Departamento Acadêmico de Química

Curso Técnico Integrado

Disciplina: Microbiologia Industrial
Relatório de Aulas Práticas

Alunos: Maria Luiza Andrade Aquino

Mariana Gabriela de Oliveira
Ruslam Romaine Eleutério

Subturma: T3
Professora: Fernanda Badotti

COLORAÇÃO DE GRAM
1. Introdução

A coloração de Gram foi desenvolvida em 1884 por Hans Christian Joachim Gram, médico
bacteriologista dinamarquês. É um procedimento de coloração diferencial, pois não cora todos os
tipos de células igualmente; e muito útil, pois classifica as bactérias em dois grandes grupos:
gram-positivas e gram-negativas, de acordo com diferenças na parede celular das bactérias.
Consiste no tratamento sucessivo do esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes
cristal violeta, iodo, etanol - acetona e fucsina básica.

Os diferentes tipos de bactérias reagem de modo diferente à coloração de Gram, porque

diferenças estruturais em suas paredes celulares afetam a retenção ou liberação de uma
combinação de violeta de genciana e iodo, denominada complexo violeta-iodo (CV-I). Entre outras
diferenças, as bactérias gram-positivas têm uma parede celular mias espessa de peptideoglicana
(dissacarídeos e aminoácidos) que as bactérias gram-negativas. Além disso, as bactérias gram-
negativas contêm uma camada de lipopolissacarídeos (lipídeos e polissacarídeos) como parte de
sua parede celular. Quando aplicada a células gram-positivas e gram-negativas, a violeta de
genciana e o iodo penetram facilmente nas células. Dentro as mesmas, a violeta de genciana e o
iodo se combinam para formar o CV-I. Esse complexo é maior que a molécula CV que entrou na
célula e, devido ao seu tamanho, não pode ser removido da camada intacta de peptideoglicano
das células gram-positivas pelo álcool. Nas células gram-negativas o álcool rompe a camada
lipopolissacarídica e o complexo é removido através da camada fina de peptideoglicano, que não
consegue reter o complexo. Como resultado, as células gram-positivas retêm o corante e
permanecem de cor púrpura. As células gram-negativas não retêm o corante e ficam incolores até
serem contracoradas com um corante vermelho, após o que adquirem cor rosa. O método de
Gram é uma das mais importantes técnicas de coloração em microbiologia médica. Porém, os
resultados da coloração de Gram não são universalmente aplicáveis, pois algumas células
bacterianas coram-se fracamente ou não adquirem cor. A reação de Gram é mais consistente
quando usada em bactérias jovens, em crescimento.
A reação de Gram de uma bactéria pode fornecer informações valiosas para o tratamento de uma
doença já que bactérias gram-positivas tendem a ser mortas facilmente por penicilinas e
cefalosporinas e as bactérias gram-negativas geralmente são mias resistentes, pois os antibióticos
não podem penetrar na camada de lipopolissacarídeos.

O método de coloração de Gram consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura

bacteriana crescida em meio sólido ou líquido, com um corante primário, o cristal violeta, seguido
de tratamento com um fixador, o lugol. Tanto bactérias gram-positivas quanto gram-negativas
absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador, adquirindo uma coloração violeta
devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo, insolúvel, em seus citoplasmas. Segue-se
um tratamento com um solvente orgânico, o etanol-acetona. O solvente dissolve a camada lipídica
das membranas externas das bactérias gram-negativas, deixando também pequenos buracos na
fina camada de peptideoglicana pelos quais o complexo CV-I se espalha , decorando as células.
Por outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias gram-positivas e
provoca a contração dos poros do peptideoglicano, tornando-as impermeáveis ao complexo; o
corante primário é retido e as células permanecem coradas. A etapa da descoloração é crítica,
pois a exposição prolongada ao solvente irá provocar a remoção do cristal violeta dos dois tipos
de bactérias, podendo produzir resultados falsos. A retenção ou não do corante primário é,
portanto, dependente das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas tais
como espessura, densidade, porosidade e integridade. Em seguida, a amostra é tratada com um
corante secundário, a fucsina básica. Como as bactérias gram-negativas ficam incolores após a
lavagem com álcool, a adição do contracorante colore as células. Ao microscópio, as células
gram-positivas aparecerão coradas em violeta e as gram-negativas em rosa. Em células de
bactérias gram-positivas velhas, mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou
químicos, tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou
todas as células coradas como gram-negativas. Portanto, o uso de amostra nova é importante.
Por outro lado, resultados do tipo "falso gram-positivo" só são obtidos se o tratamento com etanol-
acetona for omitido. O corante cristal violeta pode ser substituído, com os mesmos resultados,
pelo azul de metileno e a fucsina básica pode ser substituído pelo corante vermelho safranina. A
fucsina cora muitas bactérias gram-negativas mais intensamente que a safranina, que por sua vez
não cora prontamente algumas espécies de bactérias. O solvente etanol-acetona pode ser
substituído por álcool 95%.

2. Objetivos

Desenvolver habilidades para executar as técnicas de preparação de esfregaços e para o método

de coloração de Gram, sabendo diferenciar e classificar as bactérias de acordo com a coloração
obtida e relacionando-as à composição química da parede celular das mesmas. Desenvolver a
 habilidade, também, para utilizar o microscópio óptico, observando as bactérias após a coloração
de Gram.

3. Materiais necessários

3.1 Reagentes:
• Água
• Álcool
• Cristal violeta
• Lugol
• Safranina

3.2 Materiais
• Alça de Platina
• Lâminas de vidro
• Pipetas de Pasteur
• Suporte para coloração das lâminas
• Placa com crescimento bacteriano: E.coli e S.aureus
• Tubo de ensaio

3.3 Equipamentos
• Microscópio óptico

• Bico de Bunsen
4. 1ª etapa: Preparação da atividade prática

4.1 Preenchimento da Ficha Formativa de Reagentes (Tabela 01)

Nomes Composiçã Descrição Riscos à

Meios de saúde/ Referência
o Química Físico- Manuseio Estocagem
cultura/ impacto bibliográ-
química ambiental
reagentes fica

Solubilidade Suspeito - Pipetas

- C25H30ClN3 em água: de de pasteur Ver
20 g/L (20 °C) provocar referência
cancro. - uso de s bibliográ-
Ponto de
fusão: Nocivo por jaleco ficas
Cristal
189 - 194 °C ingestão. (Item
Violeta
Provoca 5.1.4)
Massa molar: lesões
407.99 g/mol oculares
graves.
Densidade:
Muito
1.19 g/cm3
(20 °C) tóxico para
os organis-
pH: 2.5 - 3.5 mos
(10 g/l, H2O, aquáticos
20 °C) com efeitos
duradou-
ros.
 - Solúvel em - Pipetas
- Iodeto de água à 20 ºC - Não é de pasteur Armazenar Ver
potássio perigoso de 15°C a referência
- Densidade 25°C
Lugol para a - uso de s bibliográ-
1,01 g/cm³ a
- Cristais de jaleco ficas
20 ºC água
iodo (Item
- pH: 3,5 (H2O, 5.1.4)
- Água 20 ºC)
destilada
- Ponto de
ebulição: 100
ºC

Solubilidade - Forte - Pipetas

Safrani- em água: contami- de pasteur
- C20H19ClN4
na 50 g/L (20 °C) nante de
água - uso de
Massa molar: jaleco
350.85 g/mol

- pH: 10
(10 g/l, H2O,
20 °C)

5. 2ª etapa – Execução da atividade principal

5.1 Procedimentos/metodologia

I) Coloração e esfregaço

Utilizando-se da área estéril em volta do bico de Bunsen ou a capela de fluxo laminar, retirar, com
o auxílio da alça de platina, uma pequena porção da bactéria desejada (já inoculada em
placa petri).

Colocar uma gota de água destilada em um lâmina, esfregar a ponta da alça de platina com a
bactéria na gota, fazendo um círculo.

Secar a água com o auxílio do bico de bunsen.

Corar com Cristal violeta por 60 segundos.

Lavar com esguicho de água destilada

Corar com Lugol por 60 segundos.

Lavar com esguicho de água destilada.

Passar álcool acetona até que não haja mais desprendimento de corante.

Lavar com esguicho de água destilada.

Corar com fucsina por 30 segundos.

Lavar com esguicho de água destilada e esperar secar.

II) Microscópio

Ligar o microscópio na tensão adequada.

Acoplar a lâmina à mesa (platina) do microscópio.

Focalizar utilizando o parafuso macrométrico, ajustar o foco com o parafuso micrométrico.

No caso da lente de maior aumento, colocar óleo de imersão, imergir a lente no óleo, focar
utilizando o parafuso macrométrico e ajustar com ajuda do micrométrico.

Após o término da visualização, retirar a lâmina e limpar a objetiva que imergiu no óleo com um
papel absorvente.

5.1.1 Leitura e interpretação dos resultados

Os microorganismos roxos, com forma de cocos, vistos no microscópio eram gram-positivos

(Staphylococcus aureus), enquanto os de coloração rosa com forma de bastonetes eram
gram-negativos (Escherichia coli). Essa diferença de cor ocorre, pois as bactérias gram-
positivas possuem uma densa camada de peptideoglicano em sua parede celular, enquanto
as gram-negativas possuem uma fina camada desse composto e uma membrana externa,
constituída por lipopolisacarídeos. Ao corar as bactérias com cristal violeta e lugol, o
complexo de cristal violeta-iodo é absorvido por ambas, porém, ao serem tratadas com
álcool, as espessas paredes celulares das bactérias gram-positivas são desidratadas,
provocando a contração dos poros do peptideoglicano, tornando-as impermeáveis ao
complexo; enquanto a porção lipídica das membranas externas das bactérias gram-
negativas se dissolve, deixando o complexo ser removido. Ao corar ambas com a safranina,
as gram-negativas absorvem esse contracorante por estarem incolores, diferentemente das
gram-positivas, que não absorvem por já estarem coradas.

Foi possível a observação de bactérias descoradas em ambos esfragaços (Staphylococcus

aureus e Escherichia coli); e também algumas bactérias do tipo Staphylococcus aureus
 com uma cor mais roseada e outras do tipo Escherichia coli em um tom mais roxeado em
comparação com as outras do mesmo esfregaço. Isso pode ter ocorrido por causa de uma
má coloração ou até mesmo devido ao tipo de cultura das bactérias. A etapa de
descoloração na Coloração de Gram é uma das mais importantes. Isso, porque se for muito
prolongado o tempo de exposição ao solvente (álcool), o complexo cristal violeta-iodo pode
ser removido de ambos tipos de bactérias (gram-positivas e gram-negativas) e ambas
serem coradas pelo contracorante (safranina) na próxima etapa do procedimento, o que
explica a cor roseada de algumas gram-positivas, e se o tempo for curto, pode não haver
remoção do complexo cristal violeta-iodo das bactérias gram-negativas, o que explica a
coloração roxeada de algumas delas no esfregaço. A descoração das bactérias pode ser
explicada pela retenção ou não do corante, já que depende das propriedades físicas e
químicas das paredes celulares bacterianas, tais como densidade, espessura, porosidade e
integridade. Outras explicações para esses resultados adversos podem estar ligadas a
células velhas, células mortas ou células com envelopes danificados por agentes químicos
ou físicos, tais como o aquecimento no bico de bunsen, utilizado para a secagem do
esfregaço.

Outro problema nas etapas de coloração pode ser o quanto espesso é um esfregaço, já que é
mais difícil descora-las e até mesmo permitir a observação no microscópio.

Por esses motivos, a Coloração de Gram nunca deve ser utilizada como um diagnóstico definitivo
para a classificação de bactérias e sim como um ponto de partida. Visto isto, a Coloração de
Gram somente será um recurso rápido e útil quando corretamente realizada e interpretada e
com o uso de culturas em que se saiba, pelo menos, o tempo de incubação.

5.1.2 Apresentação de propostas de minimização, reutilização, tratamento e descarte dos

resíduos gerados

Os meios utilizados podem ser reaproveitados transformando estes em alimentos para animais e
adubos. Para a produção dos alimentos e adubos seria necessário o tratamento dos produtos
gerados pela degradação do meio e pelo metabolismo das bactérias. Porém, não foram
encontradas pesquisas nessa área. O tratamento existente consiste na combustão dos meios, o
que gera muita poluição por gás carbônico e resíduos sólidos não identificados. (concertar)
5.1.3 Conclusão

5.1.4 Bibliografia

- MICHAEL J. PELCZAR JR. & E.C.S. CHAN & NOEL R. KRIEG. Microbiologia: Conceitos e
Aplicações - vol. 1. 2ª Ed.

- TORTORA, Gerard J., FUNKE, Berdell R. e CASE, Christine L. Roberta Marchiori Martins.
Microbiologia. Porto Alegre: Artmed, 2005.

- MERCK CHEMICALS Brazil. Disponível em: http://www.merck-chemicals.com.br/is-

bin/INTERSHOP.enfinity/WFS/Merck-BR-Site/pt_BR/. Acessado em: 15 de maio de 2010.