VIII OLIMPÍADA

IBERO-AMERICANA DE BIOLOGIA
7-13 de Setembro 2014
CIDADE DOTEÓRICO
EXAME MÉXICO-MÉXICO

EXAME PRÁTICO
BIOLOGIA MOLECULAR
TOTAL DE PONTOS: 80 PONTOS

DURAÇÃO: 75 MINUTOS

ESCREVA SEU CÓDIGO DE NUEVE DÍGITOS NO

SEGUINTE QUADRO

CÓDIGO DE ESTUDANTE
INTRODUÇÃO

O genoma humano é composto por mais de 3 bilhõ es de pares de bases por célula
haploide, divididos em 23 cromossomos. Entre indivíduos, temos uma identidade
>99.8%, que nos identifica como seres humanos. A diferença de <0.2% é constituída
por variaçõ es que podem ser em uma só base, em duas, em três, e até em vá rias
centenas. Quando estas diferenças sã o características em uma populaçã o e mais de
1% dos indivíduos a possuem, estamos falando de polimorfismo genético. Em nosso
genoma temos milhares destes polimorfismos, e alguns deles sã o utilizados para a
identificaçã o humana.

Os STR (por suas siglas em inglês Short Tandem Repeats, repetiçõ es curtas em
tandem) sã o regiõ es conhecidas que possuem sequências curtas de DNA, entre 2 e 6
nucleotídeos, repetidas vá rias vezes de maneira consecutiva. Por exemplo, para uma
populaçã o, a sequência GATA se repete 4 vezes, gerando a sequência de 16 pb
GATAGATAGATAGATAGATA, enquanto em outra populaçã o esta mesma sequência se
repete 10 vezes, gerando a sequência
GATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATA de 40 pb. Utilizando
primers que reconheçam locais conservados adjacentes ao fragmento que contém
estas repetiçõ es, é possível amplificar e analisar mediante sequenciamento ou
eletroforese a diferença no tamanho dos fragmentos gerados.

Primer para PCR STR

2-6 pb
Como sã o sequências
pequenas, possuem a vantagem
de poder amplificar DNA a
partir de amostras escassas ou
degradadas e podem ser
usados vá rios pares de primers
para amplificar STR diferentes
em uma só reaçã o. Atualmente
o sistema mais utilizado é o
CODIS (DNA Index System), que
é o sistema que trabalha com a
base de dados do FBI dos
Estados Unidos, e o software
para analisá -la. Possui 13
marcadores genéticos ou loci,
mais o de amelogenina para
determinar o sexo, portanto, é realizada de maneira simultâ nea a amplificaçã o de 14
loci que conduzirã o poder diferenciar dois indivíduos com 99.9999% de certeza, e
determinar em um teste com 99.73% a probabilidade de paternidade.

OBJECTIVOS
1. Sabe convenientemente a análise de DNA humano e sua utilidade na ciência
forense.
2. Extraia o DNA humano de uma forma não-invasiva
3. para reconhecer sequências que são usadas em genética forense como
marcadores para estabelecer a filiação
 

CASO DE IDENTIFICAÇÃO DE PARENTESCO

Em dezembro de1959, Bulmara e Reynaldo, jovem roqueiro e sonhador, se

conheceram em uma festa do bairro onde moravam. Em 1960, contraíram matrimô nio
e em meados dessa década tornaram-se pais de 2 crianças: Alelí e Danilo.
Em 1969, Reynaldo convidou Bulmara para ir ao festival Woodstock, considerado um
evento de mú sica e arte hippie. Bulmara –que é profundamente tradicionalista- nã o
quis, e Reynaldo disse que iria com as crianças com ou sem a autorizaçã o dela. Um
problema levou a outro, e eles se separaram. Bulmara ficou com Alelí e Reynaldo
levou Danilo. Naquele momento nã o sabiam, mas o ex-casal jamais se reencontrará .
Na década de 1970, Alelí avisa Bulmara que viverá em uniã o livre com seu namorado
Patrício. A quilô metros de distâ ncia, Reynaldo falece, nã o sem antes abençoar Danilo
para que case com Maria Teresa. Tanto Alelí como Danilo tiveram filhos com seus
respectivos cô njuges na década de 80. A filha de Alelí se chama Macaria, e os filhos de
Danilo sã o Javier e Demétrio.
Em 2005, os 2 jovens conhecem Macaria (sem saber de seu parentesco) no festival de
mú sica Vive Latino. Ambos os meninos se apaixonam por Macaria, mas ela só
corresponde a Demétrio. A relaçã o entre ambos prospera e chega ao compromisso em
breve. Quando Alelí e Danilo sã o apresentados aos sogros, inicia-se uma série de
coincidências e lembranças que os fazem pensar na possibilidade que sejam os irmã os
separados na infâ ncia… o que causaria que seus filhos estivessem se casando com seus
primos irmã os. Com essa preocupaçã o, Alelí e Danilo decidem fazer testes de
parentesco.

Foram obtidas amostras de DNA de todos os membros da família para realizar a

primeira genotipificaçã o com três STR (STR 500, STR 1000, e STR 2000) e com os
alelos da amelogenina (AMELX 125 pb e AMELY 100 pb) para identificar o sexo dos
indivíduos. Os quatro marcadores foram amplificados simultaneamente em um PCR
multiplex utilizando oligonucleotídeos marcados com um fluoró foro distinto para
cada tipo marcador. Na seguinte pá gina está a imagem da eletroforese realizada nas
amostras que lhe permitirã o identificar as relaçõ es entre os indivíduos da família.

Aná lise de dados:

1. Construir uma curva de calibraçã o com os marcadores de tamanho conhecido. (10
pontos)
a. Com apoio da escala localizada perto da imagem de gel, determine a
distâ ncia de migraçã o de frente de eletroforese a partir de origem e registre
na tabela 1.
b. Estime a distâ ncia percorrida por cada faixa de pista etiquetada como
marcadores, que contem uma mistura de fragmentos de DNA de tamanho
conhecido, e registre na tabela 1.
c. Na mesma tabela, calcule a mobilidade relativa (Rf) de cada fragmento com
a fó rmula:
Rf = distâ ncia migrada pela faixa
distâ ncia migrada pela frente
d. Na tabela, calcule o logaritmo de tamanho de cada fragmento.
e. Na grade, faça um grá fico dos dados log(pb) vs Rf

2. Determinar o tamanho aproximado em pares de bases (pb) dos amplicones e o

nú mero de repetiçõ es em cada alelo. (10 pontos)

a. Identifique os 17 diferentes alelos separados no gel (cinco de STR2000,

cinco de STR1000, cinco de STR500 e dos de AMEL)
b. Estime a distâ ncia migrada pelas faixas correspondentes a cada alelo e
registre-o na tabela 2.
c. Usando o mesmo valor de distâ ncia migrada pela frente, calcule o Rf da
faixa correspondente a cada alelo e registre-o na tabela 2.
d. Interpolando na curva de calibraçã o, determine o Rf para cada faixa.
e. Na tabela, calcule o tamanho em pares de bases de cada faixa (antilog ou
10x).
f. Finalmente, para calcular o nú mero de repetiçõ es, a cada um dos quinze
alelos de STR, subtrair 100 ao tamanho em pb (equivalentes à regiã o
invariante que flanqueia ao microssatélite) e dividir entre 6.
3. Complete a tabela 3 que conterá os resultados da genotipificaçã o da família. Com
base nos alelos de amelogenina, determine o sexo de cada indivíduo (XX ou XY).
Indique o nú mero de repetiçõ es dos dois alelos dos três STR estudados para cada

-Demetrio

-Javier

-María Teresa

-Macaria

-Patricio

-Danilo

-Alelí

-Reynaldo

-Bulmara

-marcadores (pb)
---origem

325

300

275

250

225

200

-----frente

indivíduo. (10 pontos) alelos STR 2000

175
alelos STR 1000
alelos STR 500
alelos AMEL
150

125

100
 Tabela 1. Marcadores de tamanho (pb)

tamanho (pb) log (pb) distâ ncia Rf

frente -----
325
300
275
250
225
200
175
150
125
100

Curva de calibraçã o
log(pb) vs Rf
log(pb)

Rf
Tabela 2. Tamanho de amplicones e nú mero de repetiçõ es em cada alelo
Faixa
ou distâ ncia Rf log (pb) tamanho (pb)1 repetiçõ es2
alelo
frente ----- ----- -----
1
2
STR
3
2000
4
5
6
7
STR
8
1000
9
10
11
12
STR 500 13
14
15
AMEL X 16 -----
AMEL Y 17 -----

NOTAS:
1
Ao estimar o tamanho, arredondar ao nú mero inteiro mais pró ximo
2
Ao estimar o nú mero de repetiçõ es, arredondar ao nú mero inteiro mais pró ximo

Tabela 3. Sexo e alelos de STR

Reynaldo

Demétrio
Bulmara

Macaria
Patrício

Teresa
Danilo

María

Javier
Alelí

sexo
STR2000
STR1000
STR500
QUESTIONÁRIO

Em sua folha de resposta registra a resposta correta

1. Quais alelos sã o compartilhados por todos os indivíduos neste estudo? (4 pontos)

2. Que indivíduo tem menor probabilidade de pertencer à família? (4 pontos)

A. Reynaldo
B. Danilo
C. Patrício
D. Javier
E. Demétrio

3. A hemofilia é considerada uma doença homozigota recessiva, os filhos de qual

casal terã o maior probabilidade de sofrer essa doença, os de Macaria e Demétrio
ou os de Macaria e Javier? (4 pontos)

4. Os três marcadores utilizados nesta aná lise sugerem que Demétrio e Macaria sã o
gêmeos; no entanto, a histó ria familiar contada indica que nã o é assim. Como você
resolveria esta discrepâ ncia? (4 pontos)

A. Isolando mais DNA

B. Realizando um carió tipo
C. Utilizando mais STRs
D. Analisando mais membros de a família

Marque as respostas corretas:

5. Devem ser feitos testes estatísticos nos estudos de genotipificaçã o para
determinar se: (4 pontos)
A. o DNA de duas origens diferentes possui alelos coincidentes.
B. as amostras de DNA se degradaram com a aná lise.
C. uma coincidência entre alelos de amostras diferentes de DNA pode ser casual.
D. uma amostra desconhecida de DNA procede de um homem ou uma mulher.

6. Entre as amostras de DNA obtidas por seu grupo. Das seguintes, qual ou quais sã o
as respostas corretas: (4 pontos)
A. Podem ser encontrados alelos coincidentes com os da família
B. Nã o será encontrado nenhum alelo coincidente com os da família deste estudo.
C. Ao menos um perfil será idêntico ao de Macaria.
D. Todas as amostras provenientes indivíduos masculinos apresentarã o uma faixa
de 100 pb.
7. Os alelos STR sã o regiõ es hipervariá veis de DNA humano que diferem entre si na:
(4 pontos)
A. posiçã o de locais internos reconhecidos por enzimas de restriçã o.
B. um nú mero variá vel de mutaçõ es pontuais.
C. o nú mero de có pias de uma sequência de DNA repetida internamente.
D. sua posiçã o em distintos cromossomos.
E. a capacidade de hibridar com uma determinada sonda específica.

8. Qual das seguintes NÃ O é uma fonte potencial de DNA para aná lise médica legal?
(4 pontos)
A. raízes de cabelo
B. gló bulos vermelhos
C. células epiteliais na urina
D. tecido muscular
E. saliva

ATIVIDADE PRÁTICA: (18 pontos)

Extraçã o de DNA humano da mucosa bucal.

MATERIAL
 Cotonetes  PBS 1X
 Tubos de polipropileno de 1.5 mL  Cloro a 2%
 Pontas para micropipetas  Soluçã o de lise
 Acetato de só dio 3M
 Microcentrífuga  Etanol absoluto
 Micropipetas  Etanol 70%
 Bloque térmico  Agua injetá vel
 Cronô metro

METODOLOGIA

Obtençã o de células
1. Fazer uma raspagem da mucosa bucal com um cotonete de algodã o estéril, raspar
varias vezes a parte interna de cada bochecha para obter as células.
2. Colocar o algodã o em um tubo de 1.5 mL, adicionar 500 uL de PBS IX, enxaguar
delicada e firmemente o cotonete no fundo e contra as paredes de tubo. A soluçã o
deve tornar-se turva. Chame o instrutor para mostrar.
3. Ao terminar a extraçã o da amostra, colocar o algodã o em uma soluçã o de cloro a
2% para descartá -lo.

Extraçã o de DNA
1. Coloque seu tubo na microcentrífuga de maneira adequada, seguindo as
instruçõ es.
2. Centrifugar os tubos com as amostras a 14,000 rpm durante 2 min.
3. Descartar o sobrenadante despejando-o no vidro para resíduos.
4. Resuspender a pastilha em 150 uL de soluçã o de lise com cuidado utilizando a
micropipeta adequada.
5. Aquecer as amostras a 95 °C em bloco térmico por 5 minutos.
6. Esfrie sua amostra a temperatura ambiente por dois minutos.
7. Centrifugar por 2 minutos a 14,000 rpm.
8. Transferir o sobrenadante a um tubo limpo de 1.5 mL.

Precipitaçã o de DNA
1. Levar o sobrenadante a um volume final de 200 uL com agua injetá vel.
2. Adicionar 20 uL de NaOAc 3 M, 440 uL de etanol absoluto e misturar.
3. Incubar 10 min a -20 °C.
4. Centrifugar 10 min a 14,000 rpm.
5. Descartar o sobrenadante.
6. Agregar 500 uL de etanol ao 70% e agitar vigorosamente.
7. Centrifugar 10 min a 14,000 rpm.
8. Descartar o sobrenadante.

NOTA: Os instrutores sã o responsá veis por resuspender cada amostra e passar em

uma eletroforese para analisar se cada participante obteve sucesso na extraçã o de
DNA.

INSIRA O SEU TESTE E SUA FOLHA DE RESPOSTAS EM SEU ENVELOPE E

ENTREGUE-O PARA O PROFESSOR