CAPÍTULO

Manipulação de Oócitos Inclusos

em Folículos Ovarianos Pré-Antrais
José Ricardo de Figueiredo • Ana Paula Ribeiro Rodrigues • José Roberto Viana Silva •
Regiane Rodrigues dos Santos

oócitos primários ou imaturos e, finalmente, l1 .b eran doumoó-,.

1n_
tr,~duçã..~............. ............. .................................. . ...................... . - A
cito maduro no processo de ovulaçao. orga nização do ova
, no
A utilização e o desenvolvimento de biotécnicas da repro- ,
mam1fero . . . estru t uras, incluindo os foliculos
com suas pnnc1pa1s
dução animal são ações indispensáveis para o aumento da ovaria nos, é apresentada na Figura 16.1.
eficiência produtiva dos rebanhos. Nesse sentido, especial-
mente no tocante a ruminantes domésticos, biotécnicas como
a inseminação artificial, a fecundação in vitro (FIV) e a trans-
Tipos
ferência de embriões (TE) vêm sendo utilizadas com sucesso.
A população folicular do ovário é bastante heterogênea e lo:a-
outras tecnologias já estão tendo aplicabilidade prática, e no
liza-se no córtex ovariano. De acordo com o grau de evoluçao,
futuro, poderão ser empregadas em ampla escala. Nesse gru-
os folículos podem ser divididos em: (1) folículos pré-antrais
po, podem-se incluir clonagem, pesquisas sobre a produção
ou não cavitários; e (2) folículos antrais ou cavitários. Os fo-
de gamelas a partir de células-tronco e, de forma mais concre-
lículos pré-antrais representam cerca de 90 a 95% de toda a
ta eexequível, a manipulação de oócitos inclusos em folículos
população folicular e, dessa forma, armazenam a maioria dos
ovarianos pré-antrais (MOIFOPA).
oócitos presentes em ovários mamíferos.
No intuito de facilitar a compreensão da importância dessa
biotécnica reprodutiva para animais, bem como demonstrar
como ela se insere no momento e como será utilizada no futu- Folículos pré-antrais
ro, este capítulo será dividido em duas seções. A primeira será Os folículos pré-antrais são constituídos pelos folículos pri-
dedicada a uma breve revisão sobre os folículos ovaria nos, en- mordiais, intermediários, primários e secundários. Eles podem
fatizando sua formação, classificação e destino no interior dos ser diferenciados entre si pela forma e quantidade de cama-
ovários. Na segunda, será abordada a importância do estudo das de células da granulosa que circundam o oócito imaturo
de folículos ovarianos pré-antrais (FOPA) isolados in vitro, as (Figura 16.2).
principais técnicas de isolamento, conservação e cultivo de
F0PA, o estado atual da MOIFOPA e, fi nalmente, serão discuti-
das as perspectivas de utilização dessa biotécnica na reprodu- Folículo
Folículo
çãodeanimais domésticos, silvestres e em perigo de extinção. primário
antral
Folículo Folículo
Folículo pré-ovulatório
secundário
FOLÍCULOS OVARIANOS

Defi~içã~ J
O folículo é a unidade morfofuncional do ovário, sendo e: Vasos
constituído por um oócito circundado por células somáticas
(células da granulosa e teca is). Ele desempenha duas funções
principais que são Interdependentes: uma endócrina (produ-
ção e liberação de hormônios esteroides e outros peptldios)
e a outra exócrina ou gametogênica. Nesta última função, o Corpo Folículo Ovulação
follculo é um elemento essencial para a manutenção da viabi- lúteo atrésico
lidade oocitária, assegurando o crescimento e a maturação de FIGURA 16.1 Ovário mamífero com suas principais estruturas.
1--f--f lfl píl"'
cresci
. . processo denominado ativa •
·...ord1a1s,
•mento o
.. lt' 1· -
ocitario, mu 1p 1caçao das ce' I
Çao, b
Ula
ção da morfologia dessas cél I s da gr ªtri.1
o s
e1y
nsforma , u as d ªri e
e tra ' b'ica Quando os fohculos apre e " ~1 0,
ara cu · sent "'ªv·1 ••
wsa P or células da granulosa com a ªtn llrri 1'rie~
. undado P • mbos o, '
C1rc e cúbico, eles sao classificados os f~ ~qt"
. entoso com 0 vrrri "
pavimd' , ioS ou de transição.' Em bovinos, ov· folíclll •to,
terme_iaer tro mede 42, ' 41 ' e 40,7 µm,3respectinos e ca" o, i~,
u d1am • 1va "r1n
se , ulos primários estao em fase mais lnerite o,.
os fo 11c , . avan .
. nto e apresentam um ooc1to imat Çada d
envolv1me , ur0 ed
s ruma camada de celulas da gra ceritr I e.
ndado po nulo a e·
cu . , N sse tipo de folículo, as células da gr sa de f ir,
cúbica. e . anulas orl))
• mero e tornam-se mais volumosa 10 a all,,,_1 •
tam em nU • • s. Em ·• en.
. prinos, esses fohculos tem diâmetr bovi
ovinos e ca o de 55 nos
m i respectivamente. ,1,, sii.
49, 8 µ , d• . t . e
·culos secun arios carac erizam-se Pel
Os folI a Pre
, ·to imaturo circundado por duas ou ma· sença d
um ooc1 , is carn e
, d granulosa cúbicas. Nos folículos secu d . ªdas d
celu 1as a n ario e
. ·os mais avançados, observa-se o apareciment d sern es.
t
teca que são recrutadas de precursores teca is
º~ ·
Celulos
da f 1· 1 Present
ovariano." Nesses o 1cu os, uma estrut es no
estrom a . . . ., ura hiai· .
d nominada zona peluc1da, tambem Ja Pod 1n120•
da, e . . . e ser evi
.. . .
. da em cortes h1stolog1cos co rados pelo métod
ão PAS (ácido period1co de Sch 1ff) hematoxilina."
º~e den.
olor•.
ç 1• ·d As Prot ·
nas que formam a zona pe uc1 a começam a ser 1 . . e1-
. s ntet1iad
a partir do início do crescimento dos folículos prirn .. as
., . f 1· 1 ord1a1s
são claramente v1s1ve1s em o 1cu os secundários.n O e
· · t · d" s Peque
nos folículos secun darios _em 1ametr~ de 81,' 73, e 83 ;
em bovinos, ovinos e caprinos, respect1vamente. Ern 6 _µm
, 1 d, . , - ovinos
grandes folicu os secun arios, com varias camadas de . '
. . celulas
da granulosa, po dem me d 1r ate 200 µm de diâmetro.

FIGURA 16.2 Características morfológicas de folículos pré-antrais e an-
trais. A. Folículo primordial. B. Folículo primário. C. Folículo secundário.
D. Folículo terciário. A: antro; O: oócito; G: células da granulosa; N:
núcleo.
Os folículos primordiais são os menores folículos encontra-
dos no ovário. Em bovinos, ovinos e caprinos, o diâmetro dos
folículos primordiais é de 35,2, 1 35' e 33 µm,3 respectivamente.
Os folículos primordiais são os primeiros que se formam no
ovário• e consistem em um oócito imaturo com localização
central, circundado por uma única camada de células da pré-
granulosa de forma pavimentosa demarcada por uma mem-
brana basal,' que o separa do estrema ovariano.' Os folículos
primordiais estão localizados na região periférica do córtex do
ovário,• constituem o pool de reserva de folículos quiescen-
tes' e compreendem 90% de toda a população folicular do
ovário mamífero.• Com o início do crescimento dos folículos
Folículos antrais
Com a intensa proliferação das células da granulosa , um a area,
preenchida por fluido folicular é identificada na camada gra-
nulosa e, a partir disso, os folícul os passam a ser classificados
como antrais ou terciários. O início da formação de antro em
bovinos, ovinos e caprinos é observado quando os folículos
ascendem a 250, 14 1192 e 130 µm, 3resp•', tlvamente. Os folícu-
los terciários ainda apresentam um oó, o imaturo, enquanto,
na maioria das espécies, somente o fo i,· Jio pré-ovulatário ou
de De Graaf contém um oócito maturo A Figura 16.2 ilustra
as características morfológicas de folículos pré-antrais e an-
trais. O controle do desenvolvimento folicular na fase antral
foi previamente descrito no Capítulo 3, Controle do Estro e da
Ovulação em Ruminantes.
Origem
Especialmente em ruminantes a formação dos folículos ova·
. , 1
nanos, e consequentemente dos oócitos neles contidos, n
eia-se no período pré-natal.' A oogênese e a folfculogênest!
 dois P
.
sos simultaneos que precedem f ô
roces . -
ubsequente hberaçao do oócito mat
O en meno
Wtfiffl!-/b·i'
·o ·o e s .
sa vulaça rn humanos e ruminantes, a oogêne
Uro. Par- forma-se o · Est
o tee seeafo. zigoto, que evoluirá ao estágio de blastoclsto, e,
~-fté ,
dª iarrl'len podem ter uma longa duração, alcançand
ticu • ese . ,516 A o até toderma z, composto
, por duas estruturas, ou seja, o tro,ec-
d
10 gen h manos e ovinos. · relação entre . ou tro,oblasto e o botão embrionário, também e-
l·cU J1'l u • •. 0 s Proces-
1 eses e • e e foliculogenese e ilustrada na Figu norrunado
bot· embrioblasto
· ou massa celular interna. A partir do
deºº genes
6f1'1 ra 16.3.
505 ao
0
embrionário, três folhetos serão originados: o ectoder-
ma, mesoderma e o endoderma. Deste último folheto será
énese formado, dentre várias estruturas o saco vitelínico, do qual se-
OOU rocessos que compreende o desenvolvim rão originadas as CGPs, as quais s~ caracterizam por serem mó-
. to de P • . . . ento e
co nJun nc1aça
. •0 das celulas germinat1vas
• . primordiais (CGP) da veis e altamente invasivas.•• Ainda na vida fetal, nas espécies
difere , formação do oooto haploide fecundado A bovina e ovina, as CGPs migram para o mesênquima da crista
a ate a . . . •17 ntes
f.fi'lea no fohculo ovariano, a celula oocitária e· genital e colonizam a gônada indiferenciada.19 Nesse local, as
e incluso . . prece-
deser I ção de dois tipos celulares sucessivos a sab . CGPs Perdem a sua característica móvel e multiplicam-se por
evo u , er. as mitose, Podendo atingir, na espécie bovina, em torno de dois
dida da gônias. As CGPs têm origem extragonadal e •
e as oo , . . sao milhões de células por animal.'° Após um processo marcado
cGPS • durante o penodo embnonario, como expli d
w~
11 Qo Pelo crescimento celular e pela redistribuição de organelas
cons
aseguir. p
. A ós a fecundação do oócito pelo espermatozoid
e, citoplasmáticas, as CGPs, dentro do ovário, reproduzem-se ati-
vamente e diferenciam-se em oogônias. As oogônias sofrerão

tr ·
aco VI e líllCO

Oogênese
(Início)
..... ~ ~ Mitose

~ ~ Mitose

Foliculogênese 1• parada da meiose

{In icio) _,. Foi. primordial= 1 cam. CGPav + Oóc. 1• (Nu-P1 )

Foi. primário= 1 cam. CGC + Oóc. 1• (Nu-P1)

Crescimento
Foi. secundário=?. 2 cam. CGC + Oóc. 1, (Nu-P1) oocitário

Foi. terciário =?. 6 cam. CGC + antro + Oóc. 1, (Nu-P1 )

PPO-LH-puberdade
"=oó-c =
1,~
(Nu- =
-P:::-:
1)~ }
1• retomada da me,ose
Oóc 1• (Nu-P1>M1>A1>T1) Maturação
ooc,tána
r:;-=:-:--==:;, 1• CP
Folicu logênese ' - - - , - - - - - 2• parada da meIose
(Fim) _,. FPO = ?. 6 cam CGU + antro + Oóc. 22 (Nu-M2)

2• retomada da meiose
(N,-u-7M;;:;2:-->A
~Occó-c.-=2=-,;:- "2,;:>'"
T2")1
Fecundação
Oogênese
(Fim) - - -- -~

Zigoto

F
IGURA 11.3 Relação entre oogênese e follculogênese no processo de .ç. forma ão dos oócitos (Oóc.) e folículos. MCI: massa celular interna; cam.:
é-ovulatório; Ml : metáfase 1; A1: anáfase 1; T1 : telófase 1;
e,.,,,." e ·
-_' """1; GP célula germlnatíva primordial: Nu: nuc1eo,· P1 · prótase; PPO. p,co. pr. SPTZ· espermatozoide;
°2 ' Prótase 2; CP; corpúsculo polar: M2: metáfase 2: FPO: 1011cu1os pré-ovulat6nos, ·
· A2: an áfase 2·, T2·• telófase 2·, OHF·•
~haoloide fecundado.
 mesoderma, circundam o oócito prim ano ,. o
em prófase 1), formando
. d' . o folículo primo . uA
rd1aI iniatllro
sucessivas mitoses e, posteriormente, sofrerão a primeira divi- dos folículos primor IaIs, as células da , · Pós (~,·
são meiótica (estágio de prófase 1), passando a denominar-se . . f , Pre-g af,
de rnu tIp 11car-se e o o1Icu 1o primordial rano 10 vrl'rl.i.:'
oócitos ou ovócitos. Os oócitos cujos núcleos encontram-se 1
dormência ou quiescência. A prolifera _entra no sa ~I¾ 1
na primeira divisão meiótica são conhecidos como primários

º'
somente quando o folículo primordialç(ao quI_celular e~en°<I
r Or1. '~
ou imaturos. O núcleo oocitário que se encontra na fase de crescer, meses ou anos
, após
. a sua form açao
• escent
1a e) eeto~"'
meiose I passará, sucessivamente, por quase todos os está-
sivarnente pelos estagias de folículos i ' Passa
gios pertencentes à prófase 1 (leptóteno, zigóteno, paquíteno rios e secundários (folículos pré-antra·is)ntermediá ~dos~C\1
et rios
e diplóteno). Porém, o processo meiótico é interrompido (pri-
antral! até alca~çar o estágio de folículo' r' _erciários
0
' Pr11\
meira parada da meiose) no estágio de diplóteno, também nologIa da oogenese e da foliculogênes p e vulató .(folic~1.
denominado dictioteno ou de vesícula germinativa (VG). O ,· b · · , e no p no ,
especIes ovIna • e ovma e mostrada no Quad eríod ºfe·~ cr().
núcleo do oócito permanecerá nesse estágio pelo menos até
A populaçao total de folículos no ova, no. ro 16.l . laln, ·•s
que o animal alcance a puberdade. Durante o período em que
posta por urna grande reserva de foli'cu 1os mamífe
. ro •
o núcleo oocitário se encontrar na fase de prófase I, o oócito,
centes, mas sua quantidade é prog ressiva . Pnniordi aiseCori,
em íntima inter-relação com as células somáticas inclusas no
durante a vida reprodutiva da fêmea 22 , mente r %1e,
compartimento folicular, empreenderá uma intensa fase de 1
crescimento (intermediários, primário s, ·secund
Ja os, falicu1eduijd
0
crescimento, caracterizada por aumento na atividade trans-
apresentam-se em número muito me norem arios , eantsetli
cripcional (síntese de ácido ribonucleico [RNA]), acúmulo de
feros.23 Alguns folículos primordiais 1
-nicIamo
.. ovarias den, tais)
lipídios e absorção ativa e/ou passiva de diferentes nutrientes.
tão logo sejam formados, mas outro s perma seu cres c1n,
. ªttii.
Quando o animal iniciar a puberdade, devido às liberações
tes. por meses ou anos. Na maioria da s especie
, necern qu·leseento
pré-ovulatórias de hormônio luteinizante (LH) algumas horas
ollcular . começa
. . com a transform açao • mo fs, o, cres c1nie e~
antes da ovulação, a meiose será retomada e o núcleo oocitá- f
culos primordraIs;
, nele, O oócito ci·rcundador ologica defointo 1
rio entrará em diacinese. Nesse momento, inicia-se o processo
de rompimento da VG, que é seguida das fases de metáfase 1 da ,de celulas
. da pré-granulosa pa vImentos
. Por urna cani ·
anáfase 1_e telófase 1, momento em que ocorrerá a expulsã~ foliculos intermediários e primári os, nos quais
as os
evolue
oó _rn Paraa.
citas São
d_ o primeiro corpúsculo polar, resultando na formação do oó-
cIto secundário, assim denominado pelo fato de seu núcleo
e_ncontrar-se na segunda divisão meiótica. Essa fase caracte-
' ' 1 ' ' 16.1
QUADRO • Cronologia da oogênese efoliculog"
riza-se por um~ '.ápida e, às vezes, inexistente fase de prófase de
I ' fetos
• t bli' · 1 ,, · f . d .- 1 en

li, que progre~ira para ~etáfase li, quando ocorrerá a segunda

Dias de gesta\ào
parada da meIose. Ooocito retomará a meiose somente se for
Evento Bovinos" Caprinos' i Ovinos '
fecundado pelo espermatozoide. Nesse caso, o núcleo do oó-
c'.to passará, sucessivamente, pelos estágios de anáfase li e te- ' ... 39a40
lofase li, s:guido da expulsão do segundo corpúsculo polar e li
da formaçao ~o oócito haploide fecundado, marcando, assim, Diferenciação sexual das gónadas 57
Formação dasoogônias 43

0 fim da oogenese (ver Figura 16.3). Multiplicação de oogônias Início

Fim
4oogônias _ 48
Foliculogênese Sincronização da mitose
.Processo
.. e maturação f I' 1 16oogônias 8oogônias _ 53
de formaç·ao, crescimento
.
iniciando com f • o 1cu ar,
, . a ormaçao do folículo primordial e culminand
com o estagio de folículo maduro também co h 'd o Inicio da meiose 75 a 82 55
folículo de o G f. , ' n ec1 o como
e raa , pre-ovulatório ou dominante 21 Inicio da separação 90 fJ,

Conforme mencionado afun ão d f , , . folicular

um ambiente ideal para a , ç • o ollculo eproporcionar
manutençao da · bT d d 130 62 62
Formação de folículos
cimento e da maturação o ·t , . via 11 a e, do cres-
ocI aria Desse mod f 1· primordiais
nese ocorrerá simulta ,· o, a o 1culogê- 73 95
neamente a oogênese d Formação de folículos 140
estiver entre as fases de pro'fase I e metáfase' 11quan o o oócito primários
espécies. Em outras palav ras, o .líllCIO
, . da o , •na maioria das 73 103
Formação de folículos 210
o da foliculogênese que , , ogenese precede secundários
, . ' so e concluída ap ,
oooto e posterior fecund - ( . os a ovulação do 150
b . açao ver Figura 16 3) N Formação de folículos 230 a 250 101
ovma e ovina, respectivament . . as espécies terciários
t - e, em torno de 130 9 .
ges açao, uma camada de cél u1as somatIcas
d , . pia e Odias de 280 1~
as, conhecidas como células da ,
---;;;::=~--:---=----~~-~
nas ou achata- Nascimento
pre-granulosa, originárias do CGP: células germinativas
• . primordiais.
. .....--
, . . ,.,lnS por
dado
uma camada •
-
de celulas da granulosa CU b01·
esquisas tem demonstrado que os foi·
. rr:r Jjjj§fj-
unO teS p ICU os
,1rC oecen estágios subsequentes de desenvalvim 1 importantes
transgên• Para a foliculogênese inicial, pois camundongos
.
des· rd1a1s, e emtores de varias , h •
ormonios, bem ca~ d'
ento,
rt1º
pr1 essarTl
receP
de crescimento e seus receptores (Quadro
, "º
Ife-
)
• icos e ovelhas portadoras de mutações naturais que
,pr res • , nao expressam essas proteínas apresentam crescimento fal i·
e, sfato ndidatos que contra 1ama ativação e d16 2 cular interrompido na fase de folículos primários e são, con-
renue sãO for folie ular na fase
• .
pré-antral.
_
O
sequentemente, inférteis.".,. Além disso, deficiência em GDF-
O
I00
aol• ent don9° s transgenicos • que . nao sintetizam KL ou 9 Pode acarretar folículos poliovulares, ou seja, contendo mais
v cannun m a follculogense Interromp1da na fase . de um Oócito e, consequentemente, provável atresla ."
13 ~g p~
"
0
,. 1 pres ostra ndo a importância do sistema KL/c-Kit p ara Essas informações mostram que a ativação de folículos
rn . se inicial. GDF-9 e BMP-15 são extremamente
3ntrai.'' iogene Primordiais e o posterior crescimento de folículos primá-
afollCU rios e secundários são controlados por um sistema bastante

· ~-···M&1;;.;-
complexa envolvendo a participação de diferentes fatores de

Expressão de fatores de crescimento eseus receptores em folículos pré-antrais.

-+ '·'(b) +'(c,o,b) os secundanos

+ '(c.o,b) Referencias
+ '·'(b) 187; 188; 181; 189
LH·R + '·'(b),+'(s,o)
190; 191
+'·'(e.o) +'(e)
Ki- +'·'(c,o) + '·'(c, o) 192
c•Kít + '·'k,o) +' '(c, o)
+'·'(c).'(b,o) 193; 194; 195; 196; 197; 83
GDf-9 + "(c,o)
+ '·'(c),'(o) + '·' (c),'(b,o)
B,MP-6 +'·'(c),'(o) + '·'(c),'(b,o)
+ '· '(e) 198; 199; 200; 201; 202; 203
BMP-15 +"(e) +''(c).'(o)
BMPR-IA + ' (c),'(o,s) + ''(e)
+ ' (c),'(o,s) + ' (c),'(o,s)
B,MPRIB +'(c),'(o,s)
+ '(c).'(o,s)
B,MPRII +'(c),'(o, b,s) + '(c).'(o,s)
+'(c),'(o,b,s)
p[J(if-A +'·'(e) + '(c),'(o, b,s)
+'-'(e)
p[J(if·B + '·' (e) +"(e)
+'·'(e) 204
p[J(if-( + '·' (e) + "(e)
+ '·'(e)
P(Xjf-D +'·' (e) + '·'(e)
+"(e)
p[J(ifR·a +'·' (e) +"(e)
+'·'(e)
p[J(ifR-jl +'·' (e) + ''(e)
+ '·'(e)
+ "(e)
Aclivin·A + '·' (c),'(b,o)
+'·' (c).'(b,o)
ActR-IA + '·' (e) +"(c).'(b,o)
+'·'(e) 205; l 09; 2; 95
ActR-1B + '·' (e) +"(e)
+ '·'(e) + ''(e)
ActR·IIA +'·' (c),'(b) + ''(c),'(b) +"(e)
ActR-11B + ''(c),'(b) +'·'(c),'(b) + '·'(e)
Follis1a1in + '·' (e) +'·'(c),''(o) +"(c),' '(o)
TGF~ + '' (g) +"(g) +"(g) 189
TGF,l-RI + '' (g) +'·'(g) +"(g)
TGF,l-RII +'·' (g) +'·'(g) +''(g)
Kifl-1
+ ' (b) 187; 206; 207; 208
KifR-1
+'(b) +'(b,c)
KiFBP-11
+ '·' (b) +'·' (b)
KiFBP-111
+'(b) +'(b)
EGF
+ '·' (e) +' ' (e) +'·' (e) 68
EGFR
+ '' (e) + '·'(e) +"(e)
AMH
+'(o) 209
~P + ' (e) + ' (e) + ' (e) 98
Fíf-2 +,• (c),'(b, o) +''(c),'(b, o) + '·' (c),'(b,o) 210; 211 ; 212; 213; 214; 215;
fl',.7 + '' (b) + '·'(b) +"(b) 216; 217
frf 8 + ' (b) +'(b)
+'(b)
"• 10 + ' '(b) +''(b) +''(b)
'f17 +'(b) +'(b) ++'(b)
fGR lc f (b) +'(b) '(b)
+ ' (b) '(b)
;(b)
lt.illl:• Ptot•fna; tr bov,no~, e Cdp11nos, o: ovinos; s: suínos.
 mente prevalente em todos
• é rgua ! os
que"ªº to folicular.'° Byskov" sugere es1~ i,
imen 9ue 9 vs
õnlos. Apesar
do crescimento
rmõnio
senvo1v
possa O
correr
em qualquer momento do
ndo a fase pré-antral. Em ca
des
essa doN.
'ºn "'
en,,01 d1u •
cresamento e também de hort11 r dependente do hO ele in· I
fol1cu 1ar, inC UIe que a atres1a atinge 12 ePrin 5 Os•i e "' r\\e1"'ll,_
fohcular na fase pré..1ntral não se 'dênciaS de que nstrou·S 0% d º•1 'll
·stem ev1 " dem 0 . spectivamente. Por outro lad os I lo1
fohculo estimulante (FSH)• exi da fohcui09ênese, trais, re o, n 01·1 , ·
fluenC1a indiretamente essa etapa pré·ª"
•cies estu
dadas, diferentes autores relat ª
arall\
lllai c~l11.
or1a ••
espe folfculos antrais que apresentam d1feren %e a Qas
ria dos s da granulosa e da teca não s c1ação rii,,I),
População folicular d 1das cé 1u1ª e de te 1
. to é estima a na . d ovulação, morrendo pelo proc sen,,0I 1l)1,
. . ao nascimen "e o es ª
1·910 e
temente da fase na qual ocorra
essa "e
de , 11 'ti
Aquantidade de folículos no ovano ., 37 mil na cabra
1ndepe~den natural, a atresia reduz de ma e'. 'Pes,r es,, ,
em 23S mil na vaca, 160 mil na ovelh;,número sofre grande fenomen° ne1ra de
2 milhões na mulher.' entretanto, ess . de oa 720 mil um de oócitos potencialmente viáve, sign Ir1 Ser
. -.vle variar . • •mero s du c,t11
variação individual." Em bovinos, f"'u . . - dos d1feren o nu de um animal. Em resumo, o dese rante, ,
• e distnbu1çao d rodutIva , . . nvo1,,I vIi
folículos por ovário.'° A populaçao . . dem ser afeta as reP , pré-ovulatono m vivo, a partir de fO1. 1llent ,
• · de animais Pº · is fohcU 1o 1cu1 oQ
tes tipos foliculares nos ova nos ,, 'd de ,,.,.,. n1ve um . um fenómeno raro porque se considera os Pré., e
.. " raça 1 ª '
por vários fatores, como: nutnçao, ' trais, e t um em cada mil folículos Primo d9Ue, ell\ b n.
s somen e . r 1aIs o,.1
hormonais" e estado reprodutivo." no ' , de folículo maduro ou pre-ovulatóno alc,nç0
0
estagio · tá

Atresia folicular eseu impacto na re~u-~ão

massiva do "capital" oocit~~io no ovari MANIPULAÇÃO DE ~ÓCITos
... ... ···
,. mífero contem
• milha· INCLUSOS EM F~LICULos
Conforme mencionado, o ovano ma ,
, r ulos pre-antra1s.
. Entretanto, a OVARIANOS PRE-ANTRA1s
res de oócitos inclusos em ,o 1C • endo eli·
. h té à ovulaçao, s
maioria desses folículos nao c ega ª t sia folicu·
hecido por a re
minada por meio de um processo con . d01•stipos de conceito
. • . , . • d' mque existem
lar. Ev1denoas morfologicas in ica . mente
. b vada mais comu
atresia: Ae B. Na atresia do tipo A, 0. serdegenerativas. ocorrem MOIFOPA é uma biotécnica que consiste em: ll ) i
A , . solan,
em folículos pré-antrais, as alteraçoes ais te de folículos pre-antra1s a partir de ova· . ento
. d !'po B que ocorrem ou re Sga _ rios; 121
primariamente no oócito. Na atres1a . o 1 ·meiras , •
alteraçoes vação visando a estocagem por um curto (resfr,• con.
se r . . arnento)
frequentemente nos folículos antra1s, as pn fi longo (criopreservaçao) penado; e.(3) cultivo folicul arquei ou
, A t sia é um processo I·
ocorrem nas célulasda granulosa. a re d o finalidade promover crescimento, matura • . em
'd ode ocorrer por e· co m ~m
siológico, de duração desconheci a, que P (MIV) e FIV dos oócitos previamente inclu sos em FOPA Vitro
. • . 1- demonstrado que a
generação e/ou apoptose. Ev1denc1as em .
. , . onsável pela atres1a
apoptose é o mecanismo b1oqu1mico resp .
• 1 arte celular ativa
folicular." A apoptose caracteriza-se pe a m .
. • ocorre em tecidos
em todos os organismos mu 1tice 1u1ares e
que estão sofrendo alterações no desenvolvimento ou res· Aspectos anatõmicos
. . . como .formato, tamanho• locai·izaçao. e
pendendo a um estímulo fisiológico. Aalteração típica obs~r- organização h1stolog1ca ovaria na, compreendendo as regIoes
..
vada é a condensação da cromatina, resultando na formaçao cortical e medular, bem como as estruturas constitui·nt es do
de zonas densas de heterocromatina na membrana nuclear. estrema (tecido conjuntivo, fibroblastos, vasos sanguíneos e
independentemente da condensação da cromatina, endonu· linfáticos, nervos etc.) e do parênquima (folículos, corpos he-
cleases dependentes de cálcio e magnésio são ativadas, resul-
morrágico, lúteo e albicans), têm sido extensivamente descri-
tando na clivagem do ácido desoxirribonucleico (DNA) entre
tos.'3 Da mesma maneira, as duas principa is funções dos ová-
as unidades nucleossomais, acada 180 a200 pares de bases."
rios, isto é, endócrina e gametogênica (produção e liberaçáo
Ocitoplasma de células apoptóticas evidencia-se pela agrega-
do oócito por ocasião da ovulação) são igualmente descritas
ção e desorientação de suas organelas. Concomitantemente, a
em diversas publicações. 2' Referente à função gametogênica,
membrana plasmática mostra sinais de retração e finalmente
embora se saiba que esta resulta da interação de dois proces-
a célula rompe-se em diversos fragmentos denominados cor-
sos -oogênese e foliculogênese -, muito pouco se compreen-
pos apoptóticos,38 que são, então, fagocitados pelas células
da vizinhança. Em geral, esse processo inicia-se antes que a de sobre os mecanismos que controlJm o desenvolvimento e
membrana plasmática perca completamente sua integridade; aregressão (atresia) folicular. Apesar de o desenvolvimento de
dessa forma, não ocorre extravasamento dos componentes ci- folículos antrais, notada mente em bovinos, ter sido amplamen·
toplasmáticos e não se observa reação infiamatória. 38 Aatresia te descrito, informaçõesconcernentesà fisiologia dos folículos
fo/icular é um processo de duração ainda pouco conhecido,39 pré-antrais são escassas. Sabe-se de estudos histológicos que
 rirnordiais são ativados e transformam -
rculoS P . .. . se, suces-
0sf0 1 ern folículos 1ntermed1arios, primários e s d. uma população d · ·
. ente, _ _ . ecun a- . e ooc,tos em um mesmo estágio de d esen-
11varTl tanto nao sao conhecidos com exatidão os f t volvimento e d .
. entre ' . . . _ a ores e mesma origem. Outra consequência imediata
dessa nova b.10 t · • ,
rios, vern ou inibem a at1vaçao dos folículos pr,·m d . . ecnica e a criopreservação de FOPA isolados
m~
queP aqueles irnplicados no controle do cresc·I ou in situ (no interior d e tecido ovariano), a qual poderia ter
como . menta fundamental 1 ·m rt · • . . -
l)efll s prirnários e secu ndários. Em resumo compar d po ancIa na con stItuIçao de bancos de ger-
folícLI Io , a a
de t ai a pré-antral compreende um período obscu moplasma animal, que visaria à conservação de oócitos de
. fase an r , . • ro e
a conhecido da fohculogenese, sendo, portanto, um vas- animais de alto valor zootécnico e/ ou em perigo de extinção.
pOuco . - . t ·f·
para investIgaçoes oen 1 Icas. A vantagem da criopreservação de FOPA é semelhante à do sé-
0
1ocamP b. t · · 1· men. Tendo em vista a prevalência dos folículos pré-antrais so-
Tendo em vista que as 10 ecnicas Igadas à reprodução
bre os antrais (90% contra 10%), milhares de oócitos neles con-
finalidade geral o aumento da eficiência reprodu -
têfll com 0 . . tidos poderiam ser recuperados a partir de um ovário de um
. dos rebanho s, sera considerada agora a eficácia do ová-
mesmo animal, congelados e estocados por longos períodos
tiva uma "máquina" produtora e liberadora de óvulos
O . . - . (meses a anos), preservando dessa forma o material genético
forme abordado na primeira seçao deste capítulo, 0 ovário
da espécie em questão. A criopreservação de FOPA também
con ·t ro contém mI·1h ares d e oocItos,
· · ·inc 1usos em sua maio-
rnamI e pode contribuir para a medicina humana, pois pode represen-
ria (cerca de 90%) nos folículos pré-antrais. Apesar deste enor- tar uma excelente alternativa para mulheres que apresentam
me ·capital" oocitário, uma ínfima proporção desses oócitos problemas de concepção ou que são submetidas a tratamento
(cerca de o,1%) será ovulada e, consequentemente, poderá químio e/ ou radioterápico. As vantagens do emprego atual e/
ter alguma possibi lida de de ser fecundada. Conforme o ex- ou futuro da biotécnica de MOIFOPA estão resumidas a seguir:
sto anteriormente, considerando-se o fato de que a quase
• Aumento da eficiência reprodutiva de animais de alto valor
:alidade dos oócitos se rá eliminada pelo processo de atresia,
zootécnico ou em perigo de extinção
caso eles perman eçam n o interior dos ovários, a biotécnica de
• Redução do intervalo entre gerações, por meio da utiliza-
MOIFOPA fundam enta-se em dois objetivos principais: (1) res-
ção de ovários de animais jovens (fetos, recém-na scidos e
gatar ou isolar os FOPA a partir dos ovários antes que eles se
animais pré-púberes)
tomem atrésicos; e (2) cu ltivar os FOPA e, consequentemente,
• Recuperação de rebanhos eliminados por problemas de
osoócitos imaturos n eles inclusos, até o estágio de maturação, saúde, desde que não haja comprometimento do ovário
prevenindo-os da atresia. • Utilização de ovários de animais que não reagem a trata-
Abiotécnica de M OI FOPA é de grande importância tanto mentos de superovulação
para a pesquisa fun dam ental ou básica quanto para a repro- • Aproveitamento de ovários de animais portadores de pato-
dução animal. No tocante à pesquisa fundamental, essa tec- logias graves de tubas uterinas e/ ou útero
nologia poderá contribuir para elucidação dos mecanismos • Obtenção de descendentes de um animal mesmo apó s a
implicados na foliculogên ese na fase pré-antral. Nesse caso, os sua morte, desde que a colheita dos ovários seja realizada
FOPAs isolados do ambiente ovariano, e consequentemente antes que a sua degeneração ocorra
das influências endócrina e nutricional do organismo animal, • Melhoramento da utilização de biotécnicas como FIV, clo-
JIOclerão ser cultivado s in vitro em presença de diferentes subs- nagem, transgênese e TE •
"·-· • · fªtores .de
""JC1as conhecidas (matriz e x tracelular, hormonios, Padronização das biotécnicas de FIV, clonagem e tran sg e-

Ci!Scimento, carboidratos aminoácidos etc.), cujos efeitos m- nese . -

. f da mental_ fonte abundante de informaçoes a
ilvidual ou associado pod,e rão ser avaliados e controlados em • Pesquisa un ,
·t da foliculogênese na fase pre-antral
41-ersos experimentos. Os re sultados oriundos desses expe- respeI o
~ os Possibilitarão
. a e lucidação dos mecani
·smos envol- • Formação de recursos humanos.
lidos tant0 na ativa ção dos folículos
. d . ·s
primor 'ª'
quanto no

lllscimento de folículo s primários e secundários. Conservação e isolament? in vit~o

reiaçao
• à reprod ução animal, no f uturo Oisolamento
. .
5 de FOPA a partir de um único ova no e 0
posterior
.
de folícul°..5. .ºvarianos.pre~~.~.~r..~•5. .........
.
ln 'litro {CJV) dos oócitos neles inclusos ate, O es tágI0.
de
. ···· ;ação de ovários durante
. 1· · o de an1ma1s
..,,.,_
P<>derá contribuir para a multIp ,caça
· ão Tal o Je
b. _ conse orle até o laboratório
.......,r ZOotécnico ou ameaçados de extinç · d O transp e folículos pré-antrais de mamíferos é de
..,__ d uantidade e
-..inçado pela obtenção de gran e q se O resfriamento d. conservação durante o transpor-
mo animal, que tãncIa para sua .
êneos oriundos de um rnes . dos poste- g rande impor d
, . do local e co
lheita até O laboratório, garantm-
1.
m e maturariam in vitro, sendo utiliza ologia te dos ovanos ·d d para criopreservação e/ ou cu t1vo
boa quali a e
blotécnlcas de FIV e clonagern , Essa tecntécnicas,
do portanto,
'
. d
·sas realiza as p
or nossa equipe demonstraram
. - de outras
bé m para a padronizaçao folicular. pesqu1
á utilizada
z que ser
, FIV e transgênese, uma ve
 Wf11illi?WWTifi'TtWITZP . ..
uantidade de FOPA a partir dos ova n os. Na literatura
. e ovinos podem ser q ·stros de estudos de FOPA isolados re 5 • Os pII
que folículos pré -an trais bovinos, capnn~s as soluções salina
conservados in situ, eficientemente, a 4 C n . ( BC) TCM-
meiros regi
te em anI
, . . '
·mais de laboratono (com o munnos) so e d
,
Pectiv
orn .
·
ª"'•ri.
5 ' b •nos)" ocorreram nas d écadas de 1960 •stico,
(55), à base de água de coco (58AC ), Braun-Collins ' bem (como ov1 . . . e 1990
t · 24 horas; rocedimentos enz1maticos e mecânicos , Utili-
199 ou phosphate buffer saline (PB5) por ª e _ E tai s zando-se P . . . . , respec .
rincipio dos metodos de ,solamente f0 1.1 tiva.
como a 20ºC por 4 horas nessas mesmas soluçoes. m _ mente. O P _ . cuJar
. rf I giramente nor . dissociação ou separaçao dos foliculos Pré- cor,
condições o percentual de foliculos mo O O s1ste na . antrais
' 65% (TCM-199 a . omponentes do estrema ova nano (fibrobla dos
mais variou de 60 (55 - 4°( por 24 horas) a )" demais c . .. stos, fib
" (55 4ºC por 24 horas , as e elásticas, fibronectina etc.) utll12ando-se ra,
4ºC por 24 horas) para bovinos, 78, 1 - . ( 8C co 1agen . _ , Para is
70 5 . ntos mecânicos associados ou nao aos qu· . SO,
a 91 % (5BAC - 4º( por 4 horas).. para caprinos e de instrume . A • 1rr11cos
- 2o•c por 4 horas)" a 95% (TCM-199 a 4ºC por 4 horas) para .
-NI.
•t·cos Nos procedimentos mecanicos, os equ·i
. .
º"
ovinos, não sendo observadas diferenças significativas em mais com umente utilizad~s sao o t,ssue chopper, mixe,, tesoº'
comparação aos ovários no momento da colheita, apresen- ras cirúrgicas, pequenos fo rceps_e agu lhas di_ssecantes. Elt\ r::
88 496
tando média de normalidade de 68% para bovinos," , lação aos proced ime ntos enz1mat1 c~s, ~s enzimas ProteoHticas
para caprinos 45•46 e 93,6% para ovinos.47 Por outro lado, após mais utilizadas são a colag_enase, tnps,na _e Pronase, sendo a
12
conservação a 2o•c por 12 ou 24 horas e a 39ºC por 4, ~u primeira empregada na m a1ona das pesquisas.
24 horas, em todos os m eios test ados, observou-se reduça~ Métod os enzimátic~s d e isolamento_ de folículos Pré-a,.
significat iva d o percent ual de folículos pré-antrais morfologi-
ta:~
trai s foram descritos nao apen as em anima is de laboratór
camente normais ao longo do tempo.u,4 5-48 Utilizando a tem- como camundonga,s2.sJ rata,5" hamste,,ss coelha,56 mas
peratura de 39ºC, a conservação de ovári os ovin os é viável por 58
bém em suínos,6 gatas, 57 huma noS, fetos bovinos,s9 ovinosl50
ap enas 2 horas,49 quando ocorre manutenção do percentual
e caprinos.6, Já os métod os mecânicos têm sido mais com .
d e fo lículos pré-antrais normais similar àquela observada no · 51,59 ' 31,62 • U
mente usados em b ovinos, caprinos, ovInos 63 e felinos ~,
m o m ento da colheita dos ovários, conforme análise ultraes-
A quantidade máxima de FOPAs isolados por ovário, utiliza~-
trutural (Figura 16.4).
do-se procedimentos m ecânicos e enzimáticos em ovários de
diferentes espéci es, é m ostrada n o Quadro 16.3. Conform,
Bases gerais da técnica pode ser observad o, indep endentemente do tipo de procedi-
de isolamento folicular mento (mecânico ou enzimát ico) podem ser isolados milhares
No laborató ri o, a utilização de FOPA para criopreservação e/ ou de folículos pré-antrais po r ovário. Diante do exposto, conclui-
CIV no âmbito das pesquisas fundamental e aplicada (futuro) é se que, devido à grande eficiên cia dos métodos disponíveis,a
precedida do emprego de métodos eficazes (mecânicos e/ ou obtenção de oócitos inclusos em folícu los pré-ant rais isolados
enzimáticos) que possibilitem o isolamento de uma grande não constitui um empecilho p ara o desenvolvimento da bio-
técnica de MOIFOPA.

Protocolo de isolamento de folículos

ovarianos pré-antrais bovinos in vitro
A titulo de exemplo prático referente ao isola mento mecânico
de FOPA, será ilustrado e det alhado a seguir o procedimento

6mero médio de folículos ovarianos pré-antraís (FOPAI

os em bovinos, ovinos e caprinos utilizando os
ntos mednico ou enzimático. •

itfi'li'il ·
2.396 SI
JI
65
SI
61
218
 -----------------====·~•:
Wtt.JJauxna ·•
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~-t~il~®'~ttA~i~•t~&-~ti~4~•~1i~i!J~•l~f!!i~iM~
•~•)®)~
.
~IJi= ~~-!.I - •
·t~,t-~f-w~rntMJ;m1b!·
~ -~ -

. pi es desenvolvido para bovinos" qu .

. sim . e e e manipulação dos FOPAs. O procedimento mecânico sim-
cân1c 0 o-o rotina em d iferentes laboratórios N
111e ado c '" • . • esse ples de isolamento de folículos pré-antrais é il ustrado nas
f11Pre9 isolam ento m ecan 1co de FOPA consiste
e d·rnento, 0 . em Figuras 16.5 e 16.6. A Figura 16.7 ilustra folículos primordiais,
roce I desc rit as a seguir.
primários e secundários presentes nas suspensões obtidas
p etapas,
qúatrO após isolamento mecânico.
IObtenção e tratamento
ftaPª 1 ,·
, 1·rn inar do ovano
pre 1 . •
, , s oriund os d e ani m ais m ortos (obtidos em mata-
0vano . . ) _
OS vivos (a pós ova nect om1a sao colocados em meios
úrol ou - d I d , .
do , d s (p. ex., soluçao e c oreto e sod10 (NaCI] a o9%
opna o ' '
aP; rcM-l 99), t ra nsportados ao laboratório em recipientes
PS'. a temperatu ras que variam de 4° a 39º(, Os meios as-
tér1111cos ·1·
. orno as t emperatu ras ut1 1zadas, dependem da finalidade
'
s1rnc o No labo ratono,, . os f o 1icu
· 1os antra1s
. superficiais são
do estu d ·
cionados com u m a peque na ag ulha para a eliminação do
plln 'd , . , .
flúidofolicular. Em segui a, o ova no e seccionado com uma lâ-
. de bisturi de m odo a obter duas porções. Posteriormente
mina ,
rocede-se à rem oção de estruturas ovarianas, como os cor-
p salbicans, lúteo e hemorrágico, visando obter melhor frag-
po
rnentação do ova' no
· no t1ssue
· eh opper.

, Etapa 21 Fragmenta ção do ovário no tissue chopper

Nesta etapa, as duas porções de cada ovário são seccionadas
!sentido corticomedular) em peq uenos fragmentos utilizan-
do-se o tissue chopper previamente regu lado para a realização
de cortes em interval os seriados, de acordo com a espécie
(bovino - 50 µm,64 caprino - 75 µm, 31 ovino - 87,5 µm" ). Para
B
se obter uma frag mentação mais eficiente no tissue chopper,
oovário é umid ifi cado com TCM 199 acrescido de 5% de soro
1anguíneo (TCM 199•) e cortado nos sentidos longit udinal,
transversal e obl íquo. Em seguida, os fragmentos ovarianos
obtidos são transferidos para tubos de 50 m(, contendo 15 mf
de TCMl99• e ressu spendidos nesse meio.

• Etapa 3 I Dissociação mecânica

dos fragme ntos ova ria nos
Paraotim• , ,
tra· izar O processo de isolamento dos follculos pre-an-
b.
dos15, os frag mentos ovarianos presentes na suspensao,•
o t i-
dos na etapa -
2, sao d issociados mecanicamente por repet1 •-

Pw.lllovirnentos de sucção e eJ·eção utilizando-se pipetas

· de
·.':'11!\Jr tal'b '
1 rada s a 1.600 e 600 µm de diâmetro.

Pa 1Separação de folículos isolados

rneio de filtração simples
laçao m ecâ n ica com pi petas de Pasteur, a suspen-
na etapa anterior é sucessivamente fil t rada em ma-
nde 500 µ e 100 µm de d iâmetro, com a fina lida-
r OS follculos p ré-antrals iso lados dos fragmentos
no > 100 µm de diâm etro, retidos nas malhas
8 Pós, o filtra do obtido é levado ao microscó-
a Identificação, contagem, classificação
D
FIGURA 16.5 Procedimento mecânico simples de isolamento de foll-
culos ovarianos pré-antrais a partir de ovários bovinos. A, Ovário no
tissue chopper. B. Suspensão de fragmentos no meio de isolamen-
to. e. Dissociação mecânica dos fragmentos de ovário com pipetas
Pasteur. o. Filtração da suspensão em malhas de 500 e 1oo µm .
•
. _ _
FIGURA 16.6 Principais matenais e equipamentos ull
_liZados no isolamento 8 na identificação de folículos ovarianos pré-antrais OOVn)s
FIGURA 16.7 Folículos pré-antrais isolados mecanicamente. A. Folículo primordial. B. Folículo primário. C. Folículo secundário.
Cultivo in vitro de folículos
ovarianos pré-antrais
Bases gerais
o objetivo principal do CIV de FOPA é promover o desenvolvi-
mento folicular, assegurando o crescimento e a maturação dos
oócitos, bem como a multiplicação e posterior diferenciação
das células da granulosa inclusas nesses folículos. O sistema
de cultivo ideal deve preencher os três seguintes requisitos
básicos e sequenciais: preservar a viabilidade dos folículos,
conservar sua aparência morfológica preexistente in vivo e,
finalmente, desde que mantidas as condições precedentes.as·
segurar o crescimento e a maturação folicular. Especialmen_te
no tocante a animais domésticos, os sistemas de cultivo do·
poniveis cumprem apenas parcialmente os requisitos supr;
citados. A composição dos meios utilizada para o cultivo de
FOPA varia enormemente, em função do estudo realizaOO-
Apesar disso, alguns componentes como solução salina, an~
bióticos (penicilina, estreptomicina), tampões (bicarbonal~
fosfato, Hepes) e diferentes substratos nutricionais (monas
. .
sacarídeos, lipldios, proteínas, aminoac1dos,
. . etc.) constituem a base da ma,orta
ª"
, 'dos nucleKO!.
. . dos meiosellie
. ~•·
vitaminas
poniveis. Ademais, esses meios básicos são frequentem
 W+ffiHll•hDmài,t[4!1tei.f.'t•t-:rfflmtmlh.i-fiA,idOtA!it:Imkiihi:~
enriquecidos com fontes proteicas (soro - fetal calf serum
CS], estrus cow serum [ECS], steer serum [55] ou bovine serum
(~bumin [BSA]), hormõnios (FSH, LH, hormõnio do cresci-
:ento [GH], hormõnio antimü!leriano (AMHJ, andrógenos e
17 p-estradiol), peptídios (pept1dio intestinal va soativo [VIP])
e diversos fatores de crescimento (ativina, kit ligand, fator de
crescimento queratinocitico [KGFJ, BMP-7, LIF, EGF, FGF, TGFa,
TGFP, IGF-1, IGF-2 e GDF-9) em diferentes combinações e con-
centrações. Independentemente da composição do meio para
o sucesso do cultivo, a osmolaridade e o pH devem situar-se,
respectivamente, entre 280 e 31 O mOsm/f e 7,2 a 7,4. A dura-
çâo do cultivo pode variar de um a vários dias, de acordo com
a finalidade do experimento. Além do meio de cultivo, outro
componente que não afeta propriamente a viabilidade do fo-
lículo, mas a sua habilidade de reagir a diferentes estímulos
(hormônios, peptídios e outros fatores de crescimento), é 0
substrato com o qual o folículo mantém contato. Do ponto de
vista didático, de acordo com a modo de contato do folículo
com o substrato, podem-se classificar os sistemas de cultivo
em bi e tridimensionais, conforme ilustrado na Figura 16.8. No
sistema bidimensional, o folículo encontra-se sobre o substra-
to. Este pode ser o próprio plástico da placa de cu ltivo recober-
to ou não por ágar, por componentes da matriz extracelular
purificados (colágeno do tipo 1, fibronectina, laminina e matri-
gel) ou por monocamada de células somáticas (células da gra-
nulosa, fibroblastos e outros componen tes do estroma ovaria-
no). No sistema tridimensional, o folículo encontra-se no inte-
rior do substrato, ou seja, totalmente circundado pelo subs-
trato. Os substratos mais comu mente utilizados nesse tipo de
Exemplos
i
!
1 tem sido realizado para estudar a ativação de folículos pri-
Meiode
l l
Ê BE:J~~.
cultivo
Foilculo
2 3 4 Substrato
A o contato celular e facilitar a perfusão do meio para o tecido
S u b s t r a t o ª Follculo
B auxílio da técnica de imuno-histoquímica, o PCNA tem sido
FIGURA 18.8 Sistemas de cultivo de follculos pré-antrais. A. Sistema bi-
clmenak,na1 - folículo cultivado sobre o substrato. B. Sistema trid1men·
llonal - follculo cultivado no interior do substrato. 1: suporte plástico
lern revestimento; 2: suporte plástico revestido por células: 3: suporte
Plllauco revea1Jdo por matriz; 4: suporte plástico revestido por matriz
COrlf8ndo Células sobre a sua superfície.
sistema são o colágeno do tipo I e o ágar, apesar de existirem
relatos com cultivo em gotas de algi nato utilizando folículo
pré-a ntrais de murinos, humanos ou primatas não human~s... 1
É bem conhecido e relatado em diferentes artigos que existe
uma relação direta entre forma e função celular. A forma da
célula é determinada, entre outros fatores, pelos componen-
tes do ci toesqueleto (acti na, tali na). Substratos à base de com-
ponentes da matriz extracelular têm a propriedade de liga r-se
a proteínas transmembranárias denominadas integrinas, que
por sua vez estão unidas aos componentes do citoesqueleto.
Agindo dessa maneira, as proteínas da matriz extracelular, atu-
ando no citoesqueleto indiretamente por meio das integrinas,
controla m a fo rm a da célula e, consequentemente, interferem
em sua função.
Protocolo de cultivo
A título de informação prática, serão apresentados a seguir,
em detalhes, os protocolos de ativação de folículos primor-
diais e de cultivo de folículos primários e secundários após
isolamento. Diferentes métodos têm sido desenvolvidos
para o estudo da ativação de folículos primordiais. Em roe-
dores, a pequena dimensão dos ovários possibilita o cultivo
do órgão inteiro, o que tem sido bastante útil para o estudo
da foliculogênese inicial em pequenos mamíferos. Eppig &
O'Brien 67 obtiveram grande sucesso com a ativação de folícu-
los primordiais in vitro e, a partir disso, esse modelo tem sido
utilizado por diferentes grupos de pesquisadores. Por outro
lado, devido às grandes dimensões dos ovários de animais
domésticos de médio e grande portes, não é possível utili-
zar esse modelo. Para esses animais, o cultivo de pequenos
fragmentos de córtex ovariano, rico em folículos primordiais,
mordiais de caprinos,68 bovinos,'·69 primatas não humanos do
velho'º e novo mundo," e de humanos.58 Utilizando-se des-
ses modelos, os autores citados demonstraram que a maioria
dos folículos primordiais, até 80%, é ativada e se desenvolve
para o estágio de folículos primários. O cultivo de pequenos
fragmentos de córtex ovariano tem a vantagem de manter
ovariano. 72
Diversos marcadores têm sido utilizados para detectar a
proliferação das células da granulosa durante o CIV. O antí-
geno nuclear de proliferação celular (PCNA) é uma proteína
presente somente em células em multiplicação relacionada
com o início de crescimento folicular. 69 Nesse contexto, com
utilizado com sucesso como marcador da atividade prolifera-
tiva das células da granulosa de folículos primordiais de bo-
vinos, babuínos'º e caprinos68 durante o CIV. Por outro lado,
a incorporação de marcadores radioativos (timidina tritiada
[H'-timidina]) ou não radioativos (bromodesoxiuridina [BrdU])
no DNA de células com atividade proliferativa também tem
 ·"'- ..... .
. • . 1e à Human
81otécnicas Aplicadas à Reproduçao Anima

varo início do
sido utilizada com bastante êxito para compro . .d. )' e
. .. . (H'-tImI Ina
crescimento de folículos primord1a1s bovinos
felinos (BrdU).57 , . e
, 1 s primanos
De acordo com Figueiredo et al., fo11cu 0
73
. d manipulados
secundários destinados ao CIV são isola os e CS
previamente em M199 HEPES suplementado com 5% de F '
t
antibióticos (200 Ul/m( de penicilina, 200 µg/m f de eS repto-
.. , . lamento folicu lar,
micma) e 0,23 mM de piruvato. Apos o 1so
obtém-se uma suspensão de volume final igual a 20 me
(p~ra
um ovário inteiro). Dessa suspensão, após homogeneizaçao,
são retiradas alíquotas de 2 mf, posteriormente levadas ao
microscópio invertido para localização, seleção e manipula-
ção de FOPAs isolados. Os FOPAs selecionados são aspirados
com micropipetas e colocados, em grupo de quatro a cinco,
em microgotas de 50 µl do meio de isolamento. A utilização
de microgotas faci lita a localização dos folículos, agilizando
sua inserção nas placas de Petri. Em seguida, os folículos são
submetidos a três lavagens em microgotas, para eliminar as
células do estrema ovariano presentes na suspensão. Após a
lavagem, eles são introduzidos no meio de cultivo (cerca de
350 µt) contido no interior das fossas da placa de cultivo. O
meio de cultivo utilizado por nossa equipe é constituído de
a-MEM suplementado com antibióticos (200 UI/ me de penici-
lina, 200 µg/m l de estreptomicina), 10% de FCS e ITS (insulina
- 10 µg/mf , transferrina - 5,5 µg/ ml e selênio - 5 ng/mt). O
cultivo folicular é realizado em estufas contendo 5% de CO,
em ar a 39°C No caso de cultura de duração de 5 dias, o meio
é trocado 24 horas após o início do cultivo e, posteriormente,
a cada 48 horas,

FIGURA 16.9 Folículos pré-antrais normais (A e B- ausência de azu

Parimetras para avaliação do cultivo in vitro tripan; Ee F- ausência de marcação com etídio homodímero)eoo!'
Analise da sobrevivência folicular nerados (Ce D- marcados com azul de tripan; Ge H- marcados com
etldio homodímero) após o cultivo in vitro.
Os FOPAs podem ser avaliados quanto à sua viabilidade, di-
retàmente fresco, utilizando-se um microscópio invertido
ou após processamento histológico. A
degenerados observados após CIV. Também é possível avaliai
'a-se no aspecto do oócito, quando
a viabilidade oocitária pela autorradiografia, que de modo
granulosa circundantes que devem
semelhante utiliza técnicas histológicas em uma de suas ela·
brilhantes. Os folículos degene-
pas. Nesse caso, avalia-se a capacidade si ntética do oócito e
ulares, oócito e/ou células
das células da granulosa, considerando a sua habilidade de
· o, podendo estar retraídas
incorporar uridina triciada ou metionina marcada com enxo·
ponto de vista histoló-
fre 35 (535). A taxa de folículos vivos pré e pós-CIV pode ser
oócito e das células da
oócito deve apresen- determinada utilizando-se corantes vitais como, por exemp~
0 azul de tripano" e o brometo de etídio, que são incorport
o estágio de
mogêneo. dos somente por células mortas. Além disso, também pode sei
oeadis- definido o índice de apoptose em células da granulosa antes e
ulos após O cultivo folicular pela técnica de Tunel.

• Análise do crescimento 1

Essa análise pode ser realizada: (1) a fresco, medindo-se odiâ-

metro dos,'º1·rcu 1os em geral no início e no fim do pen·odode
cultivo· e (2) d . . . . d células
' etermmando-se a atividade m1totIca as
da g
m ª
readores
. . 3
•
CAPÍTULO l 6 • Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-Antrais
ranulosa, considerando a sua capacidad d .
e e incorporar
rad1oat1vos (H -tImidina- técnica de autorrad10-
.
grafia) ou não radioativos (BrdU) ou expressa· o de protemas
.
específicas como o PCNA. Além disso, a imunomarcaç·
. ao de
atores de crescimentos específicos para O oócito (p.ex., GD F-
f .
9 e e-Kit) e celulas da granulosa (p. ex., KL) poderá definir se 0
desenvolvimendo está ocorrendo de forma sincrónica ou se a
funcionalidade folicular está sendo afetada.
1 fatores que afetam a sobrevivência ,
e
a adesão a morfologia
Informados os princípios básicos sobre o cultivo folicular, al- cultivo. No sistema bidimensional, a utilização de fibronectina
guns fatores que afetam a sobrevivência, adesão e morfolo- (76%), colágeno do tipo 1(65,2%) e matrigel (80,4%) aumentou
gia de FOPAs serão discutidos a seguir, com ênfase na espécie significativamente o índice de folículos aderidos quando com-
bovina. As perdas de folículos durante o CIV podem ocorrer
por duas maneiras: (1) degeneração; e (2) por inabilidade do
folículo de aderir-se ao substrato e, consequentemente, extra-
viar-se por ocasião das trocas de meio de cultivo.
Perdas foli culares por degeneração
A taxa de degeneração folicular que ocorre predominante-
mente no oócito durante o cultivo de FOPAs bovinos pode ser
influenciada principalmente por três fatores: (1) tipo de ovário
utilizado como doador de FOPAs; (2) meio utilizado no isola-
mento folicular; e (3) composição do meio de cultivo.
No tocante à influência do estado fisiológico do animal,
Figueiredo et al. 75 testaram a eficiência de ovários de bezer-
ra, vacas adultas em ciclo normal, gestantes e finalmente em
pós-parto como doadoras de FOPA para o CIV. Após 5 dias de
cultivo, evidenciou-se que o percentual de folículos viáveis
oriundos de vacas em pós-parto (32, 1%) foi significativamente
inferior ao de bezerras (55,5%), vacas em ciclo normal (71,7%)
evacas gestantes (60,7%). Esses resultados mostram que está-
gio reprodutivo das fêmeas doadoras de ovários afeta a viabi-
lidade de FOPAs cultivados in vitro. A sobrevivência de FOPAs
pode também ser afetada pela composição do meio de isola-
mento. Quando o PBS foi usado como meio de isolamento, a
maioria dos folículos apresentou oócitos degenerados após o
primeiro dia de cultivo.'•
A composição do meio de cultivo é outro fator que afeta
a viabilidade folicular, pois Figueiredo." descreveram que a
sobrevivência dos folículos pré-antrais bovinos in vitro foi re-
duzida na ausência de hipoxantina e substratos energéticos,
c~mo O Piruvato e a glutamina. Constatou-se que a adição de
p1ruvato (0,23 mM), glutamina (2 mM) e hipoxantina (2 mM)
ª0 meio de cultivo de base denominado controle (MEM su-
Plementado com antibióticos - 200 Ul/ml de penicilina e 200
11(/mt de estreptomicina 10% de FCS e ITS - insulina 6,25 µg/
mt e selênlo 6,25 ng/mf)' aumentou O percentual de follcu- ·
rnortologlcamente normais de 29,4 (meio-controle) para
,69(, (melo tratado).
• Perdas foliculares por inabilidade
de adesão ao substrato
-
O cultivo de FOPAs bovinos diretamente sobre o suporte de
plástico apresenta como inconvenientes, além da alteração da
forma folicular, as grandes perdas foliculares durante as tro-
cas de meio, devido ao fato de os folículos não aderirem ou
aderirem de modo insuficiente ao plástico. Na busca para su-
perar esses problemas, Figueiredo et al.12 avaliaram o efeito de
diferentes tipos de matriz extracelular (fibronectina, colágeno
do tipo 1, matrigel e laminina) na morfologia e adesão folicular
ao substrato, nos sistemas bidimensional e tridimensional de
parado ao plástico (20,4%) não recoberto por matriz. Quando
os folículos foram cultivados em sistema tridimensional no in-
terior de um gel de colágeno tipo 1, nenhuma perda folicular
foi observada e a morfologia folicular manteve-se semelhante
à originada no ovário. Em resumo, a utilização de componen-
tes da matriz extracelular é importante para preservação da
morfologia folicular e redução ou extinção das perdas folicula-
res durante as trocas de meio de cultivo.
Fatores que afetam ocrescimento
ln vivo, vários componentes produzidos endócrina e localmen-
te podem estimular a neovascularização ou inervação dos
pequenos folículos, os quais fornecem nutrientes, citocinas,
hormônios e substâncias neuropeptidérgicas. Esses fatores
parecem ser necessários para a sobrevivência dos folículos e o
inicio do crescimento folicular.'º
O CIV de fragmentos de córtex ovariano tem sido utilizado
para estudar a ativação de folículos primordiais em várias es-
pécies. Pesquisas recentes têm demonstrado que a fragmenta-
ção do córtex ovariano promove alteração na via de sinalização
"Hippo~ As alterações nessa via de sinalização em associação
com nutrientes, hormônios e fatores de crescimento induzem
a ativação dos folículos primordiais.'' Vários estudos com o cul-
tivo de tecido ovariano de animais domésticos evidenciaram
que FSH (caprinos68), FGF-2 (caprinos" ), GDF-9 (caprinos"),
BMP-15 (caprinos 80~ 1), IGF-1 (caprinos"), KL (caprinos"), BMP-7
(caprinos"'), estradiol e progesterona (caprinos" ·86), LIF (capri-
nos" ), lipopolissacarideos (bovinos 88) , melatonina (caprinos")
GH (caprinos"'), FGF-1O(caprinos" ·"), e deidroepiandrostene'.
diona (ovinos" ) promovem a ativação de folículos primordiais
e aumentam a sobrevivência folicular. Com exceção de IGF-l
e LIF, todos os fatores de crescimento citados, bem como EGF
(caprinos, 68 ov~nos" ), ativina:A (caprinos" ), VEGF (caprinos,.),
BMP-4 (ovinos ') e VIP (capnnos98) induzem crescimento 00 _
citário durante o cultivo de tecido ovariano· Por ouro t 1ado
KGF (caprinos". ) e AMH (bovinos' 00
) não influenc·
1 . '
am a ativa-
ção dos follculos primordiais, e a BMP-6 aument • .
. . . . a os niveis de
atresIa follcular m v1tro (caprino"'). Em animais de Iaboratono,..
 :- ! ) ~.~~;.:.r.•:~•~c;.- .,
•.
-
.<-,- -~- .,i;""', ,, '/'
.:a...~~J.. • •1,,.
..
Biotécmcas Aplicadas a Reprodução Animal e à Humana ,;;J

ostraram que a exposição de folículos a alta

diversos fatores influenciam positivamente a ativação de folí- m . . .
de insulina e FSH induzem a diferenciação i entraç·
culos primordiais in vitro como, por exemplo, kit /igand, FGF-l, . napropr'1 °'i
células da granulosa e estimulam a expressão d ªda d
BMP-2, -7, GDF-9, LIF e insulina.11,101-103,100 Outras substâncias, . . . . e rec a1
de LH em fohculos antra1s em estag1os iniciais d ePtor
ao contrário, como o hormônio antimülleriano, reduzem os ní- e des ei
menta, 0 que pode acarret~r_efeitos deletérios na ca en_vo~.
veis de ativação de folículos primordiais de camundongos in de desenvolvimento dos oocitos.1-1 19 Pac1dade
vitro, como é observado in vivo.1°' Avanços significativos com o cultivo de folícul
Vários sistemas de cultivo de folículos primários e secun- . . . d , os sec..
rios foram descritos em animais omesticos (ver Q ""dá.
dários foram desenvolvidos em diferentes espécies. Tem-se 1 d d uad~
e l6.5), e os pnnc1pa1s resu ta os emonstraram O s 5 16-4
• • •

demonstrado que, para otimizar esses sistemas de cultivo, são

volvimento até folículos antrais iniciais, bem como aeu desen.
necessários a utilização de componentes de matriz extracelu-
de embriões após a fertilização de oócitos oriundos Produçào
lar e vários suplementos, como hormônios, fatores de cresci- ..
los crescidos m v1tro (caprinos,
. i" bbl'
u a mos,106.110.1,. defoli
5
• cu.
mento, antioxidantes, aminoácidos, eletrólitos, vitaminas etc. · fo11cu' 1os secun danos
' · cresceram; uinos 1
Na espécie bovina, . "',.
Esses elementos são essenciais para a manutenção da viabi- • 1 . - , nvrtroat·
0
estágio de fohcu os antra1s, mas nao ,oi relatada e
lidade, do crescimento e da aquisição da competência ooci- a Prod -
de oócitos meioticamente competentes.'"·"'-"' uçao
tária.105·106 Com relação aos fatores que influenciam o cresci-
mento oocitário e o desenvolvi mento de folículos primários,
alg uns estudos demonstrara m que os principais são FSH (bo- Criopreservação de oócitos imaturos
vinos,107 caprinos'°'), ativina-A (ca prinos," bovinos"'·"º), GDF- oriundos de folículos pré-antrais
9,79 estradiol" e IGF-2 (caprinos'"). Em camundongos, recen-
temente verificou-se que uma proteína derivada do oócito, a
História da criopreservação
R-spondin2, promove a proliferação das células da granulosa
e o desenvolvimento de folículos primários para o estágio de A criopreservação teve um grande avanço com a dºs eco ber~
folículos secundários."' de que o glicerol dispunha de capacidade para protegºcrasce-
.
Em animais domésticos, estudos in vitro demonstraram os lulas contra as lesões causadas pela congelação. Em1948,des-
efeitos de vários hormônios (Quadro 16.4) e fatores de cres- cobriu-se acidentalmente que o glicerol poderia possibilitar a
cimento (Quadro 16.5) sobre desenvolvimento, viabilidade e sobrevivência dos espermatozoides de aves durante aconge-
formação de antro durante o cultivo de folículos secundários. lação a uma temperatura de -70'C. Várias especulações sur-
Além disso, já se revelou que o cultivo de grupos de folículos giram sobre como essa descoberta foi realizada. Atualmente
secundários favorece as interações entre eles e promove o está claro que um engano ao etiquetar uma garrafa de solu'.
desenvolvimento folicular in vitro (caprinos 113). A tensão óti- ção em um refrigerador permitiu que o sêmen de ave fosse
ma de oxigênio (20%) e o intervalo ideal de troca do meio (a congelado em uma mistura de glicerol, albumina e água, em
cada 2 dias) também foram descritos.11 ~116 Além disso, rela- vez de uma solução planejada, contendo levulose (frutose).Os
tou-se que a associação de fatores com o FSH é maiseficiente resultados da experiência mostraram que a solução de levu-
na promoção da retomada da meiose em oócitos de folículos lose foi ineficaz e que a de glicerol, em contrapartida, foi alta-
secundários caprinos cultivados in vitro.'"·' 1' Estudos prévios mente efetiva. No princípio, os pesquisadores não conheciam

FSH

LH
Promove crescimento esobrevivência folicular, eformação de antro (e, o, s), produção de estradiol (o, s) e
maruraçao meiótlca oocrtária (e, o, s)
Interage com LH eEGF (c), aumenta aexpressão de IGF-RI eLH·R (e) eamaturação ooc1tána (e, o)
Reduz as taxaS de extrusão oocitária (e) ediminui aexpressão de mRNA para BMPR-IA eBMPRII (c)
Esnmula ocrescimento follcular, afomnaçJo de antro, asecreção de estrad~I eamaturação oocitária (o) 225; 181; 192
-
produção.

219; 220: 181; 221;2n

208; 192; 223; 224

Interage com o EGF eaumenta asobreviYêncla eocresomento folkular, promove aretomada da meiose ooc1tária
(b) eodesenwlvimentofollcular(c) mas.em concentrações superiores a5ng/ml, induz atresia folicular (e)
GH PromoYeaescimentofcllClllar(e;o) íormaçaodeantro(c)eaumentaastaxasdematuraçãooocitária ,n vrrro (c) 182: 116
lnsulilla nteragecomFSHeeslntUla.o emanténS11asobrevivênciafolicular eaumenta a 124; 118

ffe!IUla 226
oocit6rta (s) e mantém a 227; 228

b: bOWIOl; bit bubaflnO!; e caprlnO!; o: OYln05; t ,ui~

 Efeitos de diferentes fatores de crescim t .
. , , , , , . , , en º. ~o~esenvolv1mento in vitro de folículos secundários.

1 Promove cresomento fohcular (c O b b ) .

IGF· retomada da meiose oocitá (b, ' ' u, s · 1ormaçao de antro (c, o, b, bu, s), sobrev1vênoa fohcular (e. bu), e ,,:
- para FSH-R e IGF-1 (b) "ª '
s), bem como aumenta a produção de estrad1ol (b, o) e a expressão de mRNA

IGF-2 Mantém o percentual de folículos m 1 • • _

melhora as taxas d • . or O1ogicamente normais durante o cultivo, aumenta a formaçao de antro e
e maturaçao meiótica (c) 230

Ativina-A Promove proliferação de células d 1 - • • • •

st • 1 . a granu osa (b), formaçao de antro (b) e manutenção da morfologia oootána (b), 124;231;95; 110
°
ed ~ml~ ª1 cresomá ento folicular e OOCitário (o), mas não acelera a diferenciação folicular (o)· induz o crescimento
e ,o 1cu os pnm nos a formação de antro ' -
meiótica (c) ' • aumenta a taxa de crescimento diário e o percentual de maturaçao

UF °
Interage com FSH e promove formação de antro (o), maturação oocitária e desenvolvimento de embriões
partenogenéticos (c) 232

VEGF-A Potencializa o crescimento folicular, a formação de antro e a maturação oocitária (c)

115
Kicligand Promove crescimento e sobrevivência folicular, formação de antro e maturação oocitária (c) 83
p[)GF Interage com o FSH e estimula o crescimento folicular (c)
204
EGF Promove crescimento folicular (c, bu, s), viabilidade (bu), formação de antro (bu, s) e secreção de estradiol 219; 220; 233; 80; 234
e maturação oocitária (s), diminui a expressão de RNAm para FSH-R (c), estimula o crescimento de folículos
primários in virro (b)
FGF-2 Aumenta o crescimento e a sobrevivência folicular (c, bu), promove maturação oocitária in virro (b) 229; 235; 217; 234
VlP Promove o crescimento de folículos pré-antrais (bu)
233
BMP-6 Aumenta o diâmetro folicular, a formação de antro e interage com o FSH para promover a expressão de RNAm
para FSH-R (c) 223

BMP-7 Promove crescimento folicular e interage com o FSH para aumentar a formação de antro e a expressão de RNAm 203
para BMP-7 e FSH-R (c)
BMP-1 5 Influencia positivamente a formação de antro. Promove o crescimento folicular e mantém a ultraestrutura (c) 81
b: bovinos; bu: bubalinos; e: caprinos; o: ovinos; s: suínos.

a composição da sua sol u ção aparentemente "milagrosa~ mas

com ajuda de um quím ico analítico foi revelada a sua verda-
deira constituição, e experimentos realizados posteriormen-
te revelaram que o g licerol era o ingrediente ativo. Após a
descoberta do glicerol, pesqu isas foram realizadas utilizando
essa substância como agente crioprotetor (ACP) de gametas
femininos (oócitos) inclusos no tecido ovariano de camundon-
gas'" e ratas."' Apesar da eficiência do glicerol na preservação
de sêmen, os pesquisadores mostraram também que a conge-
lação e a descongelação de ovários causava a destruição de
mais de 90% de oócitos. 127 Por outro lado, uma outra pesqui-
sa mostrou que uma grande quantidade de oócitos oriundos
de folículos primordiais sobrevivia e tornava-se madura após
transplante para fêmeas ovariectomizadas. 12• Historicamente,
devido ao seu baixo efeito tóxico, o glicerol tem sido exten-
sivamente utilizado como ACPs para a congelação de sêmen
de animais e humanos. Entretanto, o seu uso para a preserva-
ção de tecido tem sido limitado, devido à sua pobre capacida-
de de Penetração.129 Desde então, vários outros ACPs, como
Ddimetllsulfóxido (DMSO),"º·"' 0 propanodiol (PROH) "' ou o
etilenoglicol (EG),"'·'"' t ê m sido amplamente util izados para
a crio Preservação de oócitos ou teci•d o ovan·a no por já terem
lllo5!rado resultados superiores aos do glicerol.
Principais avanços
A criopreservação de oócitos é uma alternativa para conser-
vação do material genético d e espécies ou raças de animais
domésticos que são utilizados comerciaimente, bem como
de mamíferos silvestres. Essa técnica também é importante
na medicina humana para estocagem d e oócitos de mulhe-
res com problemas re produtivos ou submetidas a tratamento
rádio e/ ou quimioterápico (no caso de câ nceres), reduzindo
assim os problemas éticos, legais e morais que geralmente
estão associados ao armazenamento d e embriões. Os oócitos
utilizados na criopreservação pod e m ser imaturos (orig inários
de folículos pré-antrais ou t e rciários) ou maduros, oriundos
de punção de folículos pré-ovuiatórios ou obtidos apó s MIV.
Neste último caso, ne m sempre aplicado e m humanos, poi s
em alguns países é proibido maturar o ó citos humanos in vitro,
a não ser que sejam utilizados ape nas p a ra p esqui sa. A des-
peito da considerável p esqu isa realizada du rante os últimos
15 anos, o progresso obtido na crioprese rva ção d e oócitos
maduros tem sido muito limitado. Esses oócitos t ê m sido crio-
preservados utilizando-se o s protocolos de cong e lação lento
e rápido, e de vitrificação. Entretanto, as ta xas de f ecundação
e de desenvolvimento in vitro são muito infe riores às d e oó-
citos não criopreservados e, geralmente, a FIV ocorre p o r meio
 i realizada em bovinos,'" utiliza ndo-se .
rnaturos fo , Princ'1
MSO e o PROH como ACP em procedi Pal.
de técnica de injeção intracitoplasmática de espermatozoides mente, o D menta
(ICSI). Apesar de os oócitos maduros serem particularmente elação lenta'" e rápida.'so s de
ro~ . . .. d
sensíveis aos procedimentos de criopreservação, alguns pro- t rísticas citolog1cas espec1a1s os oócitos
C arac e . . . . madur 0
gressos têm sido obtidos inicialmente com a adaptação de rneiótico granulos cort1ca1s e c1toesquelet s,
corno fusO ' . o, tên,
uscetíveis a danos durante o resfriamento se
protocolos empregados em embriões. mostrado S ._ . eaex
Whittingham 135 criopreservou pela primeira vez oócitos . _ s ACP111 Essa expos1çao e a posterior criopres Po-
s1çao ao · . . . . ervaçào
maduros de camundongos utilizando um protocolo similar _ . plicados no aumento da inc1denc1a de anorm l'd
estao ,rn . .. . _ a I ade
ao empregado originalmente para embriões de animais dessa rneiótico no 1nic10 da at1vaçao pa rtenogenéti s
no fus O ' . • . . ca e no
espécie. Carrol! & Gosden'36 demonstraram que, emcondições .
estIm ulo da liberaçao dos granulos cort1ca1
. . . . s. A criopr eser,a.
apropriadas para congelação e descongelação, oócitos de - pode também aumentar
çao .. a inc1denc1a de . perda cro111as.
camundongos criopreservados são aptos para fecundação e ômica no fuso rneiot1co e, nesses casos, nao se poden,
S f d - 15l Ob-
podem desenvolver-se a taxas similares àquelas normalmente ter resultados favoráveis na .ecun . açao. Em d experimentos
obtidas a partir de oócitos frescos. Outros resultados favorá- citoesqueleto de ooc1tos rnaturos e camundongas
38 de Flv, O
veis têm sido relatados em camundongos,137 coelhos' e hu- sofrera m ruptu ra da rede de filamentos e desorganização do
manos."' Nesta última espécie, alguns pesquisadores foram fuso, levando à dispersão dos crornossornos.
mais além, associando a ICSI aos oócitos maduros previamen- Mais recentemente, a criopreservação de folícu los pré-an-
te congelados. Foi também relatado o nascimento de fetos trais vem sendo considerada urna eficaz alternativa para a es-
normais a partir de oócitos criopreservados e submetidos à tocagern de grande quantidade de oócitos imaturos obtidos
ICSI."º Embora o sucesso da criopreservação de oócitos matu- a partir de um único animal. Os oócitos incl usos em folículos
ras já tenha sido obtido em diferentes espécies, verifica-se que pré-antrais apresentam várias características que os tornam
a sobrevivência desses oócitos após os procedimentos de con- menos suscetíveis à crioinjúria do que os oócitos maturas."'·'"
gelação/descongelação é extremamente variável e menos de Dentre elas, as mais importantes são: seu pequeno tamanho
1% dos oócitos humanos maduros fertilizados desenvolve-se bem corno das suas células de suporte (células da granulosa):
a termo.'" Muitas são as justificativas para essa baixa eficiên- sua baixa taxa metabólica, estágio do ciclo celular (núcleo no
cia. O núcleo dos oócitos maduros encontra-se estacionado estado de prófase da primeira divisão meiótica), número restri-
na metáfase da segunda divisão meiótica, condição em que to de células da granulosa, ausência de zona pelúcida e de grâ-
a célula torna-se uma unidade altamente organizada, apre- nulos corticais periféricos e a pequena quantidade de lipídios
sentando zona pelúcida, cromossomos alinhados ao longo de
intracitoplasmáticos sensíveis às baixas temperaturas. Todas
um delicado fuso de microtúbulos (fuso meiótico) e grânulos
essas características são potencialmente benéficas para a crio-
corticais periféricos. Essas estruturas são altamente suscetí-
preservação. Uma vez que a maioria dos oócitos encontra-se
veis aos danos causados pela criopreservação e pelos ACP.'"
inclusa em folículos pré-antrais e que esses oócitos não apre-
e isso pode ser a causa para as baixas taxas de sobrevivência
sentam fuso meiótico, os riscos citogenéticos são menores nas
e fertilização após a descongelação, comumente relatadas.
divisões subsequentes.'" Portanto, eles são pouco suscetíveis
Estudos têm indicado que anormalidades graves podem se
às aberrações cromossómicas'" e, consequentemente, mais
desenvolver durante diferentes estágios do processo de crio-
resistentes aos procedimentos de congelação. Além disso,
preservação, inclusive a lise do oócito. Aexposição aos ACPs
diferentemente dos oócitos maduros, os folícu los primordiais
e/ou a formação de cristais de gelo durante os processos de
têm tempo para reparar danos subletais nas organelas e em
congelação/descongelação podem provocar despolarização
outras estruturas durante a sua prolongada fase de crescimen-
do fuso de microtúbulos,143 interrupção da separação das cro-
mátides no momento da fertilização e a indução potencial to, que ocorreria durante o CIV. Entretanto, ainda não há uma
de aneuploidia após a extrusão do segundo corpllsculo po- qu~ntldade expressiva de experimentos nesta área para com·
lar.'"'·'" Além disso, o endurecimento da zona r essa suposição.m
ocorrer como resultado da liberação prematu s Inclusos em folículos pré-antrais podem ser
corticais do ooplasma.146 Portanto, uma , Isto é, no interior do próprio tecido ovaria·
para evitar esses graves problemas mento.7~146 Atualmente, a criopreserva·
ção de oócitos em um esUglo Inicial de a medicina huma na temsido uma
(imaturos), isto é, antes de retoma rvação da ferttlt" dade."'·"'
folículos pré-antrais que
progredir até a metáfase li,145 qua
com os problemas de
ciada e mais resistente aos da
do tratamento de
de congelação/descongelaçãoll
e 1rra<11ação:
de produção quanto em hu
completamente d
tes, a maioria dos
 tit!4U!1G.ü~-mm;fl!ll.
, .•-----------.::===~~·:!·:U~-I~·•~·:t l~•~h:M~t:t~f~®'~lt~•f~i·:f-~·4:,~,P~=~·~ltil!i:::~troi~•~tt~-H~b:·1~••~•f~~:·
,odução assistida tanto d~ ~umanos como de animais do-
reP . ou não. 158 Na medicina humana•29.1s9 e e . .
ést1cos m an1ma1s
rfle 1aboratório,1S6 os pesquis_adores têm concentrado seus es-
d para a criopreservaçao de folículos pré-antrais in .
1orços -r h. s,tu.
Essas pesqu_isas p~r ana ise ,stológi~a têm demonstrado que
folículos pre-antra1s pre~entes no tecido ovariano após a con-
elaçáo e descongelaçao apres_entam-se morfologicamente
9 ais.1s1.160 Desse modo, o tecido ovariano congelad
norrfl , _ o, con-
tendo os fol,culos pré-antra1s, pode ser utilizado posterior-
/l'lente para tran splantes. Camundongas ovariectomizadas e
autotransplantadas com tecido ovariano fresco ou congelado
e descongelado apresentaram ciclos estrais regulares pós-
transplante em 75 e 80% dos animais, respectivamente.14-4
Teeido ovariano de saguis criopreservado também tem sido
transplantado sob a cápsula renal de camundongas imunode-
ficientes. Nos enxertos recuperados 21 a 32 dias depois, obser-
varam-se folículos em todos os estágios da foliculogênese, in-
cluindo folículos antrais d e 1 a 2 mm de diâmetro.161 Resultados
similares também foram obtidos em humanos, utilizando-se
oMSO e o PROH como ACP."º Relatou-se que ovários fetais
0
decamundongas congelados e descongelados, quando trans-
plantados, recuperaram a fertilidade, mostrando que 73 a 86%
dos animais mostraram-se gestantes.156 O transplante para
um ambiente diferente in vivo pode ser uma alternativa para
a constituição de bancos de t ecido ovariano congelado.1 s9
Fragmentos de ovários ovinos 153 e primatas não humanos'61
enxertados sob a cápsula renal de camundongos imunodefi-
cíentes demonstraram revascularização e crescimento folicu-
lar. Ademais, folículos presentes no tecido ovariano humano
cresceram até o estágio antral (mais de 5 mm de diâmetro)
após 6 semanas de estimulação exógena com FSH."' O nas-
cimento de animais viáveis foi primeiramente obtido a partir
de enxerto de tecido ovariano congelado e descongelado em
camundongos. 136·162. 163 Até o momento, constatou-se que o te-
cido ovariano congelado e autotra nsplantado pode restaurar
•fertilidade em humanos, por experimento que resultou no
nascimento de 38 criança s, contudo sem relatos de sucesso
utlllzado tecido vitrificado. Em animais domésticos
05 ovinos, a viabilidade folicular também já foi demons-
lnedlante análise histológica de tecido ovariano con-
e descongelado., .. Baird er ai.'" realizaram autotrans-
de tecido ovariano em ovelhas após descongelação e
m aumento nos níveis de progesterona 4 semanas
rto. Santos et ai. •06 obtiveram a recuperação da
rlana mesmo após autotransplantar 1/3 de tecido
congelado em cabras ovariectomlzadas. Porém, os
mais encorajadores foram relatados por Gosden
quais relataram nascimento após o transplante de
no ovino congelado e descongelado.
!19sultados satisfatórios referentes à congelação de
l' tenham sido obtidos em alguns animais,
gas, 151161161 coelhas, 167 ovelhas, 151 cabras' e
66
lheres, "' a formação de gelo intracelular ainda
1
:·:-:·:=
·:J-1
pode representar, em alguns casos, um entrave para o sucesso
da criotecnologia. Em tecido, a formação de gelo intracelular
tem mostrado ser muito mais prevalente e pode ocorrer a uma
taxa significativamente maior do que pode ser atingida nas
células em suspensão. A criopreservação de tecido é substan-
cialmente diferente do mesmo processo em células em sus-
pensão, como os folículos pré-antrais isolados, por exemplo.
Em um tecido organizado, a difusão de água e ACP não é fa -
cilitada. Em um tecido, vários tipos celulares contribuem para
a função do mesmo. Portanto, a sobrevivência de cada tipo
1
celular pós-descongelação é extremamente importante. "" O
tecido do estrema ovariano é muito rico em células, as quais
estão juntamente posicionadas. Portanto, a formação de gelo
no espaço intercelular pode danificar facilmente as células e
interromper a comunicação intercelular necessária para a in-
tegridade do tecido. 168
Uma possível alternativa para reduzir os danos causados
pela formação de gelo intracelular seria a congelação de fo-
lículos pré-antrais isolados ou a vitrificação. A congelação
lenta de folículos isolados tem sido estudado apenas em ca-
mundongos 169 e felinos. 1• Utilizando folículos primordiais de
camundongos isolados enzimaticamente, que foram conge-
lados lentamente com DMSO, Carrol! et a/. 169 conseguiram o
nascimento de um animal vivo após a fecundação do oócito
cultivado in vitro. Em outro trabalho, Carroll et a/.51 relataram
que a criopreservação não afeta o crescimento e o desenvol-
vimento do folículo nem a habilidade do oócito de retomar
a meiose, demonstrando, desse modo, que é possível estocar
grande quantidade de folículos para o seu subsequente de-
senvolvimento in vitro. Jewgenow et a1.1• testaram diferentes
ACP (DMSO, PROH, EG e glicerol) também para congelação
lenta de folículos pré-antrais felinos e observaram que, so-
m:nte quand~ o glicerol foi empregado, houve diminuição no
numero de fohculos com oócito e células da granulosa intac-
tos quando comparados com os não congelados (controle). o
percentual de folículos viáveis utilizando os demais ACP foi si-
mil~r ao controle. Amorim et at. 110 realizaram pela primeira vez
a cnopreservação de folículos pré-antrais isolados a partir do
tec_id~ ~variano de. ovelhas. Esses autores demonstraram que
a v1ab11idade de foh~ulos primordiais congelados em DMSO ou
EG nas concentraçoes de 1 e 1,5 M foi similar àquela obser-
va~• para folículos frescos ou não criopreservados. Folículos
pre-an~raIs isolados do tecido ovariano caprino também fo-
ram cnopreservados e posteriormente cultivados in vitro por
24 h"' ou 5 dias (dados não publicados) e mantiveram sua
vi~bilidade compatível com aquela observada em folículos
na~ cnopre~ervados. Após congelação e descongelação de
fohculos pre-a ntra1s isolados, 73 e ?O% de folículos ovinos e
capn~os, respect~vament~, apresentavam-se viáveis. No caso
da cnopreservaçao de .tecido ovariano e m ovinos
· .
. e caprinos
. obtidos, respect1vamente, 47 e 68% d e ,10 1·1culos morfo '
foram
log1Camente normais após descongelação. -
• !'lii:ilfii@ltiiifi·hfrl&rtltí&t:@ [ Ovário
Protocolo de criopreservação de folículos
ovarianos pré-antrais caprinos f"
Fragmentos •
Isolamento

•
ovarianos folicular
Congelação lenta
Folículos
A título de informação, a seguir será apresentado o protoco- isolados
lo de criopreservação de folículos pré-antrais caprinos utili-
zado no Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos
Equillbrio (20°C/20 min)
Ovarianos Pré-antrais (LAMOFOPA). Os ovários caprinos obti-
dos em abatedouros são transportados até ao laboratório a
20'C (freezer programável)
uma temperatura de 20ºC. No laboratório, eles são divididos
em pequenos fragmentos (3 a Smm) e equilibrados a 20ºCpor 2°C/min t
-7' C (seeding)
um período de 20 minutos em solução crioprotetora compos-
ta por MEM adicionado de 1,5 M de DMSO e 10% de SFB. Ao 0,3°C/min t Curva de
COngelaÇào

•
-33°C
término dos 20 minutos, os fragmentos ovarianos são trans-
feridos para um freezer programável, previamente resfriado a
-196ºC (NL,- período mínimo de 24 h)
20ºC e a uma velocidade de 2ºC/min a -7ºC. O tecido ovariano
é mantido nessa temperatura durante a indução da formação

•
Descongelação (1 min TA I banho-maria 37°C)
de cristais de gelo (seeding). O seeding é realizado manual-
mente, utilizando-se uma pinça pré-resfriada em nitrogénio
Remoção de crioprotetor (3 lavagens em MEM - 5 min)
líquido. Em seguida, a temperatura é reduzida a 0,3ºC/min até
+ •
1
alcançar -33ºC e, então, a temperatura é reduzida a uma velo-
Fragmentos ovarianos Folículos isolados

•
cidade de O, 1SºC/min até chegar a -33ºC. Finalmente, os frag-
mentos ovarianos são removidos do freezer e mergulhados em
Isolamento folicular
nitrogênio líquido a -196ºC.
Para a congelação, os fragmentos ovarianos são rapida-
mente expostos à temperatura ambiente por 1 minuto e de-
pois imersos em banho-maria a 37°C por um período suficien-
•
Folículos isolados

te para ocorrer a descongelação total. Após a descongelação, Cultivo in vitro

é realizada a remoção do ACP. Para isso, cada fragmento ova-
riano é submetido, separadamente, a três lavagens sucessivas
em MEM, em intervalos de Sminutos. Após a remoção do ACP,
os fragmentos ovarianos poderão ser submetidos ao isola-
mento follcular.
No caso da crio reservação de folículos pré-antrais isola-
no LAMOFOPA é, resumidamente,
nsão folicular de 0,9 mi são
da mesma quantidade
ndorf, e estabilizadas
pós esse período, os
dos, utilizando-se
s ln sltu. Para
FIGURA 16.10 Protocolo de criopreservação de FOPAs caprinos.
Vitrificação
Um dos gargalos da congelação lenta consiste nos danos celu-
lares causados pelos cristais de gelo. Para minimizar esses ris·
cos, uma alternativa consiste na vitrificação de tecido ovariano
ou folículos pré-antrais isolados. Para tanto, altas concentra·
ções de ACP intracelulares, sozinhos ou combinados (geral·
mente EG + DMSO) em um meio adicionado ou não de ACP ex·
tracelular (comumente sacarose) ou polímeros, são utilizados.
Um dos métodos empregados com sucesso em caprinos,'"
bovinos 173 e ovinos'" consistia na vitrificação em superfície
sólida (VSS). Para a VSS, fragmentos ovarianos são expoStºs
aos ACPs por 5 minutos e subsequentemente mantidos em
uma superflcie resfriada constituída de uma caixa de alumínio
P,llrclalmente imersa em nitrogênio líquido. Os fragmentos ~-
cados são transferidos para criotubos previamente resfria·
·rio
Idos em nitrogênio líquido até que seja necessa
gela·
ulndo procedimentos similares ao da con
meio de
aquecimento e remoção do ACP por
llll _....
t,__' --~=======::::::=::::;~-~_
. . ., ~ l i i t•A•f.till!MWh•EiA:rmti-!!'il:'0E1/tirl•ffWv:=J

do sucesso obtido com a VSS, esse método fun-
Apesar • ltando
. na ern sistema aberto, ou seJa, em direto cantata com o
,1_º,ogênio líquido ou seu v_apor, o que pode acarretar conta-
r,J~nação do tecido com pnons, por exemplo. Por tal motivo,
''" equipe desenvolveu o Ovarian nssue Cryosystem (OTC),
nossa s·,ste em uma peça metálica cilíndrica que promove
que con . . , .
. •ficação de teodo ovariano ou fohculos isolados em um
a v1tri a hermeticamente fechado.17s O protocolo de vitrifica-
si~temmbém viabiliza a utilização de passos para a exposição
~u . '
do ACP, e suces~o ve,': sendo obtido com ~ecido ovariano de
caprinos11s e ovinos, bem ~o~o c~m follculos secundários
isolados ovinos ~ue, após a i~;tnficaçao, foram cultivados in vi-
r,oaté a formaçao de antro.
Estado atual da biotécnica de manipulação
·nvitro de folículos ovarianos pré-antrais
,
....... ··················· · ···· · ············· .... ··········
Superada a etapa de desenvolvimento de métodos eficazes
para O resgate de FOPAs a partir dos ovários, o grande desafio
dos pesquisadores consiste na criação de sistemas de cultivo
especiais que proporcionem condições adequadas para o de-
senvolvimento ótimo de FOPAs in vitro. Em felinos, Jewgenow
eraf.1' relataram o crescimento de folículos pré-antrais oriun-
dos de ovários de felídeos domésticos (gata) e silvestres (leoa
e tigresa). Em marsupiais, Butcher & Ullman 11ª mostraram que
o FSH teve efeito positivo no crescimento in vitro de folículos
pré-antrais de gambás sul -americanos. Nas espécies humana,sa
179
canina,21 e bovina, folículos pré-antrais isolados desenvolve-
ram-se in vitro até o estágio antral. Já em suínos, 2• bubalinos, 180
caprinos116.1a1 e ovinos,1s2 oócitos oriundos de folículos se-
cundários cultivados in vitro sofreram maturação, re~u .
na produção de embriões após FIV. Entretanto, a maioria ~as
pesquisas referentes ao cultivo de folículos pré-antrais in v1tro
foi realizada em animais de laboratório. Em ratos, relat_<>u-se
.- f da fecundaçao de
a produção in vitro de embnoes, a par rr . . s-4
oócitos oriundos de folículos pré-antrais cultivados m v1tro.
Em camundongos, o desenvolvimento in vitro de folículos
pré-antrals foi descrito por vários autores_si.sl.1u-1as Resultados
espetaculares foram relatados por Eppig & Schroeder,6 que
obtiveram o nascimento de camundongos a partir de folícu-
los pré-antrais que cresceram, maturaram e foram fecundados
in vitro. No ano seguinte, Carroll et ai. 169 publicaram um artigo
que representou grande marco na biotécnica de MOIFOPA.
Esses autores obtiveram produtos viáveis a partir do desenvol-
············
vimento in vitro de folículos pré-antrais de camundongos que
foram submetidos previamente a procedimentos de congela-
ção e descongelação. De modo resumido, a Figura 16.11 mos-
tra o estado atual da biotécnica de MOIFOPA em diferentes
animais.
Considerações finais e perspectivas
Conforme abordado neste capítulo, a biotécnica de MOIFOPA
apresentou um avanço significativo na última década. Folículos
pré-antrais oriundos de ovários de seres humanos, animais do-
mésticos, silvestres e de laboratório podem ser isolados e cul -
tivados in vitro em meios especiais que têm possibilitado um
aumento da taxa de desenvolvimento folicular in vitro.

Animal Crescimento Antro Ovulaçao Embrião Nascimento

Felino
(Jewgenow, 1998)
Marsupíal
(Butcher & Ul/man, 1996)
Babuíno
(Fortuna et ai., 1998)
Vaca
(Gutierrez et ai., 2000)
Mulher
(Roy e Treacy, 1993)
Ovelha
(Arunakumari et ai., 2010)
Búfala
(Gupta et ai., 2008)
Cabra
(Saraiva et ai., 2010)
Porca
(Wu et ai., 2001)
Rata
(Daniel et ai., 1989)
Camundonga
(Eppig Schroeder. 1989)
Camundonga
(Carrol/ ai ai., 1990)
FllkJRA 11 · ·
.11 Estado atual da biotécnice de manipulação de oóc1tos inclusos em folículos ovarianos pré-antrais em diferentes espécies.
• Atualmente, essa tecnologia vem sendo utilizada somente
em pesquisa fundamental, não podendo ser aplicada ainda
para multiplicação de animais. Entretanto, no momento, já é
recém-nascidos ou animais adultos) atuarão co
. , . d M
de ovários para a b1otecn1ca e OIFOPA. A partir
mo doad

ovário, milhares de FOPA serão isolados e poder- de um únieo

servados, constituindo bancos de germoplasma a .
ao ser e110
ores

Pre.
possível criopreservar com sucesso tecido ovariano ou folícu- . . ·b·1· d . n1ma1 /
cultivados ,n v,tro, poss1 11tan o o crescimento e 'e ou
los isolados utilizando congelação lento ou vitrificação, com . 1 O , . a matura .
dos oócitos ne 1es me usos. s oootos maduros Pod • láo
posterior desenvolvimento folicular in vitro ou nascimento de ._ . era 0 se
cundados, e os embnoes obtidos poderão ter três des . rfe.
progênie viável após o transplante de tecido congelado.
CIVaté os estágios de mórula e blastocisto e poste . tinos:(J)
O rápido avanço da ciência, associado às facilidades ' norTE
do os embriões submetidos ou não à criopreseva . 'sen.
crescentes de trocas de informações entre laboratórios do , . • rçao; (2)
modificados pela tecn1ca de transgenese no está . ser
mundo inteiro, propiciará, no futuro, o desenvolvimento de gio Pron
clear e, posteriormente, submetidos à TE; (3) ser mulr1 . IJ.
sistemas de cultivo que promoverão excelente crescimento . . - . P11Cado
pela tecrnca de clonagem por transferenc1a nuclear O s
folicular com a preservação da viabilidade folicular. Isso pos- . d . d' 'd d . . essao,a
sibilitará, posteriormente, a utilização de oócitos oriundos neira, milhares e in 1v1 uos po enam ser produzidos a .·
, . , . t 'b . d . Partir
da numerosa população de folículos pré-antra is isolados e de um urnco avario, con n uin o, assim, pa ra a mulr1 1. .
. , . P1caçao
desenvolvidos in vitro, em programas de FIV, clonagem e TE, de animais de alto valor zootecrnco e/ou em perigo d .
e ext1n.
contribuindo a longo prazo para a multiplicação de animais ção (ver Figura 16.12).
de alto valor zootécn ico e daqueles em via de extinção. A cur-
to prazo, paralelamente ao estudo de crescimento folicu lar
in vitro, uma alternativa seria criar procedi mentos de isola- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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