UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AQUICULTURA

José Victor Safadi Ferrarezi

Efeitos da suplementação dietária com Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis na

microbiota e saúde intestinal da tilápia-do-nilo

Florianópolis
2021
 José Victor Safadi Ferrarezi

Efeitos da suplementação dietária com Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis na

microbiota e saúde intestinal da tilápia-do-nilo

Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação

em Aquicultura do Centro de Ciências Agrárias da
Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção
do título de Mestre em Aquicultura.

Orientador: Prof. José Luiz Pedreira Mouriño, Dr.

Florianópolis
2021
 José Victor Safadi Ferrarezi

Efeitos da suplementação dietária com Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis na

microbiota e saúde intestinal da tilápia-do-nilo

O presente trabalho em nível de Mestrado foi avaliado e aprovado por banca examinadora
composta pelos seguintes membros:

Prof. Dr. Vinícius Ronzani Cerqueira

Universidade Federal de Santa Catarina

Prof. Dr. Vinícius Ronzani Cerqueira

Universidade Federal de Santa Catarina

Profa, Dra. Cristiane Meldau de Campos Amaral

Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul

Certificamos que esta é a versão original e final do trabalho de conclusão que foi julgado
adequado para obtenção do título de Mestre em Aquicultura

_________________________________________
Coordenação do Programa de Pós-Graduação

___________________________________
Prof. José Luiz Pedreira Mouriño, Dr.
Orientador

Florianópolis, 2021
 AGRADECIMENTOS

Como prioridade nos agradecimentos desse trabalho, dedico o mesmo aos meus pais
Luiz Antônio Ferrarezi e Patricia Safadi Ferrarezi, que fazem o possível e o impossível para
que eu obtenha as melhores oportunidades na vida e alcance os objetivos almejados por mim,
sempre através da educação e do conhecimento. Sou grato aos meus padrinhos e familiares José
Eduardo Ary, Iracema Lúcia Oliva Ary, Thiago Ary, José Roberto Ary e Adriana Gervasio Ary,
pois a priori, sem eles a execução desse trabalho não seria possível.
Agradeço ao meu orientador José Luiz Pedreira Mouriño e ao Prof. Maurício Laterça
Martins, pelo incentivo e confiança dada ao longo de 7 anos de trabalho conjunto, à Scheila
Anelise Pereira, Lúvia de Souza Sá e Mateus Aranha Martins pelo auxílio na execução das
metodologias e escrita, bem como a toda a equipe do Laboratório de Sanidade de Organismos
Aquáticos – AQUOS/UFSC.
Gostaria de agradecer especialmente os amigos Gustavo Ruschel Lopes, Hugo Mendes
de Oliveira, Marco Shizuo Owatari, Gabriel Fernandes Alves de Jesus, Jorge Pedro Rodrigues
Soares, Matheus Berlofa Ferreira, Marcela Maia Yamashita, Maria Luiza Ruiz, Lucas Cardoso
e Paula Brando de Medeiros que estiveram comigo não só ao longo do desenvolvimento desse
trabalho, mas também durante o tempo no qual desenvolvi atividades dentro da Universidade
Federal de Santa Catarina, tornando o trabalho científico mais prazeroso.
Por fim, meus agradecimentos ao Programa de Pós-Graduação em Aquicultura, à
Universidade Federal de Santa Catarina, ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico
e Tecnológico – CNPq e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior –
CAPES.
O presente trabalho foi realizado com o apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior Brasil - (CAPES) - Código de Financiamento 001.
“Se eu vi mais longe, foi por estar
sobre ombros de gigantes.”
(Isaac Newton)
 RESUMO

O objetivo deste estudo foi avaliar a relação entre adesão in vitro e a capacidade de colonização
in vivo de um produto probiótico comercial, contendo as bactérias Bacillus subtilis e Bacillus
licheniformis, ao muco intestinal de tilápia-do-Nilo, bem como avaliar os efeitos da
suplementação na saúde intestinal dos animais. O ensaio in vitro foi realizado utilizando o muco
intestinal retirado de juvenis de tilápia-do-Nilo saudáveis, cultivado em uma microplaca de 96
poços de fundo chato e posteriormente incubado com o produto probiótico em diferentes
concentrações de inóculo. Foram realizados dois ensaios in vivo distintos, um com 15 dias a
fim de aferir o grau de colonização das bactérias através de métodos de microbiologia baseados
em cultura e outro ensaio de 50 dias com a intenção de realizar uma análise molecular refinada
da saúde intestinal dos animais, em ambos os ensaios foram coletados dados de desemprenho
zootécnico. Durante os ensaios in vivo os animais foram suplementados com o produto
probiótico aspergido na ração na proporção de 100 ml Kg-1 de ração. No ensaio in vitro,
encontramos evidências da adesão da bactéria probiótica ao muco intestinal da tilápia-do-Nilo,
sendo posteriormente embasado no ensaio de alimentação in vivo de 15 dias no qual a contagem
de B. liqueniformis no intestino dos juvenis de tilápia-do-Nilo foi significativamente maior no
tratamento com o PureGro®, quando comparado com peixes alimentados com uma dieta
controle não suplementada. Além disso, no ensaio in vivo de 50 dias, foi possível analisar uma
modulação da microbiota do intestino da tilápia-do-Nilo com a suplementação dietária do
probiótico. Por meio de métodos moleculares observou-se claramente aumento na riqueza de
espécies, maior abundância de espécies autóctones potencialmente probióticas e menor
abundância de Aeromonas veronii, um potencial patógeno para peixes, nos animais alimentados
com dieta suplementada com o probiótico.

Palavras-chave: Aquicultura; Microbiologia; Probiótico; Bacillus subtilis; Bacillus

licheniformis.
 ABSTRACT

The aim of this study was to evaluate the relationship between in vitro adhesion and the in vivo
colonization capacity of a commercial probiotic product, containing Bacillus subtilis and
Bacillus licheniformis in the intestinal mucus of Nile tilapia, as well as to evaluate the effects
of supplementation on the intestinal health of animals. The in vitro assay was performed using
intestinal mucus taken from healthy Nile tilapia juveniles, cultured in a 96-well flat-bottomed
microplate and subsequently incubated with the probiotic product at different inoculum
concentrations. Two in vivo assays were carried out, one with 15 days in order to measure the
degree of colonization of bacteria using culture-based microbiology methods and another 50-
day assay with the intention of performing a refined molecular analysis of the intestinal health
of animals, in both trials and zootechnical performance data were collected. During the in vivo
tests, the animals were supplemented with the probiotic product sprinkled on the feed in the
proportion of 100 mL Kg-1 of feed. In the in vitro assay, we found evidence of the adhesion of
probiotic bacteria to Nile tilapia intestinal mucus, which was later based on the 15-day in vivo
feeding assay in which the count of B. liqueniformis in the intestine of fish was significantly
higher in treatment with PureGro® when compared to fish fed unsupplemented diet. In addition,
in the 50-day in vivo trial, it was possible to analyze a modulation of the Nile tilapia gut
microbiota with dietary supplementation of the probiotic. Through molecular methods, an
increase in species richness, greater abundance of potentially probiotic autochthonous species
and lower abundance of Aeromonas veronii, a potential fish pathogen, was clearly observed in
animals fed diet supplemented with the probiotic.

Key words: Aquaculture; Microbiology; Probiotic; Bacillus subtilis; Bacillus licheniformis.

 LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Progressão das concentrações de adesão ao muco intestinal in vitro, de tilápias-do-

Nilo, relativas à concentração do inóculo de ambas as bactérias oriundas do produto
comercial PureGro®, com valores decimais representados em Log10 X+1 ........... 26
Figura 2 - Quantificação de bactérias heterotróficas totais presentes no trato intestinal de
tilápias-do-Nilo suplementadas ou não com produto comercial PureGro®, durante
15 dias, com valores decimais de UFC g-1 representados em Log10 ..................... 27
Figura 3 - Diagrama de Venn proporcional mostrando unidades taxonômicas operacionais
compartilhadas (OTUs) da comunidade bacteriana do intestino de tilápia do Nilo
após uma suplementação de 50 dias com PureGro®.............................................. 28
Figura 4 - Diversidade-α medindo Riqueza, Shannon e Simpson estimada por meio de curvas
de rarefação / extrapolação da comunidade bacteriana do intestino de tilápia-do-
Nilo após suplementação de 50 dias com PureGro® ............................................. 29
Figura 5 - Abundância relativa de todos os filos (esquerda) e abundância relativa entre os filos
de baixa abundância (direita) da comunidade bacteriana do intestino de tilápia-do-
Nilo, após uma suplementação de 50 dias com PureGro®. O gráfico com cores
diferentes no painel direito destaca a mudança na abundância relativa de
Firmicutes .............................................................................................................. 29
Figura 6 - Abundância relativa de todos os gêneros (superior) e abundância relativa entre
gêneros de baixa abundância (inferior), da comunidade bacteriana do intestino de
tilápia-do-Nilo após uma suplementação de 50 dias com PureGro®. O gráfico de
cores diferentes no painel inferior destaca a mudança na abundância relativa de
Aeromonas ............................................................................................................. 30
 LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Parâmetros hemato-imunológicos analisados de tilápias-do-Nilo suplementadas ou

não com produto comercial PureGro ®, durante 50 dias, com 0,5% de
significância .......................................................................................................... 27
Tabela 2 - Número de leituras e Índice de Cobertura de Good da comunidade bacteriana do
intestino de tilápia-do-Nilo após uma suplementação de 50 dias com PureGro® 28
Tabela 3 - Dados de desempenho zootécnico de tilápias-do-Nilo suplementadas ou não com
PureGro®, durante 15 dias ..................................................................................... 31
Tabela 4 - Dados de desempenho zootécnico de tilápias-do-Nilo suplementadas ou não com
PureGro®, durante 50 dias ..................................................................................... 31
 SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO GERAL .................................................................................................... 12

1.1 AQUICULTURA NO BRASIL E NO MUNDO ....................................................... 12

1.2 DOENÇAS NA PISCICULTURA ............................................................................. 12

1.3 PROBIÓTICOS .......................................................................................................... 13

1.4 REQUISITOS BÁSICOS PARA A SELEÇÃO DE PROBIÓTICOS ....................... 14

1.5 O GÊNERO BACILLUS. ............................................................................................ 14

1.6 METODOLOGIA DE ADESÃO IN VITRO.............................................................. 15

1.7 ANÁLISES DE METAGENÔMICA ........................................................................ 15

1.8 OBJETIVOS ............................................................................................................... 16

1.8.1 Objetivo Geral .......................................................................................................... 16

1.8.2 Objetivos Específicos ................................................................................................ 16

1.9 ESTRUTURA DO TRABALHO ............................................................................... 16

2 ARTIGO CIENTÍFICO .......................................................................................... 17

2.1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................... 19

2.2 MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................ 21

2.2.1 Material biológico ..................................................................................................... 21

2.2.2 Ensaio de adesão IN VITRO .................................................................................... 21

2.2.3 Preparo da dieta e viabilidade do produto na ração ............................................. 22

2.2.4 Ensaio in vivo I - 15 dias........................................................................................... 22

2.2.4.1 Parâmetros microbiológicos dependentes de cultura do ensaio in vivo .................... 23

2.2.5 Ensaio in vivo II - 50 dias ......................................................................................... 23

2.2.5.1 Análises hemato-imunológicas ................................................................................... 24

2.2.5.2 Análise metagenômica ................................................................................................ 25

2.2.6 Parâmetros zootécnicos ............................................................................................ 25

2.2.7 Análise estatística ..................................................................................................... 25

2.3 Resultados .................................................................................................................. 26

2.3.1 Ensaio de adesão in vitro .......................................................................................... 26

2.3.1.1 Parâmetros microbiológicos dependentes de cultura do ensaio in vivo .................... 26

2.3.2 Ensaio IN VIVO II - 50 dias ..................................................................................... 27

2.3.2.1 Análises hemato-imunológicas ................................................................................... 27

2.3.2.2 Análise metagenômica ................................................................................................ 28

2.3.2.3 Parâmetros zootécnicos ............................................................................................. 31

2.4 Discussão .................................................................................................................... 31

2.5 Conclusão ................................................................................................................... 36

2.6 Agradecimentos .......................................................................................................... 36

2.7 Referências ................................................................................................................. 36

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DA INTRODUÇÃO GERAL ............................... 41

 12

1 INTRODUÇÃO GERAL

1.1 AQUICULTURA NO BRASIL E NO MUNDO

Desde os anos 1990 os estudos sobre a produção mundial de pescados apontam a
estagnação da pesca de captura, e isso se dá principalmente pela grande pressão exercida sobre
os estoques naturais de organismos aquáticos, que com sua redução não causam apenas baixas
econômicas como também graves problemas ambientais (FAO, 2019).
Entretanto, ao contrário da pesca, a aquicultura tem como premissa o desenvolvimento
de tecnologias capazes de produzir organismos aquáticos com alto valor de mercado e o menor
impacto ambiental possível, por isso mostra um crescimento notável ano após ano, tornando-se
um dos principais setores de produção de alimentos no mundo, abastecendo o mercado mundial
com cerca de 82,1 milhões de toneladas de pescados no ano de 2019 (FAO, 2019).
Dentro deste cenário o Brasil participa ativamente e possui alto potencial de
crescimento no mercado aquícola, principalmente pela grande quantidade de espécies aquáticas
nativas, extenso litoral e clima e geografia bastante favoráveis. A produção brasileira já é
substanciosa, 758.006 toneladas de peixes no ano de 2019, com destaque para a espécie de
peixe tilápia-do-Nilo (Oreochromis niloticus) (Peixe BR, 2020).
Hoje a tilápia-do-Nilo é a responsável por 57% de todo o peixe provindo da aquicultura
nacional, colocando o Brasil como o 4º maior produtor de tilápia do mundo, com a produção
de 432 mil toneladas em 2019 (Peixe BR, 2020).
Tendo em vista o acelerado desenvolvimento da aquicultura e a crescente demanda
por seus produtos no mercado fez com que fosse necessário, investir em tecnologias para a
intensificação dos cultivos, principalmente no setor da piscicultura. No entanto a intensificação
dos cultivos, quando feita de forma inadequada, pode trazer problemas sérios, como o aumento
do aparecimento de doenças que acometem os animais de forma severa, causando mortalidades
em massa e grandes perdas econômicas (PRIDGEON e KLESIUS, 2012).

1.2 DOENÇAS NA PISCICULTURA

As doenças na piscicultura muitas vezes estão ligadas a algum desequilíbrio no
ambiente ou no organismo do animal, como por exemplo má qualidade de água, nutrição
inadequada ou manejo incorreto. Dessa forma agentes patogênicos que já estão naturalmente
inseridos no ambiente de cultivo veem uma oportunidade de se replicar e acometer os animais
(DEFOIRDT, 2013).
 13

Dentre os principais agentes patogênicos que acometem as pisciculturas, podemos

citar as bactérias, pois a remediação é difícil e tornam-se necessárias uma série de medidas
sanitárias para conter o avanço da doença, onerando ainda mais o custo de produção dos
animais.
Pode-se destacar os gêneros Streptococcus, Francisella, Aeromonas, Pseudomonas,
Flavobacterium, Vibrio, Edwardsiella e Enterococcus como causadores de grandes surtos de
mortalidade (EL – SAYED, 2006, SILVA et al., 2009, DONG et al., 2015).
Streptococcus spp. possui capacidade de causar processo inflamatório e septicemia
(TAVARES et al., 2016). Por outro lado, Francisella spp. é considerada um patógeno
emergente, uma vez que sua ocorrência foi relatada no Brasil apenas em 2012, afetando
principalmente alevinos (LEAL et al., 2014).
As Aeromonas e Pseudomonas são bactérias oportunistas responsáveis por provocar
septicemia hemorrágica nos seus hospedeiros (AUSTIN; AUSTIN, 2012); Flavobacterium
columnare tem como característica o surgimento de pontos acinzentados no corpo do animal,
erosão de pele e nadadeiras (DECOSTERE et al., 1999) e Vibrio vulnificus tem a habilidade de
produzir extensas áreas hemorrágicas nos animais acometidos, além de ser potencialmente
zoonótico (FOUZ et al., 2002).
Por sua vez, Edwardsiella tarda faz parte da família das enterobactérias, manifesta-se
na forma de abcessos cutâneos ou musculares repletos de gás (IREGUI et al., 2012);
Enterococcus spp. provoca hemorragias musculares, exoftalmia e necrose do baço e rins
(MARTINS et al., 2008). Todas as bactérias citadas, quando associadas a fatores
predisponentes, causam grandes surtos de mortalidade sendo responsáveis por extensas perdas
econômicas nos cultivos.

1.3 PROBIÓTICOS
Diante do obstáculo na produção que são as doenças, medidas de prevenção estão
sendo bastante estudadas para que seja mais fácil controlar a saúde dos animais, ou pelo menos
que estas apareçam de forma mais branda e o seu tratamento possa ser feito sem o uso
demasiado de antibióticos, que quando administrados da forma errada podem causar diversos
problemas, como a proliferação de cepas resistentes (LIU et al., 2015; RINGO et al., 2020;
PEREIRA et al., 2020).
Dentre as formas de prevenção podemos citar os probióticos, que ao longo dos anos
tem se mostrado ser uma ótima ferramenta não só para o controle de doenças, mas também na
 14

melhora de índices produtivos, uma vez que fortalecem o sistema de resposta imune, melhoram
a absorção de nutrientes e também o balanço de bactérias benéficas dentro do trato gastro-
intestinal, criando uma espécie de barreira contra a entrada de patógenos (NEWAJ-FYZUL,
AL-HARBI e AUSTIN, 2014; YAMASHITA et al., 2017; RUIZ, 2019).
Os probióticos foram introduzidos na piscicultura conforme o sucesso de suas
aplicações em outros setores de criação animal e hoje, com isso Tachibana et al. (2019) sugerem
que os probióticos para piscicultura sejam definidos como “micro-organismos vivos ou viáveis
que, fornecidos via alimentação ou água, proporcionam benefícios no desempenho zootécnico,
imunológico e digestivo, combatendo os agentes patogênicos, e promovam a diminuição do
estresse do hospedeiro e/ou atuem como biorremediadores do ambiente aquático onde vivem.”.

1.4 REQUISITOS BÁSICOS PARA A SELEÇÃO DE PROBIÓTICOS

Diversos gêneros de micro-organismos já foram e estão sendo estudados como
potenciais probióticos na aquicultura, sendo assim começamos a busca por cepas a partir das
características desejadas em um probiótico (MERRIFIELD e RINGO, 2014).
Um probiótico tem como principais requisitos a biossegurança, ou seja, não ser um
potencial patógeno, resistir às condições adversas do ambiente, processos de agregação na
ração, administração e até mesmo na sua passagem pelo trato gastro-intestinal. Além de causar
os efeitos benéficos desejados, como o estimulo da resposta imune, atividades antimicrobianas
contra patógenos e ter a capacidade de colonizar a mucosa intestinal (TACHIBANA et al.,
2019; MOURIÑO et al., 2012).
Existem ainda requisitos exigidos para o registro de probióticos no Brasil pelo
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), onde é necessário que o produto
apresente evidências científicas dos seus efeitos benéficos, possua descrição e nomenclatura
detalhadas e possa ser armazenado de forma a não comprometer seu uso.

1.5 O GÊNERO BACILLUS.

Diversos gêneros de micro-organismos já foram e estão sendo estudados como
potenciais probióticos, e um dos que se destacam é o gênero Bacillus. Isso se dá principalmente
por conter, além dos requisitos básicos, outras características que o fazem ter maior viabilidade
na ração e resistência às condições adversas do meio, interno ou externo ao animal (OLMOS,
2014; KUEBUTORNYE et al., 2020).
 15

As bactérias do gênero Bacillus usadas como probióticos são em sua maioria gram-
positivas, aeróbicas ou anaeróbicas facultativas, quimioheterotróficas, catalase-positiva e
possuem motilidade, porém o destaque para esse gênero está na capacidade de esporulação, que
é em suma a produção de cápsulas diferentes das células vegetativas, produzidas para resistirem
a condições adversas do ambiente, como excesso de calor, falta de nutrientes e alguns métodos
de desinfecção, retornando ao estado vegetativo após se estabelecerem em um ambiente
favorável ao desenvolvimento (SOLTANI, 2019). Faz-se então a utilização dos esporos para
inserir os Bacillus no processo produtivo de rações, onde outras bactérias não-esporulantes
perderiam a viabilidade, além de chegarem ao trato intestinal mais facilmente
(KUEBUTORNYE et al., 2019).

1.6 METODOLOGIA DE ADESÃO IN VITRO

Para a seleção de cepas probióticas são usados diversos métodos que funcionam de
forma que, dentro de um grupo de candidatas, podemos selecionar as que melhor se encaixam
dentro das prerrogativas impostas (HOSEINIFAR, 2018).
Para a seleção de bactérias probióticas faz-se necessário a utilização de uma série de
metodologias que identifiquem os atributos que farão com que aquele determinado
microrganismo tenha capacidade probiótica (YAMASHITA et al., 2020). Um desses atributos
é o grau de colonização ao muco intestinal, fator determinante na influência que as células
bacterianas irão exercer sobre os outros microrganismos presentes naturalmente no trato
intestinal (MERRIFIELD e RINGO, 2014).
A metodologia de ensaio de adesão in vitro de bactérias probióticas ao muco intestinal
de peixes é um método, onde, através destes ensaios é possível presumir o grau de colonização
que uma bactéria consegue obter dentro do trato intestinal (SUGIMURA, HAGI e HOSHINO,
2010). Este método não exclui a necessidade de um ensaio in vivo, porém evita o uso demasiado
de tempo, dinheiro e animais, uma vez que há a possibilidade de a bactéria testada não possuir
boa capacidade de colonização e isso já seja identificado no ensaio in vitro.

1.7 ANÁLISES DE METAGENÔMICA

Pode-se dizer ainda que os métodos de microbiologia convencionais utilizados
atualmente para analisar a composição da microbiota intestinal após a aplicação do probiótico
no ensaio in vivo não são conclusivos o suficiente para mostrar o amplo espectro de bactérias
que estarão presentes no trato intestinal (UDAYANGANI, 2017). Análises moleculares mais
 16

precisas são necessárias para a obtenção de resultados mais conclusivos sobre como a adição
de bactérias probióticas influência na diversidade microbiana do trato intestinal dos animais
(MOURIÑO et al., 2016).
As análises metagenômicas são capazes de nos fornecer dados mais precisos sobre a
microbiota intestinal, como riqueza, diversidade e abundância bacteriana do meio, utiliza-se
este método quando a intenção é não analisar um gene em particular, mas sim uma composição
de espécies de um microbioma (BREITWIESER; LU e SALZBERG, 2017).

1.8 OBJETIVOS
1.8.1 Objetivo Geral
Avaliar a capacidade de adesão in vitro e de colonização in vivo ao muco intestinal das
cepas probióticas Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis na microbiota intestinal da tilápia-
do-Nilo.

1.8.2 Objetivos Específicos

• Avaliar a capacidade de adesão in vitro das cepas probióticas Bacillus subtilis e Bacillus
licheniformis, bem como suas capacidades de colonização in vivo ao muco intestinal.
• Avaliar a riqueza, abundância e diversidade da microbiota intestinal em peixes alimentados
com as cepas probióticas do estudo.
• Analisar os efeitos da suplementação com as cepas probióticas no estado sanitário e no
desempenho zootécnico dos animais.

1.9 ESTRUTURA DO TRABALHO

Esta dissertação é composta por artigo cientifico submetido ao periódico “Microbial
Pathogenesis”.
 17

2 ARTIGO CIENTÍFICO

Bacillus subtilis E B. licheniformis (PUREGRO®) COMO PROBIÓTICO PARA

TILAPIA-DO-NILO: ADESÃO BACTERIANA IN VITRO E EFEITOS IN VIVO NO
MICROBIOMA INTESTINAL, SAÚDE E PERFORMANCE DE CRESCIMENTO

José Victor Safadi Ferrarezi1*, Lúvia de Souza Sá1, Mateus Aranha Martins1,2, Scheila Anelise
Pereira1, Marco Shizuo Owatari1, Thiago Soligo3, Eduardo Yamashita4, José Luiz Pedreira
Mouriño1, Maurício Laterça Martins1

1
AQUOS - Laboratório de Sanidade de Organismos Aquáticos, Departamento de Aquicultura,
Centro de Ciências Agrárias (CCA), Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC). Rodovia
Admar Gonzaga, 1346, CEP 88034-000, Florianópolis, SC, Brazil.
2
LCM - Laboratório de Camarões Marinhos, Departamento de Aquicultura, Centro de Ciências
Agrárias (CCA), Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC). Serv. Beco dos Coroas, 503,
CEP 88061-600, Florianópolis, SC, Brazil.
3
DSM - Royal DSM Animal Nutrition and Health, Costa Rica
4
DSM - Royal DSM Animal Nutrition and Health, São Paulo, Brazil

*Autor correspondente: jv.sf@outlook.com

 18

RESUMO

O objetivo deste estudo foi avaliar a relação entre adesão in vitro e a capacidade de colonização
in vivo de um produto probiótico comercial, contendo as bactérias Bacillus subtilis e Bacillus
licheniformis, ao muco intestinal de tilápia-do-Nilo, bem como avaliar os efeitos da
suplementação na saúde intestinal dos animais. O ensaio in vitro foi realizado utilizando o muco
intestinal retirado de juvenis de tilápia-do-Nilo saudáveis, cultivado em uma microplaca de 96
poços de fundo chato e posteriormente incubado com o produto probiótico em diferentes
concentrações de inóculo. Foram realizados dois ensaios in vivo distintos, um com 15 dias a
fim de aferir o grau de colonização das bactérias através de métodos de microbiologia baseados
em cultura e outro ensaio de 50 dias com a intenção de realizar uma análise molecular refinada
da saúde intestinal dos animais, em ambos os ensaios foram coletados dados de desemprenho
zootécnico. Durante os ensaios in vivo os animais foram suplementados com o produto
probiótico aspergido na ração na proporção de 100 mL Kg-1 de ração. No ensaio in vitro,
encontramos evidências da adesão da bactéria probiótica ao muco intestinal da tilápia-do-Nilo,
sendo posteriormente embasado no ensaio de alimentação in vivo de 15 dias no qual a contagem
de B. liqueniformis no intestino dos juvenis de tilápia-do-Nilo foi significativamente maior no
tratamento com o PureGro®, quando comparado com peixes alimentados com uma dieta
controle não suplementada. Além disso, no ensaio in vivo de 50 dias, foi possível analisar uma
modulação da microbiota do intestino da tilápia-do-Nilo com a suplementação dietária do
probiótico. Por meio de métodos moleculares observou-se claramente aumento na riqueza de
espécies, maior abundância de espécies autóctones potencialmente probióticas e menor
abundância de Aeromonas veronii, um potencial patógeno para peixes, nos animais alimentados
com dieta suplementada com o probiótico.

Palavras-chave: Piscicultura; Microbiologia; Probiótico, Bacillus subtilis, Bacillus

licheniformis.

ABSTRACT

The aim of this study was to evaluate the relationship between in vitro adhesion and the in vivo
colonization capacity of a commercial probiotic product, containing Bacillus subtilis and
Bacillus licheniformis in the intestinal mucus of Nile tilapia, as well as to evaluate the effects
of supplementation on the intestinal health of animals. The in vitro assay was performed using
intestinal mucus taken from healthy Nile tilapia juveniles, cultured in a 96-well flat-bottomed
microplate and subsequently incubated with the probiotic product at different inoculum
concentrations. Two in vivo assays were carried out, one with 15 days in order to measure the
degree of colonization of bacteria using culture-based microbiology methods and another 50-
day assay with the intention of performing a refined molecular analysis of the intestinal health
of animals, in both trials and zootechnical performance data were collected. During the in vivo
tests, the animals were supplemented with the probiotic product sprinkled on the feed in the
proportion of 100 mL Kg-1 of feed. In the in vitro assay, we found evidence of the adhesion of
probiotic bacteria to Nile tilapia intestinal mucus, which was later based on the 15-day in vivo
feeding assay in which the count of B. liqueniformis in the intestine of fish was significantly
higher in treatment with PureGro® when compared to fish fed unsupplemented diet. In addition,
in the 50-day in vivo trial, it was possible to analyze a modulation of the Nile tilapia gut
microbiota with dietary supplementation of the probiotic. Through molecular methods, an
 19

increase in species richness, greater abundance of potentially probiotic autochthonous species

and lower abundance of Aeromonas veronii, a potential fish pathogen, was clearly observed in
animals fed diet supplemented with the probiotic.

Key words: Fish farm; Microbiology; Probiotic, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis.

DESTAQUES
• O ensaio de adesão in vitro com Bacillus spp. com muco intestinal foi validado pelo ensaio
in vivo de 15 dias.
• A dieta contendo Bacillus spp. aumentou a riqueza da microbiota intestinal após um ensaio
de 50 dias.
• Animais alimentados com Bacillus spp. apresentaram maior abundância de bactérias
autóctones potencialmente probióticas na microbiota intestinal.
• Animais alimentados com Bacillus spp. apresentaram baixa abundância de Aeromonas spp.
potencialmente patogênicas.

2.1 INTRODUÇÃO
O uso de aditivos alimentares na aquicultura tem se mostrado muito eficiente, pois
melhora o desempenho zootécnico e os parâmetros imunológicos dos animais, uma vez que
promovem crescimento acelerado, boas taxas de conversão alimentar e maior resistência a
patógenos [1, 2]. Dentre os aditivos mais comuns estão os probióticos, microrganismos vivos
adicionados à alimentação, que agem modificando a composição da microbiota e melhorando
a saúde intestinal [3, 4].
Para a seleção de bactérias probióticas faz-se necessário a utilização de uma série de
metodologias que identifiquem os atributos que farão com que aquele determinado
microrganismo tenha capacidade probiótica [5]. Um desses atributos é o grau de colonização
ao muco intestinal, fator determinante na influência que as células bacterianas irão exercer sobre
os outros microrganismos presentes naturalmente no trato intestinal [6].
Atualmente este critério de seleção é feito através de ensaios in vivo, utilizando animais
alimentados com ração suplementada com o probiótico em repetições, durante pelo menos 15
dias de ensaio, após isso os animais são eutanasiados para coleta do trato intestinal e é realizada
a análise [7].
 20

A metodologia de ensaio de adesão in vitro de bactérias probióticas ao muco intestinal

de peixes é um método, onde, através destes ensaios é possível presumir o grau de colonização
que uma bactéria consegue obter dentro do trato intestinal [8]. Este método não exclui a
necessidade de um ensaio in vivo, porém evita o uso demasiado de tempo, dinheiro e animais,
uma vez que há a possibilidade de a bactéria testada não possuir boa capacidade de colonização
e isso já seja identificado no ensaio in vitro.
Pode-se dizer ainda que os métodos de microbiologia convencionais utilizados
atualmente para analisar a composição da microbiota intestinal após a aplicação do probiótico
no ensaio in vivo não são conclusivos o suficiente para mostrar o amplo espectro de bactérias
que estarão presentes no trato intestinal [9]. Análises moleculares mais precisas são necessárias
para a obtenção de resultados mais conclusivos sobre como a adição de bactérias probióticas
influência na diversidade microbiana do trato intestinal dos animais [10].
A importância de compreender a adesão das bactérias ao muco intestinal se deve
principalmente pela relação que este mecanismo tem com microrganismos patogênicos que
estão inseridos no meio [11]. Assim como a mucosa intestinal é uma barreira contra a entrada
de agentes patogênicos, podemos encarar a microbiota intestinal como uma camada auxiliar
para proteção, onde as bactérias probióticas agem competindo por nutrientes, espaço e
produzindo compostos antimicrobianos no meio intestinal [6].
Estruturas como o glicocálix e as interações iônicas da membrana das células
bacterianas com o muco do trato intestinal funcionam como um mecanismo não específico
muito importante de adesão, porém somente isso não garante a colonização permanente das
células, uma vez que a mucosa intestinal possui camadas que se renovam constantemente [12].
Entre as bactérias probióticas se destacam as espécies Bacillus subtilis e Bacillus
licheniformis, que são organismos intimamente ligados, principalmente devido à capacidade de
degradar moléculas de grande peso molecular, sendo assim são capazes de tornar os nutrientes
mais disponíveis para o animal no trato intestinal [13]. O potencial probiótico das cepas B.
subtilis e B. licheniformis já foi relatado por diversos autores em estudos que mostram o
aumento da melhora na saúde dos animais e desempenho em crescimento dos mesmos, o que
leva a necessidade de aprofundamento no estudo dessas cepas probióticas [14, 15].
Dessa forma, pesquisas que visam o desenvolvimento de novas tecnologias, produtos
e estratégias que possibilitem incremento na resistência da tilápia-do-Nilo contra patógenos
tornam-se necessárias e indispensáveis, permitindo assim, o crescimento sustentável da
piscicultura brasileira. O objetivo deste estudo foi avaliar o produto PureGro® como aditivo
 21

alimentar na dieta de tilápia-do-Nilo em ensaios in vitro e in vivo por 15 e 50 dias e seus efeitos
sobre os parâmetros hemato-imunológicos, zootécnicos e microbiota intestinal.

2.2 MATERIAL E MÉTODOS

2.2.1 Material biológico

A cepa probiótica testada está contida no produto comercial PureGro® fabricado pela
empresa DSM com sede na Holanda, e aprovado pela Autoridade Europeia de Segurança
Alimentar (EFSA-Q-2015-00164). O fabricante indica a composição do mesmo como sendo
93-95% de carbonato de cálcio, 2% de maltodextrina, 1% de dióxido de silício e as bactérias
probióticas B. subtilis e B. licheniformis na concentração mínima de 0,5 x 1010 UFC g-1 cada.

2.2.2 Ensaio de adesão IN VITRO

Para os ensaios de adesão in vitro foi utilizada a metodologia adaptada de [8], alterando
os meios de cultura e diluições. Os peixes após serem anestesiados, foram eutanasiados por
aprofundamento anestésico com solução de Eugenol (75 mg L-1), eviscerados e o intestino
removido e lavado com solução salina estéril 0,65%. O muco intestinal foi obtido através da
raspagem delicada da superfície intestinal e ressuspendido em solução salina estéril 0,65%. A
solução de muco foi diluída e utilizada a uma concentração proteica de 1,0 mg mL-1. Este teste
foi realizado em triplicata.
Posteriormente foram adicionados 100 µL da solução de muco em cada poço de uma
microplaca fundo chato de 96 poços, a qual foi incubada overnight a 4º C. Em seguida, o
excesso de muco foi removido lavando-se delicadamente os poços duas vezes com 200 µL de
solução salina estéril 0,65%. Posteriormente, foram adicionados 50 µL do produto probiótico
PureGro® nas concentrações 103 a 108, diluído em fator 1:10 em solução salina estéril 0,65%,
em seus respectivos poços e a microplaca incubada por 1 hora a 30ºC. As bactérias não aderidas
foram removidas por dupla lavagem dos poços com 100 µL de solução salina estéril 0,65%.
Em seguida, 50 µL de solução salina estéril 0,65% foram adicionados por poço e as bactérias
aderidas ao muco intestinal foram raspadas com a ponta de uma pipeta obtendo-se uma amostra
única.
A amostra então foi diluída serialmente em fator 1:10 e as diluições de 10-2 a 10-8 foram
plaqueadas em meio de cultura TSA (Agar Triptona de Soja). Para quantificar a concentração
 22

de bacilos realizou-se a contagem de bactérias heterotróficas totais e a diferenciação pela

morfologia e caracterização pelo método de Gram.

2.2.3 Preparo da dieta e viabilidade do produto na ração

Para a incorporação do probiótico na ração foi utilizado o método de aspersão, onde o
produto foi diluído na razão 1:10 em solução salina estéril 0,65%, na proporção de 100 ml Kg-
1
de ração. Após a aplicação da solução na dieta, foram realizadas agitações periódicas em um
Becker por aproximadamente 15 minutos antes de fracionar em porções, a fim de se obter a
máxima incorporação na ração.
Para averiguar a viabilidade do produto junto à ração, uma porção de 1g da ração já com a
adição do probiótico PureGro® foi macerada e diluída serialmente em fator 1:10 com solução
salina estéril 0,65%, e cada diluição plaqueada em meio de cultura TSA para a quantificação
do número de colônias viáveis.

2.2.4 Ensaio in vivo I - 15 dias

O primeiro ensaio in vivo foi realizado no Bioensaio do Laboratório de Sanidade de
Organismos Aquáticos (AQUOS), localizado no Núcleo de Estudos em Patologia Aquícola da
Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC). (Projeto CEUA Nº 2426210318). Para tal,
foram utilizados 60 juvenis de tilápia-do-Nilo (Oreochromis niloticus) saudáveis divididos
homogeneamente em 6 unidades experimentais de 100 L, sendo 3 unidades destinadas ao grupo
controle, animais alimentados com dieta sem a adição do produto probiótico PureGro®, e 3
unidades ao grupo suplementado, animais alimentados com dieta comercial suplementada com
o probiótico PureGro® durante 15 dias apenas afim de observar a colonização inicial do produto.
As unidades estão acopladas ao sistema de recirculação de água com filtros do tipo mecânico,
esterilização UV e reatores biológicos.
Os parâmetros de qualidade da água foram controlados com analises diárias de oxigênio
dissolvido, temperatura, pH e salinidade usando o equipamento multiparâmetro Hanna® HI-
9829, e amônia total e nitrito a cada 3 dias utilizando kit colorimétrico Alfakit ®. Todos os
parâmetros se mantiveram dentro dos níveis recomendados para o cultivo da espécie.
A ração utilizada no ensaio foi a Supra® com 40% de proteína em sua composição e a
alimentação será calculada a uma quantidade de 5% da biomassa ao dia, dividida em quatro
porções.
 23

2.2.4.1 Parâmetros microbiológicos dependentes de cultura do ensaio in vivo

Após o fim do período experimental de 15 dias do primeiro ensaio in vivo, os animais
permaneceram em jejum por 24 horas, e a coleta foi realizada utilizando 3 animais de cada
caixa. Após eutanásia por aprofundamento anestésico foram coletadas porções do trato
intestinal médio posterior dos animais para verificação do grau de colonização da bactéria
probiótica em função do tempo de tratamento com o produto.
Para isso realizou-se um pool do trato intestinal dos 3 animais coletados de cada caixa
para compor as amostras que em seguida foram pesadas e maceradas em gral de porcelana com
solução salina estéril 0,65%. As amostras foram então diluídas serialmente em fator 1:10, e as
diluições de 10-5 a 10-9 plaqueadas em meio de cultura TSA, a fim de quantificar a concentração
de bactérias heterotróficas totais, e a concentração das bactérias probióticas utilizando
coloração de gram.

2.2.5 Ensaio in vivo II - 50 dias

O segundo ensaio in vivo foi conduzido por 50 dias no Bioensaio do Laboratório de
Sanidade de Organismos Aquáticos (AQUOS), localizado no Núcleo de Estudos em Patologia
Aquícola da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC) (procedimentos experimentais
aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais CEUA Nº 2426210318). Um total de
120 juvenis de tilápia-do-Nilo, com aproximadamente 1,88g (± 0,25g), foi distribuído
igualmente em 8 tanques de 100 L, sendo 4 destinados ao grupo controle e 4 destinados ao
grupo tratado com o probiótico. As unidades estavam acopladas ao sistema de recirculação de
água com filtros do tipo mecânico, esterilização UV e reatores biológicos.
Os parâmetros de qualidade da água foram controlados com analises diárias de oxigênio
dissolvido, temperatura, pH e salinidade usando o equipamento multiparâmetro Hanna® HI-
9829, e amônia total e nitrito a cada 3 dias utilizando kit colorimétrico Alfakit ®. Todos os
parâmetros se mantiveram dentro dos níveis recomendados para o cultivo da espécie.
A ração utilizada no ensaio foi formulada com as exigências nutricionais da tilápia-do-Nilo,
de acordo com [16], com 30% de proteína em sua composição e fabricada no Laboratório de
Nutrição de Espécies Aquícolas – LABNUTRI / UFSC. A alimentação será calculada a uma
quantidade de 5% da biomassa ao dia, dividida em quatro porções.
 24

2.2.5.1 Análises hemato-imunológicas

Após o ensaio in vivo de 50 dias três peixes por unidade experimental foram
anestesiados com solução de Eugenol (75 mg L-1) e seu sangue coletado por punção do vaso
caudal com seringas de 3 ml (21 G) contendo anticoagulante. Alíquotas sanguíneas também
foram utilizadas para a determinação do hematócrito (HTC) [17], para a quantificação do
número total de eritrócitos (ERI) em câmara de Neubauer e para a quantificação de
hemoglobina sanguínea (HB). Com a determinação destes parâmetros, foram calculados os
seguintes índices hematimétricos: volume corpuscular médio (VCM), hemoglobina corpuscular
média (HCM) e concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM) [17].
Com o restante do sangue coletado anteriormente, foi realizado um pool com as três
amostras de cada caixa, e este permaneceu em repouso por 1 h a 25 °C, o material foi então
centrifugado a 1.400 g, durante 10 min a 4 °C, para obtenção do plasma que, foi armazenado a
-20 °C para as posteriores análises imunológicas.
A concentração de proteína total do soro sanguíneo foi mensurada de acordo com o kit
de Proteína Total (Biotécnica, Varginha, MG, Brasil). A concentração de imunoglobulina total
foi mensurada de acordo com o método descrito por [18], expressa em mg mL-1.
O título da atividade aglutinante sérica foi realizado em microplaca de 96 poços de
fundo U, onde o soro diluído na proporção de 1:1 em solução tampão fosfato salino (PBS) no
1° poço (50 μL de solução PBS:50 μL do soro), sendo diluído serialmente em fator 1:2 para os
demais poços até o 12°. Depois disso, serão adicionados 50 μL de bactéria Streptococcus
agalactiae inativada em todos os poços. A microplaca será incubada a 25 °C durante 18 h em
câmara úmida. A aglutinação foi confirmada com a observação de um bottom no fundo do poço
a olho nu. O título aglutinante é considerado como o recíproco da última diluição que
apresentou aglutinação [19].
O título da mínima concentração inibitória (MCI) foi realizado em uma microplaca de
96 poços de fundo chato. Adicionou-se 150 µL do meio de cultura “Brain heart infusion broth”
(BHI) no primeiro poço e 100 µL nos demais poço da microplaca. Posteriormente foi
adicionado 50 µL do soro no primeiro poço da linha e realizada uma diluição seriada fator 2 até
o 12° poço. Depois foram adicionados 20 µL de uma suspensão contendo Streptococcus
agalactiae na concentração bacteriana de 0,5 na escala Macfarland ou 1x108 UFC.mL-1 diluídas
em BHI. A microplaca foi incubada a 28 ºC por 24 h.
A mínima concentração inibitória foi determinada como a última diluição do soro onde
houve inibição total do crescimento da bactéria [19]. Por fim foi determinada a concentração
 25

bactericida mínima (CBM). Para o CMB foi realizada estria em TSA da concentração mínima
que inibiu o crescimento visível bacteriano no MCI e de duas diluições acima e duas diluições
abaixo para determinar a concentração bactericida. As placas de TSA foram incubadas por 24h
a 35 ºC, a CBM foi definida como a menor concentração do plasma capaz de causar a morte do
inóculo de S. agalactiae.

2.2.5.2 Análise metagenômica

Visando verificar as alterações da microbiota intestinal, após os 50 dias de tratamento,
realizou-se um pool dos intestinos de cinco animais por unidade experimental, os quais foram
armazenados a -80ºC. Posteriormente foi feita a extração do DNA com o kit QIAamp® DNA
Stool mini (QIOGEN, Hilden, Alemanha, DE) seguindo as especificações do fornecedor. O
material extraído foi quantificado pelo espectrofotômetro NanoDrop ™ 1000 (Thermo
Scientific DE, EUA). As amostras que apresentarem mais de 60 ng serão enviadas para a
empresa Macrogen® para sequenciamento de alto rendimento (HTS).

2.2.6 Parâmetros zootécnicos

Em ambos os ensaios de colonização in vivo, foram realizadas biometrias semanais para
verificação do crescimento e ajuste da ração. Os cálculos, para as características de
desempenho, foram feitos para cada unidade experimental, utilizando as variantes: peso inicial
(g), peso final (g), ganho de peso (g), conversão alimentar e sobrevivência (%), segundo as
fórmulas:
Ganho de peso (g) = Peso final (g) – Peso inicial (g)
Conversão alimentar aparente = Quantidade de ração fornecida (g) / Ganho de peso (g)

2.2.7 Análise estatística

Para o teste in vitro foi utilizada a análise de regressão e para os testes in vivo os dados
foram submetidos à análise de variância e se necessário ao teste T de Student com grau de
significância de 5%, utilizando o software STATISTICA 13.0.
A análise dos dados de metagenômica foi realizada usando R Core Team, 2019. Os
principais pacotes utilizados foram nVennR [20], vegan [21], phyloseq [22] e iNEXT [23,24].
 26

2.3 RESULTADOS

2.3.1 Ensaio de adesão in vitro

A partir do ensaio de adesão in vitro, foi possível observar um aumento do grau de
adesão com relação à concentração do inóculo (Figura 1). O inóculo de concentração 1x103
UFC mL-1 não foi capaz de aderir ao muco, já a partir do inóculo de concentração 1x104 UFC
mL-1, a adesão foi progressiva chegando próximo a 100%.

Figura 1. Progressão das concentrações de adesão ao muco intestinal in vitro, de tilápias-do-Nilo,

relativas à concentração do inóculo de ambas as bactérias oriundas do produto comercial
PureGro®, com valores decimais representados em Log 10 X+1.Ensaio IN VIVO I - 15 dias

9
Concentração de colonização in vitro (Log 10

y = 7,9558ln(x) - 8,309
8
R² = 0,9858
7
6
5
X+1)

4
3
2
1
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Concentração do inóculo (Log 10 X+1)

2.3.1.1 Parâmetros microbiológicos dependentes de cultura do ensaio in vivo

Ambas as cepas probióticas estavam presentes na ração a uma concentração de 1x107
UFC mL-1 no momento da alimentação.
Para a coleta dos resultados microbiológicos do ensaio in vivo realizou-se a contagem
das bactérias heterotróficas totais e a contagem diferencial, através da identificação e
caracterização por coloração de gram, a fim de verificar alteração pela suplementação com B.
subtilis e B. licheniformis (Figura 2). Houve diferença significativa apenas na contagem de B.
licheniformis, porém esta diferenciação não pode ser confirmada através da metodologia de
contagem de colônias em placas de ágar nutriente, sendo indispensável o uso de métodos de
identificação molecular.
 27

Figura 2. Quantificação de bactérias heterotróficas totais presentes no trato intestinal de tilápias-do-Nilo

suplementadas ou não com produto comercial PureGro ®, durante 15 dias, com valores decimais de UFC g-1
representados em Log10.
9,00

8,00

7,00
Contagem microbiana (Log 10)

6,00 *
5,00
Controle
4,00
PureGro®
3,00

2,00

1,00

0,00
Hetetróficas Totais B. subtilis B. liqueniformis

2.3.2 Ensaio IN VIVO II - 50 dias

2.3.2.1 Análises hemato-imunológicas

Dentre os parâmetros hemato-imunológicos analisados pós período experimental,
houve diferença estatística apenas na contagem de eritrócitos totais, com uma concentração
maior para o grupo controle, não tratado com o probiótico PureGro® (Tabela 1).

Tabela 1. Parâmetros hemato-imunológicos analisados de tilápias-do-Nilo suplementadas ou não com produto

comercial PureGro®, durante 50 dias, com 0,5% de significância.
Tratamentos
Variáveis
Controle PureGro® Valor de p
6 -1
ERI (10 ·µl ) 1,63±0,19 1,47±0,13* 0,01
Hematócrito (%) 30,6±5,45 28,2±4,97 0,26
Hemoglobina (g dl-1) 16,28±7,85 14,32±5,44 0,69
VCM (fL) 190,67±34,93 190,41±31,02 0,99
HCM (pg) 104,39±47,43 95,37±28,76 0,81
CHCM (g dl-1) 49,96±28,97 52,81±18,27 0,89
Proteína total (mg ml-1) 37,72±3,75 40,16±10,03 0,66
Imunoglobulina (mg ml-1) 17,81±2,63 17,4±10,19 0,94
Título aglutinante (Log2) 5,25±0,58 5,33±0,5 0,84
MCI (Log2) 3,58±0 3,58±0 -
CBM (Log2) 2,83±0,5 3,08±0,58 0,53
Dados apresentados como média ± desvio padrão. *Indicação de diferença estatística para o nível de significância
de 5%. ERI: Contagem Total de Eritrócitos. VCM: Volume Corpuscular Medio. HCM: Hemoglobina Corpuscular
Media. CHCM: Concentração de Hemoglobina Corpuscular Media. MCI: Mínima Concentração Inibitória. CBM:
Concentração Bactericida Mínima
 28

2.3.2.2 Análise metagenômica

O sequenciamento do trato intestinal dos animais resultou em 68.278 leituras,
agrupadas em 65 unidades taxonômicas operacionais (OTUs) (Figura 3).

Figura 3. Diagrama de Venn proporcional mostrando unidades

taxonômicas operacionais compartilhadas (OTUs) da
comunidade bacteriana do intestino de tilápia do Nilo após uma
suplementação de 50 dias com PureGro®.

O alto Índice de Cobertura de Good e o número semelhante de leituras para ambas as

amostras (Tabela 2) indica que houve uma cobertura adequada da comunidade bacteriana do
intestino dos peixes.

Tabela 2. Número de leituras e Índice de Cobertura de Good da comunidade bacteriana do intestino de tilápia-
do-Nilo após uma suplementação de 50 dias com PureGro ®.
Tratamento
Média ± Desvio
Variáveis Controle PureGro®
Leituras 32904 35374 34139±1747
Índice de Cobertura
99,98% 99,93% 99,95±0,03
de Good

Com relação às medidas de diversidade α, a amostra PureGro® apresentou maior

riqueza, enquanto a amostra Controle pontuou mais alto para as medidas de Shannon e Simpson
(Figura 4).
 29

Figura 4. Diversidade-α medindo Riqueza, Shannon e Simpson estimada por meio de curvas de
rarefação / extrapolação da comunidade bacteriana do intestino de tilápia-do-Nilo após
suplementação de 50 dias com PureGro®.

O filo mais abundante para ambas as amostras foi o Fusobacteria, enquanto entre os
filos de baixa abundância, pode-se destacar que a abundância relativa de Firmicutes aumentou
na amostra PureGro® quando comparada com a amostra Controle (Figura 5).

Figura 5. Abundância relativa de todos os filos (esquerda) e abundância relativa entre os

filos de baixa abundância (direita) da comunidade bacteriana do intestino de tilápia-do-
Nilo, após uma suplementação de 50 dias com PureGro ®. O gráfico com cores diferentes no
painel direito destaca a mudança na abundância relativa de Firmicutes.
 30

Da mesma forma, houve um único gênero responsável pela maior parte da abundância
relativa para ambas as amostras, ou seja, Cetobacterium, enquanto entre os gêneros de baixa
abundância, pode-se destacar que a abundância relativa de Aeromonas diminuiu para o grupo
PureGro® (Figura 6).

Figura 6. Abundância relativa de todos os gêneros (superior) e abundância relativa entre

gêneros de baixa abundância (inferior), da comunidade bacteriana do intestino de tilápia-do-
Nilo após uma suplementação de 50 dias com PureGro ®. O gráfico de cores diferentes no
painel inferior destaca a mudança na abundância relativa de Aeromonas.
 31

2.3.2.3 Parâmetros zootécnicos

Não houve diferenças estatísticas significativas nos parâmetros de desempenho
zootécnico entre os grupos controle e suplementado de ambos os ensaios in vivo, 15 e 50 dias
(Tabela 3 e 4 respectivamente).

Tabela 3. Dados de desempenho zootécnico de tilápias-do-Nilo suplementadas ou não com PureGro®, durante
15 dias.
Tratamento
Variáveis
Controle PureGro® Valor de p
Peso inicial (g) 10,10 ± 2,24 9,52 ± 2,20 0,92
Peso final (g) 20,50 ± 6,40 20,08 ± 6,62 0,85
Ganho de peso (g) 11,14 ± 4,75 11,19 ± 4,45 0,75
Conversão alimentar 0,84 ± 0,59 0,82 ± 0,50 0,47
Sobrevivência (%) 93,3 ± 0,58 83,3 ± 2,08 0,46
Dados apresentados como média ± desvio padrão.

Tabela 4. Dados de desempenho zootécnico de tilápias-do-Nilo suplementadas ou não com PureGro®, durante
50 dias.
Tratamentos
Variáveis
Controle PureGro® Valor de p
Peso inicial (g) 1,96 ± 0,05 1,69 ± 0,50 0,32
Peso final (g) 28,60 ± 2,29 26,35 ± 5,46 0,47
Ganho de peso (g) 26,64 ± 2,26 24,66 ± 5,01 0,49
Conversão alimentar 1,01 ± 0,10 1,07 ± 0,29 0,68
Sobrevivência (%) 85,00 ± 18,00 60,00 ± 22,00 0,13
Dados apresentados como média ± desvio padrão.

2.4 DISCUSSÃO
Os resultados do ensaio in vitro mostram que a concentração do inóculo é diretamente
proporcional ao grau de adesão alcançada pelas bactérias probióticas no muco intestinal. A
partir do inóculo de concentração 1x105 UFC mL-1 foi possível obter um maior percentual de
adesão, uma explicação plausível está na relação de quorum sensing entre as bactérias
probióticas para a formação do biofilme, que ocorre como resultado do aumento progressivo
dos sinais químicos extracelulares ocasionado pelo aumento do número de bactérias em um
determinado ambiente, o que ativa a expressão de genes específicos que permitem que as
bactérias vivam em aglomerados de alta densidade ligados a superfícies, como a mucosa
intestinal [25, 26].
 32

O ensaio in vitro alcançou níveis próximos a 100% de adesão das bactérias ao muco
intestinal referente ao inóculo aplicado. Entretanto é coerente analisar este resultado como
superestimado, visto que estudos [8] observaram que bactérias ácido-láticas foram capazes de
aderir até 20% em ensaios in vitro utilizando muco intestinal de carpa, porém mostra que a
espécie de peixe da qual o muco foi retirado para o ensaio pode influenciar diretamente na taxa
de adesão do ensaio in vitro, bem como o tipo de bactéria a ser testada, colocando em foco a
necessidade de realizar mais ensaios com diferentes espécies de peixes e cepas probióticas, a
fim de elucidar melhor essas questões.
Nos parâmetros microbiológicos dependentes de cultura do ensaio in vivo de 15 dias
houve diferença significativa apenas na concentração da bactéria B. licheniformis, entre o grupo
tratado e o grupo controle. Alevinos de tilápia suplementados com B. subtillis durante pelo
menos 30 dias apresentaram colonização expressiva do trato gastrointestinal, indicando que esta
bactéria necessita de um período maior que 15 dias para colonizar de forma efetiva o trato
intestinal, porém nestes estudos usou-se a contagem diferencial de colônias em meio TSA para
quantificar a colonização por Bacillus sp. no trato gastrointestinal, método não utilizado para
realizar este tipo de afirmação, pois não possui o grau de certeza suficiente para a identificação
da espécie da bactéria a ser quantificada [7, 27].
Há uma grande dificuldade em quantificar e diferenciar corretamente bactérias do
gênero Bacillus, pois não existem meios de cultura seletivos para este grupo de bactérias o que
implica diretamente na necessidade da realização de métodos moleculares mais avançados,
através destes métodos é possível consolidar os argumentos que indicam a eficácia de
colonização dos Bacillus.
Na comparação entre os resultados de colonização in vivo do ensaio de 15 dias e adesão
in vitro é possível observar que a concentração de bactérias totais no grupo suplementado ficou
a um nível muito próximo do indicado no ensaio de adesão in vitro, mesmo sendo pressuposto
de que nem todas as bactérias presentes na contagem sejam do grupo Bacillus sp. e possam
estar presentes em menor quantidade, deve ser levado em conta também o fato de que as
condições in vitro são mais favoráveis ao crescimento das bactérias do que no ambiente natural,
menos controlado e com maiores variáveis. No entanto, o prenúncio do ensaio in vitro de que
as bactérias oferecem alto grau de colonização foi confirmado a partir da identificação
molecular das cepas probióticas na análise metagenômica do ensaio in vivo II – 50 dias, que
mesmo encontradas em baixa concentração mostra a assertividade do ensaio in vitro em apontar
 33

que uma bactéria probiótica mesmo sendo alóctone pode colonizar o trato intestinal da tilápia-
do-Nilo.
Diferentes cepas probióticas autóctones foram testadas na mesma relação de adesão in
vitro e colonização in vivo utilizando muco intestinal de carpa, e obtiveram resultados positivos
da relação entre os dois ensaios [8]. Ainda não foram realizados outros ensaios de adesão in
vitro utilizando cepas alóctones em peixes, o que mostra a necessidade da realização de mais
ensaios. Estudos [28] destacam que considerando todos os fatores que influenciam a adesão in
vivo e que não podem ser simulados in vitro, a validade dos resultados dos ensaios de adesão
in vitro permanece incerta, portanto, não descartando a necessidade da realização do ensaio in
vivo para uma validação sólida da eficiência de cepas probióticas.
Para as análises hemato-imunológicas, diferenças estatisticamente significativas foram
encontradas apenas para a contagem de eritrócitos, em que os peixes alimentados com a dieta
controle exibiram um valor significativamente maior desta variável. Exceto por essa diferença,
esses resultados estão de acordo com os relatados previamente [29, 30] que avaliaram os
probióticos Bacillus spp. e Enterococcus faecium, respectivamente, em dietas para tilápia-do-
Nilo e não encontraram diferenças significativas para as variáveis hemato-imunológicas quando
comparadas com peixes alimentados com dietas não suplementadas. Apesar do valor mais baixo
de eritrócitos encontrado em nosso estudo para os peixes alimentados com probióticos, a falta
de diferenças significativas para as variáveis hemato-imunológicas restantes, juntamente com
a falta de diferenças significativas no desempenho de crescimento, sugere que a suplementação
com probióticos não prejudicou a saúde dos peixes.
O sequenciamento dos tratos-intestinais de tilápia-do-Nilo resultou em 68.278 leituras,
agrupadas em 65 unidades taxonômicas operacionais (OTUs). O alto Índice de Cobertura de
Good e número semelhante de leituras para ambas as amostras indica que houve uma cobertura
adequada da comunidade bacteriana do intestino do peixe para as duas amostras. Com relação
às medidas de diversidade α, a amostra PureGro® exibiu maior riqueza, enquanto a amostra
Controle pontuou mais alto para as medidas de Shannon e Simpson. O filo mais abundante para
ambas as amostras foi o Fusobacteria, enquanto entre os filos de baixa abundância, pode-se
destacar que a abundância relativa de Firmicutes aumentou na amostra PureGro® quando
comparada à dos animais não suplementados. Da mesma forma, houve um único gênero
responsável pela maior parte da abundância relativa de ambas as amostras, ou seja,
Cetobacterium, enquanto entre os gêneros de baixa abundância pode-se destacar que a
 34

abundância relativa de Aeromonas diminuiu para o grupo PureGro®. Em relação ao grupo B.

subtilis, apenas uma leitura foi obtida por sequenciamento, ocorrendo na amostra PureGro®.
Acredita-se que a diversidade da microbiota intestinal esteja relacionada à saúde
animal e ao aparecimento de doenças. Enquanto uma maior diversidade está associada a uma
comunidade bacteriana mais estável que é menos propensa ao aparecimento de espécies
potencialmente patogênicas, uma menor diversidade está associada a uma comunidade
bacteriana menos estável e maior probabilidade de espécies potencialmente patogênicas se
tornarem virulentas [31, 32]. Neste estudo, os efeitos dos probióticos na diversidade da
microbiota intestinal da tilápia-do-Nilo não foram consistentes em todas as medidas de
diversidade α. Enquanto que o tratamento PureGro® aumentou a riqueza de espécies, o grupo
controle apresentou pontuação mais alta para a medida de Simpson, sendo que o efeito na
análise de Shannon não foi clara, pois houve sobreposição entre os intervalos de confiança.
Essas diferenças foram devido ao fato de que OTUs de baixa abundância, como leituras simples
(singletons) e leituras duplas (doubletons), aumentam a riqueza de espécies, que é simplesmente
uma medida do número absoluto de espécies na amostra,onde Shannon e as medidas de
Simpson também levam em consideração as abundâncias relativas de cada OTU [24]. Esses
resultados podem ser interpretados como significando que o probiótico aumentou o número de
espécies pouco abundantes na microbiota intestinal dos peixes.
Embora a abundância relativa do filo Firmicutes tenha aumentado no tratamento
PureGro®, não foi devido a um aumento na abundância do grupo B. subtilis, relativo às espécies
com aplicações biotecnológicas B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis e B.pumilus
[33], visto que este gênero estava presente como um único, em comparação com leituras zero
para o grupo de controle (Tabela S1). O aumento deve-se principalmente a outros gêneros desse
filo, como Clostridium e Paenibacillus (Figura 6), este último compreendendo espécies com
potencial probiótico para peixes [34, 35]. De fato, quando os probióticos são fornecidos aos
peixes, uma das mudanças na comunidade microbiana que eles podem causar é o aumento da
abundância de espécies autóctones com potencial probiótico. Por exemplo, [36] utilizaram
Rummeliibacillus stabekisii como probiótico para tilápia-do-Nilo e, além de um aumento em
sua abundância, também ocorreram aumentos nas abundâncias de Bacillus e Lactobacillus no
trato intestinal dos peixes.
Em estudos de avaliação da microbiota intestinal da tilápia-do-Nilo, é comum a
ocorrência de uma ou poucas espécies constituindo a maioria da comunidade bacteriana
[29,36,37,38], como foi o caso deste estudo. Na verdade, semelhante aos resultados aqui
 35

encontrados em que Cetobacterium somerae (Tabela S1) compreendeu a maioria das contagens
de OTU, Cetobacterium também foi o gênero mais abundante, conforme relatado por Adeoye
et al. [29] (84,3 a 92,1%), Ray et al. [37] (81,6 a 93,9%), Tan et al. [36] (62,8 a 65,4%) e Yu et
al. [38] (40,7 a 69,0%).
Um modo de ação proposto pelo qual os probióticos podem ser benéficos para os
peixes é a competição por nutrientes e espaço com espécies potencialmente patogênicas ou
produtoras de substâncias que inibem seu crescimento [39]. Uma mudança notável na
abundância em nível de gênero foi a redução de Aeromonas de 32% para 0% ao comparar os
peixes alimentados com a dieta controle com os alimentados com PureGro®, o que pode ter sido
causado pelos fatores mencionados acima. A espécie que compreende a maioria das contagens
de Aeromonas foi A. veronii, uma bactéria que tem sido associada a doenças e mortalidade em
massa nos cultivos de tilápia-do-Nilo [40, 41], sugerindo um benefício pelo uso dos probióticos
avaliados neste estudo.
Apesar do fato de que a análise metagenômica forneceu evidências de um pequeno
aumento na abundância dos probióticos avaliados neste estudo, de zero leituras para um
singleton, há indicações de que o produto promulgou mudanças positivas na microbiota
intestinal da tilápia-do-Nilo, a julgar pelo aumento na riqueza de espécies, a maior abundância
de Paenibacillus, um gênero que contém cepas probióticas [34, 35], e a redução da cepa A.
veronii potencialmente patogênica [40, 41].
De acordo com os resultados de desempenho zootécnico dos ensaios in vivo, tanto 15
quanto 50 dias de suplementação não foram suficientes para gerar melhoras significativas no
ganho de peso e conversão alimentar, o que corrobora os dados anteriores [27, 42], os quais
suplementaram B. subtilis na dieta de tilápia-do-Nilo, durante 30 e 70 dias respectivamente, não
encontrando diferenças nas taxas de crescimento. No entanto, os efeitos sobre a melhoria do
desempenho zootécnico em animais suplementados com probióticos, deve-se às características
da bactéria probiótica em produzir uma boa quantidade de enzimas digestivas e se aderir tempo
suficiente para trazer melhorias no intestino, melhorando a digestibilidade e a absorção de
nutrientes, bem como ao tempo de suplementação ao qual os animais são submetidos. Isto
indica que as bactérias probióticas podem resistir às adversidades do meio gastrointestinal
geradas pela competição com a microbiota autóctone já estabelecida, sais biliares, pH e sistema
imune, a fim de se aderir ao trato intestinal, colonizando-o, antes de gerar efeitos significativos
na saúde do animal [6].
 36

Há também a influência do gênero das bactérias presentes no produto, destacando-se

as ácido-láticas e leveduras. Alevinos de tilápia suplementados com Lactobacillus plantarum e
Saccharomyces cerevisiae durante 55 dias apresentaram melhora significativas no ganho de
peso, conversão alimentar e taxas de retenção proteica e energética [43].

2.5 CONCLUSÃO
Os resultados deste ensaio de adesão in vitro indicam que os probióticos B. subtilis e
B. licheniformis (PureGro®) podem aderir ao muco intestinal da tilápia-do-Nilo, uma conclusão
que é ainda apoiada pela microbiologia tradicional dependente de cultura usada para validação
do ensaio in vivo, no qual a contagem de B. liqueniformis foi significativamente maior no
intestino dos peixes alimentados com PureGro®. Além disso, a análise metagenômica no ensaio
in vivo de 50 dias evidenciou a modulação da microbiota intestinal nos peixes provocada pela
adição do probiótico na dieta, ou seja, aumento na riqueza de espécies, maior abundância de
espécies autóctones potencialmente probióticas e menor abundância de A. veronii, um potencial
patógeno para peixes.

2.6 AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES) pela bolsa de Mestrado a J.V.S. Ferrarezi e apoio financeiro parcial (Código
Financeiro 001); ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
pelo apoio financeiro e bolsa de pesquisa a J.L.P. Mouriño (CNPq 301524/2017-3), a M.L.
Martins (CNPq 306635/2018-6), e pela bolsa de pós-doutorado de S.A. Pereira (CNPq 155524
/ 2018-6); e a Fundação de Amparo à Pesquisa e Extensão Universitária (FAPEU), por meio de
bolsa a M.A. Martins.

2.7 REFERÊNCIAS
A. Newaj-Fyzul, A.H. Al-Harbi, B. Austin, Review: Developments in the use of probiotics for
disease control in aquaculture, Aquaculture 431 (2014) 1-11.

M.M. Yamashita, S.A. Pereira, L. Cardoso, A.P. de Araujo, C.E. Oda, E.C. Schmidt, Z.L.
Bouzon, M.L. Martins, J.L.P. Mouriño, Probiotic dietary supplementation in Nile tilapia as
prophylaxis against streptococcosis. Aquac. Nutr. 23 (6) (2017) 1235-1243.
https://doi.org/10.1111/anu.12498.

J.L.P. Mouriño, A.B. Jatobá, B.C. Silva, F.N. Vieira, M.L. Martins, Probióticos na aquicultura.
In: A.T. SOUZA, M.L.A. LIZAMA, R. TAKEMOTO, (Org.), Patologia e sanidade de
organismos aquáticos, Maringá, 2012, pp. 381-404.
 37

L. Tachibana, M.M. Natori, D.C. Dias, S.B. Hamed, C.M. Ishikawa, M.J.T. Ranzani-Paiva,
G.S. Gonçalves. Recentes avanços dos estudos e utilizações de probióticos na piscicultura. In:
M.J.T. Ranzani-Paiva, R.M. Takemoto, M.A.P. Lizama, L.M. Perazzolo, R.D. Rosa (Eds.).
Biotecnologia e sanidade de organismos aquáticos., São Paulo: Associação de Patologistas de
Organismos Aquáticos (ABRAPOA), Cap. 2. p. 41-80, 2019.

M.M. Yamashita, J.V. Ferrarezi, G.V. Pereira, G.B. Júnior, B.C. Silva, S.A. Pereira, M.L.
Martins, J.L.P. Mouriño, Autochthonous vs allochthonous probiotic strains to Rhamdia quelen.
Microb. Pathog. 139 (2020) 103897-103907. https://doi.org/10.1016/j.micpath.2019.103897.

D. Merrifield, E. Ringo, Gut Health, Probiotics and Prebiotics, Aquaculture Nutrition (2014)
498.

H. Mello, J.R.E. Moraes, Efeitos benéficos de probióticos no intestino de juvenis de Tilápia-

do-Nilo. Pesq. Vet. Bras. 33 (6) (2013) 724-730.

Y, Sugimura, T. Hagi, T. Hoshino, Correlation between in vitro Mucus Adhesion and the in
vivo Colonization Ability of Lactic Acid Bacteria: Screening of New Candidate Carp
Probiotics. Biosci. Biotechnol. Biochem (2010) 511-515.

R.M.C. Udayangani, S.H.S. Dananjaya, C. Nikapitiya, G. J. Heo, J. Lee, M. Zoysa,

Metagenomics analysis of gut microbiota and immune modulation in zebrafish (Danio rerio)
fed chitosan silver nanocomposites. Fish & Shellfish Immunol. 66 (2017) 173-184.
https://doi.org/10.1016/j.fsi.2017.05.018.

J.L.P. Mouriño, G.V. Pereira, F.N. Vieira, A.B. Jatobá, T.T. Ushizima, B.C. Silva, W.Q.
Seiffert, G.F.A. Jesus, M.L. Martins, Isolation of probiotic bacteria from the hybrid South
American catfish Pseudoplatystoma reticulatum × Pseudoplatystoma corruscans
(Siluriformes: Pimelodidae), Aquac. Rep. 3 (2016) 166-171
https://doi.org/10.1016/j.aqrep.2016.03.001.

F.C. Odds, Pathogenesis of Candida infections, J. Am. Acad. Dermatol. 31 (3) (1994) 2-5.

R. Vazquez-Juarez, T. Andlid, L. Gustafsson, Cell surface hydrophobicity and its relation to

adhesion of yeasts isolated from fish gut. Coll. Surf. B: Biointerfaces 2 (1-3) (1994) 199-208.

B. Voigt, H. Antelmann, D. Albrecht, A. Ehrenreich, K.H. Maurer, S. Evers, G. Gottschalk,

V.J.M. Dijl, T. Schweder, M. Hecker, Cell Physiology and Protein Secretion of Bacillus
licheniformis Compared to Bacillus subtilis. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 16 (1-2) (2009) 53-
68. https://doi.org/10.1159/000142894.

S.M. Aly, Y.A. Ahmed, A.A. Ghareeb, M.F. Mohamed, Studies on Bacillus subtilis and
Lactobacillus acidophilus, as potential probiotics, on the immune response and resistance of
Tilapia nilótica (Oreochromis niloticus) to challenge infections. Fish & Shellfish Immunol.
25(1-2) (2008) 128-136.

N. Gobi, B. Vaseeharan, J. Chen, R. Rekha, S. Viajayakumar, M. Anjugam, A. Iswarya, Dietary

supplementation of probiotic Bacillus licheniformis Dahb1 improves growth performance,
mucus and serum immune parameters, antioxidant enzyme activity as well as resistance against
 38

Aeromonas hydrophila in tilapia Oreochromis mossambicus. Fish & Shellfish Immunol. 74

(2018) 501-508.

NRC (National Research Council), 2011. Nutrient Requirements of Fish and Shrimp. National
Academies Press, Washington, DC.

M. J. T. Ranzani-Paiva, S.B. Pádua, M. Tavares-Dias, M.I. Egami, Métodos para análise

hematológica em peixes, Maringá: Eduem (2013) 140.

E.C. Amar, V. Kiron, S. Satoh, N. Okamoto, T. Watanabe, Effects of dietary beta-carotene on

the immune response of rainbow trout Oncorhynchus mykiss. Fish. Sci. 66 (6) (2000) 1068-
1075.

B.C. Silva, M.L. Martins, A. Jatobá, B. Neto, C. Celso, F.N. Vieira, G.V. Pereira, G.T.
Jerônimo, W.Q. Seiffert, J.L.P. Mouriño, Hematological and immunological responses of Nile
tilapia after polyvalent vaccine administration by different routes. Pesq. Vet. Bras. 29 (11)
(2009) 874-880. http://dx.doi.org/10.1590/s0100-736x2009001100002.

V. Quesada, 2020. nVennR: Create n-Dimensional, Quasi-Proportional Venn Diagrams. R

package version 0.2.2. https://CRAN.R-project.org/package=nVennR.

J. Oksanen, F.G. Blanchet, M. Friendly, R. Kindt, P. Legendre, D. McGlinn, P.R. Minchin,

R.B, O'Hara, G.L. Simpson, P. Solymos, M.H.H. Stevens, E. Szoecs, H. Wagner, vegan:
Community Ecology Package. R package version 2. (2019) 5-6. https://CRAN.R-
project.org/package=vegan.

P.J. McMurdie, S. Holmes. Phyloseq: An R package for reproducible interactive analysis and
graphics of microbiome census data. PLoS ONE 8(4) (2013) e61217.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0061217.

A. Chao, N.J. Gotelli, T.C. Hsieh, E.L. Sander, K.H. Ma, R.K. Colwell, A.M. Ellison,
Rarefaction and extrapolation with Hill numbers: a framework for sampling and estimation in
species diversity studies. Ecol. Monogr. 84 (2014) 45–67. https://doi.org/10.1890/13-0133.1.

[24] T.C. Hsieh, K.H. Ma, A. Chao, 2020. iNEXT: iNterpolation and EXTrapolation for species
diversity. R package version 2.0.20 URL: http://chao.stat.nthu.edu.tw/wordpress/software-
download/.

M.R. Parsek, E.P. Greenberg, Sociomicrobiology: the connections between quorum,

Ehttp://dx.doi.org/10.1016/j.tim.2004.11.007.

M. Whiteley, S.P. Diggle, E.P. Greenberg, Progress in and promise of bacterial quorum sensing
research. Nature 551 (2017) 313–320. https://doi.org/10.1038/nature24624.

L. Tachibana, D.C. Dias, C.M. Ishikawa, C.F. Correa, A.F.G. Leonardo, M.J.T. Ranzani-Paiva,
Probiotic in the feed of Nile tilapia (Oreochromis niloticus Linnaeus, 1758) during sex reversal:
zootechnical performance and the recovery of probiotic bacteria in the intestine. Bioikos 25(1)
(2011) 25–31.
 39

A.C. Ouwehand, S. Salminen, In vitro adhesion assays for probiotics and their in vivo
relevance: a review. Microb. Ecol. Health Dis. 15 (4) (2003) 175-184
http://dx.doi.org/10.1080/08910600310019886.

A.A. Adeoye, R. Yomla, A. Jaramillo-Torres, A. Rodiles, D.L. Merrifield, S.J. Davies,

Combined effects of exogenous enzymes and probiotic on Nile tilapia (Oreochromis niloticus)
growth, intestinal morphology and microbiome. Aquaculture 463 (2016) 61–70.

L. Tachibana, G.S. Telli, D.C. Dias, G.S. Gonçalves, C.M. Ishikawa, R.B. Cavalcante, M.M.
Natori, S.B. Hamed, M.J.T. Ranzani-Paiva, Effect of feeding strategy of probiotic Enterococcus
faecium on growth performance, hematologic, biochemical parameters and non-specific
immune response of Nile tilapia. Aquac. Rep. 16 (2020) 100277.
https://doi.org/10.1016/j.aqrep.2020.100277.

O. Vadstein, K.J. Attramadal, I. Bakke, Y. Olsen, K-selection as microbial community

management strategy: a method for improved viability of larvae in aquaculture. Front.
Microbiol. 9 (2018) 2730. https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.02730.

S. Infante‐Villamil, R. Huerlimann, D.R. Jerry, Microbiome diversity and dysbiosis in

aquaculture. Rev. Aquacult. (2020) 1–20. https://doi.org/10.1111/raq.12513.

B. Fan, J. Blom, H.P. Klenk, R. Borriss, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus velezensis, and
Bacillus siamensis form an “Operational Group B. amyloliquefaciens” within the B. subtilis
species complex. Front. Microbiol. 8 (2017) https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.00022.

S.W Chen, C.H. Liu, S.Y. Hu, Dietary administration of probiotic Paenibacillus ehimensis
NPUST1 with bacteriocin-like activity improves growth performance and immunity against
Aeromonas hydrophila and Streptococcus iniae in Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Fish
Shellfish Immunol. 84 (2019) 695–703. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2018.10.059.

S.J. Midhun, D. Arun, S. Neethu, A. Vysakh, E.K. Radhakrishnan, M. Jyothis Administration

of probiotic Paenibacillus polymyxa HGA4C induces morphometric, enzymatic and gene
expression changes in Oreochromis niloticus, Aquaculture 508 (2019) 52–59.
https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2019.04.061.

[36] H.Y. Tan, S.W. Chen, S.Y. Hu, Improvements in the growth performance, immunity,
disease resistance, and gut microbiota by the probiotic Rummeliibacillus stabekisii in Nile
tilapia (Oreochromis niloticus). Fish & Shellfish Immunol. 92 (2019) 265–275.
https://doi.org/10.1016/j.fsi.2019.06.027.

C. Ray, N. Bujan, A. Tarnecki, A.D. Davis, C. Browdy, C.R. Arias, Analysis of the gut
microbiome of Nile tilapia Oreochromis niloticus L. fed diets supplemented with Previda® and
Saponin, J. Fishscience 11(2) (2017) 36–45. https://doi.org/10.21767/1307-234X.1000116.

L. Yu, N. Qiao, T. Li, R. Yu, Q. Zhai, F. Tian, J. Zhao, H. Zhang, W. Chen, Dietary
supplementation with probiotics regulates gut microbiota structure and function in Nile tilapia
exposed to aluminum. PeerJ 7 (2019) e6963. http://doi.org/10.7717/peerj.6963.

A. Farzanfar, The use of probiotics in shrimp aquaculture. FEMS Immunol. Med. Microbiol.
48(2) (2016) 149–158. https://doi.org/10.1111/j.1574-695X.2006.00116.x.
 40

H.T. Dong, C. Techatanakitarnan, P. Jindakittikul, A. Thaiprayoon, S. Taengphu, W.

Charoensapsri, P. Khunrae, T. Rattanarojpong, S. Senapin, Aeromonas jandaei and Aeromonas
veronii caused disease and mortality in Nile tilapia, Oreochromis niloticus (L.). J. Fish Dis.
40(10) (2017) 1395–1403. https://doi.org/10.1111/jfd.12617.

N.S. Raj, T.R. Swaminathan, A. Dharmaratnam, S.A. Raja, D. Ramraj, K.K. Lal, 2019.
Aeromonas veronii caused bilateral exophthalmia and mass mortality in cultured Nile tilapia,
Oreochromis niloticus (L.) in India. Aquaculture 512, 734278.
https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2019.734278.

R.V. Azevedo, J.C.F. Filho, S.L. Pereira, L.D. Cardoso, M.V.V. Junior, D.R. Andrade,
Suplementação com prebiótico, probiótico e simbiótico para juvenis de tambaqui a duas
densidades de estocagem. Pesq. Agropec. Bras. 51 (1) (2016) 9-16.

F.H.G. Cornélio, E. Cargnin-Ferreira, M.R. Borba, J.L.P. Mouriño, V.A.G. Fernandes, D.M.
Fracalossi, Crescimento, digestibilidade e resistência à infecção por patógeno em tilápia-do-
nilo alimentada com probióticos. Pesq. Agropec. Bras. 48 (8) (2013) 863-870.
 41

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DA INTRODUÇÃO GERAL

AUSTIN, B.; AUSTIN, D.A. Bacterial Fish Pathogens Disease of Farmed and Wild Fish. 5º
edição, pp. 119-228 Springer, 2012.

BREITWIESER, F.P.; LU, J.; SALZBERG, S.L. A review of methods and databases for
metagenomic classification and assembly. Briefings in Bioinformatics, v. 20, n. 4, p. 1125-
1136, 2017.

DECOSTERE, A.; HAESEBROUCK, F.; TURNBULL, J. F.; CHARLIER, G. Influence of

water quality and temperature on adhesion of high and low virulence Flavobacterium
columnare strains to isolated gill archés. Journal of Fish Diseases, v. 22 (1), p. 1–11, 1999.

DEFOIRDT, T. Virulence mechanisms of bacterial aquaculture pathogens and antivirulence

therapy for aquaculture. Reviews in Aquaculture, v. 6, n. 2, p. 100-114, 2013.

DONG, H.T.; NGUYEN, V.V.; LE, H.D.; SANGSURIYA, P.; JITRAKORN, S.;
SAKSMERPROME, V.; SENAPIN, S.; RODKHUM, C. Naturally concurrent infections of
bacterial and viral pathogens in disease outbreaks in cultured Nile tilapia (Oreochromis
niloticus) farms. Aquaculture. v. 448 (1), p. 427–435, 2015.

EL-SAYED, A-F. M. Tilápia Culture. CAB Publishing. v.1, p.17-40, 2006.

FOUZ, B.; ALCAIDE, E.; BARRERA, R.; AMARO, C. Susceptibility of Nile tilapia
(Oreochromis niloticus) to vibriosis due to Vibrio vulnificus biotype 2 (serrovar E).
Aquaculture, v. 212 (1-4), p. 21-30, 2002.

HOSEINIFAR, S. H.; SUN, Y.; WANG, A.; ZHOU, Z. Probiotics as Means of Diseases
Control in Aquaculture, a Review of Current Knowledge and Future Perspectives. Frontiers in
Microbiology, v. 9, p. 1-18, 2018.

IREGUI, C.A; GUARÍN, M.; TIBATÁ, V.M.; FERGUSON, H.W. Novel brain lesions caused
by Edwardsiella tarda in a red tilapia (Oreochromis spp.). Journal of Veterinary Diagnostic
Investigation, v. 24(2), p. 446–449, 2012.

KUEBUTORNYE, F. K. A.; ABARIKE, E. D.; LU, Y.; HLORDZI, V.; SAKYI, M. E.;
AFRIYIE, G.; WANG, Z.; LI, Y.; XIE, C. X. Mechanisms and the role of probiotic Bacillus in
mitigating fish pathogens in aquaculture. Fish Physiology and Biochemistry, v. 46, n. 3, p.
819-841. 2020.

KUEBUTORNYE, F. K.; ABARIKE, E. D.; LU, Y. A review on the application of Bacillus as

probiotics in aquaculture. Fish & Shellfish Immunology, v. 87, p. 820-828, 2019.

LEAL, C.A; TAVARES, G.C.; FIGUEREDO, H.C. Outbreaks and genetic viversity of
Francisella noatunensis subsp orientalis isolated from farm-raised Nile tilapia (Oreochromis
niloticus) in Brazil. Genetics and Molecular Research, v.13, p. 574-5712, 2014.

LIU, X. F.; LI, Y.; LI, J. R.; CAI, L.Y.; LI, X. X.; CHEN, J. R.; LYU, S. X. Isolation and
characterisation of Bacillus spp. antagonistic to Vibrio parahaemolyticus for use as probiotics
 42

in aquaculture. World Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 31, n. 5, p. 795-803,

2015.

MARTINS, ML.; MOURIÑO, JLP.; AMARAL, GV.; VIEIRA, FN.; DOTTA, G.; JATOBÁ,
AMB.; PEDROTTI, FS.; JERÔNIMO, GT.; BUGLIONE-NETO, CC.; PEREIRA-JR., G.
Alterações hematológicas em tilápia-do-nilo infectada experimentalmente com Enterococcus
sp. Brazilian Journal of Biology, v. 68 (3), p. 657-661, 2008.

MERRIFIELD, D.; RINGO, E. (Edit) Gut health, probiotics and prebiotics. Aquaculture
Nutrition, Wiley-Blackwell, 488 p., 2014.

MOURIÑO, J. L. P.; JATOBÁ, A.; Silva, B. C.; Vieira, F. N.; MARTINS, M. L. Probióticos
na aquicultura. In: SOUZA, Ângela Teresa; LIZAMA, Maria De Los Angeles; TAKEMOTO,
Ricardo. (Org.). Patologia e sanidade de organismos aquáticos. 1ed. MARINGÁ, PR:
ABRAPOA, v. 1, p. 381-404, 2012.

OLMOS, J. Bacillus subtilis A Potential Probiotic Bacterium to Formulate Functional Feeds

for Aquaculture. Journal of Microbial & Biochemical Technology, v. 6, n. 07, p. 361-365,
2014.

Peixe BR - Anuário Brasileiro da Piscicultura Peixe Br. São Paulo: Texto Comunicação
Corporativa, 2020. Anual.

PEREIRA, S. A.; JESUS, G. F. A.; PEREIRA, G. V.; SILVA, B. C.; SÁ, L. S.; MARTINS, M.
L.; MOURIÑO, J. L. P. the chelating mineral on organic acid salts modulates the dynamics and
richness of the intestinal microbiota of a silver catfish Rhamdia quelen. Current Microbiology,
v. 77, n. 8, p. 1483-1495, 2020.

PRIDGEON, J. W.; KLESIUS, P. H. Major bacterial diseases in aquaculture and their vaccine
development. CAB Reviews, v. 7, p. 1-16, 2012.

RINGO, E.; VAN DOAN, H.; LEE, S. H.; SOLTANI, M.; HOSEINIFAR, S. H.;
HARIKRISHNAN, R.; SONG, S. K. Probiotics, lactic acid bacteria and bacilli: interesting
supplementation for aquaculture. Journal of Applied Microbiology, v. 129, n. 1, p. 116-136,
2020.

RUIZ, M. L.; OWATARI, M. S.; YAMASHITA, M. M.; FERRAREZI, J. V. S.; GARCIA, P.;
CARDOSO, L.; MARTINS, M. L.; MOURIÑO, J. L. P. Histological effects on the kidney,
spleen, and liver of Nile tilapia Oreochromis niloticus fed different concentrations of probiotic
Lactobacillus plantarum. Tropical Animal Health and Production, v. 52, n. 1, p. 167-176,
2019.

SILVA, B.C.; MARTINS, M.L.; JATOBÁ, A.; NETO, C.C.B.; VIEIRA, F.N.; PEREIRA,
G.V.; JERÔNIMO, G.T.; SEIFFERT, W.Q.; José Luiz P. MOURIÑO, J.L.P. Hematological
and immunological responses of Nile tilapia after polyvalent vaccine administration by
different routes. Pesquisa Veterinária Brasileira. v. 29 (11), p. 874-880, 2009.

SOLTANI, M.; GHOSH, K.; HOSEINIFAR, S. H.; KUMAR, V.; LYMBERY, A. J.; ROY, S.;
RINGO, E. Genus Bacillus, promising probiotics in aquaculture: aquatic animal origin, bio-
 43

active components, bioremediation and efficacy in fish and shellfish. Reviews In Fisheries
Science & Aquaculture, v. 27, n. 3, p. 331-379, 2019.

SUGIMURA, Y.; HAGI, T.; HOSHINO, T. Correlation between in Vitro Mucus Adhesion and
the in vivo Colonization Ability of Lactic Acid Bacteria: Screening of New Candidate Carp
Probiotics. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, v. 75, n. 3, p. 511-515, 2010.

TACHIBANA L.; NATORI, M. M.; DIAS, D. C.; HAMED, S. B.; ISHIKAWA, C. M.;
RANZANI-PAIVA, M. J. T.; GONÇALVES, G. S. Recentes avanços dos estudos e utilizações
de probióticos na piscicultura. In: RANZANI-PAIVA, Maria José Tavares et al (Org.).
Biotecnologia e sanidade de organismos aquáticos. São Paulo: Associação de Patologistas
de Organismos Aquáticos (ABRAPOA), Cap. 2. p. 41-80, 2019.

TAVARES, G.C.; F.A.A; SANTOS, R.R.D.; BARONY, G.M.; LEAL, C.A.G.; FIGUEIREDO,
H.C.P. Nonlethal sampling methods for diagnosis of Streptococcus agalactiae infection in Nile
tilapia, Oreochromis niloticus (L.). Aquaculture, v. 454 (1), p. 237-242, 2016.

UDAYANGANI, R. M.; DANANJAYA, S. H. S.; NIKAPITIYA, C.; HEO, G. J.; LEE, J.;
ZOYSA. Metagenomics analysis of gut microbiota and immune modulation in zebrafish (Danio
rerio) fed chitosan silver nanocomposites. Fish & Shellfish Immunology, v. 66, p. 173-184,
2017.