundo a fórmula: 0,3 grama de Giemsa em pó
+ 25 mililitros de glicerina + 25 mililitros de metanol puro.

PROCEDIMENTO:
1. As distensões e imprints secos ao ar são fixados em metanol por 5 minutos.
2. Transfira para o corante de May-Grünwald-Giemsa, diluído na hora de usar (1 volume do corante para 2
volumes do tampão fosfato, pH 6,8) e deixe por 3 a 5 minutos.
3. Transfira, sem lavar, para a solução de Giemsa, diluída na hora de usar (1 volume do corante + 9 volumes do
tampão fosfato, pH 6,8), e deixe por 7 a 15 minutos.
4. Faça a diferenciação como no método de Jenner-Giemsa.
 TAMPÕES FOSTATOS

Fosfato de Potássio Dibásico Hidróxido de Sódio

[KH2PO4 0,2 M] [NaOH 0,2 M]
pH
(2,722% m/v) (0,8 % m/v)
ml ml
50 17,8 6,6
50 21,0 6,7
50 23,7 6,8
50 26,5 6,9
50 29,6 7,0

OU
Solução A:
Dissolva 27, 6 gramas de fosfato de sódio monobásico (NaH2PO4.H2O) em até 1 litro com água destilada,
fazendo uma solução 0,2 M.

Solução B:
Dissolva 28,39 gramas de fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4 ou 53,62 gramas de Na2HPO4.7H2O) em até um
1 litro com água destilada, fazendo uma solução 0,2 M.

Misture os volumes das soluções-estoques (A e B), como mostrado na tabela abaixo, e dilua ao volume
final de 200 mililitros para obter os pHs desejados.

SOLUÇÃO A SOLUÇÃO B
pH
(ml) (ml)
85,0 15,0 6,1
81,5 18,5 6,2
77,5 22,5 6,3
73,5 26,5 6,4
68,5 31,5 6,5
62,5 37,5 6,6
56,5 43,5 6,7
51,0 49,0 6,8
45,0 55,0 6,9
39,0 61,0 7,0

REFERÊNCIAS:
LIMA, A.O.; Soares, J.B.; Greco, J.B.; Galizzi, J. & Cançado, J.R. – Métodos de Laboratório Aplicados à
Clínica. Técnica e Interpretação. Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, 1985, pp.417-419.
RAPHAEL, S.S. (ed.) – Lynch’s Medical Laboratory Technology. 4th ed., Philadelphia, W.B.Saunders, 1983, pp.
685-686.