Insulina Humana Recombinante

Michael R. Ladisch' e Karen L. Kohlmann

Laboratório de Engenharia de Recursos Renováveis, A. A. Potter Engineering Center, Purdue
University, West Lafayette, Indiana 47907

Abstract:

A insulina é um peptídeo bem caracterizado que pode ser produzido por tecnologia de
DNA recombinante para uso terapêutico humano. Uma breve visão geral da produção
de insulina, tanto a extração pancreática de mamífero tradicional quanto a de sistemas
de bactérias e leveduras recombinantes é apresentado, e técnicas de detecção,
incluindo eletroforese, são revisadas. Os sistemas analíticos para a separação da
insulina são baseados principalmente na cromatografia em fase reversa, que resolve
o(s) produto(s) de desamidação (insulina desamido) da insulina, pró-insulina e
insulina. A separação em larga escala é um processo de várias etapas e inclui
cromatografia de troca iônica, fase reversa e exclusão de tamanho. Vantagens e/ou
desvantagens de várias abordagens de separação, conforme descrito pela literatura
numerosa referências sobre purificação de insulina, são apresentadas.
Introdução:

A insulina é um hormônio polipeptídico essencial para o fornecimento de energia para

as células do corpo (Barfoed, 1987). Estima-se que a doença diabetes mellitus
(produção prejudicada de insulina e suas complicações) é a terceira maior causa de
morte em países industrializados depois de doenças cardiovasculares e câncer
(Barfoed, 1987). Produzido pelas células do pâncreas em resposta à hiperglicemia, a
insulina é um hormônio potente afetando direta ou indiretamente todos os órgãos ou
tecidos do corpo. As principais funções da insulina são estimular reações anabólicas
para carboidratos, proteínas e gorduras, todos os quais têm as consequências
metabólicas de produzir um nível reduzido de glicose no sangue (Norman e Litwack,
1987).
Estimava-se em 1986 que havia 60 milhões de diabéticos do mundo (Johnson,
1986) e que 12 milhões dos americanos têm diabetes (Barfoed, 1987). Esses números
estão aumentando dramaticamente. Acredita-se que a população dos E.U.A esteja
crescendo a uma taxa de 1% ao ano, mas a taxa de crescimento da população
diabética usuária de insulina é 54% ao ano (Johnson, 1986).
Os problemas de saúde relacionados ao diabetes podem ser devastadores.
Barfoed (1987) relata que, embora os sintomas agudos possam ser tratados com
insulina, complicações vasculares nos estágios mais avançados da doença reduzem a
expectativa de vida diabéticos em um terço. Além disso, ele relata que diabéticos são
25 vezes mais propensos a ficar cegos e ter duas vezes o risco de doença cardíaca do
que os não diabéticos. Nos E.U.A., os custos diretos e indiretos para a economia são
estimados em mais de 5 bilhões de dólares por ano. A administração de insulina como
tratamento para diabéticos tem uma longa e interessante história. Em 1922, Frederico
Banting e Charles Best trataram com sucesso o primeiro paciente humano com uma
preparação de insulina obtida de extrações pancreáticas de animais (Barfoed, 1987).
De 1922 até 1972, a única insulina disponível foi purificada a partir do pâncreas de
porcos e vacas. Esta insulina foi bastante valiosa para prolongar a vida de diabéticos
que, de outra forma, teriam morrido lentamente porque a glicose não estava disponível
às células do seu corpo. Melhorias na purificação de insulina durante a década de
1970 foram bem-sucedidas na produção de um fármaco estável com um tempo de
ação previsível (Chance et al., 1975; Dolan-Heitlinger, 1981; Barfoed, 1987). Em 1950,
A Novo Nordisk A/S (Bagsvaerd, Dinamarca) modificou o estado da própria insulina
para obter um cristal de insulina com um alto teor de zinco que teve um longo tempo
de ação, em comparação com a insulina amorfa que foi rapidamente absorvida (Dolan-
Heitlinger, 1981; Barfoed, 1987). As adições de protamina e zinco retardaram a
absorção da insulina por formarem um hexâmero estável na presença de zinco, com a
taxa de dissociação deste hexâmero sendo a passo controlador da taxa de absorção
da insulina.
O desenvolvimento de tecnologias de DNA recombinante resultou na produção
e uso do primeiro produto, insulina humana, em 1982. Então, como agora, a insulina
humana recombinante tem duas vantagens distintas sobre insulina tradicional obtida
da extração pancreática: existe virtualmente um suprimento ilimitado de insulina
humana recombinante, e a insulina humana recombinante é idêntica à insulina
humana. A insulina humana recombinante é menos suscetível de causar reações
imunológicas durante o tratamento do que a insulina de origem animal. Insulina suína,
quando administrado por longos períodos de tempo, pode resultar em reações
alérgicas graves. Variação de sequência na insulina é mais comum nas posições 8-10
(meio da cadeia A ligação dissulfeto), e essas diferenças podem levar a respostas
imunológicas (Norman e Litwack, 1987). Um impulso para o desenvolvimento do
processo de insulina humana recombinante foi uma escassez percebida de carne
bovina e suína na década de 1970 que, se tivesse realmente ocorrido, teria restringido
a disponibilidade do tecido pancreático do qual a insulina foi extraída e, portanto, a
quantidade de insulina disponível (Hall, 1987). Naquela época, temia-se que o a
demanda de insulina estava aumentando mais rapidamente do que a oferta.
Os americanos continuam a limitar o consumo de carne, afetando a
disponibilidade de tecido pancreático. A insulina foi uma escolha particularmente boa
para ser a primeira proteína terapêutica a ser produzida com tecnologia de DNA,
simplesmente por causa da grande quantidade de insulina necessária. Em
comparação com outro produto recombinante, o hormônio do crescimento que tem um
uso atual de vários quilogramas/ano, o mercado de insulina é de 2 ordens de
magnitude maior (Prouty, 1991). Desde que foi desenvolvido em 1982, a quantidade
de insulina humana utilizada aumentou dramaticamente. Estima-se que nos EUA 73%
dos pacientes usam insulina humana (Crossley, 1991).

Fundamentação Teórica:

Estrutura da Insulina. A insulina é um peptídeo bem definido com sequência de

aminoácidos e características estruturais conhecidas (Watson et al., 1983; Norman e
Litwack, 1987). Este hormônio consiste em duas cadeias peptídicas separadas que
são a cadeia A (21 aminoácidos) e a cadeia B (30 aminoácidos) unidas por pontes
dissulfeto conforme indicado na Figura 1:
 A pró-insulina é o precursor biológico da insulina e é uma única cadeia
peptídica formada quando as cadeias A e B são conectadas pelo peptídeo C (Figura
2). As insulinas humanas e suínas diferem em apenas um aminoácido, enquanto as
insulinas bovina e humana diferem em três aminoácidos, conforme indicado na Figura
1. Em um trabalho sobre hormônios, Norman e Litwack (1987) detalham a descoberta
da sequência e estrutura da insulina. Devido ao seu pequeno tamanho, a insulina tem
sido uma molécula ideal para o estudo da sequência e estrutura peptídica. Em 1955, a
sequência primária de aminoácidos foi encontrada por F. Sanger, e em 1967, D. F.
Steiner e R. Chance determinaram a estrutura da pró-insulina. O trabalho continuou
com a elucidação da estrutura tridimensional através da cristalografia de raios X por D.
CrowfootHodgkin em 1969. Usando essa técnica, a insulina era vista como um
monômero, um dímero ou um hexâmero. A cristalografia de raios-X continua sendo
uma técnica importante para confirmar as identidades de diferentes tipos de insulina.
Na relação estrutura-função da insulina, três características foram conservadas: (1) as
posições precisas das três ligações dissulfeto; (2) as regiões N- e C-terminais da
cadeia A; e (3) os resíduos hidrofóbicos da cadeia B (Norman e Litwack, 1987). A
insulina humana recombinante é química, física e imunologicamente equivalente à
insulina pancreática humana e é biologicamente equivalente tanto à insulina
pancreática humana quanto à insulina de porco purificada (Chance et al., 1981a).
Produção e Purificação de Insulina Tradicional.

Historicamente, a insulina foi purificada do tecido animal por procedimentos de

extração seguidos por técnicas de cromatografia (Dolan-Heitlinger, 1981; Barfoed,
1987). Pâncreas bovinos ou suínos congelados são cortados em cubos, extraídos com
etanol e acidificados a pH 2 com HCl ou H2SO4. Essas etapas inativam e removem a
enzima tripsina, que pode degradar a insulina. O carbonato de cálcio é então
adicionado para neutralizar a solução, o extrato é concentrado por extração a vácuo a
baixas temperaturas e a insulina é precipitada por adição de sal. O precipitado é
redissolvido em água e reprecipitado ajustando o pH ao ponto isoelétrico da insulina.
As etapas de cromatografia para purificação adicional da insulina podem incluir
filtração em gel seguida de sistemas de troca iônica (Dolan-Heitlinger, 1981). A
aplicação de insulina a uma coluna de filtração em gel dá um pico principal composto
por insulina, insulina(s) desamido, insulina(s) arginina, éster(es) etílico(s) de insulina,
glucagon, polipeptídio pancreático e somatostatina. Uma pequena quantidade de
material de maior peso molecular elui antes do pico de insulina e contém pró-insulina e
intermediários de pró-insulina, além de uma mistura de dímeros de insulina
covalentes. Materiais semelhantes a pró-insulina podem ser imunogênicos e, portanto,
devem ser removidos durante o procedimento de purificação (Chance, 1972; Chance
et al., 1975). A filtração em gel seguida de cromatografia de troca iônica separa a
insulina desses outros materiais.

Produção de insulina humana.

O desejo de não se restringir a fontes de tecidos animais para produção de

insulina levou ao interesse em fabricar insulina humana. A insulina humana pode ser
obtida por extração do pâncreas humano, síntese química de aminoácidos individuais,
conversão de insulina suína em “semissíntese” de insulina humana ou fermentação de
microrganismos geneticamente modificados (Barfoed, 1987). A extração de um
pâncreas humano só é viável para fins de pesquisa, e a síntese química (embora
tenha sido realizada) atualmente não é econômica. O terceiro e quarto métodos foram
desenvolvidos para produção comercial de insulina para uso terapêutico e serão
discutidos.
Conversão da insulina suína

A insulina humana semissintética foi desenvolvida comercialmente na década de 1970

pela Novo Nordisk A/S e é produzida pela substituição do resíduo de alanina B-30 da
insulina suína por um resíduo de trequina. Cinco etapas resultam na insulina humana
monocomponente (Barfoed, 1987). A insulina é primeiramente extraída das glândulas
pancreáticas porcinas congeladas. O segundo passo de processamento envolve
processos de purificação convencionais, que foram descritos na seção anterior. Em
seguida, a insulina suína purificada é convertida em insulina humana em um meio que
contém apenas uma pequena quantidade de água e tripsina e uma grande quantidade
de solvente orgânico e éster de treonina. A tripsina hidrolisa a insulina em LysB 29 –
AlaB30, ao mesmo tempo em que catalisa a reação inversa na qual o éster de treonina
desloca a alanina da posição B-30 na molécula de insulina. Esta transpeptidação de
insulina suína para insulina humana foi otimizada para 97% de rendimento utilizando
tripsina solúvel (Markussen et al., 1983). A transpeptidação também é catalisada pela
tripsina imobilizada, embora o rendimento seja inferior a 80% (Ueno e Morihara, 1987).
Isto é seguido por purificação cromatográfica para reduzir os níveis mensuráveis de
pró-insulina e remover os outros reagentes. Finalmente, o produto é formulado e então
envasado em condições estéreis, embalado e distribuído.

Insulina Produzida por Métodos Recombinantes.

A insulina humana foi a primeira proteína animal a ser produzida em bactérias

em uma sequência idêntica à do peptídeo pancreático humano (Watson et al., 1983).
Isso foi realizado pela Eli Lilly and Co. (Indianapolis, IN) e Genentech (San Francisco,
CA). Essas empresas trabalharam juntas para alcançar a expressão da insulina
humana recombinante em 1978 em Escherichia coli (E. coli) K-12 usando genes para
as cadeias de insulina A e B sintetizadas no City of Hope National Medical Center
(Chance et al., 1981a). Cientistas da Genentech clonaram os genes em frame com o
gene β-galactosidase do plasmídeo pBR322; o plasmídeo recombinante foi
amplificado em E. coli (Chance et ai., 1981b). A primeira expressão bem-sucedida foi
anunciada em 1978, com ampliação e aprovação pelas agências reguladoras de
medicamentos apropriadas alcançadas em 1982 (Johnson, 1983). O pequeno
tamanho da insulina e a ausência de resíduos de metionina (Met) e triptofano (Trp) nas
cadeias A e B foram elementos críticos na decisão de realizar a clonagem desse
peptídeo, bem como na obtenção do rápido desenvolvimento do processo de
fabricação. Os resíduos Met e Trp produzidos como consequência da engenharia e
expressão em E. coli são hidrolisados pelos reagentes utilizados durante o processo
de recuperação da insulina. A presença desses aminoácidos na insulina teria resultado
na hidrólise e destruição do produto.

Método de duas cadeias

. Embora a insulina humana recombinante seja agora produzida de várias

maneiras, o primeiro método bem-sucedido, ilustrado esquematicamente na Figura 3
(Watson et al., 1983), foi realizado em escala laboratorial pela Genentech, seguido por
uma ampliação bem-sucedida pela Eli Lilly and Company ( Chance et ai., 1981a,b,c).
Cada cadeia de insulina foi produzida como uma proteína de fusão β-galactosidase em
fermentações separadas usando E. coli transformada com plasmídeos contendo a
sequência peptídica de insulina A ou B. Os produtos eram intracelulares e apareciam
em corpos de inclusão citoplasmáticos proeminentes (Williams et al., 1982). O método
usado para extrair os peptídeos dos corpos de inclusão é informação proprietária. As
proteínas recombinantes produzidas em E. coli geralmente representam 10-40% da
proteína total (Burgess, 1987).
Uma vez removidos dos corpos de inclusão, a clivagem química por CNBr no
resíduo Met entre a β-galactosidase (abreviada β -gal) e a cadeia A ou B, seguida de
purificação, deu peptídeos A e B separados. Os peptídeos foram então combinados e
induzidos a dobrar em uma proporção de 2:1 de cadeias AB (formas S-sulfonadas) na
presença de quantidades limitadas de mercaptano para obter um hormônio ativo
(Chance et al., 1981c; Frank e Chance, 1985). Após 24h, o rendimento foi de
aproximadamente 60% com base na quantidade de cadeia B utilizada (Chance et al.,
1981a; Johnson, 1986). Goeddel et ai. (1979) obtido resultados semelhantes com 20%
da proteína celular total expressa como a proteína de fusão da cadeia A ou B. A
dobragem subsequente das cadeias S-sulfonadas deu 50-80% de dobragem correta.
O grande tamanho da proteína de fusão β -gal limitou os rendimentos, uma vez que a
proteína de fusão de @ β -gal (-1000 aminoácidos) e a cadeia A ou B da insulina (21
ou 30 aminoácidos, respectivamente) se desprendeu do ribossomo da célula (cadeia
prematura terminação durante a tradução) e, portanto, produziu peptídeos de insulina
incompletos (Burnett, 1983; Hall, 1987). Uma melhoria chave para esta abordagem foi
o uso do operon triptofano (Trp) no lugar do operon lac (sistema β -gal) para obter uma
proteína de fusão menor.
 O operon Trp consiste em uma série de cinco genes bacterianos que sintetizam
sequencialmente as enzimas responsáveis pelo anabolismo do triptofano. Uma dessas
enzimas, Trp E, tem apenas 190 aminoácidos em comparação com os 1000
aminoácidos de β -gal. O gene Trp E seguido por genes para as cadeias A ou B da
insulina tem a vantagem adicional de aumentar a produção de proteína de fusão de 5-
10% para 20-30% da proteína total (Hall, 1987), uma vez que o promotor Trp é um
forte promotor em E. coli. Isso leva a pelo menos 10 vezes mais expressão do
polipéptido quando comparado com o sistema lac (i.e., &gal) (Burnett, 1983). O operon
Trp é ativado quando a fermentação de E. coli fica sem triptofano (Hall, 1987; Etienne-
Decant, 1988). Esta característica é benéfica durante a fermentação, uma vez que a
massa celular pode ser maximizada primeiro. Então, quando apropriado, o sistema de
produção de insulina da célula pode ser ativado, permitindo que o meio de
fermentação se esgote em Trp. Uma vez que a proteína de fusão de insulina é um
produto intracelular (isto é, corpo de inclusão), a produtividade é proporcional à massa
celular. Se os corpos de inclusão fossem formados prematuramente, o crescimento
celular pararia e, portanto, a massa celular total seria menor do que o máximo
possível. Consequentemente, o "Trp switch" é uma ferramenta prática muito
importante para maximizar a produção.
 A vantagem do sistema Trp LE' em termos de produtividade potencial é clara
na Figura 5. A proteína Trp menor, como a proteína lac grande, é altamente insolúvel.
Consequentemente, a proteína de fusão Trp E também se acumula intracelularmente
na forma de corpos de inclusão insolúveis, que ajudam a retardar a degradação
proteolítica do produto durante a fermentação e recuperação inicial (Burnett, 1983). A
estrutura do plasmídeo codificador de insulina é mostrada na Figura 4, e o tamanho
molecular relativo de várias proteínas quiméricas de insulina humana é mostrado na
Figura 5 (Burnett, 1983).

Detalhes do método de duas cadeias de produção de insulina são fornecidos

na literatura. Fermentações separadas de cepas de E. coli recombinantes específicas
são realizadas para produzir cada cadeia com os corpos de inclusão processados para
produzir formas de S-sulfonato parcialmente purificadas. Estes são posteriormente
usados na reação de combinação (Frank e Chance, 1983; Johnson, 1984; Johnson,
1986). Ambas as fermentações produzem uma proteína quimérica composta pela
cadeia A ou B específica ligada através do aminoácido metionina (Met) a um peptídeo
promotor Trp-LE' (Frank e Chance, 1983). Após a fermentação estar completa, as
células são recuperadas e rompidas. Os detritos celulares são então separados dos
corpos de inclusão, e os corpos de inclusão são dissolvidos em um solvente, embora
as especificidades não sejam conhecidas (Wheelwright, 1991). Os corpos de inclusão
são por vezes dissolvidos em guanidina HCl 6 M e ditiotreitol 0,1 mM (Burgess, 1987).
Em seguida, a cadeia Trp-LE'-Met-A e a cadeia Trp-LE'-Met-B sofrem uma clivagem
de CNBr para liberar as cadeias de insulina A e B. Outras modificações das cadeias A
e B incluem sulfitólise oxidativa, purificação e combinação para produzir insulina bruta.
Esta insulina bruta é submetida a troca iônica, exclusão de tamanho e cromatografia
líquida de alta eficiência de fase reversa para produzir a insulina humana
recombinante purificada (Frank e Chance, 1983). Existe uma patente recente (Bobbitt
e Manetta, 1990) sobre a solubilização caotrópica e sulfitolítica de corpos de inclusão
de proteínas heterólogas. Este processo em particular inclui sulfitólise seguida por
uma etapa de aquecimento, permitindo que a proteína S-sulfonato precipite em alta
pureza: 95% de pureza em comparação com o material de partida. Este método
procura evitar a formação imprópria de ligações dissulfeto ou reticulação
intermolecular que pode ocorrer no processamento convencional após a lise celular.

Método Pró-insulina (Intracelular).

A insulina humana também pode ser produzida com microrganismos

recombinantes que produzem pró-insulina intacta em vez das cadeias A ou B
separadamente. A rota da pró-insulina é o método atual de escolha para a produção
de insulina (Kroeff et al., 1989) e envolve uma sequência de etapas de fermentação e
purificação em vez de duas sequências de etapas (ou seja, uma para a cadeia A e
outra para a cadeia B). Esta abordagem é resumida por Kroeff et al. (1989) com base
na tecnologia recombinante descrita por Watson (Watson et al., 1983), conforme
mostrado na Figura 2. Inicialmente, o mRNA é copiado em cDNA, e um códon de
metionina é sintetizado quimicamente e ligado à extremidade 5' do cDNA da pró-
insulina. O cDNA é inserido em um gene bacteriano em um vetor de plasmídeo que é
introduzido e depois cultivado em E. coli. A proinsulina pode ser libertada do fragmento
da enzima bacteriana β gal) (ou alternativamente da Trp-LE'-Met-proinsulina [Trp
proinsulina]) destruindo o ligante de metionina. A cadeia de pró-insulina é submetida a
um processo de dobramento para permitir a formação de dissulfetos intermoleculares,
e o peptídeo C pode então ser clivado com enzimas para produzir insulina humana
(Frank e Chance, 1983). Em comparação, o método de duas cadeias descrito
anteriormente é mais complexo (Figura 3). A insulina humana, derivada da pró-insulina
gerada através do promotor Trp LE, é discutida por Kroeff et al. (1989). Após a
recuperação, a pró-insulina Trp sofre clivagem CNBr para produzir pró-insulina. A pró-
insulina é submetida a sulfitólise oxidativa, condições de dobra na presença de um
mercaptano, várias etapas de purificação e, em seguida, tratamento enzimático para
formar a insulina bruta. As etapas de cromatografia de troca iônica, fase reversa e
exclusão de tamanho resultam na insulina humana recombinante purificada. Pró-
insulina (secretada). Villa-Komaroff et al. (1978) foram os primeiros a descrever um
sistema de secreção de pró-insulina humana em E. coli. Watson (1983) sugeriu que a
situação ideal para a produção de proteína recombinante seria ter grandes
quantidades da proteína estranha secretada eficientemente no meio pelas bactérias.
No caso específico da insulina, a proteína recombinante poderia ser a β-lactamase
(enzima que inativa a penicilina, que é naturalmente secretada pelas bactérias no meio
de cultura) e a pró-insulina. As leveduras também são atraentes para esse tipo de
sistema, pois secretam apenas algumas de suas próprias proteínas. Portanto, menos
proteínas estranhas precisariam ser removidas na purificação. As leveduras também
são capazes de facilitar a formação de ligações dissulfeto. No entanto, para proteínas
glicosiladas, as leveduras tendem a superglicosilar. A Novo Nordisk A/S usou fermento
de padeiro ou Saccharomyces cerevisiae para secretar insulina como um precursor de
insulina de cadeia simples. Tanto o processo como o produto foram aprovados pelo
Parlamento Dinamarquês em 1986 (Diers et al., 1991). Diers et ai. (1991) descrevem o
peptídeo desdobrado como líder ou prosegmento, seguido de uma sequência Lys-Arg
(reconhecida pela enzima processadora), a cadeia B (aminoácidos 1-29), uma ponte
peptídica curta, seguida pela cadeia A (aminoácidos ácidos 1-21). Neste precursor, o
aminoácido 29 da cadeia B da insulina está ligado ao aminoácido 1 da cadeia A por
um peptídeo de conexão curto contendo um aminoácido básico adjacente à cadeia A.
A insulina humana é produzida por transpeptidação seguida de hidrólise da ligação
éster formada. Seguem-se vários passos de cromatografia para purificação adicional
(Diers et al., 1991). Outro processo para a produção intracelular de pró-insulina
humana na levedura S. cereuisiae foi recentemente descrito (Tottrup e Carlsen, 1990).
Usando este sistema de levedura em uma fermentação alimentada em lote otimizada,
os rendimentos da proteína de fusão de superóxido dismutase-pró-insulina humana
(SOD-PI) foram relatados como sendo 1500 mg/L. SODPI seria o material de partida
para a produção de insulina humana recombinante; rendimentos do produto final não
foram relatados. Aparentemente, a expressão de polipeptídeos heterólogos em
leveduras tem sido algumas vezes inferior ao desejável. Uma patente da Eli Lilly Co.
(Beckage e Ingolia, 1988) descreve um processo de cultivo aeróbico de levedura,
seguido por anaeróbio e depois de volta às condições aeróbicas. Este método é
relatado para resultar em uma alta expressão do produto (produzido intracelularmente
em S. cerevisiae).
Separação Analítica da Insulina

Cromatografia Líquida de Alta Performance de Fase Reversa. A

cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (RP-HPLC) sobre suportes de
alquilsilano parece ser o método de escolha na análise de insulina (Tabelas I e 11)
(Monch e Dehnen, 1978; Damgaard e Markussen, 1979; O'Hare e Nice, 1979; Terabe
et al., 1979; Dinner e Lorenz, 1979; Kroeff e Chance, 1982; Lloyd e Corran, 1982;
Rivier e McClintock, 1983; Parman e Rideout, 1983; McLeod e Wood, 1984, Knip,
1984; Kalant et ai., 1985; Smith e Venable, 1985; Vigh, 1987). A alta seletividade e alta
capacidade de resolução de RP-HPLC usando uma ampla variedade de fases
estacionárias e móveis permitem a separação de espécies de insulina que diferem por
apenas um aminoácido (Koreff et al., 1989). O mecanismo para a separação da
insulina em sistemas RP-HPLC é baseado na hidrofobicidade da insulina e compostos
relacionados. A tendência de algumas proteínas (particularmente proteínas grandes)
para se ligar tão firmemente à fase estacionária que são difíceis de eluir parece ser a
principal limitação dos suportes de alquilsilano. É difícil comparar os sistemas
analíticos descritos nas Tabelas I e 11. Cada sistema em particular foi projetado e
otimizado para uma série específica de separações. Em geral, porém, Smith et al.
(1985) resumiram as condições que afetam a RP-HPLC da insulina e compostos
relacionados. Acetonitrila ou metanol com várias misturas de tampões aquosos são
normalmente usados para a fase móvel na análise de insulina. Os fatores de
capacidade da insulina diminuem com o aumento da concentração de acetonitrila até
40% (Grego e Hearn, 1981). Uma vez que a maioria dos polipeptídeos e proteínas se
ligam fortemente aos suportes de alquilsílica, o sal cloreto pode ser substituído pelo
sal fosfato na fase móvel. A maioria das separações são realizadas à temperatura
ambiente, com detecção ideal de insulina entre 190 e 220 nm. Todos os sistemas
sofrem, em graus variados, de interferências devidas a conservantes ou outras
impurezas de insulina (Smith et al., 1985). Com o advento das insulinas
recombinantes, outros sistemas analíticos, bem como modificações do sistema RP-
HPLC, foram descritos para a separação analítica de insulina, pró-insulina, peptídeo C
e cadeias A e B de insulina entre si e de proteínas de fusão recombinantes. De
Guevara (1985) isolou e quantificou as cadeias A e B da insulina com um sistema RP-
HPLC (Waters Radial Pak com cartucho Bondapak c18, Waters, Milford, MA) usando o
emparelhamento de íons com ácido trifluoroacético (TFA) como o contra-íon para o
Uma cadeia e ácido fórmico para a cadeia B. Kakita et ai. (1981) utilizaram
cromatografia em gel (Biogel P-30, Bio-Rad, Richmond, CA) para separar a proinsulina
do péptido C com ácido acético 1 M como tampão de eluição. Welinder (1984)
analisou a homogeneidade da insulina cristalina usando RP-HPLC (Nucleosil 10 CIS)
e cromatografia de permeação em gel de alta eficiência (HP-GPC) (coluna 1-125,
Waters). Welinder e Linde (1984) relataram a separação de insulina e derivados de
insulina usando cromatografia de troca iônica de alta eficiência (HP-IEC) e deram uma
comparação com RP-HPLC. A cromatografia de troca iônica usando um gradiente de
sal de NaCl 0-0,29 M sobre uma fase estacionária polimérica derivada de DEAE foi
recentemente relatada por Ladisch et al. (1990). Nesta separação baseada em troca
iônica, a insulina foi separada da β-galactosidase e da cadeia A da insulina. A
cromatografia de afinidade também pode ser usada na purificação de proteínas de
fusão. Foi descrito um procedimento de purificação por afinidade de um passo que dá
um rendimento global de 85-95 ?6 de proteína híbrida com actividade β -gal utilizando
TPEG-Sepharose sob condições de elevado teor de sal (Burgess, 1987). Nilsson et ai.
(1989) descrevem uma abordagem geral de fusão de genes para facilitar a purificação
de proteínas recombinantes com base na fusão de um gene de interesse com um
gene que codifica uma proteína com forte afinidade a um ligante (fusão de afinidade).
Smith et ai. (1988) relatam o uso de uma técnica chamada cromatografia de afinidade
de íon metálico imobilizado com peptídeo quelante (CP-IMAC) para purificar a pró-
insulina recombinante. Neste método, a pró-insulina é expressa com um peptídeo
quelante no terminal NH2. A pró-insulina pode então ser purificada por afinidade com
íons metálicos imobilizados, e o peptídeo quelante é removido quimicamente ou
enzimaticamente. A eletroforese é um método comumente usado para detectar
proteínas contaminantes em uma amostra previamente purificada. No entanto, ao
contrário de muitas outras proteínas, as insulinas apresentam um desafio especial.
Técnicas eletroforéticas convencionais separam proteínas até pesos moleculares de
cerca de 12 OOO Da. embora modificações de procedimentos convencionais sejam
relatadas para estender a faixa de separação para Mr = 2500 (Fling e Gregerson,
1986). Proteínas ou peptídeos menores do que isso migram e também podem corar de
forma diferente das proteínas maiores. A insulina é um polipeptídeo (M, = 5800)
[cadeia A M, = 2300, cadeia B Mr = 34001 (Sanger, 1949). Usando as técnicas de
Fling e Gregerson (19861, a cadeia B da insulina mostra um peso molecular
anormalmente alto, enquanto a cadeia A não se cora devido a migração anômala, falta
de bandas ou fixação inadequada antes da coloração. dificuldades envolvidas na
separação eletroforética da insulina das cadeias dos componentes ita A e B. A insulina
pode, no entanto, ser separada da pró-insulina e da insulina monodesamido usando
um sistema de eletroforese de disco-gel de poliacrilamida descrito por Chance et al.
(1968). Neste sistema em particular, no entanto, insulina e dessalanina (des B-30)
possuem a mesma carda e migram de maneira idêntica.
Purificação de insulina humana em Larga Escala

A purificação de uma proteína que foi superproduzida em E. coli requer uma

metodologia um pouco diferente daquela usada na purificação convencional de
proteínas ou técnicas usadas para fins analíticos (Welinder e Linde, 1984). Um grau
extremamente alto de pureza é necessário, bem como a liberdade de solventes e
toxinas contaminantes (de E. coli) e os nutrientes, metabólitos, catabólitos e moléculas
funcionais da célula hospedeira que estão presentes como consequência do
crescimento celular (Johnson, 1986). A proteína recombinante também deve estar livre
de componentes de proteína de fusão. Além disso, as condições de processamento
devem ser escolhidas para evitar a proteólise de proteínas híbridas, especialmente as
proteínas maiores que estão sujeitas a degradação proteolítica (Ullmann, 1984). Em
particular, a insulina deve ser separada de outras formas de insulina (pró-insulina,
insulina desamido, etc.) que podem ser imunogênicas. Um esquema de purificação em
larga escala deve atender a todos esses requerimentos e, ao fazê-lo, estima-se que
mais da metade dos custos de processamento estão na purificação a jusante em
relação à fermentação real (Ullmann, 1984). Os corpos de inclusão são formados em
mais de 80% dos casos em que as proteínas foram superproduzidas em E. coli
(Welinder e Linde, 1984). A proteína de fusão β -galactosidase-insulina de E. coli não
é exceção. Burgess (1987) apresenta um procedimento para liberar uma proteína de
fusão insolúvel envolvendo etapas de lise, centrifugação, desnaturação, renaturação,
recipitação e cromatografia de troca iônica. Muitas proteínas foram purificadas a partir
de corpos de inclusão insolúveis por esses métodos de desnaturação e renaturação.
Procedimentos de purificação mais convencionais podem ser seguidos para uma
proteína de fusão segregada tal como β -lactamase-insulina. Existem poucos
procedimentos detalhados publicados para uma sequência completa de purificação em
larga escala para insulina recombinante de E. coli. No entanto, Kroeff et al. (1989)
descrevem um sistema de escala preparativa de cromatografia multimodal com uma
etapa de RP-HPLC integral desenvolvida para purificar e analisar insulina humana
recombinante produzida a partir de E. coli. Este sistema RP-HPLC é colocado
bastante tarde no sistema de purificação de insulina, uma vez que a maioria das
impurezas (principalmente de E. coli) são removidas antes desta etapa por uma etapa
de troca iônica. Uma separação por exclusão de tamanho segue a etapa de fase
reversa. O sistema de fase reversa é baseado em uma fase estacionária de 10 pm
Zorbax (Du Pont Instruments, Wilmington, DE) CS de grau de processo para as
colunas de escala de produção e partículas de 5 pm para as colunas de escala
analítica. Os cristais de zinco de insulina humana parcialmente purificados preparados
na Eli Lilly and Co. foram o material de partida para esta parte da sequência de
purificação. A insulina foi aplicada em uma fase móvel rica em água e então eluída em
um gradiente linear de 0,25 M de ácido acético (eluente A) a 60% de acetonitrila
aquosa (eluente B). Recomenda-se uma fase móvel ácida, uma vez que proporciona
uma excelente resolução da insulina a partir de componentes semelhantes à insulina
estruturalmente semelhantes, ao mesmo tempo que promove a solubilidade da
insulina. Acredita-se que o pH ideal esteja na região de 3,0-4,0, que está bem abaixo
do pH isoelétrico de 5,4. Sob condições levemente ácidas, a insulina pode desamidar
para insulina monodesamido, mas se o RP-HPLC é feito com bastante rapidez (em
questão de horas), a desamidação pode ser minimizada. Este sistema de RP-HPLC foi
utilizado com sucesso em um sistema em escala de produção para purificar insulina
recombinante com potência biológica igual à obtida do sistema de purificação
convencional, que emprega cromatografia de troca iônica e exclusão de tamanho
(Kroeff et al., 1989). Welinder e Linde (1984) investigaram a cromatografia de troca
iônica de alta eficiência (HP-IEC) para purificação de insulina e compararam este
método com RP-HPLC para separação de insulina. HP-IEC permitiu o fracionamento
rápido da insulina cristalina sem gradiente de sal. Eles descobriram que o HP-IEC
dava boa recuperação e tinha menos contaminantes orgânicos do que o RP-HPLC,
mas precisava ser realizado sob condições de dissociação (7 M de ureia).

Conclusão

A insulina é uma proteína terapêutica que agora tem um histórico de produção

por métodos de DNA recombinante. Melhorias nos métodos de engenharia genética
facilitaram tanto a produção quanto a recuperação desse peptídeo de alto valor. O
método padrão para análise de insulina e derivados de insulina é RP-HPLC. Os
métodos padrão para a purificação da insulina produzida por métodos recombinantes
incluem troca iônica, permeação em gel e cromatografia em fase reversa. Embora a
prática atual desses métodos produza insulina altamente purificada, o refinamento
adicional na separação é uma área de pesquisa contínua. Isso reflete a crescente
demanda por proteínas terapêuticas com contaminação mínima e a necessidade de
reduzir o alto custo de purificação.