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Vol. 159, nº 3, 1989 BIOQUÍMICA E BIOFÍSICO PESQUISAR COMUNICAÇÕES

Marchar 31, 1989 Páginas 1128-1134

Um novo composto, Withangulatin A, Promove Tipo II

DNA mediado por topoisomerase Danos no DNA

Jin-Iiai Juan,* Hurng Wern Huang,* Chiu Ming Chen, eu/

e Hon Ju Liu*l

*Instituto de Ciências da Vida BDepartmer e

It of ChemistrI-, National Tsing Hua
University, Hsin-chu, Taiwan 30043, ROC

Recebido em 12 de fevereiro de 1989

Verificou-se que withangulatin A. um novo composto com uma estrutura química conhecida
e da erva chinesa antitumoral Phr-salis angulata atua na topoisomerase II para induzir danos no DNA mediados EU,

pela topoisomerase II in vitro.

Tem dois intervalos de dosagem eficazes de
aproximadamente 0,5 e 20 uM, com um terço da atividade de cerca de 20 uM VM-26.
0 1989 Acadêmico Imprensa, Inc.

Recente estudos tem demonstrado que alguns antitumoral medicamento

clivagens de DNA induzidas pela foram mediados por mamífero DNA

II
topoisomerase (1). no DNA Tal antitumoral pode ser dividido aproximadamente

intercalando não intercalando drogas [m-AMSA, ellipticines (2-411 e DNA

[VM-26, VP-16 (5,6), (8)1. novobiocina (7), e

cumarinas Pesquisamos muitos purificados de alguns chineses, dos compostos isolado
quais ervas, os extratos tem o actilitl

inibir célula tumoral e/ou matar tumor células na cela

cultura (inédito com crescimento nosso).

trabalhar Um desses compostos,

nomeadamente, angulatina de A (Fig. 1 (9)) isolado de toda a erva

drogas Phq'salis angulata para L e com uma estrutura diferente daqueles

do antitumoral aquele mencionado acima foi descoberto para ha1.e um

atividade- semelhante de \?l-26, isto é, tem a atividade para

estabilizar a DNA-topoisomerase II complexo em que o DNA pode ser

danificado para clivado de ação estado pelos fatores de de SDS-proteinase 2;.

Isso é mecanismo vários adição e afetando o

atividade da topoisomerase II são relatados aqui.

1Para quem correspondência deve ser endereçado.

0006-291X/89 $ 1,50 0 1989

direito autoral por Acadêmico de reprodução Inc.

Todos os direitos Imprensa, em qualquer forma reservada. 1128

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Figo. 1. Estrutura de withangulatin A.

MATERIAIS E MÉTODOS

Proteinase K Gias adquirida da Boehringer Mannheim.

Agarose e corante reactix-e red-120 foram adquiridos da Sigma. VM-26
(4'-demethyleGipodophyl1otosi.n thionylidine glucoside) foi um gentil presente do Prof.
LF Liu, Departamento de Química Biológica , Escola de Medicina da
Universidade Johns Hopkins. Outros produtos químicos foram
adquiridos da E. Merck.

O DNA do dímero pBR322 ccc foi preparado a partir de E. coli C 600 (uma cepa de nosso
laboratório) cultivada em alta concentração de ampicilina. plasmídeo não continha nenhuma
quantidade detectável odeisolado
monômero. O DNA de plasmídeo r; foi purificado por centrifugação de gradiente de
densidade CsCl em duas etapas (10).
A topoisomerase II de ADN de baço suíno foi preparada
pelo nosso novo método modificado de Halligan et al. 111) que é descrito resumidamente da seguinte forma:
O núcleo SaCl 0,4 µl foi cortado para r;inthin 20 a 55% por precipitação de extrato de sulfato de amônio .

Após diálise: a topoisomerase II foi isolada por cromatografia em coluna BioRes

70, fosfocelulose P-11, agarose vermelha e hidrosilapatita.
Ue usou gel vermelho em vez de gel azul para a cromatografia em
coluna de afinidade porque o corante vermelho-120 se liga à topoisomerase II suína mais fortemente do
que o corante azul . Esta etapa aumenta a pureza da topoisomerase II em cerca de 50 vezes de uma só
vez.
A última fração da topoisomerase II ainda apresentava bandas de proteína txo com .Yr de 172 e 162 kDa ilustradas
em SDS PAGE. Ambos os polipeptídeos interagiram com soro de topoisomerase de timo anti-bezerro Kith
após Western blotting (nossos dados não publicados).

A reação de clivagem do DNA mediada pela topoisomerase II foi realizada conforme descrito
por Liu et al. (1). Salvo indicação em contrário, a
mistura de reação (15 ul) contendo 0,3 ug de plasmídeo pBR322 dímero de DNA (3 nM), 0,3 ug de
topoisomerase II (60 nM) e drogas de concentrações variadas em tampão de ensaio padrão (50 mM Tris,
pH 7,5; 75 mM KCl; 5 mM MgClz; 0,1 mL?l EDTA; 0,5 mM DTT; 1 mM ATP; e 30 pg/ml BSA) foi incubado a
37OC por 30 min, SDS e proteinase Ii foram então ajustados para 1% e 0,5 mg/ ml, respectivamente. Por
fim, o EDTA foi incubado a 50°C por mais 15 min. ajustado para 100 mL para quelar Mgz+ que
causará agregação de DNA na subsequente eletroforese em gel alcalino.

As
amostras foram sujeitas a electroforese através de gel de agarose neutro a 0,8% em tampão Tris-borato 90
mP1 (pH 8,3)/2 mM EDTA ou gel de agarose desnaturado a 1% em tampão NaOH 30 mM/2 mL EDTA.

RESULTADOS

nossa coleção de inibidores, ou seja, withangulatin A,

peperomina A, peperomina B e peperomina C inibiram topoisomerase

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II desatando em concentrações de 60, 200, 200 e 100

PM, respectiva atividade com C'M-26 às 20h. Todos não tinham
inibição detectável comparada na topoisomerase eu relaxo reação

até 1 mM. Entre os novos inibidores, a withangulatin é o mais forte, A foi encontrado

embora a concentração do P4 unknotting seja ligeiramente Em (60 ~?1) necessário para

retardar preliminar reação testes superiores,
relataram para W-26, etc. ou (6,12). o outro
três, seja, as peperominas (13), não mostraram nenhuma tendência para
produzem DNA danificado na reação de clivagem (dados não mostrados).
VW26 e m-AMSA são conhecidos por serem capazes de formar uma DNA-topoisomerase I
II estabilizado
reversível; quando doses mais altas de W-26 e m-AMSA
complexo são usadas,
(1,51. a formação
Além disso,
de linear
DNA é aumentado pela reação de clivagem (1-6). Nisso
respeito, o mecanismo de ação da withangulatin A parece ser

diferente dos outros. tem duas doses

concentração Primeiro, intervalos (0,5-1,0 PM e 10-20 PM) em que induz
masimal DX;A dano na reação de clivagem, conforme mostrado na Fig. 2 e pela quantidade de DKA linear de fita simples produzida.

indicado
Embora a reação de clivagem na alta concentração com angulatina A não seja de

tão aparente quanto na baixa

concentração, esta clivagem Fias reprodutível outros resultados e demonstrável por

experimentais mostrados na Fig. 3 e Fig. não corresponde a P3 unknotting 5. este resultado

ao esperado de sua habilidade para inibir
reação. Segundo, Khen variando concentrações

Figo. 2. Topoisomerase A reação de dano ao DNA mediada por II é de

aprimorada por duas dosagens faixas withangulatin A. O DNA linear das
de é encontrado em um withangulatin A
concentração máxima de fita simples em torno de 0,5 a 20 NM. Os produtos reagidos
foram separados por eletroforese em gel alcalino. A pista C (controle) é
uma mistura de DNA de plasmídeo relaxado e super-hélice não tratado.
[Abreviações: ds RC--circular relaxado de fita dupla (sem cortes). ss C--forma circular
de fita simples: ss L-- forma linear de fita simples: ds CCC--forma super-hélice de
fita dupla DNA]

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VM-26 comangulatina A
Faixa Cl2345 C 6 7 8 910

Fig. 3. Estimativa da atividade estabilizadora de withangulatin A para

do complexo clivável DNA-topoisomerase II em relação a VU-26. Concentrações variáveis de
topoisomerase II foram ajustadas na mistura de reação contendo 20 uM de VM-26 ou
withangulatin A. De acordo com a quantidade de DNA linear de fita dupla, a capacidade
da withangulatin A de estabilizar o complexo clivável DNA-topoisomerase II é de cerca
de um terceiro do VM-26. O gel de agarose foi executado em tampão TEE. A
pista C é DNA super-hélice não tratado. [Abreviaturas: ds OC--forma circular aberta de
cadeia dupla tanto para entalhado como relaxado (sem entalhe); ds L - forma linear de fita
dupla: ds CCC - DNA super-hélice de fita dupla]

da presença de II xere usado para reação de clivagem no

topoisomerase de 20 n?l de withangulatin A com VM-26 usado como controle, pode ser visto na Fig. sendo
produzido por withangulatin A do que 3, que além para DNA menos linear

bl; W-26, uma escada de bandas de DNA com diferentes uithangulatin

níveis de relacionamento pode ser visto no
Uma pista em contraste para as pistas \M-26 onde não
bandas de escada podem ser observadas. Isso indica que a quantidade de

a cadeia de DNA permitida para passar através dos complexos de DNA-topoisomerase II induzidos b\- as
duas drogas não são as mesmas.

nós especulamos que a withangulatin A deve ter pelo menos dois tipos
de ação sítios na topoisomerase k-hi& II para manifestar os dois

intervalos de dosagem dentro dotopoisomerase

dano ao DNAémediado
a por XI é promovido.
Um desses sites kithangulatina (Fig. Um local de alta
site
afinidade e outro de baixa afinidade 4). Suspeita-se que o lor;- afinidade- seja o sítio VY-26 não apenas
porque VM-26 esite
withangulatin na atividade ATPase dependente de DNA da topoisomerase II (nossos, mas
também porque os dados não A a 20 uM cada um tem o mesmo efeitos

publicados da DNA-topoisomerase II), complexos cliváveis estabilizados por ambos os compostos pode
ser deslocado para o inibidor reunido
voltar

estado k.ith red-120 d\-e, que é um resultado não competitivo) da ATPase

(nosso topoisomerase dependente de DNA de [Aqui, apenas as bandas principais II
inédito reagente inibitório A 5. como mostrado na Fig. nos efeitos do
são considerados intensidade variada- nisso

manuscrito. dessas bandas é devido ao

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Faixa

dsCCC

05

Fig.4. Uma especulação sobre modelo de dímero de Uma ligação sites em

a topoisomerase withangulatin II.

Figo. 5. Danos no DNA mediados por topoisomerase II promovidos por VM-26 ou withangulatin A são
revertidos pelo corante red-120. Uma concentração 20 )IM de VM-26 (pistas 1 e 2) ou withangulatin (pistas
3 e 4) foi suplementada na reação padrão Após incubação a 37OC por 30 min 10 pM de corante
vermelho-120 uas adicionado às misturas (pistas 2 e 41 e incubadas por mais tempo. As amostras Uma mistura.
foram submetidas à eletroforese alcalina.
10 min.

A pista C é DNA super-hélice não tratado. [Abreviaturas: as da Fig. 21 igual a

dímero efeito da nossa amostra de DNA e a concentração assim como

ao tipo de medicamento (VM-26 ou withangulatin A) fatores usados ou que

determinar se a fita dupla fita simples na reação nicks vão

ocorrem predominantemente do ensaio.1

DISCUSSÃO

Neste artigo, apresentamos um relatório preliminar sobre os tipos de pequenas moléculas de quatro novos

topoisomerase II inibidores, e mecanismo de pagamento

em atenção para o inibitório de um deles,

particular, novos A, em comparação com o VM-26. nenhum dos quatro

inibido a topoisomerase
compostos com angulatina ativam detectavelmente o relaxamento do peperomina,
I. O grupo DNA embora de

capaz de inibir o desatado, não induz dano ao DNA mediado pela topoisomerase II. A inibição deste
grupo está sendo estudada detalhadamente. reação,
mecanismo

Preliminarmente, descobrimos que a withangulatin A tem o mesmo

inibitório como o dopersonagem
VM-26, embora sua concentração de withangulatin A necessária para inibir o unknotting
seja ligeiramente superior à do W-26 (60 e 20 uM, respectivamente). reação

Além disso, na presença de withangulatin A, um DNA relaxado a

subproduto você foi encontrado depois reação de clivagem da topoisomerase

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II que não foi encontrado na presença de VM-26. é interessante que a reação Fora isso, observar que
de clivagem com duas faixas de concentração de dose induzem danos ao DNA no 2). Estas duas

angulatina A fosse necessária (Fig. concentrações com o inibidor

aparentemente não são consistentes, efeito
a explicação do nó é mostrada na Fig. de alcance em P4
reação. Um especulativo 4.

Quando a concentração de withangulatin A está entre 0,5 e 1 pM, onde o local de ligação de alta afinidade
com angulatin A de uma topoisomerase é a contraparte da DNA-topoisomerase
II subunidade (local 1) é ocupado pela droga enquanto (site 1') na outra
site subunidade está desocupado, o complexo II é perturbado por uma
assimetria para destruir as interações estabilizando o dímero da
distorção proteína e tornando-o pronto para ser o estado "completos cliváveis " .

Quando o sítio correspondente também é ocupado simetricamente pela droga, a distorção assimétrica pode

ser compensada e as condições para a clivagem do complexo desaparecem.

Esta explicação
também pode ser aplicado à withangulatin A de baixa afinidade (sítios 2 e 2') quando a sites

concentração ativa utilizada é maior

superior a 10 uM.

O nós de alta withangulatin Um sítio de ligação postulado bll

afinidade parece ser irrelevante para quaisquer domínios relatados em
topoisomerase II. Isso vai ser interessante para ver se um verdadeiro
efetor pode ser encontrado em r-ivo para ligá-lo por causa de sua estreita
e delicado gama de efeito. A baixa afinidade site acredita-se para

ser o sítio de ligação VM-26, porque além para as razões

descrito acima, a DNA-topoisomerase bloqueada II clivável complexo
formação pela withangulatin A em concentrações superior a
50 yM pode resultar do mesmo maior que 100 pg/ efeito de VM-26 em concentrações

ml (ver ref. 14, Fig. 3).

AGRADECIMENTOS Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da

NSC (77-0203-8007-03) ROC

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