Diagnóstico Sorológico II

Profª Msc. Liliana Portal Weber

 Imunofluorescência

Baseia-se na capacidade de as moléculas de Ac

se ligarem covalentemente a fluorocromos,
mantendo especificidade contra o Ag
Fluorocromo mais utilizado: Isotiocianato de
Fluorsceína
A leitura é feita em microscópio:
Fonte de luz de alta intensidade
Filtros de excitação
Filtros-barreira
 Imunofluorescência

Imunofluorescência Direta:
Baseia-se na localização do Ag em células
ou tecidos através de Ac específico marcado
com fluorocromo (conjugado)
Há necessidade de um conjugado para cada
Ag
Tem grande sensibilidade e especificidade
Vírus respiratórios (Influenza A e B), herpes
vírus, CMV, varicela-zoster, Chlamydia
trachomatis, etc
 Imunofluorescência

Imunofluorescência Indireta:
Baseia-se na utilização de um Ac
antiimunoglobulina marcado pelo fluorocromo
cujo o objetivo é detectar o anticorpo
Vantagens e desvantagens relacionadas à
IFD:
Vantagens: maior sensibilidade, utilização do
mesmo conjugado para vários sistemas
Desvantagens: menor especificidade, mais
demorado, maior número de reagentes
Imunofluorescência Direta
Imunofluorescência Indireta
 Técnicas com
Marcadores Radioativos
Radioimunoensaio:
É um dos métodos mais sensíveis para análise
quantitativa das reações Ag-Ac
Permite medidas rápidas e precisas
Apresenta limiar de detecção na ordem de
nanogramas ou picogramas
Limitações: custo do teste, a vida média dos
reagentes e o risco operacional
Radioisótopos utilizados: 125I e 131I
 Técnicas com
Marcadores Radioativos
Radioimunoensaio (RIE): A quantidade de Ac na fase sólida
é limitada, sendo um reagente proporcional, e o Ag fica em
excesso;.
Imunorradiométrico (IRMA): O Ac deve estar em excesso
na fase sólida. Técnica “sanduíche “ou Duplo Ac
A medida: contagem radioativa dependente do tipo de
radiação emitida (alfa ou gama)
Comparado ao RIE de Competição , o IRMA tem tempos de
incubação menores, maior precisão e, teoricamente, maior
sensibilidade
 Radioimunoensaio

Compreende três estágios:

Construção de curva de calibração
Interpolação dos resultados
Controle de qualidade
Radioimunoensaio
Técnicas Imunoenzimáticas

São técnicas que permitem medidas

quantitativas diretas da interação Ag-Ac
A medida é feita através da atividade
enzimática sobre um substrato;
Tem substituído o RIE pela:
– sensibilidade comparável
– reagentes estáveis
– grande aplicabilidade sem exposição dos técnicos
aos radioisótopos
 Enzimaimunoensaio

Homogêneo:
Não necessita separação entre os complexos Ag-Ac e Ag
e/ou Ac livres
São mais utilizados para detecção de haptenos
Enzimas mais utilizadas: peroxidase e fosfatase alcalina
Heterogêneo:
A separação é necessária
Utilizados para detecção de partículas maiores
As enzimas mais utilizadas: peroxidase, fosfatase
alcalina; Β-galactosidase, glicose oxidase, glucoamilase,
anidrase carbônica e acetilcolinesterase
 Ensaio Imunoabsorvente
Ligado a Enzima (ELISA)
Baseia-se na imobilização de um dos reagentes em fase
sólida, enquanto outro reagente pode ser ligado a uma
enzima com preservação tanto da atividade enzimática
quanto da imunológica;
Como o substrato forma um produto colorimétrico, a
alteração da cor é monitorada visualmente ou através de
espectrofotômetro;

É um teste empregado para detecção de Ag e Ac em

número muito grande de sistemas
 Ensaio Imunoabsorvente
Ligado a Enzima (ELISA)

Reagentes utilizados:
Suporte sólido Conjugados
Amostra Substratos cromogênicos
Diluente da amostra Antígenos
Anticorpos

Tipos de ELISA:
Competitivo e não competitivo
 Ensaio Imunoabsorvente
Ligado a Enzima (ELISA)

Ensaios para anticorpos:

a) Método indireto;
b) Método de captura para anticorpos IgM.

Ensaios para antígenos:

a) Método de captura;
b) Método de competição com antígeno marcado;
c) Método de competição com anticorpo marcado;
d) Método da inibição para haptenos.
Ensaios para Anticorpos
Princípios de Reações
Ensaios para Antígenos
Princípios de Reações
 Demais Metodologias...

Imunoeletrotransferência (Western Blot)

Quimioluminescência
Enzima com Substrato Quimioluminescente
Enzima com Substrato Fluorescente
(Fluoroimunoensaio)
– MEIA : Microparticle enzyme immunoassay, Abbott®;
– ELFA: Enzyme linked fluorescent assay, bioMérieux®;
– FEIA: Fluorornzymeimmunoassay, Pharmacia & Upjohn®;
Eletroquimioluminescência (ECLIA)
Turbidimetria e Nefelometria
Automação dos ensaios de
imunoprecipitação

– Nefelometria
Totalmente automatizada
Rápida e precisa
Fácil realização
Determinação de proteínas de interesse clínico (C3, C4,
Proteína C Reativa, Fator Reumatóide, ASLO, IgA, IgG
e IgM)
– Turbidimetria:
características semelhantes à Nefelometria
Ensaios Manuais x Automação

Fatores a serem considerados na utilização de técnicas

manuais, semi-automatizadas ou automatizadas:
Sensibilidade
Especificidade
Reprodutibilidade
Custo
Tipo de rotina do laboratório
Volume de amostras
O tempo dispensado nas análises
O tipo de sistema: aberto ou fechado
Compra de equipamentos, comodato
Automação em Imunoensaios

Principais Objetivos:
– Padronização do procedimento
– Redução do custo/ do trabalho técnico, de tempo de
processamento
– Aumento da produtividade
– Melhoria na precisão, repetitividade e reprodutibilidade
– Sensibilidade e Especificidade
– Faixa de medição (linearidade dos testes)
– Eliminação de erros:
– Utilização de tubo primário
– Código de barras
– Interfaceamento de resultados