Extração líquido-líquido em

sistema de duas fases aquosas

 Etapas da Purificação/Separação de Bioprodutos

1) Clarificação

2) Concentração/Purificação de Baixa resolução

3) Purificação de alta resolução

4) Tratamento final
??

Sistema de duas
fases aquosas
Fase aquosa + Solvente  purificação de antibióticos e ácidos
orgânicos há 60 anos!!

Proteínas altamente sensíveis à desnaturação, podem ser

purificadas em sistemas constituídos por duas fases aquosas
imiscíveis (SDFA) em decorrência de uma partição
diferenciada da molécula alvo e impurezas entre as fases
líquidas.

Alto teor de água (75 – 80% em massa) garante a manutenção

das propriedades biológicas das proteínas.
 As propriedades superficiais das proteínas são
fatores decisivos: massa molecular, carga elétrica e
hidrofobicidade

Acreditava-se não
ser suficiente

Produtos elevada pureza  SDFA não seria suficiente??

baixa resolução
 Atualmente:

Aplicada na substituição da separação por

processos cromatográficos

 Sistema de duas fases aquosas são sistemas bifásicos

constituídos de dois compostos hidrofílicos (geralmente dois
polímeros ou um polímero e um sal)

 Duas fases imiscíveis são formadas e uma extração líquido-líquido

é usada para a partição das fases
Fonte: Benavides et al. (2008)
 Duas soluções aquosas
imiscíveis;

 Molécula-alvo (P) apresenta

maior solubilidade na fase de
topo em relação à fase de fundo;

 Maior grau de pureza da

molécula-alvo se os
contaminantes apresentarem
solubilidade maior na fase de
fundo
 Tipos de sistemas formados por duas fases aquosas

 Sistemas formados pela reunião de determinados polímeros

com solutos de baixa massa molecular;

 Sistemas mais empregados:

 Polímero-polímero;
 Polímero-sal;
 Tipos de sistemas formados por duas fases aquosas

 Sistemas formados por polímero (polietilenoglicol - PEG) e um

sal (fosfato de potássio) são intensamente empregados:

 rápida separação das fases;

 baixo custo;
 elevada seletividade na separação de moléculas com base na solubilidade;
 aplicações
Vantagens:

Uso de solvente:

O uso de solvente pode afetar negativamente a recuperação

dos compostos  manutenção da estrutura nativa das
proteínas, principalmente.

FUNÇÃO BIOLÓGICA
Curvas de equilíbrio do sistema PEG/fosfato de potássio
em função dos parâmetros massa molecular e pH do meio

Quanto maior a massa molar do

polímero menor a concentração
necessária para formação de
duas fases

Redução do valor do pH desloca

a curva para a direita,
concentrações para formação
de duas fases aumentam.
Coeficiente de Partição (K)

 Grandeza adimensional que representa a relação entre as

concentrações da molécula de interesse na fase de topo e
na fase de fundo no equilíbrio:
K= CTi
CFi

CTi = Concentração de soluto i na fase de topo (g/L);

CFi= Concentração de soluto i na fase de fundo (g/L);

Utilizado para avaliação da extensão das separações nos sistemas

de duas fases aquosas;
Ocorrência de purificação: coeficientes distintos para a molécula de
interesse e para as demais moléculas.
Fatores que influenciam no coeficiente de partição K

 Interações hidrofóbicas
 Cargas superficiais / pH
 Diferença de potencial elétrico entre as fases
 Efeito de salting-out da fase salina
 Diferenças de viscosidade
 Diferenças de densidade
 Diagramas de fases (ex.: concentração de PEG e sal)
 Massa molecular da biomolécula
Extração

- Variáveis influenciam coeficiente de partição e rendimento

de extração;

- Planejamento estatístico dos experimentos:

- Componentes (polímeros/sal)
- pH
- Peso molecular
Avaliação da extração

- Desempenho de extração é dado pelo k;

- Valores elevados de k: partição da molécula alvo na fase

de topo é favorável;

- Eficiência de extração: razão entre k molécula alvo e

contaminantes

- Avaliação de valores k e razões  aliada a rendimentos

elevados da molécula alvo
 Reciclagem do polímero

 Recuperação é uma etapa importante;

 Ruptura da interação entre ligante e a molécula do produto

purificado;

Sequência: reciclagem do polímero de afinidade

 Interações rompidas pela alteração do pH;

 Capacidade de reciclar: possibilita aplicação em larga escala;

 Reciclagem do polímero

 PEG reciclado por:

 Extração por solventes orgânicos;
 Transferência da fase polimérica para outro sistema;
Ultrafiltração
Problemas com SDFA tradicional:

 Bioproduto alvo pode se acumular na fase rica em polímero

ou na fase rica em sal  causando dificuldades na
recuperação;

 Necessitando de operações mais complexas como

cristalização, cromatografia de troca iônica;

 Sais não são eficientemente recuperados (necessidade de

solvente = poluição)
Alternativa:

- Avanços no Sistema de Duas Fases Aquosas tem sido

feitos (álcool, surfactantes, líquido iônico e polímero de
termoseparação)

- Polímeros termoseparação (TSP) foram primeiramente

descritos 1990 (dextrana);

- Exemplos de TSPs são o óxido de etileno hidrofílico

(OE) e óxido de propileno hidrofóbico (PO),
denominados copolímeros (EOPO)

- Ampla variedade de aplicação como sua relação EO / PO

e peso molecular variado
- SDFA foram formados utilizando EOPO:

- fosfato de potássio
- sulfato de amônio ou sódio
- dextrana

- Substituindo os PEG

Vantagens:
- Transferência de massa é facilitada pela elevada área de
contato interfacial devido a baixa tensão superficial
- Facilidade na separação de fases
- Bons resultados na partição das biomoléculas
- Menores quantidades de componentes são necessários para
formar as duas fases
- O conceito de separação induzida pela temperatura diminui a solubilidade na
solução aquosa e forma as duas fases (água e polímero)

- Nestes sistemas a fase de topo tem quase 100% de água, enquanto que a
fase de fundo apresenta o EOPO

Figura: Termoseparação baseada no SDFA

Fonte: Leong et al. (2016)
Este sistema simplifica a extração do produto alvo e faz a
reciclagem possível

A reutilização de polímeros sem a necessidade de um terceiro

componente ou etapas extras de separação

Torna a bioseparação mais econômica e ambientalmente correta

Adequada para aplicação em escala industrial