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NATAL-RN
2013
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NATAL-RN
2013
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Aos meus pais, exímios arqueiros da minha vida. Pelo eterno exemplo de dedicação,
AGRADECIMENTOS
A Deus, por tudo o que me foi dado, por estar sempre no controle da minha vida.
Aos meus pais, Noélia Lima e Aldo Lima, pela persistência em me educar e amar, pelos
ombros e ouvidos sempre amigos, pelo incentivo e apoio incondicionais.
Aos meus irmãos Breno Lima e Adam Lima, que tão bem me conhecem.
Aos amigos Sancha Vale e Roberto Silva, sempre presentes. Pela família de braços
abertos, pronta a nos acolher, pelas conversas e todas alegrias vividas e a serem vividas
juntos.
À Maria Cardoso pela doce amizade, por ter me proporcionado inesquecíveis momentos
que me impulsionaram na execução do trabalho.
À Profa Dra Selma Jerônimo pelo espaço de aprendizagem tão generosamente cedido.
Pela confiança e compreensão. Que as sementes plantadas em cada aluno orientado
cresçam, frutifiquem e sejam luz no caminho do ensino, da pesquisa e extensão
compromissados.
À Profa Dra Tatjana Keesen pelas aulas e sugestões tão valiosas para o desenvolvimento
desta pesquisa. Pela amizade e companhia, sempre disposta e generosa.
E por fim, mas mais importante, às crianças, que voluntariamente participaram deste
estudo. Que este trabalho possa de alguma forma contribuir para aqueles que sofrem
com o calazar.
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RESUMO
ABSTRACT
LISTA DE FIGURAS
Figura 11. Correlação entre o Retinol sérico e anticorpos (A) anti-rK39, (B)
anti-SLA, (C) proteína C reativa (D) AGP e (E) carga parasitária.
Análise realizada em todos os grupos estudados (n = 179)............ 83
Figura 14. (A) Frequência de monócitos CD14+ e sua produção de (B) IL-
10..................................................................................................... 90
Figura 16. Correlação negativa entre retinol sérico e produção de (A) IL-10
e (B) TGF-β1 em células T CD4+CD25highFoxp3+ após estímulo
93
com SLA.........................................................................................
Figura 17. Ciclo vicioso desnutrição – leishmaniose visceral e sua relação
com a resposta imune...................................................................... 107
10
LISTA DE TABELAS
LISTA DE QUADROS
Ac Anticorpo
AGP Alfa-1-glicoproteína ácida
APC Células apresentadoras de antígenos
ATRA Ácido all-trans retinóico
cAMP adenosina 3’,5’-monofosfato cíclico
CB Circunferência do braço
CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência
CMSP Células Mononucleadas de Sangue Periférico
ConA Concanavalina A
CR Receptor do complemento
CRP Proteína C-reativa
Ct Cycle threshold
DALY Anos potenciais de vida perdidos ajustados para incapacidade
DAT Teste de aglutinação direta
DTH Resposta de hipersensibilidade tardia
ELISA Ensaio imunoenzimático
ENDEF Estudo Nacional de Despesas Familiares
FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations
HIV Human immunodeficiency virus
HLA Complexo principal de histocompatibilidade
HPLC High pressure liquid chromatography
IDO Indolamina 2,3-dioxigenase
IFI Imunofluorescência indireta
IFN-γ Interferon-γ
Ig Imunoglobulina
IL interleucina
IMC Índice de massa corporal
IQ Distância interquartílica
iTreg T regulatórias induzidas
LAP Peptídeo de latência associado
LC Leishmaniose cutânea
LM Leishmaniose mucosa
LPG Lipofosfoglicano
LTBP Proteína ligadora de latência
LV Leishmaniose visceral
NO Óxido nítrico
OMS Organização Mundial da Saúde
PCR Reação em cadeia da polimerase
PGE2 Prostaglandina E2
PNDS Pesquisa Nacional de Demografia e Saúde da Criança e da
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Mulher
PNSN Pesquisa Nacional de Saúde e Nutrição
POF Pesquisa de Orçamentos Familiares
QI Quociente de inteligência
RA Ácido retinóico
RAR Receptor nucleico de ácido retinóico
RARE Elementos de resposta ao ácido retinóico
RBP Proteína transportadora de retinol
rK39 Proteína cinesina recombinante 39
ROI Intermediários reativos de oxigênio
ROR Receptor retinóide orphan
RXR Receptor X retinóide
SLA Antígenos solúveis de promastigotas de L. infantum
TGF-β Fator de transformação do crescimento-β
Th T helper
TNF Fator de necrose tumoral
Tr1 T regulatórias 1
Treg T regulatórias
14
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO………………………………………………………………………... 17
1.1.1 Epidemiologia..................................................................................................... 19
2. OBJETIVOS………………………………….………………………………………... 55
3. METODOLOGIA…………………………………………..………………………….. 56
4. RESULTADOS....................................…….…………………………………………... 73
5. DISCUSSÃO….………………………………………………………………………... 95
6. CONCLUSÃO………………………………………………………………………….. 108
7. REFERÊNCIAS……………………………………………………………………….. 109
8. ANEXO............................................................................................................................. 137
9. APÊNDICES.................................................................................................................... 138
1. INTRODUÇÃO
1.1.1 Epidemiologia
A infecção por L. infantum possui amplo espectro clínico que, após o estudo
realizado por Badaró et al.. (1986) em área endêmica da Bahia, pôde ser classificado
em: 1) Forma assintomática; 2) Forma subclínica, na qual as pessoas desenvolvem
hepatomegalia, esplenomegalia, tosse, diarréia e febre, podendo esta forma se resolver
espontaneamente ou evoluir para LV; e 3) LV clássica, caracterizada por
hepatoesplenomegalia (Figura 3), febre, caquexia, anorexia, anemia,
hipergamaglobulinemia, hipoalbuminemia, trombocitopenia e leucopenia, manifestada
principalmente por neutropenia e eosinopenia (BADARO et al., 1986; BRASIL,
2009a). No entanto, a maior parte dos infectados são assintomáticos, sendo a proporção
de infecção por L. infantum assintomática versus sintomática de 6 a 8:1 em crianças e
18:1 em adultos (BADARO et al., 1986; WILSON; JERONIMO; PEARSON, 2005).
24
utilização (BRASIL, 2006; GUERIN et al., 2002; OLLIARO et al., 2005). No entanto,
nos últimos anos, tem havido maior disponibilidade de formas lipossomais via acordo
das indústrias farmacêuticas com a Organização Mundial de Saúde, permitindo maior
acessibilidade (MCGWIRE; SATOSKAR, 2013).
No entanto, segundo discutido por Nylén & Sacks (2007), não parece haver um
defeito inerente na resposta Th1 de indivíduos com LV uma vez que indivíduos curados
são resistentes à novas infecções, tornam-se DTH+ e produzem IFN-γ em resposta ao
estímulo com antígenos de Leishmania (WHITE, Jr. et al., 1992). Além disso, as CMSP
de pacientes com LV respondem ao estímulo com PPD ou superantígeno (NYLEN et
al., 2007; SACKS et al., 1987). Ainda, estudos demonstraram em pacientes com LV
altas concentrações plasmáticas de IFN-γ (KARP et al., 1993; CALDAS et al., 2005), e
IL-12 p40 (CALDAS et al., 2005) e produção elevada de IFN-γ em ensaios de sangue
31
total estimulado com antígenos de Leishmania (GIDWANI et al., 2011; SINGH et al.,
2012).
células dendríticas produtoras de IL-10, que por sua vez induzem células T produtoras
de IL-10; 5) Aumento da morte celular induzida em células T; 6) Promoção da
sobrevivência de células B e indução de plasmócitos, que contribuem para a progressão
da LV. Em LV observa-se a mudança isotípica de imunoglobulina (Ig) G em IgG1 e
IgG3, que formam imunocomplexos. As células B podem ser uma fonte de IL-10 e os
anticorpos em imunocomplexos podem causar dano tecidual. Os imunocomplexos
induzem ainda macrófagos a produzir IL-10 e citocinas inflamatórias como a IL-6 e
TNF-α, o que por sua vez promove a geração de mais imunocomplexos e mais IL-10
(BOGDAN; GESSNER; ROLLINGHOFF, 1993; KANE; MOSSER, 2001; MILES et
al., 2005; NYLEN; SACKS, 2007). Apesar de se conhecerem vários dos mecanismos
imunossupressores da IL-10, as fontes produtoras dessa citocina durante a LV, além de
macrófagos, ainda não estão claramente definidas.
No entanto, verificou-se que outras células com função regulatória podiam não
apresentar CD25 e/ou Foxp3. Além disso, o CD25 e Foxp3 mostraram-se não
suficientes para a caracterização das células Treg: Estudos em sangue periférico de
humanos demonstraram que até 30% das células T CD4+ também apresentavam-se
como células CD25+. Nesses estudos apenas 1-2% das células com a maior expressão de
CD25 (CD25high) eram funcionalmente supressoras e podiam ser consideradas Treg
(ALLAN et al., 2007; BAECHER-ALLAN et al., 2001). Assim, o CD25, que é o
receptor α para IL-2, necessária para ativação de células T, passou a ser considerado
insuficiente para o isolamento e estudo de células Treg, uma vez que sua expressão
também está relacionada com ativação celular. Em relação ao Foxp3, estudos também
demonstraram que sua expressão pode ocorrer transitoriamente em T CD4+ ativadas, e
que o padrão de metilação de seu gene influencia na ação supressora de células Treg
Foxp3+. Células T Foxp3+ com ação supressora apresentam o gene Foxp3
34
Dessa forma, ainda não existem marcadores definitivos para as células Treg,
especialmente para as induzidas, das quais pouco se conhece (CHEN; OPPENHEIM,
2011; GRATZ; ROSENBLUM ; ABBAS, 2013). Dentre os marcadores mais estudados
estão o antígeno citotóxico T-linfocitário 4 (CTLA-4) e a proteína receptora de TNF
induzida por glicocorticoide (GITR), ambas com boa correlação com a expressão de
Foxp3 e CD25 (YAGI et al., 2004). A expressão de CD45RA e CD45RO vem sendo
utilizada para a marcação de células Treg naive e efetoras, respectivamente. No entanto,
estes marcadores também não são exclusivos de células Treg, podendo ser expressos em
células T CD4+ efetoras. Assim, a maioria dos estudos ainda utiliza as combinações de
CD4, CD25 e Foxp3 para o estudo das células Treg (GRATZ; ROSENBLUM; ABBAS,
2013). O Quadro 1 demonstra os principais marcadores utilizados para células Treg.
Existem diversas vias conhecidas de ação das Treg durante infecções, sendo as
principais resumidas na Figura 4. As células nTreg podem limitar as respostas Th1 e
Th2 indiretamente, através da modulação da função de células apresentadoras de
antígenos (APC) ou diretamente, por contato direto com as células T CD4+. A regulação
indireta envolve a liberação de IL-10, TGF-β e adenosina. Ainda, a interação das APC
com o CTLA4 na membrana das nTreg induz a produção da enzima indolamina 2,3-
dioxigenase (IDO) pelas APC, o que leva a degradação de triptofano. Esta redução no
triptofano está associada com inibição da ativação de linfócitos T e promoção da
apoptose dos linfócitos T. A regulação direta das células T pelas nTreg envolve a
produção de adenosina 3’,5’-monofosfato cíclico (cAMP). As Treg também induzem a
formação de células Tr1 via IL-10, por meio da produção de IDO pelas APC. As células
Tr1 por sua vez podem limitar as respostas Th1 e Th2 durante infecções pela produção
de IL-10 e/ou TGF-β.
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Macadores Função/comentários
1-2% das células CD4 CD25+ com maior expressão de CD25 (CD25high) é
+
CD25high funcionalmente supressora. O uso isolado desse marcador não é indicado para o
isolamento e avaliação de Treg.
Sua expressão é necessária, mas não suficiente para a caracterização de células Treg.
Foxp3+
Células T efetoras quando ativadas podem expressar Foxp3 transitoriamente.
Figura 4. Vias de ação de células Treg durante infecções (adaptado BELKAID, 2007).
O TGF-β é também considerada uma importante citocina para a LV. Gantt et al.
(2003) verificaram aumento da forma livre (ativa) do TGF-β em aspirados de medula de
indivíduos com LV e em culturas de macrófagos infectados. Esta forma de TGF-β
prolongou a sobrevivência do parasita em macrófagos. Barral-Netto et al. (1992) em seu
37
estudo verificaram que o TGF-β foi uma citocina que inibiu a ação de macrófagos
contra a infecção por Leishmania tanto in vitro como in vivo.
O TGF-β é uma proteína liberada das células ligada de forma não covalente a
um peptídeo de latência associado (LAP). No meio extracelular este complexo se une a
uma proteína ligadora de latência (LTBP), sendo o complexo armazenado na matriz
extracelular. Para a ação do TGF-β, este precisa ser liberado destes peptídeos e isto é
realizado através de meios físicoquímicos ou por meio de enzimas que agem na LAP ou
LTBP (GANTT et al., 2003).
Em LV ainda são poucos os estudos que procuraram estudar o papel das Treg
durante a infecção e doença (NYLEN et al., 2007; RAI et al., 2012; RODRIGUES et
al., 2009). Nylen et al. (2007) em estudo com LV humana verificaram que células
CD4+CD25−Foxp3− são as principais células responsáveis pela elevação do mRNA de
IL-10 no baço. Ao contrário, Rai et al. (2012) demonstraram em seu estudo também em
LV humana um aumento da quantidade de células CD4+CD25+Foxp3+ produtoras de IL-
10 na medula e argumentam que possivelmente essas seriam as células responsáveis
pela supressão da resposta efetora de células T observada durante a LV.
sangue periférico humano foram capazes de produzir tanto IL-17 quanto agir de maneira
supressora, a depender do estímulo realizado (BERIOU et al., 2009; SAKAGUCHI et
al., 2010). No entanto, poucos estudos foram realizados buscando compreender o papel
da IL-17 na LV. Pitta et al. (2009) verificaram na Índia que CMSP de indivíduos com
infecção assintomática produziam mais IL-17 após estímulo com Leishmania, sugerindo
que esta citocina estaria associada com proteção contra a infecção.
Quadro 2. Principais estudos envolvendo outras leishmanioses que encontraram associação da doença com células Treg.
Parasita Hospedeiro Células estudadas Principais achados envolvendo a resposta T regulatória Referência
CD4+CD25+ (a maioria
L. braziliensis Humano Produção de IL-10 por células Treg nas lesões (SALHI et al., 2008)
Foxp3+)
Alta expressão de Foxp3 nas lesões esteve relacionada com falha (BOURREAU et al.,
L. guyanensis Humano mRNA de Foxp3 nas lesões terapêutica 2009b)
Com o passar dos anos, o ciclo vicioso sinérgico mostrou-se de maior relevância
para a saúde (KEUSCH, 2003). Diversos estudos demonstraram que a desnutrição
causa alterações tanto na resposta imune inata quanto adaptativa, que levam a uma
maior susceptibilidade para infecções (MCMURRAY, 1981; MCMURRAY;
WATSON; REYES, 1981; NAJERA et al., 2004). Uma das alterações mais
evidenciadas na literatura é a involução do timo, tanto estruturalmente quanto
funcionalmente, levando a uma resposta reduzida de células T (CHANDRA, 1974;
KEUSCH et al., 1987; NAJERA et al., 2004; SAVINO, 2002). Todos os componentes
do complemento (exceto o C4) apresentam-se diminuídos em pacientes desnutridos,
42
Por sua vez, as infecções cursam com resposta inflamatória (produção de IL-1,
IL-6, TNF-α, prostaglandina E2 – PGE2), que leva ao aumento das necessidades
nutricionais (pela febre, formação de proteínas de fase aguda e catabolismo), anorexia e
alteração da absorção intestinal, agravando o quadro de desnutrição (BLOSSNER; DE
ONIS, 2013; GUERRANT et al., 2013). A Figura 5 resume o ciclo vicioso desnutrição-
infecção e sua relação com a resposta imune.
Para se ter uma ideia, de acordo com relatório da Food and Agriculture
Organization of the United Nations – FAO (FAO, 2012), 868 milhões de pessoas ainda
sofrem com a desnutrição e os efeitos negativos da deficiência de micronutrientes afetam
cerca de 2 bilhões de pessoas. Ainda segundo o documento, mais de 100 milhões de
crianças menores de 5 anos apresentam baixo peso, sendo a desnutrição a causa de morte de
mais de 2,5 milhões de crianças por ano.
braço e área muscular do braço que correspondia a 66% e 81% das áreas de seus
familiares sadios (n = 30), pareados por sexo e idade, que viviam na mesma casa. O
estudo encontrou diferenças ainda maiores quando comparou as crianças que
apresentaram LV aos vizinhos sadios (n = 30), pareados por sexo e idade, encontrando
área gordurosa do braço e área muscular do braço correspondentes a 41% e 75% das
áreas encontradas para os vizinhos sadios.
Estudo realizado pelo nosso grupo demonstrou não só que crianças com LV (n =
20) apresentavam menor IMC/idade quando comparadas aos controles sadios (n = 129),
mas também que o maior tempo de amamentação e a maior idade estavam associadas
com a infecção assintomática, sendo essas consideradas variáveis de proteção contra a
LV. Outro modelo de regressão logística multivariada realizado no mesmo trabalho
46
demonstrou que a baixa albumina e menor peso ao nascer mostraram-se como fatores de
risco para o desenvolvimento de LV (MACIEL et al., 2008).
Apesar dos estudos acima citados, existe ainda lacuna no que tange à
compreensão das bases moleculares e imunológicas da associação do estado nutricional
com a resposta à Leishmania. Isso porque os estudos em humanos, em sua maioria,
limitam-se a avaliar o estado nutricional por meio de avaliação antropométrica e
bioquímica (medida das concentrações de proteínas totais, albumina, hematócrito e
hemoglobina), associando estas variáveis com os conhecidos fenótipos de resposta à
infecção por Leishmania. Não se sabe ao certo se a desnutrição observada na LV está
associada com a resposta imune/inflamatória e/ou com carga parasitária frente à
infecção pelo parasita. Esta lacuna nos levou a hipotetizar que o estado nutricional
comprometido durante a LV pode estar correlacionado com a resposta
imune/inflamatória montada pelo infectado e não necessariamente com a carga
parasitária. Além disso, a avaliação da carência de micronutrientes específicos é ainda
cara, restrita aos grandes centros de pesquisa, e complicada pela própria infecção, que
pode alterar a distribuição e metabolismo de nutrientes (PRASAD et al., 1997;
THURNHAM et al., 2003), o que leva a uma visão parcial do processo de depleção do
estado nutricional durante a doença.
resposta imune inata, o que não é realizado pela maioria dos estudos que procura
estudar variáveis nutricionais associadas com a LV.
dehidrogenases a retinal, que por sua vez é oxidado por retinal dehidrogenases a ácido
retinóico – RA (BLOMHOFF; BLOMHOFF, 2006). O ácido retinóico pode ser gerado
em múltiplas isoformas, no entanto, a forma all-trans (ácido all-trans retinóico –
ATRA) é a predominante na maioria dos tecidos (HALL et al., 2011; MIC et al., 2003).
Estudos ao longo dos anos têm demonstrado que a vitamina A apresenta ação
pleiotrópica, desde a função visual, organogênese, metabolismo até a resposta imune
(CIN-PEREZ et al., 2010; HALL et al., 2011). O seu efeito protetor contra doenças
infecciosas foi verificado em diversos estudos de suplementação em crianças, os quais
demonstraram redução da morbidade por diarreia (RAHMAN et al., 2001), pneumonia
e sarampo (COUTSOUDIS et al., 1992; COUTSOUDIS; BROUGHTON;
COOVADIA, 1991; FAWZI et al., 1993). Este efeito foi reforçado por dados que
demonstraram que a suplementação de vitamina A em crianças após os 6 meses de
idade e menores de 5 anos de populações com deficiência pode reduzir a mortalidade
em torno de 23-30% (GLASZIOU; MACKERRAS, 1993; WORLD HEALTH
ORGANIZATION, 1998; WORLD HEALTH ORGANIZATION; UNICEF, 1997).
Ainda, nos últimos anos, tem sido reconhecido que o RA é um dos fatores
críticos que promovem a diferenciação de células iTreg pela indução da expressão de
Foxp3. Na presença de TGF-β, RA e baixas concentrações de IL-6, a indução do Foxp3
nas células iTreg é favorecida (BENSON et al., 2007; MUCIDA et al., 2007;
NOLTING et al., 2009). Esta ação é atualmente aceita como uma dos mecanismos mais
importantes de indução de tolerância oral, uma vez que grande parte dessas células é
induzida na mucosa intestinal (HALL et al., 2011). Ainda, o Foxp3 pode ligar-se
diretamente ao RORγt e RORα, inibindo sua atividade transcricional, o que explica
parte do efeito inibidor do RA na indução de Th17 e o fato de as respostas iTreg e Th17
parecerem opostas (MUCIDA; SALEK-ARDAKANI, 2009).
Estes dados nos levaram a hipotetizar que o estado de vitamina A está associado
com a resposta à infecção por Leishmania. Ainda, acreditamos que o ácido all-trans
retinóico pode modular a resposta à infecção por L. infatum em células
CD4+CD25highFoxp3+, CD4+CD25-Foxp3- e monócitos, que são importantes células
para a resposta frente à infecção por Leishmania.
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2. OBJETIVOS
3. METODOLOGIA
A faixa etária de crianças foi escolhida para o desenvolvimento deste estudo por
ser classicamente a mais susceptível à infecção por Leishmania na ausência de
imunossupressão e pela população de crianças ser uma das populações-alvo para
suplementação de vitamina A segundo o protocolo da OMS.
A população estudada foi composta por crianças que apresentaram LV, assim
como seus irmãos sadios. Os indivíduos participantes no estudo foram recrutados a
partir dos casos de LV internados na enfermaria do Hospital Infantil Varela Santiago e
Hospital Giselda Trigueiro em Natal-RN. A resposta fenotípica à infecção por
Leishmania foi determinada pelo teste de hipersensibilidade tardia (ou teste cutâneo de
Montenegro) e ELISA para anticorpos contra rk39 e extrato solúvel de Leishmania
(SLA), segundo metodologia descrita nos itens 3.3.3 e 3.3.4 adiante. Conforme a
resposta fenotípica à infecção, as crianças estudadas foram divididas nos seguintes
grupos:
Para cada indivíduo, foram coletados cerca de 15mL de sangue para realização
das seguintes dosagens: hemograma, proteínas totais, albumina, globulinas, ELISA para
anticorpo anti-SLA e rK39, retinol sérico, proteína C-reativa, α-1-glicoproteína ácida, e
extração de DNA. Foi aplicado um questionário semi-estruturado para coleta de dados
sócio-econômicos e investigação da história de amamentação, peso ao nascer, presença
de co-morbidades, tempo de tratamento para a LV (no caso de crianças com história da
doença) e uso de medicação e/ou suplementos nutricionais (Apêndices 1 e 2).
medida pelo método de Lowry (1951). O antígeno foi titulado usando células
mononucleares de sangue periférico de pacientes infectados com L. infantum.
Para coleta dos dados antropométricos, foi utilizada balança digital marca
Plenna® com capacidade para 150Kg, sensibilidade de 100g e estadiômetro portátil
marca Invicta Education® com capacidade para 2m e sensibilidade de 0,1cm. Para
crianças menores de 2 anos, o comprimento foi aferido utilizando antropômetro com
capacidade para 120cm e sensibiliade de 0,1cm. A estatura/comprimento foi aferida
duas vezes, com erro padrão permitido de ± 0,5cm. Foi utilizado um questionário para
coleta dos dados na enfermaria e campo (Apêndices 3 e 4).
Em 80% das amostras, antes da desnaturação com etanol 95%, foi acrescentado
padrão interno de retinol acetato em uma concentração que conferisse após a
reconstituição 1µg/mL. Este procedimento foi realizado de forma a se manter o controle
da eficiência das extrações (TANUMIHARDJO et al., 1996). A Figura 7 mostra o
fluxograma das extrações das amostras.
400µL soro
Vortex 30 segundos
Adição de 500µL de
Hexano
Vortex 1 minuto
+ 2 vezes
Aplicação no HPLC
(50µL)
A fase móvel foi composta de 100% metanol grau HPLC. Foi utilizado looping
de 50µL, e o fluxo de 1mL/min. O comprimento de onda para detecção foi de 325nm.
Foi utilizada coluna Microsorb MVTM, C18 (fase reversa), 4,6 x 150mm, com poro de
100 Å e pré-coluna MPLC® NewGuard®Holder complete C18 (fase reversa), 3,2 x
15mm, sendo utilizado cromatógrafo da marca SHIMADZU, constituído de duas
64
Assim, estas duas proteínas foram utilizadas para a avaliação da resposta de fase
aguda, por meio de teste imunoturbidimétrico. Os pontos de corte utilizados para
proteína C-reativa e AGP foram de 5mg/dL e 100mg/dL, respectivamente
(THURNHAM et al., 2003). Foram utilizados os kits CRP/AUT-000 BioSys® e
AGP/AUT-000 BioSys®, respectivamente.
O DNA total foi extraído por salting out (MILLER; DYKES; POLESKY, 1988),
sendo colocados 80ng de DNA por poço, amplificado pela PCR com os iniciadores a
3,75µM e sonda de detecção marcada com FAM a 2,5µM para kDNA de Leishmania
infantum. Os demais reagentes foram fornecidos em solução 2X concentrada,
denominada master mix, contendo dNTPs, enzima AmpliTaq Gold® DNA polimerase,
uma referência passiva e tampão de reação Gold PCR (Applied Biosystems, Foster City,
CA, EUA). Foi utilizado um volume final de 10µL por reação em triplicata. Para cada
placa, foram inseridos, em triplicata, controles negativo e positivo, com carga
parasitária conhecida de L. infantum.
Tamanho
Gene/sonda Iniciador Sequência do
produto
kDNA Foward CTTTTCTGGTCCTCCGGGTAGG
kDNA RV Reverse CCACCCGGCCCTATTTTACACCAA
140 pb
Taqman®probe5’F
- TTTTCGCAGAACGCCCCTACCCGC
AM/3’TAMRA
A eficiência das reações (E) foi calculada através da seguinte fórmula: E = 10-1/á
– 1 x 100, onde á é a inclinação da curva (PFAFFL, 2001). Foram considerados valores
de boa eficiência os próximos a -3,3 (LIVAK; SCHMITTGEN, 2001; PFAFFL, 2001).
Cinco diferentes condições foram utilizadas nas culturas: meio, SLA (10µg/mL)
(NYLEN et al., 2007; SINGH et al., 2012), ATRA (0,25nM), SLA (10µg/mL) + ATRA
(0,25nM) e Concanavalina A – ConA (10µg/mL) (NYLEN et al., 2007; SINGH et al.,
2012). O SLA foi obtido conforme metodologia descrita no item 3.3.2.2.
A
TGF-β1 em
CD4+CD25High CD4+CD25HighFoxp3+
em P1
SSC
Foxp3+ em
CD4+CD25High
FSC
B
IL-17 em CD4-
CD25- Foxp3-
CD4-CD25-
em P1
CD25 PE-Cy7
SSC
Foxp3- em
CD4-CD25-
FSC
CD4 APC-Cy7
IL-10 em CD14+
CD14+ em
SSC
P2
FSC
4. RESULTADOS
Sexo n (%)
Tabela 2. Distribuição dos grupos estudados de acordo com tamanho da enduração ao teste cutâneo de Montenegro, presença de anticorpos anti-
Leishmania e carga parasitária.
Tabela 4. Distribuição dos grupos estudados segundo escore z médios para IMC/Idade.
Total DTH-/Ac- DTH+ História de LV ativa
LV
Indicador
p valor
(n = 179) (n = 71) (n = 44) (n = 33) (n = 31)
antropomético
(escores z) Média ± dp Média ± dp Média ± dp Média ± dp Média ± dp
IMC/Idade -0,29 ± 1,07 0,05 ± 0,92 -0,36 ± 0,79 -0,29 ± 1,11 -1,04 ± 1,39 < 0,0005*
*Pós-teste de Tukey indicou diferença significativa entre o grupo LV ativa e demais grupos. Dados
referentes a 2006-2008 foram publicados no trabalho de Maciel et al. (2008).
Quanto ao IMC/Idade para crianças de até 5 anos (Tabela 6), observou-se que a
maioria das crianças (63,9%) apresentou risco de sobrepeso. Apesar de não ter sido
observada diferença significativa entre os grupos estudados (Qui-quadrado, p = 0,270),
apenas no grupo de crianças com LV ativa foi observado percentual de crianças com
magreza acentuada (5,3%) e magreza (15,8%).
DTH-/Ac-
40 DTH+
Anova, p = 0,006
História de LV
Retinol sérico ( g/dL)
LV ativa
30
*
20
10
A 5.0
Pearson, r = -0.303, p < 0.0001 B 5.0
Pearson, r = -0.143, p = 0.061
IM C/Idade (escores z)
IM C/Idade (scores z)
2.5 2.5
0.0 0.0
-2.5 -2.5
-5.0 -5.0
0 1 2 3 0 1 2 3
rK39 OD (405nm) SLA OD (405nm)
C 5.0 D 5.0
Pearson, r = -0.331, p < 0.0001 Pearson, r = -0.231, p = 0.006
IM C/idade (escores z)
IM C/Idade (escores z)
2.5 2.5
0.0 0.0
-2.5 -2.5
-5.0 -5.0
0 2 4 6 8 10 30 60 90 120 150 180 210
Proteína C reativa (mg/dL) AGP (mg/dL)
E
5.0
Pearson, r = 0.083, p = 0.373
IM C/idade (escores z)
2.5
0.0
-2.5
-5.0
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 100 200 300
Carga parasitária (promastigotas/80ng de DNA)
Figura 10. Correlação entre o IMC/Idade e anticorpos (A) anti-rK39, (B) anti-SLA, (C)
proteína C reativa (D) AGP e (E) carga parasitária. Análise realizada em todos os
grupos estudados (n = 179).
83
A 70 B 70
Pearson, r = -0.175, p = 0.025 Pearson, r = -0.167, p = 0.032
60 60
Retinol sérico ( g/dL)
40 40
30 30
20 20
10 10
0 0
0 1 2 3 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
rK39 OD (405nm) SLA OD (405nm)
C 70
D
70
Pearson, r = -0.030, p = 0.719 Pearson, r = -0.300, p = 0.002
60 60
Retinol sérico ( g/dL)
40 40
30 30
20 20
10 10
0 0
0 2 4 6 8 10 30 60 90 120 150 180 210
Proteína C reativa (mg/dL) AGP (mg/dL)
E 70
Pearson, r = -0.086, p = 0.356
60
Retinol sérico ( g/dL)
50
40
30
20
10
0
0.0 0.5 1.0 100 200 300
Carga parasitária (promastigotas/80ng de DNA)
Figura 11. Correlação entre o Retinol sérico e anticorpos (A) anti-rK39, (B) anti-SLA,
(C) proteína C reativa (D) AGP e (E) carga parasitária. Análise realizada em todos os
grupos estudados (n = 179).
84
quando comparados aos controles endêmicos: Após estímulo com SLA, os pacientes
aumentaram significativamente a produção de IL-10, enquanto que nos controles
endêmicos isso não é observado (Figura 12-B). O ATRA aumentou significativamente a
produção de IL-10 nos controles endêmicos, o que não é observado nos pacientes com
LV (Figura 12-B). No entanto, o uso de ATRA juntamente com SLA impediu o
aumento na produção de IL-10 observado quando se estimula as células de crianças com
LV com SLA (Figura 12-B). Interessantemente, nos controles endêmicos, o uso de
ATRA + SLA estimulou a produção de IL-10. Similarmente, o ATRA induziu
significativamente a produção de TGF-β1 em células T CD4+CD25highFoxp3+ dos
controles endêmicos (Wilcoxon, p = 0.037), mas não em crianças com LV (Figura 12-
C).
*
A * B
*
* **
50 * **
* Controles endêmicos (DTH-/Ac-)
* 30 *
% CD4+CD25highFoxp3+
40 Pacientes com LV
20
10
10
0 0
Meio SLA ATRA SLA + ATRA ConA Meio SLA ATRA SLA + ATRA ConA
C * D
40 * * 30
% TGF-1 em CD4 +CD25 highFoxp3 +
20
10
10
0 0
Meio SLA ATRA SLA + ATRA ConA Meio SLA ATRA SLA + ATRA ConA
Figura 12. (A) Frequência de células T CD4+CD25highFoxp3+ e sua produção de (A) IL-10, (B) TGF-β1 e (C) IL-17 após as diferentes condições
testadas. Os gráficos são referentes à n = 16 controles endêmicos e n = 10 pacientes com LV ativa. Barras representam mediana e distância
interquartílica.* p < 0,05; ** p < 0,01.
87
Também foi avaliada a produção de IL-10 nos monócitos CD14+ (Figura 14-B).
Os pacientes com LV produziram quantidades significativamente maiores de IL-10
nessas células após o estímulo com SLA quando comparados ao meio (Wilcoxon, p =
0.023) e aos controles endêmicos (Mann-Whitney, p = 0.002). Similarmente, assim
como nas demais células estudadas, o ATRA aumentou significativamente a produção
de IL-10 em monócitos de controles endêmicos, mas não em crianças com LV.
Novamente, o uso de ATRA + SLA nas crianças com LV impediu o aumento de IL-10
observado após o estímulo com SLA (Figura 14-B). No entanto, nos controles
endêmicos, o uso de ATRA + SLA estimulou a produção de IL-10.
A B
100 **
**
Controles endêmicos (DTH-/Ac-)
80 3.5 *
Pacientes com LV
2.0
40
1.5
20 1.0
0.5
0
0.0
M edium SLA ATRA SLA + ATRA ConA M eio SLA ATRA SLA + ATRA ConA
C
D
*
3.5 * 3.5
%TGF-1 em CD4 +CD25 -Foxp3-
1.5 1.5
1.0 1.0
0.5 0.5
0.0 0.0
M eio SLA ATRA SLA + ATRA ConA M eio SLA ATRA SLA + ATRA ConA
Figura 13. (A) Frequência de células T CD4+CD25-Foxp3- e sua produção de (B) IL-10, (C) TGF-β1 e (D) IL-17 após as diferentes condições
testadas. Os gráficos são referentes à n = 16 controles endêmicos e n = 10 pacientes com LV ativa. Barras representam mediana e distância
interquartílica.* p < 0,05; ** p < 0,01.
90
**
100 Controles endêmicos (DTH-/Ac-)
** * ** * Pacientes com LV
80
% Monócitos CD14 +
60
40
20
0
Medium SLA ATRA SLA + ATRA ConA
*
*
*
B *
15
*
**
% IL-10 em CD14 +
10
0
Meio SLA ATRA SLA + ATRA ConA
Figura 14. (A) Frequência de monócitos CD14+ e sua produção de (B) IL-10. Os
gráficos são referentes à n = 16 controles endêmicos e n = 10 pacientes com LV ativa.
Barras representam mediana e distância interquartílica.* p < 0,05; ** p < 0,01.
91
Conforme pode ser observado na Figura 15, foi observada correlação positiva
significativa entre o IMC/Idade e a produção de IL-17 nas células T
CD4+CD25highFoxp3+ (r = 0,485, p = 0,019). Para as demais citocinas e tipos celulares
não foi encontrada correlação significativa, conforme pode ser observado na Tabela 10.
45
Sperm an, r 2 = 0,485
% IL-17 em CD4+CD25highFoxp3+
p = 0,019
30
15
0
-2.5 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
IMC/idade (escores z)
Tabela 10. Correlação entre o IMC/Idade e a produção de citocinas após estímulo com
SLA nas células T CD4+CD25highFoxp3+, T CD4+CD25-Foxp3- e monócitos CD14+.
IMC/Idade
Coeficiente de Spearman
p valor
Citocinas/Tipo celular (r2)
IL-10 em céls. T CD4+CD25highFoxp3+ 0,161 0,462
TGF-β em céls. T CD4+CD25highFoxp3+ 0,397 0,161
IL-10 em céls. T CD4+CD25-Foxp3- 0,057 0,797
+ - -
TGF-β em céls. T CD4 CD25 Foxp3 -0,111 0,615
IL-17 em céls. T CD4+CD25-Foxp3- 0,118 0,582
IL-10 em monócitos CD14+ -0,174 0,506
A 40
Sperm an, r 2 = -0,434
20
10
0
0 10 20 30 40 50
Retinol sérico ( g/dL)
B
50
% TGF-beta1 em CD4 +CD25 highFoxp3+
30
20
10
0
0 10 20 30 40 50
Retinol sérico ( g/dL)
Figura 16. Correlação negativa entre retinol sérico e produção de (A) IL-10 e (B) TGF-
β1 em células T CD4+CD25highFoxp3+ após estímulo com SLA. Análise realizada em n
= 16 controles endêmicos e n = 10 pacientes com LV ativa.
94
Tabela 11. Correlação entre o Retinol sérico e a produção de citocinas após estímulo
com SLA nas células T CD4+CD25highFoxp3+, T CD4+CD25-Foxp3- e monócitos
CD14+.
Retinol sérico
Coeficiente de Spearman
p valor
Citocinas/Tipo celular (r2)
IL-17 em céls. T CD4+CD25highFoxp3+ -0,089 0,693
IL-10 em céls. T CD4+CD25-Foxp3- 0,255 0,253
TGF-β em céls. T CD4+CD25-Foxp3- -0,291 0,189
IL-17 em céls. T CD4+CD25-Foxp3- 0,186 0,406
IL-10 em monócitos CD14+ 0,311 0,300
95
5. DISCUSSÃO
em cerca de 1/3 das crianças avaliadas, excedendo em mais de oito vezes a frequência
de déficit de peso. Ainda na POF, para menores de 5 anos estão disponíveis as
prevalências de baixa Altura/Idade, que foram de 6,3% em meninos e 5,7% em
meninas. Para crianças entre 5 e 9 anos de idade, o percentual de baixa Altura/Idade foi
de 6,8% (IBGE, 2010a).
Um ponto importante a ser discutido quanto aos dados de estado nutricional aqui
apresentados é o fato de 83% destes terem sidos coletados entre 2006-2008. Cabe
salientar que são poucos os grandes estudos de referência do estado nutricional de
crianças ou adolescentes realizados no Brasil, sendo escassos dados mais atuais
representativos. Além disso, nossos dados mais recentes, referentes aos coletados para o
99
Nos dados aqui apresentados, foi demonstrado que o estado nutricional, medido
tanto pelo IMC/Idade (Figura 10) quanto pelo retinol sérico (Figura 11) está
negativamente correlacionado com a produção dos anticorpos anti-Leishmania, anti-
SLA e anti-rK39, e as proteínas de fase aguda, proteína C-reativa e AGP, indicando que
quanto maior a produção dos anticorpos e proteínas de fase aguda, pior o estado
nutricional. Estes dados estão de acordo com os estudos que comprovam que a infecção
compromete significativamente o estado nutricional (BLOSSNER; DE ONIS, 2013;
GUERRANT et al., 2008; GUERRANT et al., 2013; SCRIMSHAW; TAYLOR ;
GORDON, 1968).
Foi interessante observar que a carga parasitária não esteve correlacionada com
o estado nutricional. Poderia ser levantada a hipótese de que isto foi observado uma vez
que a carga parasitária foi medida em sangue periférico e não nos locais onde há maior
presença do parasita, como medula, fígado e baço. No entanto, verificou-se que, mesmo
no sangue periférico, a carga parasitária foi significativamente maior em casos de LV
que em controles (Tabela 2). Assim, o dado de ausência de correlação entre a carga
parasitária e estado nutricional corrobora a hipótese de que a resposta imune e
inflamatória do hospedeiro frente à infecção por Leishmania e não a presença do
parasita em si é determinante para a depleção do estado nutricional observada em
pacientes com LV. Claramente, fatores imunogenétios estão associados com esta
resposta à infecção por Leishmania, o que já foi comprovado por diversos estudos
(FAKIOLA et al., 2013; JAMIESON et al., 2007; JERONIMO et al., 2007). No
entanto, o conhecimento dessas vias de regulação genéticas da resposta imune ainda não
foram suficientes para o estabelecimento de ações efetivas que promovam a resolução
da infecção de maneira assintomática e eficiente.
100
Neste estudo também foi analisada a produção de IL-17 em células Treg, uma
vez que foi demonstrado que estas células exibem plasticidade e podem produzir IL-17
103
Cabe ainda ressaltar que o efeito do ATRA em células parece ser dose-
dependente. Dawson et al. (2006) observaram que doses de 1, 10 e 100 nM em CMSP
apresentaram efeito significativamente maior no aumento da produção de IL-5, IL-4 e
redução da produção de IFN-γ, medida por meio de ELISA do sobrenadante da cultura.
Elias et al. (2008), em estudo utilizando citometria de fluxo, com células T esplênicas e
de linfonodos de camundongos, observaram que doses crescentes de ATRA, de 1 nM,
100 nM e 10 µM, diminuiram progressivamente a produção de IL-17 e doses de 10 pM,
10 nM e 10 µM aumentaram progressimente a expressão de Foxp3. Um ponto frágil na
análise destes estudos é que experimentos visando observar viabilidade ou morte celular
após a cultura com ATRA não foram demonstrados. No entanto, os dados indicam que,
possivelmente, o efeito do ATRA é linear, uma vez que não foi observada inversão em
sua ação com aumento das doses utilizadas em cultura.
Outra questão importante é que ainda são escassos na literatura dados que
permitam extrapolar as concentrações utilizadas em cultura para doses de
suplementação de vitamina A. Também, ainda não se sabe o efeito em termos
quantitativos dos suplementos de vitamina A recomendados pela OMS nas
concentrações séricas e intracelulares de ATRA, o que torna difícil a aplicação dos
estudos in vitro realizados com vitamina A.
104
No presente estudo, a produção de IFN-γ não foi avaliada uma vez que os dados
na literatura já demonstraram que as CMSP de pacientes com LV não possuem a
habilidade de produzir essa citocina frente ao estímulo com antígenos de Leishmania
(BACELLAR et al., 1996; CALDAS et al., 2005; CARVALHO et al., 1985), apesar de
ter sido encontrada elevada produção de IFN-γ em sangue total de pacientes com LV
(KARP et al., 1993; SINGH et al., 2012). Além disso, sabe-se que o ATRA inibe a
expressão do IFN-γ possivelmente por agir diretamente em seu promotor (CIPPITELLI
et al., 1996; DAWSON et al., 2006).
As células Th17 são células T CD4+ que foram inicialmente caracterizadas pela
produção de IL-17 (HARRINGTON et al., 2005; HARRINGTON et al., 2006). Esta
105
Assim, os resultados deste trabalho demonstram que, durante a LV, células Treg
e monócitos apresentam diferentes respostas frente a estímulos quando comparadas às
células de controles saudáveis, o que reforça que estas células apresentam papel
importante durante a doença. Além disso, observou-se que a vitamina A pode apresentar
duplo efeito na regulação da resposta imune: Promoção de resposta regulatória durante a
homeostase e modulação da produção de IL-10 durante a LV. Dessa forma, o uso de
vitamina A durante o tratamento da LV pode promover a recuperação; no entanto, mais
estudos são necessários. O estudo também demonstra a importância da manutenção do
estado nutricional adequado, visando promover a produção de IL-17 e manter em
106
concentrações adequadas a produção de IL-10 e TGF-β por células Treg, que podem
promover a persistência e replicação do parasita.
Figura 17. Ciclo vicioso desnutrição – leishmaniose visceral e sua relação com a
resposta imune.
108
6. CONCLUSÃO
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136
8. ANEXO
9. APÊNDICES
1. Amaral CT, Pontes NN, Maciel BL, Bezerra HSM, Triestea ANAB, Jeronimo
SMB, McGowan SE, Dantas VM. Vitamin A deficiency alters airway resistance in
children with acute upper respiratory infection. Pediatric Pulmonology, 48:481-489,
2013.
1. Maciel BL, Valverde JG, Rodrigues-Neto JF, Freire-Neto FP, Keesen T, Jeronimo
2. Lacerda HG, Monteiro GR, Queiroz PV, Pontes NN, Rodrigues-Neto JF, Maciel BL,
Queiroz JW, Pearson RD, Wilson ME, Jeronimo SMB. The natural history of
asymptomatic infection with the protozoan Leishmania infantum.
Artigo – short report a ser submetido à revista The American Journal of Tropical
Medicine and Hygiene, FI = 2,53 (em Anexo)
1. Maciel BL, Valverde JG, Lacerda HG, Jeronimo SMB. Nutritional status in human
visceral leishmaniasis is correlated to the immune and inflammatory response against
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Brazilian Society of Immunology, 2013, Natal, RN.
2. Maciel BL, Valverde JG, Rodrigues-Neto JF, Freire-Neto FP, Nascimento PP,
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3. Maciel BL, Valverde JG, Rodrigues-Neto JF, Freire-Neto FP, Nascimento PP,
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4. Lacerda HG, Maciel BL, Lima ID, Pontes NN, Pearson RD, Wilson ME, Jeronimo
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5. Maciel BL, Freire-Neto FP, Rodrigues-Neto JF, Keesen T, Jeronimo SMB. Vitamin
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6. Amaral CT, Pontes NN, Maciel BL, Triestea ANAB, Bezerra HSM, Jeronimo
SMB, McGowan SE, Dantas VM. Deficiência de vitamina A e resistência respiratória
em crianças após infecção de vias aéras superiores. In: 13o Congresso Brasileiro de
Pneumologia Pediátrica, 2011, Salvador.
7. Maciel BL, Lacerda HG, Queiroz JW, Pontes NN, McGowan SE, Jeronimo SMB.
Impact of Leishmania chagasi infection on nutritional status and development. In: 14th
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Biomedicine, 2010, Fortaleza-CE. Advanced Topics in Biomedicine, 2010.