Roteiro de Práticas de Laboratório de Bioquímica

ROTEIROS DE
PRÁTICAS DE
LABORATÓRIO
DE BIOQUÍMICA
Universidade Federal de Viçosa
Reitor Demetrius David da Silva

Vice-Reitora Rejane Nascentes
Pró-Reitor de Extensão e Cultura José Ambrósio Ferreira Neto
Diretor da Editora UFV Derly José Henriques da Silva
Conselho Editorial Alexandre Santos Brandão (Presidente),
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Maria Carmen Aires Gomes, Rodrigo
Siqueira Batista
A Editora UFV é filiada à
Associação Brasileira das Editoras Asociación de Editoriales Universitarias de

Universitárias América Latina y el Caribe
Pollyanna Amaral Viana
Gabriel Angelo Saraiva Raimundo
Bruno Paes de Melo
Renato Sílvio Siqueira

ROTEIROS DE
PRÁTICAS DE
LABORATÓRIO
DE BIOQUÍMICA
Universidade Federal de Viçosa

2022
2022 by Pollyanna Amaral Viana, Gabriel Angelo Saraiva Raimundo, Bruno Paes de
Melo e Renato Sílvio Siqueira
Direitos de edição reservados à Editora UFV.
Todos os direitos reservados. Nenhuma parte desta publicação pode ser reproduzida,
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detentor dos seus direitos de edição.
Impresso no Brasil
Ficha catalográfica elaborada pela Seção de Catalogação e Classificação da

Biblioteca Central da Universidade Federal de Viçosa - Campus Viçosa
Roteiro de práticas de laboratório de bioquímica [recurso eletrônico]
R842 / Pollyanna Amaral Viana… [et al.] -- Viçosa, MG : Ed. UFV, 202
2022 1 livro eletrônico (123 p. ) ; il. algumas color. -- (Didática)
Referências: p. 121-122
Disponível em: https://www.editoraufv.com.br/
ISBN: 978-65-5925-055-4
1. Bioquímica - Manuais de laboratório. I. Viana, Pollyanna
Amaral, 1976-. II. Raimundo, Gabriel Angelo Saraiva, 1996-. III.
Melo, Bruno Paes, 1992- . IV. Siqueira, Renato Sílvio, 1986-. V.
Série.
CDD 572
Bibliotecária responsável: Renata de Fátima Alves – CRB6/2578
Capa: Miro Saraiva
Revisão linguística: Constança Bezerra Albino Chaves e Leonardo Vinícius Macedo Pereira
Diagramação: Frederico Luiz Ribeiro Fontes
Impressão e acabamento: Divisão Gráfica da Editora UFV
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Sumário
Apresentação, 7
Roteiro 1 – Procedimentos laboratoriais, 9
Roteiro 2 – Soluções, 23
Roteiro 3 – Carboidratos: caracterização baseada na produção de

furfural e hidroximetilfurfural, 28
Roteiro 4 – Carboidratos: caracterização baseada nas propriedades

redutoras, 40
Roteiro 5 – Lipídeos: caracterização, 48
Roteiro 6 – Ácidos nucleicos: extração e identificação, 58
Roteiro 7 – Titulação potenciométrica de aminoácidos, 65
Roteiro 8 – Separação e identificação de aminoácidos por

cromatografia em papel, 72
Roteiro 9 – Separação e identificação de aminoácidos por eletroforese

em papel, 81
Roteiro 10 – Estudo da solubilidade de proteínas, 87
Roteiro 11 – Dosagem de proteínas do leite por espectrofotometria, 96
Roteiro 12 – Estudo da polifenoloxidase (PFO), 110
Roteiro 13 – Estudo da hidrólise do amido, 116
Referências, 121
APRESENTAÇÃO
A Bioquímica é a ciência que estuda as biomoléculas e suas
relações, ou seja, moléculas envolvidas com a formação e a viabilidade
da célula. Neste contexto, aspectos estruturais e funcionais são
importantes para entendermos como estas estruturas estão envolvidas
com os mecanismos de transformação ou metabolismo, permitindo a
adaptação da célula ao ambiente.
As principais biomoléculas são os carboidratos, os lipídeos, as
proteínas, os ácidos nucléicos e as enzimas. Com base em suas
propriedades químicas, alguns experimentos podem ser feitos de forma
a caracterizar as biomoléculas e ajudar a compreender suas ações na
célula. A Bioquímica permite observar como a versatilidade das
biomoléculas é determinante para a formação da célula.
Dessa forma, nesta Série Didática realizaremos alguns
experimentos para determinar características estruturais e funcionais
das principais biomoléculas, a fim de facilitar o aprendizado da
bioquímica.
Roteiros de Práticas de Laboratório de Bioquímica 9
ROTEIRO 1
PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS
Introdução
Durante a realização das práticas no Laboratório de
Bioquímica, os alunos deverão seguir algumas orientações importantes:
x Manter o asseio do ambiente laboratorial e realizar a limpeza das
vidrarias e bancadas após o uso.
x Estar atento à voltagem dos equipamentos antes de ligá-los à rede.
x Não consumir alimentos, bebidas e cigarros no laboratório.
x Evitar derramar reagentes nas balanças e limpá-las após o uso.
x Não utilizar a mesma vidraria para verter diferentes reagentes.
x Identificar corretamente as soluções após o preparo (nome,
concentração e data).
x Ao utilizar o bico de Bunsen, não abra a torneira do gás antes de
ter à mão a chama que deve acendê-lo. Após o uso, para evitar
acidentes, verificar se as torneiras do gás estão bem fechadas.
x Ler os rótulos dos reagentes antes do uso e não restituí-los aos
frascos em caso de sobras.
x Pipetar reagentes líquidos com o pipetador de sucção.
x Evitar tocar, cheirar ou manusear produtos que tenham
derramado ou extravasado de algum recipiente, pois existem no
laboratório substâncias tóxicas.
x Os descartes deverão ser feitos em locais apropriados.
x Ao manipular alguma vidraria com solução aquecida, direcionar
a boca desta de modo a não atingir a si e os demais alunos em
caso de ejeção do líquido ࡳ o que pode decorrer de agitações,
mudanças bruscas de pressão e choques térmicos.
10 Viana, Raimundo, Melo e Siqueira
x Diluir ácidos ou álcalis fortes sempre na água e nunca o inverso,

pois a consequente reação exotérmica pode gerar acidentes.
x Averiguar com o instrutor ou professor caso queira desenvolver
experiências paralelas ao roteiro da aula prática.
x Não aquecer vidrarias de precisão (consulte o item Vidrarias para
medição precisa de volumes).
x Manipular somente na capela de exaustão os reagentes tóxicos,
voláteis ou corrosivos.
x Deixar bolsas, mochilas e outros pertences dentro do armário na
entrada do laboratório.
x Lavar bem as mãos ao término das aulas práticas.
x Usar sempre no laboratório jaleco, sapato fechado, calça
comprida e óculos de proteção.
x Seja pontual, uma vez que é importante para a boa condução dos
trabalhos. É tolerado um atraso de 10 minutos após o início da
aula prática.
Obs.: De acordo com a legislação vigente há um limite de faltas de 25%
para esta disciplina. Acima disso, o aluno será reprovado por faltas
(Conceito L).
Objetivo geral
A disciplina Laboratório de Bioquímica tem como objetivo
fazer com que o aluno aprenda a manipular equipamentos e vidrarias
de rotina no laboratório, compreenda as propriedades físico-
químicas das biomoléculas (carboidratos, lipídeos, proteínas, ácidos
nucleicos e enzimas) e saiba interpretar e discutir os resultados
experimentais.
Material individual
Roteiro das aulas práticas; calculadora científica; lápis; pincel
para identificação de vidrarias; borracha; régua; equipamento de
proteção individual (EPI), como óculos de proteção e jaleco; sapato
fechado; calça comprida.
Materiais e equipamentos comuns em

laboratório
Utensílios continentes de volumes
1) Béquer: de vidro pirex (ou borossilicato) ou plástico com
diversas capacidades, encontrado nos formatos de copo alto (copo
Berzelius) e copo baixo (copo Griffin), usado no preparo e aquecimento
de soluções e em reações de precipitação e recristalização, além de
servir de base para a medição de massas de sólidos.
2) Erlenmeyer: de vidro pirex com diversas capacidades,
empregado em análises titulométricas, no aquecimento de líquidos e na
dissolução de substâncias. Pela sua forma cônica, é muitas vezes
utilizado para conter soluções durante reações conduzidas sob agitação.
3) Funil analítico: de vidro comum ou pirex de diversos
diâmetros, usado para transferir líquidos ou realizar filtrações.
4) Tubo de ensaio: de vidro pirex ou vidro comum de diversos
tamanhos, usado na contenção de pequenos volumes de líquidos e para
reações. Em caso de reações que se procedam a quente, deve-se utilizar
uma pinça de madeira para a manipulação dos tubos.
5) Pisseta: de plástico utilizado para contenção e dispensa
direcionada de água destilada, aplicada em diluições ou limpeza de
vidrarias. Quando devidamente identificada, também pode conter
outros líquidos, como o etanol 70% (v/v).
Vidrarias para medição precisa de volumes

6) Balão volumétrico: de vidro comum ou pirex, contém uma
única marcação de volume. Sua calibração é feita diretamente pelo
fabricante, em temperaturas determinadas (próximas a 20 °C, com
variação máxima de até 5 °C). Por ser uma vidraria de precisão, jamais
deve ser seca em estufas para que não haja dilatação do vidro e
consequente perda da capacidade analítica do balão.
7) Bureta: utilizada para titulações e aferimento de volumes
precisos de reagentes líquidos. Antes do seu uso, deve ser lavada com
água destilada e feita a lavagem tríplice (ambiência) com o líquido
aferido ou titulante. De modo geral, as buretas têm volume de 25 mL
com graduação de 1 em 1 mL. Devem ser preenchidas com excesso de
líquido para que o acerto do menisco seja feito de modo a deixá-la

completamente preenchida do bico gotejador até o seu volume máximo.
8) Pipetas: há quatro tipos:
8.1) Pipeta automática: apropriada para a manipulação de pequenos
volumes fixos ou variáveis, através de uma ponteira descartável de
polipropileno acoplada à extremidade inferior da pipeta. A capacidade
das pipetas é dada em intervalos, em unidades de microlitros (μL) como
1-20 μL, 10-100 μL e 100-1000 μL.
8.2) Pipeta graduada: permite a aferição de volumes diversos,
envolvendo frações de 1 mL, com divisões de 0,01 ou 0,1 mL. Pode ser
de 1, 2, 5, 10 e 20 mL. As pipetas não são instrumentos de medição
precisa de volume, apesar de extremamente úteis no laboratório, dada a
necessidade de pipetar volumes fracionários.
8.3) Pipeta volumétrica: usada para dispor volumes fixos múltiplos de
1 mL. Pode ser de 1, 2, 5, 10, 20 e 25 mL. Todas as pipetas volumétricas
exibem um bulbo em seu corpo com uma única marcação de volume.
8.4) Pipeta Pasteur: utilizada para transferir volumes sem necessidade
de acurácia volumétrica, na faixa de 2 mL ou para dosar gotas. Pode ser
de plástico ou de vidro, com um bulbo de látex acoplado.
9) Proveta: utensílio de vidro comum, pirex ou plástico, com
diversas capacidades e não tão precisa – erro apreciável de até 0,5%.
Consiste de um cilindro graduado, variando normalmente de 5 mL até
2 L. Assim como as demais vidrarias de medição de volume, não deve
ser seca em estufa para evitar possíveis dilatações e perda da sua
graduação.
Utensílios de uso variado

10) Bastão de vidro: empregado para dissolver solutos por
agitação manual e introduzir líquidos em recipientes de borda estreita.
11) Vidro de relógio: utilizado no recolhimento de sublimados,
na pesagem de substâncias sólidas, em evaporações e na secagem de
sólidos não higroscópicos.
12) Bico de Bunsen: usado para aquecimento de soluções. Fica
embaixo do tripé e da tela de amianto. Ao terminar o uso, deve-se
certificar de que o registro de gás esteja completamente fechado.
13) Tela de amianto com tripé: tela metálica, contendo

amianto, utilizada para distribuir uniformemente o calor durante o
aquecimento de recipientes de vidro ou de metal, expostos à chama do
bico de gás.
14) Almofariz (ou gral) e pistilo: destinados à pulverização e
homogeneização de sólidos, bem como à trituração de amostras a ser
preparadas para posterior extração. Geralmente são de porcelana, ágata,
vidro ou metal.
15) Espátula: utilizada para transferir substâncias sólidas,
especialmente em pesagens. Pode ser de aço inoxidável, porcelana ou
plástico.
16) Cápsula: usada na evaporação de soluções, na sublimação,
secagem de sólidos e na preparação de misturas.
17) Pinça de madeira: utilizada para segurar tubos de ensaio,
principalmente durante o aquecimento.
18) Pinça metálica (ou tenaz): empregada na manipulação de
objetos aquecidos.
19) Grade (ou estante) para tubos de ensaio: usada como
suporte para colocá-los.
20) Suporte universal: usado para fixação de garras, argolas e
buretas.
21) Garra: empregada para acoplar vidrarias, como buretas,
colunas e funis, ao suporte universal.
22) Barra magnética: usada para misturar soluções usando o
agitador magnético.
23) Pipetador de sucção (ou pera): usado (encaixado) nas
pipetas graduadas e volumétricas para sucção de líquidos.
Equipamentos comuns em laboratório

24) Capela de exaustão: equipamento de proteção para dissipar
gases tóxicos emitidos de reagentes líquidos ou sólidos durante a
manipulação destes.
25) Estufa: equipamento utilizado geralmente para secagem de
vidrarias e utensílios, esterilização ou para uso geral.
26) Banho-maria: equipamento contendo água destilada em

seu interior, com temperatura controlada, para aquecer substâncias
líquidas ou sólidas que não podem ser expostas diretamente ao fogo.
27) Agitador de tubos (ou vortex): equipamento para agitar
tubos de ensaio com velocidade controlada.
28) Medidor de pH: também chamado de pHmetro, é usado
para medir o pH de uma solução. É constituído basicamente por um
eletrodo e um circuito potenciômetro.
29) Manta aquecedora: equipamento com isolamento térmico,
para aquecer de maneira controlada as substâncias de determinadas
análises.
30) Balança analítica: equipamento de precisão para pesagem
de reagentes sólidos.
31) Centrífuga: equipamento usado para acelerar a separação
de substâncias de densidades diferentes em uma mistura via decantação.
32) Espectrofotômetro: equipamento de análise, capaz de medir
e comparar a quantidade de luz (radiação eletromagnética) absorvida por
determinada amostra, seja ela solução, sólido transparente ou sólido opaco.
Observações: As vidrarias utilizadas na medição de volumes não
devem ser submetidas às temperaturas além da recomendada pelo
fabricante, que se encontra na faixa da temperatura ambiente (20-
25 oC). O vidro pirex é resistente a altas temperaturas; entretanto, é
suscetível a choques térmicos. Alguns materiais e equipamentos
comuns de laboratório estão mostrados na Figura 1.1.
1) Béqueres 2) Erlenmeyer 3) Funil analítico
Continua...
Fig. 1.1 - Cont.
4) Tubos de ensaio 5) Pisseta 6) Balão volumétrico
7) Bureta 8.1) Pipetas automáticas 8.2) Pipetas graduadas
8.3) Pipetas volumétricas 8.4) Pipetas Pasteur 9) Proveta
Continua...
Fig. 1.1 - Cont.
10) Bastão de vidro 11) Vidros de relógio 12) Bico de Bunsen
13) Tela de
14) Almofariz e pistilo 15) Espátulas
amianto com tripé
16) Cápsula 17) Pinça de madeira 18) Pinça metálica
Continua...
Fig. 1.1 - Cont.
20) Suporte
19) Grade para tubos de
universal e 21) 22) Barras magnéticas
ensaio
garra acoplada
23) Pipetador de sucção 24) Capela de exaustão
Continua...
Fig. 1.1 - Cont.
25) Estufa 26) Banho-maria
27) Agitador de tubos 28) Medidor de pH
29) Manta aquecedora 30) Balança analítica
Continua...
Fig. 1.1 - Cont.
31) Centrífuga 32) Espectrofotômetro
Figura 1.1 - Materiais comuns em um laboratório de Bioquímica.
Materiais da aula prática

Vidrarias e outros utensílios
1 béquer de 50 mL; 1 erlenmeyer de 250 mL; 1 funil analítico; 1 grade
para tubos de ensaio; 12 tubos de ensaio; 1 pisseta com água destilada;
1 balão volumétrico de 50 e 100 mL; 1 suporte universal com garras; 1
bureta de 25 mL; 1 pipeta automática de 100-1000 μL; 1 pipeta
graduada de 1, 2, 5 e 10 mL; 1 pipeta volumétrica de 1, 2, 5 e 10 mL; 1
pipeta Pasteur; 1 proveta de 10 e 100 mL; 1 bastão de vidro; 1 bico de
Bunsen com tela de amianto e tripé; 1 almofariz; 1 pistilo; 1 espátula; 1
pinça de madeira; 1 vidro de relógio; 1 barra magnética; 1 pipetador de
sucção; 1 balança analítica.
Reagentes
Permanganato de potássio (KMnO4).
Procedimento
Identificação de utensílios e vidrarias
Na bancada de trabalho, identificar cinco materiais de
laboratório, especificando as características de cada material (nome da
vidraria, tipo de graduação, capacidade e temperatura de calibração).
Preparo da solução corada

Preparar 100 mL de uma solução corada, pesando-se 0,176 g de
KMnO4, verificando as casas decimais da balança analítica utilizada.
Descrever o preparo da solução citando todas as vidrarias empregadas
e o procedimento realizado.
Emprego de pipetas graduadas
Com o auxílio da pipeta graduada, sempre na posição vertical,
pipetar os volumes referentes à solução corada preparada no item
anterior, nos tubos de ensaio correspondentes, completando o volume
com água destilada para a capacidade máxima da pipeta utilizada,
seguindo a Tabela 1.1.
Tabela 1.1 - Emprego de pipetas graduadas
Pipeta de 1 mL Pipeta de 2 mL Pipeta de 5 mL
Solução Solução Solução

Água Água Água
Tubos corada Tubos corada Tubos corada
(mL) (mL) (mL)
(mL) (mL) (mL)
1 0,00 5 0,00 9 0,00

2 0,37 6 0,63 10 2,50
3 0,50 7 1,00 11 3,75
4 0,75 8 1,65 12 4,17
Observação: Para medir líquidos translúcidos, observe a parte inferior

do menisco (leitura ao nível do olho) e, para medir líquidos opacos,
observe a parte superior do menisco (Figura 1.2).
Figura 1.2 - Leitura de volumes em vidrarias: para líquidos translúcidos

(A) e para líquidos opacos (B).
Exercícios
1. Cite o utensílio ou vidraria usados para os seguintes
procedimentos:
a) Preparo de soluções.
b) Medição de volumes exatos de soluções tóxicas.
c) Medição de volumes com precisão de até 0,5%.
d) Medição de volumes variados e precisos.
2. Cite o tipo de pipeta utilizada e a graduação para medir
volumes com maior e menor precisão: a) 10 mL; b) 2 mL: c) 0,8 mL; e
d) 0,15 mL.
3. Quantos gramas (g) de carbonato de sódio (Na2CO3) existem
em 0,8 L da solução desse sal, de concentração 2,5M? Dados: Na = 23
g/mol, C = 12 g/mol; e O = 16 g/mol.
Resposta: 212 g.
4. Não podemos usar materiais do cotidiano, como faca, colher
e copos, dentre outros, no laboratório; para isso, temos materiais
específicos para cada operação. Com base nos seus conhecimentos,

julgue se as afirmativas abaixo são verdadeiras (V) ou falsas (F) e
justifique.
a) O almofariz e o pistilo são empregados para triturar sólidos.
b) A pipeta volumétrica é usada para medir e transferir volumes
fixos com grande precisão.
c) A pipeta graduada é utilizada para medir volumes variáveis
de líquidos.
d) O vidro de relógio é empregado para determinar a velocidade
das reações químicas.
e) A pisseta é utilizada para medir volumes de líquidos com
razoável precisão.
f) Os tubos de ensaio são empregados na realização de
pequenos testes químicos.
5. Foi dada a você a tarefa de preparar 5 L de hipoclorito de
sódio (NaClO) a 2% (p/v) para a desinfecção do chão do laboratório de
bioquímica. Para isso, foram fornecidos água destilada, o referido sal e
as vidrarias. Diante dessa situação, responda:
a) Quais as vidrarias e os equipamentos adequados para este
procedimento? Monte uma tabela destacando uma coluna para a
aplicação de cada um deles.
b) Qual é a quantidade do sal (g) a ser utilizada? Resposta: 100 g.
c) Qual seria a concentração dessa solução em mol/L? Dado:
Cl = 35 g/mol.
Resposta: 0,27 mol/L.
ROTEIRO 2
SOLUÇÕES
Introdução
As interações entre os reagentes são geralmente desenvolvidas
em meios que permitam a interação entre as entidades químicas que os
compõem. Tais meios geralmente constituem soluções, ou seja, mistura
homogênea de duas ou mais substâncias. Os componentes de uma
solução são chamados soluto ou solvente, conforme descrito a seguir:
Soluto: substância que se dissolve no solvente e que, em geral,
está em menor quantidade na solução.
Solvente: substância que dissolve o soluto.
As soluções mais importantes para os seres vivos são aquelas
em que o solvente utilizado é a água, denominadas soluções aquosas. A
água é considerada o solvente universal, em virtude de suas
propriedades físico-químicas e por ser capaz de solubilizar ampla gama
de substâncias. O fluido dos tecidos, o plasma sanguíneo e a água que
bebemos são exemplos de soluções aquosas. As soluções podem ser
encontradas em qualquer fase de agregação: sólida, líquida ou gasosa.
De acordo com a proporção entre o soluto e o solvente, podem ser
classificadas como:
Solução diluída: possui pouca quantidade de soluto em relação
ao solvente.
Solução concentrada: possui grande quantidade de soluto.
Quanto à natureza do soluto, as soluções podem ser:
Iônicas: quando as partículas dispersas no meio são íons, em
decorrência do desmanche do retículo cristalino, de modo que os íons
gerados permitam a condução elétrica pela solução. Exemplo: cloreto
de sódio (NaCl) dissolvido em água destilada (H2O).
Molecular: quando nas soluções moleculares não há alteração

química das moléculas solubilizadas, somente eventos de adsorção
superficial, não havendo possibilidade de condução de energia elétrica.
O soluto é uma substância neutra. Exemplo: sacarose (C12H22O11)
dissolvida em água destilada.
Existem muitas soluções que apresentam moléculas neutras e
íons ao mesmo tempo, como no caso de uma solução de ácido acético,
onde estão muitas moléculas neutras (CH3COOH) e poucos íons
(CH3COO- e H+).
A solubilidade é a propriedade que as substâncias têm de se
manter em solução em determinado solvente, podendo variar de soluto
para soluto e com o tipo de solvente, sendo diretamente influenciada
pela temperatura. Pode ser expressa em g/L, g/mol, mg/mL, g/mL ou
mg/L. A quantidade máxima de soluto dissolvida em dada quantidade
de solvente, a certa temperatura, é denominada coeficiente de
solubilidade. Exemplos: 357 g de NaCl em 1 L de água a 0 °C; 36 g de
NaCl em 100 g de água a 20 °C.
Com base no coeficiente de solubilidade, as soluções podem ser
assim classificadas:
Não saturadas ou insaturadas: são aquelas que contêm uma
quantidade de soluto dissolvido em quantidade menor que a
estabelecida pelo coeficiente de solubilidade. Elas ainda são capazes de
dissolver mais soluto.
Saturadas: são soluções que atingiram o coeficiente de
solubilidade, ou seja, que contêm uma quantidade de soluto dissolvido
igual à sua solubilidade naquela temperatura. Se for adicionado mais
soluto nessa solução, a massa excedida não se dissolverá e se depositará
no fundo do recipiente.
Conceitos importantes
Fração em massa: geralmente expressa em porcentagem como
% (p/p); massa (g) do soluto em 100 g de solução. É comum encontrar
a mesma grandeza representada como % (w/w), sendo o “w”
proveniente do inglês weight (peso).
Fração em volume: também expressa em porcentagem como
% (v/v); volume (mL) de soluto em 100 mL de solução.
Concentração em massa: é a forma mais comum encontrada

nos rótulos de reagentes. É apresentada como % (p/v) ou % (w/v);
massa (g) do soluto em 100 mL de solução.
Número de mol (n): também chamado de quantidade de
matéria de determinada substância, expressa em mol. É a razão entre a
massa do soluto (g) e o seu peso molecular (g/mol).
Molaridade: dada em mol/L ou M (molar), sendo o número de
mol do soluto (n) em 1 L de solução. Uma forma comum de
representação da molaridade é o potencial hidrogeniônico (pH),
equivalente a -log[H+], uma vez que a concentração dos prótons H+ é
dada em M.
Normalidade: expressa em N, sendo a razão do número de
equivalentes do soluto em 1 L de solução. O número de equivalentes
refere-se, de modo amplo, às cargas elétricas ou a um grupo reativo.
Uma solução com um equivalente por litro tem 1 N. O termo
Normalidade está em desuso, mas ainda pode ser encontrado em alguns
rótulos nos laboratórios.
Substância padrão: apresenta um grau de pureza em torno de
100% com erro de até 0,05%; conhecida pela sigla PA (Para Análise).
Substância padrão primário: considerada somente aquela que
satisfaz aos seguintes requisitos: ser de fácil obtenção, purificação,
dessecação e conservação; as impurezas devem ser facilmente
identificáveis em ensaios qualitativos conhecidos e não ser superior a
0,01-0,02%; não deve ser higroscópica (absorver umidade do ar); não
oxidar e nem reagir com o gás carbônico (CO2) atmosférico; deve
possuir elevado peso molecular (PM), reduzindo assim os erros de
pesagem; e deve ser sólida, de fácil dissolução e reagir rápida e
totalmente.
O número de substâncias padrão primário é relativamente
pequeno. As principais são: Na2CO3, Na2B4O7, NaCl, AgNO3,
Na2C2O4, K2Cr2O7, ácido benzoico e ácido oxálico. As soluções padrão
devem ser conservadas em frascos limpos, de forma que suas
concentrações se mantenham inalteradas, não sejam armazenadas em
balões volumétricos e nem expostas diretamente à luz.
Diluição: é o ato físico-químico de tornar uma solução menos
concentrada em partículas de soluto pelo aumento do solvente (número
de vezes que a concentração da solução vai diminuir).
Fator de diluição: corresponde à relação entre o volume da

solução depois de diluída e o volume da solução antes de ser diluída.
Para calcular os valores de uma diluição, podemos usar a
equação (1):
Ci . Vi = Cf . Vf (1)
em que: Ci é a concentração da solução antes de ser diluída (solução
estoque); Cf a concentração da solução depois de ser diluída; Vi o
volume da solução antes de ser diluída; e Vf o volume da solução depois
de ser diluída.
Objetivo geral
Capacitar o aluno para preparar corretamente soluções
utilizando reagentes, vidrarias e equipamentos.
Materiais da aula prática

1 vidro de relógio; 1 espátula; 1 balança analítica; 1 barra magnética; 2
béqueres de 50 mL; 2 funis analíticos; 1 agitador magnético; 2 bastões
de vidro; 1 balão volumétrico de 50 e 100 mL; 1 pipeta graduada de 5
e 10 mL; 2 provetas de 100 mL; 2 pipetadores de sucção; e 1 pisseta
com água destilada.
Reagentes
Hidróxido de sódio (NaOH) PA e ácido clorídrico (HCl)
concentrado.
Procedimento
Preparar duas soluções separadamente:
x 50 mL de uma solução de NaOH 1M; e
x 100 mL de uma solução de HCl 1M.
Obtenha os valores de pureza, peso molecular (PM) e densidade
dos reagentes nos seus rótulos e descreva detalhadamente o preparo
dessas duas soluções.
Exercícios
1. Qual é o volume (mL) de ácido sulfúrico (H2SO4) necessário
para preparar 100 mL de uma solução 4 mol/L?
Dados: pureza = 96% (p/p); PM = 98 g/mol; e densidade = 1,84 g/mL.
Resposta: 22,2 mL.
2. Qual é a massa (g) de NaOH necessária para preparar 100 mL
de uma solução 2 mol/L? Dados: pureza = 98% (p/p); e PM = 40 g/mol.
Resposta: 8,16 g.
3. Qual é o volume (mL) de água que deverá ser adicionado
para que 50 mL de H2SO4 3,5 mol/L se torne uma solução 2 mol/L?
Resposta: 87,5 mL.
4. Qual é o volume (mL) de HCl necessário para preparar 500
mL de uma solução 1 mol/L? Dados: pureza = 36,5% (p/p); PM = 36,5
g/mol; e densidade = 1,19 g/mL.
Resposta: 42,02 mL.
5. O biftalato de potássio (C8H5KO4) é usado como padrão
primário para a padronização de bases. Qual é a massa (g) deste
composto é necessária para preparar 200 mL de uma solução 0,5 mol/L?
Dados: pureza = 99,5% (p/p); e PM = 204,22 g/mol.
Resposta: 20,52 g.
6. Após a pesagem de 18 g de glicose (C6H12O6) e dissolução
em 50 mL de água destilada, a solução foi transferida para um balão
volumétrico de 100 mL e completado o volume. Calcule a concentração
da solução em:
a) mol/L; b) % (p/v); c) mol/L e % (p/v) quando 50 mL dessa
solução for diluída 10 vezes. Dado: PM = 180 g/mol.
Respostas: a) 1 mol/L; b) 18% (p/v); e c) 0,1 mol/L e 1,8% (p/v).
7. Calcule a concentração em % (p/v) e em mol/L de 50 mL de
uma solução composta de 0,158 g de KMnO4. Dado: PM = 158 g/mol.
Respostas: 0,32 % (p/v); e 0,02 mol/L.
8. Calcule a concentração em % (p/v) e em mol/L da solução da
questão anterior se a mesma for diluída: a) 10 vezes; b) 20 vezes; e c) 50 vezes.
Respostas: a) 0,032 % (p/v) e 2 × 10-3 mol/L; b) 0,016 % (p/v)
e 1 × 10-3 mol/L; c) 6,4 × 10-3; e 4 × 10-4 mol/L.
ROTEIRO 3
CARBOIDRATOS: CARACTERIZAÇÃO
BASEADA NA PRODUÇÃO DE FURFURAL E
HIDROXIMETILFURFURAL
Introdução
Os carboidratos, considerados moléculas orgânicas de maior
abundância na natureza, são compostos relativamente simples,
formados de carbono, hidrogênio e oxigênio. Quimicamente, os
carboidratos são classificados de acordo com a função orgânica que
os define, podendo se apresentar como aldeídos ou cetonas
poliidroxilados. Se o grupo funcional for um aldeído, esse carboidrato
é denominado aldose; porém, se o grupo funcional for uma uma
cetona, ele é denominado cetose. Além da classificação química, os
carboidratos são classificados de acordo com o número de resíduos
glicídicos que compõem as moléculas. Os carboidratos mais simples,
formados por apenas um resíduo glicídico, são chamados
monossacarídeos, que podem ainda ser classificados de acordo com o
número de átomos de carbono que constitui sua molécula. Os dois
monossacarídeos mais simples são a diidroxiacetona e o gliceraldeído,
ambos apresentando três átomos de carbono (triose), sendo o tamanho
mínimo de um monossacarídeo. Na natureza, ainda podem ocorrer
monossacarídeos com quatro (tetrose), cinco (pentose) ou seis
(hexose) átomos de carbono; há outros tamanhos maiores e menos
comuns. A glicose, a frutose, a manose e a arabinose são exemplos
dos monossacarídeos mais comuns na natureza (Figura 3.1).
Carboidratos formados por dois a dez resíduos glicídicos são
classificados como oligossacarídeos, de forma geral. Aqueles
formados por dois resíduos glicídicos são chamados dissacarídeos e
os formados por três resíduos glicídicos, de trissacarídeos e assim por
diante. Existem ainda carboidratos de alta massa molecular, formados
por inúmeros resíduos de monossacarídeos, como o amido, o
glicogênio e a celulose. Esses polímeros são chamados de

polissacarídeos e podem ser classificados em homopolissacarídeos,
caso apresentem apenas um tipo de resíduo em sua cadeia, ou em
heteropolissacarídeos, caso apresentem dois ou mais tipos de resíduos
em suas cadeias.
Figura 3.1 - Estruturas das Projeções de Fischer (estruturas lineares) de

alguns monossacarídeos mais comuns na natureza.
Todas as propriedades físico-químicas dos carboidratos são

decorrentes das propriedades dos monossacarídeos. Uma das mais
relevantes sobre essas moléculas é o grande número de isômeros: para
cada aldose, sempre há uma cetose de mesma fórmula molecular, ou
seja, todo monossacarídeo tem dois isômeros de função. A
diidroxiacetona e o gliceraldeído são exemplos de trioses de mesma
fórmula estrutural (C3H6O3) e mesma massa molecular, porém de
funções orgânicas distintas, ou seja, são isômeros de função, sendo o
gliceraldeído uma aldose e a diidroxiacetona uma cetose.
Os monossacarídeos possuem pelo menos um átomo de
carbono quiral (carbono em que os quatro ligantes são diferentes), à
exceção da diidroxiacetona. Sabe-se que compostos com carbono quiral
apresentam-se em séries enantioméricas, ou seja, dependendo do
número de átomos de carbono quiral na estrutura de um
monossacarídeo, ele pode apresentar diversos enantiômeros ou

estereoisômeros. Vale lembrar que os compostos enantiômeros são
imagens especulares um do outro, como um par de luvas em que cada
mão é uma molécula. Para cada átomo de carbono quiral (n), existem
2n enantiômeros. Esse fato leva à classificação dos monossacarídeos em
duas séries enantioméricas gerais: a série D e a série L. Quando se tem
o gliceraldeído como referência, que possui apenas um átomo de
carbono quiral, a hidroxila (OH) ligada a esse átomo de carbono pode
estar voltada para a direita, sendo este o D-gliceraldeído, ou para a
esquerda, sendo este o L-gliceraldeído. Todas as demais moléculas de
monossacarídeos, quando comparadas ao gliceraldeído, mantêm essa
classificação. Monossacarídeos cujo último átomo de carbono quiral de
suas estruturas tenha a hidroxila voltada para a direita pertencem à série
D, enquanto aqueles com a hidroxila do último carbono quiral voltada
para a esquerda pertencem à série L.
Em solução, os monossacarídeos com cinco ou mais átomos
de carbono apresentam-se na forma cíclica. Isso ocorre porque os
elétrons da hidroxila ligada ao último carbono quiral do
monossacarídeo atacam o carbono da carbonila, deficiente em
elétrons, e formam um hemicetal ou um hemiacetal interno, levando
à molécula a se ciclizar. Quando na forma cíclica, os anéis com seis
átomos de carbono são designados piranoses e aqueles com cinco
átomos de carbono como furanoses, dada sua semelhança com o
pirano e o furano, respectivamente.
As formas cíclica e linear das moléculas estão em constante
equilíbrio em solução. Durante esse processo, as moléculas podem
gerar outro tipo de isômero, chamado anômero. Quando se forma o
grupo hemicetal ou hemiacetal interno, o carbono da carbonila passa a
ser um novo centro quiral. Por ser um grupo planar, o ataque à carbonila
pode ocorrer tanto pela face si quanto pela face re, fazendo com que a
hidroxila ligada a esse carbono se posicione em planos diferentes
(Figura 3.2). Quando a hidroxila está no mesmo plano que o último
átomo de carbono, diz-se que esse é um anômero do tipo ȕ (beta). Caso
a hidroxila esteja no plano oposto ao do último átomo de carbono, diz-
se que esse é um anômero do tipo ‫( ܤ‬alfa). Como as formas linear e
cíclica coexistem em equilíbrio em solução, um anômero pode se
interconverter em outro durante a linearização da molécula, sendo esse
fenômeno conhecido como mutarrotação.
Figura 3.2 - Reação de ciclização e mutarrotação da D-glicose.
Os carboidratos ainda apresentam uma propriedade

interessante, que pode ser explorada em testes de identificação desses
compostos. Quando um carboidrato tem a hidroxila ligada diretamente
ao carbono anomérico livre, este é dito redutor. Ou seja, em solução,
esses açúcares são capazes de se oxidarem e reduzirem íons férricos ou
cúpricos, em íons ferrosos ou cuprosos, respectivamente. Essa
propriedade é universal para os monossacarídeos, por serem
constituídos de apenas um resíduo glicídico e sempre têm a hidroxila
do carbono anomérico livre. Alguns dissacarídeos, como a maltose e a
lactose, são redutores; outros, como a sacarose, não. Essa propriedade
será mais bem explorada no próximo roteiro.
Na natureza, muitos carboidratos importantes são
oligossacarídeos ou polissacarídeos. Dentre os oligossacarídeos
incluem-se os dissacarídeos, que são carboidratos formados por dois
monossacarídeos, sendo muito comuns em nossa rotina. A lactose, o
açúcar mais abundante no leite, é um dissacarídeo composto de um
resíduo de galactose ligado a um resíduo de glicose. A sacarose, o
açúcar de mesa extraído e refinado da cana-de-açúcar, é um
dissacarídeo formado por um resíduo de glicose ligado a um resíduo de
frutose. A ligação entre dois monossacarídeos para a formação de um
dissacarídeo é chamada de ligação O-glicosídica e sua reação de
formação compreende uma reação de condensação (Figura 3.3).
Figura 3.3 - Reações de condensação e hidrólise da sacarose.
Os polissacarídeos são polímeros de açúcares, também

chamados poliosídeos ou glicanos. Contêm centenas ou milhares de
unidades monossacarídicas e apresentam papel importante no
armazenamento de energia nos animais, como o glicogênio, e nos
vegetais, a exemplo do amido. Além disso, podem estar envolvidos na
manutenção da integridade estrutural das células dos vegetais, como a
celulose, e do exoesqueleto de invertebrados, como a quitina (Figura 3.4).
Figura 3.4 - Comparação entre as estruturas da amilose (componente do

amido) e da celulose. Nota-se que, apesar de ambos serem
polímeros de glicose, o tipo de anômero e a geometria da
ligação glicosídica em cada uma das moléculas são
diferentes, conferindo a elas propriedades distintas.
Objetivo geral
Capacitar o aluno para realizar testes específicos (Molish,
Seliwanoff e Bial) para identificação de carboidratos, com base na
produção de compostos furfúricos.
Materiais de aula prática

21 tubos de ensaio; 1 grade para tubos de ensaio; 10 pipetas Pasteur; 1
manta aquecedora; 1 pinça de madeira; 10 béqueres de 50 mL; 1 béquer
de 500 mL; 1 pisseta com água destilada.
Reagentes
Reagente de Molish: Į-naftol 5% (p/v) em etanol (CH3COOH) 95%
(v/v); reagente de Seliwanoff: resorcinol 0,03% (p/v) em HCl 3M;
reagente de Bial: orcinol 0,3% (p/v) em HCl concentrado com adição
de 1,5 mL de solução de cloreto férrico (FeCl3) 10% (p/v) em 1 L; e
amostras a serem identificadas: soluções de carboidratos (arabinose,
glicose, frutose, maltose, sacarose e amido) a 1% (p/v).
Reações de desidratação: testes de

Molish, Seliwanoff e Bial
Quando se adiciona ácido concentrado em um monossacarídeo,
este sofre desidratação (Figura 3.5), podendo ter como produtos o
furfural, se o monossacarídeo for uma pentose, ou hidroximetilfurfural,
se o monossacarídeo for uma hexose (Figura 3.6).
Vários compostos fenólicos na presença de ácido reagem com
estes produtos para formar compostos de condensação coloridos,
constituindo teste positivo para carboidratos. Além de promover a
desidratação dos monossacarídeos, a adição de ácido aos oligossacarídeos
e polissacarídeos promove hidrólise em seus monossacarídeos
correspondentes.
Figura 3.5 - Reação de desidratação da D-xilose (aldopentose), com

formação de furfural.
Figura 3.6 - Estruturas do hidroximetilfurfural e furfural formadas pela

desidratação de hexoses e pentoses, respectivamente.
Teste de Molish
Este teste é utilizado para identificação de carboidratos. O
composto furfúrico formado a partir da reação de desidratação dos
monossacarídeos com o H2SO4 reage com um composto fenólico (Į-
naftol), formando um produto de condensação colorido de cor violeta
(Figura 3.7). Os oligossacarídeos e os polissacarídeos são hidrolisados
primeiro pelo ácido em seus monossacarídeos constituintes.
Figura 3.7 - Reação do ‫ܤ‬-naftol com o hidroximetilfurfural no teste de

Molish.
Procedimento
Para facilitar a realização dos experimentos e evitar a
contaminação das amostras desconhecidas, sugere-se que o grupo se
divida de modo que todos os testes sejam feitos após todas as amostras
terem sido pipetadas.
1. Enumere sete tubos de ensaio (de 1 a 6, conforme Tabela 3.1)
e sinalize um tubo como controle negativo (-).
2. Pipete 1 mL de cada amostra a ser identificada (item
Reagentes, p. 33), enumeradas de 1 a 6 em cada tubo de ensaio.
3. Pipete 1 mL de água destilada para o tubo controle negativo.
4. Adicione duas gotas do reagente de Molish em cada tubo e
misture.
5. Incline cada tubo e deixe escorrer pela parede 1 mL de H2SO4
concentrado, não deixando os dois líquidos se misturarem efetivamente.
Não agite os tubos depois desse passo. Essa etapa deve ser feita
vagarosamente na capela de exaustão.
6. Teste positivo: formação de uma região de cor violeta na
interface ácido-reagente.
Tabela 3.1 - Procedimento e resultados do teste de Molish

Amostra 1 mL de cada
Controle (-) 1 mL de água destilada
Procedimento Reagente de Molish 2 gotas
1 mL de H2SO4 pela parede do
Reação
tubo
Tubo Resultado Observações
Controle (-)
1
2
3
4
5
6
Teste de Seliwanoff
Este teste é utilizado para identificação de cetoexoses. O
composto furfúrico formado a partir da reação de desidratação dos
monossacarídeos com o HCl diluído reage com um composto fenólico
(resorcinol), sob aquecimento, formando um produto de condensação
colorido de cor avermelhada (Figura 3.8). Os oligossacarídeos e os
polissacarídeos são hidrolisados primeiro, para que em seguida a cetose
liberada possa reagir. As aldoses também dão reação positiva com um
tempo de reação maior. Um teste semelhante para a identificação de
cetoses é o teste de Tollens, no qual as cetonas reagem com o cloreto de
prata (AgCl) em meio amoniacal formando um espelho de prata no tubo.
Note que o ácido utilizado no teste de Seliwanoff é diluído,
enquanto o usado no teste de Molish é concentrado. Essa diferença se
deve ao propósito dos testes: no de Molish, dada a sua universalidade
para carboidratos, o ácido é forte, de modo que todos os carboidratos
sejam hidrolisados (no caso dos oligossacarídeos e polissacarídeos) e
desidratados para reagirem com o Į-naftol. No de Seliwanoff, no qual
o tempo reacional é controlado de modo a permitir apenas a reação das
cetoses, o ácido é diluído para evitar falsos positivos.
Figura 3.8 - Reação do resorcinol com o hidroximetilfurfural no teste

de Seliwanoff.
Procedimento

4. Adicione 2 mL do Reagente de Seliwanoff em cada tubo e
misture.
5. Aqueça os tubos juntos em banho fervente por 4 min (não
ultrapasse esse tempo para evitar falsos positivos).
Obs.: O teste será positivo se a coloração for alaranjada
brilhante e negativo se for amarela.
Tabela 3.2 - Procedimento e resultados do teste de Seliwanoff

Procedimento Reagente de
2 mL
Seliwanoff
Reação Banho fervente por 4 min
Controle (-)
1
2
3
4
5
6
Teste de Bial
Este teste é utilizado para identificação de pentoses. O furfural,
único composto possível formado pela desidratação de pentoses pelo
HCl diluído, reage com um composto fenólico (orcinol), sob
aquecimento, formando um produto de condensação colorido de cor
verde-azulada (Figura 3.9).
Figura 3.9 - Reação do orcinol com o furfural no teste de Bial.
Procedimento
4. Adicione 1,5 mL do Reagente de Bial em cada tubo e misture.
5. Aqueça os tubos juntos em banho fervente por 4 min.
Obs.: O teste será positivo se a coloração for verde-clara e
negativo se for amarronzada.
Tabela 3.3 - Procedimento e resultados do teste de Bial

Procedimento
Reagente de Bial 1,5 mL
Controle (-)
1
2
3
4
5
6
Resultados
Preencher os resultados obtidos para os testes de Molish,
Seliwanoff e Bial na Tabela 4.4 – Roteiro 4.
Exercícios
1. Por que são usados reagentes ácidos nos testes de Molish,
Bial e Seliwanoff?
2. Quais são os compostos fenólicos utilizados nos testes de
Molish, Bial e Seliwanoff e qual a função destes?
3. Descreva como ocorre a produção de furfural e
hidroximetilfurfural.
4. Mostre as reações com a sacarose com o ácido e com o
composto fenólico dos testes de Molish, Bial e Seliwanoff.
5. Por que o ácido utilizado no teste de Molish é concentrado,
enquanto os ácidos usados nos testes de Seliwanoff e Bial são diluídos,
apesar de todos os testes explorarem a mesma propriedade dos
carboidratos?
6. Por que o tempo de aquecimento é importante para a
seletividade no teste de Seliwanoff?
ROTEIRO 4
CARBOIDRATOS: CARACTERIZAÇÃO
BASEADA NAS PROPRIEDADES
REDUTORAS
Introdução
As reações sofridas pelos carboidratos são reflexos das
propriedades físico-químicas dos grupos que caracterizam essas
moléculas. Por se tratarem exclusivamente de aldeídos ou cetonas,
que em condições brandas de oxidação podem levar à conversão da
carbonila a uma carboxila (ácido carboxílico), testes que exploram a
capacidade redutora, assim chamada, dos carboidratos podem ser
úteis na identificação dessas moléculas. Sabe-se que todo
monossacarídeo em solução é capaz de reduzir alguns íons, como
Cu2+ĺ Cu+ ou Fe3+ĺ Fe2+. No caso dos dissacarídeos, para que ele
seja redutor, uma das hidroxilas do carbono anomérico deve estar
livre. Dessa forma, se o dissacarídeo envolve apenas um carbono
anomérico na ligação glicosídica, ele é redutor. Exemplos de
dissacarídeos redutores: maltose (‫ܤ‬-D-glicopiranosil-(1ĺ4)-‫ܤ‬-D-
glicopiranose) e lactose (ȕ-D-galactopiranosil-(1ĺ4)-‫ܤ‬-D-
glicopiranose). Exemplos de dissacarídeos não redutores: trealose
(‫ܤ‬-D-glicopiranosil-(1ĺ1)-‫ܤ‬-D-glicopiranose) e sacarose (‫ܤ‬-D-
glicopiranosil-(1 ĺ 2)-ȕ-D-frutofuranose).
Objetivo geral
Capacitar o aluno para realizar testes específicos (Benedict,
Barfoed e Iodo) para identificação de carboidratos baseados em sua
capacidade redutora.

21 tubos de ensaio; 1 grade para tubos de ensaio; 10 pipetas Pasteur; 1
manta aquecedora; 1 pinça de madeira; 9 béqueres de 50 mL; 1 béquer
de 500 mL; e 1 pisseta com água destilada.
Reagentes
Reagente de Benedict: solução com citrato de sódio (Na3C6H5O7)
17,3% (p/v), carbonato de sódio anidro (Na2CO3) 10% (p/v) e sulfato
cúprico pentaidratado (CuSO4.5H2O) 1,73% (p/v); reagente de Barfoed:
acetato de cobre (Cu(CH3COO)2) cristalino 6,65% (p/v) em água com
0,9 mL de ácido acético (CH3COOH) P.A; solução de Lugol: iodo 5%
(p/v) em iodeto de potássio (KI) 10% (p/v); H2SO4 concentrado;
amostras a serem identificadas: soluções de carboidratos (arabinose,
glicose, frutose, maltose, sacarose e amido) a 1% (p/v).
Reações de oxidação-redução: testes de

Benedict e Barfoed
Os monossacarídeos capazes de sofrer oxidação por agentes
oxidantes brandos como os íons férricos (Fe3+) ou cúpricos (Cu2+) são
chamados de açúcares redutores e apresentam hidroxila livre no
carbono anomérico. Como todos os monossacarídeos são unidades
monoméricas, sempre apresentam essa hidroxila livre para participar da
reação de oxidação-redução, sendo assim açúcares redutores. No
entanto, o mesmo não acontece com todos os dissacarídeos, nos quais a
ligação O-glicosídica pode envolver os carbonos anoméricos das
unidades formadoras do dissacarídeo. Vale ressaltar que as cetonas não
podem em sua forma absoluta serem oxidadas aos ácidos carboxílicos
correspondentes. Entretanto, devido ao equilíbrio entre as formas
cetoenólicas, que acontece de forma natural em todas as cetonas, as
cetoses, assim como as aldoses, são redutoras (Figura 4.1). Ou seja,
caso as cetonas não sofressem esse equilíbrio natural, apenas aldoses
seriam redutoras. Tal equilíbrio recebe o nome de tautomerismo ou
isomeria dinâmica.
Figura 4.1 - Equilíbrio entre a forma cetônica e a forma enólica,

(Equilíbrio cetoenólico).
Se o dissacarídeo envolve apenas um carbono anomérico na

ligação O-glicosídica, este é redutor, pois apresenta a hidroxila do
segundo carbono anomérico livre, capaz de ser oxidado formando um
ácido carboxílico. Observe a reação de oxidação do dissacarídeo lactose
como exemplo (Figura 4.2).
Figura 4.2 - Reação de oxidação da lactose na presença de íons cúpricos

ou férricos.
Nota-se nesta figura que, devido ao equilíbrio entre as formas

cíclica e linear da ȕ-lactose, o resíduo de glicose na lactose passa, em
algum estágio, da forma cíclica (hemiacetal) para a forma linear
(aldeído). Nesse instante, o aldeído pode sofrer oxidação a ácido
carboxílico, gerando um dissacarídeo contendo o ácido-glicurônico.
Teste de Benedict
Este teste é utilizado para identificação de açúcares redutores. O
Reagente de Benedict contém sulfato cúprico (CuSO4), agente oxidante,
carbonato de sódio (Na2CO3), que basifica o meio, favorecendo a oxidação
dos carboidratos, e citrato de sódio (Na3C6H5O7), o qual complexa com os
íons cúpricos, evitando sua precipitação em meio básico. A formação do
precipitado óxido cuproso (Cu2O), de cor vermelho-tijolo, em meio básico,
caracteriza a reação positiva para açúcares redutores (Figura 4.3).
Figura 4.3 - Reação do teste de Benedict para a xilose.
Procedimento
4. Adicione 1 mL do Reagente de Benedict em cada tubo e misture.
Obs.: O teste será positivo se houver formação do precipitado
vermelho-tijolo.
Tabela 4.1 - Procedimento e resultados do teste de Benedict

Procedimento
Reagente de Benedict 1 mL
Controle (-)
1
2
3
4
5
6
Teste de Barfoed
Este teste é utilizado para identificação de monossacarídeos,
baseado também na redução dos íons cúpricos, na presença de ácido
acético (CH3COOH). A formação do precipitado óxido cuproso
(Cu2O), de cor vermelho-tijolo, em meio ácido, caracteriza a reação
positiva apenas para os monossacarídeos nesse tempo de reação (Figura
4.4). Os dissacarídeos, após um tempo maior de aquecimento, sofrem
hidrólise ácida em seus monossacarídeos correspondentes,
apresentando também reação positiva para o teste de Barfoed.
Figura 4.4 - Reação do teste de Barfoed para a xilose.
Procedimento
4. Adicione 1 mL do reagente de Barfoed em cada tubo e
misture.
Obs.: O teste será positivo se houver formação do precipitado
vermelho-tijolo.
Tabela 4.2 - Procedimento e resultados do teste de Barfoed

Procedimento
Reagente de Barfoed 1 mL
Controle (-)
1
2
3
4
5
6
Reações com iodo: teste para amido

O amido é um polissacarídeo de reserva vegetal formado de
amilose e amilopectina. A amilose é um polímero linear de resíduos de
glicose, unidos por ligação glicosídica do tipo ‫(ܤ‬1ĺ4), enquanto a
amilopectina é um polímero ramificado, cuja cadeia principal é
constituída por resíduos de glicose unidos por ligação do tipo ‫(ܤ‬1ĺ4)
e as ramificações se dão por meio de ligações do tipo ‫(ܤ‬1ĺ6). Ambos
interagem com o iodo; no entanto, a interação entre a amilose e o iodo
forma um complexo que exibe coloração azul intensa, enquanto a
amilopectina mostra uma coloração avermelhada. A coloração do iodo
com a amilopectina não é visualizada na presença de amilose devido à
intensidade da coloração da amilose com o iodo.
A solução de lugol contém iodo nas formas de iodo molecular
(I2), iodeto (I-) e tri-iodeto (I3-), que se encontram em equilíbrio. A
mudança de cor de compostos de amido após o contato com o lugol
deve-se a alterações na topologia das moléculas constituintes do amido
(amilose e amilopectina), devido à formação de complexos com o tri-
iodeto, que passa a interagir diferentemente com a luz e reflete
comprimento de onda característico. A diferença de cor é devida às
diferenças do padrão de ramificação das cadeias ou devido à ausência
dessas ramificações. As macromoléculas como o glicogênio, ainda que
formadas por monômeros de ‫ܤ‬-D-glicopiranoses e serem
estruturalmente similares ao amido, não apresentam alterações
topológicas em solução de lugol.
Procedimento
4. Adicione 1 gota de lugol em cada tubo e misture.
5. O teste será positivo se a solução apresentar coloração azul
intensa.
6. Adicione no tubo positivo água destilada na proporção de 1:3
(1 mL de solução de amido/iodo: 3 mL de água).
7. Aqueça o tubo em banho fervente por 5 min e observe a
mudança de coloração.
8. Resfrie o tubo em água corrente e observe novamente a
mudança de coloração.
Tabela 4.3 - Procedimento e resultados do teste para Amido

Procedimento
Reagente de Barfoed 1 gota de lugol
Reação Misturar
Controle (-)
1
2
3
4
5
6
(*) Para o tubo positivo, adicionar 3 mL de água destilada e submetê-lo ao banho
fervente por 5 min seguido de resfriamento em água corrente.
Resultados
Complete a Tabela 4.4 e identifique o carboidrato
correspondente a cada amostra desconhecida, justificando os resultados
encontrados em cada teste.
Tabela 4.4 – Resultados dos testes para identificação de carboidratos

(Roteiros 3 e 4)
Tubos Testes Carboidrato
Molish Seliwanoff Bial Benedict Barfoed Iodo
Controle (-)
1
2
3
4
5
6
Exercícios
1. Em que princípio se baseiam os testes de Benedict e Barfoed?
2. Defina açúcar redutor.
3. No teste de Benedict, qual é a função dos reagentes sulfato
cúprico, carbonato de sódio e citrato de sódio?
4. Explique por que as condições de reação do teste de Barfoed
são diferentes das do teste de Benedict.
5. Na reação do teste de Benedict, carbonos anoméricos são
susceptíveis de oxidação por vários agentes oxidantes contendo íons
cúpricos devido à presença de quais grupos livres?
6. Explique a diferença no resultado do teste de Benedict para os
dissacarídeos maltose e sacarose.
7. Sugira uma explicação caso o teste de Barfoed tenha sido
positivo para a sacarose.
8. Mostre as reações com a manose nos testes de Benedict e Barfoed.
9. Em que consiste a reação de lugol?
ROTEIRO 5
LIPÍDEOS: CARACTERIZAÇÃO
Introdução
Os lipídeos, diferentemente dos carboidratos, que possuem
funções orgânicas bem definidas, são biomoléculas de natureza diversa,
mas compartilham uma propriedade físico-química em comum que os
caracteriza. De modo geral, os lipídeos são moléculas hidrofóbicas, ou
seja, insolúveis em água e solúveis em solventes apolares, como
clorofórmio e éter. A classificação dos lipídeos em grupos é feita de
acordo com a função biológica dessas moléculas. Basicamente, os
lipídeos dividem-se em dois grandes grupos: os de armazenamento (ou
reserva energética), como os triglicerídeos (óleos e gorduras), e os
estruturais (constituintes de membranas), como os glicerofosfolipídeos,
os esfingolipídeos e os esteróis (colesterol). Vale ressaltar que os
esteróis ainda podem ser classificados como lipídeos de sinalização
celular, uma vez que os hormônios esteroides são formados a partir do
núcleo isoprenoide do colesterol.
A maioria dos lipídeos existentes nos alimentos e no corpo
humano ocorre na forma de triglicerídeos, que são ésteres de ácidos
graxos do glicerol. Os ácidos graxos são ácidos carboxílicos de cadeia
longa (de 6 a 20 átomos de carbono), que podem apresentar diferentes
propriedades físico-químicas de acordo com o tamanho da cadeia
carbônica e a geometria da molécula. De modo geral, os ácidos graxos
são classificados de acordo com a presença ou ausência de insaturações
na cadeia hidrocarbonada, sendo os ácidos graxos que não apresentam
duplas ligações ao longo de sua cadeia, denominados saturados,
enquanto aqueles que mostram uma ou mais insaturações são
denominados insaturados (Figura 5.1). Os ácidos graxos insaturados
ainda podem ser subdivididos em duas classes, de acordo com sua
isomeria geométrica. As insaturações em moléculas orgânicas podem
apresentar-se em duas geometrias, cis e trans, dependendo da
configuração dos átomos de carbono. Sendo assim, existem ácidos

graxos cis insaturados (de incidência natural nos organismos) e trans
insaturados (pouco comuns na natureza, incidente em produtos cárneos
e lácteos ou em produtos de modificações industriais, como na
hidrogenação de óleos vegetais).
Figura 5.1 - Estrutura de ácidos graxos insaturados e saturados.
Dependendo da combinação, do comprimento da cadeia e do

grau de insaturação, os ácidos graxos apresentam propriedades físico-
químicas distintas. Uma vez que os ácidos graxos são moléculas
apolares, as interações entre essas moléculas se dão por meio de
interações hidrofóbicas e forças de Van der Waals. Este tipo de
interação intermolecular depende da proximidade entre as moléculas
e da extensão dessa interação, pois são forças do tipo dipolo-dipolo
induzido, e é afetado de acordo com a forma da molécula. Ácidos
graxos com cadeias carbônicas mais longas exibem uma área de
contato maior para a interação com outras moléculas, gerando entre
elas forças de coesão mais fortes. Isso faz com que essas moléculas
tenham pontos de fusão mais elevados do que moléculas de cadeia
mais curtas. Essa propriedade é ainda mais acentuada para os ácidos
graxos saturados, já que a ausência de duplas ligações confere uma
geometria distendida à molécula, facilitando o contato entre elas. No
caso dos ácidos graxos insaturados, duplas ligações na geometria cis
geram torções na molécula, que diminuem a área de contato entre elas,
fazendo com que seu ponto de fusão seja menor que de seus
correspondentes saturados.
De modo geral, os lipídeos de armazenamento de energia

(triglicerídeos) (Figura 5.2) são assim classificados:
Gorduras: mistura de triglicerídeos com maior quantidade de
ácidos graxos saturados, sólidos à temperatura ambiente e de origem
animal.
Óleos: mistura de triglicerídeos com maior quantidade de
ácidos graxos insaturados, líquidos à temperatura ambiente e de origem
vegetal.
Figura 5.2 - Estrutura geral de um triglicerídeo, em que X1, X2 e X3

indicam a presença de qualquer ácido graxo, saturado ou
insaturado esterificados ao glicerol.
O comportamento físico-químico destes compostos depende

das características dos ácidos graxos que os compõem. O tamanho da
cadeia principal e o número de insaturações influenciam nos pontos de
fusão, na hidrossolubilidade e na reatividade. Triglicerídeos com ácidos
graxos insaturados são comumente relacionados a óleos vegetais,
enquanto os com ácidos graxos saturados são atribuídos às gorduras
animais; entretanto, existem as gorduras com alta incidência de ácidos
graxos insaturados (cis ou trans), denominadas gorduras hidrogenadas,
que são fruto da modificação industrial dos óleos vegetais.
Tem-se também as ceras biológicas, que são ésteres de ácidos
graxos saturados e insaturados de cadeia longa (de 14 a 36 átomos de
carbono) com álcoois de cadeia longa (de 16 a 30 átomos de carbono),
com ponto de fusão maior comparado aos triglicerídeos; por exemplo,
a cera de abelha.
Quanto aos lipídeos estruturais (constituintes de membranas), os
representantes mais comuns são os glicerofosfolipídeos, os
esfingolipídeos e os esteróis. Esses lipídeos são estruturalmente distintos,
mas exibem uma característica em comum que os permite formar

bicamadas em solução, sendo anfipáticos. Os lipídeos de membrana são
constituídos de uma parte apolar, formada pelas cadeias hidrocarbonadas
dos ácidos graxos (chamada de cauda), e uma polar, constituída por
grupos fosforilados ou ligados a compostos polares, como os
carboidratos (chamada de cabeça). Essa característica permite que os
lipídeos de membrana interajam entre si por meio de interações
hidrofóbicas e forças de Van der Waals e, ao mesmo tempo, interajam
com a água por ligações de hidrogênio. Sendo assim, em solução, os
lipídeos de membrana organizam-se na forma de bicamadas estáveis,
com as caudas dos ácidos graxos voltadas umas para as outras,
resguardando-se da água e as cabeças polares interagindo com a água.
Os glicerofosfolipídeos são constituídos de uma molécula de
glicerol-fosfato esterificada com duas moléculas de ácidos graxos
variados. Geralmente, uma molécula de ácido graxo é saturada e a
outra é insaturada. Isso faz com que a molécula tenha uma geometria
perfeita que permita a interação molécula-molécula, estabilizando as
bicamadas, mas que não leve à alta rigidez, garantindo fluidez à
membrana. No caso dos esfingolipídeos, o glicerol-fosfato é
substituído por uma molécula de esfingosina, um aminoálcool de
cadeia longa ligado a apenas uma molécula de ácido graxo por
ligação amida.
Os esterois, moléculas presentes nas membranas biológicas e
que atuam como hormônios em animais, apresentam em sua estrutura
um núcleo isoprenoide comum de quatro anéis fundidos (A, B, C e D).
Dentre os representantes dessa classe, o mais estudado é o colesterol,
que apresenta ainda uma função alcoólica na posição do carbono 3 do
anel A, uma insaturação entre os carbonos 5 e 6 do anel B e uma cadeia
alquila no carbono 17 do anel D (Figura 5.3). Vale lembrar que o
colesterol é um composto exclusivo do metabolismo animal. As plantas
apresentam esteróis muito parecidos, mas diferentes do colesterol,
como o estigmasterol. No metabolismo animal, o colesterol, além de
modular a fluidez das membranas, é precursor da síntese de hormônios
esteroides, como por exemplo o estrógeno e a testosterona, chamados
também de hormônios sexuais, além de ser precursor da Vitamina D e
dos ácidos biliares.
Figura 5.3 - Estrutura do colesterol, que que os anéis destacados com as

letras de A a D representam o núcleo isoprenoide básico
presente em todos os esteroides.
Embora as propriedades de solubilidade dos esteroides sejam

análogas às dos demais lipídeos, os esteroides como o colesterol
possuem estrutura e propriedades químicas exclusivas, podendo ser
diferenciados através de reações de coloração específica. A reação de
Salkowski, por exemplo, é específica para esteroides que contêm dupla
ligação na molécula, ocorrendo uma desidratação que leva à formação
de um composto colorido.
Os lipídeos podem sofrer diversos tipos de reações, que podem
ser utilizadas como ferramentas na identificação destes. Uma vez que o
material de trabalho desse roteiro é o óleo de soja, constituído
principalmente de triglicerídeos ricos em ácidos graxos insaturados,
focaremos em reações que esse tipo de molécula pode sofrer:
Oxidação: ocorre devido ao contato com o oxigênio
atmosférico, formas reativas do oxigênio (oxigênio singlete, oxigênio
triplete, peróxidos e perácidos), umidade e metais oxidantes (Fe e Cu).
A oxidação de lipídeos também pode ser desencadeada pela influência
de fontes de energia, que compreendem a elevação da energia térmica
ou a absorção de radiação.
Rancificação: constitui um tipo de processo oxidativo.

Diversas podem ser as causas: lipolíticas, inerentes a um alimento, ou
devido à atividade de micro-organismos ou em decorrência do
aquecimento prolongado em meio aquoso, com consequente hidrólise
dos triglicerídeos e subsequente formação de radicais livres. Uma vez
produzidos, estes radicais com o autoataque na molécula de lipídeo
geram diversos subprodutos, por exemplo, hidrocarbonetos, compostos
alcoólicos, acídicos, cetônicos e aldeídicos, que conferem sabor e odor
desagradáveis, denominados ranço. Essas reações são potencializadas
pela luz e pelo contato com o oxigênio. Isso explica o envase dos óleos,
há alguns anos, em latas metálicas. Atualmente, os óleos são
armazenados em frascos PET transparentes, mas são enriquecidos com
antioxidantes (BHA – hidroxianisol butilado e o BHT – hidroxitolueno
butilado) para aumentar a vida útil do produto.
Saponificação: os sabões são sais de ácidos graxos (Figura 5.4).
Dessa forma, para a formação de sabões, assim como de outros sais,
ocorre a reação entre um ácido com uma base forte, liberando glicerol.
Os cátions de metais alcalinos apresentam carga 1+ (monovalente),
enquanto os cátions de metais alcalinos terrosos têm carga 2+ (bivalente).
Os sabões constituídos por metais monovalentes são hidrossolúveis,
porém os que possuem metais bivalentes não o são, uma vez que o metal
interage com o grupamento carboxílico de dois ácidos graxos distintos,
levando à baixa solubilidade e rápida precipitação.
Figura 5.4 - Reação de saponificação da trioleína, triglicerídeo contido

no óleo de soja.
Hidrogenação: consiste em reduzir o nível de oxidação da

molécula por meio da adição de átomos de hidrogênio às duplas
ligações (Figura 5.5). Esta técnica é utilizada para a conversão de óleos
vegetais em gordura vegetal (por exemplo, margarina), o que aumenta
a vida útil, por reduzir a tendência oxidativa.
Figura 5.5 - Reação de hidrogenação do ácido oleico - 18:1(ǻ9).
Objetivo geral
Capacitar o aluno para caracterizar as propriedades físico-
químicas de triglicerídeos (ésteres de ácidos graxos e sabões) e
identificar a presença do colesterol pelo Método de Salkowski.

9 tubos de ensaio; 2 tubos de ensaio com tampa de rosca; 7 pipetas
Pasteur; 1 manta aquecedora; 1 béquer de 500 mL; 1 pinça de madeira;
5 béqueres de 50 mL; 3 provetas de 10 mL; 2 provetas de 50 mL; 1 tubo
de ensaio grande; 1 grade para tubos de ensaio; 1 espátula; 1 bastão de
vidro; 1 pisseta com água destilada.
Reagentes
Óleo de soja; NaOH PA; solventes: água, etanol (CH3CH2OH) 95%
(v/v), éter etílico (CH3CH2)2O e clorofórmio (CHCl3); solução de
cloreto de cálcio (CaCl2) 10% (p/v); solução saturada de cloreto de
sódio (NaCl); solução de NaOH 2M; solução de hidróxido de potássio
(KOH) 0,1% (p/v); ácido acético (CH3COOH) concentrado; solução de
fenolftaleína (C20H14O4) 0,1% (p/v); gema de ovo; H2SO4 concentrado;
e solução clorofórmica de colesterol: 0,1 g de gema de ovo em 10 mL
de clorofórmio (validade: 1 dia).
Procedimento
Avaliação da solubilidade dos triglicerídeos
1) Enumere quatro tubos de ensaio.
2) Pipete dois mL de água, 2 mL de etanol, 2 mL de éter etílico

e 2 mL de clorofórmio separadamente em cada tubo de ensaio.
3) Adicione 1 mL de óleo de soja em cada tubo e agite.
4) Deixe em repouso por 4 min.
5) Avalie a solubilidade do óleo em cada tubo e justifique
estruturalmente.
Avaliação da acidez livre

1) Enumere dois tubos de ensaio com tampa de rosca.
2) Adicione no primeiro tubo 2 mL de óleo de soja, 3 mL de
água, três gotas de fenolftaleína 0,1% (p/v) e duas gotas de KOH 0,1%
(p/v) e misture.
3) Adicione no segundo tubo de ensaio 3 mL de água, três gotas
de fenolftaleína 0,1% (p/v) e duas gotas de KOH 0,1% (p/v) e misture.
4) Tampe os tubos e observe a coloração inicial da reação.
5) Agite os tubos vigorosamente por 5 min.
6) Deixe os tubos em repouso por 4 min e explique o
desaparecimento da coloração rosa.
7) Mostre a reação ocorrida.
Reação de saponificação dos triglicerídeos

1. Adicione 1 mL de óleo de soja no tubo de ensaio grande.
2. Adicione NaOH (cinco pedrinhas pequenas).
3. Adicione 10 mL de etanol (apesar de polar, o etanol
misturado à água reduz a polaridade do meio reacional e favorece a
solubilização do sabão formado).
4. Aqueça o tubo em banho fervente por 10 min.
5. Resfrie o tubo em água fria por 5 min.
6. Adicione 15 mL de água destilada e homogenize com um
bastão de vidro.
7. Observe a solução límpida de sabão.
8. Agite o tubo e justifique sua observação.
9. Mostre a reação de saponificação ocorrida.
10. Distribua a solução do tubo de ensaio grande em três tubos de

ensaio e utilize-os nos três itens seguintes: Separação de ácidos
graxos, Geração de sabões e Separação por salificação.
Separação dos ácidos graxos

1. Adicione no primeiro tubo de ensaio, duas gotas de
fenolftaleína 0,1% (p/v) e 10 gotas de ácido acético concentrado e agite.
2. Deixe o tubo em repouso por 5 min.
3. Observe a separação da mistura em duas fases: a camada
superior, amarela e gordurosa corresponde aos ácidos graxos livres.
4. Reserve o tubo para ser utilizado no item Ressaponificação.
5. Mostre a reação do sabão com o ácido acético e explique
porque a adição de um ácido concentrado permite a separação de ácidos
graxos de triglicerídeos já saponificados.
Geração de sabões insolúveis

1. Adicione no segundo tubo de ensaio o mesmo volume de
água e cinco gotas de CaCl2 10% (p/v).
2. Observe o aparecimento de um precipitado branco (sabão
insolúvel).
3. Mostre a reação do sabão com o cloreto de cálcio.
Separação por salificação

4. Adicione no terceiro tubo de ensaio o mesmo volume de
água e de solução saturada de NaCl.
5. Observe a separação do sabão.
6. Mostre a reação do sabão com o cloreto de sódio e explique
porque a adição de uma solução salina concentrada é capaz de separar
os sabões em solução.
Ressaponificação
1. Adicione 5 mL de água em um tubo de ensaio.
2. Transfira, cuidadosamente, usando uma pipeta Pasteur,
quatro gotas do ácido graxo formado no item Separação dos ácidos
graxos.
3. Adicione 10 gotas de solução de NaOH (2M), agite o tubo

e verifique a formação de espuma.
4. Mostre a reação do ácido graxo com o hidróxido de sódio.
Determinação de colesterol do ovo (Método de

Salkowski)
1. Adicione em um tubo de ensaio 1 mL da solução
clorofórmica de colesterol.
2. Adicione 1 mL de H2SO4 concentrado, cuidadosamente pela
parede do tubo.
3. Observe a formação de um composto vermelho
amarronzado.
Exercícios
1. Defina índice de acidez de um alimento. Quais são as
implicações para valores de índice de acidez maiores que o padronizado?
2. Por que ao final da reação do teste de acidez livre a solução
passa de rosada para esbranquiçada? Explique por meio da reação
química entre os ácidos graxos e o hidróxido de potássio.
3. A denominação água dura é usada nas regiões onde há
calcário (CaCO3). O que acontece quando são utilizados sabões com
essas águas? Mostre a reação ocorrida.
4. Quais são as características químicas e estruturais dos
lipídeos e como eles se classificam?
5. Quais são as funções biológicas desempenhadas pelos
lipídeos na célula?
6. Explique a baixa solubilidade dos lipídeos em solventes polares.
7. Descreva como ocorre o transporte de lipídeos pela corrente
sanguínea.
8. Defina indicador de pH e explique o seu funcionamento.
9. Faça a estrutura do ácido graxo 18:3 (ǻ9,12,15).
10. Explique como a adição de ácido concentrado e de solução
salina concentrada em uma amostra de triglicerídeos saponificados leva
à sua separação.
ROTEIRO 6
ÁCIDOS NUCLEICOS: EXTRAÇÃO E

IDENTIFICAÇÃO
Introdução
Os ácidos nucleicos são as biomoléculas ligadas à
transmissão hereditária da informação genética. O ácido
desoxirribonucléico (DNA) é o repositório de toda a informação
que permite com que a célula se divida, execute suas funções e
morra. Em todo o ciclo celular, o DNA é constantemente acessado
para que genes específicos sejam expressos. Durante esse processo,
o DNA é transcrito em uma molécula de ácido ribonucléico (RNA),
um tipo de ácido nucléico com propriedades semelhantes às do
DNA, mas com algumas particularidades. Enquanto o DNA é uma
fita dupla de cadeias polinucleotídicas, o RNA é constituído por
uma fita simples. Além disso, os polímeros diferem na sua
constituição.
Os monômeros que constituem os ácidos nucleicos são
chamados nucleotídeos e formados por uma pentose, um grupo
fosfato e uma base nitrogenada. No caso dos ribonucleotídeos, que
constituem as moléculas de RNA, a pentose é a ribose, ligada ao
fosfato no carbono 5’ e à base nitrogenada no carbono 1’. A ligação
da ribose ao grupo fosfato é do tipo fosfodiéster e sua ligação com a
base nitrogenada do tipo N-glicosídica. Nos desoxirribonucleotídeos,
que compõem o DNA, a pentose é uma 2’- desoxirribose, ou seja,
uma molécula de ribose sem o oxigênio no carbono 2’ (Figura
6.1). Essa é uma das principais diferenças entre o DNA e o RNA
e reflete diretamente na estabilidade da molécula e no seu papel
biológico.
Figura 6.1 - Pentoses características do DNA e RNA, respectivamente.
As bases nitrogenadas são parte importante na constituição dos

nucleotídeos e muitas das propriedades dos ácidos nucléicos são
inerentes a estas. As bases podem ser classificadas em purinas ou
pirimidinas: as purinas, adenina (A) e guanina (G), são formadas de dois
anéis fusionados, e as pirimidinas, timina (T), citosina (C) e uracila (U)
exibem apenas um anel (Figura 6.2). As bases nitrogenadas são capazes
de deslocalizar elétrons e, por isso, são chamadas pseudoaromáticas, o
que permite que os ácidos nucleicos absorvam luz ultravioleta e essa
propriedade é explorada na quantificação destes em solução. Além
disso, as bases nitrogenadas são protagonistas nas diferenças entre o
DNA e o RNA. O DNA possui em sua estrutura as bases A, G, C e T,
enquanto o RNA possui as bases A, G, C e U.
Figura 6.2 - Estrutura das bases púricas e pirimídicas que constituem os

nucleotídeos.
Todos os componentes dos nucleotídeos são essenciais às

funções e à conformação estrutural dos ácidos nucleicos. O fosfato
atribui carga negativa aos polímeros, enquanto as bases
nitrogenadas apresentam diferentes configurações e composições
atômicas, sendo úteis no estabelecimento do código genético.
Nesse roteiro, serão exploradas propriedades inerentes às pentoses,
constituintes dos nucleotídeos presentes nos ácidos nucleicos para
sua identificação.
As técnicas de extração e isolamento de material genético
variam de acordo com a finalidade da obtenção da amostra.
Entretanto, baseiam-se em princípios similares: rompimento da
membrana celular e da parede celular, caso exista, separação das
proteínas e demais interferentes que interajam com o material
genético, purificação, isolamento e análise da amostra. No processo
de rompimento de membranas, sejam elas a membrana plasmática,
sejam a membrana nuclear, podem-se utilizar detergente e/ou
trituração da amostra congelada ou liofilizada. A separação do
material genético é feita por precipitação com sais e álcool, que
reduzem a interação dos ácidos nucleicos com a água, facilitando
seu isolamento. Dependendo da finalidade do método, podem ser
empregados reagentes e etapas adicionais, como a adição de
antioxidantes como PVP (polivinilpirrolidona) e de quelantes,
como o EDTA (ácido etileno diamino tetracético), para aumentar o
grau de pureza dos ácidos nucleicos isolados. O aquecimento
também pode ser usado de modo a desnaturar as proteínas
contaminantes e separar a dupla hélice, no caso do DNA.
Na prática em questão, os envoltórios celulares são
rompidos e o material genético é precipitado via solução de ácido
tricloroacético (TCA) e, posteriormente, extraído a quente. O DNA
é identificado pela reação do produto de desidratação da 2’-
desoxirribose (Figura 6.3) com a difenilamina (Figura 6.4),
enquanto o RNA é detectado pela reação da ribose com o orcinol
(Roteiro 3 – Figura 3.9).
Figura 6.3 - Ação do ácido sobre a 2’-desoxirribose, levando à sua

desidratação e consequente formação do 5-hidroxilevulinilaldeído,
que reage com a difenilamina para a identificação do DNA.
Figura 6.4 - Reação entre o 5-hidroxilevulinilaldeído e a difenilamina para

a formação do produto de condensação azulado característico
em testes de identificação da presença de DNA.
Objetivo geral
Capacitar o aluno para extrair e evidenciar ácidos nucleicos
(DNA e RNA) no fermento biológico, mediante reações características
para as pentoses que o compõem.

6 tubos de ensaio; 1 grade para tubos de ensaio; 1 tubo de ensaio grande;
1 gral; 1 pistilo; 1 bastão de vidro; 6 béqueres de 50 mL; 9 pipetas
Pasteur; 1 proveta de 10 mL; 1 vórtex; 1 centrífuga de bancada; 2 tubos
de centrífuga; 1 pinça de madeira; 1 banho-maria; e 1 pisseta com água
destilada.
Reagentes
Fermento biológico; água destilada; éter etílico; ácido tricloroacético -
TCA (CCl3COOH) a 5 e 20% (p/v); padrão de RNA ou pentose (0,5
mg/mL); reativo de difenilamina: 1 g de difenilamina em 100 mL de ácido
acético (CH3COOH) mais 2,75 mL de H2SO4 concentrado; e reagente de
Bial: 0,2 g de orcinol em 60 mL de HCl concentrado mais 0,2 g de cloreto
férrico (FeCl3).
Procedimento
Preparo do homogeneizado
1. Pese 2 g de fermento biológico e coloque em um gral.
2. Adicione 5 mL de éter etílico e macere com o uso de um pistilo.
3. Adicione 5 mL de água destilada até formar um
homogeneizado.
Extração dos ácidos nucleicos

1. Coloque 2 mL do homogeneizado em um tubo de centrífuga
(Tubo Falcon).
2. Adicione 1 mL de TCA 20% (p/v).
3. Misture e deixe em repouso por 10 min.
4. Centrifugue por 5 min a 5000 rpm e despreze o sobrenadante.
5. Adicione 3 mL de TCA a 5% (p/v) ao precipitado e
ressuspenda-o com um bastão de vidro.
6. Transfira a suspensão para um tubo de ensaio grande.
7. Aqueça em banho-maria fervente por 5 min.

8. Transfira a solução para o tubo de centrífuga e centrifugue
por 5 min, a 2.500 rpm.
9. Transfira o sobrenadante (extrato de ácidos nucleicos) para
um tubo de ensaio e descarte o precipitado.
Identificação dos ácidos nucleicos

Reação para identificação de DNA
1. Enumere dois tubos de ensaio.
2. Adicione aos tubos, respectivamente, 1 mL de água (controle -)
e 1 mL do extrato.
3. Adicione aos tubos 1 mL do reativo de difenilamina e
misture.
Obs.: O teste será positivo se a coloração for azul.
Reação para identificação de RNA
1. Enumere três tubos de ensaio.
2. Adicione aos tubos, respectivamente, 1 mL de água
(controle -), 1 mL de xilose (controle +) e 1 mL do extrato.
3. Adicione aos tubos 1 mL do reagente de Bial e misture.
5. Teste positivo: coloração verde.
Exercícios
1. Qual é o motivo da alta proporção de resíduos de arginina e
lisina nas proteínas histonas?
2. Por que os ácidos nucleicos têm caráter ácido? Explique
utilizando eventuais valores de pK de seus constituintes básicos.
3. Por que o material precisa ser macerado para isolar os ácidos
nucleicos?
4. Qual é a função do éter etílico no processo de extração dos
ácidos nucleicos?
5. De que é composta a molécula de DNA? Qual é a sua função

biológica?
6. Transcreva a estrutura do ácido tricloroacético (TCA) e sua
função na extração dos ácidos nucléicos. De que maneira os átomos de
cloro influenciam na acidez do TCA?
7. Por que é necessário após adição de TCA a 20% (p/v) deixar
a mistura em repouso?
8. Faça a reação do DNA com a difenilamina.
9. Faça a reação do RNA com o orcinol.
ROTEIRO 7
TITULAÇÃO POTENCIOMÉTRICA DE
AMINOÁCIDOS
Introdução
Os aminoácidos são moléculas com estrutura característica,
constituída por um grupo amino (NH2) e um grupo carboxílico
(COOH), ligados diretamente a um átomo de carbono (Figura 7.1). O
que diferencia um aminoácido do outro é a sua cadeia lateral (R),
comumente chamada de radical, totalizando 20 aminoácidos proteicos.
Uma vez que o átomo de carbono que forma os aminoácidos está ligado
a um átomo de hidrogênio, um grupo amino, um grupo carboxílico e
uma cadeia lateral R diferentes entre si, esse átomo de carbono constitui
um centro quiral e, por isso, é chamado carbono alfa (C‫)ܤ‬. Isso faz com
que os aminoácidos se apresentem em séries enantioméricas D e L,
assim como os carboidratos, dependendo da configuração em torno do
átomo de carbono. Na natureza, os aminoácidos proteicos são
exclusivamente da série L e somente a glicina não apresenta carbono
quiral, uma vez que sua cadeia lateral é um átomo de hidrogênio.
Figura 7.1 - Estrutura genérica de um aminoácido, constituído de um

carbono quiral (C‫)ܤ‬, um átomo de hidrogênio, um grupo
amino e um grupo carboxil.
Cada cadeia lateral pertence a um grupo de moléculas com

propriedades em comum, que definem as propriedades dos
aminoácidos. De acordo com a natureza de cada grupo R, os
aminoácidos podem ser divididos em cinco grupos: alifáticos ou
apolares, que são aqueles com cadeias laterais constituídas basicamente
por carbono e hidrogênio (glicina, alanina, leucina, isoleucina, valina e
metionina – que possui um átomo de enxofre entre dois átomos de
carbono); os polares não carregados, aqueles cuja cadeia lateral possui
um grupo polar não ionizável, como a hidroxila, o grupo tiol ou ainda
uma amida (serina, treonina, cisteína, prolina, asparagina e glutamina);
os polares carregados, que se subdividem em ácidos e básicos – os
aminoácidos ácidos possuem cadeias laterais constituídas por ácidos
carboxílicos, que se ionizam em solução gerando uma carga negativa
na molécula (aspartato e glutamato), enquanto os básicos têm um grupo
amino, também ionizável, que gera uma carga positiva na molécula
(lisina, arginina e histidina); e, por fim, ainda existem os aromáticos,
cuja cadeia lateral apresenta um grupo aromático (tirosina, triptofano e
fenilalanina).
Visto que os grupos carboxílico e amino são ionizáveis em
solução, ou seja, podem atuar como ácido ou base, alterações no pH das
soluções contendo aminoácidos levam a alterações no estado de
ionização desses grupos. Podemos associar constantes de ionização
para cada um deles, assim como se associa uma constante de equilíbrio
a uma reação química. A equação (1) representa a dissociação de um
ácido genérico (HA) e de uma base genérica (BOH):
(1)
Define-se como Ka a constante de ionização desse ácido, dada
pela equação (2):
Ka = [H+].[A-] / [HA] (2)
Quanto maior a razão anterior definida, equação 2, maior será
a facilidade de um ácido de se dissociar; portanto, mais forte ele é.
Como os aminoácidos são ácidos fracos, os valores de Ka são muito
pequenos e, por isso, costuma-se representar a força de um ácido por
meio de seu pKa, que nada mais é que -logKa. O grupo carboxílico
apresenta caráter ácido, sendo relacionado à constante pK1, que tem
valores em torno de 2. Já o grupo amino tem caráter básico e é

relacionado à constante pK2, que tem valores em torno de 10. A cadeia
lateral dos aminoácidos pode apresentar grupos ionizáveis de caráter
ácido ou básico, no caso dos aminoácidos polares negativos e positivos,
respectivamente, sendo representada pela constante pKR.
A carga dos aminoácidos, e consequentemente das proteínas,
varia de acordo com o pH do meio, já que ocorre alteração dos estados
de protonação dos grupos ionizáveis e, obviamente, sua carga líquida.
Esse fenômeno faz com que os processos biológicos que envolvam
proteínas e a interação delas com outras biomoléculas sejam altamente
sensíveis à variação de pH. Para que se entenda melhor como o pH afeta
a carga líquida dos aminoácidos, é necessário compreender qual a
relação entre pH e a constante de ionização dos ácidos, dada pela
Equação de Handerson-Hasselbach.
A equação de Henderson-Hasselbalch
O pH é uma função logarítmica da concentração de prótons
(H+) no meio de acordo com a equação (3):
pH = - log [H+] (3)
Outra relação é o pKa, também logarítmica e que se relaciona à
força de um ácido, conforme equação (4):
pKa = - log Ka (4)
Assim, podem-se incorporar as equações (3) e (4) na equação
de dissociação de um ácido, estabelecendo a seguinte relação,
determinada pela equação (5):
(5)
Logo, substituindo as equações (3) e (4) na dedução anterior,
equação (5), tem-se a equação (6) de Henderson Hasselbalch, que
determina como o pH afeta a ionização de um ácido ou de uma base:
pH = pKa - log ([HA]/[A-])
? pH = pKa + log ([A-]/[HA]) (6)
Esta relação permite inferências sobre a concentração de

prótons, base conjugada ou sal e do ácido não dissociado. Caso [A-] =
[HA] tem-se que o logaritmo da relação entre as concentrações é zero,
de modo que o pH é igual ao pK, caracterizando assim uma solução-
tampão – Equação (7):
Se [A-] = [HA], logo
pH = pKa + log ([A-]/[HA]) ? pH = pKa + log 1 ? pH = pKa (7)
Em termos práticos, quando o pH = pK, a forma ácida e a forma

básica de um grupo ionizável coexistem em solução em proporções
iguais. Isso define um limite de pH para que o estado de protonação dos
grupos carboxílico e amínico sejam alterados. Se o pH da solução é
menor que o pK de um grupo ionizável, significa que naquela solução
deve prevalecer a forma protonada desse grupo, porque a razão [A-]/[HA]
< 1. Por sua vez, se o pH de uma solução for maior que o pK de um
grupo ionizável, significa que naquela solução deve prevalecer a forma
desprotonada desse grupo, porque a razão [A-]/[HA] > 1.
Esse fato curioso sobre a influência do pH no estado de
ionização de ácidos e bases confere uma característica interessante aos
aminoácidos. Em pH fisiológico, próximo de 7,0, os aminoácidos são
chamados anfólitos, ou seja, moléculas que exibem cargas distintas
simultaneamente. Isso se deve ao caráter diferente de acidez dos grupos
carboxílico e amino. Em pH 7,0, o pH da solução é maior que o pK dos
ácidos carboxílicos, o que faz com que se predomine a forma
desprotonada do grupo (COO-), mas é ao mesmo tempo menor que o
pK do grupo amino, o que faz com se predomine a forma protonada do
grupo (NH3+). Isso gera pólos de cargas distintas nos aminoácidos,
chamados também zwitterions (íons dipolares) – Figura 7.2.
Figura 7.2 - Efeito da variação de pH no estado de ionização dos grupos

amino e carboxila dos aminoácidos.
A titulação de aminoácidos possibilita a identificação da

natureza do íon híbrido dessas substâncias (caráter anfótero),
propriedade altamente útil no estudo de proteínas. Tal comportamento
leva à obtenção de curvas de titulação polifásicas, isto é, com duas ou
mais fases. Aminoácidos sem grupos laterais dissociáveis, como os
alifáticos, levam às curvas bifásicas, já os aminoácidos com grupos
laterais dissociáveis (ácidos ou básicos) proporcionam curvas trifásicas,
enquanto que peptídeos e proteínas produzem curvas multifásicas, dado
o grande número de resíduos de aminoácidos.
Cada aminoácido possui um ponto isoelétrico (pI)
característico, que corresponde ao valor de pH, em que as cargas da
molécula se igualam e se anulam (carga líquida zero). Aminoácidos sem
grupos laterais ionizáveis têm como pI a média aritmética dos valores
de pK1 e pK2. Aminoácidos com grupos laterais ionizáveis têm um
terceiro estágio de tamponamento obtido ao redor do pKR, que é usado
junto ao pK1 ou pK2 para a obtenção do valor de pI.
Objetivo geral
Capacitar o aluno para entender o comportamento ácido-básico
dos aminoácidos e pela curva de titulação obtida e determinar os valores
de pK e pI de um aminoácido.

3 béqueres de 50 mL; 1 béquer de 100 mL; 1 bureta de 25 mL; 1
balão volumétrico de 50 mL; 1 funil analítico; 1 pipeta de 1 mL; 1
pipetador de sucção; 1 agitador magnético; 1 barra magnética; 1
medidor de pH; e 1 papel milimetrado.
Reagentes
Solução de glicina 0,1M; solução de NaOH 0,5M; e HCl
concentrado.
Procedimento
1. Meça 50 mL da solução de glicina em um balão volumétrico
e coloque em um béquer de 100 mL.
2. Coloque o béquer no agitador com uma barra magnética
dentro.
3. Coloque o eletrodo na solução de glicina e adicione 1 mL de
HCl concentrado até o pH aproximar do valor 1.
4. Ponha a solução de NaOH na bureta e titule a solução de
glicina adicionando de 1 em 1 mL, anotando os valores de pH
correspondentes.
5. Faça a curva de titulação da glicina, construindo um gráfico
de pH (eixo x) versus volume de NaOH (eixo Y) em papel milimetrado.
6. Assinale na curva de titulação os valores de pK e pI da glicina
e as regiões de tamponamento.
7. Anexe no relatório a curva de titulação obtida.
8. Escreva as estruturas da glicina nos seguintes valores de pH:
1; 2,34; 5,97; 9,60 e 13 e suas cargas líquidas.
Exercícios
1. Defina solução tampão.
2. Calcule o pH de uma solução sabendo-se que a concentração
+
de H é de 0,00565 mol/L. Resposta: 2,25.
3. Calcule a concentração de OH- em mol/L sabendo-se que o
pH de uma solução tem valor 6. Resposta: 1x10-8 mol/L.
4. Calcule o pH de uma solução-tampão formada por ácido
fórmico 0,05M (pK 3,75) e formiato de sódio (HCOONa) 0,1M.
Resposta: 4,05.
5. Calcule a relação de bicarbonato de sódio (NaHCO3) para
ácido carbônico (H2CO3) (pK 6,1) no plasma sanguíneo, sabendo-se
que o pH da solução-tampão tem valor 7,5.
Resposta: 25,12.
6. Calcule o pH da solução-tampão acetato de sódio

(C2H3NaO2)/ácido acético (CH3COOH) (pK 4,76), 0,1M, pH 4,76,
quando se adiciona 0,01M de HCl.
Resposta: 4,58.
7. Calcule o pH da solução-tampão acetato de sódio/ácido
acético (pK 4,76), 1M, pH 5,5, quando se adiciona 0,01M de HCl.
Resposta: 5,47.
8. Faça a curva de titulação da arginina indicando os valores de
pK (pK1 2,17; pK2 9,04 e pKR 12,48) e calcule o valor de pI.
Resposta: 10,76.
ROTEIRO 8
SEPARAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE
AMINOÁCIDOS POR CROMATOGRAFIA
EM PAPEL
Introdução
O termo cromatografia, de modo geral, pode ser definido como
um procedimento analítico usado para separar e identificar
componentes de uma mistura de substâncias (aminoácidos, ácidos
graxos, carboidratos etc.), sendo separados pela carga, tamanho,
solubilidade ou outra propriedade de seus componentes. Existem
diversos meios de separação explorados em cromatografia, de acordo
com o sistema utilizado, o tipo de molécula que se deseja separar e o
tipo de solvente que se quer usar nessa separação.
O princípio geral das cromatografias baseia-se na interação das
moléculas entre duas fases, ou seja, uma que funciona como matriz para
a adsorção das moléculas, chamada fase estacionária (FE), e outra,
chamada fase móvel (FM), que de acordo com a afinidade entre as
moléculas e o solvente irá arrastar as moléculas ao longo da FE até o
fim da corrida cromatográfica.
A cromatografia é uma técnica antiga, utilizada pela primeira
vez em 1906 para a separação de pigmentos coloridos de folhas e flores
de plantas. Ao longo dos anos, ela vem sendo melhorada e refinada de
modo a se tornar mais eficiente na separação, identificação e
quantificação de biomoléculas. Como existe grande variedade de
possíveis combinações das condições cromatográficas, podem-se
classificar as cromatografias de acordo com:
Tipo de sistema:
. Cromatografia planar: cromatografia realizada em um
suporte plano, por exemplo papel (cromatografia em papel) ou lâminas
delgadas de metal ou vidro, nas quais se deposita uma camada fina de
uma matriz sólida, por exemplo a sílica (cromatografia em camada
delgada).
. Cromatografia em coluna: situação em que a FE é uma
matriz sólida particulada (geralmente pequenas beads) de agarose,
sefarose ou outro polímero modificado, contido dentro de uma coluna
de metal ou de vidro. A amostra é aplicada no topo da coluna e frações
de solventes são sucessivamente adicionadas a esta para arrastar a
amostra pela FE. Quanto maior a coluna cromatográfica, mais efetiva
será a separação das moléculas. Exemplos: cromatografia de exclusão
molecular, troca-iônica e afinidade.
Tipo de fase móvel (FM):

. Cromatografia líquida (CL): quando a FM é um líquido,
podendo utilizar substâncias puras ou misturas. A Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência (CLAE) ou High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) é muito usada para separação, identificação
e quantificação de vários compostos.
. Cromatografia gasosa (CG): cromatografia em que a FM é
um gás inerte, por exemplo o nitrogênio, o hélio, o argônio ou o dióxido
de carbono. Nesse tipo de cromatografia, todas as amostras devem ser
volatilizadas para passarem para a fase gasosa e, dessa forma, poderem
interagir com o gás de arraste. Moléculas não voláteis, como é o caso
da maioria das biomoléculas, devem ser primeiramente derivatizadas
de modo que possam ser volatilizadas e assim analisadas.
. Cromatografia supercrítica (CS): cromatografia em que
a FM é um fluido em estado supercrítico, ou seja, em temperaturas
tão elevadas que ultrapassam a temperatura de ebulição da
substância. Ela é complementar entre a CL e a CG, que separa
amostras termicamente instáveis e de alto peso molecular.
Exemplos: cromatografias de dióxido de carbono supercrítico ou a
de água supercrítica, chamada de cromatografia verde, já que não
utilizam solventes orgânicos como FM.
Princípio de separação:
Nesse caso, dois principais tipos de interação regem os
sistemas: a que ocorre entre a FE e as moléculas a serem separadas
e aquela entre a FM e moléculas a serem separadas. Sendo assim,
podem-se distinguir a seguir alguns princípios de separação que
compartimentaliza as cromatografias.
1) Sorção/dessorção, cromatografia de troca-iônica e
cromatografia de afinidade: nesses tipos de cromatografia as
moléculas de interesse são separadas devido à sua interação com a
FE, que é sólida. Geralmente, elas se procedem em colunas contendo
uma matriz sólida particulada com grupos especiais que
proporcionam interações específicas com moléculas que se deseja
separar.
Na sorção/dessorção, resinas com grupos químicos
específicos formam a FE e podem interagir especificamente com
carboidratos ou lipídeos, como é o caso das resinas aminadas e com
caudas alifáticas, respectivamente.
Na cromatografia de troca-iônica, a matriz sólida contém
grupos carregados que irão interagir com moléculas de cargas
opostas. As colunas com grupos carregados positivamente são
chamadas catiônicas ou trocadoras de ânions e aquelas carregadas
negativamente são chamadas aniônicas ou trocadoras de cátions.
Na cromatografia de afinidade, moléculas específicas estão
ligadas à FE de modo a interagirem especificamente com uma ou um
pequeno grupo de moléculas. Um exemplo é a resina de
concanavalina-A, uma proteína imobilizada sobre beads de
polímeros inertes capaz de se ligar com grande afinidade em
proteínas glicosiladas, permitindo sua separação de extratos
protéicos brutos.
2) Cromatografia de gel filtração (peneira ou exclusão
molecular): nesse tipo não há qualquer interação entre as moléculas
com as fases FM ou FE. As moléculas são arrastadas através de uma
matriz com poros de diâmetro definido (FE), de modo a serem
separadas por tamanho. Moléculas menores que o poro podem
adentrar-se na malha da resina, percorrendo todo o volume da coluna
até a sua eluição, o que exige um tempo maior para que sejam
detectadas nas frações coletadas na cromatografia. Porém, moléculas
grandes não entram na malha e percorrem um volume menor da
coluna, sendo eluídas primeiramente.
3) Partição: a partição compreende um princípio físico-
químico no qual as moléculas dividem-se entre a FM e a FE de
acordo com a solubilidade da molécula em uma dessas fases. No caso
da cromatografia em papel, a FE é considerada líquida, formada por
uma rede de moléculas de água que interagem com os resíduos de
glicose da celulose no papel por ligações de hidrogênio, sendo o
papel apenas o suporte da corrida cromatográfica. A FM é uma
mistura de solventes apolares ou pouco polares, de modo que os
compostos, de acordo com sua natureza diversa, interajam mais com
a água ou com a mistura de solventes, realizando a partição entre
eles.
A cromatografia em papel é uma técnica qualitativa, simples,
de baixo custo, de boa resolução e nela são utilizadas pequenas
quantidades de amostras. Esta técnica será usada nesta aula prática
para separação e identificação de aminoácidos. Para entendermos
tais fundamentos devemos considerar a solubilidade dos
aminoácidos em determinado solvente (variando em função da
temperatura) e a propriedade dos aminoácidos de se tornarem
coloridos após reagirem com substâncias específicas. Como os
aminoácidos em pH fisiológico são polares (já que exibem cargas
positiva e negativa), dependendo da estrutura da cadeia lateral
destes, apresentarão diferentes solubilidades no solvente empregado,
mantida a temperatura constante. A capacidade de determinado
solvente (contido em um recipiente) subir contra a força da
gravidade através de um papel absorvente é muito importante nesta
técnica de cromatografia em papel (Figura 8.1). Conforme o solvente
sobe pelo papel absorvente, ele pode levar consigo diferentes
aminoácidos a diferentes distâncias separando-os a partir de uma
mistura inicial de aminoácidos. Técnica baseada no mecanismo de
partição, onde os componentes separam devido às diferenças de
solubilidade nas fases líquidas (FE e FM).
Figura 8.1 - Migração da FM pelo papel-filtro (suporte da FE) de modo

ascendente.
Após a corrida cromatográfica, para que os aminoácidos sejam

identificados é necessário usar um revelador, denominado ninhidrina.
A ninhidrina (C6H4COCO.C(OH)2) é um composto que reage com
aminas primárias na estequiometria 2:1, formando um composto violeta
com uma ligação de nitrogênio entre os dois resíduos de ninhidrina,
havendo a liberação de água, gás carbônico e o aldeído correspondente
ao esqueleto do aminoácido, após a desaminação (Figura 8.2). Os
aminoácidos prolina e hidroxiprolina, que são iminoácidos, reagem
com a ninhidrina, mas formam um produto de coloração amarelada.
Figura 8.2 - Reação da ninhidrina com um aminoácido genérico. Note que

são necessárias duas moléculas de ninhidrina para cada amino,
gerando um produto de cor violeta. A intensidade da coloração
é proporcional à concentração do aminoácido.
A partir da distância percorrida pelos aminoácidos, desde a

linha básica até o centro da mancha formada após a pulverização com
a ninhidrina, podemos calcular o fator de retenção (Rf). Este pode ser
definido como a relação entre a distância percorrida pelo aminoácido
(até o centro da mancha), pela distância total percorrida pelo solvente
(Figura 8.3). Essa razão varia de 0 a 1, de modo que quanto menor a
solubilidade de um componente no solvente empregado, mais próximo
de 0 será essa razão e, quanto mais solúvel um componente for nesse
mesmo sistema de solvente, mais próximo de 1 será a razão. Em termos
práticos, o valor de Rf é um reflexo da solubilidade de cada aminoácido
no solvente empregado. O valor de Rf é único para cada tipo de
molécula em determinado sistema de solventes e, na literatura, existem
livros que contêm dados padronizados de Rf para substâncias de
diversas naturezas em diversos sistemas de solvente.
Quando há valores de Rf muito próximos, faz-se a
cromatografia bidimensional, ou seja, o papel é girado 90o e em seguida
recromatografado, usando-se outra mistura de solventes (FM).
Figura 8.3 – Soluções de aminoácidos (a.a.1, a.a.2 e a.a.3) colocadas

sobre a linha básica e percorrendo distâncias diferentes
(d1, d2 e d3). A distância d refere-se àquela percorrida
pelo solvente. Assim, os Rf para cada solução de
aminoácido são: Rf (a.a.1) = d1/d; Rf (a.a.2) = d2/d; e Rf
(a.a.3) = d3/d.
Objetivo geral
Capacitar o aluno para entender o processo cromatográfico,
separar e identificar aminoácidos em uma mistura por cromatografia em
papel e calcular os seus fatores de retenção (Rf).

1 papel cromatográfico (Whatmann no 1), 15 × 20 cm; 1 cuba
cromatográfica com tampa; 5 tubos capilares; 1 pinça metálica; 1 proveta
de 10 mL; 1 lápis; 1 régua; 1 pulverizador; 1 estufa (90-100 °C); e 1 capela
de exaustão.
Reagentes
Mistura de solventes: butanol (C4H9OH), ácido acético (CH3COOH) e
água, na proporção de 20:6:5; soluções de aminoácidos (alanina,
isoleucina e aspartato) a 0,1M; misturas desconhecidas (1 e 2) de dois
aminoácidos em cada; e solução reveladora: ninhidrina 0,1% (p/v) em
acetona (CH3(CO)CH3).
Procedimento
1. Trace uma linha horizontal a 2 cm da borda inferior do papel
(linha básica) sobre a qual, posteriormente, serão distribuídas manchas
das soluções contendo os aminoácidos. Trace pontos de aplicação das
soluções com 5 cm de distância entre eles, conforme esquema a seguir.
Obs.: Não toque o papel diretamente com as mãos para evitar contaminação.
2. Aplique as amostras sobre as marcações devidamente

identificadas. Para uma aplicação efetiva, apenas toque o capilar sobre
a marca e deixe que o papel absorva o líquido até formar uma marca
circular de 0,5 cm de diâmetro. Repita a aplicação duas vezes.
3. Coloque 10 mL da mistura de solventes (FM) na cuba
cromatográfica e feche a tampa para que haja a saturação da cuba com
os vapores do sistema solvente, a fim de aperfeiçoar a cromatografia.
4. Coloque o papel dentro da cuba cromatográfica com o auxílio
de uma pinça metálica e aguarde a corrida até que o solvente atinja 2
cm da borda superior do papel.
5. Faça uma marca com lápis na altura que o solvente atingir
para posterior cálculo do fator de retenção (Rf).
6. Retire o papel e coloque em uma estufa (90-100 °C) para
secar por 2 min para remoção completa do solvente antes da revelação
com ninhidrina.
7. Pulverize o papel com ninhidrina na capela de exaustão.
8. Coloque o papel novamente na estufa (90-100 °C) por no
máximo 5 min, até o surgimento das manchas coloridas, que
representam os aminoácidos separados. Obs.: Não exceder esse tempo
para que não haja reações inespecíficas ou dispersão das manchas no
papel.
9. Marque as distâncias percorridas pelos aminoácidos e pelas
misturas desconhecidas (1 e 2) no centro de cada mancha.
10. Calcule os Rf para cada aminoácido e para as misturas
desconhecidas (1 e 2).
11. Identifique os aminoácidos presentes em cada mistura.
12. Anexe o cromatograma obtido no relatório.
Exercícios
1. O que é cromatografia? Em que se baseia a separação de
aminoácidos por cromatografia em papel?
2. Qual é a coloração dos aminoácidos vistos na prática na
reação com a ninhidrina? Por que a coloração seria diferente (amarela)
se usássemos o aminoácido prolina?
3. Quais são as fases móvel e estacionária utilizadas na prática?

4. No sistema cromatográfico, qual é o motivo de um
aminoácido possuir maior ou menor valor de Rf? Explique essa
diferença com base nas propriedades das cadeias laterais dos
aminoácidos e sua polaridade.
5. Qual é a função da ninhidrina? Qual parte do aminoácido
reage com ela?
6. Quais são os produtos da reação da ninhidrina com o
aminoácido?
ROTEIRO 9
SEPARAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE
AMINOÁCIDOS POR ELETROFORESE EM
PAPEL
Introdução
Eletroforese compreende um conjunto de técnicas analíticas de
separação e identificação de moléculas carregadas por migração em um
campo elétrico. Por ser uma técnica com bom poder de resolução, é
muito utilizada na separação, purificação e análise de ácidos nucleicos
e proteínas, principalmente. Qualquer tipo de biomolécula pode ser
submetido à eletroforese, desde que nas condições experimentais
apresentem carga líquida diferente de zero.
Quando uma molécula carregada é submetida ao efeito de um
campo elétrico, as forças atrativa e repulsiva que regem as interações
entre as cargas fazem com que ela se afaste do polo com carga igual à
sua e migre em direção ao polo com carga oposta. Essa migração em
misturas de biomoléculas é ainda regida pelo tamanho e formato destas.
Quanto maiores as moléculas, mais elas ficam retidas pela matriz em
que acontece a eletroforese, podendo ser fibras de celulose no papel
embebido em tampão ou um gel de agarose ou poliacrilamida. A forma
da molécula também influencia na migração; moléculas com
organização espacial em formas globulares passam mais facilmente nas
malhas dos suportes, migrando mais eficientemente que as moléculas
mais distendidas.
A eletroforese em papel é um processo realizado em condições
laboratoriais, em que o pH do meio é controlado através de uma
solução-tampão, usando-se alta voltagem (300V), produzindo assim um
campo elétrico, que faz com que os aminoácidos migrem em
determinadas direções com velocidades variáveis. A separação dos

aminoácidos é baseada na carga; porém, o tamanho do grupo lateral (R)
também influencia. Na eletroforese em papel, um sistema com duas
cubas contendo tampão é utilizado com uma conexão em papel
Whatman embebido também em tampão, por onde correrão as amostras
durante a eletroforese. O sistema é conectado a uma fonte contínua, que
fornece a diferença de potencial responsável pela migração. As
amostras são aplicadas em um ponto médio do papel e, de acordo com
sua carga líquida, migram para o polo com maior afinidade (Figura 9.1).
Figura 9.1 – Esquema de uma eletroforese em papel: aplicação da

amostra nas tiras de papel: as tiras são marcadas com os
polos da fonte e a amostra é aplicada no centro do papel
(A); montagem do aparato eletroforético – o papel
embebido em tampão é fixado na cuba com as
extremidades mergulhadas no tampão de corrida (B).
Cada marcação dos polos da fonte deve ser corretamente
posicionada na cuba de acordo com a posição dos
eletrodos. A cuba é fechada e a fonte acionada para que
a corrida se inicie.
Após a corrida, as moléculas são reveladas. No caso dos

aminoácidos, uma reação com ninhidrina (Roteiro 8 – Figura 8.2)
produz um complexo violeta, à exceção da prolina, que forma um
produto amarelado.
Objetivo geral
Capacitar o aluno para entender o processo de eletroforese em
papel, pela separação e identificação de alguns aminoácidos.

1 aparelho de eletroforese; 1 papel (Whatman no 1) em tiras de 2 × 40
cm; 3 tubos capilares; 1 pulverizador; 1 régua; 1 lápis; 1 estufa (90-100
°C); 1 pinça metálica; e 1 capela de exaustão.
Reagentes
Solução-tampão de ácido acético (CH3COOH)-acetato de sódio
(CH3COONa) 0,1M, pH 4,6; solução de aminoácidos (glicina, arginina
e ácido glutâmico) a 0,1M; e solução reveladora: ninhidrina 0,1% (p/v)
em acetona (CH3(CO)CH3).
Procedimento1
1. Faça uma marcação no meio do papel Whatman com lápis,
onde serão aplicadas as amostras. Não se esqueça de anotar os nomes
dos aminoácidos que estão sendo aplicados em cada ponto. Nas bordas,
faça uma marcação (+) e (-), que serão conectadas aos polos positivos
e negativos, respectivamente.
2. Aplique as amostras com o tubo capilar ao longo da linha
tracejada e deixe secar.
3. Embeba cada tira de papel em solução-tampão de maneira que
suas extremidades fiquem mergulhadas no tampão da cuba e a sinalização
dos polos esteja corretamente posicionada com o cátodo (-) e o ânodo (+).
4. Feche o aparelho, ligue-o e ajuste a voltagem para 300V.
5. Deixe a corrida proceder por aproximadamente uma hora,
desligue o aparelho, retire o papel e seque-o em estufa (90-100 °C)
por 2 min.

1Utilize este endereço para fazer uma simulação virtual da eletroforese:
http://www.iq.usp.br/bayardo/softwares/eletroforese/ .
6. Pulverize o papel seco com solução de ninhidrina 0,1% (p/v)

com o auxílio do pulverizador.
7. Seque em estufa (90-100 °C) para revelação dos
aminoácidos, por no máximo 5 min, para evitar manchas extensivas.
Exercícios
1. Qual é a finalidade do uso da solução-tampão?
2. Calcular a massa (g) de acetato de sódio e o volume (mL) de
ácido acético para preparar 1 L de uma solução-tampão 0,1M, pH 4,6.
Dados: acetato de sódio PM = 136,08 g/mol; e ácido acético PM = 60,05
g/mol, d =1,05 g/mL. Verificar o valor de pK na Tabela 9.1.
3. Defina ponto isoelétrico (pI) e justifique a importância de
determinar o pI de um aminoácido ou de uma proteína.
4. Calcule o pI dos aminoácidos glicina e aspartato. Com base
em seu cálculo, sugira um pH para a separação eletroforética desses
aminoácidos em mistura e faça um esquema simulado dessa separação.
Utilize as tabelas do Adendo para justificar o uso do ácido e sua base
conjugada com os quais o tampão será preparado.
Respostas: 5,97 e 2,77.
5. Explique por que os aminoácidos podem migrar tanto para o
polo positivo como para o polo negativo, dependendo do valor de pH
do tampão em que estiverem em solução. Em seu raciocínio, construa
uma relação entre cargas positivas, cargas negativas e o pI.
Adendo
Tabela 9.1 - Valores de pK de alguns ácidos e bases
Ácido ou base Fórmula pK
Ácido acético CH3COOH 4,76
Ácido bórico HBO3 9,24
Ácido carbônico H2CO3 3,77
Ácido fosfórico H3PO4 2,14
Bicarbonato HCO3- 10,20
Etanolamina C2H7NO 9,44
Fosfato di-hidrogênio H3PO4- 6,86
Fosfato mono-hidrogênio HPO2-4 12,4
Tris (hidroximetil aminometano) NH2C(CH2OH)3 8,10
Tabela 9.2 - Aminoácidos e os respectivos valores de pK

Aminoácidos pK1 pK2 pKR
Fenilalanina 1,83 9,13 -
Leucina 2,36 9,60 -
Isoleucina 2,36 9,68 -
Metionina 2,28 9,21 -
Valina 2,32 9,62 -
Prolina 1,99 10,96 -
Alanina 2,34 9,69 -
Triptofano 2,38 9,39 -
Glicina 2,34 9,60 -
Serina 2,21 9,15 -
Treonina 2,11 9,62 -
Tirosina 2,20 9,11 10,07
Glutamina 2,17 9,13 -
Asparagina 2,02 8,80 -
Cisteína 1,96 10,28 8,18
Histidina 1,82 9,17 6,00
Lisina 2,18 8,95 10,53
Arginina 2,17 9,04 12,48
Aspartato 1,88 9,60 3,65
Glutamato 2,19 9,67 4,25
Figura 9.2 - Estrutura molecular dos aminoácidos proteicos.

ROTEIRO 10
ESTUDO DA SOLUBILIDADE DE
PROTEÍNAS
Introdução
As proteínas são macromoléculas formadas por resíduos de
aminoácidos unidos por ligação peptídica. Na formação desse tipo de
ligação, os elétrons disponíveis do átomo de nitrogênio no grupo amino
de um aminoácido atacam o carbono da carboxila de outro aminoácido,
deficiente em elétrons, formando uma ligação amídica (Figura 10.1).
Figura 10.1 - Esquema de formação de uma ligação peptídica entre dois

aminoácidos.
Observa-se nesta figura que os elétrons do nitrogênio atacam o

carbono da carboxila e forma-se uma ligação do tipo amida, chamada
ligação peptídica (destacada em cinza). A reação de formação da
ligação peptídica é de condensação, com liberação de uma molécula de
água. O quadro tracejado indica os átomos envolvidos na saída da
molécula de água, pertencentes aos grupos carboxila e amino.
A ligação peptídica entre os aminoácidos confere às proteínas
algumas propriedades estruturais: os elétrons da dupla ligação entre o
carbono da carbonila (antes carboxila) podem se deslocalizar entre o
oxigênio e o nitrogênio, formando uma ligação parcialmente simples e
parcialmente dupla. Isso faz com que essa ligação seja rígida e planar,
criando o que se chama plano peptídico, no qual os átomos envolvidos
na ligação peptídica estão sempre no mesmo plano. Além disso, ela é
uma ligação do tipo trans, ou seja, o nitrogênio derivado do grupo
amino de um aminoácido e a carbonila derivada do grupo carboxila de
outro aminoácido apontam para lados opostos na ligação peptídica.
As proteínas apresentam níveis organizacionais hierárquicos,
ou seja, a cadeia assume conformações de acordo com a interação entre
os átomos que constituem a molécula. A cadeia polipeptídica e as
interações covalentes entre os aminoácidos, por exemplo as pontes
dissulfeto, fazem parte da estrutura primária – nada mais que os
aminoácidos ligados uns aos outros, ordenadamente, por ligação
peptídica. Essa estrutura apresenta arranjos ordenados na forma de
hélice (‫ܤ‬-hélice) ou de folhas distendidas (conformação ȕ) devido à
interação por ligações de hidrogênio entre o grupo amino e o grupo
carboxila dos aminoácidos da cadeia, dando origem à estrutura
secundária. Além disso, as cadeias laterais dos aminoácidos podem
interagir entre si por diversos tipos de interações não-covalentes
(ligação de hidrogênio, forças de Van der Waals, interação hidrofóbica,
interação iônica) e covalentes (pontes dissulfeto), formando um arranjo
tridimensional complexo, termodinamicamente favorável, em seu
estado nativo, chamado de estrutura terciária. Por fim, a estrutura
tridimensional de uma proteína em múltiplas subunidades é chamada
estrutura quaternária.
A conformação de uma proteína sob condições fisiológicas
padrão e com suas atividades biológicas é denominada estrutura nativa.
O estudo das proteínas requer que as condições do ambiente nativo
(células, vasos sanguíneos, seiva elaborada etc.) sejam produzidas in

vitro, para permitir a reprodutibilidade funcional das proteínas.
A solubilidade de uma proteína depende do número e do arranjo
de cargas na molécula que por sua vez, depende da composição de
aminoácidos. As partes não proteicas da molécula, por exemplo
lipídeos, carboidratos e fosfatos, também influenciam na solubilidade
das proteínas.
A solubilidade depende das interações que ocorrem entre as
moléculas de proteínas (interação proteína-proteína) e as de proteína e
o solvente (interação proteína-meio). Qualquer fator que interfira na
estabilidade e no equilíbrio do conjunto de interações provoca alteração
na solubilidade das proteínas. Dentre os fatores que influenciam a
estabilidade e, consequentemente, a interação proteína-meio, podem-se
citar o pH, a força iônica, o potencial redox, a temperatura e a presença
de sais, solventes e aditivos. Quanto maior a interação proteína-meio,
maior a solubilidade das proteínas e, quanto maior a interação proteína-
proteína, menos solubilizadas as proteínas se encontram, sendo assim
mais propícias à precipitação. Nos processos de purificação de
proteínas, tanto em escala laboratorial quanto industrial frequentemente
são utilizadas as suas características da solubilidade para purificá-las,
visando à manutenção da atividade biológica dos seus produtos.
Alterações nas estruturas quaternária, terciária e secundária
sem que se perca a estrutura primária constituem o processo de
desnaturação, que pode ou não ser irreversível. Já alterações protéicas
que atinjam a estrutura primária correspondem ao processo de
degradação, sendo este irreversível. Portanto, enquanto mudanças
extremas podem levar à desnaturação proteica, existem condições que
podem alterar a solubilidade sem, contudo, afetar sua integridade
estrutural.
Os protocolos de estudo das proteínas devem conduzir à
manipulação suave das soluções em que estas estão contidas, não só
abordando os seus aspectos intrínsecos como também do tipo de matriz
biológica da qual estão sendo obtidas. Um exemplo prático do tipo de
cuidado supracitado é o emprego de pH ligeiramente alcalino para
reduzir a atividade de enzimas proteolíticas de vacúolos e lisossomos
durante o rompimento de células no processo de extração proteica.
Fatores que modelam o comportamento das

proteínas
. Potencial hidrogeniônico (pH): precipitação isoelétrica
O pH influencia a ionização de aminoácidos ácidos e básicos,
afetando as cargas das moléculas e, consequentemente, os padrões de
interações intermoleculares. As proteínas tendem a ter maior
estabilidade no ponto isoelétrico (pI), no qual a carga líquida da
proteína é igual a zero e a repulsão entre cada unidade proteica é menor,
reduzindo a solubilidade e contribuindo para a precipitação. Em valores
de pH menores que o pI, a carga líquida da proteína é positiva
(protonada) e, em valores de pH maiores que o pI, a carga líquida da
proteína é negativa (desprotonada), aumentando a solubilidade da
proteína (Figura 10.2).
Figura 10.2 - Efeito do pH na solubilidade das proteínas da clara do ovo

com concentração constante de NaCl 0,1M. Observa-se
menor solubilidade em torno do pH 4,6, que constitui o pI
da caseína (proteína da clara do ovo).
Recomenda-se o uso de tampões de qualidade para trabalhos

com proteínas, para estabilizar o pH e manter a funcionalidade destas.
O conhecimento do pI permite que técnicas de precipitação sejam

empregadas sem que as características do estado nativo sejam
permanentemente comprometidas.
. Concentração de sais: precipitação por força iônica
A presença de íons salinos pode alterar a solubilidade das
proteínas. O efeito de salting-in caracteriza o aumento da solubilidade
de proteínas pela adição de baixas a moderadas concentrações de sais
(NaCl, por exemplo), favorecendo assim a interação proteína-meio. E o
efeito de salting-out caracteriza o decréscimo da solubilidade de
proteínas, pela adição de altas concentrações de sais (a exemplo de
(NH4)2SO4; Na2SO4), fazendo com que os íons salinos compitam com
a proteína pelas moléculas de água, resultando em uma diminuição da
solvatação da proteína, favorecendo a interação proteína-proteína e
consequente aumento da precipitação (Figura 10.3). De maneira geral,
íons que reduzem a solubilidade de proteínas estabilizam a estrutura
nativa de modo que as proteínas que precipitam pela adição de sais não
são desnaturadas. Técnica muito utilizada em protocolos de purificação
de proteínas, na qual cada proteína tem uma concentração mínima de
sal necessária para causar a sua precipitação.
Figura 10.3 - Efeito da força iônica sobre a solubilidade de proteínas da

clara do ovo em diferentes concentrações de Na2SO4, em
pH 8,0.
. Temperatura: precipitação pelo calor

A precipitação pelo calor varia com a natureza das proteínas
(40 a 60 °C). A maioria das proteínas é solúvel à temperatura ambiente
e um aumento da temperatura favorece a solubilidade destas. Altas
temperaturas aumentam a vibração dos átomos que constituem as
moléculas e, por conseguinte, há probabilidade de alterações nas
estruturas proteicas, devido ao aumento da flexibilidade topológica
causada pela ruptura de interações não covalentes importantes na
manutenção das estruturas secundária e terciária. Pode haver também o
favorecimento da quebra de pontes dissulfeto, elevação das taxas de
desaminação e aumento da exposição de domínios hidrofóbicos, todos
contribuindo para a precipitação. Dessa forma, as proteínas
desnaturadas pelo calor são mais facilmente precipitadas. De maneira
geral, as soluções de proteínas devem ser armazenadas sob
temperaturas abaixo de 4 °C para garantir a preservação das moléculas
no seu estado nativo. O uso do congelamento, embora muito
empregado, pode causar desnaturação em algumas proteínas, embora
seja pouco comum. Para evitar isso, agentes crioprotetores como o
glicerol ou soluções concentradas de osmólitos são utilizados.
. Potencial redox (Eh)
O potencial de oxidação-redução da solução influencia
fortemente o estado oxidativo dos resíduos de aminoácidos, em especial
os de cisteínas, que contêm grupos sulfidrílicos responsáveis pela
formação das pontes dissulfeto. Quanto maior o potencial redutor do
solvente, maior a proporção de sulfidrilas livres (-SH), ao contrário,
quanto mais oxidante, maior a proporção de ligações dissulfeto (-S-S-).
As ligações dissulfeto são essenciais para a conformação do estado
nativo, portanto, alterações nas suas ocorrências impactam na estrutura
da proteína. Esse princípio é utilizado nos alisamentos e
remodelamentos químicos de cabelo, nos quais se aplicam agentes
redutores no cabelo, remodelando-se o fio e aplicando-se em seguida
agentes oxidantes para estabilizar a nova forma da fibra.
. Metais pesados
Os metais pesados (ex. Hg2+, Pb2+, Cu2+, Zn2+) são cátions que
podem apresentar várias valências e interagir com diversos resíduos de
aminoácidos simultaneamente, levando a um padrão de coagulação que
reduz drasticamente a solubilidade das proteínas e à formação de
proteinatos dos metais (sais insolúveis).
. Reagentes ácidos
Na presença de determinados ácidos (por exemplo, ácido
tricloroacético – TCA) a solubilidade de algumas proteínas é reduzida,
levando à formação de sais insolúveis.
. Solventes orgânicos
Os solventes alteram a constante dielétrica das soluções e
podem conferir funções adicionais como ação crioscópica,
estabilização estrutural proteica, efeito caotrópico ou cosmotrópico,
formação de quelatos com íons metálicos, ação antioxidante e
inibição de proteases. Em relação à solubilidade, podem-se aplicar
solventes orgânicos (etanol ou acetona, por exemplo) para reduzir a
constante dielétrica da solução, contribuindo para reduzir a interação
proteína-meio, ocasionando a precipitação das proteínas. Ao
contrário, um aumento da constante dielétrica da solução favorece a
interação proteína-meio, aumentando a solubilidade da proteína.
Objetivo geral
Capacitar o aluno para entender como alguns fatores
(temperatura, força iônica e pH da solução) influenciam a
solubilidade de proteínas.

1 béquer de 50 mL; 5 tubos de ensaio; 1 grade para tubos de ensaio; 1
bastão de vidro; 4 pipetas Pasteur; 1 pinça de madeira; 1 proveta de 10 mL;
1 banho-maria fervente; e 1 pisseta com água destilada.
Reagentes
Água destilada; solução de ovoalbumina 1% (v/v) (usar clara de ovo);
clara de ovo in natura; Solução de caseína 1% (p/v); ácido
tricloroacético (TCA) 10% (p/v); NaCl 0,1M; e solução saturada de
sulfato de amônio ((NH4)2SO4).
Procedimento
Efeito da temperatura
1. Pipete 2 mL da solução de ovoalbumina 1% (v/v) e coloque
em um tubo de ensaio.
2. Pipete 2 mL da solução de caseína 1% (p/v) e coloque em
outro tubo de ensaio.
3. Aqueça os tubos em banho-maria fervente por 5 min.
4. Observe os resultados.
Efeito do pH usando reagentes ácidos

1. Pipete 2 mL da solução de ovoalbumina 1% (v/v) e coloque
em um tubo de ensaio.
2. Pipete 2 mL da solução de caseína 1% (p/v) e ponha em outro
tubo de ensaio
3. Adicione, gota a gota, TCA 10% (p/v).
Efeito da força iônica

. Salting-in
1. Pipete 2 mL da clara de ovo in natura e coloque em um
béquer de 50 mL.
2. Dilua com água destilada (5 mL) sob agitação usando um
bastão de vidro.
3. Observe a solubilidade da proteína.
4. Adicione, gota a gota, solução de NaCl 0,1M.
. Salting-out
1. Pipete 2 mL da solução diluída da clara de ovo do item
anterior e coloque em um tubo de ensaio.
2. Adicione 2 mL da solução saturada de (NH4)2SO4 e observe
os resultados.
3. Adicione 5 mL de água destilada.

Exercícios
1. Critique a seguinte afirmativa: a desnaturação causa
precipitação da proteína e toda a proteína precipitada está desnaturada.
2. Qual é a diferença entre desnaturação e degradação de
proteínas?
3. Cite duas técnicas de precipitação de proteínas utilizadas
para purificação sem que haja perda da atividade da proteína purificada.
4. Explique como a temperatura afeta a solubilidade das
proteínas.
5. Que técnica poderá ser utilizada para separar proteínas com
pesos moleculares diferentes? E com pI diferentes e próximos?
6. O que é uma substância dielétrica?
7. Por que os solventes orgânicos, como acetona ou etanol,
causam redução da solubilidade das proteínas?
ROTEIRO 11
DOSAGEM DE PROTEÍNAS DO LEITE POR

ESPECTROFOTOMETRIA
Introdução
A espectrofotometria como ferramenta analítica

Pesquisas que envolvem biomoléculas geralmente
necessitam da quantificação da molécula em estudo. Com as
proteínas não é diferente: diversos métodos de quantificação têm
sido desenvolvidos para aumentar as opções disponíveis, já que os
métodos dependem da natureza da proteína, da finalidade analítica,
da rapidez e do custo do protocolo, além de visar a maior
sensibilidade e eficiência possíveis.
Nesse contexto, a espectrofotometria tem sido uma
ferramenta analítica muito útil. Sabe-se que, a natureza química das
moléculas permite que elas absorvam luz em determinado
comprimento de onda, de modo a excitar seus elétrons e os promover
a níveis mais altos de energia por um pequeno intervalo de tempo.
Algumas moléculas, quando os seus elétrons retornam ao nível basal
de energia, liberam essa energia absorvida para o ambiente em que
se encontram, podendo esta ser inclusive quantificada. É o que
acontece em leituras de fluorescência.
No caso da espectrofotometria de luz (UV-Visível), um feixe
de luz monocromático (resultado da decomposição da luz branca e
filtragem por um monocromador) atinge uma solução, onde parte da
luz é absorvida pelas moléculas e parte da luz é transmitida através
da solução. A Figura 11.1 apresenta um esquema do funcionamento
dos espectrofotômetros.
Figura 11.1 - Esquema de funcionamento de um espectrofotômetro:

uma fonte de luz policromática emite feixes de luz que
são convergidos na superfície de um espelho
colimador. Esse feixe é difratado por um prisma ou
grade de difração e os feixes monocromáticos
selecionados por uma fenda. A luz no comprimento de
onda (nm) específico atravessa a cubeta com a amostra,
onde é retida (I0) em partes pelas moléculas em solução
e a luz transmitida (I) chega ao detector. Um sinal
elétrico é gerado, amplificado e, automaticamente, a
transmitância é convertida em absorbância,
apresentada no registrador.
A razão entre a quantidade de luz absorvida e a quantidade de

luz transmitida é uma medida indireta da concentração da substância na
solução. Assim é também para a luz; quanto mais concentrada a solução
a ser analisada, menos luz irá passar através dela, consequentemente a
transmitância será baixa. Diante disso, pode-se definir a transmitância
(T) como a razão entre a luz emergente (I) e a luz incidente (I0),
conforme a equação (1).
T = I/I0 (1)
A transmitância é uma função da concentração, do caminho
óptico (espessura da cubeta) e do coeficiente de extinção molar,
constante característica de cada molécula, que reflete sua capacidade de
absorver luz. Sendo assim, pode-se descrever a transmitância conforme
a equação (2):
T = 10-H.L.C (2)
em que:
T: transmitância;
H: coeficiente de extinção molar;
L: espessura da solução atravessada pela luz (espessura da
cubeta); e
C: concentração da substância.
Esta é uma função logarítmica, mostrando que, conforme o
esperado, à medida que a concentração da solução aumenta, a
transmitância diminui (Figura 11.2A). Aplicando log na equação (2)
obtemos a equação (3):
log T = -H.L.C (3)
Os espectrofotômetros, que são os instrumentos capazes de
medir a transmitância, costumam fornecer os dados em valores de
absorbância (A), ou seja, uma medida da quantidade de luz retida na
solução – equação (4).
T=1-A (4)
De acordo com a equação (4), a quantidade de luz transmitida
é igual a 100% da luz incidida menos a luz que foi absorvida pelas
moléculas. Portanto, de (4) em (3), tem-se a equação (5):
log 1 - log A = -log H.L.C.
0 - log A = - log H.L.C.
A = H.L.C. (5)
Note que a absorbância é uma função linear dos mesmos
parâmetros que definem a transmitância (Figura 11.2), e, caso se saiba
o coeficiente de extinção molar do analito em questão, basta substituir
os valores na equação (5) para determinar sua concentração. Essa
relação é chamada Lei de Lambert-Beer (a absorbância da substância
é diretamente proporcional à concentração da substância e à espessura
da solução atravessada pela luz em um determinado comprimento de
onda).
Figura 11.2 - Relação entre a transmitância (A) e a absorbância (B)

quanto à concentração de analito em uma amostra. Note
que à medida que se aumenta a concentração, a
transmitância diminui em uma escala logarítmica. Ao
contrário, a medida que se aumenta a concentração da
solução, a absorbância eleva linearmente.
Uma vez que como as moléculas poliméricas, como as

proteínas, não possuem um coeficiente de extinção molar definido e,
geralmente, não estão puras em solução, utilizam-se curvas de
calibração (curva-padrão) analíticas construídas com concentrações
crescentes do analito, as quais correlacionam-se à absorbância por meio
de funções lineares. Por exemplo, para determinar a concentração de
proteínas em uma matriz complexa, faz-se uma curva com cinco ou seis
soluções de uma proteína-padrão, como a soroalbumina bovina (BSA),
em concentrações crescentes e lê-se a absorbância de todas as soluções.
Feito isso, procede-se a uma análise de regressão linear que fornece os
parâmetros de construção de uma função afim capaz de representar a
relação, concentração de proteína versus absorbância. Essa equação é
utilizada para quantificar a concentração de proteínas em uma amostra
desconhecida com base na leitura de absorbância da solução. Vale
lembrar que as curvas de calibração possuem um intervalo de
linearidade, com um valor mínimo de concentração e um valor máximo,
chamados limites inferior e superior de quantificação, respectivamente.
Soluções em que se deseja analisar a concentração de um componente
fora desses limites não se adequam à curva de calibração e geram
estimativas com alto erro associado.
Método do Biureto para quantificação de proteínas

O Biureto é um composto orgânico com uma estrutura
semelhante a um dipeptídeo (Figura 11.3). Esse composto, em reações
com sais de cobre, desenvolve uma cor violeta, dada a complexação dos
íons cúpricos (Cu3+) com os grupos amino do composto.
Figura 11.3 - Estrutura do Biureto
No caso das proteínas, os íons cúpricos coordenam-se com

quatro grupos amino das cadeias polipeptídicas, gerando uma cor
violeta semelhante à observada na reação do Biureto (Figura 11.4).
Figura 11.4 - Condensação entre os íons cúpricos e os grupos amino da

cadeia polipeptídica formando o complexo de coloração
violeta.
A sensibilidade do método do Biureto varia entre 1 e 10 mg/mL,

o que permite com que seja utilizado para avaliar a quantidade de
proteínas no leite de modo rápido, eficiente e barato. Existem métodos
semelhantes para a quantificação de proteínas, como o de Lowry, em
que os complexos de cobre-proteína levam à redução de um reagente,
potencializando a coloração gerada. Outros métodos como Kjeldahl,
Bradford e Bicinconínico também são usados para quantificação de
proteínas em soluções ou alimentos. Vale ressaltar que o método do
Biureto é aplicável à quantificação de qualquer tipo de proteína e não
somente às derivadas do leite.
Aspectos matemáticos na construção da curva-

padrão
A correlação linear entre duas variáveis é feita para minimizar
ao máximo o erro embutido nas medidas, que servirão para a geração
de um modelo capaz de predizer concentrações em soluções complexas.
O cálculo mais utilizado para esse tipo de regressão é o método dos
mínimos quadrados, em que a soma do quadrado da diferença entre
dados observados e dados estimados é mínima. Esse método modela
dados que aparentemente descrevem uma reta sobre pontos que, de fato,
pertencem a uma reta, com a menor distância possível entre eles.
Quanto mais pontos experimentais forem feitos, mais bem modelados
serão os dados sobre a reta. Portanto, para experimentos analíticos
muito acurados, recomenda-se que sejam feitos pelo menos dez pontos
em triplicata.
Vale lembrar que uma equação que descreve uma reta no
espaço é do tipo y = ax + b, em que a é o coeficiente angular da reta e
b o coeficiente linear da reta. No caso da quantificação
espectrofotométrica de proteínas, os valores de concentração de
proteínas são representados pela variável x e os de absorbância pela
variável y. Tendo um conjunto de dados correlatos, como a
concentração da amostra e respectiva absorbância, pode-se construir o
modelo matemático para a predição da concentração com base na
leitura de absorbância, sendo os coeficientes linear (a) e angular (b)
representados pelas equações:
(6)
(7)
A qualidade da regressão linear pode ser dada pelo coeficiente
de correlação de dados (R2), que indica o quão próximos os pontos
teóricos de uma reta estão dos pontos obtidos na curva-padrão. Essa
medida é dada pela seguinte fórmula:
(8)
Quanto mais próximo de uma for esse valor, mais bem
relacionados estão os dados, portanto, melhores serão as predições
utilizando esse modelo. Valores de R > 0,98 são aceitáveis para boas
predições.
Para facilitar a compreensão, suponha a construção de uma
curva-padrão com soroalbumina bovina (BSA), feita com cinco pontos,
com as concentrações e absorbâncias correspondentes listadas na
Tabela 11.1.
Tabela 11.1 - Valores teóricos de concentração e absorbância para uma

curva-padrão construída com BSA
Amostra Concentração de BSA (mg/mL) A540 nm
1 1,0 0,045
2 2,0 0,100
3 3,0 0,150
4 4,0 0,200
5 5,0 0,245
Com os produtos e os somatórios exigidos para a definição dos

coeficientes linear e angular da reta, obtém-se a Tabela 11.2.
Tabela 11.2 - Dados para obtenção da equação da reta

Amostra (n) x (mg/mL) y (A540 nm) x.y x2 y2
1 1 0,045 0,045 1,0 0,002025
2 2 0,100 0,200 4,0 0,01
3 3 0,150 0,450 9,0 0,0225
4 4 0,200 0,800 16,0 0,04
5 5 0,245 1,225 25,0 0,06
15 0,740 2,720 55,0 0,13455
Dessa forma, tem-se que:
Portanto, a função que relaciona valores de absorbância e de

concentração de proteínas é y = 0,05x - 0,002. Vale ressaltar que essa
equação é válida para amostras cuja concentração se enquadra dentro
dos valores com os quais se construiu a curva-padrão. Amostras muito
diluídas ou concentradas precisam ser adequadas para os limites
mínimo e máximo de quantificação para que o modelo matemático seja
mantido. Quando uma amostra é diluída, a sua concentração real após
a leitura de absorbância e predição de concentração pelo modelo deve
ser corrigida multiplicando-se esse valor pelo fator de diluição (FD),
que é dado pela equação (9):
FD = VT/Vanalito (9)
em que VT: volume total de reação; e Vanalito: volume de analito

(corresponde ao volume inicial da amostra).
O método dos mínimos quadrados pode ser trabalhoso quando
calculado manualmente ou por meio de tabelas, no caso de o volume de
amostras ser muito grande. Para isso, as calculadoras científicas
facilitam o trabalho, por automatizem os cálculos. A seguir, será
apresentado um breve tutorial de como realizar uma regressão linear
usando a calculadora. Isso não dispensa o aluno de entender o método
dos mínimos quadrados e como determinar os coeficientes linear e
angular de uma função afim.
Passo 1 – Reset da calculadora

1. Aperte a tecla SHIFT.
2. Aperte a tecla MODE.
3. Selecione a opção 3 (ALL) para limpar a memória da
calculadora e voltá-la ao modo inicial (operações algébricas simples)
de uso.
4. Aperte a tecla de igualdade (=).
(*) A calculadora será reiniciada quando se apertar qualquer tecla.
Passo 2 – Escolhendo o modo de regressão linear

1. Aperte a tecla MODE.
2. Selecione a opção 3 (REG).
3. Selecione a opção 1 (LIN).
(*) A calculadora entrará no modo de regressão linear, indicado
pela palavra REG na parte superior do visor.
Passo 3 – Entrada de dados na calculadora

Obs.: Deve-se sempre entrar com os pares de dados na ordem
x, y, ou seja, valores de concentração seguidos de valores de
absorbância.
1. Digite o valor de x.
2. Aperte a tecla de vírgula (,), ao lado da tecla M+.
3. Digite o valor de y.
4. Aperte a tecla M+.
(*) A calculadora irá registrar o par x,y indicando como n=1.
5. Repita o processo com o par x, y, indicando n = 2 e assim
sucessivamente.
Passo 4 – Acessando os dados na calculadora

Para acesso aos somatórios, caso se deseje conferir os valores
tabelados e manualmente calculados:
2. Selecione a tecla 1 (S-SUM).
3. Mova a seta para a direita e esquerda para acessar os valores

de somatório.
4. Apertar a tecla de igualdade (=), depois de selecionada a
opção desejada.
Para acesso aos coeficientes da reta:
2. Selecione a tecla 2 (S-VAR).
3. Mova a seta para a direita até que se visualizem as letras A,
B e r.
4. Selecione A para obter o coeficiente linear da reta (b da
equação).
5. Selecione B para obter o coeficiente angular da reta (a da
equação).
6. Selecione r para obter o coeficiente de correlação. Lembre-
se de elevá-lo ao quadrado.
. Após terminar sua operação de regressão, repita o passo de
reset da calculadora para evitar posteriores confusões com dados nela
armazenados.
Objetivo geral
Capacitar o aluno para quantificar as proteínas presentes no
leite desnatado pelo método do Biureto usando a técnica de
espectrofotometria.

1 erlenmeyer de 100 mL; 1 bureta de 25 mL; 2 provetas de 10 mL;
3 béqueres de 50 mL; 1 béquer de 100 e 500 mL; 1 funil analítico;
10 tubos de ensaio; 1 grade para tubos de ensaio; 1 papel-filtro; 11
pipetas volumétricas de 1 mL; 1 pipeta graduada de 5 e 20 mL; 13
pipetadores de sucção; 1 agitador de tubos; 1 cubeta de vidro; 1
espectrofotômetro; 1 pisseta com água destilada; e 1 aparato para
filtração simples.
Reagentes
Leite desnatado; soluções-padrão de proteína (caseína): 1, 2, 4, 6, 8 e
10 mg/mL; HCl 2% (v/v); reagente de Biureto: 1,5 g de sulfato de cobre
(CuSO4) cristalizado, 6 g de tartarato duplo de sódio; e potássio
(KNaC4H4O6.4H2O) dissolvidos em 500 mL de água destilada.
Adicionar 300 mL de NaOH 10% (p/v) sob agitação, completar o
volume com água destilada para 1 L e filtrar a solução preparada.
Procedimento
Preparo das amostras para quantificação das
proteínas
. Amostra I – Lactoproteínas (lactoalbumina e lactoglobulina)

1. Adicione 10 mL de leite desnatado e 10 mL de água destilada
em um erlenmeyer de 100 mL.
2. Acrescente vagarosamente HCl 2% (v/v) na solução diluída
acima, usando uma bureta de 25 mL, até ocorrer a precipitação
isoelétrica da caseína (pH 4,6). Anote o volume de HCl gasto (0,5 a
1 mL).
3. Faça uma filtração simples da solução, descartando o papel-
filtro (caseína).
4. Reserve o filtrado (amostra I) contendo as lactoproteínas do
leite.
. Amostra II – Proteínas totais

1. Dilua o leite desnatado em 1:20 com água destilada (1 mL de
leite e 19 mL de água) em um béquer de 50 mL.
2. Reserve a solução preparada (Amostra II), contendo as
proteínas totais do leite.
Leitura das absorbâncias das amostras pelo

método do Biureto
1. Enumere três tubos de ensaio (0, 1 e 2) e adicione em cada
tubo, separadamente, 1 mL de água destilada, 1 mL de amostra I e 1 mL
de amostra II, conforme indicado na Tabela 11.3.
2. Adicione 4 mL do reagente de Biureto em cada tubo.

3. Agite os tubos em vortex e deixe em repouso por 15 min.
4. Faça a leitura das absorbâncias (tubos 1 e 2) em
espectrofotômetro a 540 nm, zerando o equipamento com o tubo 0
(branco).
5. Faça a leitura das absorbâncias das amostras I e II e anote os
valores.
Tabela 11.3 - Procedimento e resultado da leitura a 540 nm das amostras

I e II
Tubo Amostra Reagente
0 1 mL de água
4 mL do reagente de
1 1 mL da Amostra I
Biureto
2 1 mL da Amostra II
Agitar em vórtex
Repouso – 15 min
Valores das absorbâncias
Tubo 0 (Branco) Zerar o equipamento
Leitura (540 nm) Amostra I
Amostra II
Curva-padrão (Curva de calibração)

1. Enumere sete tubos de ensaio (0 a 6) e adicione
separadamente em cada tubo, 1 mL de água e 1 mL das soluções-padrão
de caseína nas concentrações de 1, 2, 4, 6, 8 e 10 mg/mL, conforme
Tabela 11.4.
2. Adicione 4 mL do reagente de Biureto em cada tubo.
3. Agite os tubos em vortex e deixe em repouso por 15 min.
4. Faça a leitura das absorbâncias (tubos 1 a 6) em
espectrofotômetro a 540 nm, zerando o equipamento com o tubo 0
(branco).
5. Anote os valores das absorbâncias das soluções-padrão.
6. Construa no programa Excel o gráfico, absorbância versus
concentração da caseína para obtenção da equação da reta (Y = ax + b),
em que Y é a absorbância (A) e X é a concentração da proteína-padrão
(mg/mL).
Tabela 11.4 - Procedimento e resultado da leitura a 540 nm da curva-

padrão
Tubo Amostra Reagente
0 1 mL água
1 1 mL caseína 1 g/L
2 1 mL de caseína 2 g/L
3 1 mL de caseína 4 g/L 4 mL do reagente de Biureto
5 1 mL caseína 8 g/L
Agitar em vórtex
Repouso – 15 min
Valores das absorbâncias
Tubo 0 (Branco)
Tubo 1 Zerar o equipamento
Tubo 2
Leitura Tubo 3
(540 nm) Tubo 4
Tubo 5
Tubo 6
Quantificação das proteínas nas amostras

1. Na equação da reta obtida no item curva-padrão (Curva de
calibração p. 107) usar os valores de absorbâncias obtidos no item
Leitura das absorbâncias das amostras pelo método do Biureto p. 106
para calcular as concentrações das proteínas presentes nas amostras I
(lactoproteínas) e II (proteínas totais). Não se esqueça de multiplicar o
resultado pelo fator de diluição obtido para cada amostra.
2. O cálculo do teor de caseína do leite será feito pela diferença
entre os valores encontrados nas Amostras II e I.
Exercícios
1. O que diz a lei de Lambert-Beer? As soluções-padrão de
proteína obedeceram a esta lei nas concentrações definidas?
2. Por que devemos construir uma curva-padrão?
3. Em que consiste o método de Biureto?
4. Por que o comprimento de onda utilizado nas análises foi de

540 nm?
5. Na dosagem de proteínas, para que serve o branco?
6. Por que foram feitas diluições do leite no preparo das
amostras I e II??
7. Por que o fator de diluição da amostra I foi menor comparado
à amostra II?
8. A uma amostra de 10 mL de leite foram adicionados 20 mL
de água destilada e 3 mL de HCl 0,2M. Após filtração simples, 1 mL
do filtrado foi utilizado para dosagem de proteínas pelo método do
Biureto. A leitura no espectrofotômetro a 540 nm foi de 0,250.
Sabendo-se que a equação da reta para a curva-padrão de proteína foi
Y = 0,06X - 0,004, qual é a concentração de proteínas da amostra em
g/L e em %? E quais proteínas foram identificadas na amostra?
Respostas: 13,96 g/L; e 1,396%.
ROTEIRO 12
ESTUDO DA POLIFENOLOXIDASE (PFO)
Introdução
As enzimas são catalisadores que medeiam os processos
bioquímicos e que apresentam alta especificidade reacional
(regiosseletividade, seletividade de substrato, seletividade de grupo
funcional e estereosseletividade). A cinética de uma enzima é regida
pela sua concentração da mesma e de seu(s) substrato(s), pela
temperatura e pelo pH. As enzimas são identificadas pelo sistema
proposto pela Enzyme Commission (EC), no qual quatro números
indicam, respectivamente: a classe da reação; a subclasse da reação,
com indicação do tipo de substrato ou grupo químico transferido; a
natureza do co-substrato e o número individual da enzima. Dentre as
seis principais classes de enzimas estão as oxidorredutases, cujo
primeiro algarismo na classificação da EC é 1, indicando que realizam
reações de oxidação-redução.
Uma das principais enzimas da classe das oxidorredutases é a
polifenoloxidase (PFO), ou polyphenol oxidase (PPO), que oxida
compostos fenólicos na presença do oxigênio molecular (O2). Primeiro
a PFO catalisa a hidroxilação de monofenóis, formando ortodifenóis
(posição 1 e 2 das OH) e, segundo, catalisa a oxidação de ortodifenóis
formando as o-quinonas e p-quinonas. Estas são bastante reativas e
podem polimerizar-se gerando produtos de alta massa molecular, como
as melaninas, que apresentam coloração escura (Figura 12.1).
De maneira análoga, a oxidação de compostos fenólicos na
fração orgânica de compostagens também leva à formação de polímeros
de coloração escura, que caracterizam as substâncias húmicas. A função
biológica, ainda que não completamente elucidada, é relacionada a
fatores de proteção bioquímicos pós-formados, que constituem um
mecanismo de defesa das plantas contra fitopatógenos e herbívoros.

Outras funções incluem participação em fenômenos ligados à
fotossíntese e respiração celular, formação e desenvolvimento das
raízes e síntese de lignina.
Figura 12.1 - Reação de biossíntese da melanina a partir de L-tirosina.
As PFO apresentam especificidade, afinidade por substratos

fenólicos e para o O2, têm pH ótimo na faixa de 5 a 7, são inativadas
irreversivelmente em pH 3 a 4 e têm baixa termoestabilidade. O sítio
ativo das PFO geralmente contém dois átomos de cobre cujas valências
alteram ao passo que as reações de oxidação-redução são catalisadas.
Neste roteiro serão testados vários substratos para verificar a
especificidade da PFO (Figura 12.2).
As polifenoloxidases levam ao escurecimento enzimático de

alimentos, principalmente de frutas e vegetais – o que prejudica o
aspecto visual, podendo também ocasionar odores indesejáveis e perda
do valor nutricional por destruição dos aminoácidos aromáticos
(fenilalanina e tirosina). Os métodos de mitigação ou impedimento dos
efeitos do escurecimento enzimático envolvem a supressão do O2 por
atmosfera modificada (nitrogênio ou CO2) ou embalagens a vácuo,
acidificação do produto (ácido ascórbico), tratamento térmico
(branqueamento) e adição de inibidores químicos, por exemplo, sulfitos
ou agentes redutores. No caso de alimentos como café, chocolate e chá,
é desejável ocorrer o escurecimento enzimático.
Figura 12.2 - Compostos testados na prática como substrato para PFO.
Objetivo geral
Capacitar o aluno para entender algumas características da
PFO, como especificidade de substrato e efeito da temperatura.

1 batata inglesa; 1 liquidificador; 1 peneira de nylon; 1 proveta de 250
mL; 1 bastão de vidro; 19 tubos de ensaio; 1 grade para tubos de ensaio;
1 pinça de madeira; 12 pipetas Pasteur; 12 béqueres de 50 mL; 1 béquer

de 250 e 500 mL; banho de gelo; banho-maria a 37 °C; e 1 manta
aquecedora (banho fervente).
Reagentes
Água destilada; substratos a 0,1 mM (ácido cafeico, ácido químico,
ácido gálico, hidroquinona, tirosina, glicose, fenol, catecol, resorcinol e
floroglucinol); Tampão fosfato de sódio 0,1M, pH 6,5.
Procedimento
Preparo do extrato da PFO
1. Adicione ao liquidificador 150 mL de tampão fosfato de
sódio 0,1M, pH 6,5 e por um minuto triture uma batata inglesa
descascada e picada.
2. Filtre o conteúdo do liquidificador em um béquer usando
uma peneira de náilon e um bastão de vidro e deixe em repouso em
banho de gelo por 5 min.
3. Separe o sobrenadante (extrato de PFO), mantendo-o em
banho de gelo.
Estudo da especificidade da PFO

1. Enumere os tubos de ensaio de 1 a 11.
2. Adicione 1 mL dos substratos (soluções preparadas e
identificadas – item Reagentes).
3. Adicione 1 mL de água destilada no tubo controle (-).
4. Incube os tubos de ensaio em banho-maria a 37 °C por 5 min.
5. Adicione aos tubos de ensaio, sem retirá-los do banho, 1 mL
do extrato da PFO obtido no item Preparo do extrato da PFO e deixe
por mais 5 min no banho-maria.
6. Retire os tubos de ensaio do banho-maria e anote as
intensidades da coloração comparando-os com o tubo controle (-),
conforme Tabela 12.1.
Efeito da temperatura na atividade da PFO

. Banho fervente
1. Enumere os tubos de ensaio de 1 a 4.
2. Adicione 1 mL de água destilada no tubo 1, 1 mL de catecol
no tubo 2 e 1 mL de extrato da PFO nos tubos 3 e 4.
3. Incube os tubos no banho fervente por 5 min.
4. Retire os tubos do banho e adicione rapidamente o conteúdo
dos tubos 3 e 4 nos tubos 1 e 2 respectivamente.
5. Incube os tubos 1 e 2 no banho fervente por 5 min.
6. Retire os tubos do banho e anote a intensidade da coloração
comparando com os tubos de ensaio das demais temperaturas (37 °C e
banho de gelo), conforme Tabela 12.2.
. Banho de gelo
1. Repita os procedimentos 1 a 5 do item anterior, porém,
incubando os tubos em banho de gelo.
2. Anote os resultados na Tabela 12.2, compare as intensidades
de coloração nas diferentes temperaturas e faça um gráfico (T × V).
Resultados
Tabela 12.1 - Estudo da especificidade da PFO
Intensidade da
Tubos Substratos
coloração
1 Água destilada
2 Ácido cafeico
3 Hidroquinona
4 Ácido quínico
5 D-glicose
6 Floroglucinol
7 Resorcinol
8 Ácido gálico
9 Catecol
10 Fenol
11 L-tirosina
Tabela 12.2 - Efeito da temperatura na atividade da PFO

Temperatura Intensidade da coloração
Banho de gelo
37 °C
Banho fervente
Exercícios
1. Cite dois fatores que interferem em uma reação enzimática.
Justifique.
2. Qual foi a especificidade da enzima PFO em relação ao
substrato?
3. Como você desenvolveria um experimento para verificar o
efeito do pH na atividade da PFO?
4. Construa gráficos dos efeitos da concentração do substrato e
da enzima na velocidade de uma reação enzimática.
ROTEIRO 13
ESTUDO DA HIDRÓLISE DO AMIDO

Introdução
A principal forma de reserva de carboidratos em plantas é o
amido, um homopolissacarídeo de glicose que pode ocorrer em folhas
(amido primário) ou em tecidos e órgãos de reservas especializados
(tubérculos e rizomas). O mecanismo de imobilização dos resíduos de
glicose na forma de amido contribui para o equilíbrio osmótico,
permitindo a proteção da glicose contra eventos de oxidação, além de
possibilitar o armazenamento de energia na presença de pouca água.
A forma de organização do amido permite distingui-lo em dois
componentes principais, a amilose e a amilopectina. A amilose é linear
e contém glicoses unidas somente por ligações Į(1-4). A amilopectina
é altamente ramificada, apresentando glicoses unidas por ligações
Į(1-4) e Į(1-6), sendo a última responsável pelas ramificações da
cadeia que ocorrem a cada 24 a 30 resíduos de glicose. O amido pode
ser quebrado via hidrólise ácida ou enzimática.
A hidrólise ácida leva à formação de produtos cujo tamanho e
proporção não são específicos, ou seja, carboidratos como dextrinas,
glicose e oligossacarídeos. O processo de hidrólise ácida do amido leva
à formação de compostos furfúricos, sendo desenvolvido sob condições
de baixo pH e elevada temperatura, constituindo assim um processo de
considerável rendimento na indústria alimentícia.
No caso da hidrólise enzimática, várias são as possibilidades de
substrato e ligação preferencial para hidrólise, conforme a Tabela 13.1.
Este procedimento não é bem aceito no que tange ao aspecto econômico
e logístico, uma vez que as soluções enzimáticas apresentam preço mais
elevado que o dos reagentes para o outro tipo de hidrólise, além da
constante necessidade de cuidados com a manipulação destas em
detrimento da susceptibilidade térmica enzimática. Não obstante, a alta
especificidade da reação enzimática e as condições menos perigosas no
ambiente de trabalho (pH e temperatura) são fortes pontos prós.
Tabela 13.1 - Enzimas que atuam sobre o amido

Enzimas Substrato
EC Ligação Produto
preferencial
Endoenzimas Dextrinas e
3.2.1.1 Į(1-4) Amido
Į-amilase maltose
Isoamilase 3.2.1.68 Į(1-6) Amilopectina Amilose
Isomaltase Dextrinas- Maltose e
3.2.1.10 Į(1-6)
limite maltotriose
Ciclomaltodextrinase Ciclodextrinas
Maltose e
3.2.1.54 Į(1-4) e dextrinas
maltotriose
lineares
Pululanase Maltotrioses e
Pululana e
3.2.1.41 Į(1-6) dextrinas
amilopectina
lineares
Isopululanase 3.2.1.57 Į(1-4) Pululana Isopanose
Exoenzimas ȕ-maltoses e
3.2.1.2 Į(1-4) Amido
ȕ-amilase dextrinas
Glicoamilase Į(1-4) e
3.2.1.3 Amido ȕ-glicoses
Į(1-6)
Į-glicosidase 3.2.1.20 Į(1-4) Diversos Į-glicoses
Ciclomaltodextrina-
2.4.1.19 Į(1-4) Amido Ciclodextrinas
glucano-transferase
Objetivo geral
Capacitar o aluno para realizar as hidrólises ácida e enzimática
do amido, acompanhando sua degradação pela formação de açúcar
redutor, utilizando solução de lugol e o teste de Benedict,
respectivamente.

1 béquer de 50 mL; 2 béqueres de 500 mL; 2 erlenmeyers de 250
mL; 20 tubos de ensaio; 1 grade para tubos de ensaio; 4 pipetas
Pasteur; 2 provetas de 25 mL; 1 banho-maria (37 °C); 1 manta
aquecedora (banho fervente); 1 pinça de madeira; e 1 capela de
exaustão.
Reagentes
Tampão acetato de sódio 10 mM, pH 5,5, contendo cloreto de cálcio
(CaCl2)100 mM; solução de amido 1% (p/v) em água; solução de amido
1% (p/v) em tampão acetato de sódio 10 mM, pH 5,5 contendo CaCl2
100 mM; amilase salivar; HCl concentrado; reagente de Benedict;
solução de lugol: 1 g de iodo, 5 g de iodeto de potássio (KI); e 100 mL
de água destilada.
Procedimento
Hidrólise ácida
1. Enumere dois conjuntos de tubos de ensaio, sendo cada
conjunto de 1 a 5.
2. Adicione uma gota de lugol no primeiro conjunto de tubos e
1 mL do reagente de Benedict no segundo conjunto de tubos e reserve.
3. Coloque 25 mL da solução de amido 1% (p/v) em um frasco
erlenmeyer.
4. Coloque o frasco erlenmeyer em banho fervente por 5 min.
5. Pipete 1 mL de HCl concentrado na capela de exaustão,
adicione vagarosamente ao erlenmeyer em banho fervente, misture
(com cuidado) e retire imediatamente 1 mL da mistura.
Obs.: Mantenha sempre a mistura de amido e HCl em banho
fervente.
6. Transfira 0,5 mL para cada tubo 1 de cada conjunto de tubos
(tempo zero).
7. Após 5 min, retire outra alíquota de 1 mL da mistura, colocando
0,5 mL para cada tubo 2 de cada conjunto de tubos (tempo: 5 min).
8. Repita o mesmo procedimento para retirar os tempos 10, 20 e
30 min, colocando 0,5 mL para os tubos 3, 4 e 5 de cada conjunto de tubos.
9. Após 30 min de hidrólise, coloque o conjunto de tubos
contendo o hidrolisado com o reagente de Benedict em banho-maria
fervente por 5 min.
10. Observe se houve a formação do precipitado vermelho-
tijolo e a quantidade desenvolvida ao longo do tempo.
11. Anote na Tabela 13.2 as variações de cor observadas nos testes
usando lugol e o reagente de Benedict durante a hidrólise ácida do amido.
Hidrólise enzimática
1. Enumere dois conjuntos de tubos de ensaio, sendo cada conjunto
de 1 a 5.
2. Adicione uma gota de lugol no primeiro conjunto de tubos e 1
mL do reagente de Benedict no segundo conjunto de tubos e reserve.
3. Coloque 25 mL da solução de amido 1% (p/v) tamponada em um
frasco erlenmeyer.
4. Coloque o frasco erlenmeyer em banho-maria a 37 °C por 5 min.
5. Coloque a amilase salivar (extrato enzimático) em um béquer.
6. Adicione 1 mL do extrato enzimático ao erlenmeyer em banho-
maria, misture e retire imediatamente 1 mL.
Obs.: Mantenha sempre a mistura de amido e extrato enzimático em
banho-maria a 37 °C.
7. Transfira 0,5 mL para cada tubo 1 de cada conjunto de tubos
(tempo zero).
8. Após 5 min, retire outra alíquota de 1 mL da mistura, colocando
0,5 mL para cada tubo 2 de cada conjunto de tubos (tempo: 5 min).
9. Repita o mesmo procedimento para retirar os tempos 10, 20 e 30
min, colocando 0,5 mL para os tubos 3, 4 e 5 de cada conjunto de tubos.
10. Após 30 min de hidrólise, coloque o conjunto de tubos contendo
o hidrolisado com o reagente de Benedict em banho fervente por 5 min.
11. Observe se houve a formação do precipitado vermelho-tijolo e
a quantidade formada ao longo do tempo.
12. Anote na Tabela 13.2 as variações de cor observadas nos testes
usando lugol e o reagente de Benedict durante a hidrólise ácida do amido.
Resultados
Tabela 13.2 - Resultados das hidrólises ácida e enzimática do amido
Tempo da
Hidrólise ácida Hidrólise enzimática
reação (min)
Testes Testes
Iodo Benedict Iodo Benedict
0
5
10
20
30
Exercícios
1. Compare as hidrólises ácida e enzimática citando vantagens
e desvantagens de cada uma delas.
2. Quais são os produtos das hidrólises ácida e enzimática,
respectivamente?
3. Mostre as reações dos testes positivos do iodo e de Benedict.
4. Se fosse utilizado o polissacarídeo glicogênio dariam
positivos os testes usando iodo e o reagente de Benedict? Justifique.
Referências
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Roteiro 1 – Procedimentos laboratoriais, 9

Roteiro 3 – Carboidratos: caracterização baseada na produção de

Roteiro 4 – Carboidratos: caracterização baseada nas propriedades

Roteiro 5 – Lipídeos: caracterização, 48

Roteiro 6 – Ácidos nucleicos: extração e identificação, 58

Roteiro 7 – Titulação potenciométrica de aminoácidos, 65

Roteiro 8 – Separação e identificação de aminoácidos por

Roteiro 9 – Separação e identificação de aminoácidos por eletroforese

Roteiro 10 – Estudo da solubilidade de proteínas, 87

Roteiro 11 – Dosagem de proteínas do leite por espectrofotometria, 96

Roteiro 12 – Estudo da polifenoloxidase (PFO), 110

Roteiro 13 – Estudo da hidrólise do amido, 116

x Diluir ácidos ou álcalis fortes sempre na água e nunca o inverso,

Materiais e equipamentos comuns em

Vidrarias para medição precisa de volumes

líquido para que o acerto do menisco seja feito de modo a deixá-la

Utensílios de uso variado

13) Tela de amianto com tripé: tela metálica, contendo

Equipamentos comuns em laboratório

26) Banho-maria: equipamento contendo água destilada em

1) Béqueres 2) Erlenmeyer 3) Funil analítico

Fig. 1.1 - Cont.

4) Tubos de ensaio 5) Pisseta 6) Balão volumétrico

7) Bureta 8.1) Pipetas automáticas 8.2) Pipetas graduadas

8.3) Pipetas volumétricas 8.4) Pipetas Pasteur 9) Proveta

Fig. 1.1 - Cont.

10) Bastão de vidro 11) Vidros de relógio 12) Bico de Bunsen

16) Cápsula 17) Pinça de madeira 18) Pinça metálica

Fig. 1.1 - Cont.

23) Pipetador de sucção 24) Capela de exaustão

Fig. 1.1 - Cont.

25) Estufa 26) Banho-maria

27) Agitador de tubos 28) Medidor de pH

29) Manta aquecedora 30) Balança analítica

Fig. 1.1 - Cont.

31) Centrífuga 32) Espectrofotômetro

Figura 1.1 - Materiais comuns em um laboratório de Bioquímica.

Materiais da aula prática

Preparo da solução corada

Solução Solução Solução

1 0,00 5 0,00 9 0,00

Observação: Para medir líquidos translúcidos, observe a parte inferior

Figura 1.2 - Leitura de volumes em vidrarias: para líquidos translúcidos

específicos para cada operação. Com base nos seus conhecimentos,

Molecular: quando nas soluções moleculares não há alteração

Concentração em massa: é a forma mais comum encontrada

Fator de diluição: corresponde à relação entre o volume da

Materiais da aula prática

glicogênio e a celulose. Esses polímeros são chamados de

Figura 3.1 - Estruturas das Projeções de Fischer (estruturas lineares) de

Todas as propriedades físico-químicas dos carboidratos são

monossacarídeo, ele pode apresentar diversos enantiômeros ou

Figura 3.2 - Reação de ciclização e mutarrotação da D-glicose.

Os carboidratos ainda apresentam uma propriedade

Figura 3.3 - Reações de condensação e hidrólise da sacarose.