978-85-7241-744-0

Capitulo 1 6

Manipulavao de 06citos Inclusos

em Foliculos Ovarianos Pre-antrais

J o s e Ricardo de Figueiredo • Ana Paula R i b e i r o R o d r i g u e s •

C h r i s t i a n i Andrade Amorim • J o s e R o b e r t o Viana Silva

duas funcoes principais, que sao interdependentes:

INTRODUc;Ao uma end6crina (producao e liberacao de horrnonios

ester6ides e outros peptideos) e a outra ex6crina ou

A utilizacao e o desenvolvimento de biotecnicas da
gametogenica. Nessa ultima funcao, o folfculo e um
reproducao animal sao condicoes indispensaveis para
elemento essencial para a manutencao da viabilidade
o aumento da eficiencia produtiva dos rebanhos. Nesse
oocitaria, para assegurar o crescimento e a maturacao
sentido, especialmente no tocante a ruminantes domes­
de o6citos primaries ou imaturos e, finalmente, para
ticos, biotecnicas como a inseminacao artificial (IA), a
liberar um o6cito maturado no processo de ovula­
fecundacao in vitro (FIV) e a transferencia de embrioes
cao. A organizacao do ovario mamffero, ilustrando
(TE) vern sendo utilizadas com sucesso. Outras bio­
suas principais estruturas, incluindo os folfculos ova­
tecnicas terao suaaplicabilidade pratica em Iarga escala
rianos, e mostrada na Figura 1 6 . 1 .
no futuro. Nesse grupo, podem ser colocadas a clonagem

e a manipulacao de o6citos inclusos em foliculos ova­

Tipos
rianos pre-antrais (MOIFOPA).

No intuito de facilitar a compreensao da importan­ A populacao folicular do ovario e bastante heterogenea

cia dessa biotecnica e demonstrar como se inserira no e localiza-se no cortex ovariano. De acordo com o grau

futuro, no contexto da reproducao animal, este capitu­ de evolucao, os foliculos podem ser divididos em:

lo sera dividido em duas partes. A primeira sera dedicada

• Folfculos pre-antrais ou nao cavitarios.
a uma breve revisao sobre os foliculos ovarianos, enfa­
• Folfculos antrais ou cavitarios.
tizando sua formacao, classificacao e destino no inte­

rior dos ovaries. Na segunda parte sera abordada a

Foliculo
Foliculo Foliculo Foliculo
importancia do estudo da populacao de foliculos ova­ pre-ovulatorlo
secundario
rianos pre-antrais (FOPA) isolados in vitro, as princi­

pais tecnicas de isolamento, conservacao e cultivo de

FOPA, bem como o estado atual da MOIFOPA. Por

Hilo
fim, serao discutidas as perspectivas de utilizacao da

biotecnica de MOIFOPA na reproducao de animais

domesticos, silvestres e em perigo de extincao.

Poli culos Ovarianos

DefinifiiO

O folfculo e a unidade morfofuncional do ovario, sen­ Foliculo atresico Ovulacao

do constituido por um o6cito circundado por celulas Figura 1 6 . 1 - Organizacao do ovario, ilustrando suas

somaticas (celulas da granulosa e tecais). Desempenha principais estruturas.

303
304 Manipulacao de 06citos Inclusos em Foliculos Ovarianos Pre-antrais

Os foliculos pre-antrais representam cerca de 90 a Os folfculos primordiais sao os menores foliculos

95% de toda a populacao folicular, armazenando as­ encontrados no ovario. Em bovinos, ovinos e caprinos,

sim a grande maioria dos o6citos presentes em ova­ seus diametros sao de 3 5 , 2 , 35 e 3 3 µ.m , respectiva­

rios mamiferos. mente ' : " . Sao os primeiros foliculos formados no

ovario e consistem em um o6cito imaturo localizado

no centro do foliculo, circundado por uma camada de

Folfculos Pre-antrais
celulas da pre-granulosa de formate pavimentoso,

Os folfculos pre-antrais sao constituidos pelos folfculos demarcada por uma membrana basal que os separa
2·4·5.
primordiais, intermediaries, primaries e secundarios-. do estroma ovariano Os folfculos primordiais estao

Podem ser diferenciados entre si pela forma e pelo localizados na regiao periferica do cortex do ovario,

mimero de camadas de celulas da granulosa que cir­ constituem o pool de reserva de folfculos quiescentes

cundam o o6cito imaturo (Fig. 16.2). e compreendem 90% de toda a populacao folicular

presente no ovario mamfferos". C o m o infcio do cresci­

mento dos foliculos primordiais, processo denomi­

nado ativacao, observa-se crescimento oocitario,

multiplicacao das celulas da granulosa e transformacao

da morfologia dessas celulas da forma de pavimento

para a ctibica. Quando os foliculos possuem um o6cito

circundado por celulas da granulosa com os forma­

tos de pavimento e ciibico, sao classificados como

folfculos interrnediarios, Os folfculos intermediaries

possuem diarnetros de 42, 4 1 e 40,7µ.m em bovinos,

ovinos e caprinos, respectivamente+'.

Os folfculos primaries estao em fase mais avancada

de desenvolvimento e possuem um oocito imaturo

central circundado por uma camada de celulas da

granulosa de forma ciibica". Nesse tipo de folfculo, as

celulas da granulosa aumentam em mimero e tornam­

se mais volumosas'". Em bovinos, ovinos e caprinos,

os folfculos primaries apresentam diametros de 5 5 , 1 ,

52 e 49,8µ.m, respectivamente+".

Os foliculos secundarios caracterizam-se pela pre­

senca de um o6cito imaturo circundado por duas ou

mais camadas de celulas da granulosa de forma ctibi­

ca". Nos folfculos secundarios em estadios mais avan­

cados, observa-se o aparecimento das celulas da teca,

recrutadas de precursores tecais presentes no estroma

ovariano! ' . Nesses folfculos, uma estrutura hialinizada,

deno rni nada zona pehicida tambem ja pode ser evi­

denciada em cortes h istol 6 gicos corados pelo metodo

12
da coloracao PA S- h emato x ilina . A s proteinas para

formacao da zona pelucida comecam a ser sintetizadas

a partir do inicio do crescimento dos foliculos primor­

di ai s e sao claramente visiveis em foliculos secun­

darios'>. Os pequenos folfculos secundarios possuem

diametros de 8 1 , 7 3 e 8 3 µ.m em b ovinos , ovinos e ca­

prinos , respectivamente+'. Em bovinos , grandes foli­

culos secundarios, com varias camadas de celulas da

granulosa , podem atingir ate 200µ.m em diametro.

Foliculos Antrais

C om a intensa proliferacao das celulas da gr a nulos a,

uma ea preenchida por

ar fl uido folicular e identi fi cada

na camada granulosa e entao os fo l i culos passam a

Figura 16.2 - Caracteristicas morfol6gicas de foliculos
ser classificados como antrais ou terciarios, 0 inicio
pre-antrais e antrais. (A) Foliculo primordial. (B) Foliculo

primario. ( C) Foliculo secundario. (DJ Foliculo terciario, da formacao de antro em bovinos , ovinos e caprinos

A = antro; G = celulas da granulosa; N = nucleo: 0 = o6cito. e o b servado quando os fo l f culos atingem 2 5 0 , 1 19

 Manipulacao de 06citos Inclusos em Foliculos Ovarianos Pre-antrais 305

I Blastocisto � � I Endoderma [-+ Saco vitelinico

Oogenese + Celulas germinativas primorctiais

Mitose
(lnkio)

Oogonio +--- Mitose

Meiose

�-O��
- c
_ i
t
_ o
_ 1•
_ n
(_u
_ c
�
leo
_ e
m _p
_ r
6_f
_ a
s_e
_ I
_ l� 1 • parada da meiose

r - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -,
Foliculogenese �--------�--------�

(Inicio) Foliculo primorctial (o6cito 1 • - nucleo em pr6fase I)

Foliculos primario e s-ecundario 1 Crescimen to oocitario

Foliculo terclario (o6cito l' - nucleo em pr6fase I)

! Pico pre-ovulatorto LH - puberdade

06cito 1 • (l • retomada da meiose)

Pr6fase I

Metafase 1
( Maturaceo
Anafase I
( oocitaria
Tel6fase I

06cito 2• - nucleo em pr6fase I I -+ metafase II I l' corpusculo polar

2• parada da meiose

Policulogenese Follculo pre-ovulatorio (o6cito 2• - ruicleo em rnetafase II)

(Fim)

L - - - - - - - - - - - - - - - - - - - �
Ovulacao

�-------L---�
06cito 2• (nucleo - metafase II) '·. I

. Espermatoz6ide 1 1

2• retomada da meiose
l I

06cito 2• (nucleo: metafase U -+tel6fas'e II) I

Oogenese �Fecunda�iio

�I-2_•_c_oc...rp-u-sc_ul_o_po_l_ar_l I
(Fim) ____. 06cito hapl6ide fecundado

Zigoto

Figura 16.3 - Pormacao dos o6citos e foliculos, destacando a relacao dos processos de oogenese e foliculogenese.

LH = horm6nio luteinizante; MCI = massa celular interna.

1•3•14.
e 130µm, respectivamente Os folfculos terciarios simultaneos que precedem o fenomeno da ovulacao e

ainda possuem um o6cito imaturo, ao p a s s o que na a liberacao do o6cito maturado. Especialmente em

maioria das especies somente o folfculo pre-ovula­ ruminantes e seres humanos, a oogenese e a foliculo­

tario ou de Graaf contern um o6cito maturado. A genese podem ter uma longa duracao, alcancando ate

Figura 1 6 . 2 ilustra as caracterfsticas morfol6gicas seis meses em seres humanos e o v i n o s l + ' " . A relacao

de folfculos pre-antrais e antrais. 0 controle do entre esses dois processos e ilustrada na Figura 1 6 . 3 .

desenvolvimento folicular na fase antral foi previa­

mente descrito no Capftulo 3 .

Oogenese

A oogenese pode ser definida como o conjunto de

Origem dos Foliculos Ovarianos
processos que compreende o desenvolvimento e a

Em especial no tocante aos ruminantes, a formacao diferenciacao das celulas germinativas primordiais

dos folfculos ovarianos e, conseqiientemente, a dos (CGP) da femea ate a formacao do o6cito hapl6ide
17
o6citos neles contidos iniciam-se no periodo pre-na­ fecundado . Antes da inclusao no folfculo ovariano,

tal. A oogenese e a foliculogenese sao dois processos a celula oocitaria e precedida da evolucao de dois ti-
306 Manipulaeao de 06citos lnclusos em Foliculos Ovarianos Pre-antrais

pos celulares sucessivos, a saber: as CGP e os oog6nios. da meiose. 0 o6cito retomara a meiose somente se

As CGP tern origem extragonadal e sao formadas du­ for fecundado pelo espermatoz 6 ide. Nesse caso, o

rante o periodo embrionario da seguinte maneira: ap6s rnicleo do o6cito passara, sucessivamente, pelos es­

a fecundacao do o6cito pelo espermatoz6ide, forma­ tadios de anafase II e tel6fase II, seguidos da e x pul ­

se o zigoto que evoluira ao estadio de blastocisto. Este, sao do segundo corpiisculo polar e da formacao do

por sua vez, e constitufdo por duas estruturas, o tro­ o 6 cito hapl6ide f ecundado, marcando assim o fim d a

fectoderma ou trofoblasto e o botao ernbrionario, tam­ oogenese (ver F ig. 16.3).

bem chamado de embrioblasto ou massa celular interna.

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A partir do botao embrionario, tres folhetos serao ori­
Follculogenese
ginados: o ectoderma, o mesoderma e o endoderma.

Deste ultimo folheto sera formado, dentre varias es­ A foliculogenese pode ser definida como o processo

truturas, o saco vitelfnico, do qual serao originadas as de formacao, crescime n to e maturacao folicular, ini ­

CGP, as quais se caracterizam por serem m6veis e ciando-se com a formacao do folfculo primordial e

altamente invasivas I 8. Ainda na vida fetal, nas especies culminando com o estadio de folfculo maturado, tam­

bovina e ovina, as CGP migram para o mesenquima bem conhecido como folfculo de Graaf, pre-ovulatorio

19. 21.
da crista genital e colonizam a gonada indiferenciada ou dominante

Nesse local, as CGP perdem a sua caracteristica mo­ Conforme mencionado anteriormente, a funcao do

vel e multiplicam-se por mitose, podend o at i n g ir cer­ fo li culo e p roporcionar um ambiente ideal par a a

ca de dois milhoes de celulas por animal nos bovinos-". manutencao da viabilidade, bem como o crescimento

Ap 6 s um processo marcado pelo crescimento celular e a maturacao oocitaria. Desse modo, a foliculogenese

e pela redistribuicao de organelas citoplasmaticas, as sera simultanea a oogenese, quando p o6cito estiver

CGP, dentro do ovario, multip l ica m- se ativamente e entre as fases de pr6fase I e metafase II, na m a ioria

diferenciam-se em oogonios. Os oogonios sofrerao das especies. Em outras palavras, o inicio da oogenese

sucessivas mitoses e posteriormente entrarao na pri­ precede o inicio da foliculogenese e so se conclui

meira divisao mei6tica (estadio de pr6fase I) e passa ­ ap 6 s a ovulacao do o 6 cito e a posterior fecundacao

rao a ser denominados o 6 citos ou ov 6 citos. Os o6citos (ver F ig. 1 6 . 3 ) . Nas especies bovina e ovina, em torno

cujos micleos encontram-se na primeira divisao mei6tica do 1 3 0 Q e 90Q dias de gestacao, respectivamente, uma

sao deno rni nados o 6 citos primaries ou imaturos. 0 camada de celulas somaticas planas ou ac h atadas,

micleo oocitario que se encontra na fase de meiose I conheci d as como celulas da pre-granulosa, origina­

passara sucessivamente por quase todos os estadios rias do mesoderma, circundam o o 6 cito primario ou

pertencentes a pr6fase I (lept6teno, zig6teno, paqufteno imaturo (micleo em pr6fase I), formando o foliculo

e dipl 6 teno ) . Porem, o processo mei6tico e interrom­ primordial. Ap6s a forrnacao dos folfculos primordiais,

pido (primeira parada da meiose ) no estadio de dipl6- as celulas da pre-granulosa param de se multiplicar

teno, tarnbem denorninado estadio de dicti6teno ou e o folfculo primord i al entra no perfodo de dormencia

de vesicula gerrninativa (VG ) . 0 nticleo do o6cito per­ ou quiescencia. A proliferacao cel u lar e retomada

manecera nesse estadio pelo menos ate que o animal s o mente quando o folfculo primordial ( quiescente )

atinja a puberdade. Durante o perfodo em que o micleo comeca a crescer, meses ou anos ap6s sua formacao,

oocitario se encontrar na pr6fase I, o o6cito, em Inti­ passan d o sucessivamente p elos estadios de folfculos

ma inter-relacao com as celulas somaticas inclusas no intermediaries, primaries e secundarios (foliculos pre­

compartimento folicular, empreendera uma intensa fase a ntr a is ) e terciarios ( folfculos antrais ) ate chegar ao

de crescimento, caracterizada por aumento na ativi­ estadio de foliculo pre-ovulatorio". A cronologia da

dade transcricional (sintese de RNA ) , acumulo de oogenese e da foliculogenese no periodo fetal nas

lipideos e absorcao ativa e/ou p assiva de diferentes especies bovina e ovina e mos tr ada na Tabela 1 6 . 1 .

nutrientes. Quando o animal atinge a puberdade, em A populacao total de folfculos no ovario dos ma­

razao da ocorrencia de liberacoes pre-ovulatorias de mfferos consiste em um a grande reserva de foliculos

hormonio luteinizante ( LH), algumas horas antes da p ri m ordiais quiescentes, mas seu mirnero e progres­

ovulacao, a meiose e retomada e O micleo oocitario siva rn ente reduzido durante a vida reprodutiva da fe­

entra em diacinese. Nesse momenta, inicia-se o pro­ mea". fa os folfculos em crescimento (intermediaries,

cesso de rompimento da VG, seguido das fases de primarios, secundarios e antrais) estao presentes em
23
metafase I, anafase I e tel6fase I, quan d o entao ocorrera mimero muito menor em ovaries de mamfferos . Al­

a expulsao do primeiro corpiiscu lo polar, resultando guns foliculos primordiais iniciam o seu crescimento

na formacao do o6cito secundario, assim denorninado tao logo se formam, mas outros permanecem quies­

pelo fato de seu micleo encontrar-se na segunda divi­ centes por meses ou anos. Na ma i oria das especies,

sao rn e i 6 tica. Essa se caracteriza por uma rapida e, as o crescimento folicular comeca com a transformacao

vezes, inexistente fase de pr6fase II, que progredira morfol6gica de foliculos primordiais, em que o o6cito

ate metafase II, quando entao ocorre a segunda parada circundado por uma camada de celulas da pre-granulosa
 Manipulacao de 06citos Inclusos em Foliculos Ovarianos Pre-antrais 307

de formato pavimentoso evolui para folfculos inter­ Tabela 16.1 - Cronologia da oogenese e da foliculogenese
7,59
em ovaries de fetos bovinos e ovinos1
mediarios e primaries, em que os o6citos sao cir­

cundados por uma camada de celulas da granulosa

Dias de gestacao

de forma cub6ide. Recentes estudos tern demons­

Eventos Bo vino Ouino
trado que os foliculos primordiais e em estadios sub­

seqiientes de desenvolvimento expressam diferentes Identificacao das celulas 35 23

germinativas primordiais
fatores de crescimento que sao fortes candidatos para
Diferenciacao sexual da gonada 39-40 31
controlar a ativacao e o desenvolvimento folicular
Desenvolvimento dos grupos 57 43
na fase pre-antral. Um <lesses fatores e o kit ligand
de oogonios
(KL), tambem denominado stem cell factor ou steel
Multiplicacao dos oogonios: inicio 60 48
factor, que interage com o seu receptor c-kit. 0 KL
Fim 170 55
tern sido demonstrado em celulas da granulosa de
Slncronizacao da mitose em:
folfculos pre-antrais em diferentes especies (murinos,
4 oogonios 62 48
seres humanos, ovinos, caprinos). 0 receptor c-kit e
8 oogonios 74 53
expresso em o6citos de foliculos pre-antrais de roe­
16 oogonlos 82 55
24-28
dores, ovinos e caprinos e tambem e encontrado
Inicio da meiose 75-82 55
nas celulas da teca de foliculos secundarios ou em
Inicio da separacao dos foliculos 90 66
estadios mais avancados de desenvolvimento (mu­
Surgimento dos foliculos primordiais 130 90*
27 28
rinos, ovinos, caprinos)24· · . Camundongos trans­
Surgimento dos foliculos primaries 140 95
genicos que nao sintetizam KL ou c-kit apresentam
Surgimento dos foliculos secundarlos 210 103
a foliculogenese interrompida na fase pre-antral, mos­
Surgimento dos foliculos terciarios 2 3 0 - 250 150
trando a importancia do sistema KL!c-kit para a
Nascimento 280 150
foliculogenese inicial/".

Di versos fatores de crescimento pertencentes a fa­

mflia de fatores de crescimento de transforrnacao-B

(TGF-�) tambern foram demonstrados em foliculos (LIF) (murinos ) 4 4 - 5 1 . Algumas neurotrofinas, como

pre-antrais de diferentes especies. Membros dessa o fator de crescimento do nervo (NGF) e seu recep­

familia, como o fator de crescimento e diferencia- tor, sao tarnbem expressas em folfculos pre-antrais

9ao-9 (GDF-9) e a protefna morfogenetica 6 s s e a - 1 5 de camundongos52. Alern disso, demonstrou-se re­

(BMP 1 5 ) estao presentes em foliculos pre-antrais centemente que o hormonio antimiilleriano (AMH)
30-33
de roedores, primatas, caprinos, bovinos e ovinos . e sintetizado por celulas da granulosa de folfculos

Esses dois fatores sao extremamente importantes para pre-antrais de murinos53. Todas essas inforrnacoes

a foliculogenese inicial, pois camundongos e ove­ mostram que a ativacao de foliculos primordiais e o

lhas transgenicas que nao expressam, respectivamente, posterior crescimento de foliculos primaries e secun­

GDF-9 e BMP 1 5 apresentam crescimento folicular darios sao controlados por um sistema bastante com­

interrompido na fase de folfculos primaries e sao plexo, envolvendo a participacao de diferentes fatores
34 5
conseqiientemente inferteis ,3 . Outras BMP, como de crescimento e tambem de horrnonios. Apesar do

BMP 2, 4, 6 e 7 e seus receptores (BMPR-11, IA e IB), crescimento folicular na fase pre-antral nao ser depen­

tambem sac encontradas em foliculos pre-antrais de dente do hormonio folfculo-estimulante (FSH), exis­

murinos-". A ativina e um outro membro dessa farm1ia, tem evidencias de que o FSH influencia indiretamente

que juntamente com seus receptores dos tipos IA, e s s a etapa da foliculogenese'".

IB, IIA e IIB estao presentes em foliculos pre-antrais

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de roedores, primatas, sumos, ovinos, bovinos e capri­
Populafao Folicular
nos37-42. A folistatina tambem esta presente em
2
foliculos pre-antrais de caprinos e ovinos40 . 4 . Ape­ A populacao folicular no ovario ao nascimento foi

sar da folistatina nao pertencer a famflia TGF-�, neu­ estimada em 2 3 5 . 0 0 0 folfculos em vacas, 160.000

traliza a a9ao de ativina e B M P - 1 5 , controlando assim em ovelhas, 3 7 . 0 0 0 em cabras e 2 . 0 0 0 . 0 0 0 em mu­

3 lheres8,55-57. Entretanto, o mimero de folfculos pre­
a acao desses fatores4 .

Os foliculos pre-antrais tambem expressam ou­ sentes no ovario e marcado por uma grande variacao
58
tros fatores de crescimento, como o fator de cresci­ individual . Em bovinos, a populacao folicular pode

mento epidermico (EGF) e seu receptor (caprinos, variar de O a 7 2 0 . 0 0 0 folfculos por ovario-". A po­

suinos, seres humanos, hamsters); fator de cresci­ pulacao e a distribuicao dos diferentes tipos foliculares

mento fibroblastico-Z (FGF-2) (bovinos, murinos); nos ovaries de animais podem ser afetadas por va­

fator I de crescimento semelhante a insulina (IGF-I) rios fatores, incluindo raca, idade, niveis hormonais
17 20 23·59- 6 1 .
e seu receptor (bovinos); e o fator inibidor de leucemia e estado reprodutivo · ·
308 Manipulaeao de 06citos Inclusos em Foliculos Ovarianos Pre-antrais

65.
de atresia Independentemente da fase em que ocorre
Atresia Folicular e seu Impacto na
e apesar de ser um fenorneno natural, a atresia reduz

RedufiiO Massiva do Capital de maneira significativa o mimero de o6citos poten­

cialmente ovulaveis, diminuindo, em consequencia,

Oocitario no Ovario
a producao de o6citos viaveis durante a vida re­

Conforme mencionado anteriormente, o ovario dos produtiva de um animal. Em resumo, o desenvolvi­

mamiferos contem milhares de o6citos inclusos em fo­ mento de um foliculo pre-ovulatorio in vivo a partir

liculos pre-antrais. Entretanto, a grande maioria desses de folfculos pre-antrais e um fenorneno raro, porque

folfculos nao chega a ovulacao, mas ao contrario, e se considera que nos bovinos somente um em cada

eliminada por meio de um processo conhecido por mil folfculos primordiais atingira o estadio de folfculo

atresia folicular. Evidencias morfo16gicas indicam que maturado ou pre-ovulatorio.

existem dois tipos de atresia: A e B . Na atresia do tipo 978-85-7241-744-0

A, observada mais comumente em foliculos pre-antrais,

as alteracoes degenerativas ocorrem primariamente no

Manlpulacao de 06citos
o6cito. No tocante a atresia do tipo B, que ocorre com

mais frequencia nos folfculos antrais, as primeiras al­

Inclusos em Policulos
8.
teracoes ocorrem nas celulas da granulosa A atresia

e um processo fisiol6gico, de duracao desconhecida, Ovarianos Pre-antrais

que pode ocorrer por via degenerativa e/ou apopt6tica.

Um grande mimero de evidencias tern demonstrado

Conceito
que a apoptose, na verdade, e o mecanismo bioquimico
62.
responsavel pela atresia folicular A apoptose e um A manipulacao de o6citos inclusos em folfculos ova­

programa de suicfdio celular ativo encontrado em todos rianos pre-antrais (MOIFOPA) e uma biotecnica que

os organismos multicelulares e ocorre em tecidos que consiste:

estao sofrendo alteracoes no desenvolvimento ou res­

pondendo a um estimulo fisiol6gico. A alteracao tipi­ • No isolamento ou resgate de folfculos pre-antrais a

ca observada e a condensacao da cromatina, resultando partir de ovaries.

na formacao de zonas densas de heterocromatina so­ • 'Na conservacao visando a estocagem por curto

bre a membrana nuclear. Independentemente da con­ (resfriamento) ou longo ( criopreservacao) perfodo.

densacao da cromatina, endonucleases dependentes de • No cultivo folicular que tern como finalidade pro­

calcio e magnesio sao ativada s, resultando na clivagem mover o crescimento, a maturacao e a fecundacao

do DNA entre as unidades de nucleossomos, a cada in vitro dos o6citos previamente inclusos em folfculos

1 8 0 a 200 pares de bases='. 0 citoplasma de celulas ovarianos pre-antrais (FOPA).

apopt6ticas e caracterizado pela agregacao e desorien­

tacao das organelas citoplasmaticas. Ao mesmo tem­

Importancia
po, a membrana plasmatica mostra sinais de retracao

e finalmente a celula rompe-se em diversos fragmentos Aspectos anatomicos como forma, tamanho e localiza­
63
conhecidos por corpos apopt6ticos . Esses corpos <;:ao ovariana e a organizacao histol6gica dos ovaries,

apopt6ticos sao entao fagocitados pelas celulas da vizi­ compreendendo as suas regioes (cortical e medular),

nhanca. Esse processo em geral inicia-se antes que a bem como as estruturas constituintes do estroma (te­

membrana plasmatica perca completamente sua inte­ cido conjuntivo, fibroblastos, vasos sangufneos, va­

gridade, dessa forma nao ocorrendo extravasamento sos linfaticos, nervos) e do parenquima (foliculos, corpo

dos componentes citoplasmaticos e nao se observando hemorragico, corpo luteo, corpus albicans) tern sido
63 68
reacao inflamat6ria . A atresia folicular e um processo descritos de modo extenso . Da mesma forma, as duas

de duracao ainda pouco conhecida, que nao e preva­ principais funcoes gerais dos ovaries, isto e, end6crina

lente de modo igual em todos os estadios do desen­ e gametogenica (producao e liberacao do o6cito por
64 65
volvimento folicular , . Byskov sugere que a atresia ocasiao da ovulacao) sac igualmente descritas em

pode ocorrer em qualquer momento do desenvolvi­ diversas publicacoes?'. No que se refere a funcao ga­

mento folicular, incluindo a fase pre-antral'". Em metogenica, embora.se saiba que resulte da interacao

caprinos e ovinos demonstrou-se que a atresia atinge de dois processos, isto e, oogenese e foliculogenese,

12 e 50% dos foliculos pre-antrais, respectivamente'V". muito pouco e conhecido sobre os mecanismos que

Por outro lado, na maioria das especies estudadas, controlam o desenvolvimento e a regressao (atresia)

diferentes autores mostraram que a grande maioria dos folicular. Apesar do desenvolvimento de folfculos

folfculos antrais que apresentam diferenciacao termi­ antrais, notadamente em bovinos, ter sido amplamen­

nal das celulas da granulosa e da teca nao se desen­ te descrito, informacoes concernentes a fisiologia dos

vol ve ate o estadio de ovulacao, mas morre pelo processo folfculos pre-antrais sao escassas. E sabido por meio
312 Manipulacao de 06citos Inclusos em Foliculos Ovarianos Pre-antrais

Figura 16.6 - Principais materiais e equipamentos utilizados no isolamento e identificacao de foliculos ovarianos
pre-antrais bovinos. (A) Ovario no tissue chopper. (B) Suspensao de fragmentos no meio de isolamento. (C) Disso­

ciacao mecanica dos fragmentos de ovario com pip eta Pasteur. (D) Filtracao da suspensao em malhas de 500 e lOOµm.

Figura 16.7 - Follculcs pre-antrais isolados mecanicamente. (A) Foliculo primordial. (BJ Foliculo primario. ( C)

Foliculo secundario.

978-85-7241-744-0

alguns componentes como solucao salina, antibi6-

Cultivo In Vitro de Foliculos
ticos (penicilina, estreptomicina), tamp6es (bicar­

Ovarianos Pre-antrais bonato, fosfato, HEPES) e diferentes substratos

nutricionais (monossacarfdeos, lipideos, proteinas,

Bases Gerais do Cultivo de Policulos aminoacidos, acidos nucleicos, vitaminas, etc.) cons­

tituem a base da maioria dos meios disponfveis. Ade­

Pre-antrais
mais, esses meios basicos sao f r e q ti e n t e m e n t e

O objetivo principal do cultivo in vitro de FOPA e enriquecidos com fontes proteicas (soro fetal bovi­

permitir o desenvolvimento folicular assegurando no, F C S ; soro de vaca em estro, E C S ; soro de ma­

o crescimento e a maturacao dos o6citos, bem como cho castrado, SS; albumina serica bovina, BSA),

a multiplicacao e a posterior diferenciacao das ce­ horm6nios (FSH, LH, hormonio do crescimento,

lulas da granulosa inclusas nesses foliculos. 0 sis­ AMH,. andr6genos e e s t r a d i o l - L z ji ) , peptfdeos

tema de cultivo ideal deve preencher tres requisitos (peptideo intestinal vasoativo - VIP) e diversos fa­

basicos e sequenciais, a saber: preservar a viabilidade tores de crescimento (ativina, kit ligand, fator de

dos foliculos, conservar sua aparencia morfol6gica crescimento ceratinocitico - KGF -, BMP 7 , LIF,

pre-existente in vivo e, finalmente, desde que man­ EGF, FGF, TGF-a, T G F - � , IGF-I, IGF-II e GDF-9)

tidas as condicoes precedentes, assegurar o cresci­ em diferentes cornbinacoes e concentracoes. Inde­

mento e a maturacao folicular. Em especial no tocante pendentemente da cornposicao do meio, para o su­

a animais domesticos, os sistemas de cultivo dispo­ cesso do cultivo a osmolaridade e o pH devem

niveis preenchem somente de modo parcial os re­ situar-se, respectivamente, entre 280 e 3 lOmOsm/L

quisitos mencionados. A composicao dos meios e 7 ,2 e 7 , 4 . A duracao do cultivo pode variar de um

utilizada para o cultivo de FOPA varia enormemen­ a varies dias, de acordo com a finalidade do expe­

te de acordo com o estudo realizado. Apesar disso, rimento. Alem do meio de cultivo, outro componente
 Manipulacao de 06citos Inclusos em Foliculos Ovarianos Pre-antrais 313

que nao afeta propriamente a viabilidade do foliculo, Protocolo de Cultivo de Folfculos

mas sim a sua habilidade de responder a diferentes
Ovarianos Pre-antrais In Vitro
estfrnulos (horm6nios, peptideos e outros fatores de

crescimento), diz respeito ao substrato com o qual o A titulo de informacao pratica, serao apresentados a

folfculo mantem contato. Do ponto de vista didatico, seguir, em detalhes, os protocolos de ativacao de

de acordo com a forma de contato do foliculo com o folfculos primordiais e de cultivo de folfculos prima­

substrato, podem-se classificar os sistemas de cultivo rios e secundarios apes isolamento. Diferentes meto­

em bi e tridimensionais , conforme ilustrado na F igura dos tern sido desenvolvidos para o estudo da ativacao

16 .8. o sistema bid i mensional , o folfculo encontra­

N
de folfculos primordiais. Em roedores, a pequena di­

mensao dos ovaries possibilita o cultivo do orgao inteiro,

se sobre o substrato. Esse substrato pode ser o proprio

o que tern sido bastante iitil para o estudo da folicu­

plastico da placa de cultivo, recoberto ou naopor ag ar,
logenese inicial em pequenos mamiferos. Eppig e
por componentes da matriz extracelular purificados
O'Brien obtiveram grande sucesso com a ativacao de
(colageno do tipo I, fib ronectina, larninina e M atrigel),
folfculos primordiais in vitro e desde entao esse mo­
ou mesmo por monocamada de celulas somaticas ( celu­
delo tern sido usado por diferentes grupos de pesqui­
las da granulosa , fibroblastos e demais componentes
sadores". Por outro lado, em animais domesticos de
do estroma ovariano). No s i stema tridimensional, o
medic e grande porte, em razao das grandes dimen­
folfculo encontra-se no interior do substrato, ou seja,
soes dos ovarios, nao e possfvel utilizar esse modelo.
esta totalmente circundado por ele. Os substratos mais
Para esses animais tern sido cultivados pequenos frag­
comumente utilizados nesse t i po de sistema sao o
mentos de cortex ovariano, rico em foliculos primor­
colageno do tipo I e o a gar. E bem conhecido e rela­
diais, para se estudar a ativacao desses foliculos de
tado em diferentes artigos que existe uma relacao direta 2
caprinos, bovinos, babuinos e seres humanos ,89-92_

entre forma e funcao celular. A forma da celula e de­

terminada, entre outros fatores, pelos componentes do
citoesqueleto (actina, talina ) . 0 mecanismo de
Utilizando-se desses modelos, os autores citados de­
monstraram que a grande maioria dos foliculos pri­
acao
mordiais, ate 80%, e ativada e cresce para o estadio

de substratos a b ase de componentes da matriz extra­ de foliculos primaries. 0 cultivo de pequenos frag­

celular e ligar-se a proteinas transmernbranicas de­ mentos de cortex ovariano tern a vantagem de manter

nominadas integrinas, q ue por sua vez estao ligadas ,--, o contato celular e facilitar a perfusao do meio para o

aos componentes do citoesqueleto. Agindo assim, as tecido ovariano'".

protefnas da matriz extracelular, atuando no citoes ­ Diversos marcadores tern sido utilizados para de­

queleto indiretamente por meio das integrinas, contro­ tectar a proliferacao das celulas da granulosa durante

lam a forma da celula e em consequencia interferem o cultivo in vitro. 0 antigeno nuclear de proliferacao

na sua funcao.
celular (PCNA) e uma proteina presente somente em

Exemplos

Meio de cultivo _ B
Foliculo�

A 1 2 3

Exemplo

Foliculo
B Substrate �

Figura 16.8- S istema de cultivo de f olfculos pre-antrais: (A) S istema bid i me n s i o n al. (B) S ist e ma tridimens i o n al -

f olfculo cultivado n o interior do substrato. 1 = suporte plastico sem revestimento; 2 = suporte plastico revestido p o r
celulas: 3 = suporte plastico revestido p or agar ou el e m en t o s da matriz e xtracelular; 4 = sup o rte plastico revestido

por elementos da matriz + celulas.

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 Manlpulacao de 06citos Inclusos em Foliculos Ovarianos Pre-antrais 315

A
B

Figura 16.9 - Foli culos pre-antrais normais (A) e d ege n e rad o s (B) ap6s cultivo in vitro.

978-85-7241- 744-0

cia, a adesao e a morfologia de PO PA serao discu­ composicao do meio de isolamento. Quando o PBS

tidos a seguir, com enfase na especie bovina. A s foi usado como meio de isolamento, a grande maio­

perdas de fo lf culos durante o cultivo in vitro po­ ria dos foliculos apresentou o6citos degenerados ap6s

dem ocorrer de duas maneiras : o primeiro dia de cultivo'".

A composicao do meio de cultivo e outro fator que

• P or degeneracao. afeta a viabilidade folicular, pois Figueiredo et al.

• P ela inabi l idade do foliculo em aderir ao substrato descreveram que a sobrevivencia dos foliculos pre­

e consequentemente ser perdido por ocasiao das antrais bovinos in vitro foi reduzida na ausencia de

tr ocas de meio de cultivo. hipoxantina e substratos energeticos, tais como o

piruvato e a glutamina'". Foi mostrado que a adicao

de uma mistura de piruvato (0,23mM), glutamina

Perdas Foliculares por DegenerafiiO Folicular
(2mM) e hipoxantina (2mM) ao meio de cultivo de

A ta x a de degeneracao folicular que ocorre com pre­ base denorninado de controle (MEM suplementado

dominancia no o 6 cito durante o cultivo de P OPA com antibi6ticos: 200UI/mL de penicilina e 200µL/mL

bovinos pode ser in fl uenciada princi p almente p or de estreptornicina, 10% de FCS e ITS - 6, 25µg/mL de

tres fatores : insulina, 6,25µg/mL de ansferrina e 6,25ng/mL de se­

tr

lenio) aumentou a porcentagem de folfculos morfolo­

• T ipo de ovario utili z ado como doador de PO PA. gicamente n ormais de 2 9 , 4 % (mei o controle) para

• Meio utilizado no isolamento folicular. 78 , 6 % (meio tratado).

• Composicao do meio de cultivo.

Perdas Foliculares por Inabilidade de

No tocante a influencia do estado fisiol 6 gico do

a n im a l, Figueiredo et al. testaram a eficiencia de ova­

Adesiio Folicular ao Substrato

rios de b ezerra, vacas adultas em ciclo normal, ges­

O cultivo de POPA bovinos diretamente sobre o su­
tantes e em p 6 s - parto, como doadoras de POPA para
porte de plastico apresenta como inconvenientes, alem
91.
o cultivo in vitro A p 6 s cinco dias de cultivo, de­
da alteracao da forma folicular, as grandes perdas
monstrou - se que a porcentage m de folfculos viaveis
foliculares durante as trocas de meio, pelo fato dos
o r iu n do s de vacas em p 6s- part o ( 3 2 , 1 % ) foi signifi­ folfculos nao aderirem ou aderirem fracamente ao

cativamente inferior a ovaries de bezerras ( 5 5 , 5 % ) , plastico. No sentido de superar esses problemas, Figuei­

vacas em ciclo normal (71,7%) e vacas gestantes redo et al. avaliaram o efeito de diferentes tipos de

(60,7%). E s ses resultados mostram q ue o estadio matriz extracelular (fibronectina, colageno do tipo I,

reprodutivo das fe meas doadoras de ovaries afeta a Matrigel e larninina), nos sistemas bidimensional e

viabilidade de POPA cultivados in vitro. A sobrevi ­ tridimensional de cultivo, sobre a morfologia e a ade­

vencia de POPA pode tambem ser afetada pel a sao folicular ao substrato'". No sistema bidimensional,
 Manipulacao de 06citos Inclusos em Foliculos Ovarianos Pre-antrais 317

meio sem suplementacao+U. Ao contrario dos efeitos Tabela 16.4 - Influencia de hormonios e fatores de

benefices do FSH sobre o desenvolvimento in vitro crescimento sobre a ativacao e o crescimento in vitro

de foliculos ovarianos pre-antrais

de foliculos pre-antrais bovinos descritos anteriormente,

Nuttinck et al. mostraram que o pFSH (FSH porcino) Estadio folicular Efeito positivo Efeito negativo
induz a degeneracao em pequenos folfculos pre-antrais
Primordial IGF-1 e II (pl IGF-1 (b)
bovinos e que essa degeneracao parece ser atenuada
113
GDF-9 (r) AM H ( r )
pelo F G F - 2 . Esse trabalho tambem demonstrou que
Insulina (r, b, p)
o FGF-2 provoca aumento da sfntese de DNA folicular,
Kit Ligand (r)
que nao e observada na presenca do pFSH. A discor­
FGF-2 (r)
dancia entre os resultados obtidos por Nuttinck et al.
LIF (r)
e os dos autores mencionados anteriormente, no tocante

ao efeito do FSH sobre o desenvolvimento de POPA Primario FSH (r, p) AM H ( b )

bovino in vitro, e provavelmente decorrente de dife­ GDF-9 (r, p, o) Estradiol (r)

rencas nos procedimentos de isolamento folicular e BMP 15 (o)

nos diferentes sistemas de cultivos empregados'!". FGF-2 (b)

Em animais de laborat6rio, diversos fatores influen­

Estradiol (b)

ciam positivamente o crescimento de folfculos pre­

EGF (r)
antrais, como FSH, GDF-9, EGF, TGF-�, ativina, KGF,
TGF-� (r)
LH e hormonio do crescimento (GH). Outras subs­
Ativina (r)
tancias, como o AMH, inibem o desenvolvimento de
Andr6genos (p)
folfculos pre-antrais de camundongos'P', Provavelmen­
Secundario FSH (r, p, b) FSH (r, b)
te, a interacao de varies fatores inibidores e estimu­
GDF-9 (r, p, o) IGF-1 (b)
lantes e responsavel pelo controle do desenvolvimento

de folfculos pre-antrais. BMP 15 (o) TGF-� (b)

A influencia de diferentes hormonios, fatores de cres­ FGF-2 (b) Ativina (r)

cimento e outros peptfdeos sobre a ativacao e o cresci­ IGF-1 (r, b) AM H ( r )

mento in vitro de FOPA e ilustrada na Tabela 1 6 . 4 . KGF (r)

LH (r)

Crlopreservadio de 06citos lmaturos GH (r)

Estradiol (b)
Oriundos de Foliculos Pre-antrais
EGF (r, b)

Hist6ria da triopreserva�ao TGF-� (r)

Ativina (r, b)
o A criopreservacao teve um grande avanco com a des-
� .
Andr6genos (p)
v coberta acidental de que o glicerol dispunha de habi­
t-;- Terciario
� lidade para proteger as celulas contra as lesoes causadas

� pela congelacao. De acordo com Pegg, em 1948 foi Adaptado de Fortune-'".

v-i

l descoberto por acidente que o glicerol poderia permi- b = bovinos; o = ovinos; p = primatas; r = roedores.

8:: tir a sobrevivencia dos espermatoz6ides de aves du-

114.
rante a congelacao a uma temperatura de - 7 0 ° C

Varias especulacoes surgiram sobre como se deu essa fernininos (o6citos) inclusos no tecido ovariano deratas
115 7
descoberta. Atualmente, esta claro que um engano ao e camundongas -11 . Apesar da eficiencia do glicerol,

etiquetar uma garrafa de solucao em um refrigerador os pesquisadores mostraram tarnbem que a congelacao

permitiu que o semen de ave fosse congelado em uma e a descongelacao de ovaries causava a destruicao de

mistura de glicerol, albumina e agua, ao inves da so­ mais de 90% dos o o c i t o s ! " . Contrariamente, outro

lucao planejada, contendo levulose (frutose). Os re­ trabalho mostrou que um grande mimero de o6citos

sultados da experiencia mostraram que 11 solucao de oriundos de folfculos primordiais sobrevivia e torna­

levulose foi ineficaz B que a solucao q� glicerol, ao va-se maturado ap6s transplante para femeas ovariecto­
115
contrario, foi altamente efetiva. No princfpio, os pes­ rnizadas . Historicamente, em razao de seu baixo efeito

quisadores nao conheciam a composicao da sua solu- t6xico, o glicerol tern sido utilizado de modo extensivo

9ao aparentemente "milagrosa", mas com a ajuda de como ACP para a congelacao de semen de animais e

um quimico analftico descobriu-se sua verdadeira seres humanos. Entretanto, seu uso para preservacao de

identidade e experimentos posteriores revelaram que tecido tern sido limitado por sua capacidade pobre

o glicerol era o ingrediente ativo. Ap6s a descoberta de penetracao-!". Atualmente, varies outros ACP como

do glicerol, varies trabalhos foram feitos com essa o dimetilsulf6xido (DMSO), o propanodiol (PROH) e o

substancia como agente crioprotetor (ACP) de gametas etilenoglicol (EG) tern sido utilizados de forma ampla
318 Manlpulacao de 06citos Inclusos em Policulos Ovarianos Pre-antrals

para a criopreservacao de o6citos ou tecido ovariano por zada, apresentando uma zona pehicida, cromossomos

ja terem mostrado resultados superiores ao glicerol 119-124_ alinhados ao longo de um delicado fuso de microtiibulos

(fuso mei6 tico) e granules corticais perifericos. Essas

estruturas sao altamente suscetfveis aos danos causa­

Principais Avancos
dos pela criopreservacao e pelos crioprotetores e isso

A criopreservacao de o6citos e uma alternativa para pode ser a causa das baixas taxas de sobrevivencia e

conservar o material genetico de especies ou racas de fecundacao ap6s a descongelacao, comumente relata­

animais domesticos utilizadas comercialmente, bem d a s 1 3 4 , 1 3 5 . Varies estudos tern indicado que anormali­

como de mamfferos silvestres. Essa tecnica tarnbern e dades graves podem se desenvolver durante diferentes

importante na medicina humana para estocar o6citos estadios do processo de criopreservacao, inclusive a
127
de mulheres com problemas reprodutivos, ou subme­ lise do o6cito . A exposicao aos ACP e/ou a forma­

tidas a tratamentos radio e/ou quimioterapicos (no caso c;ao de cristais de gelo durante os processos de conge­

de canceres), reduzindo assim os problemas eticos, lacao/descongelacao podem causar despolarizacao do

legais e morais que em geral estao associados com a fuso de micronibulos, interrupcao da separacao das

estocagem de embri5es125. Os o6citos utilizados para cromatides no momenta da fecundacao e inducao

a criopreservacao podem ser imaturos (originarios de potencial de aneuploidia ap6s a extrusao do segundo
36-138
foliculos pre-antrais ou terciarios) e maturados, oriundos corpiisculo polar1 . Alem disso, o endurecimento

de puncao de folfculos pre-ovulatorios ou obtidos ap6s da zona pehicida pode ocorrer como resultado da Ii- '°
oi

maturacao in vitro. A despeito da consideravel pes­ beracao prematura de granules corticais do ooplasma=". �
.'._,
quisa realizada durante os ultimos 15 anos, o progres­ Portanto, uma estrategia alternativa para evitar esses �

so obtido na criopreservacao de o6citos maturados tern graves problemas pode ser a criopreservacao de o6citos .'..i
126
sido muito limitado . Os o6citos maturados sao crio­ em estadio inicial do desenvolvimento (imaturos), isto t
b
preservados utilizando-se os protocolos de congela­ e, antes de retomarem a maturacao nuclear e progre-
137
c;ao lenta e rapida, bem como de vitrificacao. Entretanto, direm ate a metafase II , quando a celula e menos

as taxas de fecundacao e desenvolvimento in vitro sao diferenciada e mais resistente aos danos induzidos pelos

muito inferiores as de o6citos nao criopreservados. processos de congelacao/descongelacacv'". Todavia,

Apesar dos o6citos maturados serem particularmente tant_o em animais de producao quanto em humanos,

sensiveis aos procedimentos de criopreservacao, al­ esta tecnica ainda nao foi completamente desenvolvi-

guns progressos tern sido obtidos no infcio com a da. Especificamente em ruminantes, a maioria dos

adaptacao de protocolos empregados em embrioes-". trabalhos sobre criopreservacao de oocitos maturados

Whittingham criopreservou pela primeira vez o6citos tern sido realizada em bovinos, utilizando-se princi­

maturados de camundongos utilizando um protocolo palmente o DMSO e o PROH como crioprotetores em

14I-I
similar ao empregado originalmente para ernbrioes de procedimentos de congelacao len t a e rapida 43.

animais dessa especie-?". Carroll e Gosden demonstra­ Caracterfsticas citol6gicas especiais dos o6citos

ram que em condicoes apropriadas para congelacao e maturados, tais como fuso mei6tico, granules corticais

descongelacao, os o6citos de camundongos criopre­ e citoesqueleto, tern se mostrado suscetiveis a danos

servados sao aptos a fecundacao e podem desenvol­ durante o resfriamento e a exposicao aos criopro­

ver-se a taxas sirnilares aquelas normalmente obtidas tetores'?". Essa exposicao e a posterior criopreservacao
28
a partir de o6citos frescos 1 . Outros resultados favo­ estao implicadas no aumento da incidencia de anor­

raveis tern sido relatados em camundongos, coelhos e malidades no fuso mei6tico, no infcio da ativacao
31.
seres h u m a n o s 1 2 9 - I Nessa iiltima especie, alguns partenogenetica e no estfrnulo da liberacao dos gra­

pesquisadores foram mais alem, associando a tecnica nulos corticais. A criopreservacao pode tambern au­

de injecao intracitoplasmatica de espermatoz6ides mentar a incidencia de perda cromossornica no fuso

(ICSI) com os o6citos maturados previamente conge­ mei6tico e, nesses casos, nae se obtern resultados

lados. Porcu et al. relataram o nascimento de fetos favoraveis na fecundacao+". Em experimentos de

32.
normais a partir de o6citos criopreservados ap6s ICSI1 fecundacao in vitro, o citoesqueleto de o6citos matu­

Embora o sucesso da criopreservacao de o6citos rados de camundongas sofreu ruptura da rede de

maturados ja tenha sido obtido em diferentes especies, filamentos e desorganizacao do fuso, causando a disper­

verifica-se que a sobrevivencia desses o 6 citos ap6s os sao dos cromossomos.

procedimentos de congelacao/descongelacao e extre­ Mais recentemente, a criopreservacao de folfculos

mamente variavel e menos de 1 % dos o 6 citos huma­ pre-antrais vem sendo considerada como uma grande
1 33
nos maturados fecundados desenvolvem-se a te rm o . alternativa para a estocagem de grande mimero de

Varias sao as razoes para essa baixa eficiencia, 0 micleo o6citos imaturos obtidos a partir de um tinico animal.

dos o 6 citos maturados encontra-se estacionado na Os o6citos inclusos em foliculos pre-antrais possuem

metafase da segunda divisao mei6tica, condicao em varias caracterfsticas que os tornam menos suscetiveis
14
que a celula torna-se uma unidade altamente organi- a criolesao do que os o6citos maturados125, 6. Dentre
 Manlpulacao de 06citos Inclusos em FoHculos Ovarianos Pre-antrals
elas, as mais importantes sao: menor tamanho do o6cito
e das suas celulas de suporte (celulas da granulosa),
baixa taxa metab6lica, estadio do ciclo celular (nu­
cleo no estado de pr6fase da primeira divisao mei6tica),
ntimero restrito de celulas da granulosa, ausencia de
zona pehicida e de granules corticais perifericos e
pequena quantidade de lipfdeos intracitoplasmaticos
sensiveis as baixas temperaturas. Todas essas carac­
teristicas sao beneficas em potencial para a criopre­
servacao. Uma vez que a grande maioria dos o6citos
encontra-se inclusa em folfculos pre-antrais e que esses
o6citos nao possuem um fuso mei6tico, os riscos cito­
geneticos sao menores nas divisoes subsequentes
Portanto, sao pouco suscetiveis as aberracoes
moss6micas e, em consequencia, mais resistentes aos
procedimentos de congelacaol-", Alem disso, de modo
diverso dos o6citos maturados, os folfculos primor­
diais possuem tempo para reparar danos subletais nas
0
i organelas e em outras estruturas durante a sua pro-
;: longada fase de crescimento, que ocorreria durante
� o cultivo in vitro. Entretanto, ainda nao ha um mimero
r-
� suficiente de experimentos nessa area para compro-
S; var essa suposicao?".
Os o6citos inclusos em foliculos pre-antrais podem
ser congelados in situ, isto e, no interior do pr6prio
9 39 148 149
tecido ovariano, ou ap6s isolamento 6,I · · . Atual­
mente, a criopreservacao do cortex ovariano, para a
medicina humana, tern sido uma alternativa promis- ,-.
134 147
sora para a preservacao da fertilidade , . Alern da
perda natural (atresia) de folfculos pre-antrais que ocorre
in vivo, em seres humanos ha os problemas de inferti­
lidade prematui·a resultantes do tratamento de certos
canceres, incluindo altas doses quimioterapicas e ir­
140.
radiacao abdominal Portanto, a criopreservacao de
o6citos podera ser uma tecnica extremamente neces­
saria para o sucesso da reproducao assistida, tanto de
seres humanos como de anirnais domesticos ou nao150.
Na medicina humana e em animais de laborat6rio, os
pesquisadores tern concentrado seus esforcos na criopre­
118 4 149
servacao de folfculos pre-antrais in s i t u ,13
ses estudos tern demonstrado por analise histol6gica
que folf culos pre-antrais presentes no tecido ovariano
ap6s congelacao e descongelacao apresentam-se
148·151
morfologicamente normais . Dessa forma, o te­
cido ovariano congelado, contendo os foliculos pre­
antrais, pode ser utilizado em momento posterior para
transplantes. Camundongas ovariectomizadas e auto­
transplantadas com tecido ovariano fresco, ou congelado
e descongelado, apresentaram ciclos estrais regulares
p6s-transplante em 75 e 80% dos animais, respectiva­
mente-'". Tecido ovariano criopreservado de saguis
tambem tern sido transplantado sob a capsula renal de
camundongas imunodeficientes. Nos enxertos recu­
perados 21 a 32 dias depois, observaram-se foliculos
em todos os estadios da foliculogenese, incluindo
152
foliculos antrais de 1 a 2mm de diametro
319
tados similares tambern foram obtidos por Hovatta et
al. em seres humanos, utilizando-se DMSO e PROH
151
como crioprotetores . Cox et al. demonstraram que
ovaries fetais congelados e descongelados quando trans­
plantados recuperaram a fertilidade em camundongas
149
e que 73 a 86% dos animais mostraram-se gestantes .
O transplante para um ambiente diferente in vivo pode
ser uma alternativa para a constituicao de bancos de
134
tecido ovariano congelado . Fragmentos de ovaries
ovinos e primatas nao humanos enxertados sob a cap­
sula renal de camundongos imunodeficientes apresen­
146,152
taram revascularizacao e crescimento folicu1ar .
147
. Ademais, foliculos presentes no tecido ovariano hu­
cro­ mano cresceram ate o estadio antral (mais de 5mm de
diarnetro) ap6s seis semanas de estimulacao ex6gena
147
com FSH . Embora ate o momento nao tenha sido
demonstrado que o tecido ovariano criopreservado possa
restaurar a fertilidade em seres humanos, o nascimen­
to de animais viaveis tern ocorrido a partir de enxerto
de tecido ovariano congelado e descongelado em ca­
mundongos128·153, 1 5 4 . Em animais domesticos, como
os ovinos, a viabilidade folicular tambem ja foi de­
monstrada pela analise histol6gica de tecido ovariano
155
congelado e descongelado . Baird et al. realizaram
autotransplante de tecido ovariano em ovelhas ap6s
descongelacao e observaram aumento nos nfveis de
progesterona quatro semanas ap6s o enxerto-P''. Po­
rem, nessa especie, os resultados mais encorajadores
foram reportados por Gosden et al., que relataram
nascimento ap6s transplante de tecido ovariano con­
gelado e descongelado-'".
Embora resultados satisfat6rios referentes a conge­
lacao de tecido ovariano ja tenham sido obtidos em alguns
animais, como camundongas, coelhas, ovelhas e ate
mesmo em mulheres, a formacao de gelo intracelular
ainda pode representar em al guns casos um entrave para
118 4 148,153,154 157.
o sucesso da criotecnologia · t 6, , Em tecido,
a formacao de gelo intracelular tern se mostrado muito
mais prevalente e pode ocorrer a uma taxa significa­
, . Es­ tivamente maior do que pode ser atingida nas celulas
em suspensao. A criopreservacao de tecido e substan­
cialmente diferente da criopreservacao de celulas em
suspensao, como os foliculos pre-antrais isolados, por
exemplo. Em um tecido organizado, a difusao de agua
e crioprotetores nao e facilitada. Varies tipos celula­
res em um tecido desempenham uma contribuicao para
a sua funcao. Portanto, a sobrevivencia de cada tipo
celular pos-descongelacao e de extrema importancia 38. I
O tecido do estroma ovariano e muito rico em celulas,
as quais estao juntamente posicionadas. Portanto, a
formacao de gelo no espaco intercelular pode danifi­
car facilmente as celulas e quebrar a comunicacao
intercelular necessaria para a integridade do tecidol-".
Uma possivel alternativa para reduzir as lesoes
causadas pela formacao de gelo intracelular seria a
. Resul- congelacao de folfculos pre-antrais isolados. No entanto,
320 Manlpulacao de 06citos Inclusos em Folfculos Ovarianos Pre-antrais

esse procedimento tern sido estudado apenas em ca­ tao mantido nessa temperatura durante a inducao da

mundongos e felinos. Utilizando folfculos primor­ formacao de cristais de gelo (seeding). 0 seeding e

diais de camundongos isolados enzimaticamente, realizado manualmente, utilizando-se uma pinca pre­

congelados de modo lento com DMSO, Carroll et resfriada em nitrogenio lfquido. Em seguida, a tem­

al. conseguiram o nascimento de um animal vivo ap6s peratura e reduzida a 0,3°C/min ate atingir-30°C, ap6s
159.
a fecundacao do o6cito cultivado in vitro Em outro O que e reduzida a uma velocidade de 0, 15°C/min ate

trabalho, Carroll et al. relataram que a criopreservacao atingir -33°C. Finalmente, os fragmentos ovarianos

nao afeta o crescimento e o desenvolvimento do folf­ sao removidos do freezer e mergulhados em nitroge­

culo e n e m a habilidade do o6cito de retomar a meiose, nio Iiquido a - 1 9 6 ° C .

demonstrando assim que e possfvel estocar um grande Para a descongelacao, os fragmentos ovarianos sao

mimero de folfculos para o seu subsequente desen­ rapidamente expostos a temperatura ambiente por lmin
77.
volvimento in vitro Jewgenow et al. testaram di­ e entao imersos em banho-maria a 37°C por um pe­

ferentes crioprotetores (DMSO, PROH, EG e glicerol) rfodo suficiente para ocorrer a descongelacao total.

tambem para a congelacao lenta de folfculos pre-antrais Ap6s a descongelacao, e realizada a remocao do

felinos e observaram que somente quando o glicerol crioprotetor. Para isso, cada fragmento ovariano e sub­

foi empregado houve diminuicao no mimero de foli­ metido, separadamente, a tres lavagens sucessivas em

culos com o6cito e celulas da granulosa intactos em MEM, a intervalosde 5min. Ap6s a remocao do crio­

comparacao a folfculos nao congelados (controle)?". protetor, os fragmentos ovarianos poderao ser subme­

A porcentagem de foliculos viaveis com os demais tidos ao isolamento folicular. ·

crioprotetores foi similar ao controle. Amorim et al. No caso da criopreservacao de folfculos pre-antrais

realizaram pela primeira vez a criopreservacao de isolados, o protocolo utilizado no LAMOFOPA e, em

folfculos pre-antrais isolados a partir do tecido ova­ resumo, o seguinte: amostras de suspensao folicular

riano de ovelhas'P''. Esses autores demonstraram que de 0,9mL sao adicionadas a mesma quantidade de

a viabilidade de foliculos primordiais congelados em solucao crioprotetora, transferidas para tubos eppendorf

DMSO ou EG nas concentracoes de 1 e l , 5 mM , respec­ e equilibradas a 20°C por um perfodo de 20min. Ap6s

tivamente, foi similar aquela observada para foliculos o perfodo de equilfbrio, os folfculos pre-antrais isola- .

frescos ou nao criopreservados. Foliculos pre-antrais dos sao congelados com o protocolo anteriormente

isolados do tecido ovariano caprino tambern foram descrito para OS foliculos pre-antrais in situ. Para a

criopreservados e depois cultivados in vitro por 24h descongelacao, os tubos eppendorf contendo os foliculos

ou cinco dias (dados nao publicados) e mantiveram isolados criopreservados sao rapidamente aquecidos

sua viabilidade cornpatfvel com aquela observada em a temperatura ambiente por lmin e entao imersos em
161.
foliculos nao criopreservados Ap6s congelacao e banho-maria a 3 7 ° C por perfodo suficiente para a

descongelacao de folfculos pre-antrais isolados, 73 descongelacao total. Em seguida, o crioprotetor e re­

e 70% de folfculos ovinos e caprinos, respectivamente, movido. Para isso, a suspensao de foliculos e submetida

apresentavam-se viaveis. No caso da criopreservacao a tres lavagens sucessivas em meio MEM suplementado

de tecido ovariano, obtiveram-se em ovinos e caprinos, com 10% de SFB a temperatura ambiente, a interva­

respectivamente, 47 e 68% de foliculos morfologica­ los de 5min. Os foliculos pre-antrais isolados pode­

mente normais ap6s descongelacao. rao ser submetidos posteriormente ao cultivo in vitro.

O protocolo de criopreservacao de POPA caprinos e

Protocolo de Crlopreservacao de Foliculos ilustrado na Figura 1 6 . 1 0 .

Ovarianos Pre-antrais Caprinos

Estado Atual da Biotecnica de

A titulo de informacao, a seguir sera apresentado o Manipula9iio In Vitro de Foliculos

protocolo de criopreservacao de folfculos pre-antrais
Ovarianos Pre-antrais
caprinos utilizado no Laborat6rio de Manipulacao de

06citos e Folfculos Ovarianos Pre-antrais (LAMOFOPA). Superada a etapa de desenvolvimento de metodos �

.i:,.

Os ovaries caprinos obtidos em abatedouros sao trans­ eficazes para o resgate de POPA a partir dos ovaries,
6
portados ate o laborat6rio a uma temperatura de 20°C. o grande desafio dos pesquisadores consiste no de­

No laborat6rio, o ovario e dividido em pequenos frag­ senvolvimento de sistemas especiais de cultivo que

mentos (3 a 5mm) e equilibrados a 20°C por um pe­ proporcionem condicoes adequadas para o desenvol­

rfodo de 20min na presenca de uma solucao crioprotetora vimento 6timo de POPA in vitro. Jewgenow et al. rela­

composta de MEM adicionado a l,5mM de DMSO e taram o desenvolvimento em felinos de folfculos

1 0 % de SFB. Ao termino dos 20min, os fragmentos pre-antrais oriundos de ovaries de felfdeos domesticos

ovarianos sao transferidos para um freezer programavel (gata) e silvestres (leoa e tigresaj'". Butcher e Ullman

previamente ajustado a 20°C e resfriados a uma velo­ mostraram que em marsupiais o FSH teve efeito po­

cidade de 2°C/min ate -7°C. 0 tecido ovariano e en- sitivo sobre o crescimento in vitro de folfculos pre-
 Manlpulacao de 06citos Inclusos em Foliculos Ovarianos Pre-antrals 321

162 tral8 4 ,I63-I65_ Em sumos, Hirao et al. obtiveram a ovu­

antrais de gambas sul-americanos . Nas especies

humana, ovina, caprina e bovina, foliculos pre-antrais lacao in vitro a partir de foliculos pre-antrais isolados
166.
isolados se desenvolveram in vitro ate o estadio an- que cresceram e maturaram in vitro Entretanto, a

maioria dos trabalhos referentes ao cultivo de folfculos

pre-antrais in vitro foi realizada em animais de labo­

Ovario
rat6rio. Em ratos, relatou-se a producao in vitro de
I

! l embrioes, a partir da fecundacao de o6citos oriundos

,ra,,,.,r •=""" Isolamento folicular

de folfculos pre-antrais cultivados in vitro'", Em ca­
Foliculos isolados
mundongos, o desenvolvimento in vitro de folfculos

pre-antrais foi descrito por varies autores76,77,167-I69_

i Resultados espetaculares foram relatados por Eppig e

Equilihrio (20°C/20min)
I
Schroeder, que obtiveram o nascimento de camundongos

• a partir de folfculos pre-antrais que cresceram, matu­

20°C (freezer programavel)
raram e foram fecundados in vitro'l". No ano seguin­
2°C/min

+ te, Carroll et al. publicaram um artigo que representou

-7°C (seeding)
0,3°C/min i Curva de congelacao um grande marco na biotecnicadeMOIFOPA159. Esses

autores obtiveram produtos viaveis a partir do desenvol­

-33°C

vimento in vitro de folfculos pre-antrais de camundon­

i
-196°C (NL
2
- periodo minimo 24h) gos que foram submetidos previamente a procedimentos

. ... de congelacao e descongelacao. A Figura 1 6 . 1 1 mos­

Descongelacao (lmin temperatura arnblente/banho-maria 37°C)
tra de forma resurriida o estado atual da biotecnica de

i MOIFOPA em diferentes animais.

Remocao crioprotetor (3 lavagens em MEM - 5min)

!
Fragmentos ovarianos Foliculos isolados
CONSIDERA<;OES FINAIS
i
Isolamento folicular
Conforme mostrado anteriormente, a biotecnica de
i
Foliculos isolados MOIFOPA apresentou um avanco significativo nos

ultimos dez anos. Folfculos pre-antrais oriundos de

ovaries de seres humanos, animais domesticos, silves­

Cultivo in vitro
tres e de Jaborat6rio podem ser isolados e cultivados

in vitro em meios especiais que tern permitido um au­

Figura 1 6 . 1 0 - Protocolo de crio preservacao de foliculos
ovarianos pre-antrais caprinos. MEM = meio essencial mento da taxa de desenvolvimento folicular in vitro.

minimo. Alem disso, a viabilidade de foliculos pre-antrais oriundos

Animal Crescimento Antro Nascimento

Felino

(Jewgenow et al., 1997)

Marsupial

(Butcher e UUman 162)

Babutno

(Fortune et al.91)

Mulher
4)
(Roye Treacy8

Ovelha

(Cecconi, et al.163)

Vaca

(Gutierrez et al., 2000)

Ca bra

(Huanmin e YonglOB)

Porca

(Hirao et af.166)

Rata

(Daniel et al.'")

Camundonga

(Eppig Schoeder170)

Camundonga"
126)
(Carroll et al.

Figura 1 6 . 1 1 - Estado atual da biotecnica de manipulacao de o6citos inclusos em foliculos ovarianos pre-antrais em

diferentes especies. * Obtencao de nascimento a partir de ovaries de camundonga submetidos previamente a con­
gelacao e posterior cultivo in vitro.
322 Manlpulacao de 06citos Inclusos em Foliculos Ovarianos Pre-antrais

de animais de laborat6rio ( camundongo) e felinos pode No sentido de finalizar este capitulo, faremos a seguir

ser preservada ap6s procedimentos de congelacao e uma projecao de como sera a reproducao animal quando

descongelacao. a biotecnica de MOIFOPA estiver francamente desenvol­

Atualmente, a biotecnica de MOIFOPA vem sendo vida e integrada a outras biotecnicas da reproducao,

utilizada somente em pesquisa fundamental, ainda conforme mostrado na Figura 1 6 . 1 2 . No futuro, ani­

nao podendo ser empregada para multiplicacao de mais de alto valor zootecnico ou em perigo de extincao,

animais. Entretanto, o rapido avanco da ciencia, as­ estejam vivos ou mortos (fetos, recem-nascidos, ou

sociado com as facilidades crescentes de trocas de animais adultos), atuarao como doadores de ovaries

informacoes entre laborat6rios do mundo inteiro, pode para a biotecnica de MOIFOPA. A partir de um iinico

resultar, no futuro, no desenvolvimento de sistema ovario, milhares de FOPA serao isolados e poderao

de cultivo que permita um excelente crescimento ser criopreservados, constituindo bancos de germoplas­

folicular com a preservacao da viabilidade folicular. ma animal, e/ou serem cultivados in vitro, permitindo

Posteriormente, isso possibilitara a utilizacao de o crescimento e a maturacao dos o6citos neles inclu­

o6citos oriundos da numerosa populacao de foliculos sos. Os o6citos maturados poderao ser entao fecunda­

pre-antrais isolados e crescidos in vitro em progra­ dos e os ernbrioes obtidos poderao ter tres destinos:

mas de fecundacao in vitro, clonagem e transferen­

cia de embrioes, contribuindo a longo prazo para a • 0 cultivo in vitro ate m6rula e blastocisto e poste­

multiplicacao de animais de alto valor zootecnico e rior transferencia embrionaria, sendo submetidos

mesmo daqueles em vias de extincao. A curto prazo, ou nae a criopreservacao.

paralelamente ao estudo do crescimento folicular in • Serem modificados pela tecnica de transgenia no

vitro, uma alternativa seria desenvolver procedimentos estadio pronuclear e, posteriormente, submetidos a
de isolamento e congelacao de foliculos pre-antrais transferencia embrionaria.

in vitro visando a utilizacao futura em sistemas de • Serem multiplicados pela tecnica de clonagem por

cultivo que apresentarem condicoes 6timas para o transferencia nuclear.

completo desenvolvimento folicular in vitro. Futu­

ramente, com o emprego, na pratica, da biotecnica Dessa forma, milhares de indivfduos poderiam ser

de MOIFOPA, sera factfvel o restabelecimento de produzidos a partir de um unico ovario, contribuindo

populacoes de animais ameacados de extincao a partir assirn para a multiplicacao de animais de alto valor

de pequenos mirneros de femeas. zootecnico e/ou em perigo de extincao (Fig. 16.12).

Performance
ireprodutiva

Animais Producao de milhares de animais

-Alto valor zootecnlco

- Em vias de extincao t Clonagem

TE .... Transgenia

Mortos ou vivos (feto, neonato,

adulto)
t /
M IV - F IV �
Ovarlo

/'

' MIV

•
Isolamento

Milhares de FOPA

'
lt
Criopreservacao

-,

Figura 16.12-Integrac;ao futura da biotecnica de manipulacao de o6citos inclusos em foliculos ovarianos pre-antrais

(FOPA) com outras biotecnicas da reproducao, FIV = fecundacao in vitro; MIV = maturacao in vitro; TE= transferen­

cia de embri6es.
 Manipulacao de 06citos Inclusos em Foliculos Ovarianos Pre-antrals 323

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