Ebook Bioquimica Biotecnologia Vol1

Vagne de Melo Oliveira
Ranilson de Souza Bezerra

Ana Lúcia Figueiredo Porto
Organizadores
Bioquímica & Biotecnologia

de Organismos Aquáticos:
Guia Teórico-Prático de Atividades
Experimentais para Estudantes e Profissionais
Conteúdo:
Volume I: Bioquímica com ênfase na

Biotecnologia
Volume II: Biotecnologia com ênfase na

Bioquímica
Ranilson de Souza Bezerra
Ana Lúcia Figueiredo Porto
Organizadores
Volume I
Bioquímica & Biotecnologia

de Organismos Aquáticos:
Guia Teórico-Prático de Atividades
Experimentais para Estudantes e Profissionais -
Bioquímica com ênfase na Biotecnologia
1a Edição
Recife – 2021
Vice-Reitor: Prof. Gabriel Rivas de Melo
Conselho Editorial
Diretor da Editora Universitária da UFRPE: Bruno de Souza Leão
Prof.
Reitor:de
Diretora do Sistema Marceloda
Bibliotecas Brito Carneiro
UFRPE: MariaLeão
Wellita Santos
Vice-Reitor: Prof. Gabriel Rivas de Melo
Conselheiros:
Conselho
Renata PimentelEditorial
Teixeira
Diretor da Editora Universitária da UFRPE: Bruno de Souza Leão
Soraya Giovanetti El-Deir
Diretora do Sistema de Bibliotecas da UFRPE: Maria Wellita Santos
Andréa Carla Mendonça de Souza Paiva
Rafael Miranda Tassitano
Conselheiros:
Maria do Rosario de Fátima Andrade Leitão
Renata Pimentel Teixeira
Monica Lopes Folena Araújo
Soraya Giovanetti El-Deir
Andréa Carla Mendonça
Créditos: de Souza Paiva
Rafael Miranda
Revisão Textual Tassitano
| Editoração | Diagramação
Maria do Rosario de Fátima Andrade
Vagne de Melo Oliveira Leitão
Monica Lopes Folena Araújo
Tradução (Abstracts | Keywords)
Créditos:
Beatriz de Aquino Marques da Costa
Revisão Textual | Editoração | Diagramação
ArteVagne de Melo
Gráfica Oliveira
(Capa |Contracapa)
Rodrigo Lahiri (be.net/rodrigolahiri)
Tradução (Abstracts | Keywords)
Beatriz
Arte Gráfica de Aquino
(Chamada Marques
de Capítulos da Costa
|Protocolos |Ilustrações)
Arte Gráfica (Capa |Contracapa)
Créditos de imagens (Capa |(be.net/rodrigolahiri)
Rodrigo Lahiri Contracapa |Protocolos |Ilustrações)
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Este livro não pode ser comercializado em parte, ou na sua totalidade,

conforme determinação legal, podendo ser reproduzido desde que com
autorização expressa e por escrito do(s) autor(es) e organizador(es). Texto,
imagens, gráficos, figuras, tabelas e quadros são de exclusiva
responsabilidade dos colaboradores (autores e coautores).
Este livro faz parte do trabalho desenvolvido com aporte financeiro

concedido pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior, processo nº 88887.175810/2018-00, e do Programa FACEPE
(Fundação de Amparo a Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco),
Acordo CAPES/FACEPE - 18/2016.
Editora Universitária da UFRPE

Rua Dom Manoel de Medeiros, s/n, Dois Irmãos - CEP 52171-900 - Recife/PE. (81)
3320 6170 | editora@ufrpe.br |
Filiada à Associação Brasileira das Editoras Universitárias
FICHA CATALOGRÁFICA
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Sistema Integrado de Bibliotecas da UFRPE
Biblioteca Central, Recife-PE, Brasil
B615 Bioquímica & biotecnologia de organismos aquáticos: guia teórico-

prático de atividades experimentais para estudantes e
profissionais / Vagne de Melo Oliveira, Ranilson de Souza
Bezerra, Ana Lúcia Figueiredo Porto (organizadores) - 1. ed. –
Recife: EDUFRPE, 2021.
210 p. : il.
E-book: PDF
Conteúdo: v. 1 - Bioquímica com ênfase na biotecnologia.
Inclui bibliografia.
ISBN: 978-65-86547-33-7
1. Aminoácidos 2. Enzimas 3. Proteínas 4. Pescados 5. Resíduos

I. Oliveira, Vagne de Melo, org. II. Bezerra, Ranilson de
Souza, org. III. Porto, Ana Lúcia Figueiredo, org.
CDD 620.8
AGRADECIMENTOS
______________________________
U
m agradecimento especial aos autores e
coautores pela significativa e imprescindível
contribuição, profissionalismo e empenho na
materialização desta obra. Ao Programa de Pós-graduação em
Biociência Animal-PGBA/UFRPE e aos órgãos de fomento,
Fundação de Amparo a Ciência e Tecnologia do Estado de
Pernambuco-FACEPE e Coordenação de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior-CAPES.
Aos alunos de graduação e pós-graduação, professores,
técnicos, terceirizados, profissionais, pescadores artesanais e
demais colaboradores. Em especial, a todos que compõem o
grupo de Pesquisa chefiado pela Profa. Dra. Ana Porto e que
desenvolvem seus trabalhos no Laboratório de Tecnologia de
Bioativos-LABTECBIO/UFRPE; também, aos que fazem parte
do grupo chefiado pelo Prof. Ranilson Bezerra, Laboratório de
Enzimologia-LABENZ/UFPE.
Aos departamentos de Morfologia e Fisiologia Animal-
DMFA e ao de Pesca e Aquicultura-DEPAq da UFRPE. Por fim,
um agradecimento especial ao Excelentíssimo Reitor da UFRPE,
Prof. Marcelo Carneiro Leão, a Pró-Reitoria de Ensino de
Graduação-PREG, representada pela Profa. Maria do Socorro
de Lima Oliveira, e a Pró-Reitoria de Extensão, Cultura e
Cidadania-PROEXC, representado pelo Prof. Moisés de Melo
Santana, pelo apoio em todos os âmbitos.
A todos, a mais sincera gratidão.
Prof. Dr. Vagne de Melo Oliveira.
APRESENTAÇÃO
______________________________
O
livro “Bioquímica & Biotecnologia de
Organismos Aquáticos: Guia Teórico-Prático
de Atividades Experimentais para Estudantes e
Profissionais” é uma obra desenvolvida em
dois volumes, numa tentativa de correlacionar a prática
profissional dos engenheiros de pesca e aquicultura, no âmbito
na biotecnologia, com os conteúdos ministrados na disciplina
de bioquímica (aminoácidos, proteínas, enzimas, carboidratos
e lipídeos), estabelecendo um elo entre os conteúdos didáticos
e a vivência profissional.
O vol. I (Bioquímica com ênfase na Biotecnologia) traz
10 capítulos correlacionados com as etapas de extração,
preparação, pré-purificação e investigação analítica das
principais moléculas biológicas obtidas de fontes aquáticas
(proteínas e enzimas); enquanto que o vol. II (Biotecnologia
com ênfase na Bioquímica) traz agrega conhecimentos de
outras biomoléculas (carboidratos e lipídeos), também a partir
de fontes aquáticas, constando também de 10 capítulos.
Ambos os volumes desta edição são escritos de modo
contextualizado e exemplificado dos principais conceitos
básicos utilizados nas aulas de bioquímica para Engenharia de
Pesca e Aquicultura. Os dois volumes formam uma edição
escrita a partir da experiência profissional dos autores e
colaboradores. Todas as práticas e protocolos experimentais
descritos ao longo desta obra foram baseados em atividades
científicas publicadas internacionalmente pelos autores e
colaboradores.
A dinâmica do conteúdo é a mesma para os dois
volumes: os capítulos são iniciados com uma contextualização
breve do conteúdo (fundamentação teórica simples e objetiva),
abordando informações bioquímicas e biotecnológicas sobre o
assunto. Logo em seguida, são listados os reagentes, soluções,
materiais, equipamentos e tipo de amostra a serem utilizados
nas experimentações.
Outro ponto a destacar nestes volumes é a abordagem
interdisciplinar dada aos conteúdos, correlacionando a
bioquímica com as áreas de anatomia de animais aquáticos,
fisioecologia de animais aquáticos, piscicultura, carcinicultura,
maricultura, extensão pesqueira e educação ambiental.
Toda a obra parte do pressuposto da valorização dos
recursos da exploração dos recusos pesqueiros, focando na sua
potencialidade biotecnológica e na preservação do ambiente
aquático, reutilizando resíduos gerados pelo processamento
de peixes e frutos mar realizados por pescadores artesanais e
pela indústria. O incentivo ao aproveitamento dos resíduos se
faz presente do primeiro até o vigésimo capítulo. Esta obra é
destinada também para pesquisadores de iniciação científica,
inovação tecnológica, pós-graduandos dos cursos de mestrado
e doutorado, podendo ser aplicada parcialmente ou em sua
totalidade, de acordo com as condições de cada laboratório.
Por fim, os autores esperam que ambos os volumes
sejam utilizados como guia teórico-prático para serem
utilizadas como ferramenta de aprendizagem para acadêmicos
e profissionais da área, auxiliando no aprimoramento dos
conteúdos de bioquímica aplicados à biotecnologia aquática.
Boa leitura!
Os autores, por Prof. Dr. Vagne de Melo Oliveira.
PREFÁCIO1
______________________________
Adalberto Pessoa Jr
E
ste livro é um avanço na transferência de
conhecimento deste imenso campo no qual
estamos empenhados. Ao receber o convite para
escrever o Prefácio desta obra, vários sentimentos emergiram
de uma só vez; a surpresa da proposta, a felicidade pela honra
do convite e a responsabilidade pela redação de um texto que
precede conteúdo de tamanha importância. Descobri que
minha experiência na escrita de artigos científicos, de capítulos
de livros e de livros não tornaria fácil este desafio, a começar
pelos autores que, apesar de serem de gerações diferentes,
demonstram estar acometidos de energia que mereceria ser
adquirida pelos novos profissionais da área de bioquímica e
biotecnologia. Podemos afirmar que já temos uma nova e
criativa geração de pesquisadores na área de Bioquímica e
Biotecnologia no Brasil e de professores competentes para
ampliar este quadro. Honra-me sobremaneira prefaciar a obra
em dois volumes do livro Bioquímica & Biotecnologia de
Organismos Aquáticos: Guia Teórico e Prático de Atividades
Experimentais para Estudantes e Profissionais organizado pelos
Professores Vagne de Melo Oliveira, Ranilson de Souza
Bezerra e Ana Lúcia de Figueiredo Porto da UFRPE
(Universidade Federal Rural de Pernambuco).
O prazer à leitura deste livro não me surpreendeu. O
tema me envolve há décadas e mais uma vez aprendi que um
1 Prefácio relacionado aos volumes I e II.

novo livro sempre deve ser celebrado. Desde a década de 1980,
temos lutado para que a área de Bioquímica e Biotecnologia no
Brasil fosse incentivada e alavancada. Ao ver a autoria dos
capítulos, confirmei que atingimos um importante objetivo:
temos massa crítica de qualidade, constituída por jovens
distribuídos de norte a sul do Brasil, produzindo com
autonomia. Felizmente já aprendemos a ensinar nossos alunos
de graduação e de pós-graduação fundamentos e conceitos de
Bioquímica, com auxílio luxuoso da Biotecnologia e, no caso
desta obra, com a saudável contribuição de produtos
derivados de pesca e aquicultura.
O conteúdo deste livro está direcionado a todos que
estejam em busca de iniciar ou ampliar o conhecimento em
Bioquímica e Biotecnologia - com destaque para aminoácidos,
proteínas, enzimas, carboidratos e lipídeos - aplicado a organismos
aquáticos, uma vez que propiciará melhor maneira de como
pensar e planejar estratégias de otimização da indústria
pescados. É um livro que está ao alcance de todos que
pretendem evoluir na área; desde o estudante de graduação
até o profissional que já atua no mercado de trabalho, tanto da
área acadêmica quanto da empresarial. A profundidade com
que os tópicos são abordados está perfeitamente adequada
àqueles interessados em atuar na área de processos
bioquímicos e biotecnológicos no mercado de trabalho.
Os capítulos abordam conceitos de bioquímica e
biotecnologia, do ponto de vista teórico e prático, de forma
equilibrada. Eles foram revisitados com objetivo de
contextualizar as estruturas e funções das biomoléculas no
âmbito experimental. O livro pode ser lido do início ao fim de
forma harmônica e sequencial e, também, possibilita que possa
ser lido em qualquer ordem, visto que os capítulos são
autocontidos e os leitores são incentivados a entrarem em
contato com a bibliografia específica referenciada. Percebe-se
que esta produção está profundamente vinculada a uma
prática acadêmica de construção coletiva do conhecimento. O
conjunto da obra me deixa alegre em constatar que algo de
importante e de novo está se passando na bioquímica e
biotecnologia brasileira.
Este livro não esgota, e nem tem essa pretensão, o
assunto relacionado à Bioquímica e Biotecnologia aplicada a
organismos aquáticos. É mais um passo dado na caminhada
rumo à expansão do conhecimento, em língua portuguesa, em
área estratégica, atual e promissora. Ele é direcionado a todos
aqueles que acreditam e trabalham para que a bioquímica e a
biotecnologia do Brasil continuem sendo referências mundiais.
Com prazer recomendo este livro.
Prof. Tit. Adalberto Pessoa Jr

FCF/USP
CONTEXTUALIZAÇÃO
A
s atividades práticas (experimentais e/ou de
campo) são alguns dos instrumentos utilizados
por professores do ensino fundamental, médio
e universitário com o objetivo de aumentar as possibilidades
de compreensão dos conteúdos teóricos explanados em sala de
aula, principalmente (Pagel; Campos; Batitucci, 2015).
A bioquímica tem sido muitas vezes reportada pelos
discentes dos variados cursos que envolvem as áreas das
Ciências Agrárias e das Ciências Biológicas como sendo uma
disciplina de conteúdo de difícil assimilação e entendimento.
Nesse sentido, o desenvolvimento de aulas práticas pode
servir de ferramenta auxiliar para fazer com o que os discentes
consigam se apropriar e desenvolver de modo mais eficiente
determinados conteúdos, especialmente aqueles que exigem
um conhecimento básico de química.
Assim, visando contribuir com a formação profissional
dos discentes de bacharelado e tecnólogos dos cursos ligados a
áreas da Engenharia de Pesca e Aquicultura, este livro propõe
ações experimentais como metodologias auxiliares no processo
de ensino-aprendizagem de bioquímica. Ainda, a proposta
visa, primordialmente, a utilização da pesquisa como suporte
para auxiliar no aprendizado, além da valorização desses
conhecimentos nas ações de cunho extensionistas. Para tanto,
será necessária a definição de alguns conceitos iniciais para
um melhor aproveitamento desta obra e entendimento de seus
objetivos.
O foco das práticas é a dinâmica interdisciplinar. A
educação ambiental é tratada como agente norteador de todas
15
as práticas experimentais, através do reforço a reutilização de
resíduos pesqueiros. Atrelados a isso, estão ainda à exploração
dos aspectos morfo-anatômicos (forma e estrutura) (Figura 1.1)
e fisiológicos (funções físicas, mecânicas e moleculares) das
espécies-alvo, a relação da bioquímica com a fisiologia.
Figura 1.1 Anatomia de peixe teleósteo
Fonte: Design por Vecteezy.com

(<a href="https://www.vecteezy.com/free-vector/vector"> Vetores
vetoriais de Vecteezy </a>)
O desperdício da captura de peixe e o desperdício do

processamento da carne de peixe (filé) ocasionam poluição
ambiental, mas esses materiais ainda podem ser utilizados
como matéria-prima biotecnológica (Espíndola Filho; Oetterer;
Assis, 2001; Tugiyono et al., 2020). Vísceras internas de peixes
são fontes ricas em biomoléculas, incluindo proteínas (Bezerra
et al., 2002, 2005; Feltes et al., 2010; Pinto et al., 2017; Henriques;
Pires; Rodrigues, 2020; Rossetto; Signor, 2021), contendo todos
16
os aminoácidos, fornecendo ácidos graxos poli-insaturados,
vitaminas e minerais. A tabela 1.1 traz alguns dos compostos
que podem ser extraídos a partir de resíduos do pescado,
seguindo descrição de Ashraf et al. (2020), com adaptações.
Tabela 1.1 Compostos extraídos de resíduos do pescado

Componentes Efeito biológico
bioativos
Ácidos graxos
Ômega-3 Efeitos antiinflamatórios, cardio-protetores,
melhoram a sensibilidade à insulina.
Efeitos cardio-protetores, melhora doenças como
Ômega-6 artrite e hipertensão, aumenta a expressão da
molécula 1 de adesão vascular, oxidação, agregação
plaquetária, vasoconstrição, síntese de
eicosanoides.
Aminoácidos
Necessário para a desintoxicação da amônia,
Arginina (Arg) nutricionalmente essencial para a espermatogênese,
crescimento fetal e neonatal, manutenção do tônus
vascular e hemodinâmica.
Alanina (Ala) Ajuda na biossíntese de proteínas, importante fonte
de carbono para a gliconeogênese hepática.
Ácido aspártico Tratamento para fadiga crônica devido ao papel
(Asp) que desempenha na geração de energia celular.
Ácido glutâmico Surfactantes, tampão, agentes quelantes,
(Glu) intensificadores de sabor, função imunológica.
Fenilalanina Precursor para tirosina.
(Fen)
Ajuda na regulação da expressão gênica, síntese de
Glicina (Gli) glutationa. Baixas concentrações de glicina
plasmática têm sido relatadas de forma consistente
em associação com obesidade e diabetes tipo 2
Atua como substrato para a síntese de nucleotídeos
Glutamina (purinas, pirimidinas e amino açúcares), fosfato de
(Gln) dinucleotídeo de nicotinamida adenina (NADPH),
17
antioxidantes e muitas outras vias biossintéticas
envolvidas na manutenção da integridade e função
celular.
Precursor de vários hormônios (hormônio liberador
de tireotropina), metabólito crítico para funções
Histidina (His) renais, neurotransmissão, secreção gástrica e
sistema imunológico, propriedades antioxidantes e
antiinflamatórias, regulação e metabolismo de
oligoelementos e precursor da histamina.
Isoleucina (Ile) Formação muscular e crescimento adequado.
Promove o metabolismo energético (absorção de
Leucina (Leu) glicose, biogênese mitocondrial e oxidação de
ácidos graxos) para fornecer energia para a síntese
de proteínas, enquanto inibe a degradação de
proteínas.
Lisina (Lis) Necessário para um crescimento, imunomodulador.
Usado em vários níveis no metabolismo celular,
Metionina (Met) como um constituinte de proteína, na iniciação da
tradução do mRNA e como uma molécula
reguladora na forma de S-adenosilmetionina.
Papel importante na diferenciação de células, bem
Prolina (Pro) como do feto e associado com membrana extra-
embrionária e desenvolvimento.
Serina (Ser) Homeostase celular, proliferação e diferenciação.
Tirosina (Tir) Precursor de dopamina e norepinefrina.
Treonina (Ter) Manutenção da integridade da mucosa intestinal.
Síntese de proteínas, homeostase de glicose, anti-
Valina (Val) obesidade e vias de sinalizações sensíveis a
nutrientes.
Vitaminas
Vitamina A Promotor de crescimento, ajuda na visão deficiente,
ajuda no crescimento ósseo.
Vitamina D Raquitismo, osteomalácia, melhora a densidade
óssea.
Responsável por converter alimentos em energia
Complexo B nas células do corpo e auxilia no funcionamento do
tecido nervoso.
18
Minerais
Ferro Síntese de hemoglobina.
Crescimento e desenvolvimento, funcionamento do
sistema imunológico e para uma pele saudável.
Zinco Ajuda na divisão celular, crescimento celular,
cicatrização e quebra de carboidratos. Essencial
para os sentidos do olfato e paladar.
Cálcio Essencial para ossos fortes (formação e
mineralização) e para o funcionamento normal dos
músculos e do sistema nervoso.
Importante para os hormônios que regulam o
Iodo metabolismo do corpo, necessário para o
crescimento e o desenvolvimento mental normal.
Proteínas, Carboidratos e Lipídeos
Peptídeos Efeitos anti-hipertensivos, antioxidantes,
Bioativos antimicrobianos e antiproliferativos.
Quitina e Auxilia na cicatrização, reduz os níveis de
Quitosana colesterol, agente anti-úlcera, antienvelhecimento,
cosméticos, oftalmologia.
Condroitina Efeitos antiinflamatórios, suplemento dietético.
Colágeno e Indústrias farmacêuticas, indústrias alimentícias,
Gelatina microencapsulação de vitaminas, engenharia de
tecidos, antioxidante, anti-hipertensivo e
antienvelhecimento da pele.
Astaxantina, Antioxidante, distúrbio neurológico,
beta-caroteno, cardiovascular, antiaterogênico, oftalmologia,
zeaxantina e psoríase, conservante, cosméticos.
luteína
Fonte: Ashraf et al. (2020), traduzido e adaptado.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7281228/
Apesar do baixo valor tradicionalmente atribuído aos

subprodutos pesqueiros, desta enorme massa de recursos não
utilizados/subutilizados pode ser produzida uma quantidade
significativa de compostos bioativos, como enzimas, colágeno,
gelatina, hidrolisados, lipídios, pigmentos (astaxantina, β-
19
caroteno, zeaxantina e luteína), quitina e produtos derivados
extraídos de resíduos de crustáceos (Wang et al., 2019; Ashraf
et al. 2020; Sasidharan; Venugopal, 2020; Coppola et al., 2021).
A bioquímica pura muitas vezes é vista mais como
uma disciplina complexa e apenas “mais uma a ser cursada”
do que como necessária na formação profisisonal. Neste
aspecto, a relação interdisciplinar auxilia na consolidação do
conhecimento de modo associativo. Exemplo dessa situação é
quando o assunto a ser ministrado é sobre enzimas. O assunto
“Enzimas” permeia a bioquímica como um todo, uma vez que
quase todas as reações utilizam enzimas em seus processos. A
diversidade e a complexidade do assunto muitas vezes pode
gerar certa confusão na cabeça do aluno. O estudo associativo
tem contribuído para minimizar esta problemática. Usando
exemplos de espécies de peixes gástricas (tucunaré, tambaqui,
tilápia, ex.) e agástricas (carpa), o conteúdo de enzimas pode
ser desenvolvido de modo a tornar a aula mais atrativa.
Ainda, uma atividade complementar que instigue o aluno a
buscar informações sobre as espécies-alvo do questionamento
e o papel das enzimas naquela espécie pode ajudar na
construnção do conhecimento. Alguns materiais que mesclam
bioquímica com outras disciplinas podem ser indicados, como
o material produzido por Rota (2003) em que são vistos os
aspectos gerais da fisiologia e estrutura do sistema digestivo
dos peixes relacionados à piscicultura da EMBRAPA Pantanal.
Salienta-se que não é do interesse dos autores desta
obra aprofundar conhecimentos relacionados a outras áreas
e/ou competências, mas sim trazer à luz da discussão
informações básicas que podem ser utilizadas nas práticas de
bioquímica como forma de consolidar o conhecimento teórico
20
e despertar, tanto na área da pesquisa quanto da extensão, o
interesse dos discentes pela disciplina. Por fim, estabelecemos
um panorama de informações conceituais básicas atreladas às
atividades propostas visando melhorar a contextualização e o
entendimento dos conteúdos, como as definições descritas na
tabela 1.2.
Tabela 1.2 Termos e definições gerais comumente

utilizadosnas aulas de bioquímica e biotecnologia aplicadas à
pesca e aquicultura
Termo Definições* Exemplificação**
Estuda a química e Estudo de proteínas,
estrutura das moléculas e como colágeno extraído
Bioquímica
reações no organismo. da pele, escamas, ossos e
bexiga natatória de
peixes.
Segundo Nelson; Cox, Exemplos típicos são os
(2017), as biomoléculas são álcoois, que têm um ou
compostos de carbono com mais grupos hidroxila;
Biomoléculas uma grande variedade de aminas, com grupos
grupos funcionais. amina; aldeídos e
cetonas, com grupos
carbonila; e ácidos
carboxílicos, com
grupos carboxila.
21
Segundo Marzzoco; Torres
(2015), os aminoácidos são
Glicina, Prolina,
ácidos orgânicos,
Treonina, Triptofano,
compostos por átomos de
etc.
C, N, O e H, apresentando,
Aminoácidos
na sua molécula, um grupo
amino (− NH2) e um grupo
carboxila (–COOH).
Segundo Nelson; Cox, Proteínas colagenosas

(2017), as proteínas são (colágeno, gelatina)
polímeros de aminoácidos, extraídas da pele e
com cada resíduo de escamas de peixes
aminoácido unido ao seu teleósteos, tai como
Proteínas
vizinho por um tipo pescada branca, e de
específico de ligação cartilagens de peixes
covalente. cartilaginosos, como
raias e tubarões.
Também, enzimas
extraídas do trato
digestivo de espécies de
peixes.
Segundo Harvey; Ferrier Pepsina (estômago),
(2012), as enzimas são tripsina, quimotripsina e
catalisadores proteicos que amilase (intestino) que
Enzimas aumentam a velocidade de podem ser extraídas a
uma reação e não são partir dos resíduos de
consumidas durante a peixes para fins
reação que catalisam. industriais.
Segundo Nelson; Cox,
(2017), os carboidratos são
poli-hidroxialdeídos ou
poli-hidroxicetonas, ou
substâncias que geram
Quitina extraída de
esses compostos quando
carapaças de crustáceos.
Carboidratos hidrolisadas. Muitos
22
carboidratos têm a fórmula
empírica (CH2O)n; alguns
também contêm
nitrogênio, fósforo ou
enxofre.
Segundo Marzzoco; Torres A extração de ácidos
(2015), os lipídios graxos de cadeia longa
constituem uma classe de dos resíduos, a exemplo
Lipídeos compostos caracterizados dos insaturados da série
por sua alta solubilidade ômega-3.
em solventes orgânicos e
por serem praticamente
insolúveis em água.
Segundo Malajovich Trabalhos envolvendo o
(2012), a biotecnologia desenvolvimento de
pode ser entendida como produtos e/ou
uma atividade baseada em processos, como de
conhecimentos extração de quitina e
Biotecnologia
multidisciplinares, que produção de crustáceos
utiliza agentes biológicos para uso biomédico e
para fazer produtos úteis alimentício.
ou resolver problemas.
Segundo Gonçalves (2011),
entende-se por pescado
Uso de peixes,
todos os organismos
moluscos, crustáceos,
aquáticos (animal e
anfíbios, quelônios,
vegetal) de origem fluvial,
Pescado mamíferos, algas, etc.,
marinha ou estaurina,
na alimentação.
destinados à alimentação
humana.
Segundo Brasil (2007), é o Peixes, crustáceos,
pescado que não tenha moluscos, entre outros,
Matéria-prima
recebido nenhum tipo capturados visando fins
processamento. industriais.
Segundo Nelson; Cox, Extrato bruto produzido
23
Extrato bruto (2017), extrato bruto é o após maceração,
(EB) produto em solução obtido homogeneização e
após a lise tecidual centrifugação de
realizado por técnicas vísceras internas de
convencionais ou não. peixes.
Segundo Oliveira et al. O extrato bruto após
(2020), É o produto em passar por técnicas de
Extrato pré-
solução obtido após lise filtração, precipitação,
purificado
tecidual realizado por centrifugação ou mesmo
técnicas convencionais ou sistema de fases
não, passando por técnicas aquosas, de modo
de pré-purificação. individual ou
combinado.
Segundo Rotta (2003), Carpa-comum (Cyprinus
peixes agástricos são carpio).
Peixes
aquelas em que o estômago
Agástricos
está ausente.
Peixes que se alimentam
de invertebrados
Peixes Segundo Rotta (2003), são
aquáticos ou outros
carnívoros peixes em que alimentação
peixes menores, a
é baseada em itens de
exemplo do tucunaré
origem animal.
(Cichla sp.), dourado
(Salminus maxillosus) e
pintado
(Pseudoplatystoma
corruscans).
Segundo Rotta (2003), são Espécies como piava
peixes em que alimentação (Schizodon Borelli) e piau
Peixes
é baseada em itens de (Leporinus friderici), por
herbívoros
origem vegetal. exemplo.
Segundo Rotta (2003), são Alimentam-se de
peixes em que alimentação pequenos invertebrados,
é baseada em itens de plantas e frutos, a
Peixes onívoros origem animal e vegetal. exemplo do pacu
24
(Piaractus
mesopotamicus),
tambaqui (Colossoma
macropomum) e o híbrido
tambacu (C.
macropomum x P.
mesopotamicus).
Segundo Gonçalves (2011), Transformação da carne
são etapas tecnológicas de de peixes e crustáceos,
Beneficiamento/
transformação da matéria- em produtos mais
Processamento
prima em produto. elaborados, como filé,
fishburguer, nuggets,
entre outros.
Segundo Gonçalves (2011), Pele de tilápia e
são produtos secundários espinhaço de peixe
que ocorrem como resíduo usado para preparo de
Subprodutos
ou incidente na produção carne mecanicamente
principal. separada.
Segundo Rossetto; Signor, Carne de esturjões de
(2021), coprodutos são cativeiro como
Produtos secundários da coproduto ou produto
produção principal. Podem secundário em relação
ser produzidos em ao caviar produzido.
Coprodutos
conjunto ou em sequência
com o produto principal.
Sua produção é planejada.
Segundo Bezerra et al. Vísceras internas
(2005), os resíduos do (estômago, intestino,
pescado são as partes cecos pilóricos, fígado,
Resíduos economicamente não bexiga natatória, entre
aproveitáveis, mas que outros); Pele, Escamas,
podem ser empregados etc.
para fins biotecnológicos.
Segundo Chaves; Vink Descarte de vísceras sem
(2017), rejeitos são as partes condições sanitárias de
25
provenientes do uso; Ainda, após as
processamento dos etapas de centrifugações
Rejeitos
resíduos, onde não existe sucessivas dos resíduos
mais possibilidade de uso de intestino macerados
(reaproveitamento ou para obtenção de
reciclagem). proteínas, os pelletes
resultantes não
costumam mais ser
aproveitados, sendo
então descartados como
lixo biológico.
*Segundo publicações científicas. **Exemplos clássicos, sem necessariamente
relação com os trabalhos utilizados nas definições.
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29
30
CONTEXTUALIZAÇÃO
O
s recursos pesqueiros são essenciais para a
segurança alimentar, tendo em vista que
quase metade da população mundial obtém
20% de sua ingestão de proteína animal a partir da exploração
dos recursos pesqueiros (Samy-Kamal, 2021).
O aumento do consumo é acompanhado de perto pelo
aumento do volume de partes negligenciadas, fato que vem
tomando cada vez mais espaço nas discussões: as prováveis
consequências ambientais da ausência de tratamento para
resíduos da pesca (Henrique; Pires; Rodrigues, 2020; Rossetto;
Signor, 2021). A resposta a essa questão tem sido enfática: sua
reutilização através de procedimentos biotecnológicos, uma
vez que são ricas em moléculas de alto valor (Oliveira et al.,
2021), como discutidos no Capítulo 1.
A partir das etapas de processamento de peixes, são
descartados: cabeça, pele, escamas, barbatanas, resquícios de
músculos, cauda e órgãos internos, tais como ossos, estômago,
intestino, cecos pilóricos, fígado, mesentério, bexiga natatória,
etc. Os descartes são aplicáveis biotecnologicamente, o que os
torna uma valiosa matéria-prima para uso na indústria, seja
pela abundância, baixo custo na aquisição e/ou facilidade de
tratamento.
A viabilidade econômica dos processos que envolvem
o tratamento de biomoléculas depende muito da demanda por
uma determinada biomolécula-alvo, aplicação na indústria e
da produção contínua de matéria-prima (espécie de pescado
da qual é extraída e aplicada) (Bezerra; Freitas, 2015). Para que
haja o aproveitamento biotecnológico dos resíduos pesqueiros,
a matéria-prima deverá passar por uma série de tratamentos
31
com o intuito de liberar em solução as biomoléculas proteicas
teciduais. O produto final obtido desse tratamento é nomeado
de extrato bruto (EB), ou extrato bruto proteico – quando o
objetivo é a extração de proteínas (Nelson; Cox, 2017; Oliveira
et al., 2020).
As proteínas provenientes de fontes sólidas precisam
ser colocadas em solução para romper os tecidos e/ou células
(Novák; Havlíček, 2016). O rompimento pode ser realizado
através de quatro métodos: 1) Mecânicos; 2) Não mecânicos ou
físicos; 3) Químicos; e, 4) Enzimáticos. O meio resultante do
rompimento celular é designado de homogeneizado, sendo
constituídos pela molécula-alvo, contaminantes, fragmentos
de membranas celulares (Pessoa Jr; Pereira; Hasmann, 2020),
restos teciduais e detritos, materiais estes que muitas vezes
atuam como inibidores enzimáticos (Oliveira et al., 2020).
O rompimento celular será dependente do organismo
(tipo de organismo, estado fisiológico, tamanho e forma da
célula) e do produto final (sensibilidade ao calor, tempo de
rompimento e custo) (Pessoa Jr; Pereira; Hasmann, 2020). A
preparação do extrato bruto a partir dos resíduos do
processamento do pescado dependerá do tipo de pescado e da
molécula-alvo envolvidos na operação de rompimento celular.
O preparo utilizando vísceras de peixes (estômago, intestino,
cecos pilóricos, fígado, por exemplo) envolve etapas rápidas,
simplificadamente, como ilustrado na Figura 2.1: Maceração;
Homogeneização; e, Centrifugação.
A maceração é um procedimento físico muitas vezes
empregado para auxiliar no processo de rompimento celular,
principalmente quando envolve tecidos com maior resistência,
como estômago de peixes, por exemplo. Para a maceração são
32
utilizados um almofariz (gral) de porcelana ou polietileno, e
um pistilo, do mesmo material. Geralmente, utiliza-se uma
solução tampão (citrato de sódio, fosfato de sódio, Tris-HCl,
etc.), seguindo para um homogeneizador de tecidos.
Figura 2.1 Preparação de extrato bruto de vísceras de peixes
Fonte: Oliveira et al. (2020). Cedida gentilmente.
33
A homogeneização é um procedimento mecânico em
um equipamento designado de homogeneizador de tecidos,
que contribui para o rompimento celular. O tempo e as
condições de temperatura da homogeneização devem ser
levados em consideração, uma vez que o prolongamento do
processo pode levar ao aquecimento da amostra, ocasionando
a desnaturação proteica (Nelson; Cox, 2017).
A centrifugação é uma operação unitária utilizada para
separar líquidos e sólidos, tendo como resultado a formação
de um precipitado (pellet) e de um líquido sobrenadante e
clarificado (Kilikian, 2020). Este processo se dá com velocidade
de rotação constante e temperatura controlável (Nelson; Cox,
2017).
A tabela 2.1 descreve as principais técnicas de pré-
purificação (também chamada de semi-purificação) utilizadas
para obtenção de extratos obtidos do processamento do
pescado para um melhor aproveitamento biotecnológico.
Tabela 2.1 Aplicação de técnicas de pré-purificação nos extratos

brutos obtidos a partir dos resíduos do pescado
Técnica Finalidade/ Aplicações Referên
Princípio cia
Segundo Kilikian
(2020), a filtração Filtração de extrato bruto Oliveira
visa clarificar e de resquícios de músculos e et al.
Filtração reduzir os detritos. É intestino de pescada-branca (2017)
uma técnica Baseada (Cynoscion leiarchus)
no tamanho das
partículas.
Segundo Kilikian Centrifugações contínuas
Centrifugação (2020), a aplicadas em extrato de
centrifugação visa à intestino de beijupirá
separação de fases, (Rachycentron canadum), Oliveira
34
baseado no tamanho ariocó (Lutjanus synagris), et al.
e densidade das tainha (Mugil liza) e apairi (2019)
partículas. (Astronotus ocellatus) para
pré-purificação de
colagenase e protease
fibrinolítica.
Segundo Smith
(2017), as proteínas Precipitações usando
são precipitadas da diferentes concentrações de
solução à medida sulfato de amônio
Precipitação que a força iônica (variando de 0-100%) para Santos et
salina aumenta, usando um pré-purificação de al.
sal neutro, como o proteases alcalinas do (2020)
sulfato de amônio intestino de exemplares de
[(NH4)2SO4]. dourado (Coryphaena
hippurus).
Segundo Smith Precipitações usando etanol
(2017), os solventes e acetona em diferentes
orgânicos miscíveis concentrações (10-90%) Oliveira
em água diminuem a para pré-purificar amostras et al.
constante dielétrica de intestino de tucunaré (2020)
Fracionamento de uma solução (Cichla ocellaris) para
com solvente aquosa e diminuem a obtenção de enzimas
solubilidade da colagenolíticas.
maioria das
proteínas, de modo
que as proteínas
precipitam da
solução.
Após a obtenção do extrato bruto é possível empregar

técnicas simples para obter um melhor rendimento da matéria-
prima. Freitas-Junior et al. (2012) propuseram o aquecimento
(45ºC) do extrato bruto de pirarucu (Arapaima gigas) por um
período de 30 minutos como forma de selecionar proteases
alcalinas provenientes de vísceras intestinais.
35
Em geral, o extrato bruto é submetido a tratamentos
para separar as proteínas em diferentes frações com base em
uma propriedade (tamanho ou carga), em um processo
chamado de fracionamento. Etapas iniciais de fracionamento
em uma pré-purificação utilizam diferenças na solubilidade de
proteínas, que são uma função complexa do pH, temperatura,
concentração de sais e outros fatores (Nelson; Cox, 2017).
Outra forma de pré-purificar biomoléculas de resíduos
pesqueiros é utilizando técnicas de precipitação, empregando
solventes orgânicos (acetona, etanol, butanol) e/ou soluções
salinas, usando sais neutro como o sulfato de amônio
[(NH4)2SO4] (Oliveira et al., 2020), embora outros sais neutros,
como NaC1 ou KCl também podem ser usados (Smith, 2017).
A solubilidade das proteínas é reduzida em presença
de alguns sais, um efeito chamado de salting out (Nelson; Cox,
2017). As proteínas são precipitadas da solução à medida que
a força iônica é aumentada (Smith, 2017), formando partículas
insolúveis, podendo ser separadas através de um processo
sólido-líquido (Pessoa Jr; Pereira; Lucarini, 2020). Assim, a
adição de sais neutros em concentrações adequadas auxilia a
precipitar as proteínas de modo seletivo (Nelson; Cox, 2017),
enquanto outras permanecem em solução, sendo o (NH4)2SO4
um dos sais mais utilizados para precipitar proteínas extraídas
do pescado (Oliveira et al., 2020). Esse procedimento é bastante
utilizado pela rapidez e praticidade na sua realização (Zuñiga
et al., 2003), sendo realizado, geralmente, em duas etapas para
maximizar a eficiência de separação (Smith, 2017).
Após a realização de uma precipitação usando sais, faz-
se necessário realizar um procedimento para a remoção destes
presentes no material, sendo realizada uma etapa de diálise,
36
um procedimento que separa proteínas de solutos pequenos se
aproveitando do seu tamanho. O extrato pré-purificado é
colocado em uma bolsa ou tubo composto por uma membrana
semipermeável (Nelson; Cox, 2017).
A membrana semipermeável permite a passagem de
moléculas pequenas, mas não de moléculas maiores. Os
tamanhos dos poros das membranas são especificados como
limite de peso molecular (Smith, 2017). Assim, descreveremos
adiante os procedimentos metodológicos visando à preparação
e a pré-purificação da matéria-prima pesqueira, que servirá de
base para utilização nas atividades experimentais descritas ao
longo deste livro de protocolos, a saber:
Imagens: SMART – Servie Medical Art; Pixabay.
37
I. PREPRAÇÃO DE EXTRATO BRUTO
REAGENTES E SOLUÇÕES
o Tampão de extração.
Tris-HCl 0,5 M; pH: 7,5
MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Tris-HCl 0,5 M; pH: 8,0
Glicina-HCl 0,1 M; pH: 2,0
o Almofariz e pistilo;
o Béquer de vidro;
o Homogeneizador de tecidos;
o Centrífuga (preferencialmente, com refrigeração);
o Tubos falcon (15 ml e/ou 50 ml).
AMOSTRAS UTILIZADAS
o Resquícios de músculos e vísceras internas de peixes
(Estômago; Intestino; Cecos pilóricos; Fígado).
PROCEDIMENTO
Metodologia adaptada de Bezerra et al. (2005).
o Separar, identificar e pesar vísceras de peixes;
o Em seguida, macera-lás, separadamente, utilizando
almofariz e pistilo;
o Após a maceração, levá-las para o homogeneizador de
tecidos, solubilizando o material por completo no
tampão de extração determinação (volume e
molaridade);
o Após, centrifugar o material (10,000 RPM, 15 min, 4ºC);
o Em seguida, descartar o precipitado; o sobrenadante
será definido como Extrato Bruto (E.B.).
38
ESQUEMATIZAÇÃO DO PROCEDIMENTO
39
Fonte: Própria. Criada no software Diagram. Imagens:

SMART- Servie Medical Art; Freepik; Pixabay.
II. PRÉ-PURIFICAÇÃO POR SOLVENTES
ORGÂNICOS
o Tampão de extração;
o Acetona (gelada);
o Etanol (gelado).
MATERIAIS E EQUIPAMENTOS
o Vórtex;
o Tubos Falcon (15 ml);
o Centrífuga refrigerada.
PROCEDIMENTO
Metodologia adaptada de Oliveira et al. (2020).
1- Nesta etapa, o extrato bruto (E.B.) será precipitando

usando solventes orgânicos (acetona e etanol);
2- Separar tubos do tipo Falcon (15 ml) e identificá-los;
3- O volume final de cada tubo falcon deverá ser de 3 ml,
levando em consideração a inclusão da amostra e do
tipo de solvente;
4- Após a inclusão das amostras e das concentrações dos
solventes, levar as amostras para agitarem no vórtex
rapidamente para homogeneizar a amostra;
5- Em seguida, as amostras deverão ser refrigeradas por
10 min, a 4°C;
40
6- Após esse período, as amostras deverão ser
centrifugadas (10,000 x g durante 10 min, a 4 °C);
7- Logo após a centrifugação, descartar o sobrenadante e
coletar o precipitado;
8- Ressuspender o precipitado em 3 ml de solução
tampão (tampão de amostra);
9- Levar as amostras novamente ao vórtex por 1 min;
10- O material finalizado será designado de extrato bruto
pré-purificado e servirá para as dosagens bioquímicas.
Tabela 2.1 Proporções de solvente e de amostra para

realização da precipitação de proteínas
Concentração Volume do Volume do Volume
do solvente Solvente Extrato Bruto total (Vt)
(EB)
10% 0,3 ml 2,7 ml 3,0 ml
20% 0,6 ml 2,4 ml 3,0 ml
30% 0,9 ml 2,1 ml 3,0 ml
40% 1,2 ml 1,8 ml 3,0 ml
50% 1,5 ml 1,5 ml 3,0 ml
60% 1,8 ml 1,2 ml 3,0 ml
70% 2,1 ml 0,9 ml 3,0 ml
80% 2,4 ml 0,6 ml 3,0 ml
90% 2,7 ml 0,3 ml 3,0 ml
41
42
III. PRÉ-PURIFICAÇÃO POR SAIS
o Tampão de extração;
o Sulfato de amônio [(NH4)2SO4].
o Béquer de vidro;
o Centrífuga refrigerada;
o Agitador magnético;
o Barra de agitação magnética;
o Tubos para centrífuga;
o Micropipetas;
o Ponteiras para micropipetas;
o Membrana semipermeável para diálise.
PROCEDIMENTO
Será realizado de acordo com metodologia adaptada de
Burgess (2009) e Duong-Ly; Gabelli (2014).
o Descongelar o extrato bruto (E.B.);

o Centrifugar o E.B. descongelado (10,000 x g durante 10
min, a 4 °C) – diminuir impurezas e interferentes;
o Consultar quadro da concentração final de sulfato de
amônio: porcentagem de saturação (Tabela 2.1);
o Os valores do quadro 2.1 estão planejados para volume
de extrato celular de 100 ml, devendo-se realizar uma
regra de três simples em casos de volume de E.B.
diferentes.
43
Etapa 1 – Fracionamento 0-30% (duração: 2-3 horas)
1- Volume inicial de E.B.: 100 ml (exemplificando);
2- Volume de (NH4)2SO4: 16,4 g (pesar em balança de
precisão) (exemplificando);
3- Colocar o béquer com a barra de agitação magnética no
agitador magnético;
4- Adicionar ao béquer o volume de 100 ml de E.B.;
5- Logo em seguida, adicionar – suavemente – ao béquer
o volume sólido de 10,6 g de (NH4)2SO4 (valor
exemplificado) até dissolver por completo;
6- Após dissolução completa do sal, permanecer com
agitação e refrigeração (banho de gelo) constante por
pelo menos 2 horas;
7- Após o período de 2 horas, retirar o E.B. do béquer e
adicionar em tubo de centrífuga refrigerada;
8- Centrifugar os tubos a 20,000 x g, por 30 min, 4ºC;
9- Após a centrifugação, serão obtidos: sobrenadante e
precipitado;
10- O precipitado (pellet) será ressuspendido no volume de
4 ml de tampão, identificado e armazenado em freezer.
Este material será designado fração 0-30% e seguirá,
posteriormente, para diálise;
11- O sobrenadante deverá ter seu volume mensurado,
repetindo-se todo processo com este resultante.

1- A partir do volume de E.B. resultante da fração 0-30%,
calcular a quantidade de (NH4)2SO4 necessário (pesar
em balança de precisão);
44
2- Colocar o béquer com barra de agitação magnética no
3- Em seguida, adicionar – suavemente – ao béquer a
quantidade de (NH4)2SO4 estabelecida pela regra de
três simples (levando em consideração o volume de
E.B. resultante da fração anterior), até dissolver por
completo;
agitação e refrigeração (banho de gelo) constantes por
pelo menos 3 horas;
6- Centrifugar os tubos a 20,000 x g, por 30 min, a 4ºC;
7- Após a centrifugação, serão obtidos novamente:
sobrenadante e precipitado;
9- O sobrenadante deverá ter seu volume mensurado
novamente, repetindo-se todo processo com este
resultante.

1- A partir do volume de E.B. resultante da fração 30-60%,
calcular a quantidade de (NH4)2SO4 necessário (pesar
em balança de precisão);
2- Colocar o béquer com barra de agitação magnética no
45
3- Em seguida, adicionar – suavemente – ao béquer a
quantidade de (NH4)2SO4 estabelecida pela regra de
três simples (levando em consideração o volume de
E.B. resultante da fração anterior), até dissolver por
completo;
agitação e refrigeração (banho de gelo) constantes por
pelo menos 3 horas;
6- Centrifugar os tubos a 20.000 x g, por 30 min, a 4 ºC;
7- Após a centrifugação, serão obtidos novamente:
sobrenadante e precipitado;
9- O sobrenadante deverá ter seu volume mensurado
novamente, devendo ser armazenado em freezer.
Etapa 4 – Diálise (Frações 0-30%, 30-60% e 60-90%)

1- Para a diálise será necessário fazer uma solução
estoque (visando as trocas de soluções do béquer);
2- Em um béquer grande, preparar uma solução para a
diálise de 4 l, sendo: 40 ml de tampão + 3690 ml de
H2Od (água destilada), resultando em uma diluição de
100 vezes;
3- Hidratar na solução preparada a membrana de diálise
semipermeável para facilitar o manuseio da mesma;
4- Colocar o material fracionado e vedar as extremidades;
46
5- As extremidades deverão estar bem vedadas para
evitar que a amostra seja desperdiçada por vazamento;
6- Mergulhar a membrana semipermeável na solução
preparada e deixar em ambiente refrigerado (4 ºC) por
pelo menos 4 horas, com agitação lenta e constante;
7- Após 4 horas, remover a solução preparada e substituir
por outra solução nova nas mesmas condições (4 l,
sendo: 40 ml de tampão + 3690 ml de H2Od);
8- Aguardar o mesmo período, sob as mesmas condições:
4 horas, refrigeração 4 ºC, agitação lenta e constante;
9- Após as 4 horas, realizar a última troca da solução,
porém usando agora 4 l da solução tampão da amostra,
(sem a H2Od);
10- Após nova rodada de 4 horas, retirar as amostras e
realizar as dosagens analíticas de proteínas e protease,
como descritas neste protocolo nos capítulos
posteriores.
Tabela 2.2 Concentração final de sulfato de amônio:

porcentagem de saturação a 0 ºC
Concentração
inicial de
(NH4)2SO4 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100
(porcentagem de
saturação a 0ºC)
Sulfato de amônio sólido (gramas) a ser adicionado a 100 ml de solução.

0 10,6 13,4 16,4 19,4 22,6 25,8 29,1 32,6 36,1 39,8 43,6 47,6 51,6 55,9 60,3 65,0 69,7
5 7,9 10,8 13,7 16,6 19,7 22,9 26,2 29,6 33,1 36,8 40,5 44,4 48,4 52,6 57,0 61,5 66,2
10 5,3 8,1 10,9 13,9 16,9 20,0 23,3 26,6 30,1 33,7 37,4 41,2 45,2 49,3 53,6 58,1 62,7
15 2,6 5,4 8,2 11,1 14,1 17,2 20,4 23,7 27,1 30,6 34,3 38,1 42,0 46,0 50,3 54,7 59,2
20 0 2,7 5,5 8,3 11,3 14,3 17,5 20,7 24,1 27,6 31,2 34,9 38,7 42,7 46,9 51,2 55,7
25 0 2,7 5,6 8,4 11,5 14,6 17,6 21,1 24,5 28,0 31,7 35,5 39,5 43,6 47,8 52,2
30 0 2,8 5,6 8,6 11,7 14,8 18,1 21,4 24,9 28,5 32,3 36,2 40,2 44,5 48,8
35 0 2,8 5,7 8,7 11,8 15,1 18,4 21,8 25,4 29,1 32,9 36,9 41,0 45,3
40 0 2,9 5,8 8,9 12,0 15,3 18,7 22,2 25,8 29,6 33,5 37,6 41,8
45 0 2,9 5,9 9,0 12,3 15,6 19,0 22,6 26,3 30,2 34,2 38,3
50 0 3,0 6,0 9,2 12,5 15,9 19,4 23,0 26,3 30,8 34,8
55 0 3,0 6,1 9,3 12,7 16,1 19,7 23,5 27,3 31,3
60 0 3,1 6,2 9,5 12,9 16,4 20,1 23,9 27,6
65 0 3,1 6,3 9,7 13,2 16,8 20,5 24,4
70 0 3,2 6,5 9,9 13,4 17,1 20,9
75 0 3,2 6,6 10,1 13,7 17,4
80 0 3,3 6,7 10,3 13,9
85 0 3,4 6,8 10,5
90 0 3,4 7,0
95 0 3,5
100 0
Fonte: Adaptada e traduzida de Duong-Ly; Gabelli (2014).

47
48
Objetivos:
Preparar extrato bruto enzimático (EB);
Precipitar biomoléuculas do EB usando solventes
orgânicos e sais neutros.
1. Aproveitar os resíduos de peixes: estômago (quando

presente), intestino, cecos pilóricos (quando presente),
fígado e resquícios de músculo para preparação de
extrato bruto (EB);
2. Preparar o extrato bruto (EB) a partir das vísceras

identificadas de acordo com a esquematização do
procedimento estabelecido neste capítulo e utilizando a
solução tampão adequada para cada tecido (pH e
molaridade);
3. Pré-purificar os extratos selecionados através da

precipitação usando solventes orgânicos (acetona e
etanol), identificando na tabela 2.1 as condições
experimentais;
4. Pré-purificar os extratos brutos (EB) produzidos nas

atividades experimentais utilizando sais neutros em
diferentes concentrações (identificar na tabela 2.2 as
condições experimentais).
49
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52
53
CONTEXTUALIZAÇÃO
A
s proteínas são macromoléculas biológicas que
desempenham funções vitais no organismo
(Liu et al., 2020), tais como: estrutural,
transporte de oxigênio (hemoglobina), mecanismo de defesa
do organismo contra patógenos (imunoglobulinas), contração
do músculo (actina e miosina), neurotransmissores, fontes de
energia quando da carência metabólica, além de catalisarem
reações químicas, funções desempenhadas pelas enzimas
(Nelson; Cox, 2017), entre outros.
As biomoléculas proteicas são fundamentais para as
espécies de peixes alcancem os perfis zootécnicos desejados
(tamanho e peso). As principais indústrias de processamento
do pescado trabalham no direcionamento das proteínas de
peixes visando, quase sempre, fins alimentícios (através da
comercialização do filé). Em média, para cada 1 kg de peixe,
aproximadamente, 30-40% representa o filé, enquanto que os
outros 60-70% acabam sendo descartados (Oliveira et al., 2020).
Os subprodutos descartados de peixes incluem fígado,
cabeça, pele, vísceras e ossos, que são a fonte mais rica em
proteínas. Resíduos de pele, escamas, nadadeiras, ossos e as
vísceras internas são comumente utilizados para produzir
hidrolisados proteicos (Khan et al., 2020). Também é possível
extrair proteínas a partir de resquícios de músculos, muitos
dos quais são sobras da filetagem (Oliveira et al., 2017). As
proteínas presentes em resquícios de músculos esqueléticos
são pelo menos 3, classificadas de acordo com sua localização
no músculo e na solubilidade: sarcoplasmáticas, estromais e
54
miofibrilares (respondem por cerca de 50% das proteínas totais
do músuclo esquelético) (Malva et al., 2018).
A extração de proteínas do pescado, como ilustrado no
Capítulo 2, é uma prática simples, rápida, de baixo custo e que
não requer grandes aparatos tecnológicos. Sua extração é
baseada na sua solubilização em meio ácido (proteínas ácidas,
como a pepsina) e/ou alcalino (proteínas alcalinas como
tripsina e quimotripsina extraídas do intestino) de acordo com
sua natureza química (Oliveira et al., 2017a,b,c). De acordo
com o tipo de material biológico (Quadro 1), vários métodos
espectrofotométricos foram empregados para dosar
quantitativamente proteínas (Scopes, 1994), tais como: biureto
(Itzhaki; Gill, 1964), Lowry (Lowry et al., 1951), Bradford
(Bradford, 1976), Ácido bicinconínico-BCA ou de Smith (Smith
et al., 1985) e absorção de ultravioleta-UV (Zaia; Zaia; Lichtig,
1998; Santos, 2012).
Quadro 3.1 Métodos espectrofotométricos para a

determinação de proteínas totais em diferentes tipos de
amostras
Tipos de Amostra Métodos
Células bacterianas Biureto
Alimentos Biureto, Lowry, Bradford
Plasma sanguíneo Biureto, Lowry, Bradford
Soluções com detergentes Ácido Bicinconínico–BCA
Proteína pura Absorção-UV
Proteínas dissolvidas Bradford
Plantas Lowry
Fonte: Zaia; Zaia; Lichtig (1998); Miwa; Falco; Calijuri (2008).
55
Ainda, vale ressaltar que não existe uma metodologia
utilizada de modo universal para determinar a quantidade de
proteínas totais de uma amostra, ficando a escolha a critério
do pesquisador, a partir do tipo de amostra, reprodutibilidade,
reagentes, custo, além da presença de substâncias interferentes
que podem influenciar no resultado final (Zaia; Zaia; Lichtig,
1998; Miwa; Falco; Calijuri, 2008), como ilustrado na figura 3.1.
Figura 3.1 Princípios, vantagens e desvantagens de métodos

espectrofotométricos para quantificação de proteínas totais
Fonte: Zaia; Zaia; Lichtig (1998); Miwa; Falco; Calijuri (2008).

Imagem: Desing by Freepik. Modificada no software Adobe llustrator.
56
Além das técnicas descritas, outra forma de quantificar
o teor de proteínas totais é através da absorção no ultravioleta-
UV. Nesta técnica, as proteínas são submetidas à leitura no
espectro, observando-se absorbância de 280 nm, devido à
presença dos aminoácidos fenilalanina, cisteína, cistina,
metionina, triptofano, histidina e tirosina. Contudo, quando
em pH neutro, apenas triptofano, tirosina e cistina apresentam
absortividade molar alta. As proteínas também apresentam
absorbância abaixo de 220 nm devido à ligação peptídica
(Zaia; Zaia; Lichtig, 1998).
Vários métodos espectrofotométricos foram utilizados
para quantificar o total de proteínas em amostras provenientes
de pescado (pele, escamas, carcaça, músculo, vísceras internas,
tais como fígado, estômago, intestinos, cecos pilóricos, entre
outros). A dosagem de proteínas é o passo inicial na indústria
biotecnológica aquícola, sendo a escolha do método realizada
de modo criterioso, levando em consideração, principalmente,
custo, rapidez, interferentes e confiabilidade. A Tabela 3.1
descreve as principais matérias-primas obtidas da exploração
dos recursos pesqueiros nas últimas décadas e os principais
métodos espectrofotométricos utilizados para detecção de
amostras de peixes teleósteos e de invertebrados aquáticos
contendo proteínas.
Sedmak; Grossberg (1977) descreveram um ensaio
rápido, sensível e versátil para determinação de proteínas
totais utilizando o corante azul brilhante de Coomassie G250
em ácido diluído. Os autores reportaram que à medida que a
solução corante foi misturada com uma amostra de proteína, a
absorbância da mistura foi prontamente quantificada; ensaio
que foi reproduzido por Souza et al. (2018), Lopes et al. (2019) e
57
Oliveira et al. (2017c) para quantificar proteínas de brânquias,
cérebro e estômago de amostras de pescado, respectivamente.
Tabela 3.1 Principais métodos utilizados para avaliar o teor de

proteínas totais em amostras variadas de pescado
Espécie Nome vulgar Matéria-prima Método Referência
pesqueira
Cichla ocellaris Tucunaré Intestino Smith Oliveira et
al. (2020)
Macrobrachium Pitu ou Glândulas do Bradford Silva et al.
carcinus camarão- intestino médio (2020a)
d'água-doce
Centropomus Robalo-flecha Cérebro Sedmak; Lopes et al.
undecimalis Grossberg (2019)
Lutjanus Ariocó Intestino Smith Oliveira et
synagris al. (2019a)
Cichla ocellaris Tucunaré Colágeno de Smith Oliveira et
pele al. (2019b)
Pseudoplatystoma Surubim Trato digestivo Bradford Campeche
fasciatum × Leiarius
marmoratus
híbrido et al. (2018)
Crassostrea Ostra de Brânquias Sedmak; Souza et al.
rhizophorae mangue Grossberg (2018)
Crassostrea Ostra de Brânquias Sedmak; Souza et al.
rhizophorae mangue Grossberg (2018)
Seriola dumerili Arabaiana Intestino Reagente Oliveira et
de Smith al. (2017a)
Cynoscion Pescada Intestino Smith Oliveira et
leiarchus branca al. (2017b)
Oreochromis Tilápia-do- Cérebro Sedmak; Oliveira et
niloticus Nilo Grossberg al. (2017c)
Oreochromis Tilápia-do- Músculo Sedmak; Oliveira et
Oreochromis Tilápia-do- Estômago Sedmak; Oliveira et
Oreochromis Tilápia-do- Intestino Sedmak; Oliveira et
Litopenaeus Camarão- Glândulas do Bradford Peixoto et
58
vannamei branco-do- intestino médio al. (2017)
pacífico
Macrobrachium Camarão-da- Hepatopâncreas Bradford Santos et al.
amazonicum Amazônia (2014)
Oreochromis Tilápia-do- Hidrolisado Lowry Silva et al.
niloticus Nilo (2014)
Micropogonias Corvina Hidrolisado filé Lowry Martins et
furnieri e resíduos al. (2009)
Litopenaeus Camarão- Glândulas do Bradford Castro et al.
vannamei branco-do- intestino médio (2012)
pacífico
Farfantepenaeus Glândulas do Bradford Castro et al.
subtilis intestino médio (2012)
Litopenaeus Camarão- Glândulas do Bradford Castro et al.
schmitti branco intestino médio (2012)
Farfantepenaeus Camarão Hepatopâncreas Bradford Buarque et
subtilis marrom al. (2010)
Tisbe Copepódo Exemplar Warburg; França et al.
Biminiensis inteiro Christian (2010)
Farfantepenaeus Camarão rosa Glândulas do Bradford Buarque et
paulensis intestino médio al. (2009)
Colossoma Tambaqui Cecos pilóricos Warburg; Bezerra et
macropomum Christian al. (2001)
O ácido bicinconínico (BCA) é um composto estável e

solúvel em água, capaz de formar um complexo na coloração
púrpura intenso com o íon cuproso (Cu1+) em um ambiente
alcalino. Este reagente forma a base de um método analítico
capaz de monitorar o Cu1+ produzido na reação da proteína
com o Cu2+ alcalino. A cor produzida a partir desta reação é
estável e aumenta de forma proporcional em uma ampla faixa
de concentrações de proteína (Smith et al., 1985). Aqui, para
fins de protocolo, optamos por descrever adiante os reagentes,
os materiais e os procedimentos do método de Bradford
(Bradford, 1976).
59
MÉTODO DE BRADFORD
As dosagens de proteína serão realizadas através do
método Bradford (1976) modificado, utilizando o Coomassie
Brilliant Blue (corante). A curva de calibração é feita a partir
de soluções estoques de soroalbumina bovina (BSA) numa
gama de concentração de 0-100 e de 0-1000 mg/l.
1-Elaborar a curva padrão;
2- Dosar proteínas totais em amostras de pescado.
o Coomassie Brilliant Blue G 250;
o Etanol 95%;
o Ácido ortofosforico 85%.
o Frasco âmbar;
o Ponteiras;
o Pipeta automática;
o Espectrofotômetro.
60
Parte I – Preparação da curva de calibração
PROCEDIMENTO
Preparação do Reagente de Bradford

1- Em um béquer, pesar em balança de precisão 100 mg
de corante Coomassie Brilliant Blue G 250;
2- Em seguida a pesagem, adicionar 50 ml de álcool
etílico 95%;
3- Após, cobrir o béquer com papel alumínio e deixar no
agitador por 1 hora;
4- Logo em seguida, adicionar 100 ml de ácido
ortofosforico 85% (manusear na capela) e
complementar com água destilada até o menisco do
balão volumétrico;
5- Em seguida, o reagente deverá ser filtrado a vácuo 3
vezes e, posteriormente, armazenado em frasco âmbar
(protegido da luminosidade com papel alumínio);
6- Coloração do reagente pronto: acastanhada clara.
Preparação da curva padrão de soroalbumina bovina (BSA)

1- Preparar soluções padrão de albumina bovina nas
concentrações de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 e
de 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000
µg/ml (diluir em água destilada) a partir de solução
estoque de 1000 µg/ml (Tabela 3.2).
2- Adicionar 50 µl de cada concentração de BSA;
3- Adicionar 1,5 ml do Reagente de Bradford;
61
4- Para o tubo Branco, adicionar 50 µl de água destilada e
1,5 ml do Reagente de Bradford;
5- Agitar os tubos e ler em espectrofotômetro, a 595nm,
zerando o aparelho com tubo branco;
6- Toda a operação deverá ser realizada em triplicata;
7- Elaborar a curva de calibração no Excel ou programa
similar.
Tabela 3.2 Curva de calibração 0-1000 (µg/ml)

BSA (µg/ml) Volume da solução Volume de
estoque (µg/ml) H2Od (µl)
0 0 1000
50 50 950
100 100 900
200 200 800
300 300 700
400 400 600
500 500 500
600 600 400
700 700 300
800 800 200
900 900 100
100 1000 0
Observação:
Equação da reta da curva de albumina:

y = a + bx + c, onde y é a média das absorvâncias após
ter sido subtraído da média do branco. X é a quantidade de
proteína em µg/ml.
62
63
Parte II – dosagem de proteínas do pescado
o Reagente de Bradford;
o Água destilada (H2Od);
o Becker;
o Microplaca de microtitulação de 96 poços;
o Ponteiras e pipetas automáticas;
AMOSTRAS ANALISADAS
o Extratos brutos e pré-purificados.
PROCEDIMENTO
Dosagem de proteínas do pescado pelo método de
Bradford (1976), modificado por Sedmak; Grossberg (1977).
Ensaio do branco
1- Em microplaca de 96 poços, adicionar 50 µl de água
destilada (H2Od);
2- Adicionar em seguida 50 µl tampão de extração;
3- Adicionar, por fim, 150 µl do reagente de Bradford;
4- Após 15 minutos de reação, protegido da
luminosidade, levar ao leitor de microplaca com
comprimento de onda de 595 nm de absorbância;
5- O ensaio deverá ser realizado em triplicata.
O branco fornecerá indícios de interferência ocasionada pelo reagente
testado. Para tanto, pode ser feito: 64
1) Branco da amostra (elaborado sem o reagente);
2) Branco do reagente (sem a amostra).
Ensaio da amostra
1- Em microplaca de 96 poços, adicionar 50 µl de tampão
de extração;
2- Adicionar em seguida 50 µl da amostra de pescado;
3- Sem seguida, adicionar 150 µl do reagente de Bradford;
4- Após 15 minutos de reação, protegido da
luminosidade, levar ao leitor de microplaca com
comprimento de onda de 595 nm de absorbância;
5- O ensaio deverá ser realizado em triplicata.

65
Objetivos:
Preparar reagente de Bradford para uso nas dosagens de
proteínas;
Elaborar curva de calibração do reagente produzido;
Determinar o teor de proteínas totais em amostras de pescado.
1. Preparar reagente de Bradford seguindo metodologia

descrita neste protocolo (identificar as condições no item
Procedimento: solução e curva de calibração);
2. Elaborar uma curva de calibração da solução de Bradford

no Excel ou programa similar (identificar as condições no
item Procedimento: solução e curva de calibração);
3. Quantificar o teor de proteínas totais de amostras de

pescado: extrato bruto e pré-purificados (identificar as
condições no item Dosagem da amostra);
4. Comparar os resultados obtidos nas atividades práticas

com os descritos na tabela 3.3 (Proteínas totais de
organismos aquáticos).
66
Todos os procedimentos deverão ser guiados pelo roteiro descrito ao longo deste
capítulo. Todas as amostras deverão ser identificadas.
Tabela 3.3 Proteínas totais de organismos aquáticos
Nome científico Nome Tecido Perfil da mg/ml Referência
popular amostra
Katsuwonus Bonito- Intestino Extrato bruto 6,64 Matos et al.
pelamis listrado (2021)
Diapterus Carapeba Intestino Extrato bruto 2,50 Matos et al.
rhombeus prateada (2021)
Colossoma Tambaqui Fígado Extrato bruto 3,07 Ferreira et al.
macropomum (2020)
Colossoma Tambaqui Fígado Precipitação 1,8 Ferreira et al.
macropomum com acetona (2020)
25%
Colossoma Tambaqui Fígado Precipitação 2,13 Ferreira et al.
macropomum com etanol (2020)
25%
Colossoma Tambaqui Mix de Extrato bruto 1,52 Ferreira et al.
macropomum vísceras (2020)
Colossoma Tambaqui Mix de Precipitação 1,6 Ferreira et al.
macropomum vísceras com acetona (2020)
25%
Colossoma Tambaqui Mix de Precipitação 9,95 Ferreira et al.
macropomum vísceras com etanol (2020)
25%
Cichla ocellaris Tucunaré Intestino Extrato bruto 1,06 Oliveira et al.
(2020)
Cichla ocellaris Tucunaré Intestino Precipitação 1,19 Oliveira et al.
com acetona (2020)
30%
com acetona (2020)
60%
com acetona (2020)
90%
com etanol (2020)
30%
com etanol (2020)
60%
67
com etanol (2020)
90%
com (2020)
(NH₄)₂SO₄ -
0-30%
com (2020)
(NH₄)₂SO₄ -
30-60%
com (2020)
(NH₄)₂SO₄ -
60-90%
Coryphaena Dourado Intestino Extrato bruto 0,332 Santos et al.
hippurus (2020)
Coryphaena Dourado Intestino Precipitação 0,372 Santos et al.
hippurus com (2020)
(NH₄)₂SO₄ -
40-60%
Coryphaena Dourado Intestino Cromatografia 0,069 Santos et al.
hippurus de exclusão (2020)
molecular
Lycengraulis batesii Arenque Intestino Extrato bruto 4,5 Silva et al.
(2020b)
Caranx crysos Guarajuba Intestino Extrato bruto 5,9 Silva et al.
(2020b)
Acanthopagrus Dourada Trato Extrato bruto 0,94 Namjo et al.
latus digestivo (2019)
Acanthopagrus Dourada Trato Precipitação 3,4 Namjo et al.
latus digestivo com (2019)
(NH₄)₂SO₄
Astronotus Apaiari/ Intestino Extrato bruto 0,38 Oliveira et al.
ocellatus Oscar (2019c)
Anisotremus Salema Intestino Extrato bruto 11,35 Oliveira et al.
virginicus (2019c)
Colossoma Tambaqui Intestino Extrato bruto 5,14 Oliveira et al.
macropomum (2019c)
Oreochromis Tilápia- Intestino Extrato bruto 1,22 Oliveira et al.
niloticus do-Nilo (2019c)
68
Mugil liza Tainha Intestino Extrato bruto 5,11 Oliveira et al.
(2019c)
Eucinostomus Carapicu Intestino Extrato bruto 5,91 Oliveira et al.
gula (2019c)
Parachromis Jaguar Intestino Extrato bruto 2,09 Oliveira et al.
managuensis (2019c)
Centropomus Robalo- Intestino Extrato bruto 2,04 Oliveira et al.
undecimalis flecha (2019c)
Bagre Chihuil Estômago Extrato bruto 14,54 Osuna-Ruiz et
panamensis al. (2019)
Bagre Chihuil Estômago Precipitação 2,69 Osuna-Ruiz et
panamensis com (NH₄)₂SO₄ al. (2019)
- 20-70%
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75
76
CONTEXTUALIZAÇÃO
O
s avanços biotecnológicos na indústria de
aquicultura têm demonstrado progressos pela
capacidade das enzimas em produzirem
alimentos industrializados a partir de subprodutos do
processamento, agregando valor à cadeia produtiva e
destinando o material de forma ecologicamente sustentável.
Neste contexto, destacam-se as proteases, que representam as
enzimas mais empregadas nos diversos setores industriais,
especialmente, no alimentício. A aplicação de enzimas
proteolíticas para a extração de biomoléculas do pescado é
uma estratégia interessante, pois alia a aplicação de processos
enzimáticos, que são mais brandos e específicos, para geração
de produtos com alto valor. Já foram sugeridos como fonte de
enzimas proteolíticas os resíduos na forma de órgãos
digestivos provenientes do processamento do pescado (como
estômago, intestino e cecos pilóricos, por exemplo) visando
uma matéria-prima alternativa para ampliar sua utilização
econômica (Simpson et al., 1998).
As proteínas presentes nos resíduos do processamento
de crustáceos podem ser hidrolisadas através de proteases
comerciais e recuperadas como hidrolisado proteico. Durante
este processo as proteínas musculares, tecidos e complexos
proteicos como as carotenoproteinas, por exemplo, são
clivados e solubilizados, restando apenas a proteína solúvel e
carotenoides, estes últimos são agregados a outros lipídeos no
meio da reação (Chen; Meyers, 1982; Gildberg; Stenberg, 2001).
As vantagens conferidas pela utilização de enzimas
proteolíticas são ideais para produção de peptonas,
77
hidrolisados proteicos, molho de peixe, remoção de tecidos em
peixes e escamas, assim como o isolamento de biomoléculas
como pigmentos, proteínas bioativas, produtos naturais, etc.
(Simpson et al., 1998).
A utilização de subprodutos do processamento do
pescado como fonte para a recuperação de biomoléculas como
carotenoides (Santos, 2006), colágenos (Hwanget al., 2007) e
enzimas (Bezerra et al., 2005; Assis et al., 2014; Espósito et al.,
2009) tem sido reportada, com várias aplicações, por exemplo,
no segmento terapêutico, como na indústria farmacêutica e na
biomédica. Diversos trabalhos já reportaram o uso de cabeças
de camarão para a obtenção de hidrolisados proteicos
(Gildberg; Stenberg, 2001), carotenoides (Sachindra et al., 2006;
Santos, 2006), quitina e quitosana (Cahú et al., 2012) e
glicosaminoglicanos heparina-símile (Brito et al., 2014).
No processamento do peixe, os resíduos incluem
cabeça, pele, tecidos musculares, ossos, escamas e vísceras que
constituem uma importante fonte proteica e representam
acima de 60% da matéria-prima descartada (Chalamaiah et al.,
2012). Contudo, estes descartes podem causar prejuízos ao
meio ambiente. Martone et al. (2005) reportaram a relevância
de utilizar a hidrólise dos resíduos para a produção de
hidrolisados de proteína como alternativa ao descarte desses
resíduos, devido ao rigor e as exigências das legislações
ambientais, sendo o hidrolisado proteico de peixe rico em
peptídeos funcionais.
A hidrólise de proteínas ocorre através do processo de
catálise por enzimas proteolíticas, que consiste na
solubilização das proteínas do pescado e quebra de longas
cadeias de proteínas com a produção de frações solúveis e
78
insolúveis. A fração solúvel compreende proteínas, peptídeos
de cadeia curta e aminoácidos de alto valor nutricional que
podem ser adicionados como ingredientes em formulações
destinadas ao consumo humano, com propriedades funcionais
interessantes para indústria de alimentos. O hidrolisado
proteico pode ser composto por até 90% de concentrado de
proteína (Furlan; Oetterer, 2002).
O hidrolisado proteico de peixe (HPP) é um produto
obtido a partir da hidrólise dos resíduos do processamento do
peixe com a utilização de enzimas proteolíticas, o qual devido
à produção de um produto com boa composição nutricional,
perfil de aminoácidos, peptídeos bioativos e atividades
antioxidantes. Têm sua aplicação comercial no mercado de
nutrição esportiva, alimentos funcionais, alimentos saudáveis
e nutracêuticos (Kim; Wijesekara, 2010; Chalamaiah et al.,
2012). Silva et al. (2014) reportaram a produção de hidrolisado
proteico de peixe, através da utilização de enzimas comerciais
de origem bacteriana e das próprias enzimas inerentes ao trato
digestivo do animal.
Os hidrolisados proteicos despertam muito interesse
para os processos biotecnológicos alimentares devido à alta
disponibilidade de matéria-prima e à presença de elevado teor
de proteínas, aminoácidos e peptídeos, além de recuperar
nutrientes essenciais e compostos bioativos importantes na
proteção contra várias doenças e na manutenção de uma boa
saúde (Chalamaiah et al., 2012). Peptídeos bioativos são
produzidos a partir da hidrólise enzimática, que podem ser
isolados dos resíduos do processamento do pescado e
possuem atividades biológicas importantes para o organismo
na promoção da saúde humana (Kim; Wijesekara, 2010).
79
Alguns estudos têm demonstrado que hidrolisados proteicos
de peixe, obtidos através do processo de hidrólise enzimática,
podem ser utilizados como suplementos com propriedades
antioxidantes (Dekkers et al., 2011), e utilizados na prevenção e
tratamento de alguns tipos de câncer (Picot et al., 2006).
As propriedades físico-químicas como formação de
espuma, emulsificação, capacidade de ligação a óleo e
solubilidade estão presentes em hidrolisados proteicos de
peixe, e são importantes para formulações alimentares,
suplementos nutricionais e produtos farmacêuticos (He et al.,
2013). A transformação dos resíduos do processamento em
hidrolisados de peixe é de interesse dos cientistas com esforços
voltados para a produção de produtos de valor comercial,
sendo considerada na atualidade como mais rica fonte de
proteínas (Chalamaiah et al., 2012).
Morales-Medina et al. (2016) avaliaram a eficácia
funcional de hidrolisados proteicos de peixe na estabilidade
das emulsões preparadas para microencapsulação de óleo de
peixe. O estudo utilizou hidrolisado proteico de peixe
preparado através de hidrólise enzimática com alcalase e
tripsina em adição com o óleo de peixe para preparação das
emulsões, visando conferir maior estabilidade e melhorar as
propriedades funcionais do processo.
Gildberg; Stenberg (2001) demonstraram um método
para utilização avançada de subprodutos de camarão
submetidos à hidrólise proteolítica com alcalase e obtiveram
um hidrolisado proteico com alto valor nutritivo. Ainda, os
autores mostram como astaxantina pode ser recuperada a
partir do sedimento centrifugado do hidrolisado bruto e o
tratamento com alcalase não influencia negativamente a
80
recuperação ou a qualidade da quitosana produzida das
carapaças.
Usualmente, os subprodutos do processamento do
camarão podem ser submetidos à hidrólise enzimática com a
aplicação de proteases como alcalase, papaína, pepsina,
quimotripsina e/ou tripsina (Silva et al., 2017). Essas enzimas
promovem a solubilização das proteínas, permitindo também
a recuperação de complexos de carotenoproteína e
deproteinização da carapaça de quitina. A utilização de
enzimas proteolíticas, entretanto, limita a produção destes
bioprodutos de cabeça de camarão, pois encarecem o processo.
Uma forma de contornar esta dificuldade está na utilização de
enzimas endógenas presentes na cabeça do camarão
(fosforilases e lipases) e no hepatopâncreas (proteases, lipases,
amilases) (Cao et al., 2009), principal órgão de digestão em
peneídeos.
Enzimas digestivas oriundas do hepatopâncreas já
foram amplamente investigadas, sendo capazes de hidrolisar
os componentes e tecidos remanescentes do pescado por
autólise, o que diminui o custo de preparação de hidrolisados
pela inserção de enzimas comerciais, que aumenta o custo do
processo. O hepatopâncreas dos camarões marinhos peneídeo
Farfantepenaeus subtilis e F. paulensis contém proteases, tais
como tripsina e quimotripsina, responsáveis pela digestão de
proteínas nesses animais (Buarque et al., 2010; Buarque et al.,
2009).
Silva et al. (2017) relataram que o hidrolisado proteico
liofilizado obtido a partir de cabeças da espécie de camarão
marinho, Litopenaeus vannamei ,é uma relevante fonte de
aminoácidos (essenciais e não-essenciais), com conteúdo
81
superior ao recomendado pela Organização das Nações
Unidas para a Alimentação e Agricultura (FAO) e Organização
Mundial de Saúde (OMS), e ainda sem contaminantes, metais
pesados e/ou coliformes fecais e coliformes totais. O trabalho
dos autores serviu para comprovar que o hidrolisado de
cabeças de camarão constitui uma excelente fonte alimentar.
o Azocaseína 1% (substrato);
o Ácido tricloroacético (TCA) a 10%;
o Hidróxido de Sódio (NaOH) a 1M;
o Tampão Tris-HCl 0,1M; pH 8,0;
o Solução de Cloreto de Sódio (NaCl) a 150 mM;
o Kit comercial para dosagem de proteína solúvel (BCA,
Bradford, Lowry).
o Ponteiras descartáveis e pipetas de microtitulação;
o Microtubos (1,5 ml ou 2 ml);
o Homogeneizador;
o Béquer de vidro;
o pHmetro;
o Espectrofotômetro;
o Centrífuga refrigerada.
AMOSTRAS ANALISADAS
o Cabeças de camarão;
o Intestino ou cecos pilóricos de peixes.
82
PROCEDIMENTO
Preparação de extrato bruto

1- Em um homogeneizador de tecidos, solubilizar o
material (vísceras intestinais e/oucecos pilóricos de
peixes, cabeças de camarão) com solução salina (NaCl
150 mM);
2- Centrifugar o material (10.000 RPM, 10 min, 4ºC) e caso
necessário, filtrar.
3- Dosar a concentração de proteínas;
Dosagem da atividade de proteases alcalinas

1- Em microtubos, adicionar 50 µl de solução de
azocaseína 1% e 30 µl do extrato de proteases. Para o
branco, adicionar 30 µl de salina no lugar o extrato;
2- Incubar a temperatura ambiente por 60 min;
3- Adicionar 240 µl de solução de TCA 10% e aguardar 15
min;
4- Centrifugar e coletar o sobrenadante;
5- Em uma microplaca, adicionar 70 µl do sobrenadante
coletado e 130 µl de NaOH 1M;
6- Realizar a leitura no espectrofotômetro a 450 nm;
7- Calcular a atividade enzimática de acordo com a
fórmula:
𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴
𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴(𝑈𝑈𝑈𝑈) = ([𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝𝑝í𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛]𝑥𝑥𝑥𝑥 )x1000
60
Onde Abs é o valor de absorbância da atividade com
azocaseína a 450 nm, [proteína] é a concentração de
proteínas em mg/ml, 60 é o tempo de reação e 1000 é o
fator de correção para o espectrofotômetro.
83
Uma unidade de atividade enzimática (U) é a
quantidade de enzima necessária para causar uma mudança
de 0,001 de absorbância por minuto.
Produção de hidrolisado proteico

1- Triturar o material de pescado com água (proporção de
1 kg de material para 1 l de água);
2- Adicionar a enzima (5 U para 100 ml de volume de
reação)
3- Incubar no banho-maria por 90 min, a 40 ºC, com
agitação;
4- Interromper a reação aquecendo a temperatura de
fervura por 10 min;
5- Filtrar com ajuda de uma peneira;
6- Secar o material líquido e o sólido na estufa e após
pesar para calcular o rendimento.
DICAS IMPORTANTES
o Descongelar antecipadamente as amostras;
o Os extratos enzimáticos devem ser mantidos em banho
de gelo para evitar a perda de atividade;
o Na preparação do extrato bruto, caso haja formação de
uma camada de lipídeos superficial, é necessário que o
material seja filtrado (papel filtro, gaze ou tecido).
84
Fonte: Própria.
85
Objetivo:
Produzir hidrolisado proteico a partir dos resíduos de
pescado.
A atividade enzimática digestivas de organismos aquáticos difere

quanto ao ambiente, hábitos alimentares, fase de
desenvolvimento, fatores bióticos e abióticos.
1. Preparar hidrolisado de resíduos do pescado de acordo

com metodologia descrita;
2. Comparar a atividade enzimática com diversos extratos

obtidos de organismos aquáticos de acordo com descrito
na tabela 4.1 (Hidrolisados proteicos de diferentes
subprodutos do pescado);
3. Comparar o rendimento de hidrolisado proteico obtido a

partir de resíduos do processamento de e pescado de
acordo com descrito na tabela 4.1 (Hidrolisados proteicos
de diferentes subprodutos do pescado).
86
Tabela 4.1 Hidrolisados proteicos de diferentes subprodutos do
pescado
Nome APAT2 GH4 RP5
Espécie FE1 SBH3 Referência
comum (U/mg) (%) (%)
Merluccius Pescada do Savinase Karoud et al.
3,00 Cabeça 8,6 84,75
merluccius Atlântico (Novozymes) (2019)
Oreochromis Tilápia do Alcalase Silva et al.
5,55 Carcaça 25,0 58,48
niloticus Nilo (Sigma) (2014)
Oreochromis Tilápia do Extrato bruto Silva et al.
5,71 Carcaça 28,0 49,23
niloticus Nilo intestinal (2014)
Oreochromis Tilápia do Extrato bruto Silva et al.
6,92 Carcaça 35,0 50,82
niloticus Nilo intestinal (2014)
Mazorra-
Merluccius Pescada do Extrato bruto
45µMol/g Músculo 4,4 28,90 Manzano et al.
productus Pacífico do músculo
(2012)
Camarão Extrato bruto
Litopenaeus Cahú et al.
branco do dos tecidos da 6,76 Cabeça - 50,85
vannamei (2012)
Pacífico cabeça
Camarão Extrato bruto
Litopenaeus cao et al.
branco do dos tecidos da - Cabeça 43,6 51,66
vannamei (2009)
Pacífico cabeça
Vísceras
Flavoenzimas sem trato Šližyte et al.
Gadus morhua Bacalhau 25µMol/g - 79,9
(Novozymes) digestivo (2005)
e ossos
Vísceras
Endógenas + Šližyte et al.
Gadus morhua Bacalhau 25µMol/g completas 34,7 85,6
Flavoenzimas (2005)
e ossos
Vísceras
Šližyte et al.
Gadus morhua Bacalhau Flavoenzimas 25µMol/g sem trato 22,7 75,0
(2005)
digestivo
Endógenas + Vísceras Šližyte et al.
Flavoenzimas completas (2005)
Vísceras
Neutrase sem trato Šližyte et al.
(Novozymes) digestivo (2005)
e ossos
Vísceras
Endógenas + Šližyte et al.
Gadus morhua Bacalhau 24µMol/g completas 44,2 87,7
Neutrase (2005)
e ossos
Vísceras
Šližyte et al.
Gadus morhua Bacalhau Neutrase 24µMol/g sem trato 38,8 78,2
(2005)
digestivo
Endógenas Vísceras Šližyte et al.
Gadusmorhua Bacalhau 24µMol/g - 83,5
+Neutrase completas (2005)
Vísceras
completas Šližyte et al.
Gadusmorhua Bacalhau Endógenas - - 84,8
e ossos (2005)
sem água
Endógena + Vísceras Šližyte et al.
Gadus morhua Bacalhau - - 89,5
Flavoenzimas completas (2005)
87
e ossos
sem água
Vísceras
Endógena + completas Šližyte et al.
Gadus morhua Bacalhau - - 91,6
Neutrase e ossos (2005)
sem água
Thunnus Alcalase(Novo Guérard et al.
Albacora 5,60 Estômago 10,0 -
albacares Nordisk) (2001)
Thunnus Guérard et al.
Albacora Alcalase 14,40 Estômago 16,0 -
albacares (2001)
albacares (2001)
albacares (2001)
albacares (2001)
1FE:fonte de enzima; 2APAT: atividade de proteases alcalinas totais; 3SBH: subproduto base
do hidrolisado; 4GH: grau de hidrólise; 5RP:recuperaçao de proteínas.
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92
93
CONTEXTUALIZAÇÃO
O
colágeno é uma macromolécula proteica
abundante na matriz extracelular (MEC),
pertencente a uma família constituída por 29
subtipos (I-XXIX) de moléculas colagenosas (Ge et al., 2020). A
estrutura geral do colágeno é marcada por uma repetição de
domínios “Glicina-X-Y”, onde “X” é de modo frequente a
prolina (Pro) e o “Y” a hidroxiprolina (Hyp). Esse padrão leva
a formação da tripla hélice composta por 3 cadeias
polipeptídicas encontrada em todos os membros da família
colagenosa (Senadheera; Senadheera; Shahidi, 2020).
Devido suas propriedades semelhantes ao colágeno de
mamíferos (propriedades físico-químicas e espectroscópicas),
o colágeno vem sendo demasiadamente utilizado na indústria,
seja para a preparação de alimentos e bebidas nutritivas
(nutracêuticos) ou para fins médicos, como nos procedimentos
de cicatrizações de feridas diabéticas, pós-operatórios, entrega
de medicamentos, produção de peptídeos biologicamente
ativos, na área de engenharia de tecidos, na indústria de
construção civil e, principalmente, na indústria de cosméticos
e produtos de beleza (Oliveira et al., 2021).
O colágeno disponibilizado hoje no mercado comercial
é, em maior parte, obtido a partir de mamíferos, especialmente
dos subprodutos provenientes de bovinos e suínos (pele, ossos
e/ou tendões). Entretanto, existem sérias restrições sanitárias
quanto ao uso do colágeno de mamíferos devido aos riscos de
transmissão de zoonoses, como a encefalopatia espongiforme
bovina (doença da vaca louca), encefalopatia espongiforme
transmissível e a febre aftosa, além da incidência de reações
94
alérgicas em uma parcela da população (Davison-Kotler;
Marshall; García-Gareta, 2019; Felician et al., 2019; León-López
et al., 2019; Song et al., 2019; Oliveira et al., 2021). Em
contrapartida, as fontes aquáticas têm sido cada vez mais
utilizadas em substituição ao colágeno de mamíferos, muito
devido as suas propriedades semelhantes a esses últimos e não
predispor de restrições sanitárias (Oliveira et al., 2017; Felician
et al., 2019), como ilustrado no quadro 5.1.
Quadro 5.1 Principais características dos colágenos extraídos

de organismos aquáticos
CARACTERÍSTICAS
Alta disponibilidade de subprodutos da aquicultura.
Maior distância ontogenética dos peixes em relação aos
humanos (baixo risco de transmissão de doenças quando
comparado ao colágeno dos mamíferos).
Ausência de barreiras culturais e religiosas.
Facilidade dos processos de extração.
Alta versatilidade.
Biorreabsorvibilidade.
Toxicidade ausente (peixes).
Resposta inflamatória mínima.
Baixo ponto de fusão e viscosidade.
Alto conteúdo de glicina e de alanina.
Boas propriedades hemostáticas.
Metabolicamente compatíveis.
Fonte: Oliveira et al. (2021).
Os principais invertebrados marinhos investigados

como fonte de colágeno foram: pepinos-do-mar, ouriços-do-
mar, anêmonas-do-mar, corais, esponjas, estrelas-do-mar,
95
polvos, chocos, águas-vivas, lulas e mexilhões (Felician et al.,
2019; Coppola et al., 2020; Li et al., 2020; Oliveira et al., 2021).
Figura 5.1 Fontes aquáticas de colágeno
Fonte: Própria. Criada no software Diagram.

Imagens: SMART – Servie Medical Art; Freepik; Pixabay.
O colágeno do Tipo I é encontrado na maioria das

espécies aquáticas, sobretudo nos resíduos do beneficiamento.
Devido suas propriedades físico-químicas e estruturais, tem
sido empregado com sucesso na indústria (Oliveira et al.,
96
2021). O colágeno do Tipo II é encontrado nas cartilagens,
como de tubarões e raias (Kittiphattanabawon et al., 2010a).
Espécies de peixes dulcícolas (tilápia, por exemplo) têm
sido consideradas as principais fontes de colágeno da
atualidade (Costa, 2019), o que vem sendo mais aplicado na
indústria para produção de peptídeos (fragmentos de
colágeno de baixa massa molecular, 4-12 kDa), agindo como
regulador do fluxo gastrointestinal e atuando como
antioxidante, antitumoral, anti-hipertensivo, etc. (Oliveira et
al., 2017). O isolamento de moléculas de colágeno de peixes
tem sido uma alternativa viável para os resíduos da filetagem,
que incluem cabeças, peles, escamas, bexiga natatória e ossos
(Ahmed et al., 2019; Zhang et al. 2019), como ilustrado na
figura 5.2.
Figura 5.2 Subprodutos de robalo-flecha (Centropomus

undecimalis) como matéria-prima para a extração de colágeno
Fonte: Oliveira et al. (2021). Cedida gentilmente. 97

A extração de colágeno é comumente realizada baseada
na solubilidade da proteína, como descritos na secção de
protocolo, tendo como produto final o colágeno solubilizado
ou liofilizado, como ilustrado na figura 5.3. Inicialmente, os
resíduos destinados a extração de colágeno são higienizados. É
recomendável fracionar o subproduto para facilitar o processo
de extração. No caso da pele, é recortada em quadrados de
aproximadamente 1,5 cm x 1,5 cm (Valenzuela-Rojo; Lópes-
Cervantes; Sánchez-Machado, 2019; Oliveira et al., 2021).
Figura 5.3 Extração de colágeno (solubilizado e liofilizado) de

apaiari (Astronotus ocellatus)
Fonte: Oliveira et al. (2021). Cedida gentilmente.

98
Na etapa seguinte, os “pedaços cortados” passam por
um processo de branqueamento, onde é removida a maioria
das impurezas e proteínas não colagenosas (Coppola et al.,
2020; Oliveira et al., 2021). No pré-tratamento são utilizadas
soluções alcalinas, isoladas e/ou combinadas, tais como:
hidróxido de sódio (NaOH), peróxido de hidrogênio (H2O2) e
hidróxido de cálcio (Ca(OH)2), além de outros. Em seguida, é
utilizado álcool butílico (10%) com o objetivo de remover a
parte gordurosa, sendo sucedida por procedimentos
sistemáticos que vão atenuar o produto da extração. O
processo de extração é realizado sob temperatura controlada (4
ºC) para prevenir a desnaturação da proteína colagenosa
(Senadheera; Senadheera; Shahidi, 2020; Oliveira et al., 2021).
As técnicas de extração de colágeno são classificadas
atualmente em dois grupos: os convencionais e os novos. Nos
convencionais são aplicados hidrólise química (ácida ou
alcalina) e enzimática, enquanto que nos novos, técnicas como
ultrassom são utilizadas de modo auxiliar aos métodos
convencionais (Senadheera; Senadheera; Shahidi, 2020).
Salienta-se que a técnica influenciará diretamente na estrutura
da proteína, devendo-se avaliar bem as vantagens antes de
aplicá-las. O tipo de sal mais utilizado nas extrações é o
Cloreto de Sódio (NaCl) (Cumming; Hall; Hofman, 2019;
Coppola et al., 2020; Oliveira et al., 2021), enquanto que os
ácidos mais empregados são: ácido acético (CH3COOH), ácido
lático (C3H6O3), ácido cítrico (C6H8O7), ácido fórmico (CH2O2),
ácido clorídrico (HCl), ácido sulfúrico (H2SO4), ácido tartárico
(C4H6O6), entre outros.
Sucedendo a etapa com ácidos, pode ser realizada uma
etapa empregando enzimas, tais como: pepsina, papaína e/ou
99
colagenase. Na etapa de extração enzimática ocorre a remoção
das extremidades não helicoidais do colágeno, aumentando a
solubilidade da proteína, elevando o rendimento da extração.
Contudo, existe a possibilidade de desnaturação irreversível
da proteína durante esse procedimento. O rendimento é
calculado em porcentagem (%) e as propriedades do colágeno
extraído dependerão do método aplicado no procedimento e
extração, além ainda, da espécie, tamanho e do peso corporal
(Senadheera; Senadheera; Shahidi, 2020; Oliveira et al., 2021).
O rendimento é calculado baseado no peso seco a partir
da seguinte equação: Rendimento (%) = (peso do colágeno
liofilizado (g)/peso do tecido seco inicialmente utilizado (g)) ×
100
I. EXTRAÇÃO DE COLÁGENO
o Cloreto de Cálcio (NaCl) (0,8 M);
o Hidróxido de Sódio (NaOH) (0,2 M);
o Álcool butílico (10%); Ácido acético (0,5 M);
o Pepsina comercial (1,5%).
o Centrífuga (refrigerada);
o Becker de vidro (volume de 1000 l) e Proveta;
o pH digital (ou fita de pH).
AMOSTRAS ANALISADAS
100
o Pele, escamas, ossos, bexiga natatória, etc.
PROCEDIMENTO
O procedimento aqui descrito será para a extração de
colágeno a partir de resíduos de pele de peixes. Para os demais
resíduos, por existirem diferenças nos passos metodológicos, a
roteirização deverá ser baseada a partir da literatura descrita
na parte de contextualização deste capítulo. Ainda, será
descrito adiante a metodologia para extração usando ácido
acético e pepsina comercial, podendo haver substituição de
acordo com as condições laboratoriais.
Pré-tratamento (remoção das proteínas solúveis) segundo

Oliveira et al. (2019):
1- Separar 30 g de resíduos de pele, recortando em
quadrantes de 16 cm x 16 cm para facilitar a extração;
2- Para eliminar as proteínas não colagenosas presentes
no material, a pele deverá ser misturada com 0,2 M de
hidróxido de sódio (NaOH) em uma solução alcalina
na proporção de 1:10 (p/v);
3- A mistura deverá ser continuamente agitada durante 3
horas a 4 °C e a solução alcalina deverá ser trocados a
cada 30 minutos;
4- A pele tratada deverá ser então lavada cuidadosamente
com água destilada fria até a água de enxágue se tornar
neutra (pH 7) – usar pH digital ou fita de pH;
5- Em seguida, deverá ser adicionado 10% de álcool
butílico, na proporção de 1:10 (p/v), para remover
gorduras;
101
6- A mistura deverá ser continuamente agitada durante
um período de 6 h, a 4 °C;
7- Ao final do pré-tratamento, deverá ser utilizada uma
solução de peróxido de hidrogênio para o
branqueamento da amostra na concentração de 3%;
8- Todo o pré-tratamento deverá ser realizado sobre a
temperatura de 4 °C com agitação constante.
Isolamento de colágeno solúvel em ácido (ASC) segundo

Hukmi; Sarbon (2018):
1- O ácido acético 0,5 M com uma proporção de amostra

para solução de 1:10 (p/v) deverá ser aplicado às
amostras por 24 horas com agitação contínua;
2- Em seguida, o material deverá ser centrifugado a
10.000 x g por 30 min, a 4 ºC;
3- Após a centrifugação, os sobrenadantes obtidos
deverão ser separados;
4- Os resíduos da amostra deverão ser re-extraídos com
ácido acético 0,5 M com uma proporção de amostra
para solução de 1:10 (p/v) por 12 horas antes de
centrifugar a 10.000 x g por 30 min, a 4 ºC;
5- Os sobrenadantes resultantes deverão passar por nova
centrifugação;
6- Em seguida, o cloreto de sódio (NaCl) deverá ser
adicionado ao sal até a concentração final do
sobrenadante atingir 0,7 M para a precipitação ocorrer;
7- Os sobrenadantes deverão ser centrifugados a 2.500 x g
para obter o precipitado;
102
8- Após a última centrifugação, proceder à diálise (24
horas) e posterior liofilização do material;
9- O produto final deverá ser designado de colágeno
ácido-solúvel (ASC).
Isolamento de colágeno solúvel em pepsina (PSC) segundo

Hukmi; Sarbon (2018) e Oliveira et al. (2019):
1- Para isolar o colágeno solúvel em pepsina (PSC), a

matéria não dissolvida obtida da extração com
colágeno ácido-solúvel (ASC) deverá ser utilizada para
extração adicional usando 2 volumes de ácido acético
0,5 M contendo pepsina comercial a 1,5% (p/p), por 30
horas a 4 ºC com agitação contínua;
2- Logo após, os materiais deverão ser centrifugados a
10.000 x g por 30 minutos a 4ºC para separação dos
sobrenadantes;
3- Os resíduos deverão seguir para re-extração com ácido
acético 0,5 M, contendo pepsina a 1,5% (p/p), por 12
horas;
4- Em seguida, proceder a centrifugação a 10.000 × g por
30 minutos a 4ºC;
5- A partir de então, proceder a combinação de ambos os
sobrenadantes e adicionar NaCl até a concentração
final do sobrenadante atingir 0,7 M para que ocorra a
precipitação;
6- Após a etapa anterior, centrifugar novamente a 2.500 ×
g para obter um novo precipitado, e este deverá ser
liofilizado logo após;
103
7- O produto final dessas etapas será designado de
colágeno pepsina-solúvel (PSC).
Fonte: Oliveira et al. (2021). Criada no software Diagram.
104
Objetivo:
Isolar proteína colagenosa de resíduos do processamento
de peixes.
A partir dos resíduos descartados do processamento de peixes,

utilizar pele para extração de colágeno.
1. Realizar o pré-tratamento dos resíduos de pele conforme

metodologia descrita neste capítulo;
2. Isolar colágeno de pele utilizando método ácido-solúvel

(ASC), conforme descrito no item procedimento;
3. Isolar colágeno de pele utilizando método pepsino-

solúvel (PSC), conforme descrito no item procedimento;
4. Determinar o rendimento do colágeno obtido (ASC e

PSC);
5. Comparar o rendimento do colágeno obtido com os

descritos na tabela 5.1 (Rendimento de colágeno extraído
de organismos aquáticos pelo método ácido solúvel
(ASC) e pepsina solúvel (PSC)).
105
Tabela 5.1 Rendimento de colágeno extraído de organismos aquáticos pelo
método ácido solúvel (ASC) e pepsina solúvel (PSC)
Nome científico Organismo Extração Tecido Y (%)* Referência
Scomber Peixe teleósteo PSC Ossos 1,75 Asaduzzaman et al. (2020)
japonicus
Scomber Peixe teleósteo PSC Pele 8,10 Asaduzzaman et al. (2020)
japonicus
Holothuria Pepino-do-mar ASC Corpo 72,2 Li et al. (2020)
cinerascens
Thunnus obesus Peixe teleósteo ASC Pele 13,5 Ahmed et al. (2019)
Thunnus obesus Peixe teleósteo PSC Pele 16,7 Ahmed et al. (2019)
Thunnus obesus Peixe teleósteo PSC Escamas 4,6 Ahmed et al. (2019)
Thunnus obesus Peixe teleósteo PSC Ossos 2.6 Ahmed et al. (2019)
Cyprinus carpio Peixe teleósteo ASC Escamas 13,6 Chinh et al. (2019)
Rhopilema Água-viva PSC Filamentos 4,31 Felician et al. (2019)

esculentum
Cichla ocellaris Peixe teleósteo PSC Pele 2,9 Oliveira et al. (2019)
Oreochromis Peixe teleósteo ASC Pele 19,07 Song et al. (2019)

niloticus
Oreochromis Peixe teleósteo PSC Pele 19,61 Song et al. (2019)
niloticus
Coelomactra Conchas PSC Corpo 3.78 Wu et al. (2019)
antiquata
Acipenser Peixe teleósteo PSC Pele 13.4 Zhang et al. (2019)
schrenckii
Acipenser Peixe teleósteo PSC Bexiga 16,5 Zhang et al. (2019)
schrenckii natatória
Pangasius sp. Peixe teleósteo ASC Pele 4,27 Hukmi; Sarbon (2018)
Pangasius sp. Peixe teleósteo PSC Pele 2,27 Hukmi; Sarbon (2018)
Lates calcarifer Peixe teleósteo PSC Pele 47,3 Liao et al. (2018)
Oreochromis Peixe teleósteo PSC Pele 52,6 Liao et al. (2018)

niloticus
Mustelus Peixe cartilaginoso ASC Pele 23,07 Slimane; Sadok (2018)
mustelus
Mustelus Peixe cartilaginoso PSC Pele 35,27 Slimane; Sadok (2018)
mustelus
Miichthys miiuy Teleost Fish ASC Bexiga 1,33 Zhao et al. (2018)
natatória
Miichthys miiuy Peixe teleósteo PSC Bexiga 8,7 Zhao et al. (2018)
natatória
106
Probarbus Peixe teleósteo ASC Escamas 0,42 Ali; Benjakul; Kishimura
jullieni (2017)
Probarbus Peixe teleósteo PSC Escamas 1,16 Ali; Benjakul; Kishimura
jullieni (2017)
Cyprinus carpio Peixe teleósteo ASC Escamas 9,79 Bhagwat; Dandge (2016)
Loligo vulgaris Lula-comum ASC Manto 5,1 Cozza et al. (2016)
Loligo vulgaris Lula-comum PSC Manto 24,2 Cozza et al. (2016)
Hybrid Clarias Peixe teleósteo ASC Pele 18,11 Kiew; Mashitah (2013)
sp.
Hybrid Clarias Peixe teleósteo PSC Pele 26,69 Kiew; Mashitah (2013)
sp.
Chiloscyllium Peixe Cartilaginoso ASC Pele 9,38 Kittiphattanabawon et al.
punctatum (2010a)
Chiloscyllium Peixe Cartilaginoso PSC Pele 8,86 Kittiphattanabawon et al.
punctatum (2010a)
Chiloscyllium Peixe Cartilaginoso ASC Cartilagem 1,27 Kittiphattanabawon et al.
punctatum (2010b)
Chiloscyllium Peixe Cartilaginoso PSC Cartilagem 9,59 Kittiphattanabawon et al.
punctatum (2010b)
Carcharhinus Peixe Cartilaginoso ASC Cartilagem 1,04 Kittiphattanabawon et al.
limbatus (2010b)
Carcharhinus Peixe Cartilaginoso PSC Cartilagem 10,30 Kittiphattanabawon et al.
limbatus (2010b)
*Y: Rendimento.
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112
113
.CONTEXTUALIZAÇÃO
A
gelatina é um composto orgânico nitrogenado
produzido pela hidrólise parcial de materiais
colágenos, como tecido conjuntivo frouxo,
tendão, ossos e pele com água morna a cerca de 45 °C (Sultana;
Ali; Ahamad, 2018). Possui em sua composição proteínas (85-
92%), sal mineral e água (Lv et al., 2019; Ranasinghe et al.,
2020). A composição da gelatina extraída do pescado é
variável e dependerá da fonte e método de extração, já tendo
sido produzida com sucesso a partir do reaproveitamento de
uma variedade de subprodutos do pescado (Biluca; Marquetti;
Alfaro, 2011; Nagarajan et al., 2012; Shyni et al., 2014; Alipal et
al., 2021).
A gelatina é identificada como uma substância sólida,
insípida e incolor, gerada a partir da hidroxilação parcial ou
total de moléculas de colágeno sob diferentes condições, como
ácidas, álcalis, enzimáticas e através de altas temperaturas
(Sultana; Ali; Ahamad, 2018). A estrutura da gelatina de peixe
é composta, principalmente, por repetições de sequências de
"Glicina-XY", enquanto "X" e "Y" são quase sempre prolina
(Pro) e hidroxiprolina (Hyp) (iminoácidos), respectivamente
(Lv et al., 2019).
As principais matérias-primas utilizadas na fabricação
de gelatina são bovinos (couro e ossos), suínos (pele) e peixes
(Sultana; Ali; Ahamad, 2018), devido às suas disponibilidades
e preço (Lv et al., 2019). Todavia, algumas restrições sanitárias,
socioculturais e religiosas (o judaísmo e o islamismo proíbem
o consumo de qualquer produto relacionado à carne de suína,
enquanto os hindus não consomem produtos derivados de
bovinos), são alguns dos fatores limitantes para o uso dessas
114
fontes (Karim; Bhat, 2009; Silva; Bandeira; Pinto, 2014; Huang
et al., 2019; Ranasinghe et al., 2020; Zhang et al., 2020a).
Os subprodutos do processamento de peixes são fontes
potenciais para produção de gelatina muito devido a grande
quantidade de resíduos fontes de material colagenoso (Alfaro
et al., 2014), como peles, escamas, carcaça, ossos e até a bexiga
natatória (Oliveira et al., 2021). A utilização de subprodutos do
pescado para a produção de gelatina favorece o mercado de
proteínas e concede um destino apropriado para esses
resíduos (Gómez-Guillén et al., 2009; Karim; Bhat, 2009).
Várias são as características que tornam as gelatinas
extraídas de peixes atrativas para uso na indústria, muitas das
quais estão relacionadas à sua matéria-prima, a proteína de
colágeno, como descrito no capítulo 5. Os aspectos gerais das
gelatinas produzidas a partir de organismos aquáticos podem
ser visualizados no quadro 6.1
Quadro 6.1 Aspectos gerais das gelatinas produzidas a partir

de organismos aquáticos
CARACTERÍSTICAS
Maior distância ontogenética dos peixes em relação aos humanos
(baixo risco de transmissão de doenças quando comparado ao
colágeno dos mamíferos).
A indústria pesqueira gera grande quantidade de subprodutos com
alto teor de colágeno.
O uso de subprodutos de peixe para obter gelatina é economicamente
interessante para as indústrias de processamento.
A redução dos problemas de poluição ambiental causados pelo
descarte impróprio de subprodutos derivados do processamento.
O grande número de espécies aquáticas e as diferentes propriedades
funcionais da gelatina derivada de cada espécie.
Propriedades reológicas inferiores quando comparada à de mamíferos.
Fonte: Alfaro et al. (2014).
115
A gelatina tem sido útil para aplicações na preparação
de alimentos (Wangtueai et al., 2020) e bebidas nutritivas, usos
farmacêuticos, tais como no processo de cicatrização de feridas
(Sghayyar et al., 2020), engenharia de tecidos, formação óssea e
doenças relacionadas (Lv et al., 2019) e na preparação de filmes
(Hu et al., 2020; Nilsuwan et al., 2020).
A gelatina de peixes de água fria tem baixo teor de
prolina (Pro) e hidroxiprolina (Hyp) em comparação com a
gelatina derivada de mamíferos. Por esse motivo, a gelatina
derivada de peixe mantém o estado de sólido sem apresentar
comportamento de gelificação à temperatura ambiente (Kwak
et al., 2017).
O hidrolisado gelatinoso tem sido investigado devido
sua propensão de ações bioativas, como agente antioxidante
(Choonpicharn et al., 2016; Ketnawa et al., 2016; Yi et al., 2016),
anti-hipertensiva (Alemán et al., 2011; Choonpicharn et al.,
2016), antimicrobiana (Lv et al., 2019), antitumoral (Alemán et
al., 2011; Mirzapour-Kouhdasht et al., 2020) e, ainda, ação
imunomoduladoras (Karnjanapratum et al., 2016).
Ketnawa et al. (2016) produziram hidrolisados de
gelatina a partir de subprodutos de pele de uma espécie de
bagre (Pangasianodon gigas) e investigaram seu potencial
antioxidante através de simulação in vitro da digestão
gastrointestinal, observando uma maior eliminação de radicais
livres, reduzindo íons férricos e atividades quelantes desse
material.
Gelatinas produzidas a partir de organismos aquáticos
já tiveram suas características e propriedades físico-químicas e
reológicas definidas (Quadro 6.2), usando subprodutos, para
melhor inserção do produto no mercado consumidor.
116
Quadro 6.2 Características dos tipos de gelatina
Cadeias α (80-125 kDa)
Cadeias β (160-250 kDa)
Perfil Cadeias γ (240-375 kDa)
eletroforético Outras substâncias de baixa massa molecular
Classificação/Tipo Gelatina tipo A Gelatina tipo B
Colágenos menos Colágenos mais
Características covalentemente complexos
reticulados
Fontes Suínos e Peixes Bovinos
Produção Tratamento Ácido Tratamento Alcalino
Duração do 10–45 h 30-100 dias
processamento
pI pH 6,5–9,0 pH 4,8-5,2
Rendimento (%)
Força do gel (g)
Composição proximal (%): Umidade, Proteínas,
Gorduras e Teor de Cinzas.
Coloração e Odor
Propriedades Composição de Aminoácidos (%)
Fisico-químicas e Perfil Eletroforético
Reológicas Quantificação de hidroxiprolina (% ou mg)
Ponto de Fusão
Ponto Isoelétrico (pI)
Viscosidade
Gelificação
Capacidade Emulsificante (%)
Fonte: Adaptado a partir de dados descritos por Karim; Bhat (2009); Mariod;
Adam (2013), Ahmad et al. (2017), Huang et al. (2019) e Lv et al. (2019).
A viscosidade e a gelificação são as duas propriedades

físicas consideráveis quando se trata de gelatina para uso
industrial. As propriedades de gelificação dão respostas sobre
a medida da força e rigidez desse material. Uma característica
117
desse material é sua propriedade de derreter na boca – a
temperatura de fusão do gel de gelatina está abaixo da
temperatura fisiológica do corpo humano, o que confere ao
polímero de gelatina propriedades de fusão na boca com
intensa liberação de sabor e aroma, propriedade importante
para produção de sobremessas à base dessa matéria-prima
(Sultana; Ali; Ahamad, 2018).
A força do gel é uma medida da dureza, rigidez, força,
firmeza e compressibilidade do gel. O ponto de fusão e a
gelificação da gelatina de espécies de peixes é inferior aos de
mamíferos (Jamilah; Harvinder, 2002; Nikoo et al., 2014). A
temperatura de extração da gelatina tem efeito direto sobre os
atributos emulsificantes e estabilizantes (Tan et al., 2020). Silva;
Bandeira; Pinto (2014) extraíram gelatina de subprodutos de
pele de beijupirá (Rachycentron canadum) com propriedades
físico-químicas e reológicas superiores a gelatina de corvina
(Micropogonias furnieri). Os autores reportaram temperatura de
fusão e temperatura de gelificação de 26,8 e 25,7ºC e de 19,9 e
17,8ºC, respectivamente, para a gelatina de Beijupirá e a de
Corvina, ambas espécies marinhas.
O processo de extração da gelatina consiste em pelo
menos cinco etapas:
(1) limpeza da matéria-prima;
(2) remoção de substâncias não colagenosas (gorduras
na pele e sais de cálcio das escamas) (Zhang et al., 2020b);
(3) pré-tratamento ácido (cítrico, acético ou clorídrico)
ou alcalino da matéria-prima para converter o colágeno em
gelatina solúvel (Niu et al., 2013);
(4) extração da gelatina solúvel da matéria-prima em
água quente (por exemplo, incubação a 55°C por 6 h), neste
118
estágio, o colágeno também pode ser hidrolisado em gelatina
solúvel devido à hidrólise térmica;
(5) purificação (por exemplo, usando a centrifugação e
filtração) e/ou liofilização da gelatina (Zhang et al., 2020b).
No processo de produção da gelatina é necessário que
ligações cruzadas covalentes e não covalentes da estrutura do
colágeno sejam quebradas para que haja a liberação de cadeias
α e de oligômeros livres. A composição das gelatinas de peixes
é variável, especialmente quanto ao conteúdo de aminoácidos,
o que também pode ser explicado pela diversidade de espécies
e de fontes de subprodutos (pele, escamas, ossos, barbatanas),
além do tipo de método utilizado no processo de extração do
colágeno e produção da gelatina (Ahmad et al., 2017).
O rendimento da extração da gelatina é calculado com
base no peso seco obtido ao final do processo e o peso seco do
resíduo com base na seguinte equação: R(%) = m(gelatina) x
100/m(escamas) (Martins et al., 2015). Ai-Temimi et al. (2021)
reportaram rendimentos maiores quando a extração do uso da
térmica comparada com a enzimática ao produziram gelatina
a partir das escamas de alguns peixes dulcícolas e marinhos.
Os resultados também evidenciaram que as escamas de peixes
podem conter boa porcentagem de proteínas e cinzas, estando
próximas da gelatina comercial (Martins et al., 2015; Caldato;
Naves; Zatta, 2019).
119
I. OBTENÇÃO DE GELATINA
o Béquer;
o Proveta;
o Balança de precisão;
o Estufa;
o Liquidificador;
o Liofilizador.
o Cloreto de sódio (NaCl);
o Ácido clorídrico (HCl);
o Ácido acético (CH3COOH);
o Hidróxido de sódio (NaOH);
o Ácido sulfúrico (H2SO4).
AMOSTRAS ANALISADAS
o Escamas de peixes.
PROCEDIMENTO
A gelatina de escamas de peixes será obtida segundo Martins
et al. (2015) e adapatada por Caldato; Naves; Zatta (2019):
Pré-tratamento da gelatina
1- As escamas obtidas a partir dos resíduos pesqueiros
deverão ser lavadas usando água corrente, objetivando
remover o excesso de sujidades;
120
2- Em seguida, poderão ser peneiradas e congeladas em
freezer (ou pular direto para o passo seguinte);
3- Após a lavagem e peneirada, as escamas deverão ser
acondicionadas na estufa por 40 horas, a 40 ºC;
4- Após esse período, as escamas deverão passar para a
etapa de desmineralização.
Etapa de desmineralização
1- Pesar 100 g de escamas secas, adicionando-se uma
solução de cloreto de sódio (NaCl) 10% na proporção
1:10 (p/v);
2- O material deverá ficar em repouso por 24 horas, a
temperatura ambiente;
3- Após o período de repouso, as escamas deverão ser
lavadas com água destilada e peneiradas;
4- Em seguida, as escamas deverão ser imersas em uma
solução de ácido clorídrico (HCl) 0,4 mol/l na
proporção 1:10 (p/v);
5- O material deverá ficar em repouso por 24 horas;
6- Após o período de repouso, as escamas deverão ser
lavadas com água destilada até a retirada do excesso
da solução e deixadas na estufa a 40 °C por 24 horas
para secagem;
7- Após estarem completamente secas, as escamas
deverão ser pesadas e trituradas (usar um
liquidificador).
Etapa de hidrólise ácida e alcalina

1- As escamas desmineralizadas deverão ser imersas em
ácido acético (CH3COOH) 0,1 mol/l na proporção 1:10
121
(p/v) por um período de 1 hora, a temperatura
ambiente;
2- Em seguida, deverá ser adicionado o hidróxido de
sódio (NaOH) 0,1 mol/l na proporção de 1:3 (p/v),
devendo-se deixar em sob agitação constante por 1
hora, a temperatura ambiente;
3- Logo após, deverá ser aplicado ácido sulfúrico (H2SO4)
0,1 mol/l na proporção de 1:3 (p/v), por 1 hora, sob
agitação constante.
Extração da gelatina
1- As escamas desmineralizadas e hidrolisadas deverão
ser imersas em água destilada, na proporção de 1:4
(p/v) por 1 hora, a 60 °C, sob agitação constante;
2- O resíduo sólido (escamas) deverá ser pesado e
descartado, e o resíduo líquido (proteína hidrolisada,
“gelatina”) deverá ser mensurado, armazenado em
freezer, para posterior, liofilização.
O rendimento da extração de gelatina deverá ser calculado

a partir do peso seco da gelatina obtida ao final do processo e
o peso seco do resíduo com base na seguinte equação (Martins
et al., 2015):
R (%) = m(gelatina) x 100/m(escamas)
Onde: R(%) é o rendimento obtido em porcentagem;

m(gelatina) diz respeito ao peso da gelatina após o processo de
extração; m(escamas) representa o peso obtido no começo do
processo de extração (Martins et al., 2015).
122
Fonte: Adaptado de Martins et al. (2015). Criada no software Diagram.

123
Objetivo: Produzir gelatina a partir de resíduos do
processamento de peixes.
1. Produzir gelatina de subprodutos de escamas de peixes

seguindo passos metodológicos descritos no item
"Procedimento";
2. Calcular o rendimento (em %) da gelatina extraída;
3. Dosar proteínas totais do material hidrolisado;
4. Comparar os dados de rendimento (em %) obtidos na

prática experimental com os valores descritos na tabela
6.1 (Produção de gelatina de subprodutos de organismos
aquáticos), elaborando uma discussão em formato de
resumo simples (1 página), mencionando os seguintes
aspectos: espécie(s) utilizada(s) e subproduto(s)
escolhido(s);
5. Investigar em plataformas digitais para complementação

da atividade: hábitat e hábito alimentar da(s) espécies(s)
utilizadas, características físico-químicas e reológicas da
gelatina produzidas de espécies de organismos aquáticos
já publicados na literatura científica (relacionar até 3
espécies diferentes).
Sugestões:
Google acadêmico: https://scholar.google.com.br/?hl=pt
SciELO: https://www.scielo.org.
124
capítulo Todas as amostras deverão ser identificadas
Tabela 6.1 Produção de gelatina de subprodutos de organismos aquáticos
Nome científico Subproduto/ Y (%)* Força do Referência
Tratamento gel (g)
Oreochromis mossambicus Pele 8,49 190,24 Koli et al. (2014)
Ranchycentron canadus Pele 13,88 222,0 Koli et al. (2014)
Pangasius hypophthalamus Pele 7,8 238,0 Koli et al. (2014)
Catla catla Pele 10,50 180,76 Koli et al. (2014)
Oreochromis niloticus Escamas 10,0 233,5 Martins et al. (2015)
Katsuwonus pelamis Pele 11,3 177,0 Shyni et al. (2014)
Scoliodon sorrakowah Pele 19,7 206,0 Shyni et al. (2014)
Labeo rohita Pele 17,2 124,0 Shyni et al. (2014)
Rachycentron canadum Pele 79,5 232,0 Silva; Bandeira; Pinto (2014)
Micropogonias furnieri Pele 75,6 212,0 Silva; Bandeira; Pinto (2014)
Loligo formosana Pele (50ºC) 8,8 132,0 Nagarajan et al. (2012)
Oreochromis nilotica Pele (Ca(OH)2) 39,97 384,9 Jamilah et al. (2011)
Clarias batrachus Pele (Ca(OH)2) 32,06 147,40 Jamilah et al. (2011)
Pangasius sutchi fowler Pele (Ca(OH)2) 26,23 238,90 Jamilah et al. (2011)
Balistes capriscus Pele (Ácida) 5,67 168,3 Jellouli et al. (2011)
Pangasianodon gigas Pele 20,1 153,0 Jongjareonrak et al. (2010)
Priacanthus macracanthus Pele 6,5 105,7 Jongjareonrak et al. (2006)
Lutjanus vitta Pele 9,4 218,6 Jongjareonrak et al. (2006)
125
Gadus chalcogrammus Pele (Na-0,01) 7,1 62,0 Zhou; Regenstein (2005)
Gadus chalcogrammus Pele (Ca-0,01) 8,8 19,0 Zhou; Regenstein (2005)
Oreochromis mossambicus Pele 5,39 - Jamilah; Harvinder (2002)
Oreochromis nilotica Pele 7,81 - Jamilah; Harvinder (2002)
*Y: Rendimento.
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132
133
CONTEXTUALIZAÇÃO
O
teor de hidroxiprolina (Hyp) é um aminoácido
não essencial constituinte de proteínas e
derivados da prolina (Pro), sendo considerado
bom indicador pela sua confiabilidade na determinação da
presença de material colagenoso (colágeno e gelatina) em
amostras de alimentos (Neuman; Logan, 1950; Bergman;
Loxley, 1963; Tinrat; Sila-Asna, 2017; Atma et al., 2018; Yuswan
et al., 2021), ou produtos derivados (Reis et al., 1999; Oliveira;
Oliveira, 2011), principalmente em amostras derivadas do
processamento de peixes (Sotelo et al., 2016; Duarte, 2017;
Zimermann et al., 2017), como também em medicamentos,
como os provenientes de espécies aquáticas (Oliveira et al.,
2021). Ressalta-se ainda que, a hidroxiprolina também já foi
encontrada de forma variável na elastina, sendo assim, sua
presença não é estritamente exclusivo do colágeno (Schmelzer;
Getie; Neubert, 2005; Stoilov et al., 2018).
Reis et al. (1999) utilizaram a técnica de dosagem de
hidroxiprolina para estimar o teor de colágeno presente em
produtos derivados cárneos de diferentes fontes industriais,
corroborando com a possibilidade de uso deste iminoácido na
identificação da presença de colágeno em produtos derivados
de origem animal.
Os colágenos fibrilares extraídos a partir de fontes de
organismos aquáticos (peixes teleósteos, peixes cartilaginosos
e invertebrados marinhos) possuem diferentes aminoácidos na
posição X e Y da tríade da proteína de colágeno (Gly-X-Y)
(Langrock; Hoffmann, 2019; Oliveira et al., 2021), formando
ligações de hidrogênio com as cadeias α dos colágenos
vizinhos (Huang et al., 2016; Stoilov et al., 2018).
134
A hidroxiprolina é formada pela oxidação do carbono
na posição gama do anel da prolina pirrolidina pela ação da
prolil hidroxilase usando ácido ascórbico (vitamina C) como
cofator (Stoilov et al., 2018). Vários protocolos foram realizados
para quantificar o conteúdo de hidroxiprolina (Stegemann, H.;
Stalder, 1967; Blumenkrantz; Asboe-Hansen, 1974; Huszar;
Maiocco; Naftolin, 1980; Hofman et al., 2011; Silva et al., 2015;
Naffa et al., 2016; Atma et al., 2018).
Blumenkrantz; Asboe-Hansen (1974) descreveram um
procedimento automatizado para um ensaio quantitativo de
hidroxiprolina. O procedimento foi baseado na oxidação da
hidroxiprolina pela cloramina-T em solução aquosa, e seu
produto reagindo com a solução reagente de Ehrlich, um
método considerado eficiente, simples, sensível, de fácil
reprodução e específico, sendo proposto para estudos do
metabolismo de moléculas colagenosas, como também para
uso laboratorial.
Sotelo et al. (2016) quantificaram a hidroxiprolina para
investigação da presença de moléculas colagenosas em rejeitos
de condríctios Nezumia aequalis, Chimaera monstrosa, Etmopterus
spp., Galeus spp., Scyliorhinus canicula e Leucoraja naevus e
observaram maior percentual na espécie Galeus spp. Huszar;
Maiocco; Naftolin (1980) estudaram o colágeno íntegro e os
fragmentos após hidrólise alcalina, quantificando os produtos
da oxidação através de métodos cromatográficos; seguindo
protocolo de alta resolução, Langrock; García-Villar;
Hoffmann (2007) analisaram isômeros de hidroxiprolina por
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE, do inglês High
performance liquid chromatography, HPLC) de fase reversa-
espectrometria de massa, enquanto a cromatografia líquida-
135
eletrospray foi utilizada por Naffa et al. (2016) para detecção
de amostras colagenosas.
Hofman et al. (2011) descreveram a quantificação da
hidroxiprolina usando método colorimétrico baseado na
reação de oxidação da Hyp com p-dimetilaminobenzaldeído.
Atma et al. (2018) relataram que um aumento no índice de
hidroxiprolina pode ser conseguido mantendo o material
proteico em hidrólise por até 4 horas. Intervalos de tempo
maiores a este tendem a acarretar em desnaturação do
material proteico. A hidroxiprolina é um iminoácido que
desempenha inúmeras funções no metabolismo fisiológico,
tais como (Li; Wu, 2018):
a) Síntese de glicina em vários tecidos de animais;
b) Manutenção da estrutura do tecido conjuntivo;
c) Regulação das reações oxidativas celulares;
d) Regulação da expressão gênica;
e) Eliminadores de oxidantes.
O método que será descrito neste capítulo é baseado na

colorimétrica, como forma de otimizar o processo durante as
atividades experimentais, sendo indicado para mensurar o
teor de colágeno, proposto por Stoilov et al. (2018), a partir de
modificações de trabalhos de anteriores, como o descrito por
Switzer; Summer (1971) e Huszar; Maiocco; Naftolin (1980). A
concentração de resíduos de hidroxiprolina é diferente entre as
diferentes fontes aquáticas (peixes teleósteos, cartilaginosos e
de invertebrados marinhos, como moluscos) e uma prospecção
a partir de espécies de peixes Neotropicais, como tilápias,
tambaquis, apaiaris, tucunarés, robalos, surubins, entre outros,
é altamente recomendado (Oliveira et al., 2021).
136
I. ATIVIDADE DE HIDROXIPROLINA
o Béquer;
o Microplaca de 96 poços;
o Pipetas automáticas;
o Ponteiras descartáveis;
o N-propanol (CH3CH2CH2OH);
o Cloramina-T;
o 4- (Dimetilamino) benzaldeído;
o Ácido perclórico (HClO4) a 70%;
o Ácido cítrico (C₆H₈O₇);
o Ácido acético glacial (CH₃COOH);
o Acetato de sódio (C2H3NaO2);
o Hidróxido de sódio (NaOH) 1 M;
o Estoque de hidroxiprolina 1mg/ml.
AMOSTRAS ANALISADAS
o Amostras de colágeno e de gelatina.
PROCEDIMENTO
A determinação de hidroxiprolina será realizada
segundo Stoilov et al. (2018).
Preparação de solução oxidante

 0,28 g cloramina T;
 2 ml de n-propanol;
137
 16 ml de tampão de citrato.
Preparação da solução de Erlich

 3,8 g de p-Dimetilaminobenzaldeído;
 14 ml de n-propanol;
 5,9 ml de ácido perclórico a 70%.
Preparação de soluções-padrão de hidroxiprolina

1- Em poços duplicados, adicionar 5, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,25 e 0
µl de estoque de hidroxiprolina;
2- Em seguida, adicionar água deionizada ou destilada
até atingir o volume de 25 µl em cada poço.
Quantificação de hidroxiprolina
1- Em microplaca de 96 poços, adicionar 25 µl de amostra
contendo entre 0,125 e 5 µg de hidroxiprolina (um
ensaio de teste inicial com várias diluições de amostra
típica poderá ser necessário para colocar as amostras
na faixa legível do ensaio);
2- Em seguida, adicionar o volume de 100 µl de solução
oxidante e incubar por 20 min, temperatura ambiente;
3- Após, adicionar 100 µl de solução de Erlich, incubando
novamente por 20 min, a 65°C;
4- Realizar leitura em espectrofotômetro, a 550 nm de
absorbância.
Observação:
Em todos os ensaios, os padrões utilizados serão expressos em quantidade
por poço, ou seja, micrograma de proteína ou hidroxiprolina por poço. A
quantidade de colágeno/gelatina na amostra original poderá ser calculada a
partir dos resultados do ensaio, dividindo a quantidade de proteína por
138fatores
poço pelo volume testado. O resultado deverá ser multiplicado por
de diluição de retorno ao volume após a hidrólise (400 µl) (Stoilov et al.,
2018).
ESQUEMATIZAÇÃO DO PROCESSO

139
Objetivo: Determinar o teor de hidroxiprolina em
amostras colagenosas e gelatinosas.
A partir dos resíduos descartados do processamento de peixes,

utilizar o colágeno e a gelatina obtidos para determinação de
hidroxiprolina.
1. Preparar as soluções oxidante e de Erlich de acordo com

passos metodológicos descritos neste capítulo;
2. Quantificar o teor de hidroxiprolina de amostras de

colágeno e/ou de gelatina obtidos a partir de resíduos
pesqueiros, segundo procedimentos descritos neste
capítulo;
3. Comparar os valores obtidos com os resultados expostos

na tabela 7.1 (Conteúdo de hidroxiprolina de organismos
aquáticos utilizando método colorimétrico);
140
Tabela 7.1 Conteúdo de hidroxiprolina de organismos aquáticos
utilizando método colorimétrico
Nome científico Subproduto/tratamento Conteúdo de Referência
Hidroxiprolina
Pangasius catfish Pele/antes da hidrólise 18,91a Atma et al.
(2018)
Pangasius catfish Pele/hidrólise de 4 horas 63,81a Atma et al.
(2018)
Pangasius catfish Pele/hidrólise de 6 horas 46,21 a Atma et al.
(2018)
Pangasius catfish Pele/hidrólise de 8 horas 37,64 a Atma et al.
(2018)
Oreochromis Pele/temperatura de 90ºC 30,91b Tinrat; Sila-Asna
niloticus (2017)
Oreochromis Osso/temperatura de 80ºC 21,45 b Tinrat; Sila-Asna
niloticus (2017)
Oreochromis Pele/temperatura de 90ºC 26,84 b Tinrat; Sila-Asna
mossambicus (2017)
Oreochromis Osso/temperatura de 80ºC 12,14 b Tinrat; Sila-Asna
mossambicus (2017)
Lates calcarifer Pele/temperatura de 90ºC 45,38 b Tinrat; Sila-Asna
(2017)
Lates calcarifer Osso/temperatura de 80ºC 23,28 b Tinrat; Sila-Asna
(2017)
Nezumia aequalis Pele/temperatura de 150ºC 36,47 b Sotelo et al.
(2016)
Chimaera monstrosa Pele/temperatura de 150ºC 31,03 b Sotelo et al.
(2016)
Etmopterus spp. Pele/temperatura de 150ºC 27,76 b Sotelo et al.
(2016)
Galeus spp. Pele/temperatura de 150ºC 37,10 b Sotelo et al.
(2016)
Scyliorhinus canicula Pele/temperatura de 150ºC 31,31 b Sotelo et al.
(2016)
Leucoraja naevus Pele/temperatura de 150ºC 27,43 b Sotelo et al.
(2016)
a (mg/ml); b(%)
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145
146
CONTEXTUALIZAÇÃO
A
digestão de nutrientes (proteínas, lipídeos,
carboidratos) realizada por espécies aquáticas,
especialmente de proteínas, pode ser afetada
por uma série de fatores, dentre os quais estão: idade,
tamanho, fase de desenvolvimento, hábito alimentar, entre
outros (Almeidaa et al., 2018). As características bioquímicas
das enzimas digestivas e os efeitos observados da dieta
artificial na fisiologia digestiva podem ser bons indicadores
para melhorar as estratégias de alimentação, como a
composição da dieta (Murashita et al., 2021).
As proteases (pepsina, tripsina, quimiotripsina,
colagenases, proteinases ácidas e alcalinas, catepsinas,
peptidases e outras) fazem parte de um grupo de enzimas com
funções relacionadas à clivagem de outras proteínas
(Sasidharan; Venugopal, 2020). Esse grupo de enzimas pode
ser obtido a partir de fontes microbianas (fúngicas, bacterianas
e virais), plantas e animais. Por serem altamente específicas,
são amplamente empregadas nos segmentos biomédicos e
terapêutico (Gurumallesh et al., 2019).
As proteases representam mais de 60% do mercado
global de enzimas, sendo aplicadas no processamento de
alimentos funcionais e bebidas nutritivas, indústrias de sabão
e detergentes, biofarmacêuticas e nutracêuticas, em processos
têxteis, tratamentos de esgotos, couro, na gestão de resíduos,
indústrias químicas, filmes fotográficos, biocombustíveis, na
produção de peptídeos bioativos (leite, colágeno, carne, etc.),
cuidados pessoais e cosméticos, além de algumas proteases
ainda assumirem papéis regulatórios no metabolismo
147
fisiológico (Aissaoui; Marzouki; Abidi, 2017; Gurumallesh et
al., 2019; Grand View Research, 2020).
As proteases são enzimas que podem ser produzidas
através de processos fermentativos (Fernandes et al., 2020), ou
extraídas de organismos aquáticos, como de espécie de peixes
(Bougatef, 2013; Oliveira et al., 2020) e de crustáceos (Oliveira
et al., 2019). Elas podem ser comercializadas em formulações
líquidas, pó liofilizado, granulares e/ou em preparados
gelatinosos. Os principais produtos proteolíticos de origem
animal são: renina, tripsina, pepsina, quimotripsina, trombina,
elastase, catepsina, entre outras (Grand View Research, 2020).
As vísceras descartadas de peixes são fontes ricas em
proteases alcalinas nas diferentes porções do trato digestivo e
órgãos anexos, já tendo sido recuperadas do estômago,
intestino delgado, cecos pilóricos, pâncreas e fígado, como
descritos na Tabela 8.1 (no final deste capítulo). Anati; Siti
Roha; Normah (2021) investigaram a atividade proteolítica de
vísceras digestivas do bagre africano (Clarias gariepinus) e
observaram aumento gradual conforme a etapa de
processamento: extrato bruto (263 U/mg), sulfato de amônio
(280 U/mg) e amostra dialisada (608 U/mg).
O intestino tem sido a porção do trato digestivo mais
empregado para a extração e aplicação de proteases alcalinas
(Bezerra et al., 2005), tais como enzimas com propriedades
colagenolíticas e fibrinolíticas (Oliveira et al., 2019), pepsinas
(Zhou et al., 2008), tripsinas (Oliveira et al., 2017) e
quimotripsinas (Hassaan et al., 2020). Espósito (2010) extraiu
proteases alcalinas de tambaqui (Colossoma macropomum) e de
carpa (Cyprinus carpio), principal espécie de peixe nativo e
segundo peixe exótico da aquicultura continental nacional,
148
respectivamente, e de carapeba prateada (Diapterus rhombeus) e
ariocó (Lutjanus synagris), peixes de grande importância para a
pesca.
As proteases extraídas do pescado se caracterizam
pelas suas características boa resistência e por apresentarem
alta atividade catalítica, fatores que potencializam seu uso nos
diversos ramos da biotecnologia (Espósito, 2006; Santos et al.,
2020). As proteases de organismos aquáticos adaptados a
ambientes quentes costumam se apresentar mais resistentes
termicamente do que as proteases de organismos adaptados
ao ambiente frio. Acredita-se, teoricamente, que isso resulte de
interações hidrofóbicas mais fortes na estrutura proteica (parte
interna) e, em alguns casos, por causa das diferenças no
número de pontes dissulfeto (Perera et al., 2020).
Para investigar a potencialidade da espécie aquática em
fornecer proteases alcalinas como matéria-prima, o primeiro
passo é realizar a detecção através de métodos analíticos
(Merino-Contreras et al., 2018). O método mais prático de
detecção de proteases alcalinas emprega a azocaseína, um
derivado cromogênico da caseína, como substrato inespecífico
e que se caracteriza pela coloração alaranjada (Espósito, 2010).
O reagente é sensível a radiação luminosa e por essa
razão deve ficar protegido de luminosidade. O ensaio é um
método inespecífico e realizado em microplacas de
microtitulação (Alencar et al., 2003), um método adaptado de
Leighton et al. (1973), o que tem facilitado e tornado mais
rápido os ensaios para a detecção de proteases alcalinas
provenientes dos resíduos pesqueiros. O princípio da técnica é
a degradação da azocaseína pelas proteases inespecíficas
149
presentes na solução, produzindo azopeptídeos solúveis em
ácido tricloroacético (C2HCl3O2) a 450 nm (Alencar et al., 2003).
I. DETERMINAÇÃO DE PROTEASES
o Azocaseína a 1% (p/v);
o Ácido tricloroacético (C2HCl3O2) a 10%;
o Hidróxido de sódio (NaOH);
o Tampão de reação (Tris-HCl 0,2M; pH 7,5).
o Eppendorf (2 ml);
o Centrifuga refrigerada;
AMOSTRAS ANALISADAS
o Amostras de peixes, crustáceos e moluscos.
150
PROCEDIMENTO
A determinação da atividade proteolítica será realizada
seguindo procedimentos metodológicos descritos por Alencar
et al. (2003). As atividades das proteases serão realizadas
usando azocaseína como substrato, utilizando microplacas e o
leitor ELISA.
Ensaio do branco
1- Em triplicata, utilizando tubos de Eppendorf de 2 ml,
30µl do tampão de extração;
2- Em seguida, adicionar 50µl de azocaseína a 1% (p/v),
preparado em Tris-HCl 0,2M pH 7,5, e deixar
incubando por 60 min, a temperatura ambiente (25 ºC).
Atenção: proteger da luminosidade;
3- Após a incubação, adicionar nos Eppendorf o volume
de 240µl de solução de ácido tricloroacético (TCA) 10%
(p/v), objetivando cessar a reação, aguardando por 15
minutos em repouso;
4- Em seguida, centrifugar os tubos de Eppendorf (10.000
RPM, durante 10 min);
5- Após centrifugação, pipetar 70µl do sobrenadante nos
poços da microplaca de microtitulação;
6- Por fim, adicionar em cada poço o volume de 130µl de
hidróxido de sódio (NaOH) 1 M. Posssui função
reveladora;
7- A leitura deverá ser realizada em leitor de microplaca a
450 nm de absorbância.
151
Ensaio da amostra
1- Em triplicata, utilizando tubos de Eppendorf de 2 ml,
30µl de extrato enzimático (bruto, pré-purificado com
solventes orgânicos e/ou com sais neutros);
2- Logo em seguida, adicionar 50µl de azocaseína a 1%
(p/v), preparado em Tris-HCl 0,2M pH 7,5, e deixar
incubando por 60 min, a temperatura ambiente (25 ºC).
Atenção: proteger da luminosidade;
3- Após a incubação, adicionar nos Eppendorf o volume
de 240µl de solução de ácido tricloroacético (TCA) 10%
(p/v), objetivando cessar a reação, aguardando por 15
minutos em repouso;
4- Em seguida, centrifugar os tubos de Eppendorf (10.000
RPM, durante 10 min);
5- Após centrifugação, pipetar 70µl do sobrenadante nos
poços da microplaca de microtitulação;
6- Por fim, adicionar em cada poço o volume de 130µl de
hidróxido de sódio (NaOH) 1 M. Possui função
reveladora;
7- A leitura deverá ser realizada em leitor de microplaca a
Uma unidade (U) de atividade enzimática será definida

como a quantidade de enzima para hidrolisar a azocaseína,
dando um aumento de 0,001 unidades de absorbância por
minuto (Alencar et al., 2003).
152

153
Objetivo: Quantificar o teor de proteases inespecíficas
em amostras de resíduos de pescado.
1. Determinar a atividade de proteases inespecíficas o extrato

bruto e dos materiais pré-purificados de acordo com
procedimento descrito neste capítulo;
2. Comparar os resultados obtidos na atividade prática com os

descritos na tabela 8.1 (Atividade proteolítica inespecífica de
organismos aquáticos).
154
Tabela 8.1 Atividade proteolítica inespecífica de organismos aquáticos
Nome Órgão Perfil de AE Referência
científico amostra (U/ml)
Cichla ocellaris Intestino Extrato bruto 1,92 Oliveira; Lino; Porto
(2020)
Cichla ocellaris Intestino Fracionamento 3,04 Oliveira; Lino; Porto
(2020)
Cichla ocellaris Intestino Partição trifásica 15,35 Oliveira; Lino; Porto
(2020)
Coryphaena Intestino Extrato bruto 6,6 Silva et al. (2020)
hippurus
Clupea harengus Intestino Extrato bruto 6,3 Silva et al. (2020)
Diapterus Intestino Extrato bruto 10,9 Silva et al. (2020)
rhombeus
Katsuwonus Intestino Extrato bruto 5,8 Silva et al. (2020)
pelamis
Mugil Liza Fígado Extrato bruto 1,1 Silva et al. (2020)
Mugil Liza Intestino Extrato bruto 12,4 Silva et al. (2020)
Pseudupeneus Fígado Extrato bruto 4,7 Silva et al. (2020)
maculatus
Pseudupeneus Mix Extrato bruto 1,7 Silva et al. (2020)
maculatus
Scomber Fígado Extrato bruto 4,5 Silva et al. (2020)
japonicus
Scomber Intestino Extrato bruto 2,8 Silva et al. (2020)
japonicus
Scomber Mix Extrato bruto 2,8 Silva et al. (2020)
japonicus
Seriola dumerili Fígado Extrato bruto 0,1 Silva et al. (2020)
Seriola dumerili Intestino Extrato bruto 7,5 Silva et al. (2020)
Oncorhynchus Vísceras internas Extrato bruto 0,35 Anderavi et al. (2019)
Mykiss
Oncorhynchus Vísceras internas Fracioamento 1,16 Anderavi et al. (2019)
Mykiss
Archosargus Intestino Extrato bruto 1,6 Merino-Contreras et al.
probatocephalus (2018)
Scorpaena Intestino Extrat bruto 138,0 Aissaoui; Marzouki;
notata Abidi (2017)
Scorpaena Intestino Fracionamento 152,7 Aissaoui; Marzouki;
notata Abidi (2017)
Pangasianodon Vísceras internas Extrato bruto 31,14 Ketnawa et al. (2014)
gigas
Pangasianodon Vísceras internas Partição trifásica 144,45 Ketnawa et al. (2014)
gigas6
Farfantepenaeus Hepatopâncreas Extrato bruto 6,49 Buarque et al. (2009)
155
paulensis
Osteoglossum Intestino + cecos Extrato bruto 0,135 López-Vásquez; Castro-
bicirrhosum pilóricos Pérez; Val (2009)
Oreochromis Intestino Extrato bruto 3,39 Bezerra et al. (2005)
niloticus
Pseudupeneus Intestino Extrato bruto 15,6 Alencar et al. (2003)
maculatus
Pseudupeneus Cecos pilóricos Extrato bruto 51,7 Alencar et al. (2003)
maculatus
Hoplias Intestino Extrato bruto 38,1 Alencar et al. (2003)
malabaricus
Hoplias Cecos pilóricos Extrato bruto 76,8 Alencar et al. (2003)
malabaricus
Caranx hippos Fígado Extrato bruto 92,2 Alencar et al. (2003)
Caranx hippos Intestino Extrato bruto 10,8 Alencar et al. (2003)
Caranx hippos Cecos pilóricos Extrato bruto 16,2 Alencar et al. (2003)
Cardisoma Hepatopâncreas Extrato bruto Bezerra et al. (2002)
guanhumi
AE: atividade específica; Mix: mistura de vísceras internas sem identificação.
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160
161
CONTEXTUALIZAÇÃO
B
ioquimicamente, a pepsina (EC 3.4.23.1) é a
principal enzima proteolítica presente no trato
gastrintestinal de animais, pertencente ao
grupo das aspartato-proteases, sendo produzida na sua forma
inativa, o pepsinogênio, pelas células principais das glândulas
oxínticas que estão localizadas no epitélio da parede estomacal
(Kageyama, 2002; Klomklao et al., 2007).
Os pepsinogênios são autocataliticamente ativados em
pepsinas sob condições ácidas, em que há a remoção de um
peptídeo de baixa massa molecular, liberando os segmentos de
ativação do terminal NH2 e transformando esse zimogênio na
enzima ativa (pepsina) (Rotta, 2003). Os pepsinogênios podem
agrupados em 5 categorias, a saber: pepsinogênio A,
pepsinogênio B, pepsinogênio F, progastricsina (pepsinogênio
C) e pró-quimosina, com estruturas primárias e propriedades
catalíticas diferenciadas entre si. Apenas os tipos A e C são
encontrados em peixes (Kageyama, 2002; Zhou et al., 2007;
Nalinanon; Benjakul; Kishimura, 2010; Cao et al., 2011).
As pepsinas de uma variedade de espécies aquáticas já
foram extraídas (tabela 9.1, no final deste capítulo), purificadas
e caracterizadas visando suas aplicações efetivas na indústria.
Biotecnologicamente, as proteases ácidas têm sido aplicadas
em numerosos processos de extração de colágeno (Nalinanon
et al., 2008), silagem de peixes, processamento do pescado,
fabricação de queijos, formulação de detergentes, em
procedimentos médicos (Zhao et al., 2011; Sholeh et al., 2019),
como antisséptico dentário e tratamento de algumas doenças
(dispepsia, gastralgia e alguns tipos de câncer, por exemplo).
162
Ainda, também já foi utilizada na indústria de ração animal
para aumentar a digestibilidade de proteínas. A pepsina suína
é usada no tratamento de úlceras gástricas e na coagulação do
leite para formar a coalhada, um importante processo na
indústria de laticínios. É considerada uma protease promissora
com ampla aplicação industrial de efeito eficiente se técnicas
eficazes para sua recuperação e purificação puderem ser
desenvolvidas (Kageyama, 2002; Klomklao et al., 2007;
Eisenmenger; Reyesde-Corcuera, 2009; Zhao et al., 2011; Zeng
et al., 2012; Oliveira; Bezerra; Assis, 2014).
A pepsina comercial disponibilizada é de origem suína.
Todavia, os resíduos dos recursos pesqueiros são fontes
promissoras e alternativas viáveis dessa biomolécula. Assim, a
etapa básica na prospecção é a detecção da atividade
enzimática em amostras gástricas levando em consideração a
anatomia e fisiologia das espécies aquáticas (Zhou et al., 2008;
Oliveira et al., 2017). A atividade da pepsina pode ser
determinada através de absorção de luz no espectrofotômetro,
tendo a hemoglobina como seu substrato (Oliveira; Bezerra;
Assis, 2014; Oliveira et al., 2017).
A pepsina extraída de espécies de peixes tem uma
ótima atividade catalítica com o pH em torno de 2, podendo
algumas espécies chegar a atingir sua eficiência até pH
próximo a 4. É uma endopeptidase, por atuar nas ligações
internas da cadeia, tendo papel importante na digestão
gastrintestinal de espécies peixes com hábitos carnívoros,
como a traíra (Hoplias malabaricus), o pintado (Pseudoplatystoma
corruscans), o dourado (Salminus maxillosus), por exemplo, por
iniciar o processo de desnaturação de proteínas ao atacarem as
ligações peptídicas no meio da cadeia, liberando peptídeos e
163
aminoácidos livres. Nos peixes herbívoros que possuem um
pH estomacal bastante ácido (entre 1 e 2), como é o caso das
espécies de tilápias (mossâmbica e nilótica), têm a capacidade
de decompor a clorofila (Rotta, 2003).
O pH e temperatura ótimas podem afetar de modo
significativo a propriedade catalítica da pepsina de peixes. O
pH ótimo é dependente da espécie, sendo encontrado na faixa
de 2,0 a 4,0, permitindo a desnaturação de proteínas (Oliveira;
Bezerra; Assis, 2014; Silva, 2019; Moraes; Almeida, 2020).
A temperatura ótima da pepsina obtida de peixes
teleósteos também vai variar conforme a espécie, encontrando-
se entre 30 a 55ºC, dependendo do habitat da espécie (Zhao et
al., 2011; Andrade et al., 2015). Já a temperatura da água de
criação (cultivo) parece não ter efeito efetivo sob a atividade
da pepsina, como demonstrado por Yúfera et al. (2019) quando
utilizaram o beijupirá (Rachycentron canadum) como modelo
biológico para esta avaliação. Em contrapartida, a alimentação
parece influenciar a ação enzimática, como demonstrado por
Busti et al. (2020) ao utilizarem a dourada (Sparus aurata) como
modelo biológico.
Sholeh et al. (2020) pré-purificaram com sulfato de
amônio pepsinas do estômago de várias espécies de peixes
teleósteos (Thunnus albacares, Katsuwonus pelamis e Euthynnu
affinis) e observaram maior atividade enzimática de 101,061
U/mg na albacora. Ainda, segundo os autores, a enzima com
maior atividade demonstrou condições ótimos na faixa de
temperatura entre 40 e 60°C e pH 2. Assim, pepsinas de peixes
apresentam propriedades físicas, químicas e catalíticas únicas
quando comparadas as proteases ácidas de mamíferos (Zhao
et al., 2011).
164
I. ATIVIDADE DE PEPSINA
o Hemoglobina a 2% (p/v) (substrato);
o Ácido tricloroacético (TCA a 50%);
o Tampão de reação (Glicina-HCl 0,1 M; pH 2,5);
o Eppendorf (2 ml);
o Cubeta para leitura no espectro;
o Ponteiras descartáveis.
AMOSTRAS ANALISADAS
o Amostras de estômago (peixes).
PROCEDIMENTO
A atividade de pepsina será determinada segundo
metodologia descrita por Nalinanon et al. (2010), fazendo uso
da hemoglobina como substrato.
Ensaio do branco
1- Em Eppendorf de 2 ml, adicionar 825µl de tampão de
reação, 200µl de hemoglobina a 2% e 200µl de água
destilada;
2- Em seguida, deixar incubando por 20 min, a 50 °C;
3- Após a incubação, adicionar aos Eppendorf o volume
de 200µl de ácido tricloroacético (TCA) a 50% (p/v),
165
visando cessar a reação, por um período de 1 hora, a 4
ºC;
4- Em seguida, os Eppendorf deverão ser centrifugados
(seguido de centrifugação a 15.000 x g, por 10 min);
5- Após o passo de centrifugação, o sobrenadante deverá
ser levado a cubeta de espectrofotômetro, com leitura a
Ensaio da amostra
1- Em Eppendorf de 2 ml, adicionar 200 µl de solução
enzimática, 200µl de hemoglobina a 2%, 200µl de água
destilada e 625µl de tampão de reação;
2- Em seguida, deixar incubando por 20 min, a 50 °C;
3- Após a incubação, adicionar aos Eppendorf o volume
de 200µl de ácido tricloroacético (TCA) a 50% (p/v),
visando cessar a reação, por um período de 1 hora, a 4
ºC;
4- Em seguida, os Eppendorf deverão ser centrifugados
(seguido de centrifugação a 15.000 x g, por 10 min);
5- Após o passo de centrifugação, o sobrenadante deverá
ser levado a cubeta de espectrofotômetro, com leitura a
280 nm de absorbância, para determinar o teor de
oligopeptídeos no sobrenadante.
Uma unidade (U) de atividade será definida como a

quantidade de produto que provocará um aumento de 1,0 na
absorvância a 280 nm por minuto. Pode ser fazer necessário
diluir a amostra para garantir que a quantidade de enzima não
seja excessiva para o substrato disponível no ensaio (Oliveira;
Bezerra; Assis, 2014).
166
PROCEDIMENTO ESQUEMATIZADO

167
Objetivo: Determinar a atividade de proteases ácidas
em amostras de resíduos de pescado.
1. Determinar a atividade de pepsina de amostras de extrato

bruto, pré-purificada com solventes orgânicos (etanol e
acetona) e com sais neutros a partir de resíduos pesqueiros
(seguir os protocolos descritos neste capítulo);
2. Comparar os resultados de atividade obtidos com os

descritos na tabela 9.1 (Proteases ácidas extraídas do
conteúdo estomacal de espécies aquáticas cultiváveis e/ou
selvagens);
3. Elaborar um texto dissertativo de 1 página sobre a atividade

enzimática obtida, correlacionando com a espécie fonte dos
resíduos, enfatizando hábito alimentar, importância na
produção pesqueira e potencialidade biotecnológica.
4. Explique o processo de conversão de pepsinogênio em

pepsina, incluindo: local de secreção, local de ativação e
condições necessárias para as reações bioquímicas.
168
Tabela 9.1 Proteases ácidas extraídas do conteúdo estomacal
de espécies aquáticas cultiváveis e/ou selvagens
Tipo de Atividade
Nome científico processamento específica Referência
(U/mg)
Bagre panamensis Extrato bruto 42,1 Osuna-Ruiz et al. (2019)
Archosargus Extrato bruto 2,39 Merino-Contreras et al. (2018)
probatocephalus
Paralichthys Extrato bruto 0,36 Candiotto et al. (2018)
orbignyanus
Thunnus albacares Extrato bruto 0,251 Pasaribu; Nurhayati;
Nurilmala (2018)
Nurilmala (2018)
Nurilmala (2018)
Pseudoplatystoma Extrato bruto 0,007 Andrade (2015)
corruscans
Micropterus salmoides Extrato bruto 3,6 Miura; Kageyama; Moriyama
(2015)
Lateolabrax japonicus Extrato bruto 4,0 Cao et al. (2011)
Lateolabrax japonicus Fracionamento 4,7 Cao et al. (2011)
Thunnus alalunga Extrato bruto 0,124 Nalinanon; Benjakul;
Kishimura (2010)
Thunnus alalunga Gel filtração S-200 0,257 Nalinanon; Benjakul;
Kishimura (2010)
Thunnus alalunga DEAE-celulose 10,8 Nalinanon; Benjakul;
Kishimura (2010)
Anguilla Anguilla Extrato bruto 2,3 Wu et al. (2009)
Anguilla anguilla Fracionamento 2,6 Wu et al. (2009)
Mustelus mustelus Extrato bruto 0,81 Bougatef et al. (2008)
Mustelus mustelus Fracionamento 3,02 Bougatef et al. (2008)
Mustelus mustelus Sephadex G-100 4,28 Bougatef et al. (2008)
Mustelus mustelus DEAE-celulose 7,68 Bougatef et al. (2008)
Siniperca chuatsi Extrato bruto 5,2 Zhou et al. (2008)
Latimeria chalumnae Extrato bruto 0,40 Tanji et al. (2007)
Latimeria chalumnae Fracionamento 0,88 Tanji et al. (2007)
Coryphaenoides Extrato bruto 4,33 Klomklao et al. (2007)
pectoralis
Sparus latus Extrato bruto 2,1 Zhou et al. (2007)
Sparus latus Fracionamento 3,0 Zhou et al. (2007)
169
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174
175
CONTEXTUALIZAÇÃO
C
omercialmente, as proteases que apresentam
como características alta atividade catalítica e
estabilidade em ampla faixa alcalina são as
mais desejáveis para aplicações industriais e biotecnológicas.
Neste cenário, vísceras de peixes, como intestino e cecos
pilóricos (quando presentes), por exemplo, tornam-se matéria-
prima promissora por serem fontes abundantes de proteases
alcalinas e que atendem a diversidade de necessidades físico-
químicas industriais (Espósito, 2010; Younes et al., 2015).
Uma das principais proteases alcalinas digestivas que
estão presentes nas vísceras de peixes é a tripsina (EC 3.4.21.4).
A tripsina é um membro de uma grande família de serino-
proteases, sendo responsável por vários processos biológicos,
como a digestão de proteínas dietéticas, clivando as ligações
éster e peptídica envolvendo os grupos carboxila da arginina e
da lisina, ativação do zimogênio e mediação entre a ingestão
de alimentos e a assimilação de nutrientes (Fuchise et al., 2009;
Freitas-Junior, et al., 2012; Poonsin et al., 2019; Jesús-de-La
Cruz et al., 2020).
Em vertebrados, a hidrólise do tripsinogênio é parte de
uma reação em cascata, na qual participam duodenase,
enteropeptidase, tripsinogênio e outros zimogênios (Sainz et
al., 2004). Tripsinas, ou serino-proteases que apresentaram
atividade catalítica semelhantes às tripsinas (enzimas-like), já
foram extraídas, purificadas, sequenciadas, caracterizadas e
utilizadas industrialmente a partir de uma grande variedade
de peixes (Freitas-Junior et al., 2012; França et al., 2016; Poonsin
et al., 2019), crustáceos (Kislitsyn et al., 2003) e moluscos (Balti
et al., 2009), como descritos na tabela 10.1 (parte final deste
176
capítulo). Essas enzimas se assemelham às tripsinas de
mamíferos em relação a sua massa molecular (entre 22 e 30
kDa), quanto a composição de aminoácidos e a sensibilidade
aos inibidores naturais e sintéticos (Zhou et al., 2013; Bougatef,
2013).
Estruturalmente, a maior parte das tripsinas pode ser
classificada em três grupos (I, II e III) com base na identidade
da sequência de aminoácidos. Os três grupos compartilham a
tríade catalítica de His, Asp e Ser (Jesús-de-La Cruz et al., 2018;
Sandholt et al., 2019). Numa apuração físico-química, a tripsina
de peixe é mais sensível à inativação por calor, baixo pH e
autólise do que a de análogos mesofílicos (costumam se
desenvolver entre 20 e 45 ºC) (Bougatef, 2013).
Senphan; Benjakul; Kishimura (2015) extraíram tripsina
da glândula intestinal (hepatopâncreas) de camarão branco do
Pacífico (Litopenaeus vannamei) com condições ótimas de pH e
temperatura de 8,0 e 60 ºC, respectivamente. Ainda, a tripsina
apresentou alto kcat, sinalizando alta capacidade de hidrólise,
tonando-a uma promissora para aplicações biotecnológicas. O
hepatopâncreas de camarão branco comumente serve como
uma fonte importante de proteases, especialmente de tripsina.
As proteases no hepatopâncreas podem ser recuperadas e
utilizadas nos segmentos biotecnológicos, o que favorece a
redução dos custos operacionais nesses segmentos (Senphan;
Benjakul; Kishimura, 2015).
Kislitsyn et al. (2003) avaliaram uma tripsina extraída
do hepatopâncreas de uma espécie de caranguejo (Paralithodes
camtschaticus) com homologia de 65% com a tripsina de
Penaeus vannamei. Moluscos também têm sido investigados
como fontes de tripsina. Balti et al. (2009) extraiu uma tripsina
177
termoestável do hepatopâncreas de um moluscos marinhos
(Sepia officinalis), além de manter-se estável em uma larga faixa
de pH (6,0-10,0).
Os resíduos da piscicultura também são descritos como
fontes potenciais. Freitas-Junior et al. (2012) extraíram uma
tripsina dos cecos pilóricos de pirarucu (Arapaima gigas) que
apresentou condições ótimas de pH (9,0) e temperatura (65ºC)
de interesse industrial. Segundo os autores, a enzima do
pirarucu permaneceu estável após 30 minutos de incubação
em uma ampla faixa de pH (6,0-11,5) e a 55°C. França et al.
(2016) isolaram uma peptidase alcalina termoestável a partir
de cecos pilóricos de beijupirá (Rachycentron canadum). Poonsin
et al. (2019) extraíram tripsina a partir do baço de uma espécie
de atum (Thunnus alalunga) resistente a uma ampla faixa de
pH e temperatura, além de resistente a condições salinas.
As demandas industriais estão cada vez mais voltadas
à busca por fontes alternativas, ao aumento da produtividade
das enzimas e ao desenvolvimento de novas tecnologias
visando aumentar a vida útil dessas enzimas nos bioprocessos
(Hassan et al., 2019). Leiros; Willassen; Smalås (2000)
compararam estruturalmente tripsinas psicrofílicas e
mesofílicas extraídas de peixes (peixes da Antártica e bacalhau
do Atlântico), demonstrando que enzimas de ambientes
diferentes podem apresentar particularidades. Assim, as
características físico-químicas das tripsinas de resíduos da
pesca e aquicultura as tornam uma matéria-prima viável para
aplicações industriais, como processamento de alimentos que
requerem baixas temperaturas durante a produção. Ainda, as
tripsina de peixes tendem a ser mais estáveis em pH alcalino e
perdem sua estabilidade em condições ácidas (Bougatef, 2013).
178
Outro uso recorrente da tripsina de pescado tem sido sua
utilização como aditivo em detergentes comerciais (Espósito et
al., 2010; Santos et al., 2020).
I. ATIVIDADE DE TRIPSINA
o Nα-benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide-BApNA 8 mM;
o Tampão de reação (Tris-HCl 0,1 M; pH 8,0);
o Sulfóxido de dimetilo (DMSO) (diluidor do BApNA).
o Béquer de vidro;
o Micropipeta automática;
AMOSTRAS ANALISADAS
o Intestino de peixes;
o Cecos pilóricos (quando presentes) de peixes;
o Glândulas digestivas de moluscos;
o Glândulas digestivas de crustáceos.
PROCEDIMENTO
A atividade de tripsina será determinada segundo
metodologia descrita por Bezerra et al. (2005), fazendo uso do
BApNA como substrato.
179
Ensaio do branco
1- Em uma microplaca de microtitulação, adicionar em
triplicata de poços, o volume de 140µl de tampão Tris-
HCl pH 8,0 0,1 M;
2- Em seguida, adicionar o volume de 30µl de água
destilada;
3- Por fim, adicionar o volume de 30µl do substrato
(BApNA 8 mM), dissolvido em DMSO;
4- Aguardar 15 minutos em repouso, temperatura
ambiente (± 25 ºC);
5- Levar para leitura em espectrofotômetro, a 405 nm de
absorbância, para observação da liberação do produto
(p-nitroanilina).
Ensaio da amostra
1- Em uma microplaca de microtitulação, adicionar em
triplicata de poços, o volume de 140µl de tampão Tris-
HCl pH 8,0 0,1 M;
2- Logo em seguida, adicionar o volume de 30µl do
extrato enzimático;
3- Por fim, adicionar o volume de 30µl do substrato
(BApNA 8 mM), dissolvido em DMSO;
4- Aguardar 15 minutos em repouso, temperatura
ambiente (± 25 ºC);
5- Levar para leitura em espectrofotômetro, a 405 nm de
absorbância, para observação da liberação do produto
(p-nitroanilina).
A atividade específica deverá ser expressa em unidades

por miligrama de proteína (Silva, 2009; Campeche et al., 2018).
180
PROCEDIMENTO ESQUEMATIZADO

181
Objetivo: Determinar a atividade de tripsina em
amostras de resíduos de pescado.
1. Determinar a atividade de tripsina do extrato bruto e das

amostras pré-purificadas com solventes orgânicos (etanol e
acetona) e por sais neutros, conforme descrito neste livro de
protocolos;
2. Comparar os resultados de atividade enzimática de tripsina

com os descritos na tabela 10.1 (Atividade de tripsinas
extraídas a partir de resíduos de organismos aquáticos);
3. Ainda, com os resultados da execução do protocolo de

tripsina, elaborar um texto com os resultados obtidos,
destacando os seguintes aspectos:
> Espécie(s) utilizada(s) na atividade prática
(enfatizando seu hábitat e hábito alimentar);
> Comente sobre as possíveis aplicações da tripsina
extraída de peixes, sinalizando as possibilidades com
a espécie-alvo da aula prática;
> Descreva o processo de conversão do tripsinogênio
em tripsina, incluindo local de síntese, conversão e
forma de atuação.
> Explique o motivo de a tripsina ser tão importante
para outras enzimas.
182
Tabela 10.1 Atividade de tripsinas extraídas a partir de
resídos de organismos aquáticos
Nome científico Órgão Tipo de Amostra AE Referência
(U/mg)
Coryphaena hippurus Intestino Extrato bruto 173,1 Santos et al. (2020)
Coryphaena hippurus Intestino Fracionamento 517,3 Santos et al. (2020)
Tribolodon Intestino Extrato bruto 0,7 Kanno et al. (2019)
hakonensis
Tribolodon Intestino Sephacryl S-200 2,0 Kanno et al. (2019)
hakonensis
Tribolodon Intestino Sephadex G-50 47,0 Kanno et al. (2019)
hakonensis
Tribolodon Intestino DE-52 96,0 Kanno et al. (2019)
hakonensis
Acanthopagrus latus Vísceras Extrato bruto 0,96 Namjou et al. (2019)
internas
Thunnus alalunga Baço Extrato bruto 1,52 Poonsin et al. (2019)
Archosargus Intestino Extrato bruto 4,45 Merino-Contreras
probatocephalus et al. (2018)
Pseudoplatystoma Intestino Extrato bruto 0,59 Campeche et al.
fasciatum x Leiarius (2018)
marmoratus1
marmoratus2
marmoratus3
marmoratus4
Paralichthys Fígado Extrato bruto 0,03 Candiotto et al.
orbignyanus (2018)
Oreochromis Intestino Extrato bruto 0,2 Alves et al. (2017)
niloticus
Oreochromis Intestino Imobilizada 12,3 Alves et al. (2017)
niloticus
Seriola dumerili Intestino Extrato bruto 1,46 Oliveira et al. (2017)
Rachycentron Cecos pilóricos Extrato bruto 0,55 França et al. (2016)
canadum
Rachycentron Cecos pilóricos Fracionamento 2,09 França et al. (2016)
canadum
Rachycentron Cecos pilóricos BPTI-Sepharose 28,01 França et al. (2016)
canadum
Raja clavata Intestino Extrato bruto 0,87 Lassoued et al.
(2015)
183
Farfantepenaeus Hepatopâncreas Extrato bruto 1,33 Senphan; Benjakul;
paulensis Kishimura (2015)
Farfantepenaeus Hepatopâncreas Fracionamento 2,54 Senphan; Benjakul;
paulensis Kishimura (2015)
Aluterus monoceros Cecos pilóricos Extrato bruto 0,23 Zamani; Benjakul
(2015)
Aluterus monóceros Cecos pilóricos Fracionamento 1,86 Zamani; Benjakul
(2015)
Aluterus monoceros Cecos pilóricos Sepharose 4B 6,08 Zamani; Benjakul
(2015)
Cirrhinus mrigala Vísceras Extrato bruto 0,08 Khangembam;
internas Chakrabarti (2015)
Cirrhinus mrigala Vísceras Fracionamento 0,99 Khangembam;
Cirrhinus mrigala Vísceras Diálise 1,01 Khangembam;
Cirrhinus mrigala Vísceras DEAE-celulose 1,23 Khangembam;
Cirrhinus mrigala Vísceras Benzamidina 3,07 Khangembam;
Oreochromis Intestino Extrato bruto 7,52 Zhou et al. (2013)
niloticus
Litopenaeus Hepatopâncreas Extrato bruto 13,13 Andrade (2012)
vannamei
Arapaima gigas Cecos pilóricos Extrato bruto 0,37 Freitas-Junior et al.
(2012)
Diapterus rhombeus Porções Extrato bruto 1,81 Silva et al. (2011)
intestinais
Lithognathus Vísceras Extrato bruto 0,42 El-Hadj Ali et al.
mormyrus internas (2011)
Farfantepenaeus Hepatopâncreas Extrato bruto 5,13 Buarque et al.
paulensis (2009)
Gadus macrocephalus Cecos pilóricos Extrato bruto 0,72 Fuchise et al. (2009)
Gadus macrocephalus Cecos pilóricos Sephacryl S-200 0,28 Fuchise et al. (2009)
Gadus macrocephalus Cecos pilóricos Sephadex G-50 24,0 Fuchise et al. (2009)
Eleginus gracilis Cecos pilóricos Extrato bruto 0,64 Fuchise et al. (2009)
Eleginus gracilis Cecos pilóricos Sephacryl S-200 2,1 Fuchise et al. (2009)
Eleginus gracilis Cecos pilóricos Sephadex G-50 18,0 Fuchise et al. (2009)
Colossoma Cecos pilóricos Extrato bruto 5,24 Bezerra et al. (2007)
macropomum
Colossoma Cecos pilóricos Extrato aquecido 8,47 Bezerra et al. (2007)
macropomum
Colossoma Cecos pilóricos Fracionamento 58,44 Bezerra et al. (2007)
macropomum
Colossoma Cecos pilóricos Sephadex G-75 268,7 Bezerra et al. (2007)
macropomum
184
Sardinops sagax Cecos pilóricos Extrato bruto 0,5 Castillo-Yáñez et al.
caerulea (2005)
Sardinops sagax Cecos pilóricos Fracionamento 0,65 Castillo-Yáñez et al.
caerulea (2005)
Sardinops sagax Cecos pilóricos Gel filtração 1,7 Castillo-Yáñez et al.
caerulea (2005)
Sardinops sagax Cecos pilóricos Afinidade 2,4 Castillo-Yáñez et al.
caerulea (2005)
Sardinops sagax Cecos pilóricos Troca iônica 6,5 Castillo-Yáñez et al.
caerulea (2005)
Symphysodon Intestino Extrato bruto 0,79 Chong et al. (2002)
aequifasciata
AE: Atividade específica. *Animais alimentados com diferentes níveis de proteínas:
lipídeos: 1(9,00), 2(4,60), 3(3,54), 4(1,78).
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191
192
193
194
195
196
197
198
199
200
201
202
A
absorção de ultravioleta- aquicultura, 148
UV, 55 Aquicultura, 15
Absorção-UV, 55 Arapaima gigas, 178
acetona, 36 Arginina, 17
Ácido aspártico, 17 Ariocó, 58
ácido bicinconínico, 59 astaxantina, 19
Ácido bicinconínico-BCA, Astaxantina, beta-caroteno,
55 zeaxantina e luteína, 19
Ácido glutâmico, 17 atividade catalítica, 176
Ácidos graxos poli- atividade de pepsina, 165
insaturados, 17 atividade proteolítica, 148
águas-vivas, 96 azocaseína, 149
Água-viva, 106
Alanina, 17 B
Albacora, 88
Bacalhau, 87
Alcalase, 88
Bagre panamensis, 69
almofariz (gral), 33
Balistes capriscus, 125
Aminoácidos, 17, 22
barbatanas, 31
aminoácidos livres, 164
Beneficiamento, 25
Anatomia de peixe
beta-caroteno, 20
teleósteo, 16
bexiga natatória, 31
anêmonas-do-mar, 95
Bexiga natatória, 107
aproveitamento
biomolécula-alvo, 31
biotecnológico, 34
Biomoléculas, 21
203
biomoléculas proteicas células, 32
teciduais, 32 Centrifugação, 32, 34
bioquímica, 20 Centropomus undecimalis,
Bioquímica, 15, 16, 21 58, 97
Biotecnologia, 23 Cérebro, 58
biotecnológicas, 176 Chiloscyllium punctatum,
biureto, 55 107
Biureto, 55 Chimaera monstrosa, 135
Bradford, 55, 58, 60 chocos, 96
branqueamento, 99 Cichla ocellaris, 58
Brânquias, 58 Ciências Agrárias, 15
butanol, 36 Ciências Biológicas.
Consulte
C cisteína, 57
cistina, 57
cabeça, 31
colágeno, 94
cabeça do camarão, 81
colágeno de peixes, 97
cabeças de camarão, 78
colágeno do Tipo I, 96
Cálcio, 19
Colágeno e Gelatina, 19
Camarão rosa, 59
colágenos, 114
Camarão-branco, 59
Colossoma macropomum, 59
Características dos tipos de
Complexo B, 18
gelatina, 117
concentração de sais, 36
caranguejo, 177
Condroitina, 19
Caranx crysos, 68
contração do músculo, 54
Caranx hippos, 156
Copepódo, 59
carboidratos, 147
Coprodutos, 25
Carboidratos, 19, 22
corais, 95
carcaça, 57
corante azul brilhante de
Cartilagem, 107
Coomassie G250, 57
catepsina, 148
Coryphaena hippurus, 68
cauda, 31
Crassostrea rhizophorae, 58
cecos pilóricos, 31, 32, 57,
crustáceos, 20, 176
148, 178
Cynoscion leiarchus, 58
Cecos pilóricos, 59
204
D estrelas-do-mar, 95
estromais, 54
descartes, 31
etanol, 36
desnaturação proteica, 34
Etapa de desmineralização,
determinação de
121
hidroxiprolina, 137
Etapa de hidrólise ácida e
digestão de nutrientes, 147
alcalina, 121
digestão gastrintestinal, 163
Etmopterus spp.,, 135
dosagem de proteínas, 57
extração da gelatina, 118
dosagem de proteínas do
Extração da gelatina, 122
pescado, 64
extração de colágeno, 98
Dourado, 68
extração de proteínas, 32
extrato bruto, 32, 35
E Extrato bruto, 23
elastase, 148 Extrato pré-purificado, 24
encefalopatia espongiforme
transmissível, 94 F
endopeptidase, 163
fabricação de gelatina, 114
Engenharia de Pesca, 15
Farfantepenaeus paulensis, 59
ensaio quantitativo de
Farfantepenaeus subtilis, 59,
hidroxiprolina, 135
81
enzima proteolítica, 162
febre aftosa, 94
enzimas, 54, 148, 177
fenilalanina, 57
Enzimas, 20, 22
Fenilalanina, 17
Enzimas digestivas, 81
Ferro, 19
enzimas proteolíticas, 81
fígado, 31, 32, 57, 148
escamas, 31, 54, 57
filé, 54
espécies aquáticas, 134, 163
filetagem, 54
espécies de peixes
Filtração, 34
gástricas, 20
fisiologia digestiva, 147
esponjas, 95
Fontes aquáticas de
estomacal, 162
colágeno, 96
estômago, 31, 32, 57, 148
força do gel, 118
Estômago, 58
fracionamento, 36
205
Fracionamento com hidroxiprolina, 94, 116, 134,
solvente, 35 135, 136
fragmentos de membranas histidina, 57
celulares, 32 Histidina, 18
Gadus chalcogrammus, 126 homogeneização, 34
Gadus morhua, 87 Homogeneização, 32
gelatina, 114 homogeneizado, 32
gelatina de peixes, 116 homogeneizador, 34
Gelatinas, 116
gelificação, 117 I
Glândulas do intestino
iminoácido, 136
médio, 58
instrumentos, 15
Glicina, 17
intestino, 31, 32, 148
glicosaminoglicanos
Intestino, 58
heparina-símile, 78
intestino delgado, 148
Glutamina, 17
intestinos, 57
Guarajuba, 68
invertebrados marinhos, 95
Iodo, 19
H Isolamento de colágeno
hábito alimentar, 147 solúvel em ácido (ASC),
hábitos carnívoros, 163 102
hemoglobina, 165 Isolamento de colágeno
hepatopâncreas, 177 solúvel em pepsina
hidrolisado gelatinoso, 116 (PSC), 103
hidrolisado proteico, 77 Isoleucina, 18
hidrolisado proteico de
peixe, 78 L
hidrolisado proteico de
Labeo rohita, 125
peixe (HPP), 79
Leucina, 18
hidrolisados, 19
Leucoraja naevus, 135
hidrolisados proteicos, 54
ligação peptídica, 57
hidrólise enzimática, 80
Lipídeo, 23
hidrólise proteolítica, 80
lipídeos, 147
206
Lipídeos, 19 Minerais, 17, 19
Lisina, 18 miofibrilares, 55
Litopenaeus vannamei, 58, 81, moléculas colagenosas, 94
177 moluscos, 176
Loligo formosana, 125 Moluscos, 177
Lowry, 55 músculo, 57
lulas, 96 Músculo, 58
luteína, 20
Lutjanus synagris, 58 N
Nezumia aequalis, 135
M
maceração, 32 O
Maceração, 32
Ômega-3, 17
Macrobrachium carcinus, 58
Ômega-6, 17
macromolécula proteica, 94
Oreochromis mossambicus,
macromoléculas biológicas,
125, 141
54
Oreochromis niloticus, 58, 87,
material colagenoso, 134
141, 156
matéria-prima, 31, 35
órgãos internos,, 31
Matéria-prima, 23
osagem de hidroxiprolina,
Matéria-prima
134
biotecnológica, 16
ossos, 31, 54
matéria-prima pesqueira,
Osteoglossum bicirrhosum,
37
156
matérias-primas, 114
Ostra de mangue, 58
matriz extracelular, 94
oteínas, 22
Merluccius merluccius, 87
ouriços-do-mar, 95
mesentério, 31
metionina, 57
Metionina, 18 P
métodos pâncreas, 148
espectrofotométricos, 55, Pangasianodon gigas, 116,
57 155
mexilhões, 96 Pangasius sp., 106
207
Paralithodes camtschaticus, Preparação da solução de
177 Erlich, 138
Peixe Cartilaginoso, 107 Preparação de solução
Peixe teleósteo, 107 oxidante, 137
peixes, 176 Preparação de soluções-
Peixes Agástricos, 24 padrão de
Peixes carnívoros, 24 hidroxiprolina, 138
Peixes herbívoros, 24 pré-purificado, 37
Peixes onívoros, 24 Pré-tratamento da gelatina,
pele, 31, 54, 57 120
Pele, 107 Probarbus jullieni, 107
pepinos-do-mar, 95 Processamento, 25
pepsina, 148, 162 processamento de peixes,
pepsina comercial, 163 31
pepsinas de peixes, 164 processamento do pescado,
pepsinogênios, 162 54, 78, 162
peptidase alcalina processo de extração, 99
termoestável, 178 processos fermentativos,
peptídeos, 97 148
Peptídeos Bioativos, 19 produção de gelatina, 115
Pescada branca, 58 produtos naturais, 78
Pescada do Atlântico, 87 progastricsina, 162
pescado, 31 prolina, 94, 116
Pescado, 23 Prolina, 18
pH, 36 pró-quimosina, 162
pirarucu, 178 proteases, 147, 148, 176
piscicultura, 20, 178 proteases ácidas, 162
Pitu ou camarão-d'água- proteases alcalinas, 176
doce, 58 proteases bacterianas, 147
polvos, 96 proteases de organismos
Precipitação salina, 35 adaptados ao ambiente
Preparação da curva frio, 149
padrão de soroalbumina proteases de organismos
bovina (BSA), 61 aquáticos, 149
208
proteases fúngicas, 147 resquícios de músculos, 31,
proteases virais, 147 54
proteínas, 32, 36, 54, 57, 147 restrições sanitárias, 95
Proteínas, 19 Reutilização de resíduos
proteínas alcalinas, 55 pesqueiros, 16
proteínas bioativas, 78 Rhopilema esculentum, 106
proteínas do pescado, 55 Robalo-flecha, 58
Pseudoplatystoma fasciatum rompimento, 32
× Leiarius marmoratus, 58 rompimento celular, 32
purificação, 34
S
Q Sala de aula, 15
Quantificação de sarcoplasmáticas, 54
hidroxiprolina, 138 Scomber japonicus, 106
quimotripsina, 55, 148 Scorpaena notata, 155
quitina, 20 Sedmak, 58
Quitina e Quitosana, 19 semipermeável, 37
semi-purificação, 34
R separação, 36
Sepia officinalis, 178
Reagente de Bradford, 61
Serina, 18
recursos pesqueiros, 31
serino-proteases, 176
Rejeitos, 25
Seriola dumerili, 155
remoção das proteínas
Smith, 55, 58
solúveis, 101
solubilidade, 36
rendimento, 100
subprodutos, 77
rendimento da extração da
Subprodutos, 25
gelatina, 119
Subprodutos de robalo-
renina, 148
flecha, 97
Resíduos, 25, 54
subprodutos do
resíduos do
processamento de peixes,
processamento, 77, 80
115
resíduos pesqueiros, 31
209
subprodutos do tripsinas psicrofílicas, 178
processamento do tripsinogênio, 176
camarão, 81 triptofano, 57
sulfato de amônia trombina, 148
[(NH4)2SO4], 36 Tucunaré, 58
Surubim híbrido, 58
V
T Valina, 18
Tambaqui, 59 vísceras descartadas de
tecidos, 32 peixes, 148
técnicas de extração de vísceras internas, 54, 57
colágeno, 99 viscosidade, 117
temperatura, 36 Vitamina A, 18
tendão, 114 Vitamina D, 18
Thunnus albacares, 88 Vitaminas, 17, 18
Thunnus obesus, 106
Tilápia-do-Nilo, 58
tirosina, 57 Z
Tirosina, 18 zeaxantina, 20
Trato digestivo, 58 zimogênio, 162, 176
Treonina, 18 Zinco, 19
tripsina, 55, 148, 176
tripsinas, 177
210
211
212
212

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Vagne de Melo Oliveira

Ranilson de Souza Bezerra

Bioquímica & Biotecnologia

Volume I: Bioquímica com ênfase na

Volume II: Biotecnologia com ênfase na

Bioquímica & Biotecnologia

Créditos de imagens (Capa | Contracapa |Protocolos |Ilustrações)

Este livro não pode ser comercializado em parte, ou na sua totalidade,

Este livro faz parte do trabalho desenvolvido com aporte financeiro

Editora Universitária da UFRPE

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3. Pré-purificar os extratos selecionados através da

4. Pré-purificar os extratos brutos (EB) produzidos nas

Quadro 3.1 Métodos espectrofotométricos para a

Figura 3.1 Princípios, vantagens e desvantagens de métodos

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Tabela 3.1 Principais métodos utilizados para avaliar o teor de

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Preparação da curva padrão de soroalbumina bovina (BSA)

Tabela 3.2 Curva de calibração 0-1000 (µg/ml)

Equação da reta da curva de albumina:

Fonte: Própria. Criada no software Diagram. Imagens:

1. Preparar reagente de Bradford seguindo metodologia

2. Elaborar uma curva de calibração da solução de Bradford

3. Quantificar o teor de proteínas totais de amostras de

4. Comparar os resultados obtidos nas atividades práticas

Preparação de extrato bruto

Dosagem da atividade de proteases alcalinas

Produção de hidrolisado proteico

A atividade enzimática digestivas de organismos aquáticos difere

1. Preparar hidrolisado de resíduos do pescado de acordo

2. Comparar a atividade enzimática com diversos extratos

3. Comparar o rendimento de hidrolisado proteico obtido a

Quadro 5.1 Principais características dos colágenos extraídos