Universidade dos Açores

Departamento de Ciências Agrárias

Trabalho nº 8

DOSEAMENTO DO AZOTO AMONIACAL NO LICOR DE RÚMEN

1. Introdução
A atividade proteolítica existente no rúmen deve-se à ação dos microrganismos aí
presentes e os valores ótimos de pH para esta proteólise situam-se entre 6 e 7.
A maior parte das proteínas da dieta é degradada em aminoácidos no rúmen por ação bacteriana.
Seguidamente estes aminoácidos são, em grande parte, desaminados originando amoníaco, ou em
menor proporção, incorporados diretamente em proteínas bacterianas.
Os produtos de degradação das proteínas por ação de microrganismos são o amoníaco, dióxido de
carbono e ácidos gordos voláteis. Contudo o amoníaco existente no rúmen não provém só da
desaminação de aminoácidos, mas também da redução dos nitratos e da hidrólise da ureia de
origem endógena e exógena.
A atividade da urease no licor de rúmen é muito elevada, de modo que a ureia que entra
é rapidamente hidrolisada em amoníaco e dióxido de carbono. Os nitratos também são rapidamente
reduzidos a amoníaco, passando por nitritos.
O amoníaco é o principal constituinte nitrogenado do licor de rúmen, a sua concentração
oscila de 5 a 25 mg de N-NH3/100 mL. Diversos são os fatores que influenciam a concentração
deste no rúmen: a quantidade e solubilidade das proteínas da dieta, a quantidade da ureia que entra
no rúmen, quer pela saliva, quer por difusão através da parede do rúmen, quer pela alimentação, o
conteúdo em polissacáridos facilmente digestíveis, o intervalo entre a ingestão e a taxa de absorção
de amónia a partir do rúmen.
Uma parte do amoníaco do conteúdo do rúmen é absorvida por simples difusão. No
entanto, a quantidade absorvida depende tanto da concentração de NH3 no conteúdo do rúmen
como do seu pH. Quando os valores de pH baixam, como por exemplo pela incorporação de grandes
quantidades de amido na ração, diminui a magnitude da absorção de amoníaco através do epitélio
do rúmen. A permeabilidade do epitélio ao amoníaco em níveis ácidos (pH 5.0 até 6.0) é apenas
cerca de dois terços da permeabilidade a pH neutro.
Demonstrou-se experimentalmente que o crescimento de um ruminante e a produção de
leite são possíveis com ureia (que é convertida em amoníaco) como fonte de azoto da dieta. Muitas
bactérias do rúmen possuem enzimas que lhes permitem sintetizar uma mistura completa de
aminoácidos, tornando-as capazes de crescer com o amoníaco como principal fonte de azoto.
Porém, algumas bactérias do rúmen necessitam de aminoácidos, produtos do metabolismo dos
aminoácidos e outros ácidos gordos de cadeia curta.
 A glutamato desidrogenase e a glutamino sintetase são as enzimas bacterianas mais
importantes para a fixação do amoníaco. Destas duas, a última é a que apresenta maior afinidade
para o amoníaco e assim é provável que seja a mais importante, mesmo quando os níveis de
amoníaco são baixos.
O doseamento do azoto amoniacal pelo método de Conway baseia-se na absorção, por
simples difusão gasosa, da substância volátil proveniente do compartimento exterior da célula de
Conway onde exerceu uma determinada tensão, pelo líquido do compartimento central à superfície
do qual a tensão é nula. Deste modo, as bases azotadas voláteis são extraídas por microdifusão,
por meio de uma solução de carbonato de potássio, recolhidas numa solução de ácido bórico e
tituladas com ácido sulfúrico.

2. Procedimento experimental
2.1. Material
Células de Conway de vidro Estufa a 40ºC
Pipetas (1, 2 mL) Bureta

2.2. Reagentes
Indicador: dissolver 33 mg de verde de bromocresol e 65 mg de vermelho de metilo em 100
ml de etanol a 95-96 % (v/v).
Solução de ácido bórico (1%): num balão aferido de 1 litro, dissolver 10 g de ácido bórico p.a.
em 200 ml de etanol a 95-96 % (v/v) e 700 ml de água. Juntar 10 ml de indicador. Misturar e, se
necessário, ajustar a coloração da solução a vermelho claro, por adição de uma solução de
hidróxido de sódio. 1 ml desta solução permite fixar, no máximo, 300 µg de NH3.
Solução de carbonato de potássio (50%): dissolver 50 g de carbonato de potássio p.a. em
100 ml de água em ebulição. Deixar arrefecer e filtrar.
Solução de oxalato de amónio: Pese 507,6 mg de oxalato de amónio para um balão de 500
mL, junte água e 5 mL de ácido sulfúrico concentrado. Complete o volume com água destilada.
Ácido sulfúrico 0,02 M

2.3. Procedimento

1. Unte os bordos esmerilados das placas de Conway com vaselina.

2. Introduza na célula (pequena placa de vidro) 2 mL de ácido bórico.

3. Pipete 1 a 2 mL (conforme a sua previsível riqueza em amoníaco) de licor de rúmen e coloque na

coroa circular exterior da placa.

4. Cubra parcialmente com a tampa com silicone.

5. Afaste a tampa (placa de vidro) entretanto colocada e introduza 1 mL da solução saturada de

carbonato de potássio em posição oposta àquela onde introduziu o licor de rúmen.
6. Cubra de imediato a placa de Conway fechando-a hermeticamente.

7. Agite suavemente a célula dando-lhe um movimento de rotação num plano horizontal, para
misturar os dois reagentes (licor de rúmen com a solução de carbonato de potássio).

8. Efetue um ensaio controlo utilizando o mesmo método na ausência de amostra a analisar,

substituindo o licor de rúmen por 1 mL da solução padrão de oxalato de amónio.

9. Coloque ambas as placas na estufa e deixe incubar durante 1 hora a 40 ºC.

10. Retire da estufa e titule as bases voláteis na solução de ácido bórico (célula interior) com ácido
sulfúrico 0,02 N, utilizando uma bureta.

11. Determine a quantidade de azoto amoniacal em miligramas de acordo com a seguinte equação:

V
𝑁 − 𝑁𝐻3 (𝑚𝑔) = T × 20 𝑝𝑜𝑟 100 𝑚𝐿
V0

Sendo:

V0– Volume de H2SO4 (0.02 M) gasto no ensaio controlo (padrão de oxalato de amónio)

VT– Volume de H2SO4 (0.02 M) gasto na amostra em estudo

12. Comente os resultados obtidos.

3. Bibliografia

Alemany, M. e Font, S. (1983) Praticas de Bioquímica. Editorial Alhambra, Madrid

Colaço, A.A., Monteiro, D.O. e Pinheiro, V.M.C. (1992) Guia de trabalhos práticos de fisiologia
animal, Licenciatura em Medicina Veterinária, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila
Real.

Conway, E.J. e Byrne, A. (1933) An absorption apparatus for the micro-determination of certain
volatile substances. I. The micro-determination of ammonia. Biochemical Journal, 27: 419-429.

Plummer, D.T. (1971) An Introduction to Pratical Biochemistry. McGraw Hill, London.