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MICOTOXINAS
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MICOTOXINAS
➢ Mais de 300 micotoxinas identificadas.
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MICOTOXINAS
Metabólitos secundários produzidas por fungos
toxigênicos
▪ Aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 (AFT): Aspergillus flavus, A. parasiticus,
A. nomius, outros.
▪ Ocratoxina A (OTA): Penicillium verrucosum, A. westerdijkiae, A.
steynii, A. carbonarius, A. Niger
▪ Desoxinivalenol (DON): Fusarium Graminearum (Giberella zeae), F.
culmorum
▪ Zearalenona (ZEA ou ZON): F. graminearum (G. zeae), F.
culmorum, F. cerealis, F. equiseti, F. semitectum e crookwellense
▪ Fumonisinas B1, B2: F. verticillioides, F. proliferatum
▪ Toxina T-2: Fusarium sporotrichioides
▪ Patulina: Penicillium (expansum), Aspergillus e Byssochlamys
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Efeitos adversos à saúde humana e animal (JECFA 2008)
▪ Zearalenona: Estrogênica
Sintomas característicos: inflamação do útero, mamas e vulva em fêmeas púberes
Atrofia testicular e inflamação das mamas em machos jovens
Infertilidades em animais adultos
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Regulamentação Micotoxinas
Resolução da ANVISA: RDC Nº 7, publicada em 9 de março de 2011
• Aflatoxinas BG: 1 a 20
• Aflatoxina M1: 0,5 a 5
1 em
• Ocratoxina A: 2 a 20 1 000 000 000
• Desoxinivalenol: 750 a 3000 1s em 32 anos
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Regulamentação de micotoxinas em RAÇÃO
10
FAO
Regulamentação de micotoxinas em
INGREDIENTES DE RAÇÃO (União Europeia)
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Regulamentação de micotoxinas em ração (EU)
Micotoxinas Espécie Fase Nível (µg/kg)
Aves e suína Adultos 20
Jovens 10
Bovina
AFLATOXINA B1 Leiteiros 5
Outros - 10
Bovina, suína e caprinas Adultos 20
Todos - 5.000
Bezerros (< 4 meses) JOVENS 2.000
DON
Suína 900
Cordeiros, cães e gatos 2.000
Eqüina, coelho, suína e animais de
5.000
estimação
FUMONISINAS Peixe 10.000
Ruminantes Jovens (<4 meses) 20.000
Ruminantes Adultos 50.000
Aves 100
OCRATOXINA A Suína 50
Cães e gatos 10
Bezerros, gado leiteiro, ovelha e cabras Jovens e lactação 500
Adultos não
Cães e gatos 200
ZEARALENONA reprodutores
Jovens e para
Suína, cães e gatos 100
reprodução
Suína Para engorda 250
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TOXINA T-2 + HT-2 Gatos - 50
Regulamentação Micotoxinas
✓ Ministério da Agricultura. Portaria MA/SNAD/SFA No. 07, de 09/11/88 - publicada
no Diário Oficial da União de 09 de novembro de 1988 - Seção I, página 21.968,
1988: Para qualquer matéria prima a ser utilizada diretamente ou como ingrediente para
rações destinadas ao consumo animal
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Regulamentação Micotoxinas
AMOSTRAGEM
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Representatividade estatística
16
17
18
DETERMINAÇÃO DE MICOTOXINAS
LIMITES
certificado
19
Distribuição
Alimentos não processados – heterogênea
(FAO, 1993; Whitaker, 1996)
Ingredientes e ração
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Fontes da variabilidade
Variância Total
Variância
Variância Preparo de
Amostragem Variância
amostras analítico
ppb (µg/kg)
90% 10%
Whitaker 2004
22
Distribuição
23
Distribuição
24
Evento raro
Lote = 10 ppb
Proporção = 3/10.000 = 0.03%
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Aflatoxinas - distribuição
• Amostras (5 kg)
• Moinho do USDA
• 275 g sub-amostra
• análises por TLC
0 0 0 0 3 13 19 41 43 69
Contaminações determinadas (µg/kg)
Média = 18,8µg/kg mediana = 8 µk/kg
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Aflatoxinas – distribuição Afla total
Lote 23: 4000kg
0,11 100,93
Amostra: 200kg 40,38
0,52
Média (µg/kg) =18,12 39,26
0,55 Mediana (µg/kg) = 5,15
38,11
CV (%) = 124,4
0,76
Valor mínimo (µg/kg) = 0,11 35,21
1,06 Valor máximo (µg/kg) = 100,93
30,93
Variância observada = 612,59
1,23 21,55
1,25 19,33
1,74
17,17
2,06 4,33 5,96 27
27
Contaminações determinadas (µg/kg)
Variabilidade dos resultados 27
Lote 1
0,16 Média = 1,26 11,20
Mediana = 0,53
0,19 CV = 212% 1,18
0,22 1,16
0,26 1,04
0,40 0,90
0,42 0,77
0,46 0,76
0,46 0,59
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Consequência da variabilidade dos resultados
Bons Ruins
0
Limite µg/kg
29
O estabelecimento de limites pressupõe a
disponibilidade de planos de amostragem e de
métodos analíticos
LIMITE
30
Método
analítico
VALIDADO
Equipe treinada
e capacitada
Controle de qualidade
implementado
31
Método
analítico
Análise
TLC
Certificado
Resultado
com
incerteza
32
Variabilidade na distribuição
NECESSIDADE
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Plano de amostragem:
conjunto de procedimentos planejados
Composto de 5 estágios
a- seleção do lote
e - Avaliação
0.9 False Positives
0.8
0.7
Acceptance Probability
estatística
0.6 C Cg = Acceptable C > C g = Unacceptable
Lots Lots
0.5
0.4
0.3
Ca = C g
False Negatives
0.2
0.1
0
0 10 20 30
Aflatoxin Concentration (C) -
ppb
40 50 60
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Plano de amostragem
Curva operacional para aflatoxinas em milho
1,0
0,9 Risco do vendedor
Lotes bons rejeitados
0,8
0,7
0,6
Probabilidade de aceite
0,5
0,4
0,3 Lotes ruins aceitos -
0,2 Risco do Comprador
0,1
0,0
0 10 20 30 40 50 60
Concentração de aflatoxina no lote (µg/kg)
1 kg 5 kg 20 kg Limite
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100 Amostras de 1 e 10 kg
Subamostra de 25 g
1 HPLC
Risco do 5 µg/kg
80 vendedor
60
Lotes aceitos (%)
40
10 kg
1 kg
20
Risco do
comprador
0
0 5 10 15
Concentração de OTA no lote (µg/kg)
36
100
Amostras de 1 kg
25 g Subamostra
1 HPLC
80 5 µg/kg
Lotes aceitos(%)
60
1 x 1 kg
40
2 x 1 kg
3 x 1 kg
20
0
0 5 10 15
Concentração de OTA no lote (µg/kg)
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Plano de amostragem
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Método de amostragem
Conjunto de procedimentos planejados que permitem
fazer a tomada de amostras REPRESENTATIVAS de um
determinado lote ou sublote;
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Amostragem
Quantidade de produto com
características definidas sob
LOTE condições essencialmente iguais
(t)
Quantidade de produto retirada em
Incrementos um só ponto do lote ou sublote
para formar a amostra global
(g)
Amostra global A amostra formada
(kg) pela totalidade dos
incrementos colhidos
em um lote ou sublote
Amostra reduzida (kg)
ISO 6497
Amostra de
trabalho (kg)
Formada a partir da amostra
Laboratório global, podendo ser igual a esta
40
ANEXO A - informativo:
Procedimentos para substâncias
indesejáveis, não homogêneas,
incluindo micotoxinas, cascas de
mamonas e semente venenosas
➢ Método de amostragem para alimentos para bebés e alimentos transformados à base de cereais destinados
a lactentes e crianças jovens
➢ Método de amostragem para lotes muito grandes ou lotes armazenados ou transportados de tal forma que a
amostragem do lote não seja exequível
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MÉTODO DE AMOSTRAGEM: AMOSTRAGEM PARA ALIMENTOS DE
COMMISSION REGULATION ANIMAIS: ISSO 6497
REGULAMENTO (CE) – N° 401/2006
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MÉTODO DE AMOSTRAGEM: COMMISSION REGULATION
REGULAMENTO (CE) N.o 401/2006
➢ Método de amostragem de suplementos alimentares à base de arroz fermentado com levedura
vermelha monascus purpureu
➢ Método de amostragem para especiaria
aflatoxina B1 e soma de aflatoxinas, ocratoxina A
➢ Método de amostragem para leite e produtos lácteos, fórmulas para lactentes e fórmulas de transição,
incluindo leite para bebés e leite de transição
aflatoxina M1
➢ Método de amostragem para café, produtos derivados de café, raiz de alcaçuz e extratos de alcaçuz
Ocratoxina
➢ Método de amostragem para sumos de fruta, incluindo sumo de uva, mosto de uva, sidra e vinho
Ocratoxina
➢ Método de amostragem para frutos secos, incluindo uvas secas e produtos derivados mas excluindo
figos secos
aflatoxina B1 e total de aflatoxinas em frutos secos, exceto figos secos e ocratoxina A em uvas
secas (uvas de Corinto, uvas passas e sultanas).
➢ Método de amostragem para produtos sólidos à base de maçã
Patulina
➢ Método de amostragem para óleos vegetais
Aflatoxinas e fumonisina
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➢ MÉTODO DE AMOSTRAGEM PARA CEREAIS E PRODUTOS DERIVADOS DE
CEREAIS: aflatoxina B1 e soma de aflatoxinas, ocratoxina A e as toxinas Fusarium
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Número de amostras elementares a colher em função do
tamanho do lote
Massa do lote Nº de amostras Peso da amostra
(toneladas) elementares global (kg)
≤ 0,05 3 1
> 0,05 ≤ 0,5 5 1
> 0,5 ≤ 0,1 10 1
>1e≤ 3 20 2
> 3 ≤ 10 40 4
> 10 ≤ 20 60 6
> 20 ≤ 50 100 10
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PROCEDIMENTOS: Lotes: sacas, caixas, big bags...
Calcular a freqüência da amostragem
(F)=Massa do lote (kg) X massa do incremento(kg)
Amostra global(kg) X capacidade da embalagem(kg)
ISO/FDIS 24333:2009
EU 401/2006
Em que:
F = freqüência de amostragem: indica a frequência ou
intervalos regulares de amostragem ou o número de
embalagens individuais das quais será colhido um
incremento.
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Exemplo:
Lote = 25 toneladas de milho
Massa do incremento = 100g
Massa da amostra global = 10kg
Capacidade da embalagem = 50kg
F=Massa do lote (kg) X massa do incremento(kg)
Amostra global(kg) X capacidade da embalagem(kg)
F= 25.000 kg x 0,100kg = 5
10kg x 50 kg
No final:
25.000 kg divididos por 50 kg = 500 sacos
Dos quais 100 deverão ser amostrados: 10 kg
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➢ Amostragem de grãos, sementes, pellets (ISO 6497)
Tipo de Número mínimo de
Massa (m) do lote - toneladas
Produto incrementos
< 2,5 7
“bulk”
> 2,5 20𝑚 até 100
Tamanho da Número (n) de Número mínimo de pacotes a
Embalagem pacotes no lote serem amostrados
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➢ Amostragem de grãos, sementes, pellets (ISO 6497)
51
Os caladores ou coletores de incrementos
deverão ser definidos de acordo com o local da
coleta, o tipo de produto e deverão ser
adequados para coletar a massa adequada do
incremento - 100, 200 ou 300 g.
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Definir e marcar as embalagens a
serem amostradas, considerando a
frequência da retirada de cada
incremento (definido de acordo com a
fórmula 1) e o número de incrementos
previstos.
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Exemplo de amostragem durante a produção
Fábrica produzindo 25 toneladas de ração por turno (lote)
- final do turno (8 horas de produção = 480min): 10 kg (global),
- Incrementos de 100g de ração coletados a cada 50 min.
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Preparo da amostra
55
Preparo: moagem/pasta
(~20 mesh)
Pasta
amostra: água (1:1,5 p/p) Moagem
56
Preparo da amostra – Moinhos
Tipo
Turrax
57
Critérios de desempenho dos métodos analíticos
para determinação de aflatoxinas
Nível Recuperaçã
Micotoxina DPRr DPRR
(g/kg) o (%)
58
Uso da Recuperação
59
59
Critérios de aceitação do lote ou sublote
USO DA INCERTEZA
60
Critérios de aceitação do lote ou sublote
61
Diagrama ilustrativo do efeito da incerteza
Contaminacao de afla considerando a incerteza de 22%
14
12
10
Afla total - ppb
8
6
4
2
0
0 1 2 3 4 5
resultados obtidos
16
14
Afla total (ppb)
12
10
8
6
4
2
0
0 1 2 3 4 5
resultados obitidos
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Subdivisão dos lotes em sublotes em função do massa
do lote
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Número de amostras elementares a colher em função da
massa do lote
Massa do lote Nº de amostras Peso da amostra global
(toneladas) elementares (kg)
≤ 0,05 3 1
> 0,05 ≤ 0,5 5 1
> 0,5 ≤ 1 10 1
>1e≤ 3 20 2
> 3 ≤ 10 40 4
> 10 ≤ 20 60 6
> 20 ≤ 50 100 10
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Regulamentação Micotoxinas
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Regulamentação Micotoxinas
✓ Ministério da Agricultura. Portaria MA/SNAD/SFA No. 07, de 09/11/88 - publicada
no Diário Oficial da União de 09 de novembro de 1988 - Seção I, página 21.968,
1988: Para qualquer matéria prima a ser utilizada diretamente ou como ingrediente para
rações destinadas ao consumo animal
70
Procedimento de análise
Amostra
Amostragem
Laboratório
Análise
Preparo:
moagem e
homogeneização TLC
certificado