SISTEMAS AQUOSOS BIFSICOS: FUNDAMENTOS E APLICAES PARA PARTIO/PURIFICAO DE

PROTENAS
Luis Henrique Mendes da Silva*
Departamento de Qumica, Centro de Cincias Exatas e Tecnolgicas, Universidade Federal de Viosa, 36571-000 Viosa - MG, Brasil
Watson Loh
Instituto de Qumica, Universidade Estadual de Campinas, CP 6154, 13084-971 Campinas - SP, Brasil
Recebido em 14/4/05; aceito em 16/12/05; publicado na web em 14/6/06

Divulgao

Quim. Nova, Vol. 29, No. 6, 1345-1351, 2006

AQUEOUS TWO-PHASE SYSTEMS: FUNDAMENTALS AND APPLICATIONS FOR PARTITIONING/PURIFICATION OF

PROTEINS. By the year 2005 the world biochemical market will reach an estimated $ 100 billion and separation processes are a
vital link between lab discoveries and the fulfillment of this commercialization potential. The practical application of aqueous twophase systems (ATPS) to extraction processes has been exploited for several years for the recovery of biological products.
Unfortunately, this has not resulted in an extensive presence of the technique in commercial processes. In this paper a critical overview
of the fundamental thermodynamic properties related to formation of aqueous two-phase systems and their application to extraction
and purification of bioparticules is presented.
Keywords: aqueous two phase system; proteins; biotechnology.

INTRODUO
Sistemas contendo duas ou mais fases lquidas em equilbrio
termodinmico so muito teis para aplicaes em extrao e/ou purificao de compostos presentes em inmeros processos tecnolgicos1,2. Porm, para aplicao desta tcnica de extrao lquidolquido para a obteno de compostos com importncia biotecnolgica
(protenas, enzimas, clulas, vrus, organelas, etc.), faz-se necessria
a utilizao de sistemas em que as duas fases guardem semelhanas,
em termos das propriedades fsico-qumicas, com o meio aquoso presente nos seres vivos3. Assim, a aplicao dos clssicos sistemas
bifsicos solvente orgnico/gua para extrao de uma protena seria invivel, na maioria dos casos pois, com uma eventual concentrao da protena na fase orgnica, ocorreria um processo de desnaturao, com a conseqente perda de atividade da biomolcula.
Neste sentido, os sistemas denominados aquosos bifsicos (SABs
ou, em ingls, ATPS) desempenham um papel estratgico pois, como
veremos em maiores detalhes a seguir, as duas fases so formadas
predominantemente (60-95%) por gua.
A formao dos SABs conhecida desde o final do sculo 19. Em
1896, Beijerinck4,5 descobriu que solues aquosas de gelatina e agar
ou gelatina e amido solvel, misturadas em uma dada faixa de temperatura e concentrao, formavam misturas turvas que, em repouso, separavam espontaneamente em duas fases lquidas lmpidas. A fase mais
densa era enriquecida em agar (ou amido) e a fase superior em gelatina, sendo que a gua era o componente majoritrio em ambas as fases.
Posteriormente, Ostwald e Hertel6,7 continuaram os estudos sobre
esses sistemas e verificaram que amidos provenientes de origens distintas (arroz, milho, etc.), isto , possuindo diferentes fraes de amilose
e amilopectina, produziam diferentes diagramas de fase. Esses resultados mostravam a grande influncia que pequenas variaes nas
interaes intermoleculares tm sobre as composies das fases em
equilbrio.
Com objetivo de verificar uma possvel generalidade do fenmeno de separao de fase em sistemas contendo macromolculas, Dobry
*e-mail: luhen@ufv.br

e Boyer-Kawenoki 8,9, no final da dcada de 40, estudaram a

miscibilidade de um grande nmero de diferentes pares de polmeros,
dissolvidos em solventes orgnicos ou em solues aquosas. Estes
autores constataram que dos 35 pares de macromolculas estudados,
apenas 4 no produziram a formao das duas fases, e puderam concluir que a incompatibilidade entre polmeros era um fenmeno geral.
Porm, foi apenas com os trabalhos de Per-ke Albertsson10, em
meados da dcada de 50, que ficou evidente para a comunidade cientfica a grande potencialidade de aplicao destes sistemas partio/purificao de materiais biolgicos, desde protenas at clulas.
Como o solvente a gua em ambas as fases e geralmente se encontra presente em grande quantidade, estes sistemas fornecem um ambiente ameno para as biomolculas evitando, assim, mudanas em
suas estruturas e perda das atividades biolgicas.
Outra propriedade termodinmica importante associada aos
SABs, e que lhes d uma vantagem significativa quando comparados aos clssicos sistemas gua-leo, possurem regies interfaciais
com baixo valor de tenso interfacial, 11-13. Para aplicao em processos de separao de biomolculas, este pequeno valor de excesso
de energia livre de Gibbs por unidade de rea possibilita a transferncia das biopartculas pela interface com um risco mnimo de ocorrerem alteraes estruturais nas protenas, clulas e membranas
particionadas14.
A natureza qumica dos componentes formadores das fases tem
forte impacto nas propriedades interfaciais dos sistemas aquosos
bifsicos. Alm de influenciar no coeficiente de partio dos solutos,
a tenso interfacial contribui para outras propriedades do sistema,
tais como a estabilidade cintica e termodinmica da disperso,
cintica de partio, etc15.
A primeira publicao relatando resultados de tenso interfacial
de SABs foi de Ryden e Albertsson, em 197116. O sistema bifsico
estudado era formado por PEG e Dextrana. Neste trabalho j era
relatado um comportamento caracterstico de em funo de duas
variveis termodinmicas; o comprimento da linha de amarrao
(CLA) e a massa molar dos dois polmeros. Estes autores mostraram
existir uma relao simples entre a tenso interfacial e estas duas
caractersticas dos SABs formados, conforme Equao 1

1346

da Silva e Loh

= a(CLA)b

(1)

onde a e b so constantes dependentes da massa molar das

macromolculas formadoras dos SABs. Os valores de permaneceram entre 6.5510-2 e 4.610-4 mN m-1, sendo que os valores menores pertenciam a composies mais prximas ao ponto crtico. Em
1984, Bamberg et al.17 estudaram o mesmo sistema e propuseram
uma relao exponencial entre a tenso interfacial e a diferena de
composio entre as duas fases, expressa pelo comprimento da linha
de amarrao (CLA)
= ced(CLA)

(2)

em que c e d so constantes. Uma limitao clara da Equao 2 o

fato de que ela prev um valor finito para a tenso interfacial quando
o sistema se encontra na composio do ponto crtico e isto naturalmente no faz sentido. No ponto crtico, acabam as diferenas entre
todas as propriedades termodinmicas intensivas de cada fase e, conseqentemente, o valor da tenso interfacial se iguala a zero.
A partir destes trabalhos pioneiros, centenas de outros foram realizados, enfocando, em sua quase totalidade, a descoberta, caracterizao e aplicao de novos sistemas separao de solutos especficos1,10,18,19. A Tabela 1 exemplifica alguns sistemas descobertos e aplicados com sucesso na purificao de algumas biopartculas.
Atualmente, os sistemas aquosos bifsicos so aplicados mais
eficientemente em etapas iniciais dos processos de purificao, mas
em casos raros podem at mesmo substituir os clssicos sistemas
cromatogrficos.
Tabela 1. Sistemas aquosos bifsicos formados por diferentes
componentes
Componente 1

Componente 2

Poli( xido de etileno)

Poli(xido de etileno)
Poli (xido de etileno)
Poli(xido de etileno)
Copolmero Poli(xido de etileno)poli(xido de propileno)poli(xido de etileno)
Dextrana sulfonato de sdio
Poli(xido de etileno)
Dextrana sulfonato de sdio

Poli(xido de propileno)
Dextrana
Poli(N-vinil-2-pirrolidona)
Na2SO4
Maltodextrina

Quim. Nova

Em um dos sistemas aquosos bifsicos mais estudados e aplicados, o SABs formado por dextrana-PEO-H2O, geralmente se atribui
a separao do sistema em duas fases ao surgimento de interaes
desfavorveis quando segmentos de dextrana entram em contato com
segmentos do poli(xido de etileno)20. Loh e da Silva21, utilizando
medidas calorimtricas, mostraram que esta interao repulsiva entre PEO e dextrana possui contribuio entlpica muito pequena,
sendo predominantemente de natureza entrpica, isto , oriunda de
efeito de volume de excluso22, entropia configuracional23, etc.
Em outros casos pode ser exatamente o contrrio. Existem SABs
que se formam porque existe uma forte interao entre segmentos de
diferentes polmeros. Neste caso, a diminuio da energia livre pode
ser devido a interaes eletrostticas entre cargas positivas presentes
em um dado polmero com cargas negativas distribudas ao longo da
cadeia de uma outra macromolcula24, ou formao de ligaes de
hidrognio entre os segmentos, gerando complexos de coacervao25.
interessante destacar que medida que o nmero de diferentes
componentes aumenta, abrem-se possibilidades de se formarem sistemas polifsicos. Em 1998, foi descoberto que a adio de CH2Cl2 a
um sistema aquoso bifsico formado por Na2SO4/PEO/H2O resultava em um sistema trifsico, onde, a fase mais densa era formada pela
mistura H2O/Na2SO4, a fase intermediria era composta por PEO/
CH2Cl2, enquanto a fase superior era formada por PEO/H2O. A adio de n-hexano, a este sistema trifsico, gerava um sistema tetrafsico
em que a nova fase era a menos densa e formada por mistura de
CH2Cl2/n-hexano26.
Este comportamento segregativo ou associativo dos componentes formadores dos SABs geralmente representado em diagramas
de fases retangulares ou triangulares. A Figura 1 exemplifica as duas
possibilidades.

Etil-hidroxietilcelulose-NaCl
Citrato de sdio
NaCl (0 oC)

FUNDAMENTOS SOBRE A FORMAO DOS SABs

A formao de duas fases durante o processo de mistura de solues aquosas de dois polmeros (ou de um polmero e de um sal)
depender das interaes intermoleculares - expressas em termos da
energia livre - entre os constituintes formadores do sistema. Sero
tambm estas mesmas interaes as responsveis por todas as propriedades fsico-qumicas presentes nas duas fases, como por ex., a
distribuio dos diferentes componentes no sistema, da relao de
volumes entre as fases, da diferena de potencial eltrico e do excesso de energia livre associados interface, do coeficiente de partio
de um soluto especfico, etc.
Para cada sistema, teremos pares de componentes que possuiro
interaes termodinamicamente favorveis e pares que geraro
interaes que aumentaro a energia livre do sistema e, por isto, sero consideradas desfavorveis. Naturalmente estas interaes sero
dependentes do estado termodinmico do sistema, isto , da composio, temperatura e presso.

Figura 1. Diagrama de fase para sistemas aquosos bifsicos, expresso em coordenadas triangulares e retangulares
Nestes diagramas encontramos inmeras informaes, todas relacionadas minimizao da energia livre do sistema. Por ex., podemos
obter, em quais composies globais o sistema monofsico ou
bifsico, sendo estas duas regies demarcadas por uma linha denominada curva binodal. Tambm so representadas as linhas de amarrao (tie lines), que so retas que ligam pontos no diagrama que representam a composio das duas fases em equilbrio. Qualquer conjunto de pontos que pertenam regio bifsica e que estejam sobre a

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Sistemas aquosos bifsicos

1347

onde C(POL)FS, C(POL)FI, C(SAL)FS e C(SAL)FI so as concentraes do polmero e do sal nas fases superior (FS) e inferior (FI),
respectivamente. Com o aumento do valor do parmetro CLA, aumenta-se a diferena entre a fase superior e a inferior, em termos de
propriedades termodinmicas intensivas.
Com base na discusso acima fica claro que o problema bsico
na anlise terica dos sistemas aquosos bifsicos, em termos da
termodinmica no equilbrio, a obteno de uma expresso analtica para variao da energia livre associada com a formao de uma
soluo contendo os diferentes polmeros e/ou sais, a partir de seus
componentes puros27. Esta propriedade termodinmica geralmente
denominada energia livre de mistura, mixG28.
Se as interaes que os componentes realizam em soluo forem
exatamente as mesmas que eles realizam quando puros, mesmo assim mixG no ser igual a zero, pois teremos a contribuio entrpica.
Assim, a energia livre de mistura ser funo das interaes resultantes presentes em soluo, bem como das diferentes distribuies
das molculas na soluo. Estas interaes sero expressas para cada
componente em termos dos respectivos potenciais qumicos. Matematicamente teramos:

de um sistema. Existem relaes similares Equao 5 para os termos entlpico e entrpico.

A conexo entre estes parmetros termodinmicos macroscpicos
(mixH e mixS) e as propriedades moleculares obtida a partir de um
tratamento estatstico, utilizando sempre um tipo especfico de modelo, entre os quais podemos destacar os de Flory e Huggins29,30, de
expanso do virial31, UNIQUAC32,33, de contribuio de grupo34 e o
modelo de excluso volumtrica35. Uma excelente reviso que analisa a aplicao destes modelos especificamente aos SABs foi escrita
por Cabezas Jr, em 199636.
Entretanto, muitas vezes, os novos modelos de termodinmica
estatstica quando aplicados especificamente separao de fases de
sistemas contendo polmeros so, na verdade, modificaes da teoria original de Flory e Huggins37. Em geral, eles foram formulados
na tentativa de descrever em maiores detalhes os processos dominantes em solues polimricas. No presente artigo faremos uso do
modelo de Flory e Huggins por ser mais simples e fornecer aspectos
bsicos e semiquantitativos dos fenmenos moleculares que ocorrem em sistemas aquosos bifsicos.
Na aplicao do modelo de Flory e Huggins a sistemas aquosos
bifsicos, a soluo ternria representada por uma rede tridimensional de stios, todos de mesmo volume, ocupados por molculas do solvente ou segmentos dos polmeros (ou ons). O nmero de
segmentos de cada macromolcula, Xi, encontrado dividindo-se o
volume molar do polmero pelo volume molar do solvente.
Neste modelo de rede, cada stio tem z faces de contato com stios
adjacentes. Desta forma, a entalpia de mistura resultante da variao
da entalpia associada ao processo de formao de contatos entre os
segmentos dos diferentes polmeros e destes segmentos com as molculas do solvente. Entretanto, necessrio enfatizar que a mistura descrita anteriormente ocorrer sempre custa da quebra do contato entre
unidades dos componentes de mesma espcie presentes no estado puro.
Esta variao de energia por contato, , dada por:

(4)

(6)

onde Gsol a energia livre da soluo, Gi* a energia livre de cada

componente puro, ni a quantidade de substncia e i e *i so os
potenciais qumicos de cada componente em soluo e puro, respectivamente.
Termodinamicamente, todas as vezes que mixG<0, a mistura dos
trs componentes produzir um sistema homogneo e, caso contrrio,
o sistema procurar uma nova configurao (a produo de duas fases
em equilbrio), que ter uma menor energia livre. Com temperatura e
presso constantes, a variao da energia livre de mistura ocorrer
apenas se houver variao do potencial qumico de um dos componentes quando da adio de qualquer outro componente. Verificamos
isto derivando a Equao 4 em relao a cada componente:

onde wij a energia potencial de par devido a interaes entre os

componentes i e j, e zij o nmero de coordenao que os componentes j fazem ao redor de um componente i. Rearranjando os termos da Equao 6 temos:

mesma linha de amarrao fornecer fases superiores que possuiro

propriedades termodinmicas intensivas iguais (densidade, volume
molar, entalpia molar, etc.), entretanto, sendo distintas as suas variveis termodinmicas extensivas (massa, volume, etc). Aplica-se o mesmo raciocnio para as fases inferiores formadas a partir de composies globais localizadas sobre uma mesma linha de amarrao.
O comprimento da linha de amarrao, CLA, um importante
parmetro termodinmico, geralmente utilizado como varivel
determinante dos processos de partio dos solutos em SABs formados por diferentes componentes e calculado pela Equao 3
CLA = {[C(POL)FS - C(POL) FI]2 + [C(SAL) FS - C(SAL) FI]2}0,5 (3)

(5)
A energia livre de mistura ficar positiva, devido adio de um
dos componentes formadores dos SABs, apenas se neste estado
termodinmico, o potencial qumico de um ou mais componentes da
soluo for maior que o potencial qumico do componente quando
puro, assim a derivada apresentada na Equao 5 torna-se positiva.
Utilizando a equao clssica, mixG=mixH-TmixS, podemos
observar que no termo mixG existem contribuies de natureza
entlpica, mixH e outras relacionadas variao da entropia do sistema, mixS. Naturalmente esta diviso uma aproximao, visto que
existe uma conectividade entre a variao da entalpia e da entropia

(7)
em que ij denominada de variao de energia efetiva do par potencial e igual metade da energia requerida para formar 2z pares
i-j. Estes pares i-j so formados a partir do processo de transferncia
de uma molcula do tipo i presente numa fase formada apenas
pelo componente i, mais em uma molcula do tipo j presente em
um sistema contendo apenas j, onde ambas as molculas esto
interagindo com z vizinhos.
Estes parmetros de interao podero ser expressos na forma ij
ou normalizados em relao energia trmica,

. ij

denominado parmetro de Flory-Huggins e leva em considerao a

dinmica de formao e quebra dos contatos devido, principalmente, ao movimento aleatrio das molculas em soluo.
A interao ser considerada desfavorvel entalpicamente caso
ij ou ij possuam valores positivos e, favorvel caso a interao
resultante seja exotrmica (valores negativos). O grande desafio do
ponto de vista terico estabelecer uma relao entre o nmero dos
diferentes tipos de contato com propriedades macroscpicas que expressem a composio do sistema, tais como frao volumtrica ou

1348

da Silva e Loh

frao mssica. Encontrando esta relao basta multiplic-la por ,

e obteremos o valor de mixH.
mixH=.,.[no de contatos]

(8)

onde (no de contatos) uma funo que estabelece relao entre o

nmero de diferentes contatos e propriedades macroscpicas do sistema. Para um sistema ternrio razovel supormos que a probabilidade de cada tipo de contato proporcional quantidade dos componentes envolvidos e de suas fraes volumtricas. Assim podemos
escrever a Equao 8 como:

Quim. Nova

mos aplicar estes valores na Equao 11 e minimizando-a obteremos os dados referentes ao diagrama de fase, incluindo as composies das fases em equilbrio, a curva binodal, o ponto crtico, etc.
Infelizmente estes dados so escassos, e muitas vezes a minimizao
da funo mixG no tarefa simples, levando necessidade de aplicar novos modelos38-42.
PARTIO DE PROTENAS EM SABS
Em geral, a distribuio de protenas entre as duas fases aquosas
dos SABs caracterizada por um parmetro denominado coeficiente de partio, Kp, definido como43-47

(9)
(12)
em que i a frao volumtrica do componente i (
soluo resultante, N o nmero total de stios (

) na
).

Para clculo da entropia de mistura, leva-se em considerao

apenas o nmero de diferentes maneiras de distribuir as molculas e
os segmentos nos distintos stios formadores da rede. Esta entropia
denominada entropia configuracional. Este modelo no considera as
outras variaes entrpicas (conformacionais, rotacionais, eletrnica, etc.). Assim, a contribuio entrpica do processo de mistura
dada pela Equao 10
(10)
onde R a constante dos gases.
Na Equao 10 s so possveis valores positivos para mixS, indicando assim que, na presena de foras intermoleculares muito
fracas, os componentes formadores dos SABs iro sempre se misturar para formar uma nica fase. Entretanto, esta contribuio da
entropia de mistura para a minimizao da energia livre de Gibbs
diminui com o aumento do grau de polimerizao Xi do componente
i. Assim, os valores de mixS envolvendo sistemas contendo macromolculas sero sempre menores que os valores da variao de
entropia associada mistura de molculas pequenas, da mesma forma que uma macromolcula de massa molar 100.000 g mol-1 promover um ganho entrpico menor que um polmero, quimicamente
semelhante ao anterior, mas de massa molar igual 1000 g mol-1.
por isto que a mistura etanol e glicose, molculas parecidas com as
unidades monomricas do poli(xido de etileno) e da dextrana, ser
entropicamente mais favorvel que a mistura das respectivas
macromolculas. Sistemas formados pela mistura de 20% (m/m) de
etanol e 20% (m/m) de glicose a 25 oC so completamente miscveis,
enquanto que sistemas formados na mesma temperatura pela mistura de 0,5% de dextrana e 5,0% de PEO formam sistemas aquosos
bifsicos. Em ambos os sistemas, a interao entlpica resultante
desfavorvel, mas apenas no sistema macromolecular que esta pequena energia repulsiva consegue superar a variao de entropia favorvel, levando formao de um sistema bifsico.
A combinao dos dois termos discutidos anteriormente, a
entalpia e a entropia de mistura, na clssica equao da termodinmica, mixG=mixH-TmixS, fornece a Equao 11

(11)
Caso tenhamos valores de ij ou ij medidos ou calculados para
um dado sistema em funo da temperatura e concentrao, pode-

onde ap,i e cp,i so, respectivamente, a atividade e a concentrao da

protena nas diferentes fases (S= superior ou I= inferior). A Equao
12 enfatiza o ponto de vista termodinmico, em que os parmetros
concentrao presentes nesta equao, deveriam ser substitudos
pela atividade da protena nas duas fases. importante destacar
que muitas vezes, as medidas experimentais do coeficiente de partio das protenas tm revelado uma dependncia de Kp em relao
concentrao da mesma indicando tratar-se de um coeficiente aparente, no constituindo, desta forma, um parmetro que caracterize
um sistema em equilbrio termodinmico. Alm disto, a dependncia de Kp em relao concentrao pode tambm indicar que est
ocorrendo a partio de diferentes espcies qumicas formadas, por
ex., pela agregao das protenas. Entretanto, para experimentos em
que a concentrao da protena muito baixa (regime de diluio
infinita), os valores da concentrao e da atividade tornam-se muito
prximos48.
Esta distribuio desigual da biopartcula entre as duas fases
resultante de um intrincado e delicado balano de interaes entre a
protena e as outras espcies (polmeros, H2O e/ou sais inorgnicos)
presentes nas duas fases que coexistem em equilbrio49.
Inmeras propriedades fsico-qumicas do sistema e do biopolmero determinam o valor de Kp. Exemplos de fatores associados
protena que influenciam sua distribuio entre as fases so50-55 o
tamanho, a conformao (estruturas secundria, terciria e quaternria) e a composio (estrutura primria), presena de carga eltrica e hidrofobicidade. Alm disto, propriedades importantes das fases tambm contribuem nesta distribuio, como por ex., a natureza
qumica dos componentes formadores dos SABs56,57, a massa molar
e a concentrao dos polmeros58,59, a presena de ligantes ao longo
da cadeia polimrica que possam interagir especificamente com stios da protena60,61, pH e temperatura62,63. Alm do mais, a adio de
diferentes sais inorgnicos a estes sistemas bifsicos produz uma
diferena de potencial eltrico na interface, que influencia marcantemente a partio de protenas carregadas eletricamente64-67. Este
potencial eletrosttico ocorre devido distribuio desigual dos
ctions e dos nions entre as fases enriquecidas pelos diferentes
polmeros68.
possvel relacionar o parmetro obtido experimentalmente, Kp,
com a variao da energia livre de Gibbs associada ao processo de
transferncia da protena da fase inferior para a fase superior, tG=RTlnK.
Esta funo termodinmica de transferncia, tG, est relacionada com a interao da protena com os diferentes polmeros e/ou
sais presentes nas fases e tambm com as interaes que cada componente formador dos SABs realiza entre eles69. As medidas do coeficiente de partio devem ser realizadas em regime de diluio infinita onde se procura evitar a contribuio da interao protena-pro-

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Sistemas aquosos bifsicos

tena para o tG. Entretanto, bem conhecido que mesmo em situaes de baixssima concentrao as protenas podem se associar sob
certas condies, particularmente perto do seu ponto isoeltrico e/ou
na presena de outros polmeros70.
Assim, a contribuio ou no da interao protena-protena para
o coeficiente de partio precisa ser verificada, principalmente para
aquelas protenas que so caracteristicamente auto-associativas. Outra motivao importante para a determinao do coeficiente de partio, de uma protena em baixa concentrao, que nestas condies a presena da protena no afeta o estado termodinmico do
SABs aplicado para a purificao. Uma concentrao tpica que tem
confirmado a assertiva anterior 1 mg /mL71.
A estratgia termodinmica para clculo de KP consiste em se
obter o potencial qumico da protena em cada fase do SABs. Em
geral, este parmetro fornecido pelas relaes termodinmicas apresentadas abaixo
(13)
(14)
Nas Equaes 13 e 14, SP o potencial qumico da protena na
fase superior, enquanto 0P potencial qumico da protena pura que
se encontra na mesma temperatura do SABs e (exP)S o potencial
qumico de excesso da protena na fase superior.
Para a aplicao das duas equaes anteriores, sobre os dados de
equilbrio dos sistemas aquosos bifsicos, visando a obteno do coeficiente de partio, necessrio supormos que a adio da protena no altera o estado termodinmico inicial (antes da adio) do
sistema. A aplicao destas relaes termodinmicas (Equaes 13 e
14), na Equao 11 nos fornece a seguinte vinculao entre o potencial qumico de excesso e a constante de partio72
(15)
Na Equao 15 o potencial qumico de excesso expressa a entropia
de mistura no ideal de todos os componentes formadores dos SABs,
bem como todas as interaes entlpicas entre todos os componentes no sistema, inclusive as da protena com os todos os compostos
que formem cada fase.
A combinao das Equaes 13 e 15, e a posterior substituio
do resultado na Equao 11 leva a uma relao matemtica que nos
fornece a contribuio entrpica para o processo de partio da protena72. Nesta deduo matemtica considera-se inexistente a contribuio entlpica para a variao da energia livre de Gibbs de mistura. A Equao final apresentada abaixo
(16)
onde, Mp grau de polimerizao da protena, o nmero de stios
por unidade de volume de todo o sistema bifsico, ns o nmero
total de molculas na fase superior, enquanto que ni o nmero total
de molculas presentes na fase inferior e VS e Vi, os volumes das
fases superior e inferior, respectivamente.
A Equao 13 nos mostra que a contribuio entrpica para a
partio da protena s aparecer caso exista uma diferena em termos de densidade numrica entre as duas fases. Como fora motriz,
a entropia levar a protena a particionar para a fase com maior nmero de molculas por unidade de volume, pois nesta fase haver
um maior nmero de formas de distribuir as molculas espacialmen-

1349

te, aumentando assim a contribuio da entropia configuracional para

a minimizao do parmetro termodinmico mixG. Na maioria dos
SABs atualmente conhecidos, so as molculas de gua que esto
presentes em grande maioria numrica, em ambas as fases e, por
isto, este o componente determinante para a densidade numrica
das diferentes fases. Assim, em linhas gerais, a contribuio entrpica
far a protena tender a particionar para a fase com maior contedo
de molculas de gua por unidade de volume.
Durante a partio de protenas em sistemas aquosos bifsicos
formados pela mistura de eletrlito/polmero, foras motrizes de natureza entrpica atuaro no processo forando o biopolmero a se
concentrar na fase rica em sal, visto ser esta a que contm maior
densidade numrica73-75. A concentrao de protenas na fase rica em
polmero s ocorrer nestes SABs (sal/polmero) caso existam
interaes entlpicas contribuindo para este comportamento de partio como, por ex., quando h interaes especficas entre protena
e polmero76.
Para sistemas com densidade numrica das fases muito prximas, isto , sistemas onde o fator entrpico pouco contribui, a
entalpia que determinar o comportamento de partio da protena.
Neste caso, o valor de Kp depende fundamentalmente da diferena

entre os valores que a entalpia molar parcial da protena, hP, apresentar nas duas distintas fases. No estado termodinmico em que no
ocorra interao protena-protena, a entalpia molar parcial ser dada
pela equao72
(17)
A aplicao da Equao 17 na Equao 14 e, considerando que

na ausncia de contribuio entrpica, ex = hP, obteremos aps alguns rearranjos a seguinte relao entre Kp e a composio das fases72
(18)
A Equao 18 expressa todas as interaes entlpicas que ocorrem dentro do sistema aquoso bifsico. Podemos separar a contribuio entlpica para a partio da protena em dois termos. O primeiro somatrio a contribuio da interao da protena com cada
componente formador das fases, em que iP representa a energia resultante da formao de um par entre protena e o componente i.
Neste termo entlpico, a energia resultante proporcional diferena de composio entre as duas fases. Considerando apenas a
interao da protena com os diferentes componentes, presentes no
SABs, a protena particionar para a fase que contem maior concentrao do componente com o qual ela interaja mais entalpicamente,
isto , tenha o valor de iP mais negativo ( ou menos positivo).
O segundo termo na Equao 18 representa a variao da energia
associada transferncia da protena da fase inferior para a superior,
sendo a mesma, entretanto, independente da interao da protena com
os componentes de cada fase. Este termo energtico s depende da
interao que ocorre entre os componentes formadores das fases, que
pode ser interpretado como um contedo energtico de cada fase. Esta
variao de energia est presente porque ao se transferir da fase inferior, a protena libera um volume que permite a interao entre os componentes presentes na fase, enquanto que seu deslocamento para a
fase superior possibilitar a formao de uma cavidade, impossibilitando a interao entre os componentes da fase superior.
Desta forma, a contribuio deste termo entlpico para o comportamento de partio da biopartcula faz com que a protena se
difunda para a fase onde menor o gasto energtico para formao
da cavidade em que a mesma ser alojada.

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da Silva e Loh

Este modelo terico, as Equaes 15-18, nos permite interpretar

qualitativamente algumas influncias que certas caractersticas dos
SABs tm sobre o comportamento de partio das protenas. bem
conhecido que concentrao, massa molar e tipo de polmero formador das fases influenciam decisivamente o comportamento de extrao das biopartculas.
Em relao influncia que a composio das fases exerce sobre
a partio das protenas, algumas tendncias podem ser destacadas.
Quanto menor o comprimento da linha de amarrao, CLA, associada a uma dada composio global do sistema, mais prximo a 1 ser
o valor do coeficiente de partio, portanto, menos seletiva a extrao. Segundo o modelo, nesta condio termodinmica (pequenos
valores de CLA), a distribuio igualitria da protena entre as duas
macro-regies ocorre porque com a mnima diferena de concentrao dos constituintes entre as fases ser nfima tambm a diferena
entre elas em termos de densidade numrica, auto-energia e energia
de interao. Entretanto, com o aumento do CLA, a transferncia da
protena tende a uma das fases, isto , o valor de Kp torna-se cada vez
mais distante de 1, para mais ou para menos. Este comportamento
resultante do aumento na diferena da composio entre as fases que
gera, conseqentemente, o incremento das contribuies entrpicas
(Equao 13) e entlpicas (Equao 15) na transferncia da protena
para uma das fases.
Em geral, o aumento da massa molar de um polmero que rico
em uma fase acaba diminuindo a tendncia de partio da protena
para a mesma fase. Naturalmente, este aumento no grau de polimerizao do polmero formador do SABs acaba diminuindo a entropia configuracional da fase enriquecida neste polmero, reduzindo o
valor da entropia de transferncia da protena para esta fase.
Outra propriedade fsico-qumica que influencia marcantemente
a partio de uma protena o pH. A maioria dos trabalhos que investigaram esta correlao foram realizados em sistemas aquosos
bifsicos com composio global fixa, s vezes, com adio de
eletrlitos19. A concentrao hidrogeninica afeta a transferncia das
protenas, porque estes biopolmeros contm uma grande variedade
de grupos cidos e bsicos com diferentes valores de pKa, resultando
em cargas eltricas que so funes dos valores de pH. Esta densidade de carga eltrica na superfcie da protena pode modificar sua
conformao, bem como processos de associao ou dissociao entre
as macromolculas presentes no sistema. Todos estes processos que
ocorrem com a protena modificam sua interao com os componentes do sistema bifsico, alterando seu comportamento de partio. O
pH, indiretamente, pode afetar a partio de uma protena e modificar a composio das fases dos SABs, seja a posio da linha binodal,
seja o comprimento da linha de amarrao.
Os primeiros trabalhos que investigaram o efeito do tamanho do
soluto sobre seu comportamento de partio indicavam que molculas pequenas, como aminocidos e glicosdios, tendiam a distribuirse igualmente (K 1) nos sistemas aquosos bifsicos enquanto
macromolculas, principalmente grandes protenas e cidos nuclicos,
tendiam a se concentrar em uma das fases77. Trabalhos posteriores
possibilitaram mostrar que no era uma tendncia geral. Albertsson
e colaboradores78 mostraram que a enzima -galactosidase, com
massa molar igual a 540000 g mol-1, particiona mais igualmente
(K = 0,38) que a pequena protena citocromo C, de massa molar
12384 g mol-1 (K = 0,18) no SABs Dex70-PEG-8000 contendo o
tampo 0,01 mol L-1 de fosfato de sdio, pH 6,8. Aps sucessivos
trabalhos utilizando diferentes protenas, a comunidade cientfica
reconheceu a dificuldade em separar os efeitos devidos ao tamanho
da partcula daqueles relacionados estrutura qumica.
Com o objetivo de superar esta dificuldade, Zaslavsky e colaboradores79,80 estudaram a partio de sries homologas de polmeros
sintticos. Foram investigados o comportamento de partio de dife-

Quim. Nova

rentes massas molares de polietilenoglicol(PEG), poliacrilamida(PAAm) e polivinilpirrolidona(PVP) em SABs formados por Dex
70-Ficoll 400 contendo 0,15 mol kg-1 de NaCl e 0,01 mol kg-1 de
tampo fosfato, pH 7,4. Mesmo neste estudo, onde os efeitos eram
apenas relacionados ao tamanho da partcula, diferentes comportamentos foram observados. O polmero PEG teve o coeficiente de
partio aumentado com o aumento da massa molar, enquanto os
polmeros PVP e PAAm apresentaram um comportamento inverso.
A interpretao deste efeito da massa molar (tamanho da biopartcula) sobre o comportamento de partio da protena, segundo o
modelo descrito no presente artigo, deve considerar as duas foras
motrizes termodinmicas. Como podemos verificar pela Equao 16,
nos casos em que o fator entrpico predomina sobre o fator entlpico,
o aumento do tamanho da biopartcula levar sempre a uma distribuio mais desigual da protena, com variao proporcional sua massa
molar. Entretanto, a ocorrncia de um comportamento inverso deve-se
contribuio das interaes entlpicas que a protena realiza com os
diferentes compostos que forman as fases (Equao 18).
Apesar dos avanos obtidos nos estudos sobre os sistemas aquosos bifsicos, ainda reduzido o nmero de casos em que tais sistemas foram aplicados industrialmente81. Alm disso, uma consulta
aos bancos de patente forneceu apenas oito registros, a maioria relacionados aplicao dos SABs na purificao de protenas presentes em misturas complexas produzidas geralmente por culturas de
microorganismos. Por ex., Tjerned e Sivars82 propuseram um mtodo de extrao por afinidade, para a protena de membrana, CytBO3,
em um SABs formado pela mistura de uma soluo aquosa de fosfato
e uma soluo aquosa de PEG-IDA (polietilenoglicol-cido iminodiactico). Segundo os autores desta patente, este mtodo aumentou
a seletividade, o rendimento e o fator de purificao em relao aos
mtodos tradicionais utilizados para purificao desta protena.
CONCLUSO
Atualmente alta a demanda por mtodos de extrao e purificao de biopartculas (protenas, enzimas, clulas, etc.) que sejam
eficientes e economicamente viveis. Nessa linha, os sistemas aquosos bifsicos constituem um potencial. Entretanto, notrio que os
SABs apesar da intensa aplicao em escala laboratorial para purificao de enzimas e protenas, no alcanaram ampla aplicao comercial, tendo talvez como possveis causas o custo dos polmeros
formadores das fases e/ou o comportamento complexo (inmeras
variveis interferindo de forma cinegtica ou antagnica) de partio apresentados nestes sistemas bifsicos. Alm disso, para sua aplicao sistemtica, necessria maior compreenso dos fatores que
determinam sua formao e a partio de solutos especficos. Contudo, a urgente demanda por parte da indstria biotecnolgica, com
objetivo de trazer para o mercado consumidor produtos que possuam
alto valor agregado, com ampla aplicao mdica, certamente motivar a aplicao em escala industrial dos SABs.
Conseqentemente, processos utilizando SABs em etapas de recuperao primria de produtos de interesse biotecnolgico sero
uma importante opo para novos bioprocessos associados indstria farmacutica.
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