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A553h
2008
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Aos amigos que a vida me proporcionou: Renato Cruz, Frederico Siqueira, Cludio Furtado, Carlos Roberto, Bencio Chaves, Jlio Maria e Antnio Carlos, pela fraternal convivncia.
Aos professores do Departamento de Tecnologia de Alimentos da Universidade Federal de Viosa, pelo convvio.
Apresentao
Apresentao
A ocorrncia de processos de adeso microbiana e formao de biofilmes no
ambiente de processamento de alimentos tem de ser entendida, avaliada e controlada pelos responsveis pela produo de alimentos com qualidades sensorial, nutricional e microbiolgica, de forma a atender s expectativas dos consumidores.
Constatando a escassez de informaes sobre o tema em publicaes nacionais, os idealizadores do livro Higiene na Indstria de Alimentos Avaliao e Controle de Adeso e Formao de Biofilmes Bacterianos procuraram mesclar conhecimentos tericos com resultados de pesquisas na rea de Higiene Industrial. Esses
estudos envolveram, nos ltimos anos, mais de uma dezena de pesquisadores, doutorandos, mestrandos e estudantes de iniciao cientfica, no mbito do Programa
de Ps-Graduao em Cincia e Tecnologia de Alimentos, da Universidade Federal
de Viosa, em Viosa, Minas Gerais.
O livro divide-se em duas partes. Na primeira so abordados, em trs captulos,
os mecanismos, as tcnicas microscpicas e testes usados para avaliar a adeso e
a formao de biofilmes. Na segunda parte, em sete captulos so fornecidos conhecimentos tericos e resultados de pesquisa para controle dessas ocorrncias
indesejveis. Nessa parte do livro, enfocada a relao ambiente de processamento
de alimentos e processos de adeso bacteriana e formao de biofilmes, com informaes essenciais sobre a qualidade e tratamento da gua, o uso de detergentes e
sanitizantes, o controle microbiolgico de processos e metodologias convencionais
para avaliar e controlar a qualidade microbiolgica do ar e de equipamentos, utenslios e manipuladores.
Os autores esperam que esta publicao possa contribuir para que a indstria
de alimentos brasileira, por meio dos profissionais que nela atuam, esteja mais preparada e mais competitiva neste mercado cada vez mais globalizado e exigente.
Professor Nlio Jos de Andrade
Viosa, Minas Gerais, 2008.
Autor/Pesquisador Principal
Nlio Jos de Andrade, Engenheiro-Agrnomo e Mestre em Cincia e Tecnologia de Alimentos pela UFV-MG e Doutor em Tecnologia de Alimentos pela UNICAMPSP. Professor Titular do Departamento de Tecnologia de Alimentos da UFV-MG
Co-Autores/Pesquisadores/Colaboradores
Aurlia Dornelas de Oliveira Martins, Bacharela em Cincia e Tecnologia de
Laticnios e Mestra em Cincia e Tecnologia de Alimentos pela UFV-MG.
Ernny Marcelo Simm, Engenheiro de Alimentos e Mestre em Cincia e Tecnologia de Alimentos pela UFV-MG.
Hamilton Mendes Figueiredo, Engenheiro-Agrnomo pela UFRA-PA e Mestre e Doutor em Cincia e Tecnologia de Alimentos pela UFV-MG. Professor Adjunto da UFPA-PA.
Apresentao
Maria do Socorro Rocha Bastos, Engenheira de Alimentos pela UFC-CE e Mestra e Doutora em Cincia e Tecnologia de Alimentos pela UFV-MG. Pesquisadora da
EMBRAPA, Frutas Tropicais, Fortaleza-CE.
Patrcia Dolabela Costa, Bacharela em Cincia e Tecnologia de Laticnios e Mestra em Cincia e Tecnologia de Alimentos pela UFV-MG.
Roberta Torres Careli, Bacharela em Cincia e Tecnologia de Laticnios e Mestra em Cincia e Tecnologia de Alimentos pela UFV-MG.
pela produo de alimentos seguros, sob os aspectos fsicos, qumicos, microbiolgicos, sensoriais e nutritivos, com enfoque principal no ambiente de processamento
de alimentos e na sua relao com processos de adeso microbiana e formao de
biofilmes.
Apresentao
Sumrio
Captulo 01
Adeso e Formao de Biofilmes Microbianos
15
18
28
2.1. Ao Inoxidvel
29
2.2. Polmeros
32
40
42
5.
37
40
42
44
46
50
52
55
59
60
Captulo 02
Tcnicas em Microscopia Usadas no Estudo da Adeso e da Formao de Biofilmes
Microbianos67
1.
Introduo
2. Microscopia ptica de Luz
3.
68
69
70
82
99
99
3.2. Uso da Microscopia de Fora Atmica na Avaliao de Adeso de Microrganismos e Anlise de Rugosidade de Superfcies
101
111
3.4. Adeso Bacteriana e Formao de Biofilmes Observada pela Microscopia Eletrnica de Varredura
113
4. Concluso
Referncias
114
114
116
Captulo 03
Testes em Uso Simulado para Avaliao de Processos de Adeso e Formao de Biofilmes
Bacterianos
121
1. Introduo
2. Consideraes Sobre o Sistema Cleaning In Place (CIP)
3. Sistema-Modelo de Circulao de Leite para Estudos de Adeso Bacteriana
3.1. Adeso de Enterococcus faecium a Ao Inoxidvel e sua Resistncia a Agentes Qumicos
122
123
126
127
133
3.3 - Adeso de esporos de Bacillus cereus em Ao Inoxidvel: Efeito do Fluxo e do Tempo de Adeso
147
3.4 - Adeso de Esporos de Bacillus sporothermodurans a Ao Inoxidvel e sua Resistncia a Sanitizantes Qumicos
150
4. Sistema-Modelo para Avaliao de Adeso Bacteriana e Eficincia Bactericida da Radiao Ultravioleta em Polietileno
de Baixa Densidade
158
4.1 - Adeso de Escherichia coli e Staphylococcus aureus a Polietileno e suas Resistncias Radiao Ultravioleta
4.2 - Adeso de Bacillus sporothermodurans ao Polietileno e sua Resistncia Radiao Ultravioleta
5. Concluso
Referncias
161
174
178
179
Captulo 04
Controle da Higienizao na Indstria de Alimentos
181
1. Introduo
2. Fundamentos Bsicos da Higienizao
182
183
184
184
188
188
202
2.6. Sanitizantes
204
218
220
221
221
222
222
223
223
224
Referncias
225
Captulo 05
Controle de Doenas de Origem Alimentar no Processamento de Alimentos
227
1. Introduo
2. Os Fatores do Crescimento Microbiano e o Processamento de Alimentos
228
230
230
235
239
239
256
Concluso
Referncias
265
266
Captulo 06
Qualidade e Tratamento da gua no Controle de Adeso Microbiana na Indstria de
Alimentos
1. Introduo
2. Monitoramento da Qualidade da gua
271
272
274
276
277
278
282
282
289
289
292
Referncias
303
Captulo 07
Qualidade Microbiolgica do Ar de Ambientes de Processamento na Indstria de Alimentos
305
1. Introduo
2. Avaliao da Qualidade Microbiolgica do Ar
306
307
308
309
312
312
315
324
327
328
Referncias
331
Captulo 08
Metodologias Convencionais para Anlises Microbiolgicas e Equipamentos, Utenslios e
Manipuladores na Indstria de Alimentos.
333
1. Introduo
334
335
337
337
338
338
339
339
340
344
347
Referncias
356
Captulo 09
A Tcnica de ATP Bioluminescncia na Avaliao e no Controle de Processos de Adeso
Microbiana na Indstria de Alimentos
359
1. Introduo
2. Uso de ATP-Bioluminescncia para Avaliar a Qualidade da gua
3. Adeso Bacteriana em Superfcies de Ao Inoxidvel Avaliada pela Tcnica de ATP-bioluminescncia
4. Condies Higinicas de Equipamentos para a Produo de Leite Pasteurizado Avaliadas por
ATP-bioluminescncia
5. Adeso de Esporos de Bacillus sporothermodurans em Ao Inoxidvel avaliada pela Tcnica do
ATP-bioluminescncia
6. Interferncia de Substncias Orgnicas e de Microrganismos na Medida de ATP-Bioluminescncia
360
366
370
373
375
377
377
383
Concluso
Referncias
385
386
Captulo 10
Avaliao Laboratorial de Sanitizantes Qumicos
1. Introduo
389
390
392
393
395
396
2. Avaliao da Resistncia de Enterococcus faecium Isolado de Leite Cru aos Agentes Qumicos Sanitizantes
2.2. Avaliao pelo Teste de Suspenso
3. Eficincia do cido Peractico sobre Esporos de Bacillus sporothermodurans Avaliada pelos Testes
de Diluio de Uso e de Suspenso
397
397
400
400
401
402
403
403
405
406
406
5.3 Rotulagem
407
408
409
410
411
de
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01
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Referncias
16
agregando-se em fragmentos de madeira, e convertem diversos substratos em vinagre. Esses agregados microbianos so tambm usados em tratamentos aerbios
e anaerbios de guas residurias, para remoo de matria orgnica e inorgnica.
No processo de potabilizao de gua, a remoo de nitrognio, carbono biodegradvel e precursores de tri-halometanos pode ser feita por biofilmes microbianos
submersos (TAKASAKI et al., 1992).
A adeso e formao
de
biofilmes
microbianos
desencadear
corrosivos;
e,
principalmente, tornar fontes de contaminao microbiana (BEER et al., 1992; ZOTTOLA; SASAHARA, 1994;
BEECH, 2004). Sob o aspecto microbiolgico, a adeso pode constituir-se de mi-
17
cap.01
18
Bacillus cereus (DOYLE, 1992; HOOD, 1996; PARIZZI, 1999; PARIZZI et al.,
2004).
Uma
microbio-
ta bem diversificada,
portanto, incluindo espcies Gram-positivas,
Gram-negativas, esporulantes ou no, bastonetes, cocos em cacho
(Figura 2), cocos em
cadeia, psicrotrficos,
mesfilos, termfilos e
19
cap.01
20
com predomnio dos agentes bacterianos, que se envolveram em 51,4 % dos casos.
Os surtos causados por Salmonella spp. e Staphylococcus aureus foram os que mais
contriburam para a ocorrncia das doenas de origem bacteriana.
A ocorrncia de surtos, no Brasil, de notificao obrigatria desde 1999, conforme Portaria GM/MS n 1461, de 22/12/99. No entanto, h subnotificao que geralmente ocorre porque a doena pode se manifestar de forma branda, sem necessitar
de tratamento mdico, pelo fato de o consumidor no considerar importante o aparecimento de distrbios gastrointestinais espordicos e tambm desconhecer que pode
e deve denunciar, a fim de evitar ocorrncia de novos casos. A rotina sobrecarregada
dos servios de sade, sem espao para a notificao dos surtos de doenas de origem alimentar, tambm contribui para a subnotificao.
Nos dados disponibilizados pelo Sistema nico de Sade, o SUS, no perodo entre 1998 e 2001 a ocorrncia de infeces intestinais destacada como
o principal diagnstico, as quais so responsveis por 4,5 % a 4,8 % das causas
das internaes hospitalares (ANTUNES, 2000). Dentre outras doenas envolvidas,
encontram-se a clera, febre tifide, shigelose e amebase. Tais doenas repre-
perodo, sendo o grupo de causas com maior nmero de internaes, em comparao com outras doenas infecciosas, como tuberculose, malria, dengue ou
AIDS. Nesse perodo, o numero de internaes por doenas infecciosas intestinais
foi de aproximadamente 570.000, com valor total dessas hospitalizaes para o
pas, em 2001, de cerca de 108 milhes de reais, enquanto em 1998 era de 74 milhes de reais. Em comparao com o nmero de internaes por grandes grupos
de causas, classificadas pelo Cdigo Internacional de Doenas (CID 10/10 Reviso
da Classificao), as doenas infecciosas intestinais esto classificadas no 6 ou 7
lugar, considerando-se a populao como um todo (SCZ, 2002).
Em Minas Gerais, entre 1995 e 2000, dados da Fundao Ezequiel Dias (FUNED)
demonstraram que 12.820 pessoas foram intoxicadas e 17 morreram aps ingerirem
21
Com o desenvolvimento da epidemiologia e a melhoria dos servios de vigilncia em doenas causadas por alimentos contaminados, os fatores especficos
que contribuem para a ocorrncia de surtos ficaram evidentes, incluindo-se prticas,
procedimentos e processos de fabricao deficientes.
Os fatores que contribuem para surtos de doenas de origem alimentar refletem perigos, e conseqentemente o conhecimento desses fatores ajuda a estabelecer pontos crticos de controle no processo. Assim, possvel propor medidas para
eliminar ou reduzir os perigos. A partir da possvel traar orientaes para avaliar
a probabilidade de ocorrncia de um risco e a indicao de onde a verificao do
monitoramento de um ponto crtico de controle necessria. Esses fatores devem
ser priorizados por legisladores, administradores de programas de qualidade, super-
cap.01
Em pesquisa sobre as percepes, experincias e comportamento preventivo em doenas causadas por alimentos contaminados nos Estados Unidos
foram relacionados os principais fatores que levaram ocorrncia dessas doenas naquele pas. Cerca de 65 % dos alimentos foram adquiridos em restaurantes, 17 % em supermercados, 17 % consumidos em residncias e 1 %
adquiridos de indstrias. Os principais fatores que causaram os surtos foram o
consumo de sobras de alimentos ou aps a data de validade (27 %), o resfriamento inadequado (23 %), alimentos contaminados e de fonte insegura (12 %),
coco inadequada (10 %), m higienizao e contaminao cruzada (7 %) e
reaquecimento inadequado (1 %).
Os esporos bacterianos (Figura 3) esto amplamente dispersos no ambiente, solo, ar e
gua, de onde podero contaminar alimentos e superfcies e originar processos de adeso e
formao de biofilmes. Os principais gneros de bactrias que apresentam a capacidade de
formar esporos so: Bacillus, Clostridium, Sporolactobacillus, Sporossarcina, Oscillospira,
Alycliclobacillus e Desulfotomacullum, compreendendo espcies alteradoras e, ou,
patognicas. Os esporos tm grande importncia na indstria de alimentos, por
serem resistentes ao tratamento trmico, radiao, dessecao e aos agentes
qumicos. Alm disso, so refrteis e absorvem fracamente os corantes comuns,
mas podem ser observados empregando-se mtodos especiais de colorao. So
bastonetes ou cocos, s vezes apresentam-se sob a forma de filamentos, com dimetro entre 0,3 e 2 mm e comprimento variando de 2 mm a 10 mm, podendo atingir
30 mm. A maioria das espcies na sua forma vegetativa Gram-positiva e, em geral,
tem flagelos peritrquios.
22
quando se observam as espcies bacterianas esporulantes. Dentre elas, encontram-se: i) Clostridium botulinum, que a bactria produtora da toxina mais letal
das espcies bacterianas, sendo responsvel por uma intoxicao neurotxica, de
letalidade elevada; ii) Clostridium perfringens, causador da intoxicao diarrica;
iii) Bacillus cereus, responsvel por sndromes emticas ou diarricas, dependendo da estirpe; iv) Clostridium tyrobutiricum, causador do estufamento tardio em
queijos; v) Alyciclobacillus acidoterrestris, alterador de suco de laranja; vi) Bacillus
sporothermodurans, resistente ao tratamento de Ultra Alta Temperatura, o UAT;
vii) Sporolactobacillus spp., alterador de alimentos cidos como o iogurte; viii)
Bacillus stearothermophilus, que apresenta alta resistncia ao calor; viii) Bacillus
coagulans, alterador de diversos alimentos; e ix) Desulfotomaculum nigrificans,
um anaerbio estrito, que utiliza nitrato, sulfitos e enxofre como aceptores de el-
23
As clulas cultivadas em laboratrio apresentaram-se sob a forma de bastonetes alongados e filamentosos, superiores a 30 m de comprimento e 0,7 m de
cap.01
24
interna que origina a membrana celular e uma camada que forma a parede celular da
nova clula vegetativa. Na seqncia, encontram-se a membrana externa e o crtex,
formado de peptideoglicano, que confere resistncia ao esporo a tratamentos trmicos. A capa do esporo, que a camada mais externa, constituda por uma ou mais
camadas de protena, com alto contedo dos aminocidos metionina ou cistena com
ligaes dissulfdicas (S-S). Essas ligaes no so reduzidas pelos agentes oxidantes,
o que confere resistncia aos sanitizantes mais comuns usados na indstria de alimentos, incluindo cloro, iodo, cido peractico e compostos quaternrios de amnia.
Alguns esporos apresentam uma ltima camada, o exosprio, constituda por lipopolissacardeos. Quando o esporo se transforma em clula vegetativa, o crtex, a capa e
o exosprio so hidrolisados.
25
cap.01
27
28
a detergentes e sanitizantes sob condies normais de uso. Alm disso, seus componentes no devem ser txicos, no podem migrar nem ser absorvidos pelos alimentos.
As superfcies lisas, duras, contnuas sem fendas ou fissuras so as mais indicadas para
contato sem deformaes, como o abaulamento. As caractersticas das superfcies auxiliam a realizao de um procedimento de higienizao adequado. As caractersticas
macroscpicas e particularmente microscpicas das superfcies so determinantes para
maior ou menor adeso microbiana, com reflexos na contaminao dos alimentos com
microrganismos alteradores ou patognicos. Quanto mais lisa a superfcie, mais fcil a
higienizao. O ideal que nas superfcies no se formem poros nem ranhuras, e que
estas sejam resistentes s deformaes, como o abaulamento. As caractersticas das superfcies devem ser consideradas para a realizao de um procedimento de higienizao
adequado.
29
2.1. Ao Inoxidvel
Dentre os materiais disponveis, o ao inoxidvel, liga cuja composio inclui carbono, cromo e nquel, o mais utilizado (Figura 7). H diversos tipos de ao inoxidvel,
mas os que contm 18 % de cromo e 8 % de nquel so os mais usados. Nesse grupo,
esto as ligas da classe 300, por exemplo 304 e 316, que so resistentes corroso causada pela maioria dos alimentos, detergentes e sanitizantes, alm de serem facilmente
higienizadas e relativamente baratas. A resistncia do ao inoxidvel se deve pelcula
protetora de xido de cromo que se forma na presena de oxignio. Em situaes em
que h possibilidade de ocorrerem processos corrosivos mais intensos, como o caso
de salmouras, deve-se utilizar a classe 316, por conter mais nquel em sua composio
(cerca de 10 %) e, ainda, 2 % a -3 % de molibdnio. O tipo Hastelloy, que contm 56 %
de nquel, 16 % de cromo, 16 % de molibdnio, 5 % de ferro e 4 % de tungstnio, mais
cap.01
31
ii) Corroso eletroltica: pode ser originada quando h umedecimento de dois metais
distintos, como o alumnio e o ferro, ou de dois aos inoxidveis de graus diferentes com
a mesma soluo. Assim, uma soluo de limpeza ou de sanitizao pode atuar como
um eletrlito e causar corroso quando em contato com dois metais diferentes que, por
exemplo, fazem parte da mesma pea do equipamento. Os eltrons passam do ferro para
o alumnio, permitindo a corroso do alumnio.
iii) Corroso intergranular: deve-se ao emprego de um ao inoxidvel rico em carbono.
Ocorre nos contornos dos gros dos metais e, freqentemente, propaga-se pelo interior
da pea, deixando poucos sinais visveis na superfcie. Pode acontecer em lugares prximos s soldas dos equipamentos. originada por precipitao de carbonetos de cromo
nos contornos dos gros, resultante da permanncia prolongada do ao a temperaturas
muito elevadas. Esse problema pode ser facilmente evitado utilizando-se aos inoxidveis com baixo contedo de carbono, como o tipo 304.
cap.01
iv) Corroso geral: deve-se ao emprego de um ao inoxidvel que no resiste s propriedades corrosivas do alimento processado. Pode ser evitada pelo uso de equipamento
fabricado com um ao de maior grau de resistncia.
2.2. Polmeros
Os polmeros so amplamente utilizados na indstria de alimentos, em razo
de suas excelentes propriedades. So capazes de retardar, prevenir mudanas e
deteriorao no material de embalagem devido a influncias externas, como presena de oxignio, luz e microrganismos. Uma grande vantagem o seu menor
custo em relao a outros materiais usados para embalagem, por exemplo o vidro
(VERGNAUD, 1998).
As propriedades dos polmeros variam bastante, dependendo da matria-prima
utilizada, dos aditivos incorporados e do mtodo de fabricao. Basicamente, os usados
na indstria de alimentos so agrupados em duas categorias: termoplsticos e termoestveis. Os termoplsticos amolecem quando so aquecidos e endurecem quando
resfriados, processo que pode ser repetido vrias vezes sem mudanas qumicas apreciveis. Os tipos de termoplstico mais comumente encontrados em indstrias de alimentos so: polietileno, polipropileno, poli (cloreto de vinila) ou PVC e acrlico, entre
outros. Os termoestveis so capazes de endurecer na primeira vez que so aquecidos,
mas se forem reaquecidos pode ocorrer degradao qumica. Polister, resinas epxi e
poliuretanos so polmeros termoestveis usados na fabricao de equipamentos envolvidos no processamento de alimentos (HAYES, 1993; RODOLFO Jr. et al., 2002).
O polipropileno est entre os materiais mais populares em indstrias alimentcias, uma vez que tem sido usado em fabricao de tanques, tubulaes, acess-
32
pela sua ampla aplicao, destacando-se a grande flexibilidade, longevidade e compatibilidade com os meios de aplicao. O silicone, por ser inerte e atxico, no
traz malefcios para o meio ambiente, no contamina o solo, a gua e o ar, alm de
no alterar o sabor dos alimentos com os quais entra em contato (STEVENS, 1990,
ABIQUIM, 2004).
Revestimentos de correias transportadoras de alimentos, utenslios de cozinha,
mquinas automticas de servir bebidas, moldes de confeitaria, bandejas de gelo e
bicos de mamadeira so apenas algumas das inmeras peas feitas de elastmeros
de silicone para aplicaes de contato com alimentos (ABIQUIM, 2004).
O PVC (Figuras 8, 9 e 10) caracteriza-se por ser atxico, resistente maioria dos
33
cap.01
Figura 8 - Fotomicrografia de superfcie de poli (cloreto de vinila), o PVC, com revestimento com tecido, por
microscopia eletrnica de varredura: a) poucas imperfeies e b) presena de bolhas de ar devido a defeitos
de fabricao.
Figure 9 - Fotomicrografia de superfcie de poli (cloreto de vinila), o PVC, dupla face rugosa por microscopia
eletrnica de varredura: a) e b) aspectos no uniformes da superfcie, c) ondulaes com dimetros
variados e d) depresses com dimetros diferentes.
34
Figure 10 - Fotomicrografia de superfcie de poli (cloreto de vinila), o PVC, com revestimento de tecido
grosso por microscopia eletrnica de varredura: a) presena de elevaes, b) presena de microfuro, c)
esgaramento do tecido (seta) e d) porosidade lateral.
polmeros com ampla variedade de propriedades, todas baseadas na reao de um diisocianato orgnico com componentes contendo grupos de hidrxidos, chamados de
poliis (STEVENS, 1990; ABIQUIM, 2004e). Dentre as caractersticas desse tipo de superfcie, destacam-se: elevada durabilidade, resistncia a cidos, oxidao, abraso e
radiao gama, mas no so muito resistentes a alcalinos (RODRIGUEZ, 1989). Slidos
ou expandidos, flexveis, semi-rgidos ou rgidos, os poliuretanos podem assumir a forma de artefatos moldados, revestimentos, elastmeros, espumas ou fibras (STEVENS,
1990). Dentre as aplicaes na indstria alimentcia, destacam-se o uso em revestimentos de correias transportadoras e como isolante trmico na cadeia do frio (ABIQUIM,
2004a).
Figura 11- Fotomicrografia da superfcie de poliuretano de dupla face rugosa por microscopia eletrnica de
varredura: a) presena de protuberncia e b) espao irregular com dimetro maior do que 3 m.
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Figura 12 - Fotomicrografia de superfcie de poliuretano dupla face lisa por microscopia eletrnica de
varredura: a) presena de protuberncias e b) elevao (dimetro maior) e microfuros (dimetro menor).
cap.01
cie fisicamente difcil de ser explorado e beneficiado, entretanto possui alto brilho no po-
a qualidade dos mrmores, em termos de valor, a cor. De acordo com a colorao, os mrmores podem ser classificados em brancos e coloridos. Os brancos so
compostos unicamente de carbonato de clcio, j os coloridos apresentam cores
diferentes, como amarelo, verde, roxo, preto, que podem variar de acordo com os
minerais de sua composio (LPEZ, 1970).
As superfcies dos mrmores so consideradas menos compactas devido
sua dureza relativamente baixa. Por isso, so fceis de cortar e polir, sendo adequadas para processamentos industriais. Entretanto, possuem vulnerabilidade do
desgaste fsico e reaes qumicas, com grande sensibilidade a agentes cidos e
alcalinos, o que pode acarretar o surgimento de manchas e danos na superfcie
(FRASC, 2003).
37
quando se constataram que microrganismos aderidos ou em biofilmes eram responsveis por processos de corroso em superfcies imersas em sistemas marinhos ou
aquticos (ZOBELL; ALLEN, 1935; ZOBELL ,1943; FLETCHER, 1980; CHARACKLIS;
COOKSEY, 1983; COSTERTON et al., 1987; FLETCHER, 1987).
Vrios mecanismos para adeso bacteriana em diferentes superfcies de contato
tm sido propostos (ZOTTOLA; SASAHARA, 1994; ZOTOLLA, 1997). De acordo com
a teoria descrita por Marshall et al. (1971), a adeso em superfcies slidas um processo que acontece em duas etapas. A primeira reversvel, pois o microrganismo
est fracamente aderido superfcie atravs de foras de van der Waals e atraes
eletrostticas, propiciando fcil remoo da clula bacteriana. J a segunda irreversvel, uma vez que o tempo de aderncia envolve a adeso fsica da clula superfcie,
por meio de material extracelular de natureza polissacardica ou protica produzido
pelo microrganismo, o que se denomina matriz de glicoclix. O glicoclix auxilia a forcap.01
38
39
iii) A uma distncia menor que 1,5 nm, com a barreira da energia potencial j superada, interaes especficas, iguais as que se podem originar de foras polares de curta distncia, podem
ocorrer, e essas interaes provavelmente levam a uma ligao essencialmente irreversvel.
A interao especfica microscpica, como a que existe entre componentes das superfcies, ocorrendo a uma distncia extremamente curta, que permite a
ocorrncia de ligaes inicas, de hidrognio e possivelmente ligaes qumicas.
A interao no-especfica definida como aquela que devido propriedade de
superfcie microscpica total, como as cargas ou energia livre de superfcie, pode
atuar em considerveis distncias da superfcie. proposto um valor calculado com
base na fora de van der Waals, em que uma longa distncia seria acima de 50 nm,
enquanto a curta distncia diz respeito a foras que atuam a distncias menores que
cap.01
Nesta abordagem, a variao da energia livre de superfcie interfacial de interao microrganismo e superfcie comparada antes e depois da adeso. A comparao expressa em termos de variao de energia livre de adeso (Equao 1):
(1)
O ngulo de contato formado por uma gota de um lquido sobre uma superfcie slida (Figura 16) o ngulo entre um plano tangente a uma gota e a superfcie
onde o lquido se encontra depositado. Esse ngulo permite avaliar a molhabilidade dessa superfcie. Para realizao das medidas, deve-se utilizar um lquido
polar e dois apolares. Se o lquido for a gua, o ngulo formado ser relacionado
a hidrofobicidade da superfcie. Para Van Oss e Giese (1995), ngulos inferiores a
50 indicam superfcie hidroflica e ngulos superiores a 50, hidrofbica. Contudo,
para Vogler (1998), uma superfcie hidrofbica deve apresentar ngulo de contato
com a gua superior a 65.
Figura 16 - ngulo de contato (q) entre uma gota lquida e uma superfcie plana e horizontal ilustrando as
tenses superficiais da superfcie do slido, do lquido em equilbrio com o vapor e superfcie e lquido,
respectivamente.
(2)
41
Para lquidos apolares, a componente polar da tenso superficial nula e, portanto, a Equao 2 reduz-se Equao 3:
glTOT
gsLW =
(1+cosq)2
4
(3)
em que glTOT a tenso superficial total do lquido, glLW e gsLW so as tenses superficiais das foras de interao cido-base de Lewis, gl+ e gs+ e so as componentes
aceptoras de eltrons da componente cido-base da tenso superficial e gl- e gs- so as
componentes doadoras de eltrons da componente cido-base da tenso superficial,
considerando-se que so as tenses para os lquidos (l) e para a superfcie (s) analisados. As equaes permitem determinar os componentes da tenso superficial de
lquidos a 25 C. Na Tabela 5, so mostradas as componentes da tenso superficial de
cap.01
(4)
em que GEL a variao da energia livre das foras da dupla camada eltrica
e G
LW
42
a variao da energia livre das foras da Lifshitz-Van der Waals (VAN OSS et
al., 1990).
(5)
A intensidade das foras de Lifshitz-Van der Waals diretamente proporcional ao tamanho das partculas que se interagem e na razo inversa da distncia
superfcie. As foras de dupla-camada eltrica esto relacionadas carga eltrica
43
cap.01
Figura 17 - Grfico ilustrativo do processo de adeso: (GLW) energia livre de Lifshitz-van der Waals, (GAB)
energia livre cido-base de Lewis, (GEL) energia livre de dupla camada eltrica e GTOT energia livre total
em funo da distncia (nm).
45
cap.01
46
5.1.1. Flagelo
Os flagelos so como hlices de um propulsor, apndices rgidos e inseridos
na base da clula, sendo responsveis pela motilidade dos microrganismos (Figura
18). Esses apndices so geralmente muito mais longos do que as clulas, muito
finos e somente visualizados, por anlise microscpica, quando so corados por
compostos especiais que fazem que os seus dimetros sejam aumentados.
Os flagelos esto inseridos na membrana e parede celular por meio de uma estrutura denominada corpo basal, composto de dois anis em bactrias Gram-positivas
e quatro em bactrias Gram-negativas. H uma estrutura intermediria semelhante
a um cilindro tubular, em forma de gancho, como um filamento constitudo de subunidades de protena, a flagelina. As subunidades de flagelina, expostas no corpo
basal e na poro filamentosa dos flagelos, podem ser posicionadas para mediar a
adeso a superfcies, como as de equipamentos e utenslios usados para processar
alimentos. Os flagelos so utilizados na classificao taxonmica de bactrias e se
inserem de diversas formas nos microrganismos; so denominados flagelos peritrquios quando se distribuem em vrios pontos em torno da clula, lofotrquio e
anfilofotrquio se estiverem em grupos em uma das extremidades das clulas ou em
ambas, respectivamente, e monotrquios quando h apenas um flagelo.
47
cap.01
Pesquisas com espcies marinhas de Vibrio sugerem que durante a colonizao da superfcie o flagelo pode funcionar como sensor. Essas bactrias de ambientes marinhos so bacilos planctnicos de 2 mm de comprimento contendo um
nico flagelo polar. A adeso desse microrganismo, provocada em condies de
laboratrio, leva converso dessa clula a uma forma com mais de 30 mm de comprimento e muitos flagelos laterais. Essa alterao na morfologia da clula permite
uma eficiente colonizao da superfcie. O flagelo polar obtm energia a partir do
transporte de on sdio, enquanto o flagelo lateral utiliza o transporte de prtons. A
inibio da rotao do flagelo polar por agentes que bloqueiam os canais de sdio
resulta na produo de flagelo lateral, sugerindo que, quando as clulas com flagelo
polar se aproximam da superfcie, a rotao desse flagelo pode ser negativamente
afetada. A diminuio na rotao ou no fluxo do sdio um sinal para a produo do
flagelo lateral. Assim, o flagelo polar atua como sensor (DALTON; MARCH, 1998).
Estudos com mutantes de P. aeruginosa que eram incapazes de formar biofilme em PVC mostraram que essas estirpes apresentavam defeito no pili do tipo IV ou
flagelo mediador da motilidade. Estirpes selvagens desse microrganismo formaram
uma monocamada de clulas em superfcie aps quatro horas. Entre cinco e oito
horas, as monocamadas tornaram-se confluentes, fazendo que toda a superfcie ficasse coberta. Os mutantes sem motilidade falharam em aderir ao PVC em um perodo de oito horas. Mutantes com defeito no pili do tipo IV formaram monocamadas
dispersas, porm falharam em adens-las. A retrao e extenso no pili do tipo IV
so consideradas as causas da migrao das clulas atravs da superfcie, que
chamada de twitching. No caso de P. aeruginosa, parece que a motilidade mediada pelo flagelo importante para a adeso e formao de monocamadas dispersas
de clulas (STICKLER, 1999).
49
colnias ou as clulas-filha, que podem ser lentamente liberadas para o meio. Supe-se
que algumas bactrias sejam liberadas para o meio, devido a alteraes da superfcie da
clula ou das propriedades da superfcie (MARSHALL, 1992).
Espcies do gnero Streptococcus expressam um conjunto de componentes
de superfcie importantes para a adeso da clula no hospedeiro. Essa adeso pode
ter dois estgios: um inicialmente reversvel e o outro irreversvel. H evidncias de
que a fase reversvel envolve interaes hidrofbicas entre a clula hospedeira e o
cido lipoteicico da parede celular bacteriana. Observaes adicionais indicaram
que a protena M, uma adesina, de Streptococcus spp. requerida para a adeso
irreversvel. Esse modelo provavelmente anlogo ao que acontece quando a bactria coloniza superfcies inertes. Uma importante classe de adesina liga-se especificamente aos componentes da matriz extracelular, particularmente fibronectina (Fn),
o maior componente dessa matriz. Alguns trabalhos tm enfocado o papel da Fn em
adeso bacteriana e mostraram que Campylobacter jejuni expressa uma protena da
membrana externa (37 kDa) que se liga a Fn (DALTON; MARCH, 1998).
Staphylococcus aureus expressa duas protenas associadas com a parede celular que se ligam fibronectina, chamadas de fnbPA e fnbPB. Mutantes de S.
aureus que no possuam o gene fnbA ou fnbB no foram deficientes na adeso,
porm o duplo mutante para fnbA e fnbB foi completamente deficiente. Se um dos
dois tipos de genes fornecido por meio de plasmdeos, a adeso restaurada
(DALTON; MARCH, 1998).
Experimentos com mutantes de Pseudomonas fluorescens que apresentavam de-
50
51
cap.01
Segundo Characklis e Cooksey(1983), adsoro reversvel resulta principalmente de interao de foras a longas distncias, enquanto adeso irreversvel
geralmente considerada resultado de interaes mais definitivas. Essas ltimas interaes, na maioria das vezes, contam com o encurtamento da distncia entre as
foras fsicas de atrao e so otimizadas pela interao dos grupos componentes
da clula-receptora de ligao (DENYER et al., 1993).
A Portaria SVS/MS n 326, de 30 de julho de 1997, aprova o Regulamento
Tcnico sobre as Condies Higinico-Sanitrias e de Boas Prticas de Fabricao
O eventual resultado da interao entre essas foras determinado por princpios termodinmicos. O encurtamento da distncia entre o substrato e a bactria faz
que as foras adesivas comecem a predominar, o que favorecido pela presena de
apndices e polmeros extracelulares (DENYER et al., 1993)
53
54
Alguns parmetros na anlise da rugosidade so analisados sendo os mais importantes: (i) Ra, a mdia aritmtica do valor absoluto das distncias da linha mdia
ao perfil R dentro da latitude da amostra. A unidade desse parmetro o micrmetro; (ii) Rq, o valor mdio da raiz quadrada dos desvios do perfil em relao linha
mdia, dentro da longitude da amostra. Esse parmetro apresenta um significado
estatstico, o desvio-padro das alturas do perfil, sendo considerado mais sensvel
que Ra; (iii) Rz o valor absoluto dos cinco picos mais altos mais o valor mdio
absoluto dos cinco vales mais profundos, dentro da latitude da amostra. Tambm
apresenta a unidade em micrmetros (OLIVEIRA, 2006).
55
1993).
De acordo com pesquisas, vrios
polissacardeos e fosfolipdeos acumulam-se mais tarde na fase estacionria,
quando a clula se encontra sob estresse fisiolgico. Pesquisadores tm
observado a produo de diferentes
polissacardeos durante o crescimento exponencial e a fase estacionria.
Pesquisadores induziram a inanio
de clulas em crescimento exponencial, observando que foi liberado um
polissacardeo viscoso e solvel, enquanto o mesmo polissacardeo no foi produzido por clulas que estavam em
(DENYER et al., 1993).
cap.01
Alguns pesquisadores observaram menor produo de polissacardeos por bactrias sob inanio do que em culturas em crescimento. Quando o meio de crescimento
rico, a bactria pode produzir polmeros taxa elevada, porm liberando-os como
limosidade e no os retendo como cpsula. Anticorpos produzidos em culturas lquidas
reagiram com a matriz do biofilme in situ, o que indica que substncia polimrica ex56
57
o de fibras finas, que podem ser vistas por microscopia eletrnica. Essas fibras
tornam-se mais grossas com o passar do tempo, o que leva formao da matriz
do biofilme, e, dentro dessa matriz, outras substncias orgnicas, inorgnicas e material particulado podem existir juntamente com microrganismos. A produo de
exopolissacardeos aumentada com a adeso da bactria superfcie e, caso as
clulas do biofilme sejam reinoculadas no meio, como clulas planctnicas, haver
menor produo de exopolissacardeos (KUMAR; ANAND, 1998).
Segundo Costerton et al. (1978), o glicoclix integra a membrana externa de
Gram-negativas e do peptideoglicano de clulas Gram-positivas, sendo composto
de diversas fibras de polissacardeos ou protenas globulares; em seu estado hidratado, contm entre 98 % - 99 % de gua. Pseudomonas aeruginosa forma alginato
como maior constituinte do glicoclix e importante para o desenvolvimento de
biofilmes com uma s espcie. Os exopolissacardeos produzidos pelos microrganismos tm importante papel, que o de proteger a clula da desidratao, j que
pode reter gua em quantidade vrias vezes maior que sua massa e se desidrata
lentamente. Em Pseudomonas aeruginosa, a presena de cido urnico acetilado
no alginato bacteriano aumenta a capacidade de hidratao.
58
59
cap.01
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cap.01
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02
1.
Introduo
2.
3.
4.
Concluso
5.
Referncias
1. Introduo
No nvel atual da pesquisa ps-genmica, o prximo desafio da pesquisa a
compreenso da interao das macromolculas em clulas vivas, embora, em pases em desenvolvimento, como o Brasil, muito estudo ainda tenha de ser feito sobre
nveis bsicos de conhecimento de organismos prprios das regies tropicais. Atualmente, com a comprovada mudana climtica que est ocorrendo em todo o globo,
os problemas tpicos de pases tropicais, antes restritos ao hemisfrio sul, devero
se estender parte do hemisfrio norte, atingindo pases ou parte de pases antes de
clima temperado. Portanto, onde predominavam invernos rigorosos, cujo clima controlava naturalmente a entrada de populao de patgenos tpicos do hemisfrio sul,
a partir de agora tero tambm de se preocupar com contaminantes dessas regies
de invernos amenos.
Em outros captulos deste livro, discorre-se sobre a contaminao microbiana
na indstria alimentar, com nfase na adeso de clulas, formao de biofilmes,
propagao de bactrias e seu controle, dentre outros. Neste captulo, faz-se uma
sntese sobre o uso da microscopia, tanto ptica de luz (= microscopia de luz) quanto eletrnica e de fora atmica, como mais uma ferramenta importante nos estudos
bsicos de contaminao bacteriana na indstria alimentcia e no diagnstico e na
avaliao de testes metablicos, qumicos, bioqumicos, biofsicos, fsicos e de controle. Sero feitos comentrios sobre algumas caractersticas exclusivas e importantes que diferenciam microscpios pticos de luz (microscpios de luz), microsc-
68
O microscpio ptico de luz, agora denominado microscpio de luz ou microscopia de luz, um sistema ptico capaz de fornecer uma imagem ampliada de
um objeto, permitindo a observao de detalhes invisveis a olho nu. constitudo
basicamente por dois conjuntos de lentes: o conjunto objetiva e o conjunto ocular.
A objetiva d uma imagem real ampliada e invertida do objeto; a ocular, por sua vez,
fornece uma imagem virtual que, atravs do cristalino, se projeta na retina do globo
ocular e interpretada pelo crebro.
Na microscopia de luz, o componente mais crtico a objetiva. nela que se
69
forma a imagem inicial, assim como ela que determina a resoluo do microscpio, sendo a principal responsvel pela capacidade de aumento do objeto.
A capacidade de aumento de uma lente de vidro depende da sua capacidade ou
limite de resoluo. O limite de resoluo (LR) de uma lente, ou de um microscpio,
por sua vez, medido como a capacidade da lente de resolver a menor distncia entre
dois pontos. Ele calculado pela frmula LR = k x /AN, portanto o limite de resoluo
diretamente proporcional ao comprimento de onda do espectro visvel usado (, que
varia da luz azul = 488 nm luz vermelha = 640 nm) multiplicado por um fator (k) de
0,61 e inversamente proporcional abertura numrica (AN). Conseqentemente, pela
frmula podemos concluir que, usando filtro para comprimento de onda azul e uma
objetiva com (AN) de 1,4, o microscpio estar apto a separar dois pontos com 0,5
micrmetro de distncia entre eles. No outro extremo, com a mesma objetiva usando
filtro de luz vermelha, a resoluo do aparelho cairia para 0,7 micrmetro, ou seja, o
microscpio no poderia resolver distncias menores que 0,7 micrmetro entre dois
cap.02
A AN de uma lente fornecida pelo fabricante, e ela se refere ao ngulo de captao dos feixes luminosos que passam atravs da lente condensadora, depois pela
lente objetiva. Ou seja, uma lente objetiva com capacidade de aumento de 100 x e
que trabalha imersa em leo possui maior AN do que uma lente de 10 x, porque trabalha mais prxima lente condensadora. Uma boa objetiva tambm varia com o tipo
de material do qual a lente fabricada e com os tipos de aberraes luminosas corrigidas, ou seja, lentes com correes para aberrao cromtica, aberrao esfrica,
como astigmatismo, curvatura do campo (HIBBS, 2004). A melhor lente de aumento
de 100 x a Plan-Apochromatic (Zeiss) usada em imerso em leo, que possui AN de
1,40. No lugar do leo, podem-se usar outros lquidos como meio contnuo de ligao
entre a amostra e a objetiva, como gua e glicerina. Entretanto, um bom leo aquele
que possui o ndice de refrao semelhante ao do vidro da lamnula, praticamente
no causando desvio por refrao entre a lamnula e a objetiva. Existem objetivas
apropriadas para o uso com gua como lquido de imerso da lente.
O nome das lentes objetivas varia com o fabricante. Geralmente, FLUAR significa lente de fluoreto que transmite luz visvel e luz ultravioleta (UV); PLAN ou PL significa lente de campo plano; e lente APO refere-se lente apocromtica, isto , com
correo para as aberraes das trs cores azul, verde e vermelho, dentre outros.
Para maiores detalhes sobre tipos de lentes e principais vantagens, consultar
os sites dos principais fabricantes de microscpios ( OLIMPUS, 2007a; ZEISS, 2007;
LEICA, 2007); sobre abertura numrica e resoluo (MICROSCOPYU, 2007abcf); origens do microscpio ( FIOCRUZ, 2007ab) e limitaes dessa microscopia ( WIKIPE-
70
DIA, 2007ab).
71
cap.02
centro e um anel hialino circundando o disco opaco. Assim, apenas os raios de luz
72
enquanto outra parte se difrata, desviando-se, no atingindo a objetiva. No microscpio de contraste de fase, o raio mais lateral que passa atravs da objetiva
adiantado de l em relao luz central, pela introduo de uma placa anelar,
na objetiva e de um diafragma anelar no condensador. A placa anelar um disco
transparente com um sulco em forma de anel; ela ajustada de forma a coincidir
com a imagem direta do diafragma anelar do condensador. O efeito de fase decorre da interferncia entre a imagem geomtrica fornecida pela parte central da
objetiva e a imagem difratada, dada pelos raios laterais que so adiantados em 1/4
l. Essas diferenas, transformadas em diferenas de intensidade, so traduzidas
em imagens luminosas s quais a retina sensvel. As objetivas para contraste de
fase so marcadas com as letras Ph (phase).
Os microscpios equipados com contraste de fase so relativamente comuns
nos laboratrios. So muito usados no estudo de clulas vivas e transparentes, que
no podem ser coloridas. O efeito obtido semelhante ao da iluminao DIC (differential interference contrast) embora sem a sofisticao da 3D (item 2.1.4.). Devido
aos halos luminosos que formam em torno do espcime, no devem ser usados
em medies porque tornam o limite muito impreciso. Esse tipo de microscopia
foi usado, com sucesso, nos estudos de adeso de esporos de Bacillus subtilis,
73
aps a objetiva. O ajuste cuidadoso dos prismas que d maior ou menor efeito
de sombreamento ou 3D imagem. No se pode esquecer, entretanto, de que a
imagem DIC produzida em um microscpio de luz, portanto a resoluo da imagem permanece a mesma dos demais microscpios de luz, exceto o confocal. Isso
significa que o trabalho com clulas isoladas de dimenses bacterianas tem baixa
resoluo, mas nos estudos de biofilme produz resultados interessantes.
Atualmente, tem-se usado a iluminao Nomarski em conjunto com o Confocal
(veja 2.1.6.), o que tem gerado imagens muito ilustrativas porque delineia, no fundo,
em tons de cinza, o espcime, ajudando a localizar na clula ou em parte do tecido
o elemento ou a molcula fluorescente. Mais recentemente, com a popularizao
do uso do microscpio de fora atmica (MFA) (veja 2.3.) entre os biologistas, a iluminao Nomarski tambm tem sido empregada como complementao das imagens obtidas pelo MFA, com grandes ganhos de informao, inclusive em estudos
de clulas vivas (MADJ et al., 2006). Outro aspecto positivo do uso da iluminao
cap.02
a localizao do stio que se pretende estudar antes de usar a luz UV que causa o
apagamento da fluorescncia, portanto reduz o branqueamento da amostra. Para
mais informaes, consultar Microscopyu (2007d).
74
contagem de clulas aderidas s superfcies tornam a microscopia de epifluorescncia uma tcnica extremamente til avaliao quantitativa dos processos de adeso
microbiana. Alm disso, a determinao da rea coberta pelo crescimento microbiano na superfcie, por meio de software associado microscopia de epifluorescncia,
uma evoluo na avaliao de processos adesivos (BLACKMAN; FRANK, 1996).
Vrios fontes sobre epifluorescncia esto disponveis ( MICROSCOPYU, 2007bd;
PROBES, 2007; BIOSTATUS, 2007; AMERSHAMBIOSCIENCES, 2007; HELIXRESEARCH, 2007; ICNPHAM, 2007; QBIOGENE, 2007; MOBITECH, 2007; INVITROGEN,
2007; CPG-BIOTECH, 2007).
75
cap.02
76
nesse plano de varredura, sem que os componentes celulares situados noutros planos contribuam para a formao da imagem. No somente a imagem muito mais
ntida, como tambm a clula pode ser cortada opticamente em vrios planos,
dependendo do aumento da objetiva usada. Cada plano da amostra varrido e armazenado independentemente; em seguida, atravs de programas do computador,
faz-se a remontagem dos planos, criando-se uma imagem 3D. De certa forma, ao
eliminar planos indesejveis do espcime, acima e abaixo do stio de marcao, o
confocal permite um aumento na resoluo da imagem, porque os elimina opticamente. Essas marcaes de fundo podem ser causadas por elementos autofluorescentes ou por resduos livres de fluorforos no lquido de montagem, dando
imagem uma aparncia borrada, confundindo a interpretao.
A autofluorescncia provocada por vrias molculas, como resduos de aminocidos aromticos, aldedos, nucleotdeos de piridina reduzida, flavinas e resduos de flavinas, protoporfirina de zinco, quitina, clorofila, lipofuscina (grnulos de
77
78
cncia obtida por marcaes com fluorocromos, resultando numa imagem clara,
acurada e passvel de repetio. No trabalho, os autores usaram um software que
permitia quantificar rapidamente, antes que ocorresse a fadiga (veja em 2.1.6.1) do
fluorocromo, e separar a fluorescncia verde de fluorescncia vermelha. As conexinas so subunidades glicoproticas transmembranrias, que fazem ligao entre
clulas, por onde transitam metablitos, ons e pequenas molculas e tambm esto
presentes em bactrias.
79
cap.02
docitose, devido ao seu reduzido tamanho, e so usados, tambm, em imunomarcao. Entretanto, so potencialmente txicos, por isso so bons para trabalhar com
clulas mortas, fixadas, e so deficientes para estudar movimento molecular intracelular. Para maiores informaes sobre confocal, princpios, filtros, espelhos, aberturas, fluorforos e agentes antifadiga, pode-se consultar Microscopyu (2007). Para
informaes complementares, sobre marcadores ou provas fluorescente pesquisar
em Probes (2007), Amershambioscience (2007), Helixresearch(2007), Icnpharm
(2007) e Kpl(2007). Para Informaoes adicionais sobre protenas fluorescentes consultar Qbiogene (2007), Mobitech (2007), Invitrogen (2007) e Cpg-biotech (2007).
80
de luz, uma acima da objetiva e outra abaixo do espcime. No possuem lente con-
81
82
Figura 1 - Esquema dos microscpios ptico, eletrnico de transmisso e varredura, seus componentes e o
processo de formao de imagens.
Meek (1976) fez um relato dos passos histricos da fsica at a construo comercial do primeiro MET. Bastante resumidamente aqui, e a ttulo de curiosidade,
ele informa em seu livro que pouco antes da metade do sculo 19 descobriu-se
que a eletricidade de alta-voltagem, quando era direcionada para dentro de tubos
de vidro cheios de gs baixa presso, produzia descargas eltricas; em 1850,
descobriu-se como selar eletrodos de metal dentro de tubos de vidro emendados
com alto vcuo. Cerca de 10 anos depois, descobriu-se que o que se chamava
cuo. Esses raios catdicos eram carregados negativamente e eram defletidos por
campos eletrostticos e magnticos. Em torno de 1899, foram produzidas as primeiras lentes magnticas, que na verdade so campos magnticos axialmente
simtricos formados dentro do tubo de descarga, o que permitiu o controle do
direcionamento dos feixes, assim como a concentrao e a disperso dos eltrons, ou seja, aumento e reduo do dimetro do feixe de eltrons. Em 1897,
Braun j havia descoberto as telas fluorescentes quando excitadas por feixes de
eltrons. Thomson, citado por Meek (1976), mostrou que os raios catdicos eram
corpsculos carregados negativamente com uma massa de aproximadamente um
milsimo da massa de um tomo de hidrognio. Esse corpsculo foi depois chamado de eltron. Em 1926, descobriu-se que o campo magntico poderia desviar
um feixe de eltron da mesma forma que as lentes de vidro ou quartzo desviam
a luz visvel. Assim, os fundamentos para a ptica eletrnica foram estabelecidos.
Rapidamente, todas essas informaes culminaram nos primeiros estudos sobre o
83
cap.02
uma primeira seleo, formando o feixe inicial de eltrons. Esse feixe condensado
85
sam ser extremamente delgadas, no mximo 100 nm de espessura. Para que sejam
seccionadas sem causar modificaes ultra-estruturais, os espcimes precisam ser
embebidos em resina (por exemplo Spurr, Epon, Araldite, Lowicryl e Unicryl dentre outras). As resinas so escolhidas de acordo com a finalidade do estudo e da
qualidade ou facilidade de impregnao do tecido (BUSCHMANN et al., 2002). Em
seguida, as amostras so emblocadas em molde de silicone ou cpsulas de BEEM
ou gelatina e polimerizados de acordo com o fabricante. Depois, os bloquinhos sero seccionados em seces semifinas - para observao prvia em microscpio de
luz - e, ou, ultrafinas, de 60-100 nm de espessura, com navalha de diamante ou de
vidro, na qual colocado gua para que, medida que os bloquinhos vo sendo
seccionados, as seces flutuem na superfcie. Como a essa espessura as seces
so transparentes na lupa do ultramicrtomo, necessrio que uma fonte de luz
incida sobre elas. Somente os cortes que refletirem prateado ou dourado-claro
que podero ser usados para observao no MET. Os cortes, ento, so estendidos
cap.02
86
de chumbo, hidrxido de chumbo, tartarato de chumbo, acetato de chumbo, cido fosfotungstico, permanganato de potssio, tetrxido de smio (que tambm
um forte fixador usado rotineiramente em ps-fixao), colide de torium e outros
(HAYAT,1975). Esses contrastantes, por possurem maior ou menor afinidade com
lipdeos, polissacardeos, glicoprotenas, lipoprotenas, protenas, enzimas e outras
protenas, fazem que, na biologia, sejam intensivamente usados nos estudos de
detalhes morfolgicos e fisiolgicos de organelas inteiras, como membrana plasmtica, ncleo, nuclolo, cromossomos, cloroplasto, mitocndria, centro celular e
plasmodesma, at ento conhecidas por meio de coloraes especficas, em microscopia de luz. Tambm permitem o estudo tanto morfolgico quanto fisiolgico
de uma srie de outros componentes, como retculo endoplasmtico, aparelho de
Golgi, presena de lisossomos, colides, multivesculas, cromatina, cromossomo,
ribossomos, microtbulos, microfilamentos, filamentos intermedirios, lisossomo,
peroxissoma, complexo juncional, junes comunicantes, glicoclix e caractersticas internas e externas de microrganismos, como a presena de parede celular, flagelos e fmbrias. Alem disso, em conjunto com a imunomarcao, permite verificar
a presena de ons como clcio, ferro e enxofre, dentre outros.
b) Mtodo de Imunomarcao
87
Alguns cuidados so muito importantes na imunomarcao, como: no delineamento do trabalho necessrio constar, sempre, todos os tipos de testemunha
positivas e negativas para amostra e antissoros. Deve-se, tambm, suavizar a fase
de pr-fixao e, se a quantidade de antgeno esperado de encontrar na amostra
for muito baixa, evitar o uso do tetrxido de smio que um potente bloqueador
de stios. Todos os bloqueadores de marcao de fundo como soro normal, BSA,
Tween 20 e outros precisam ser usados para neutralizar os aldedos, cargas livres
e outros. Quando se usa ouro como marcador, as seces podem ser osmicadas
e contrastadas com acetato de uranila e citrato de chumbo depois de terminado o
processo de imunomarcao. Para maiores detalhes, consultar Hayat (1989).
eltrons. Assim, alm de limitar o estudo aos espcimes mortos, bem fixados e
88
O exame de espcimes preparados por criofratura e criomoldagem no permite um direcionamento prestabelecido do sentido da fratura, porque ela ocorre
ao acaso, embora a tendncia seja de clulas fraturarem ao longo da superfcie
das membranas internas ou externas. Entretanto, algumas vezes a fratura pode
ocorrer em planos tangenciais da amostra, deixando exposto em 3D nanomtrico,
no sentido Z da amostra, as organelas internas, alm dos detalhes morfolgicos
das membranas, como poros, e tambm detalhes de paredes celulares, ribossomos, cloroplastos, mitocndrias, vesculas, retculo endoplasmtico e Aparelho
de Golgi. Smarda e colaboradores (2001), realizaram um estudo detalhado das
camadas S das paredes celulares de cianobactrias usando o mtodo de criofratura e criomoldagem e demonstraram que cada camada S formada por feixes
bidimensionais, monomoleculares cristalinos de unidades idnticas de protena ou
macromolculas de glicoprotenas arranjadas em uma de quatro possibilidades de
tipos 2D de ltice: oblquo, triangular, quadrado ou hexagonal.
Em 2006, foram apresentados dois mtodos de manipulao de imagem que
reproduzem a forma 3D obtidas de cortes ultrafinos observados no MET, sem usar a
pios de luz, e baseia-se no uso da imagem obtida pela refrao de eltrons no MET
(ALLMAN et al., 2006), enquanto Fiala e Harris (2006) afirmaram que, atravs do
programa gratuito disponvel na internet (http://synapses.bu.edu/tools/), possvel
obter imagem 3D com a remontagem de imagens de cortes seriados. O mesmo
sistema pode ser usado para imagens feitas em confocal.
d) Mtodo de leaf-dip
Outro mtodo para observao no MET, chamado de leaf-dip (HAYAT, 1972),
um mtodo rpido e consiste da contrastao negativa do material disposto sobre uma telinha recoberta com formvar 0,3%. Muito usado na diagnose de vrus,
tambm til no estudo de bactrias. D indicao sobre a disposio dos ltices
proticos da parede, presena de flagelo e morfologia. Sobre uma telinha de cobre
recoberta com formvar 0,3%, adiciona-se uma gota de uma suspenso bacteriana
contendo 1x109 clulas por mL, e sobre essa gota adiciona-se uma gota de acetato
cap.02
90
Atualmente, encontram-se no mercado aparelhos que trabalham a baixo vcuo, com presso varivel (PV) dentro da cmara, o que permite examinar amostras parcialmente hidratadas e emissoras de gases sob vcuo. Entretanto, esse
tipo de varredura produz imagens de qualidade inferior s emitidas por eltrons
secundrios (metalizadas ou condutoras), embora seja uma tcnica eficiente para
diagnose rpida (TOTH et al., 2003). Alguns modelos mais modernos de microscpios podem ser equipados com um acessrio que resfria a cmara para permitir
91
cap.02
92
facilmente sob vcuo o usado por Tiedt e colaboradores (1987). Em vez de fixarem a amostra em solues de glutaraldedo e tetrxido de smio, esses autores
fixaram-na em vapor de tetrxido de smio, sem passar pela soluo de glutaraldedo, usando uma capela de exausto durante o manuseio, tendo-se em vista que
o tetrxido altamente perigoso inalao e ao contato. Nesse caso, a amostra
colocada dentro de uma placa de Petri, e, na face inferior da tampa da placa, adicionam-se umas gotas de tetrxido de smio 2%; depois, cuidadosamente a placa
novamente tampada e vedada com parafilme. O conjunto deve ser incubado por
tempos variveis, de 2 horas a 24-48 horas, conforme o material. Depois, a amostra
retirada da placa, e continua-se o processo de desidratao, secagem no ponto
crtico e metalizao.
Tambm ao MEV pode ser acoplada, com vantagens adicionais, uma sonda
de raios X, o que vai unir a alta resoluo dos eltrons secundrios microanlise
para examinar, por exemplo, a constituio e localizao de ons e mudanas nas
concentraes inicas durante a apoptose celular , dentre outros (ver item 2.3). Para
maiores informaes, consultar Analitic (2007) e Wikipedia (2007d).
93
rea da amostra que gera raios X de tamanho vrias vezes ao do dimetro do feixe incidente e, portanto resulta em menor resoluo.
O MET, assim como o MEV, ao ser equipado com esse acessrio, devido
alta resoluo que eles alcanam, permite fazer anlises localizadas de raios X, nas
amostras, o que antes era impossvel. Anteriormente, s eram feitas anlises de
composio atmica em amostras de tamanho macro.
Os raios X acoplados ao MET ou MEV so muito teis nos estudos sobre
poluentes, como chuvas cidas, pesticidas, bactrias que vivem e sobrevivem em
locais de condies extremas de sobrevivncia, dentre outros ( NEWBURY et al.,
1986; BOZZOLA; RUSSEL, 1999). Para maiores informaes, consultar Scholar.
cap.02
Google (2007).
94
como fonte de raios X a radiao sincrotrnica. O resultado obtido por eles foi imagem tridimensional e de alta resoluo.
Brownlow e colaboradores (2006) desenvolveram um microscpio de raios X
com imagem de contraste de fase acoplado a um MEV, que eles denominaram X-ray
ultraMicroscope (XuM), que atua por flexo ou refrao dos raios X, medida que
eles interagem com a amostra. Alm de fornecer um mecanismo para fazer imagem
de materiais de baixa densidade, o contraste de fase sensvel a caractersticas de
freqncia espacial alta, definindo melhor os limites de ligaes, rachaduras e espaos vazios, como bolhas. Para isso, foram feitos estudos, em que avanos na fonte de
raios X, tecnologia de detector e softwares, possibilitaram ultrapassar muitas das limitaes anteriores da tcnica, que tinham resoluo mxima de 100 nm, passando a
obter resoluo de 50 nm. Ainda segundo esses autores, os raios X tpicos se baseiam
no contraste de absoro, mas possvel formar imagem com adaptaes precisas
feitas na origem dos raios, obtendo-se tanto informaes de contraste de fase quanto de absoro. Para conseguir alta resoluo, eles tiveram que fazer adaptaes no
MEV, assim como modificaes no sistema de captao de imagem (cmaras CCD).
Essa tcnica tem sido til para estudar a influncia de minerais na formao de
95
cap.02
96
varredura de 100 nm.s-1. No destaque, a transformada de Fourier da imagem (Fonte: CEOTTO et al., 1999).
Figura 3. Resoluo da rede atmica de uma superfcie de mica imersa em gua, obtida com velocidade de
Figura 4. Imagem de fungos Colletotrichum graminicola em superfcie de vidro (Fonte: CEOTTO et al., 1998).
No modo atrativo, ou modo de no-contato, o MFA mantm a ponta e a amostra separadas por uma distncia previamente ajustada (10 - 20 nm), enquanto monitora deflexes decorrentes de interaes de longo alcance, como foras de van der
Waals, eltricas e magnticas, dentre outras. Uma das vantagens desse modo de
operao repousa no fato de a ponta no tocar a amostra. Entretanto, a resoluo
cap.02
A representao grfica da fora aplicada ponteira do MFA, enquanto a amostra aproximada e afastada, constitui a chamada curva de fora. As curvas de fora
so complexas e especficas para diferentes sistemas em estudo. Em princpio, tal
grfico expressa a fora requerida para atingir certa profundidade de deformao, o
que possibilita a determinao de parmetros viscoelsticos de materiais. Assim, se
examinam plaquetas, bactrias e clulas, ou se estudam propriedades micromecnicas de ossos e de outros materiais.
99
passando pelo incio da formao de camadas bacterianas (agregao), estabelecimento da arquitetura do biofilme, liberao de clulas para a colonizao de outros stios, estabelecimento de formas irreversveis do biofilme (com a presena de
agentes cimentantes, como o clcio) at o estudo do papel de fmbrias e exopolissacardeos na arquitetura do biofilme. A microscopia pode tambm ser utilizada para
o estudo dos efeitos de cada superfcie experimental e de agentes sanitizantes sobre
o biofilme. Entretanto, para cada estudo sempre haver uma tcnica de microscopia
mais adequada. Como exemplo, as microscopias de luz, com exceo da MFA, s
se aplicam ao estudo da formao de biofilme em cupons transparentes, enquanto
a MFA e a MEV so usadas no estudo das superfcies e arquitetura dos biofilmes.
J a MET e a tambm a MEV so aplicveis ao estudo de exoplissacardeos e elementos qumicos envolvidos na formao do biofilme. A MET, alm do j mencionado, permite o estudo da estrutura interna do biofilme e da influncia de fmbrias,
flagelos e glicoprotenas em sua formao. As caractersticas de algumas tcnicas
de microscopia so detalhadas na Tabela 1. Constata-se que o microscpio ptico
e o microscpio de fora atmica so rpidos e fceis para uso, com nenhuma ou
pouca preparao da amostra, no sendo necessrio o uso de vcuo. Alm disso,
esses microscpios tm campos de observao amplos, ainda que somente o MFA
tenha elevada capacidade de ampliao e resoluo. Os MEV e MFA mapeiam as
superfcies e tm uma profundidade de campo ampla, mas somente a microscopia
de fora atmica funciona com um mnimo de preparao da amostra.
Quadro 1 - Caractersticas de algumas tcnicas microscpicas para avaliar microtopografia
de superfcies
100
levado a uma grande quantidade de informaes sobre processos de adeso microbiana e formao de biofilme, permanecem alguns problemas que devem ser
levados em considerao, dentre eles a interpretao das imagens produzidas,
dependendo dos procedimentos utilizados. Por exemplo, o exopolissacardeo que
geralmente cerca e envolve as comunidades microbianas pode secar, formando
cordes finos, os quais podem ser interpretados como estruturas fibrosas que unem
os microrganismos (WIMPENY, 2000).
A microscopia ptica convencional o mtodo mais simples de usar, porm
possui limitaes: i) a ampliao e a resoluo no so to boas quanto as de outros
instrumentos mais modernos disponveis; ii) a profundidade de campo que pode ser
visualizada mnima; iii) deve ser utilizado um substrato transparente, como o vidro;
e iv) as clulas aderidas devem ser coradas. Apesar disso, inmeras pesquisas com
biofilmes microbianos foram realizadas, utilizando esse instrumento e, assim, reconhecido que o microscpio de luz um instrumento til para estudar os biofilmes.
101
cap.02
As estruturas desses microrganismos foram examinadas quando estes se encontravam aderidos em cupons de mica, silcio e vidro. As observaes foram feitas
temperatura ambiente, sendo as imagens obtidas de acordo com trs diferentes
protocolos de preparao das amostras: i) os cupons de mica foram clivados imediatamente antes de receber a suspenso bacteriana, com o objetivo de obter superfcies limpas e hidroflicas, e os cupons de silcio foram mergulhados em soluo
de cido fluordrico por cerca de 1 minuto, para que as superfcies se tornassem
hidrofbicas e, em seguida, lavadas em gua Milli-Q. Logo aps, os cupons foram
impregnados por gotejamento com suspenses de esporos de B. cereus ( 109 esporos.mL-1); ii) os cupons esterilizados de vidro e de silcio foram simultaneamente
colocados, por aproximadamente 18 horas, em frascos contendo 100 mL de meio
de cultivo inoculados com B. subtilis, sendo depois lavados com gua bidestilada
para remoo de clulas planctnicas e secos por aproximadamente 48 horas,
temperatura ambiente e em ambiente assptico; e iii) cupons de vidro foram imersos em suspenses de clulas de L. innocua e, aps 12 e 18 horas de contato, foram
removidos e lavados com gua bidestilada, de forma a manter somente as clulas
ssseis. Os cupons foram observados imediatamente aps a secagem.
Quadro 2 Sntese do estudo que avaliou a adeso bacteriana em superfcies, por microscopia
de fora atmica (MFA)
102
Figura 5. Imagens de Listeria innocua obtidas no modo de contato, ao ar. Vista de topo (a) com
representao em funo da altura e (b) com iluminao lateral (Fonte: CEOTTO, 2001).
a)
103
b)
cap.02
Figura 6. Imagens de clulas de Bacillus subtilis aderidas em cupons de (a) silcio e (b) vidro, obtidas no
modo de contato, ao ar (Fonte: CEOTTO, 2001).
a)
b)
Figura 7. Imagens de clulas de Bacillus subtilis aderidas em cupom de vidro, obtidas no modo de contato,
ao ar (a). Em (b), detalhe da regio de contato entre clulas (Fonte: CEOTTO, 2001).
a)
104
b)
Figura 8. Imagens de aglomerados de clulas Bacillus subtilis aderidas em cupons de vidro, ao ar, obtidas
no modo de contato (a) e no contato (b) (Fonte: CEOTTO, 2001).
b)
a)
Figura 9. Imagens de aglomerado de clulas de Bacillus subtilis aderidas cupons de silcio, ao ar, obtidas
no modo de contato (a). Em (b), detalhes da superfcie rugosa e da regio de contato entre clulas (Fonte:
CEOTTO, 2001).
105
Figura 10. Imagens de esporos de Bacillus cereus em cupons de mica, obtidas no modo de contato, ao ar
(Fonte: CEOTTO, 2001).
cap.02
Figura 11. Imagens de esporos de Bacillus cereus em cupons de silcio tratado com soluo de cido
fluordrico, obtidas no modo de contato, ao ar (Fonte: CEOTTO, 2001).
106
Figura 12. Imagens de superfcies de esporos de Bacillus cereus obtidas no modo de contato, ao ar: (a)
coberto por uma fina camada de ~15 nm de ouro e (b) in natura.
cap.02
Figura 13 - Microtopografia de poli-nilon observada por microscopia de fora atmica, depois de irradiado
com 60cobalto.
Figura 14 -. Microtopografia de polietileno de baixa densidade observada por microscopia de fora atmica,
depois de irradiado, com 60cobalto.
cap.02
Quadro 3 Rugosidade mdia (Ra), mdia da raiz quadrada das rugosidades (Rq) e mdia dos
pontos mais irregulares (Rz) das amostras de nylon-poli, PEBD e PVDC, obtidos por microscopia de fora atmica, aps a irradiao com 60cobalto
Figura 16 - Adeso de Staphylococcus aureus e de Listeria innocua em ao inoxidvel AISI 304, n 4, aps
12 h, a 37 oC.
111
cap.02
As fotomicrografias da Figura 20 mostram a adeso de Pseudomonas fluorescens a diversas superfcies e tempos de contato.
112
113
cap.02
Figura 21 - Adeso de Escherichia coli O157:H7 superfcies de alface, avaliada por microscopia de fora
atmica.
Figura 22 - Fotomicrografia de superfcie de ao inoxidvel AISI 304 n4, por microscopia de fora atmica.
4. Concluso
H cerca de 60 anos, a microscopia foi usada pelo pesquisador Zobbel para
demonstrar o papel da adeso bacteriana na formao de depsitos e corroso de
superfcies slidas submersas no mar. Esse pesquisador mostrou a capacidade de
microrganismos de aderirem lminas de vidro, que foram posteriormente coradas
e observadas ao microscpio. A estrutura complexa do biofilme foi revelada por
essa tcnica. Com base nas caractersticas morfolgicas, concluiu-se que grande
diversidade de espcies contribua para os processos de adeso microbiana e for-
114
cap.02
115
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o em ia Fo ria
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tu tes val o e cte
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C
p e A lme
d iofi
B
03
1.
Introduo
2.
3.
4.
5.
Concluso
6.
Referncias
1. Introduo
Os testes em uso simulado preconizam a transferncia das condies de processamento na indstria de alimentos para o laboratrio. Para isso, muitas vezes,
necessrio desenvolver metodologias e equipamentos para simular as diversas
condies dos procedimentos de higienizao e dos usos dos sanitizantes. Esses
testes so mais trabalhosos e exigem criatividade, e todas as condies devem ser
muito bem definidas.
H mais de um sculo, o descobridor do bacilo da tuberculose, Robert Koch,
desenvolveu o primeiro mtodo de teste para avaliar a eficincia de desinfetantes.
Ele impregnou fio de seda com Bacillus anthracis e o mergulhou em soluo de desinfetante por vrios tempos. Observou-se que os esporos eram protegidos contra a
ao do desinfetante pela protena do meio utilizado que permaneceu no fio mesmo
aps a lavagem, resultando em efeito bacteriosttico no meio do subcultivo. A partir
de ento, vrios estudos foram desenvolvidos at o estabelecimento dos mtodos
atualmente utilizados (CREMIEUX; FLEUTETTE, 1991).
Em 1982, Scheusner inoculou Staphylococcus aureus e esporos de Bacillus subtilis
em bandejas de fibra de vidro contendo resduos de carne, leite e cereais. Aps a adeso,
122
123
ROCHA et al., 1999). Limpeza um procedimento que inclui pr-lavagem com gua,
para remoo das sujidades, seguida do uso de agentes qumicos, como detergentes alcalinos e, ou, cidos para remoo de resduos orgnicos e minerais das superfcies; e do enxge antes da etapa da sanitizao, que realizada com o uso de
calor ou de agentes qumicos (GIESE, 1991; ANDRADE; MACDO, 1996).
Dentre os mtodos de higienizao, encontra-se o sistema CIP bastante utilizado em indstria de alimentos (TIMPERLEY, 1981; SHARP, 1985; GIESE, 1991).
Trata-se de um sistema automtico e permanente que no requer a desmontagem
de equipamentos e tubulaes para a higienizao (ANDRADE; MACDO, 1996).
constitudo basicamente por uma bomba central, tanques para solues qumicas
e um conjunto de tubos para distribuio das solues para os diversos locais da
fbrica, podendo ainda estar acoplado a um tanque para gua de rinsagem e a um
cap.03
124
Re = r v D
m
em que:
(Equao 1)
Re = nmero de Reynolds
r = massa es pecfica do fluido (kg.m-3)
v = velocidade do escoamento (m.s-1)
D = dimetro da tubulao (m)
m = viscosidade do fluido (kg. m.s-1).
forme a Equao 2.
V = v x p d2
4
em que:
(Equao 2)
125
cap.03
126
Figura 1 - Modelo de linha de circulao de leite: 1) cupom de prova curva de 90 , 2) cupom de prova
cilndrico, 3) cupom de prova t, 4) controle de potncia, 5) tanque com capacidade para 25 L; 6) bomba
centrfuga e 7) controle de vazo.
cap.03
127
O psicrotrfico acidificante estudado foi caracterizado como Gram-positivo, cocos em cadeia, diplococos ou isolados, com crescimento e formao de halo amarelo quando inoculado em gar prpura de bromocresol e incubado a 7 C durante
10 dias ou a 28 C por 48 h.
A etapa de adeso consistiu em adicionar o E. faecium, desenvolvido em
suspenso no meio Lactobacilos MRS, no interior dos cupons de prova previamente
higienizados, secos em estufa a 110 C, fechados por rolhas de borracha nas
extremidades e esterilizados a 121 C por 15 min. Ao retirarem as rolhas de uma
das extremidades, um volume de 46 mL da suspenso bacteriana foi adicionado
ao cupom cilndrico, 30 mL em cupons de formato de curva e 61 mL ao cupom em
formato de t. Aps repouso por 12 horas, a 28 C, no interior dos cupons, a soluo
bacteriana foi descartada e o cupom, submetido secagem a 28 C, por 30 min. Com
os cupons de prova colocados nos locais preestabelecidos no sistema-modelo, as
solues sanitizantes foram circuladas por 10 min, vazo estimada de 137 L.min-1
(d = 0,0254 m; v = 1,5 m.s-1) nos cupons de prova. Aps esse processo, os cupons
de prova foram removidos e o procedimento de sanitizao, avaliado.
Os microrganismos aderidos foram recuperados pela tcnica da rinsagem.
Para os cupons no-submetidos sanitizao, utilizou-se a soluo-tampo fosfato
de Butterfield e para aqueles sanitizados, uma soluo neutralizante, constituda de
1 g de tioglicolato de sdio, 15 g de lecitina, 20 g de Tween 80, 6 g de tiossulfato
de sdio e 2,5 g de bissulfito de sdio por litro, esterilizada a 121 C por 15 min. Em
128
129
de prova em curva e em t.
131
Figura 2 - Mdias dos nmeros de redues decimais (RD) obtidos na populao de Enterococcus faecium,
no teste de uso simulado nos diversos sanitizantes.
cap.03
So = gua; S1 = 100 mg.L-1 de cloro residual total, a partir de hipoclorito de sdio, pH 8,6; S2 = 1 % de quaternrio
de amnio em pH 10,5; S3 = 300 mg.L-1 de cido peractico, pH 2,6; S4 = 100 mg.L-1 de gluconato de clorohexidina,
pH 7,2; S5 = 150 mg.L-1 de CRT preparada a partir de dicloroisocianurato de sdio, pH 8,7; e S6 = 12,5 mg.L-1 de IRL
preparada a partir de iodforo em pH 1,9.
De acordo com os valores das RD, as solues clorohexidina e iodforo foram ineficientes contra as clulas de E. faecium nos cupons de prova em curva. J as de clorohexidina, hipoclorito de sdio e iodforo no apresentaram eficincia nos cupons de prova
em t.
Considerando que os sistemas CIP no so constitudos apenas por tubulaes
de formato cilndrico, de curva ou de t, estimou-se o tempo necessrio para garantir
a sanitizao eficiente, ou seja, o tempo de contato necessrio para reduzir em cinco
ciclos log10 a populao de E.faecium (Figura 3). Os resultados deste experimento
mostraram que os cupons de prova que apresentaram os maiores tempos de
contato para atingir essas redues foram os cilndricos. Assim, esses cupons
devem ser considerados como um dos pontos crticos no processo de sanitizao
de tubulaes em sistema CIP, apresentando os seguintes tempos de contato: 96,5
min para a gua, 51 min para a clorhexidina, 39,4 min para o hipoclorito de sdio,
39,4 min para o dicloroisocianurato de sdio, 34,2 min para o iodforo, 19,8 min
para a amnia quaternria e 16,4 min para o cido peractico.
132
Figura 3 - Tempo necessrio para obter 5 RD populao de E. faecium no teste em uso simulado, dos
diversos sanitizantes.
So = gua; S1 = 100 mg.L-1 de cloro residual total, a partir de hipoclorito de sdio pH 8,6; S2 = 1 % de
quaternrio de amnio em pH 10,5; S3 =300 mg.L-1 de cido peractico, pH 2,6; S4 = 100 mg.L-1 de gluconato
de clorohexidina, pH 7,2; S5 = 150 mg.L-1 de CRT preparada a partir de dicloroisocianurato de sdio, pH 8,7; e
S6 = 12,5 mg.L-1 de IRL preparada a partir de iodforo em pH 1,9.
133
e aps a circulao do leite (RDB). Considera-se que a adeso ser maior para a
bactria que apresentar a menor RD. Nas comparaes de interesse, foi aplicado o
teste de Tukey a de 5 % de probabilidade (P<0,05). Os demais experimentos foram
analisados por estatstica descritiva.
Para determinao de RDA, foi feito o seguinte clculo: RDA =log N0 - log N1,
em que N0= nmero total de bactrias (planctnicas e ssseis) dentro do cupom,
aps 12 h de incubao; e N1 = nmero de bactrias ssseis dentro do cupom, aps
12 h de incubao.
O nmero de bactrias planctnicas (P1) foi determinado pelo plaqueamento
de uma alquota de 1 mL de leite do interior dos cupons de prova, sendo o resultado
multiplicado pela quantidade total do leite contido dentro do cupom de onde se retirou
a alquota.
O nmero de clulas ssseis (N1) foi obtido com a rinsagem dos cupons em
curva, cilndricos e em t, pelo plaqueamento de uma alquota de 1 mL de soluo
de citrato de sdio 2 % utilizada na rinsagem dos cupons de prova. Esse nmero foi
multiplicado pela quantidade total da soluo de rinsagem utilizada no cupom.
Para obter N2, a rinsagem foi realizada nos cupons em curva, cilndricos e em
t acoplados ao sistema-modelo e, depois da circulao do leite, na velocidade desejada. Portanto, pela soma de P1 e N1, obteve-se N0.
Para determinao de RDB, fez-se o seguinte clculo: RDB = log N1 log N2,
134
adicionou-se leite esterilizado no interior dos cupons, que ali permaneceu por 2
min, sendo, aps esse tempo, descartado. Um cupom de prova de cada tipo foi
rinsado com soluo de citrato de sdio 2 %, sendo agitados manualmente por
15 min; em seguida, alquotas das solues de rinsagem foram inoculadas
em meio de cultura e incubadas em condies apropriadas. Cupons que no
tiveram contato com microrganismos foram esterilizados e, subseqentemente,
acoplados no equipamento juntamente com os outros trs cupons de prova com
os microrganismos aderidos. Ao reservatrio do equipamento foram adicionados
10 L de leite esterilizado a 15 C, circulando por 10 min a 1 m.s-1, com exceo do
experimento que avaliou a velocidade das solues na adeso bacteriana.
A seguir so apresentados os principais resultados do experimento de importncia
relacionada ao procedimento de higienizao em indstria de alimentos.
cap.03
que apresentou menor reduo decimal (Tabela 9) de acordo com o teste de Tukey
(P<0,05). Os microrganismos estudados foram classificados em ordem crescente
de reduo decimal.
Tabela 9 - Redues decimais e porcentagem de adeso dos diversos microrganismos na
superfcie dos cupons de prova com 12 h (RDA) de incubao a 18 C
importante, portanto, que o leite seja processado o mais rpido possvel, a fim
de evitar que ocorra a esporulao durante a estocagem, antes do tratamento trmico,
o que poderia comprometer a eficincia desse tratamento. Os esporos podem aderir
superfcie de equipamentos e resistir ao processo de higienizao, posteriormente
germinar e comprometer a qualidade do leite.
Observa-se, pela Figura 4, a classificao dos microrganismos quanto porcentagem de adeso em ao inoxidvel aps 12 h a 18 C. Constatou-se a seguinte ordem decrescente de capacidade de adeso: esporos de B.cereus (24,6 %); P. aeruginosa (5,83
%); B. cereus, nas formas vegetativa e esporulada (2,21 %); e E. faecium (0,57 %).
136
Figura 4 - Porcentagem de adeso mdia de bactrias, antes da circulao do leite no modelo, calculada em
relao ao nmero total de bactrias dentro dos cupons com 12 h, em ao inoxidvel, a 18 C. A) esporos
de B. cereus; B) Pseudomonas aeruginosa; C) Bacillus cereus, incluindo esporos mais clulas vegetativas; e
D) Enterococcus faecium.
nificativas (p>0,05) na adeso quando os diferentes microrganismos foram comparados; no entanto, constatou-se diferena quanto remoo das clulas nos vrios
tipos de cupons.
Tabela 10 - Resumo da anlise de varincia do nmero de redues decimais na populao de
diferentes microrganismos, em vrios cupons de prova, aps o uso do modelo de circulao de
leite, com velocidade de 1m.s-1, por 10 min a 15 C
137
cap.03
138
Mello (1997), a turbulncia em tubos cilndricos menor que a de tubos com formatos
contornados, como em curva de 90 e tipo t. Por essa razo, o cisalhamento pelo
fluido sobre as paredes dos cupons de prova cilndricos menor, podendo causar
menor remoo de microrganismos.
139
cap.03
Observa-se, na Tabela 12, que as incubaes a 5 C e 10 C no resultaram em alterao considervel no nmero de P. aeruginosa, decorrido o perodo de 12 h de incubao.
A 18 C, o crescimento foi de 0,9 ciclo logartmico, como constatado anteriormente.
Quanto adeso bacteriana, observou-se (Figura 7) que, medida que a temperatura aumenta, as porcentagens de P. aeruginosa aderidas tambm aumentam.
Dessa maneira, a adeso a 18 C foi de 5,83 %, o que equivale a 3,2 x 105 UFC.cm-2.
A 10 C, verificou-se 1,95 % de adeso, representando 2,0 x 104 UFC.cm-2, e, a 5 C,
constatou-se 1,36 %, equivalente a 9,0 x 103 UFC.cm-2.
A menor proporo de clulas aderidas em temperaturas mais baixas ocorreu,
provavelmente, em virtude de a velocidade de multiplicao das bactrias ser menor nessas temperaturas. Tambm, a produo de exopolissacardeos pode ter sua
velocidade afetada negativamente pelo abaixamento da temperatura, alm do fato
de a mudana de viscosidade do leite poder dificultar a difuso da bactria at a
parede de cupom de prova. A alterao da viscosidade da gordura a 5 C pode fazer
que seja estabelecida uma camada gordurosa na parede dos cupons, dificultando a
aproximao de novas bactrias.
140
141
Constata-se que, aps a passagem do leite a uma velocidade de 1 m.s-1 nos cupons
de prova previamente incubados a 18 C, a adeso do microrganismo correspondeu
a 1,7 x 104 UFC.cm-2. Essa concentrao foi de 1,4 x 103 e 7,7 x 103 UFC.cm-2 quando a
cap.03
Porm, com o passar do tempo essa contaminao ir diminuir, pois apenas as clulas
Tabela 13 - Porcentagem de Pseudomonas aeruginosa que permaneceram aderidas aos diferentes tipos de cupons de ao inoxidvel submetidos s velocidades de 0,5 m.s-1, 1,0 m.s-1 e
1,5 m.s-1, durante 10 min, em modelo de linha de processamento de leite, utilizando como fluido
o leite integral a 15 C
143
cap.03
Figura 10 - Influncia da concentrao inicial de bactrias do leite sobre a porcentagem de clulas aderidas
aos cupons de prova, com12 h de incubao a 18 C. Mda de trs repeties.
Figura 11 - Porcentagem de bactrias que permaneceram aderidas aos cupons de prova, aps a circulao
de leite a 1 m.s-1, em temperatura de 15 C, no simulador de linha de circulao de leite. Mdia de trs
repeties.
cap.03
Figura 12 - Influncia do tempo de incubao do leite inoculado com 106 UFC.mL-1 sobre a porcentagem de
clulas aderidas aos cupons de prova a 18 C.
aps a incubao a 18 C.
Figura 13 - Porcentagem de bactrias que resistiram ao fluxo de 1 m.s-1 de leite em modelo de linha de leite,
Tabela 16 - Sntese do experimento que avaliou o efeito da velocidade de circulao do alimentos e do tempo de adeso de Bacillus cereus em ao inoxidvel
147
cap.03
vidro esterilizadas. Os frascos foram agitados manualmente e os sobrenadantes, coletados em tubos de centrfuga; e iv) a centrifugao foi efetuada a 2.500 g durante
15 min, a 4 C. Os sedimentos de esporos foram ressuspensos em gua destilada esterilizada e novamente centrifugados, e o processo foi repetido por cinco vezes. Ao
final, os esporos foram suspensos em gua destilada esterilizada e mantidos a 4 C.
As suspenses de esporos foram padronizadas para conter em torno de 109 esporos
por mL e serem usadas no processo de adeso dos esporos no simulador da linha de
processamento de leite. A adeso dos esporos aos cupons ocorreu a 8 C e 18 C.
149
cap.03
Observa-se, pelos resultados, que a higienizao de equipamentos deve ocorrer logo aps o uso na indstria de alimentos. Alm disso, fundamental que a
velocidade das solues detergentes e sanitizantes seja bem estabelecida, de modo
a se ter uma higienizao eficiente. As velocidades das solues de higienizao
devem ser mais elevadas do que as de processamento de alimentos e, geralmente,
acima de 1,5 m.s-1.
inoxidvel e sua resistncia a sanitizantes qumicos, em condies de uso simulado (Tabelas 19 e 20).
Seis cupons de prova, sendo dois em formato de curva de 90, dois cilndricos
e dois em t, foram inoculados com uma suspenso em tampo-fosfato de 0,31 M
em pH 7,0 +/- 0,1, contendo cerca de 105 esporos.mL-1 de B. sporothermodurans
por 12 h a 30 C.
Simulou-se um processo de sanitizao CIP, circulando-se 15 L das solues
sanitizantes temperatura entre 20-25 C, pelo tempo de 15 min, a uma velocidade
de 1,5 m.s-1 nos cupons de prova, obtida a partir de uma vazo estimada de 25,7
L por minuto e considerando o dimetro do tubo de 1,9 cm. A gua esterilizada foi
usada para avaliar a remoo mecnica dos esporos aderidos.
As solues sanitizantes avaliadas pelo teste em uso simulado foram preparadas a partir de produtos comerciais concentrados. As concentraes das solues
utilizadas de cada sanitizante so apresentadas na Tabela 21.
Tabela 19 - Sntese do experimento que avaliou a adeso de esporos de Bacillus sporothermodurans CCT6247 em cupons de ao inoxidvel e sua resistncia a sanitizantes qumicos, em
condies de uso simulado (Fonte: AKUTSU, 2001)
151
Observou-se que os esporos de B. sporothermodurans apresentaram capacidade de adeso aos cupons de prova; porm, no houve diferena significativa (P
0,05) entre eles (Tabela 22). Os logs10 do nmero de esporos aderidos por cm2 aos
cupons no formato de cotovelo 90, cilndricos e t foram, respectivamente, de 4,01;
3,88; e 4,03 (Tabela 23); e as porcentagens de adeso foram de 3,93 no cupom em
cap.03
152
constituiu um biofilme, j que, de acordo com Zottola (1997), para isso seria necessria uma adeso entre 106 e 107 UFC.cm-2. No entanto, nessas condies a superfcie
encontra-se em situao inadequada para o uso, pois a APHA (American Public Health Association) sugeriu o mximo de 2 UFC.cm-2 para superfcies adequadamente
higienizadas (Evancho et al., 2001). Portanto, a presena desses esporos aderidos s
superfcies em quantidade superior sugerida pode implicar possvel contaminao
de alimentos.
153
cap.03
Tabela 24 - Resumo da anlise de varincia do nmero de redues decimais de Bacillus sporothermodurans pela ao dos sanitizantes, nos diferentes cupons de prova do modelo de linha de
circulao de leite, aps circulao a 1,5 m.s-1 por 15 min, temperatura ambiente (20-25 C)
S1: gua; S2: hipoclorito de sdio a 100 mg.L-1 de CRT, pH 9,45; S3: hipoclorito de sdio a
100 mg.L-1 de CRT, pH 8,0; S4: hipoclorito de sdio a 100 mg.L-1 de CRT, pH 7,0; S5: cloramina orgnica a 100 mg.L-1 de CRT, pH 7,18; S6: cloramina orgnica a 60 mg.L-1 de CRT, pH
7,18; S7: cido peractico a 60 mg.L-1, pH 3,4; S8 e cido peractico a 30 mg.L-1, pH 3,7.
Ao comparar a eficincia da gua, por ao mecnica, e a dos diferentes sanitizantes, por ao qumica, notou-se efeito significativo (P<0,05) (Tabela 25). A remoo
dos esporos, nesse caso, ocorreu devido fora de atrito da gua sobre a superfcie
dos cupons de prova, ou seja, apenas da ao mecnica gerada pelo escoamento do
fluido pela superfcie, que se classificou em turbulento, com o nmero de Reynolds
estimado em 32.000 (r= 997 kg/m3; v=1,5 m/s; d= 0,01905 m e m= 0,0009 kg/m.s).
Neste experimento, verificou-se que a circulao da gua, a uma velocidade
de 1,5 m.s-1 por 15 min, reduziu em mdia 0,74 RD da populao dos esporos de B.
sporothermodurans aderidos aos cupons (Quadro 7), ou seja, 6,98 x 103 UFC.cm-2, o
que significa que 74,79 % de esporos foram removidos da superfcie.
Tabela 26 - Redues decimais (RD) na populao de esporos de Bacillus sporothermodurans
devido ao dos sanitizantes circulados por 15 min a 1,5 m.s-1, temperatura ambiente (2025 C), no modelo de linha de circulao de leite
entre o hipoclorito de sdio, contendo 100 mg.L-1 de cloro residual total (CRT) sem
correo de pH (pH 9,45), e os demais sanitizantes. Ressalta-se, nesse caso, que a
ao qumica dos sanitizantes foi influenciada pelo escoamento do fluido. Quando
o escoamento turbulento, a transferncia do sanitizantes at a superfcie maior,
resultando em remoo mais eficiente dos microrganismos aderidos.
As diferenas de eficincia obtidas entre as solues de hipoclorito de sdio
a 100 mg.L-1 de CRT em pH 9,45; 8,0; e 7,0 e as de cloramina orgnica a 100 e 60
mg.L-1 de CRT podem ser explicadas pela concentrao de cido hipocloroso (HClO)
nelas presente, que o agente antimicrobiano.
Reordenando os termos da equao de Henderson-Hasselbalch, possvel determinar a concentrao de cido hipocloroso nas solues cloradas, da
seguinte maneira:
mg.L-1 de HClO = mg.L-1 de cloro residual livre
1 + 10 pH - 7,5
A soluo de hipoclorito de sdio contendo 100 mg.L-1 de CRT e pH 9,45 (sem
cap.03
Observou-se, portanto, melhor eficincia quando o pH dessa soluo diminudo, o que tambm foi constatado por Andrade e Serrano (1993). Esses pesquisadores, utilizando uma soluo de hipoclorito de sdio a uma concentrao de
105 mg.L-1 em pH 9,0; 8,0; e 7,0, a 30 C, em teste de suspenso, sobre esporos de
Bacillus subtilis ATCC 19659, observaram reduo no valor de D quando a concentrao de cido hipocloroso foi aumentada. Essa soluo, em pH 9,0, apresentou
concentrao de 3,22 mg.L-1 de cido hipocloroso, e a diminuio do pH para valores de 8,0 e 7,0 fez que essa concentrao fosse aumentada para 25,24 mg.L-1 e
79,55 mg.L-1, respectivamente. Os valores de D obtidos foram de 5,77; 0,94; e 0,25
min, respectivamente.
Os resultados dos experimentos com B. sporothermodurans e B. subtilis, anteriormente mencionados, levam s seguintes consideraes: i) os esporos de B.
sporothermodurans so mais resistentes que os de B. subtilis ao cido hipocloroso;
ou ii) a maior resistncia est associada ao fato de os primeiros estarem aderidos
superfcie de ao inoxidvel, o que parece ser mais provvel.
No foi constatada diferena significativa (P>0,05) entre as solues de hipoclorito de sdio corrigidas para pH 8,0 e 7,0 e as solues de cloramina orgnica 100
mg.L-1, e 60 mg.L-1 CRT (Tabela 26), apesar da diferena na concentrao do cido
hipocloroso (27).
Por meio da equao que relaciona o log10 dos valores de D em virtude da
156
(Equao 11)
Em que:
D = valor de D, em minutos;
Dr = valor de D de referncia, em minutos;
Cr = concentrao de cido hipocloroso de referncia, em mg.L-1 de CRL; e
C = concentrao de cido hipocloroso, em mg.L-1 de CRL.
75,59 mg.L-1 (Tabela 27), que foi a faixa estudada neste experimento. Assim, para se
obter 3 RD a partir de uma concentrao de 50 mg.L-1 de HClO, expressa em CRL, o
tempo de contato dever ser de 17,8 min.
Observou-se que no houve diferena significativa (P>0,05) entre as solues
de cido peractico e as demais solues, com exceo do hipoclorito de sdio a
100 mg.L-1, pH 9,45 (Tabelas 27 e 28).
157
Pelos resultados obtidos, nenhum dos sanitizantes atingiu 3 RD, que o valor
sugerido em testes de suspenso para a aprovao desses produtos contra esporos
nas condies de uso (GIFFEL et al., 1995). Deve-se ressaltar que no h valor definido para aprovao de sanitizantes agindo sobre microrganismos aderidos, sejam
clulas vegetativas, sejam esporos. No entanto, assim como as clulas vegetativas
aderidas, os esporos aderidos so mais resistentes ao dos sanitizantes, necessitando de concentraes e tempos de contato maiores para serem eficientes (MOSTELLER; BISHOP, 1993; GIFFEL et al., 1995).
Constata-se, pela Tabela 28, que para se obter 3 RD o tempo de contato dos sanitizantes contra os esporos aderidos variou entre 15,83 e 28,71 min, o qual se encontra
cap.03
158
159
cap.03
balhos, em que se avaliou a eficincia da radiao UV no controle de microrganismos aderidos superfcie do polietileno de baixa densidade.
As condies da indstria foram simuladas por um modelo que reproduz as
caractersticas e condies do sistema radiao UV da mquina de empacotamento
de leite fluido.
O modelo foi construdo com chapa galvanizada, apresentando as seguintes dimenses: 10 x 25 x 50 cm (Figura 16). Em seu interior, tem-se uma lmpada ultravioleta com comprimento de onda de 254 nm, 15 W de potncia, ligada rede eltrica (127
V) por meio de um reator de 20 W e um starter. A lmpada est situada a 2 cm acima
da canaleta por onde corre o suporte, contendo a embalagem a ser irradiada.
160
Figura 16 - Modelo para exposio das embalagens radiao UV; A) aspecto geral e B) componentes do
sistema.
Tabela 29 - Sntese do experimento realizado por Silva (2000), que avaliou a adeso de microrganismos ao polietileno de baixa densidade e a resistncia desses microrganismos radiao
ultravioleta
161
cap.03
A) Adeso Superfcie
Aps a ativao das culturas de Escherichia coli K12 e Staphylococcus aureus ATCC
25923 em caldo BHI (Brain Heart Infusion), diluio do inculo em tampo-fosfato, 0,31 M
e pH de 7,0 0,1, foram obtidas as suspenses nas concentraes de 104 UFC.mL-1, 105
UFC.mL-1 e 106 UFC.mL-1.
As superfcies internas de 72 embalagens de polietileno de baixa densidade
foram previamente sanitizadas com lcool 70 GL e expostas radiao ultravioleta
com comprimento de onda de 254 nm, por 1 min. A essas embalagens, adicionaram-se 1.000 mL da suspenso bacteriana. Em seguida adio das suspenses,
as embalagens foram seladas termicamente na seladora TecnoB, modelo S300, e
incubadas em estufas tipo BOD, modelo 50A14, s temperaturas de 8 C e 18 C por
12 h, para permitir a adeso bacteriana.
Aps 12 h de incubao nas temperaturas de 8 C e 18 C, as embalagens
passaram pelos seguintes procedimentos: i) o tampo empregado na inoculao da
embalagem foi escoado, e a essa embalagem adicionaram-se 1.000 mL de tampofosfato esterilizado, pH 7,0 0,1, sendo a embalagem deixada em repouso por 1
min, para retirada das clulas planctnicas; ii) escoado o tampo, a embalagem foi
rinsada, empregando-se a agitao manual vigorosa durante 90 seg, com 100 mL de
tampo-fosfato esterilizado, para retirada das clulas ssseis. Aps a rinsagem, os
tampes contendo as clulas ssseis foram diludos conforme necessrio, sendo
as alquotas dessas diluies plaqueadas, em profundidade, em PCA; iii) as placas
de Petri, aps solidificao, foram invertidas e incubadas temperatura de 35 C
162
Tabela 31 - Porcentuais e UFC.cm-2 de Escherichia coli K12 aderidos, a 8 C e 18 C, em polietileno de baixa densidade, em razo do logaritmo do nmero inicial (UFC.mL-1) na suspenso
cap.03
Figura 18 - Efeito das temperaturas de 8 C e 18 C no nmero de clulas aderidas de Escherichia coli K12
em funo do logaritmo do nmero inicial de clulas. Mdia de trs repeties.
164
emisso da luz. Aps esse intervalo de tempo, a parte interna das embalagens foi
submetida exposio radiao UV. Foram adicionados 100 mL de tampo-fosfato
esterilizado, 0,31 M, em pH 7,0 0,1, s embalagens irradiadas e agitou-se vigorosamente durante 90 seg, para recuperao das clulas que resistiram ao tempo de
exposio radiao ultravioleta.
Aps a rinsagem, os tampes foram diludos conforme necessrio, sendo essas diluies plaqueadas em profundidade, em PCA, e incubadas a 35 C por 24 h,
sendo os resultados expressos em UFC.cm-2.
A eficincia da radiao UV foi determinada por meio de Redues Decimais
(RD), empregando-se a seguinte frmula: RD=log n0 - Log n1, em que: n0 = nmero
de UFC aderidas ao polietileno por cm2 antes do uso da radiao ultravioleta; e n1 =
nmero de UFC aderidas ao polietileno por cm2 aps o uso da radiao ultravioleta.
A intensidade da radiao ultravioleta, expressa em W.cm-2, emitida pela
lmpada, foi determinada a cada 50 h, at completar o total de 1.500 h de uso. A
eficincia bactericida da lmpada foi determinada em trs diferentes tempos: inicial
(T70); aps 800 h de uso (T800); e com 1.500 h de uso (T1500), empregando-se os
procedimentos descritos anteriormente. Foi determinada tambm a contaminao
inicial de aerbios mesfilos nas embalagens, empregando-se a tcnica de Nmero
Mais Provvel (NMP), com trs sries de cinco tubos, com o uso de volumes de
10 mL, 1 mL e 0,1 mL, conforme metodologia descrita por Greenberg et al. (1992).
Foram analisadas, ao acaso, amostras de polietileno de baixa densidade provenien-
165
tes de trs bobinas, antes e depois da exposio radiao UV. De cada bobina
foram analisados 3.780 cm2, referentes rea de seis embalagens com 630 cm2 e
capacidade para 1.000 mL. Dessas embalagens, trs no foram expostas radiao
UV, e outras trs o foram, em condies de envase de leite em um laticnios. Para
a retirada das clulas presentes na superfcie interna, adicionaram-se 100 mL de
tampo-fosfato esterilizado e pH igual a 7,0 0,1. A rinsagem foi efetuada por meio
de agitao manual vigorosa por 90 seg. Aps a rinsagem, procedeu-se diluio
dessa soluo e posterior distribuio em trs sries de cinco tubos (18 x 150 mm)
de ensaio, com capacidade para 15 mL, contendo 10 mL de caldo BHI; a primeira
srie de tubos apresentava concentrao dupla do meio de cultura e as demais sries, concentrao simples. Foram utilizados volumes de 10 mL, 1,0 mL e 0,1 mL da
soluo de rinsagem das embalagens. As sries de tubos foram levadas incubao
em estufa a 35 C, por 24 h.
De posse da combinao formada pelo nmero de tubos positivos em cada
cap.03
166
Observou-se que a radiao UV reduz o nmero de clulas aderidas superfcie do polietileno de baixa densidade. Em E. coli, as redues decimais mdias
variaram de 0,52 a 1,37. No caso de S. aureus, os valores situaram-se entre 0,85
e 1,73. Constatou-se que h diferena na ao da radiao UV em diferentes concentraes iniciais de clulas aderidas ao polietileno de baixa densidade e entre os
microrganismos estudados.
Nota-se que, no experimento com S. aureus, ocorreu reduo na intensidade da radiao UV de 216 para 179 W.cm2 e em E. coli a diminuio foi de 203
para 175 W.cm-2. No entanto, no houve grandes variaes na intensidade nem
no nmero de RD, nas repeties, quando se avaliou o efeito dos nmeros iniciais.
Por exemplo, a diferena mxima na intensidade (7 W.cm-2) foi constatada em S.
aureus quando os logaritmos do nmero inicial eram de 4,5; 4,6; e 4,7. J em E. coli
167
Com o aumento do logaritmo do nmero inicial de clulas, observou-se tambm aumento no nmero de clulas aderidas, o que parece ter influenciado a ao
da radiao UV. Por exemplo, em nmeros menores de adeso os microrganismos
podem apresentar melhor distribuio na superfcie, alojando-se em fendas ou locais de difcil acesso radiao, em virtude da sua topografia, reduzindo, assim,
sua eficincia. Como a superfcie, provavelmente, apresenta capacidade limitada de
proteo s bactrias, a ao da radiao UV ser mais eficiente proporcionalmente
quando a superfcie apresentar maior nmero de bactrias aderidas.
Para facilitar as comparaes sobre a resistncia dos microrganismos, j que
os logaritmos dos nmeros iniciais eram diferentes no experimento, foram empregadas as equaes de regresso linear de S. aureus e E. coli (Figuras 20 e 21),
cap.03
Figura 21 - Regresso linear de redues decimais em funo do logaritmo de nmero inicial de Escherichia
coli K12 , aps 2 segundos de exposio radiao UV.
se encontra o microrganismo.
Neste experimento, a resistncia das clulas vegetativas est associada adeso superfcie. Por exemplo, uma pesquisa mostrou a reduo de 6,3 ciclos logartmicos para clulas em suspenso de Salmonella Typhimurium, empregando-se a
intensidade de 620 W.cm-2 em um intervalo de tempo de 15 seg (KUO et al., 1997).
Nessa mesma intensidade, quando o experimento foi conduzido com as clulas no
169
estado sssil, previamente aderidas em casca de ovo, obteve-se reduo de trs ciclos logartmicos para 1 min de exposio das clulas radiao UV. Em outro experimento, foram obtidos cinco ciclos logartmicos de reduo do nmero de clulas
de E. coli em suspenso, utilizando-se 300.000 W.cm-2 por 2,5 seg (BACHMANN,
1975). Isso ocorre em virtude da maior suscetibilidade das clulas em suspenso
ao da radiao UV. No caso de clulas aderidas superfcie, os valores de redues so menores, pois as clulas apresentam-se fixadas superfcie por meio de
exopolissacardeos, dificultando, assim, a ao da radiao UV devido ao seu baixo
poder de penetrao.
Deve se considerar, ainda, a topografia da superfcie onde as clulas se encontram aderidas, pois a radiao UV tem pequeno poder de penetrao, sendo sua
ao restrita superfcie. Desse modo, casca de ovo, superfcie de carnes e carcaas de aves, polietileno e ao inoxidvel apresentam diferentes tipos de superfcies,
com as mais variadas irregularidades, que podem proteger as clulas do contato
cap.03
170
171
cap.03
Tabela 35 - Logaritmos dos nmeros de microrganismos mesfilos nas embalagens de polietileno, antes e depois da exposio radiao UV, em condies de uso, determinados pela
tcnica de Nmero Mais Provvel (NMP)
Os resultados mostram a existncia de determinada contaminao microbiolgica inicial nas embalagens. Neste experimento, o valor mdio de contaminao
encontrado nas embalagens antes da exposio radiao UV foi de 0,16 NMP.cm-2,
estando acima do valor recomendado, que de 0,10 NMP.cm-2. No entanto, aps
a irradiao das superfcies internas das embalagens por aproximadamente 2 seg,
observou-se a sobrevivncia de 0,014 NMP.cm-2, o que significa reduo decimal de
1,06, isto , cerca de 90 % das clulas contaminantes no sobreviveram ao da
radiao UV.
No envase do leite, o risco de contaminao igual soma dos riscos de cada
etapa do processo, sendo, assim, indispensvel o controle rigoroso dessas etapas
(FLCKIGER, 1995). A efetividade na reduo do nmero inicial de bactrias anterior
embalagem do alimento um ponto importante no prolongamento da sua vida de
prateleira (HUANG; TOLEDO, 1982), bem como na preservao das caractersticas
172
analisada.
173
cap.03
Tabela 36 - Sntese de experimento realizado por Cabral e colaboradores (2001) que avaliaram
a eficincia da radiao UV sobre esporos bacterianos
175
Aps o tempo de incubao, as embalagens passaram pelos seguintes procedimentos: i) o tampo empregado na inoculao da embalagem foi escoado; ii) embalagem foram adicionados 1.000 mL de gua destilada esterilizada, sendo a embalagem
deixada em repouso por 1 min para a remoo dos esporos que no se aderiram
superfcie do polietileno; iii) depois do escoamento do tampo, a embalagem foi rinsada
e agitada vigorosamente, durante 90 segundos, para a retirada dos esporos aderidas
superfcie do polietileno com 100 mL de tampo fosfato (0,31 M, pH 7,0 +/- 0,1, esterilizado a 121 C por 30 min) iv) aps a rinsagem, as solues-tampo foram diludas
conforme necessrio e plaqueados empregando-se o meio Agar BHI, incubados a 37 C
cap.03
176
37 e Figura 28). Uma explicao possvel que medida que aumenta o tempo de
177
cap.03
Na Figura 29 mostrada a equao de regresso linear dos valores de D obtidos de acordo com o tempo de exposio radiao ultravioleta. Por exemplo, se
o tempo de exposio dessa radiao nas condies do experimento for de 8 seg,
estima-se que o valor D ser de 7,9 seg.
5. Concluso
178
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In
na
04
1.
Introduo
2.
3.
4.
Referncias
1. Introduo
O advento da globalizao tem acarretado grandes e rpidas mudanas econmicas, sociais e polticas, ampliando oportunidades de negcios, mas provocando uma competitividade acirrada. As indstrias de alimentos que se incluem nesse
contexto tm processado uma quantidade de alimentos cada vez maior, na tentativa
de suprir o mercado crescente, buscando sempre o incremento de produtividade.
Isso pode gerar diferentes problemas, a exemplo de perdas ps-processamento ou
diminuio da vida de prateleira se os mtodos de higienizao empregados no
forem eficazes ou, ento, forem negligenciados.
A higienizao na indstria de alimentos se insere dentro das Boas Prticas de
Fabricao (BPF) e dos programas de qualidade como o de Anlise de Perigos e Pontos Crticos de Controle (APPCC), visando obteno de alimentos seguros, particularmente sob os aspectos relacionados s contaminaes com agentes qumicos,
fsicos e microbiolgicos, alm de contribuir para a manuteno das caractersticas
sensoriais e nutritivas desses alimentos. Dentro desse contexto, os profissionais
responsveis pela higienizao nos estabelecimentos produtores/industrializadores
de alimentos devem atuar de forma eminentemente preventiva na busca da melhor
qualidade dos alimentos processados, evitando problemas de ordem econmica ou
de sade pblica. Para isso, deve-se perseguir constantemente o desenvolvimento
182
183
cap.04
185
Por exemplo, frutas e vegetais so cultivados em solos e carreiam aproximadamente 109 UFC.g-1 de microrganismos aps colheita. Dentre esses microrganismos mais comuns na matria-prima esto bactrias, fungos filamentosos e
leveduras. As bactrias mais freqentes so Pseudomonas spp, Erwinia herbicola
e Enterobacter agglomerans, bactrias do cido ltico como Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus spp., as patognicas como as do gnero Salmonella e
Clostridium, alm da estirpe E. coli O157: H7. O gnero Pseudomonas geralmente
responsvel por 50 a 90% da populao microbiana de vegetais. Entretanto, outros microrganismos podem se desenvolver durante o transporte, processamento
e armazenamento.
cap.04
A gua para uso na indstria de alimentos deve ser considerada como matria-prima e atender aos padres fsicos, qumicos e microbiolgicos estabelecidos na legislao
brasileira de acordo com a Portaria n 518, do Ministrio da Sade, de 25 maro de 2004. A
gua aceita como potvel quando se encontra dentro de certos requerimentos de
qualidade. J foram detectados cerca de 2.000 contaminantes diferentes na gua.
187
cap.04
188
189
cap.04
2.4.1 Alcalinos
Dentre os alcalinos, incluem-se o hidrxido de sdio, o carbonato de sdio, o
metassilicato de sdio, o ortossiliciato de sdio e o sesquissilicato de sdio. Todos
esses agentes apresentam como caracterstica principal a liberao de ons hidroxila
(OH-) que promovem a saponificao dos cidos graxos constituintes da gordura e a
solubilizao dos resduos de protena. No entanto, existe diferena na quantidade de
alcalinidade liberada em soluo aquosa. O hidrxido de sdio o agente alcalino que
libera 100 % de alcalinidade custica que responsvel pela sua ao de detergncia
e por isso usado amplamente na limpeza pelo mtodo de limpeza no lugar, mais conhecido como CIP (Cleaning In Place). Esse mtodo de higienizao permite o uso de
agentes ou formulaes que liberam alta alcalinidade custica, temperaturas e tempo
de contato das solues de limpeza mais elevadas e tempo de contato maior. Assim,
para limpeza de um pasteurizador de leite, pode-se usar uma soluo de hidrxido de
sdio contendo 1 % de alcalinidade custica, que origina um pH 13, temperatura de
80 C, durante 30 min, circulada a uma velocidade de 1,5 m.s-1. Nesses trocadores de
calor podem ocorrer grossas pelculas de gordura e protenas que devem ser controladas por solues de alta alcalinidade. O hidrxido de sdio comercializado nas formas de escama, perolados ou lquido e origina solues que devem ser manipuladas
com cuidado, por serem perigosas aos manipuladores.
O carbonato de sdio participa de formulaes de mdia alcalinidade, pois libera
em soluo aquosa apenas 50 % de alcalinidade custica (reaes a seguir). Em concentrao de 1 % esse agente alcalino origina um pH de cerca de 11. Isso significa que
190
Os outros alcalinos que participam de formulaes so o metassilicato de sdio, cuja principal caracterstica atenuar a corrosividade das formulaes das quais
participa, o ortossilicato de sdio e o sesquissilicato de sdio, que no apresentam
a caracterstica mencionada.
191
2.4.2. cidos
Os cidos inorgnicos ou orgnicos tm efetiva participao no controle de
sais minerais na superfcie de equipamentos e utenslios. Dentre os cidos inor192
qumicas permitem o controle desses minerais pelo procedimento de higienizao, conforme as reaes qumicas a seguir.
2.4.3. Fosfatos
De maneira geral, utilizam-se o ortofosfato de sdio, representado pelo fosfato
trissdico, e os polifosfatos de sdio, representados pelo hexametafosfato, tetrafosfa-
to, tripolifosfato e pelo pirofosfato em suas formas sdicas (Figura 3). Esses produtos
ou formulaes deles podem ser adquiridos de empresas especializadas, sob diversos nomes comerciais. Como informao, pode-se afirmar que o fosfato trissdico
atua por precipitao dos sais de clcio e de magnsio, responsveis pela dureza da
gua, o que no conveniente, pois haver depsitos nas superfcies que processam
os alimentos. Os polifosfatos, em contrapartida, atuam sobre a dureza por formao
de quelatos com os sais, no ocorrendo, portanto, a deposio. A capacidade de
quelao varivel em funo do polmero. Por exemplo, 1 g de hexametafosfato de
sdio capaz de formar complexos solveis com cerca de 74 mg de dureza. Outros
polifosfatos, como o tripolifosfato de sdio e o tetrafosfato de sdio, complexam,
respectivamente, 36 e 57 mg de dureza por grama do seqestrante.
193
cap.04
2.4.4. Seqestrantes
Os agentes seqestrantes so representados pelas formas sdicas do EDTA
(etilenodiamino tetracetato de sdio), do NTA (nitriloacetato de sdio) e pelo gluconato de sdio (Figura 4). Os agentes tm como funo semelhante quela dos
polifosfatos: o controle de depsitos minerais nas superfcies por complexao,
atuando sobre clcio, magnsio, ferro e mangans, dentre outros. No entanto, so
muito mais eficientes nessa funo (Tabela 9), alm de serem mais estveis em
temperaturas elevadas. Porm, so de custo elevado e, geralmente, usados para
solucionar problemas especficos. Cada grama do EDTA-Na seqestra 201 mg de
dureza. A mesma quantidade do gluconato de sdio complexa 325 mg de dureza.
Deve-se salientar que os cidos orgnicos, como o glucnico e o ctrico, tambm
apresentam a capacidade de complexar minerais.
Figura 4 - Agentes seqestrantes orgnicos: a) etileno diamino tetracetato de sdio e b) gluconato de sdio.
os resduos a serem removidos. Observe o seguinte: a gua, ao contrrio do que parece, no molha bem a superfcie, pois apresenta alta tenso superficial, equivalente
a 72 mJ.m-2. Essa tenso deve ser diminuda a valores de 36 mJ.m-2 para otimizar
o contato entre o detergente e o resduo a ser removido. Por isso, numa superfcie
onde se encontram resduos de gordura a gua apresenta-se na forma de gotculas,
pois a atrao entre as molculas da gua maior do que aquela entre as molculas
de gua e as de gordura. Essa diminuio da tenso superficial da gua conseguida
com o uso de tensoativos.
195
Assim, os agentes tensoativos, por serem emulsificantes, permitem a disperso de dois lquidos no miscveis e, por serem agentes de molhagem, melhor
penetrao de lquidos em resduos slidos. Os sabes e alguns compostos orgnicos melhoram o poder de penetrao das solues aquosas em fissuras, ranhuras e poros capilares das pelculas de gordura depositadas nos equipamentos
e interpem-se entre a superfcie slida e os resduos. Essas substncias aderem
s superfcies das pelculas dos resduos slidos ou lquidos, favorecendo, dessa
maneira, a formao de emulso e disperso das partculas. De maneira geral, os
tensoativos so: i) solveis em gua fria; ii) ativos em concentraes muito baixas,
cap.04
iii) indiferentes dureza da gua, exceo dos sabes; iv) no formam precipitados; v) atuam em diferentes pH; vi) em alguns casos, so bactericidas; e vii) no
so corrosivos das superfcies.
A parte apolar do tensoativo na interface lquido-gs, por exemplo, quando em
soluo aquosa fica direcionada para o ar e a parte polar para a gua. Isso provoca a
formao de espuma pelos detergentes (Figura 6a). A ocorrncia de espuma pode ser
desejvel no procedimento de higienizao de superfcies externas de equipamentos,
silos, paredes e tetos, dentre outros. Nesse caso, a espuma permite melhor contato do detergente com os resduos a serem removidos e facilita a observao visual
da rea higienizada. No entanto, o excesso de formao de espuma no desejvel
para a higienizao pelo processo CIP, devido a dificuldades operacionais. A remoo
da espuma em excesso prejudica a etapa de enxaguagem dos resduos durante higienizao. Deve-se ressaltar que a quantidade de espuma formada no indicativa
da eficincia na reduo da tenso superficial. Cabe s empresas que formulam os
detergentes a escolha adequada das substncias mais indicadas, em razo do uso na
indstria de alimentos. Alm disso, deve-se mencionar que a ocorrncia de espumas,
quando os resduos de detergentes no so adequadamente tratados pela indstria,
torna-se um problema srio de poluio ambiental.
a)
196
b)
Assim, manter concentrao suficiente de molculas de tensoativo para a formao de micelas importante para se obter uma boa limpeza. Essa concentrao
varia de acordo com o tipo de tensoativo. Por exemplo, a concentrao de alquil
sulfonatos, como o dodecilbenzeno sulfonato de sdio, deve situar-se entre 0,1 % e
0,2 %. Esse tensoativo tem um CCM de aproximadamente 0,03 %.
H uma classificao dos agentes tensoativos baseada na sua ionizao em
soluo aquosa. Os tensoativos aninicos liberam uma carga eltrica negativa em
gua e so representados pelos sabes obtidos pela saponificao de cidos graxos
com cadeia de 12 a 18 tomos de carbono ou por compostos sintticos geralmente
de origem petroqumica, como o caso do dodecilbenzeno sulfonato de sdio.
cap.04
Os agentes tensoativos catinicos so aqueles que liberam carga eltrica positiva em soluo aquosa. So representados pelos compostos quaternrios de amnia, tambm conhecidos como quats, cuja funo bactericida mais importante
do que a ao como detergente.
Os agentes no inicos usualmente resultam da condensao do xido de etileno ou do xido de propileno com lcoois de cadeia longa ou alquil fenis (Figura10).
Os tensoativos anfteros liberam carga eltrica negativa ou positiva, dependendo do pH da soluo aquosa (Figura 11). Esses agentes apresentam aplicao
limitada na formulao de detergentes usados na indstria de alimentos. No entanto, so bastante utilizados na preparao de shampoos.
199
cap.04
2.4.6. Enzimas
Em algumas situaes, com o objetivo de aumentar a eficincia do procedimento de higienizao, sugere-se a adio de enzimas proteolticas e lipases s solues
de tensoativos. Na indstria de carnes, por exemplo, a utilizao dessas enzimas seria
vivel, pois pelculas de protenas e gordura podem se depositar sobre superfcies de
processamento. Os detergentes contendo as enzimas hidrolisam as gorduras e protenas, facilitando sua remoo posterior. O uso das enzimas no requer gua quente, que,
ao contrrio, pode inativ-las. Alm disso, normalmente as enzimas atuam melhor em
meio neutro ou ligeiramente alcalino. Assim, a eficincia das enzimas em formulaes
de detergentes de alcalinidade custica muito elevada deve ser bem avaliada.
200
201
cap.04
202
H - Exemplo de formulao de detergentes para higienizao de garrafas de vidro por mtodo CIP
cap.04
203
2.6. Sanitizantes
204
concentrao de uso e pelos tipos de resduos presentes nas superfcies, pelo pH,
pelas propriedades fsico-qumicas da gua e, ainda, por substncias inativadoras.
O tipo e a concentrao de microrganismos contaminantes da superfcie tambm
influenciam a eficincia do sanitizante. Os esporos so mais resistentes do que as
clulas vegetativas. Certos sanitizantes so mais efetivos sobre bactrias Grampositivas do que Gram-negativas. Outros apresentam boa eficincia contra fungos
filamentosos e leveduras, mas no sobre vrus ou cistos de protozorios, como
Cryptosporidium e Giardia.
Agentes Fsicos
Calor
O calor, quando possvel, deve ser o agente sanitizante escolhido: atinge toda a
superfcie, incluindo pequenos orifcios e ranhuras e no seletivo contra os microrganismos. A gua quente deve ser usada numa temperatura de 80 C durante 5 min.
O ar quente deve ser aplicado a 90 C durante 20 min. J o vapor direto, considerado
a verdadeira sanitizao pelo calor, deve der aplicado o mais prximo possvel da
superfcie durante 1 min. Deve-se ter cuidado na sanitizao de tubulaes com o
vapor, pois a eficincia deste pode ser diminuda em tubulaes longas, se a temperatura no for controlada.
205
cap.04
Radiao Ultravioleta
A radiao ultravioleta usada no controle microbiolgico em situaes especficas de reas de processamento, de laboratrios, cmaras de repicagens de
micorganismos, superfcies de processamento de alimentos, como polietileno usado como embalagem de leite. Tambm, pode ser usada no controle microbiolgico de alimentos. Lmpadas ultravioleta que imitem radiao 254 nm tm atividade
antimicrobiana. Como essa atividade diminui com o uso, as lmpadas devem ser
substitudas periodicamente, em geral aps seis meses.
Agentes Qumicos
As Tabelas 14, 15 e 16 descrevem as caractersticas de uso, eficincia antimicrobiana e mecanismo de ao dos principais sanitizantes qumicos.
Tabela 14 - Condies de uso de sanitizantes qumicos mais usados para controle dos microrganismos em superfcies para processamento na indstria de alimentos
206
Tabela 15 - Eficincia sobre microrganismos de alguns sanitizantes qumicos nas condies de uso
para controle de microrganismos em superfcies para processamento na indstria de alimentos
cap.04
Tabela16 - Mecanismos de ao dos sanitizantes qumicos mais usados no controle de microrganismos em superfcies para processamento na indstria de alimentos
Compostos Clorados
208
209
cap.04
mg.L-1 de cloro residual livre, com um pH de 7,5, tem 50 mg.L-1 de cido hipocloroso.
Da mesma forma, se o pH da gua for 8,5 ou 6,5, as concentraes de cido hipocloroso sero, respectivamente, 9 mg.L-1 e 90 mg.L-1, conforme determinado pela
reaes qumicas e frmula a seguir.
Iodforos
Os iodforos (Figura 13) so compostos derivados do iodo empregados como
sanitizantes na indstria de alimentos. So formulaes que combinam o iodo e
um agente tensoativo, como a polivinilpirrolidona e um agente veiculador cido.
Para manipuladores, normalmente usa-se uma soluo-tampo formada pelo cido
actico e pelo acetato de sdio, originando uma soluo de uso com pH entre 5 e 6,
de modo a no afetar a mo de manipuladores. J, em equipamentos e utenslios,
o cido utilizado para a veiculao do iodo geralmente o fosfrico. Nesse caso, as
solues sanitizantes diludas apresentam um pH em torno de 2, que otimiza a sua
210
cido Peractico
O cido peractico comercial um sanitizante constitudo por uma mistura de
cido peractico, perxido de hidrognio, cido actico e um veculo estabilizante
(Figura 14). Algumas formulaes contm, ainda, um cido orgnico como o octanico. produzido pela reao de cido actico com perxido de hidrognio na
presena de um cido mineral como catalisador, geralmente o cido sulfrico.
211
cap.04
212
Esses sanitizantes so eficientes sobre bactrias Gram-positivas e microrganismos termodricos. No entanto, apresentam baixa ao sobre bactrias Gram-negativas. So pouco eficientes contra coliformes e psicrotrficos e ineficientes contra
esporos. So incompatveis com agentes tensoativos aninicos. No so corrosivos
nem txicos. Geralmente, so utilizados para a sanitizao de pisos, paredes e equipamentos e no controle microbiolgico do ar de ambientes de processamento.
Clorhexidina
213
slios, sendo ainda recomendadas para o controle microbiolgico de salmoura no processamento de queijo. A eficincia desse sanitizante foi constatada na diluio 1:3000,
que corresponde a cerca de 70 mg.L-1 do princpio ativo no tratamento de salmoura e
na superfcie de queijo minas curado. Verificou-se reduo de 96 % na contagem de
aerbios mesfilos e de 70 % na de coliformes totais.
Perxido de Hidrognio
As solues de perxido de hidrognio apresentam forte ao oxidante devido liberao de oxignio, que possui atividade sobre microrganismos Grampositivos e Gram-negativos. O perxido de hidrognio uma composto inorgnico que se caracteriza por conter um par de tomos de oxignio (-O-O-).
Na indstria de alimentos usado como sanitizante quando se encontra nas
concentraes entre 0,3 % e 6 %, pH 4,0, e desde a temperatura ambiente at 80 C,
durante 5 a 20 min de contato. As solues desse agente sanitizante apresentam baixa
cap.04
Oznio
Descoberto em 1840 pelo qumico alemo Christian Schbein, o oznio um
alotrpico de oxignio, naturalmente presente como um gs sem cor e com odor
prprio. Ele produzido na superfcie da atmosfera pela ao da radiao ultravioleta nas molculas de oxignio.
O oznio tem sido utilizado na desinfeco de gua, ar de ambientes de processamento e, tambm, no controle microbiolgico de alguns alimentos. O uso desse sanitizante aconselhvel, por exemplo, quando a clorao origina subrodutos
indesejveis. A eficincia antimicrobiana do oznio dependente da concentrao,
do tempo de contato, do efeito residual e da temperatura de aplicao. Pode ser
214
cao do oznio expandiu-se para desinfeco de equipamentos, ambientes de produo e reduo de clulas viveis aderidas em superfcies de ao inoxidvel.
O nvel de exposio recomendado para aplicao do oznio em ambientes
foi proposto pela Administrao de Sade e Segurana Ocupacional (OSHA), pelo
Instituto Nacional Americano de Padres (ANSI), pela Conferncia Americana de Higienistas Governamentais para a Indstria (ACGIH) e pela Associao Americana de
Higiene Industrial (AIHA). Os manipuladores no podem ser submetidos ao excesso
de oznio. Na concentrao de 0,2 mg.m-3, o tempo de exposio do manipulador
no pode ultrapassar 8 h por dia de trabalho. Nenhum manipulador de alimentos
ser exposto concentrao de oznio que exceda a 0,6 mg.m-3, por mais de 10
215
cap.04
216
lcoois
Os lcoois etlico, proplico e isoproplico so usados como sanitizantes na indstria de alimentos. Dentre esses, o lcool etlico apresenta maior aplicao, sendo
preferencialmente preparado numa concentrao de 70 % do princpio ativo. A essa
soluo, podem ser adicionados 2 % de iodo e 2 % de glicerina para controle da
microbiota de mos de manipuladores de alimentos.
As solues de alcolicas so alternativas viveis para a sanitizao de algumas superfcies, em reas de processamento de alimentos em p, onde o uso de
gua deve ser evitado.
Derivados do Fenol
O uso do fenol como agente antimicrobiano data dos meados do sculo XIX,
na desinfeco em procedimentos cirrgicos. O fenol uma substncia cristalina,
incolor, muito solvel em gua, mas de difcil manipulao. Solues aquosas contendo 2 a 5 % podem ser usadas na desinfeco de equipamentos contaminados.
Este sanitizante altera a permeabilidade da membrana celular, permitindo a sada de
alguns constituintes celulares essenciais, como os aminocidos. Alguns compostos
fenlicos so excelentes fungicidas, mas apresentam baixa eficincia sobre esporos
bacterianos e vrus. Deve-se mencionar o fato, no entanto, que atualmente existem
alternativas de sanitizantes mais adequadas indstria de alimentos.
217
Vrios outros derivados de fenol com uma atividade antimicrobiana mais eficiente foram obtidos por sntese qumica. Dentre eles incluem-se os cresis (orto,
meta e para), o hesilresorcinol, o hexaclorofeno e o irgasan.
cap.04
Irgasan e triclosan so os nomes comerciais de um derivado fenlico normalmente constituinte de formulaes detergentes com atividade sanitizante indicado
para higienizar mos de manipuladores de alimentos. Este sanitizante, o 2,4,4tricloro 2-hidroxidifenil ter, apresenta um largo espectro de ao antimicrobiana e vasto campo de aplicao. A ao do irgasan/triclosan ocorre em nvel de membrana
citoplasmtica e para assegurar rpida destruio bacteriana o sanitizante tem sido
formulado com agentes tenso-ativos apropriados.
Um fato histrico em relao ao fenol merece registro. Este agente qumico foi
utilizado como antimicrobiano padro, quando se desenvolveu, no incio do sculo
XX, a primeira tcnica laboratorial para avaliar a eficincia de sanitizantes. Modificaes ocorreram, mas ainda hoje, o princpio desta metodologia, conhecida como
teste do coeficiente fenlico, basicamente a mesma: comparar a ao microbiana
de um determinado agente qumico contra uma soluo padro de fenol. No h
dvidas, no entanto, que outras tcnicas mais apropriadas para avaliar sanitizantes foram desenvolvidas, mas a determinao do coeficiente fenlico um mtodo
padronizado recomendado pela AOAC (American of Official Analytical Chemists) e
tambm usado no Brasil pelo INCQS (Instituto Nacional de Controle de Qualidade
em Sade) da FIOCRUZ (Fundao Osvaldo Cruz).
220
221
cap.04
placas RODAC, quando a contaminao era superior ou igual a 100 UFC/21-25 cm. Mas
com contagens menores, as placas de contato mostraram melhores resultados.
Para superfcies curvas ou com ranhuras, as placas Petrifilm comercializadas
pela empresa 3M podem ser utilizadas para a avaliao por contato direto. Essas
placas contm uma camada de meio de cultura na forma de gel, em um filme flexvel, com um indicador para facilitar a enumerao das colnias. Aps a hidratao
assptica do gel com 1 mL de soluo de diluio esterilizada, a placa pode ser,
ento, pressionada contra a superfcie a ser avaliada, sendo posteriormente incubada de forma usual. Uma vantagem dessa tcnica que o gel pode ser moldado,
comprimindo-o contra a superfcie curva.
O uso de neutralizantes no meio de cultura utilizado nas placas de contato
tambm se faz necessrio quando a eficincia de processos de higienizao e sanitizao est sendo avaliada.
Este mtodo consiste em usar esponjas de poliuretano, esterilizadas, de dimenses aproximadas de 13x7,5x4 cm, para a remoo dos microrganismos. A coleta
dos microrganismos realizada com o auxlio de uma bolsa esterilizada de plstico
com dimenses aproximadas de 30x40 cm. No ato da coleta, a bolsa de plstico ser
utilizada como uma luva. Assim, a superfcie externa da bolsa entra em contato com
a pele da pessoa que vai efetuar a coleta. Vestido com a luva, tira-se uma esponja
que ser friccionada de forma adequada na superfcie que se deseja avaliar. s vezes,
necessrio umedecer a esponja com gua peptonada esterilizada, principalmente
quando a superfcie estiver muito seca. Aps a coleta, retira-se a luva, retornando-a
posio original, com a face esterilizada para dentro e contendo a esponja com os
microrganismos removidos da superfcie. A partir da, usa-se o procedimento convencional para as contagens microbianas: os microrganismos so retirados da esponja
usando-se solues diluentes, que sero plaqueadas em meios de cultura, sendo as
placas incubadas em condies apropriadas. O resultado expresso em UFC.cm-2.
223
cap.04
Essa correo reflete a pressuposio de que quanto maior o nmero de partculas viveis impressas na placa, menor a probabilidade de as prximas partculas
passarem em orifcios vazios, subestimando a contagem. Dessa forma, o nmero de
UFC por volume de ar em m3 pode ser determinado (ANDERSEN, 1958).
ANDERSEN, A.A. New sampler for the collection, sizing, and enumeration of viable airborne particles.
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05
1.
Introduo
2.
3.
4.
Concluso
5.
Referncias
1. Introduo
O homem durante sua vida est sujeito a contrair um nmero elevado de
doenas de origem alimentar. Cerca de 250 diferentes doenas podem ser veiculadas ao homem por alimentos contaminados (CDC 2006). Apesar da evoluo
dos conhecimentos sobre os microrganismos, dos mecanismos de intoxicaes e
das tcnicas de higienizao, tem-se observado ainda a ocorrncia de um nmero
elevado de surtos e de casos dessas doenas. Isso se deve, principalmente, a
eventuais alteraes nos mtodos de processamento de alimentos que resultam
em menor controle microbiolgico e a comercializao de grande nmero de alimentos prontos para o consumo.
Dentre os agentes etiolgicos das doenas de origem alimentar que podem
contaminar os alimentos desde o campo at a mesa do consumidor, incluem-se as
bactrias, os fungos, os agentes qumicos, os parasitas, os vrus e as substncias
txicas de origens animal e vegetal. Agentes qumicos, como metais pesados, parasitas, incluindo Tricnela spiralis e Entamoeba histolytica, Giardia lamblia e Cryptosporidium spp. e, ainda, vrus, como o da hepatite, so incriminados em alguns
surtos de doenas alimentares. No entanto, no h dvidas de que so as bactrias
228
os principais agentes etiolgicos das doenas causadas por alimentos, sendo responsveis por cerca de 70 % dos surtos e 95 % dos casos (Quadro 1).
Quadro 1 - Etiologia dos surtos e casos de doenas de origem alimentar
alimentos contaminados veiculando microrganismos para outros em boas condies higinicas; e a adio de ingredientes contaminados a alimentos j cozidos,
sem reaquecimento.
Quadro 2 - Principais causas de surtos de doenas de origem alimentar
importante frisar que a maioria desses problemas pode ser controlada. Sem
dvida, a conscientizao dos manipuladores, dos processadores, enfim, daqueles
que de uma forma ou de outra trabalham com alimentos contribui para evitar ou
diminuir os surtos de doenas causadas por alimentos.
Com relao aos locais de produo, sabe-se que cerca de 40 % dos surtos de doenas veiculadas por alimentos ocorrem em servios comunitrios de
229
ferentes regies de um pas. Nos ltimo anos, o nmero de surtos por contaminao de alimentos em cozinhas domsticas tem aumentado consideravelmente,
atingindo, s vezes, 50 %.
A postura do profissional da rea de alimentos deve ser eminentemente preventiva, no sentido de evitar que os surtos de doenas por alimentos ocorram.
Para isso, fundamental ter e usar conhecimentos de processamento de alimentos, de controle de qualidade, de microbiologia de alimentos e de higienizao
industrial, entre outros.
No entanto, mesmo tomando-se todas as precaues, existe o risco de que os
alimentos venham causar doenas, seja por acidentes, seja por outro motivo. Por
isso, o profissional da rea de alimentos deve estar preparado para ter condies
de avaliar as causas e determinar o agente etiolgico responsvel pela doena.
cap.05
Deve-se, ainda, saber tomar medidas para evitar que novos surtos aconteam.
230
231
Os alimentos com AA entre 0,60 e 0,86 tambm so conhecidos como alimentos com atividade de gua intermediria. Nesse grupo de alimentos, esto as carnes
curadas, os queijos duros, como o parmeso, o mel, as farinhas lcteas, o doce de
leite e o leite condensado, entre outros. Nesses alimentos no h crescimento de
bactrias patognicas, mas eles so passveis de alteraes por bactrias halfilas,
leveduras osmoflicas e fungos filamentosos xerfilos. As bactrias haloflicas so
capazes de crescer em altas concentraes de sal at valores de AA prximo de
0,75. As leveduras osmoflicas crescem em altas concentraes de acar, como no
cap.05
2.1.1.2. pH
Os valores de pH dos produtos alimentcios tambm apresentam grande importncia na determinao dos possveis microrganismos presentes. Em razo desses
valores, os alimentos so classificados como muito cidos, quando apresentam pH
abaixo de 3,7, cidos em valores entre 3,7 e 4,6, de mdia acidez entre 4,6 e 5,3
e, ainda, de baixa acidez quando acima de 5,3. Em processamento de alimentos, o
232
Os microrganismos se desenvolvem em determinadas faixas de potencial redox. Assim, os aerbios estritos usam o oxignio como aceptor final de eltrons.
233
cap.05
haja controvrsia. As bactrias psicrfilas crescem temperatura de 0 C, apresentam timo de crescimento em torno ou abaixo de 15 C e um mximo prximo de
20 C. So encontrados, geralmente, em ambientes marinhos de regies muito frias,
abrangendo um nmero relativamente pequeno desses microrganismos. Por isso, e
tambm devido sua maior sensibilidade a temperaturas mais elevadas, as bactrias
psicrfilas so menos importantes, em tecnologia de alimentos, do que as psicrotrficas. Estas ltimas so capazes de crescer temperatura prxima de 0 C, mas seu
desenvolvimento timo est em torno de 25 - 30 C, sendo, inclusive, considerada
um subgrupo das mesfilas. As bactrias psicrotrficas so capazes de alterar produtos armazenados sob refrigerao, representando, assim, um grupo de grande
importncia na indstria de alimentos.
que o envolve.
A relao matemtica entre a atividade de gua e a umidade relativa a seguinte: AA=UR/100.
235
contaminada em cada 1012 processadas. Nesse caso, nos clculos dos tratamentos
trmicos, parte-se do pressuposto de que os valores D121 C das espcies de C. botulinum de mxima resistncia ao calor situam-se em torno de 0,21 minutos e que o
alimento a ser processado apresente um desses esporos por unidade de alimento
processado.
Alm do rgido controle do binmio tempo temperatura, nesse tipo de preservao do alimento importante o cuidado para evitar a recontaminao do produto
por defeitos na embalagem ou no seu fechamento hermtico.
236
As barreiras a serem empregadas dependem fundamentalmente do tipo de alimento. No entanto, em qualquer caso, tais barreiras devem ser capazes de manter a
microbiota do alimento sob controle. Os microrganismos presentes no devem ser
capazes de superar as barreiras presentes, caso contrrio ocorrer a deteriorao do
produto e at mesmo a veiculao de doenas.
A combinao de pasteurizao e pH uma alternativa para muitos produtos
alimentcios em que a esterilizao comercial pelo calor invivel, pois eles perderiam suas propriedades caractersticas. Por isso, nesses casos usam-se mais de uma
medida de controle na preservao do alimento. Nessa associao de medidas de
controle, a temperatura aplicada elimina uma srie de microrganismos alteradores
e, tambm, de microrganismos patognicos, mas no os esporos de C. botulinum.
Entretanto, a transformao desses esporos em clulas vegetativas com possvel
formao de toxina evitada pelo pH que se apresenta abaixo de 4,6. Produtos com
pH abaixo desse valor podem ser obtidos pela adio de cidos, por processos fermentativos ou, ainda, caracterstico do alimento. So exemplos desses alimentos
os sucos de frutas cidas pasteurizadas e os picles.
barreira ao desenvolvimento microbiano. Nesse caso, como os esporos sobrevivem ao tratamento trmico, a temperatura de armazenagem responsvel pelo
controle do desenvolvimento de C. botulinum. importante frisar que, nesse caso,
a temperatura de armazenamento ideal deve ser inferior a 3 C, pois a temperatura mnima para a produo de toxina por C. botulinum do tipo E, que pode
contaminar produtos marinhos.
Por exemplo, na pasteurizao do leite pelo sistema HTST, geralmente realizada a 72-75 C por 15 seg, h sobrevivncia de microrganismos termodricos,
como espcies dos gneros Micrococcus e Streptococcus, e, ainda, esporos bacterianos. O crescimento desses microrganismos controlado pelo armazenamento
temperatura em torno de 5 C. A pasteurizao do leite visa reduo de 15 ciclos
logaritmos na populao de Coxiella burnetii, a forma bacteriana vegetativa patognica mais resistente que contamina esse produto. Se a pasteurizao for realizada
corretamente e se a contaminao inicial for de uma C. burnetii por unidade processada, haver a probabilidade de uma unidade estar contaminada com a presena do
patgeno em 1015 unidades processadas.
Uma combinao de pasteurizao, sal, nitrito, refrigerao pode tambm
237
de sua concentrao, apresenta, tambm, poder inibitrio sobre os microrganismos atravs da ao do on cloreto e da interferncia na atividade de enzimas. J
o nitrito de sdio usado geralmente nas concentraes entre 150 e 200 mg.L-1, em
produtos curados de carne, atua inibindo o crescimento ps-germinativo de esporos e a multiplicao de clulas vegetativas de C. botulinum. Esse procedimento
ocorre, por exemplo, em salame e no presunto.
Na aplicao associada da secagem, pH, AA e substncias antimicrobianas, a
preservao do alimento fundamenta-se no controle dos fatores extrnsecos e em
propriedades inibitrias do crescimento dos patgenos por substncias qumicas.
Usam-se, por exemplo, o cloreto de sdio e o nitrito de sdio. A carne seca conservada por esse mtodo de preservao.
O tratamento trmico da pasteurizao em combinao com o abaixamento do
pH, utilizando culturas lticas, e adio de cloreto de sdio o fundamento do pro-
cap.05
2.2.3. Irradiao
A irradiao de alimentos tem sido estudada por mais de 30 anos, em todo o
mundo, como uma tcnica de processamento para prolongar a vida de prateleira
de vrios alimentos (LOAHARANU, 1984; LLORENTE FRANCO et al., 1992; DIEHL,
1993; FARKAS, 1998). O processo tem sido relacionado como um mtodo para aumentar a segurana de alimentos, por destruir microrganismos patognicos, como
E. coli O157:H7 (MONK et al., 1995; LAANEN, 1999).
A irradiao consiste na exposio dos alimentos radiao com uma energia
de 2 a 5 kGy em comprimento de onda de 2.000 , ou menos. As radiaes beta,
gama, raios X e as microondas esto includas nesse intervalo de comprimento de
ondas. Os raios gama so o tipo de irradiao mais usado para processamento de
alimentos e obtido do radioistopo cobalto60.
Em 1983, o FDA aprovou a irradiao como mtodo de controle de microrganismos em condimentos, principalmente pelo fato de esse tipo de processo ser uma
alternativa para alguns aditivos qumicos usados em alimentos (MURANO,1995). De
acordo com World Health Organization (WHO,1997), doses inferiores a 10 KGy no
causam alteraes substanciais no valor nutritivo dos alimentos e, do ponto de vista
toxicolgico, no promovem nenhum efeito adverso sade humana. No entanto, a
qualidade sensorial dos alimentos pode ser alterada para pior em doses de radiao
gama mais elevadas.
238
negativas e fungos filamentosos e leveduras. A inativao de esporos por alta presso est fortemente influenciada pela temperatura e em menor escala por pH, atividade de gua e fora inica. A temperatura tima para a germinao de esporos
difere nas diferentes presses (BARBOSA; CANOVAS, 1998).
A irradiao provoca a germinao dos esporos e em seguida elimina o esporo
germinado, que se comporta como uma clula vegetativa. Presses entre 300 - 400
MPa inativam os formadores de esporos. Baixas presses (<100 MPa) induzem a
germinao, mas no eliminam todas as clulas vegetativas de Clostridium spp. e
Bacillus spp.
A alta presso hidrosttica um mtodo interessante de conservao de alimentos, principalmente para aqueles que tm caractersticas sensoriais, funcionais
e nutricionais termossensveis. Um aspecto importante nessa tecnologia a possibilidade da manuteno do aroma e textura do alimento, devido inativao de
enzimas ocorrida nesse processamento.
239
cap.05
vmitos e diarrias. Para intoxicao com a toxina botulnica, a esses sintomas, que
240
3.1.1. Salmoneloses
As espcies do gnero Salmonella pertencem famlia Enterobacteriaceae.
So Gram-negativas, bastonetes curtos, anaerbias facultativas e no formam esporos. A temperatura tima de crescimento de 38 C e a mnima, de 5 C. A faixa de
pH para crescimento situa-se entre 4 e 9. Como no formam esporos, so relativamente termossensveis, podendo ser destrudas pelo tratamento de 60 C durante
15 a 20 min (ICMSF, 1996).
Salmonella encontrada nos tratos intestinais de mamferos, pssaros, anfbios
e rpteis. Uma ampla variedade de alimentos contaminados associada salmoneloses, incluindo carne bovina crua, aves domsticas, ovos, leite e derivados, peixes,
camares, temperos para saladas, mistura para bolos, cacau, manteiga de amendoim,
241
De acordo com o CDC (2003), todo ano aproximadamente 40.000 casos de salmoneloses so relatados nos Estados Unidos. Devido ausncia de relatos ou diagnstico de muitos casos, esse nmero de infeces pode ser trs vezes maior. Crianas,
idosos e imunodreprimidos so mais vulnerveis a essas infeces. A estimativa de
que aproximadamente 600 pessoas morram a cada ano com salmonelose aguda.
Em 1999, um surto de salmonelose envolveu 300 pessoas que consumiram
cidra de ma no pasteurizada (CDC, 1999). Produtos frescos podem ser contaminados ainda no campo atravs de adubo, gua contaminada e, ainda, por contato
humano (LAMIKANRA, 2002).
Vrios surtos de salmoneloses provocados por frutas, principalmente meles
cantaloupes, tm sido relatados pelo Centro de Controle e Preveno de Doenas
dos Estados Unidos e Canad. Em 1990, um surto com esses meles foi causado
por Salmonella chester, que afetou 245 indivduos, com duas mortes, em 30 esta-
cap.05
242
pasteurizado. Evitar o uso de utenslios que entraram em contato com carnes bovinas ou avcolas cruas. Ter muito cuidado no preparo de alimentos para crianas,
idosos e imunodeprimidos. Lavar as mos aps contatos com rpteis, pssaros ou
fezes de animais de estimao e no trabalhar em reas de carnes cruas e processadas ao mesmo tempo.
pertencem a um grupo de nove exoprotenas sorologicamente distintas e classificadas como EEA, EEB, EEC1, EEC2, EEC3, EED, EEE, EEG e EEH (HALPIN DOHNALEK;
MARTH, 1989; BERGDOLL, 1996; OLIVEIRA; HIROOKA, 1999).
S. aureus pode ser encontrado no solo, no ar, na gua, nos homens e nos animais. No homem, o microrganismo encontrado principalmente nas fossas nasais,
de onde se propaga direta ou indiretamente para pele e feridas. A maioria das cepas
de S. aureus cresce na faixa de pH de 4,5 a 9, 3, estando o valor de pH mais adequado
para a produo da toxina na faixa da neutralidade, entre 6 e 7 (BERGDOLL; BENNETT, 1989). Esse microrganismo possui capacidade de crescer numa atividade de
gua acima de 0,86, no entanto a produo de enterotoxina possvel a partir de uma
atividade de gua de 0,90, sendo a tima 0,99 (BENNETT, 1992).
S. aureus apresenta grande variedade de fatores de patogenicidade e virulncia: estafiloquinases, hialuronidases, fosfatases, coagulases e hemolisinas.
As intoxicaes alimentares so causadas pelas enterotoxinas. Uma toxina previamente denominada enterotoxina F agora reconhecida como responsvel
pela sndrome de choque txico ou por enterite. Essas toxinas so altamente
termoestveis (D98,9 2 h) e resistentes coco ou a enzimas proteolticas
(FORSYTHE, 2002).
Os alimentos geralmente envolvidos na intoxicao estafiloccica incluem carne de bovinos, sunos e aves e seus derivados e ovos. Tambm, leite e seus derivados, como os queijos cremosos, bem como outros produtos, como sanduches,
saladas de atum, doces recheados com creme, chocolates e outros, so geralmente
incriminados em surtos. Os sintomas aparecem rapidamente aps a ingesto, em
forma de nuseas, vmitos e dores abdominais.
243
cap.05
E.coli est presente no trato intestinal dos animais e homens e pode ser
encontrada como contaminante do solo, gua e plantas. As principais fontes no
ambiente so as fezes. Dentre as estirpes, as enterohemorrgicas so as mais perigosas, e a dose infecciosa est abaixo 100 clulas por grama de alimento, sendo
que menos de duas clulas por 25 g j foram responsabilizadas em surtos (IFPA,
2001; LAMIKANRA, 2002). E. coli O157:H7 um representante das estirpes enterohemorrgicas. A maioria das estirpes de E. coli se aloja em intestinos humanos
e de animais inofensiva, entretanto E. coli O157:H7 produz uma toxina potente
e causa doena severa. A cada ano, nos Estados Unidos, essa estirpe enterohemorrgica responsvel por 73.000 casos de infeces e 61 mortes. A infeco
geralmente leva diarria com sangue e, ocasionalmente, a problemas renais. A
maioria das doenas tem sido associada alimentos mal cozidos e carnes contaminadas. O contato de pessoas para pessoas tambm uma forma de transmisso.
Frutas e vegetais tambm podem ser contaminados com E. coli O157:H7 no campo
ou, ainda, por gua contaminada ou pelo pessoal envolvido na colheita. A infeco
tambm pode ocorrer aps a ingesto de leite cru e, ou, gua contaminada. Devido
existncia desses microrganismos nos intestinos de bovinos saudveis, medidas
preventivas em fazendas de gado e durante o processamento de carnes devem ser
avaliadas (CDC, 2004).
E. coli O157:H7 difere da maioria das outras linhagens, j que cresce pouco ou
no cresce a 44 C. Esse microrganismo se desenvolve temperatura de 7 C - 8 C e
tolerante a pH cido. Nos Estados Unidos, quatro surtos de E. coli O157:H7 foram
epidemiologicamente associados ao consumo de cidra de ma no pasteurizada
244
3.1.4. Campilobacteriose
As espcies do gnero Campylobacter so bastonetes, Gram-negativas, de tamanho entre 1,5 - 5 m. So microrganismos microaerfilos, que requerem de 3 % a
5 % de oxignio e de 2 % a 10 % de dixido de carbono e temperatura de 42 - 43 C.
como condies timas de crescimento. So sensveis ao estresse ambiental, sendo
afetadas pela presena de oxignio em concentraes de 21%, pela baixa umidade, pelo calor, pela acidez e pela ao de desinfetantes usuais, dentre outros (FDA,
2001). Essas bactrias so encontradas nos intestinos de pssaros saudveis e na
maioria de carne crua de aves.
tros alimentos que entram em contato com o exsudado da carne crua de frangos (CDC, 2002). Tambm, provocada pelo consumo de alimentos crus contaminados pela gua ou devido contaminao cruzada, principalmente entre
animais e produtos vegetais. Esse microrganismo tambm capaz de crescer
em vegetais crus e, ou, minimamente processados, embalados sob condies
microaeroflicas (LAMIKANRA, 2002).
A campilobacteriose uma doena que apresenta como sintomatologia febre,
dor abdominal e diarria, que pode ser profusa, aquosa e, freqentemente, com
sangue. O perodo de incubao de 2 a 10 dias e a durao da doena, de cerca de
uma semana. O microrganismo secretado nas fezes durante vrias semanas aps
os sintomas terem cessado. Existem duas espcies principais de Campylobacter
causadores dessas doenas. A espcie C. jejuni causa a maioria dos surtos, envolvendo-se em 89 % a 93 %, seguindo-se a espcie C. coli com 7 % a 10 %. Tambm,
as espcies C. upsaliensis e C. iari, ocasionalmente, so implicadas em surtos alimentares. Tais microrganismos so encontrados em aves domsticas, gado, sunos,
ovinos, roedores e pssaros (SKIRROW, 1991).
A dose de C. jejuni responsvel pela infeco situa-se na faixa de 500 a 10.000
clulas, dependendo da espcie, danos da clula pelo estresse ambiental e suscep-
A doena pode ser causada pelo consumo de frangos mal cozidos ou ou-
245
cap.05
pessoal de abate na produo de carnes cruas para a importncia dos bons hbitos
de higiene essencial para manter a contaminao microbiolgica dentro do aceitvel. Tratamentos bactericidas, como calor (cozimento ou pasteurizao), e irradiao
so efetivos na eliminao de Campylobacter em alimentos contaminados.
3.1.5. Shigeloses
As espcies de Shigella so bactrias altamente contagiosas que colonizam o
trato intestinal de homem e de animais. O microrganismo se propaga por contato
indireto ou direto com indivduos infectados. O alimento ou a gua podem ser contaminados por material fecal de pessoas infectadas. Esse microrganismo sobrevive
por mais tempo quando as temperaturas de manuteno dos alimentos so inferiores a 25 C e, em menor tempo, em produtos cidos (ICMSF, 1996).
O gnero Shigella dividido em quatro espcies: S. dysenteriae, S. sooney, S. flexneri e S.boydii, sendo todas responsveis por shigeloses em humanos. Essas doenas
so geralmente associadas gua e alimentos contaminados com fezes humanas (FORSYTHE, 2002). Assim, produtos frescos podem ser contaminados pela gua de irrigao,
pelo uso da compostagem como fertilizantes, por insetos e, ainda, pelo contato humano.
Frutas e vegetais processados tm sido relacionados com surtos de shigeloses. Espcies
de Shigella podem estar presentes em frutas em pores minimamente processadas,
como melancia e mamo, armazenadas sob refrigerao (LAMIKANRA, 2002).
Os principais sintomas da shigelose so diarrias branda ou grave, aquosa ou
com sangue, febre, nuseas, vmitos e dores abdominais. Os sintomas aparecem
de 12 at 96 h aps a exposio a Shigella (FORSYTHE, 2002). A shigelose pode
246
ser prevenida por lavagem freqentemente das mos com detergente apropriado,
principalmente aps utilizar banheiros. Evitar que pessoas com diarrias preparem
alimentos para outros e procurar no engolir gua de piscina (CDC, 2003).
3.1.6. Listerioses
L. monocytogenes uma bactria Gram-positiva, apresentando-se na forma de
bastonete, anaerbia facultativa, no esporulada, psicrotrfica, produz flagelo a 25
C, mas no a 35 C. Pode ser encontrada em pelo menos 38 espcies de mamferos
e 17 de vegetais. Esse microrganismo pode contaminar carnes e produtos crneos,
queijos brancos, gelados, frutas e hortalias, alm de alimentos de origem marinha
(ICMSF,1996). A dose infecciosa desse microrganismo ainda no est definida. Entretanto, parece ser necessrio um nmero acima 103 UFC.g-1 para causar a doena.
L. monocytogenes amplamente distribuda no ambiente e sobrevive por longos
perodos sob condies adversas (IFPA, 2001; LAMIKANRA, 2002). Essa bactria foi
isolada a partir de vrios ambientes, incluindo vegetao em decomposio, terra,
rao animal, esgoto e gua (FORSYTHE, 2002).
sintomas como dores de cabea, tonturas ou convulses podem ocorrer. Nos Estados Unidos, h uma estimativa de que 2.500 pessoas adoeam com listeriose a
cada ano, ocorrendo bito de 500 delas (CDC, 2003).
3.1.7. Yersinioses
247
cap.05
Os principais sintomas das enfermidades causadas por Yersinia so dores abdominais, febre, diarria (que pode durar vrias semanas), inflamao da garganta,
fezes com sangue, erupes cutneas, nuseas, dor de cabea, mal estar, dores
nas articulaes e vmitos (FORSYTHE, 2002).
A infeco por Y. enterocolitica geralmente adquirida por consumo de alimento contaminado, especialmente produtos sunos crus ou mal cozidos. A preparao de embutidos crus a partir de intestinos de porco uma fonte potencial de
risco. Leite no pasteurizado e gua no tratada podem transmitir esse patgeno
ao homem. Ocasionalmente, a yersiniose ocorre aps contato com animais infectados. Em raras ocasies, essa infeco pode ser transmitida, como resultado da
bactria, passando dos resduos ou dedos sujos de uma pessoa para a boca de
outra pessoa. A causa exata da contaminao desconhecida (CDC, 2004).
As enfermidades causadas por Yersinia no ocorrem com freqncia, estando muito associadas ausncia das boas prticas de fabricao na produo de
alimentos. A populao mais suscetvel a doena so as crianas, os debilitados,
pessoas idosas e imunocomprometidas (FDA,2004).
fatais. Essa doena tambm inicia com a ingesto de grandes quantidades, acima de
108 UFC.g-1 de C. perfringens do tipo C em alimentos contaminados. As mortes por
enterites necrticas so causadas pela infeco e necrose dos intestinos, resultando
em septicemia (FORSYTHE, 2002; FDA, 2004).
A preveno da presena desse microrganismo nos alimentos pode ser obtida
pelo controle do binmio tempo temperatura do processo de coco e pela temperatura adequada de armazenamento.
249
cap.05
250
cereais, em especial o arroz. Entretanto, outros alimentos ricos em amido como ba-
251
tagem pode aumentar para 10 UFC.g . As infeces causadas por esse micror6
-1
ganismo so associadas ao consumo de peixes e frutos do mar crus, impropriamente cozidos ou cozidos corretamente, mas recontaminados, sendo a ostra
um dos maiores riscos. Os sintomas tpicos de doena alimentar causada por V.
parahaemolyticus so diarrias, dores abdominais, nuseas, vmitos, dores de
cabea, febre e tremores (FORSYTHE, 2002).
De acordo com CDC (2004), na sia, estes microrganismos tm sido uma causa comum de doena alimentar. Nos Estados Unidos, eles so pouco implicados
como agentes etiolgicos de doena, estimando-se de 30 a 40 casos por ano. O
controle dessas infeces pode ser realizado por meio de resfriamento adequado
aps a pesca e pela coco completa dos produtos. Tambm, pode ser controlada,
evitando-se a mistura de pescados, oriundos de guas costeiras, nas pocas mais
quentes do ano, que apresentam elevadas contagens de Vibrio spp. sobretudo V.
parahaemolyticus, com produtos marinhos capturados em guas mais profundas
cap.05
253
cap.05
O HAV excretado nas fezes de pessoas infectadas e pode produzir doenas quando indivduos susceptveis consomem alimentos ou gua contaminados.
Presunto e sanduches, frutas e sucos de frutas, leite e produtos lcteos, vegetais,
255
cap.05
Dentre os aspectos levantados pela epidemiologia, so importantes a determinao da sintomatologia e do perodo de incubao, a durao da doena e os
alimentos envolvidos.
Em relao sintomatologia, devem-se considerar aqueles predominantes, que
fornecem fortes indcios do tipo de enfermidade envolvida no surto (Quadro 7). Se a
ocorrncia sintomatolgica principal do surto for em vmitos sem febre, a suspeita
recai sobre a intoxicao emtica, o que remete a S. aureus, e a forma vomitiva de
B. cereus. Esses sintomas devem atingir porcentuais elevados de incidncia entre as
pessoas doentes envolvidas no surto. Por exemplo, nesse surto, acima de 80% das
pessoas devem apresentar vmitos sem febre como principal sintoma.
Quadro 7 - Sintomas predominantes, tipos de doenas e possveis agentes etiolgicos.
258
Uma sintomatologia caracterizada por diarria sem febre indica que a doena pode no entanto, ser uma intoxicao diarrica, que por sua vez sugere que
o agente etiolgico B. cereus em sua forma clssica ou C. perfringens. Se a
diarria aquosa semelhante gua de arroz, coloca-se sob suspeio a clera e
como possvel agente etiolgico V. cholerae. Diarria sanguinolenta e com muco
e pus sugere invaso do tecido celular intestinal, evidenciando-se uma infecco
disentrica. Enquanto febre caracteriza uma infeco, problemas neurolgicos
esto relacionados ao botulismo alimentar.
Os sintomas complementares so importantes para auxiliar o diagnstico da doena. Dores musculares e abdominais, mal-estar, calafrios e cefalia, dentre outros,
fazem parte desses sintomas. Alm disso, caso no sejam identificados como predominantes, diarria, vmitos e febre so tambm considerados complementares.
O perodo de incubao da doena tambm auxilia o diagnstico. Refere-se
ao tempo decorrido entre a ingesto do alimento contaminado e a manifestao da
259
cap.05
O IEA consiste na diferena entre as taxas de ataque das pessoas que comeram
determinado alimento e ficaram doentes (TCFD) e aquelas que no o comeram e no
ficaram doentes (TNCFD). Obtm-se a TCFD pela diviso do nmero de pessoas que
comeram um alimento especfico e ficaram doentes (CFD) pelo nmero total (T) dos
que ingeriram o alimento, multiplicando-se por 100. De forma semelhante, obtm-se
a TNCFD dividindo o nmero de pessoas que no comeram um alimento especfico,
mas que ficaram doentes (NCFD), multiplicando-se por 100.
Assim, pode-se representar matematicamente IEA, TCFD e TNCFD:
A seguir, encontra-se um exemplo hipottico para a definio do alimento suspeito em surto. A partir dos dados epidemiolgicos do Quadro 9, foram obtidas as
informaes contidas no Quadro 10.
Quadro 9 - Dados de um levantamento epidemiolgico hipottico
260
261
262
263
forme a RDC n12, incluem-se em duas categorias: 1) produtos em condies sanitrias satisfatrias que se referem queles cujos resultados analticos esto abaixo ou
igual aos estabelecidos para uma amostra indicativa ou uma amostra representativa, e
2) produtos em condies sanitrias insatisfatrias que so aqueles cujos resultados
analticos esto acima dos estabelecidos para amostra indicativa ou amostra representativa. Essa interpretao permite a emisso de laudos com as seguintes alternativas: a) produto ou lote (se amostra indicativa ou representativa, respectivamente) de
acordo com os padres legais vigentes para as situaes enquadradas na categoria
1; b) produto ou lote (se amostra indicativa ou representativa, respectivamente) imprprio para o consumo humano por apresentar (citar o(s) resultado(s) analtico(s) e
o(s) parmetro(s) no atendido(s) do anexo i) nas situaes na interpretao 2; ou c)
produto ou lote (se amostra indicativa ou representativa, respectivamente) imprprio
para o consumo humano por apresentar (microrganismo patognico ou toxina que
cap.05
Nesse caso, significa que uma amostra indicativa pode apresentar um mximo
de 5x102 de coliformes 45 C por grama de especiarias ntegras e modas para que
seja considerado de acordo como os padres legais vigentes. Quando a amostra
for representativa, isso significa que foram coletadas cinco amostras e que, para
que o lote seja considerado de acordo com os padres legais vigentes, no mximo
duas delas (c) apresentam contagens entre 102 (m) e 5x102 UFC.g-1 (M) contagens de
coliformes a 45 C. As contagens desses microrganismos foram inferiores ou iguais
a 102 UFC.g-1, nas outras trs amostras.
264
Deve-se considerar, para auxlio ao diagnstico, a disponibilidade de informaes sobre anlises microscpicas realizadas nos alimentos envolvidos no surto.
Embora de execuo simples, essas tcnicas exigem analistas bem treinados e experientes. importante na elucidao do surto o conjunto de informaes envolvendo morfologia, agrupamento e caractersticas tintoriais, como colorao Gram
para clulas vegetativas e verde-malaquita, que permite determinar localizao e
tamanho de esporos bacterianos (Quadro 13).
Por exemplo, a constatao de bastonetes Gram-positivos e a presena simultnea de esporos centrais no intumescidos em determinado alimento pode auxiliar
a incriminao de Bacillus cereus. indcio de contaminao com Staphylococcus
aureus a constatao no alimento suspeito da presena de nmero elevado de cocos
em cacho Gram-positivo. No entanto, se a avaliao epidemiolgica fornece subsdios
para suspeitar-se de uma salmonelose, deve-se pesquisar na anlise microscpica a
ocorrncia de bastonetes curtos Gram-negativos, no formadores de esporos.
Concluso
A produo de alimentos com qualidades nutritivas e sensoriais e seguros sob
os aspectos fsico-qumicos e microbiolgicos envolve conhecimentos sobre fatores do crescimento microbiano associados com o processamento. Alm disso, os
profissionais da rea devem estar preparados para elucidar e diagnosticar possveis
de novos surtos.
265
cap.05
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06
1.
Introduo
2.
3.
4.
Referncias
1. Introduo
Os microrganismos surgiram em meio aquoso e, a partir desse ambiente, adaptaram-se tambm ao solo, ar, plantas, trato intestinal de homens e animais, pele de
manipuladores e, ainda, em lagos, lagoas, rios e mares, que constituem as fontes
primrias da contaminao dos alimentos. O controle de qualidade da gua para
qualquer uso na indstria de alimentos necessrio para evitar possveis riscos
sade dos consumidores dos produtos comercializados. Esse controle reduz efeitos
negativos que as caractersticas fsicas, qumicas e microbiolgicas da gua podem
provocar na indstria, como processos corrosivos, depsitos de matria orgnica
e sedimentos; alm de auxiliar a fabricao de alimentos que atendam aos critrios
de qualidade exigidos dos produtos industrializados. A gua pode ser usada como
um componente da formulao de um produto e participa de vrias etapas do processamento, alm de estar em contato com alimentos, equipamentos e utenslios e
ser usada para lavagem de mos e asseio pessoal.
A indstria de alimentos deve oferecer sua contribuio sociedade, no que
se refere utilizao racional da gua e, para tanto, tem de usar esse recurso natural renovvel, j considerado escasso, com conscincia, bom senso e tecnologia
adequada. Apenas a conscientizao para a economia pode reduzir em at 30 % o
gasto de gua no processamento de alimentos. Sabe-se que a atividade industrial
no Brasil onde esto inseridas as indstrias alimentcias consome 10 % da gua
total gasta pelos diversos setores (Figura 1). A atividade agrcola consome 70 %, e
o consumo humano utiliza os 20 % restantes. Do total da gua na Terra, apenas pequena parte, cerca de 1 % potvel ou pode ser potabilizada, encontrada em rios e
lagos, dentre outros. Alm disso, prev-se que a escassez de gua j constatada em
vrias regies da Terra se aprofunde e se estenda a outras reas nos prximos anos.
Em um ranking proposto por organizaes internacionais, baseado na pontuao
obtida no apenas em funo da quantidade disponvel, o Brasil ocupa a 50 posio
dentre 147 pases avaliados (Tabelas 1 e 2).
O Brasil que, a princpio, estaria classificado na 12 posio, considerando apenas a quantidade disponvel, no bem avaliado em relao, por exemplo, ao porcentual da populao que atendida com o fornecimento de gua potvel e com
273
cap.06
274
275
cap.06
Acerca da freqncia das anlises de gua, dois aspectos devem nortear essa
deciso: a exigncia da legislao e as especificidades de cada indstria, quando
deve prevalecer o conhecimento aliado ao bom senso dos tcnicos responsveis
pelo uso da gua.
A legislao atual prev a anlise de cerca de 90 parmetros que, sem dvida,
um nmero bastante elevado. As anlises propostas fundamentam-se em cinco
grupos principais (Tabela 7).
Tabela 7 - Grupos de anlises propostos para avaliar a qualidade da gua
As metodologias para anlises de gua so selecionadas de acordo com diversos fatores; dentre esses, podem-se citar: limite de deteco; preciso e rapidez;
equipamentos disponveis; nvel de treinamento de laboratoristas; custo da anlise;
e exigncias especficas de legislao. Aquelas usadas no Brasil fundamentam-se
em propostas de entidade de reconhecimento internacional, como APHA e AOAC
276
(American Oficial Analytical Chemist). Na Tabela 8, so mostrados os padres exigidos pela legislao brasileira para alguns parmetros das anlises
Tabela 8 - Alguns padres de qualidade exigidos pela Resoluo n 357, do Conselho Nacional
do Meio Ambiente (CONAMA), e Portaria n 518, do Ministrio da Sade, no que se refere aos
mananciais (para gua doce) e gua potvel, respectivamente)
277
cap.06
Tabela 9 - Concentraes mximas para algumas substncias qumicas na gua que representam risco sade
278
279
atmosfrico ou oriunda de material vegetal em decomposio e da atividade biolgica de microrganismos. O cido carbnico e os bicarbonatos - de sdio, clcio,
magnsio, ferro e mangans, dentre outros - presentes na gua formam um tampo.
Em pH prximo de 4,6, predomina o cido carbnico e, em pH prximo de 8,3,
prevalece o nion bicarbonato, de acordo com a metodologia analtica que usa os
indicadores fenolftalena e metilorange e a titulao com soluo de NaOH. Em virtude do tampo formado pelo cido carbnico e bicarbonatos, a gua pode apresentar
acidez e alcalinidade simultaneamente, dependendo do pH. Por exemplo, as guas
naturais da regio da Zona da Mata de Minas Gerais tm entre 5 e 20 mg.L-1 de acidez, expressa em CO2, e entre 10 e 50 mg.L-1 de alcalinidade, expressa em CaCO3.
Em gua com pH abaixo de 4,6, a acidez denominada mineral, devido presena de cidos minerais, provenientes provavelmente da poluio industrial ou do
metabolismo microbiano. De acordo com a legislao vigente, a gua considerada
potvel com pH entre 6 e 9,5, j a de um manancial ser considerada em condies
cap.06
caldeiras dever ter seu pH corrigido para valores entre 10,5 e 11,5, para evitar processos corrosivos ao ao carbono, constituinte de caldeiras.
A alcalinidade da gua ocorre em virtude da presena de bicarbonatos, carbonatos e hidrxidos de sdio, clcio, magnsio e ferro. Os bicarbonatos acontecem
quando a gua tem pH abaixo de 8,3. Outros tipos de sais responsveis pela alcalinidade so encontrados em gua com pH igual ou superior a 8,3. As guas potveis
no podem apresentar alcalinidade de hidrxido, cuja presena indica a ocorrncia
de poluio. exceo nesse caso para a gua de alimentao de caldeiras, cujo
pH deve ser corrigido para valores entre 10,5 e 11,5 com substncias alcalinas, de
forma a liberar uma alcalinidade custica entre 400 e 700 mg.L-1, expressa em OH-.
A alcalinidade apresenta relao com a dureza quando constituda de bicarbonatos, carbonatos e hidrxidos de clcio e de magnsio, que originam a dureza da
gua, causadora de uma srie de problemas para a indstria de alimentos. Plenamente aceitveis para gua potvel, em que concentraes de 500 mg.L-1 de dureza,
expressa em CaCO3, no apresenta significado sanitrio, a dureza pode ser responsvel por processos corrosivos e formao de incrustaes em diversas superfcies
e equipamentos de processamento de alimentos, particularmente em trocadores
de calor. Alm disso, as incrustaes diminuem o fluxo em tubulaes, reduzem a
transferncia de calor, por exemplo, provocando maior gasto de energia para a produo de vapor em caldeiras, alm de poderem causar contaminao microbiana de
alimentos com diversos microrganismos.
Na Tabela 11 so apresentados resultados de anlises fsicas e qumicas de
280
A turbidez variou entre 0,5 UT na gua filtrada e 91,5 na gua dos floculadores
do sistema de tratamento. O pH oscilou entre 6,9 e 8,6 na gua industrial e do sistema
de resfriamento de amnia, respectivamente. Em relao acidez, observou-se desde
ausncia na gua de resfriamento de amnia at 10,4 mg.L-1, expressos em CO2, na
amostra coletada no floculador. O vapor condensado apresentou o menor contedo de
alcalinidade, com 23,8 mg.L-1, expressos em CaCO3. A gua do sistema de resfriamento
da amnia, coletada na torre de resfriamento, tinha concentrao mais elevada com
231,7 mg.L-1. Quanto concentrao de cloretos, a gua mostrou o menor nvel, ou seja,
11,9 mg.L-1 de NaCl, e a gua do sistema resfriamento da amnia, o maior, atingindo
140,3 mg.L-1.
As anlises fsicas e qumicas das amostras coletadas no manancial encontram-se dentro dos padres propostos pela Resoluo n 357, do Conselho Nacional
do Meio Ambiente (CONAMA), de 2005. Da mesma forma, as caractersticas da gua
industrial atenderam Portaria n 518, do Ministrio da Sade, de 2004.
Na Tabela 12 so apresentadas as anlises fsicas e qumicas da gua usada em
cinco microindstrias de laticnios, ressaltando-se que estas necessitavam de subsdios tecnolgicos para produo de alimentos com melhor qualidade. O conhecimento das condies higinicas de processamento nesses pequenos estabelecimentos
uma das maneiras de buscar a produo de leite e derivados com melhor qualidade
281
As cinco microindstrias de laticnios avaliadas poca da pesquisa no tinham Selo de Inspeo Municipal e foram codificadas como A, B, C, D e E. A quali-
cap.06
Em 20 % das amostras de gua analisadas quanto a coliformes totais nos sistemas de distribuio, exige-se que seja realizada a contagem de bactrias heterotrfi-
283
284
diarria, vmitos e dores abdominais, geralmente sendo necessria a hospitalizao. A invaso de outros tecidos e rgos tambm pode ocorrer. A grande
particularidade desse protozorio, que o torna to importante para questes de
sade pblica, corresponde sua resistncia clorao.
Considera-se que as etapas de floculao, sedimentao e filtrao sejam
eficientes na eliminao desse agente, porm, quando essas fases so realizadas de forma inadequada, esses protozorios podem chegar ao homem. O surto
mais divulgado pela literatura ocorreu em Milwaukee, EUA, em 1993, acometendo 403.000 pessoas, em razo do consumo de gua contaminada, levando 104
pessoas HIV positivos a bito. O surto ocorreu devido a processos inadequados de remoo de oocistos durante as etapas de coagulao/sedimentao no
tratamento da gua. O surto, alm dos danos provocados sade de milhares
de consumidores, ainda acarretou grandes prejuzos s empresas de alimentos
locais, principalmente as produtoras de bebidas. Esse protozorio suscetvel ao
oznio, radiao UV e ao tratamento trmico de 71,7 C por 15 seg.
Os protozorios deste gnero, responsveis por distrbio denominado giardase, so os mais isolados no mundo, sendo estimados, aproximadamente, 2,5 milhes
de casos, por ano, nos EUA. O cistos, estruturas de resistncia a agentes qumicos,
depois de ingeridos liberam os tropozodeos, estgio reprodutivo, no duodeno, onde
estes se multiplicam assexuadamente, colonizando rapidamente o intestino delgado
e liberando oocistos nas fezes. Os sintomas mais freqentes so diarria, flatulncia e
inchao no abdmen, em razo de danos provocados na mucosa intestinal. A dose
infectiva pode variar de 10-100 cistos. O perodo de incubao normalmente varia
de uma e duas semanas, podendo a doena prevalecer por at cinco dias. Assim
como Cryptosporidium sp., microrganismos pertencentes a esse gnero tambm
so resistentes clorao, sendo as etapas de floculao, sedimentao e filtrao
eficientes na reduo desses agentes. Caso a gua utilizada no receba qualquer
tratamento, recomenda-se ferv-la por pelo menos 1 min, sendo o tratamento de
71,5 C por 15 seg j suficiente para eliminar oocistos. Esse protozorio suscetvel
a sanitizantes base de fenol.
Cyclospora sp.
Embora existam muitas espcies neste gnero, apenas C. cayetanensis tem
sido associado ao homem, sendo reconhecido como patgeno desde 1977. Seu
ciclo de vida ainda no est totalmente esclarecido, mas j se sabe que esses protozorios se multiplicam nas clulas do intestino delgado, culminando com a liberao
de oocistos nas fezes. O perodo de incubao varia de 2 a11 dias, podendo a doena se estender por duas semanas. Os sintomas incluem diarria no-sanguinolenta,
perda de apetite e peso, clica estomacal, nusea, vmito, fadiga e febre. Poucos
estudos tm sido desenvolvidos para determinar o comportamento desses protozorios diante de agentes de desinfeco, assim pouco se sabe sobre sua resistncia
ao cloro nos nveis usados no tratamento da gua.
285
Toxoplasma gondii
A toxoplasmose uma zoonose, ou seja, doena transmitida entre animais
e homens, sendo os felinos os hospedeiros primrios. Dentre os hospedeiros secundrios, incluem-se outros vertebrados, como roedores, bem como bovinos e
outros animais relacionados produo animal. Quando os oocistos so ingeridos
por esses hospedeiros, ocorre a liberao de esporozodeos que se multiplicam assexuadamente, colonizando rapidamente o intestino delgado. Esses esporozodeos
podem invadir outros tecidos e rgos do corpo do hospedeiro, via sistemas circulatrio e linftico, ocorrendo a formao de cistos nos tecidos. A ingesto de tecidos
infectados pode desencadear um mecanismo infectivo semelhante ingesto de
oocistos, como ocorre, por exemplo, no consumo de carne contaminada. A infeco
pode ser sintomtica ou assintomtica, sendo o inchao das glndulas linfticas,
cap.06
Com relao aos protozorios, faz-se necessrio conhecer aspectos fisiolgicos, virulncia, viabilidade e sobrevivncia desses patgenos a tratamentos empregados na indstria de alimentos e a qualidade dos suprimentos de gua para que
estratgias de controle sejam traadas. Porm, os aspectos biolgicos e ecolgicos
complexos, como ciclo de vida e os cistos altamente resistentes apresentados por
Cryptosporidium spp., Giardia spp. e Cyclospora spp. dificultam sua preveno e
controle. Associadas a essas questes, ainda existem as dificuldades impostas pela
carncia de tcnicas de anlises apropriadas e padronizadas para deteco e enumerao desses agentes.
286
As tcnicas de controle incluem preocupao com a sanidade animal, qualidade da gua empregada na produo e irrigao; adoo de tcnicas adequadas de
higiene na produo e processamento de alimentos; ateno a todas as etapas do
tratamento convencional da gua, tanto aquela a ser utilizada na produo primria
e na indstria, bem como em atividades recreacionais e, se possvel, introduzir etapas que podem reduzir esses agentes; e manejo adequado de resduos (esgoto), de
forma a minimizar a disseminao de oocistos no ambiente.
Cianobactrias
287
Na Tabela 15 so apresentadas as contagens de aerbios mesfilos e coliformes totais nas microindstrias de laticnios j mencionadas. Verificou-se, pelos
resultados, que pelo menos uma das anlises para mesfilos aerbios efetuadas
nas microindstrias A, B e C apresentou contagens acima de 500 UFC.mL-1, limite
mximo recomendado pela legislao. Todas as anlises nas microindstrias A, B,
E e uma anlise da C apresentaram coliformes totais acima de 3 NMP.100 mL-1. A
microindstria D utilizava gua do sistema de abastecimento municipal, apresentando, assim, os melhores resultados microbiolgicos. Esses resultados indicaram a
necessidade de clorao da gua, que deve apresentar nveis entre 0,2 e 1,0 mg.L-1
de cloro residual livre na gua de consumo humano e, principalmente, entre 4 e 8
mg.L-1 de cloro residual livre para uso geral nas indstrias.
Tabela 15 - Caractersticas microbiolgicas da gua das microindstrias de laticnios
288
A gua, quando no adequadamente clorada, veicula grande nmero de microrganismos alteradores ou patognicos. Dentre os alteradores, encontram-se
espcies psicrotrficas dos gneros Pseudomonas, Aeromonas, Alcaligenes,
Flavobacterium e Achromobacter. As espcies P. aeruginosa e P. fluorescens e
A. hydrophila so exemplos de microrganismos formadores de limosidades em
superfcies usadas no processamento de alimentos capazes de aderir e formar
biofilmes. Tambm, espcies esporulantes dos gneros Bacillus e Clostridium
podem ser veiculadas pela gua. J as espcies C. tyrobutiricum e B. coagulans
so alteradoras e responsveis pelo estufamento tardio de queijo e pela coagulao do leite UAT, respectivamente. Dentre as alteradoras, incluem-se ainda as
uma srie de cidos orgnicos nos alimentos; e E. aerogenes, causadora do estufamento precoce de queijo. Outro grupo de microrganismos que podem ser
veiculado pela gua so espcies do gnero Enterococcus, representado por E.
faecium, microrganismo que apresenta estirpes psicrotrficas, acidificantes de
leite e resistentes ao tratamento trmico de 65 C por 30 min.
Vrios microrganismos patognicos em suas formas vegetativas ou esporulantes so veiculados pelas gua. Os alimentos podem ser contaminados com
Clostridium botulinum, Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Staphylococcus
aureus, Salmonella Typhi, Salmonella paratyphi, Yersinia enterocolitica, Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Escherichia coli H7: O157 e Vibrio
cholerae, dentre outros.
interessante, portanto, observar a importncia do tratamento correto da
gua e do controle do processo de desinfeco ou, mais especificamente, do processo de clorao.
289
A sedimentao simples ocorre nos mananciais onde h melhoria na qualidade da gua, ocorrendo a deposio de partculas mais pesadas, em virtude
do processo de decantao e reduo no nmero de microrganismos aderidos
s partculas responsveis pela turbidez. Tambm, nas lagoas, nos rios e lagos,
ocorre um efeito bactericida da radiao ultravioleta emitida pelo sol que, dependendo da turbidez da gua, capaz de penetrar a certas profundidades
cap.06
Nesse processo de sedimentao, partculas muito pequenas poderiam demorar anos para se depositarem at atingir valores menores de 1 UT de turbidez.
Por isso, a etapa de sedimentao com agentes coagulantes fundamental para
obter gua com a qualidade que se deseja na indstria de alimentos. Normalmente
so utilizadas substncias qumicas que formam hidrxidos em soluo aquosa,
principalmente originrios de sulfatos de alumnio ou de ferro. O hidrxido formado tem carga eltrica positiva e adsorve as partculas negativas responsveis pela
turbidez, cor, sabor e odor (Reaes Qumicas 1), resultando no aumento do di-
Figura 2 - Etapas de um tratamento convencional de gua: a), b), c) vistas de um manancial, d) mistura
rpida dos agentes de floculao, e) floculao, f)-decantao, g) filtrao e h) tanque de clorao por
contato.
Equao 1 - Lei de Stokes que determina a velocidade de sedimentao das partculas na gua
em razo de vrios fatores
A ao de agentes coagulantes ocorre nos floculadores, havendo, inicialmente, uma mistura rpida entre a gua e o agente qumico, que obtida pelo
aumento da velocidade da gua, e, em seguida, essa velocidade diminuda para
que haja formao adequada dos flculos, o que acontece geralmente no ltimo
floculador. Na seqncia, a gua transferida para o decantador, onde os flculos
se depositam antes do processo de filtrao. A etapa de floculao simulada no
laboratrio, para determinar a quantidade de agente qumico a ser adicionada
gua. Essa simulao efetuada pelo Teste do Jarro, que consiste em adicionar
certas concentraes da substncia floculante e, com o auxlio da anlise de turbidez, determinar qual quantidade do floculante origina flculos adequados tanto
no aspecto tcnico quanto econmico.
291
cap.06
sncia por 100 mL, para coliformes totais na estao de tratamento e <2 NMP.100
mL-1 para coliformes fecais ou termotolerantes a 45 C, em pontos do sistema de
distribuio. Para a anlise, aplicada a tcnica do Nmero Mais Provvel (NMP)
em trs sries de cinco tubos, sendo utilizados volumes de 10 mL, 1,0 mL e 0,1 mL
da amostra. Podem ser usados vrios meios de cultura, por exemplo Caldo Verde
Brilhante para coliformes totais e Caldo EC para coliformes termotolerantes, com
incubao a 37 e 45 C, respectivamente.
Aps a incubao, determina-se o que se denomina nmero-chave, que
consiste dos tubos positivos - produo de gs nos tubos de Durham - em cada
srie. Com base no nmero-chave, determina-se o NMP.100 mL-1 por meio de
uma tabela apropriada. Por exemplo, se o nmero-chave for 521, a contagem de
coliformes ser de 70 NMP.100 mL-1, de acordo com tabela prpria. Geralmente,
o processo de desinfeco atinge seus objetivos quando a gua contiver entre
0,2 e 1,0 mg.L-1 de CRL.
293
cap.06
Figura 4 - Caldeira flamotubular, lenha e de baixa de presso, de uso comum na indstria de alimentos.
Figura 5 - a), b), c) Incrustaes minerais em caldeiras; d) Vlvula para controle de purga; e) Realizao
de uma purga.
295
cap.06
297
cap.06
Teores de cloro entre 5 e 10 mg.L-1 de CRL so utilizados para a gua de resfriamento de produtos enlatados esterilizados, como leite condensado, milho verde e
ervilhas. Aps o tratamento trmico, esses alimentos devem ser resfriados da maneira mais rpida possvel, para temperatura ambiente, e no podem permanecer
temperatura prxima de 50 C por tempo prolongado, uma vez que favorece o desenvolvimento de microrganismos termoflicos esporulantes que, geralmente, so
aqueles que sobrevivem ao tratamento da esterilizao comercial. Particularmente,
naquelas embalagens com espao vazio na parte superior h formao de vcuo
alm do cloro, e ser muito menos reativo com matria orgnica. No entanto, esse
composto apresenta dificuldades operacionais, pois deve ser gerado no prprio local de uso, por meio de equipamentos especiais, pela mistura controlada de clorito
de sdio (NaClO2) e cido sulfrico (H2SO4) ou cloro gs mais clorito de sdio. Isso
significa que h necessidade de treinamento dos operadores, para evitar acidentes
de trabalho e ensin-los a usar corretamente as solues geradas. Atualmente, encontram-se disponveis comercialmente solues estabilizadas de dixido de cloro.
Tabela 20 - Formao de tri-halometanos na gua aps a desinfeco com Cl2
299
As cloraminas orgnicas so bastante estveis ao armazenamento, so comercializadas na forma de p e pouco reativas com matria orgnica. As principais
cap.06
300
cloro residual total. Na seqncia, por meio de clculos matemticos, determinase a concentrao de cloro residual total, expressa em mg.L-1 de CRT, em Cl2. Por
exemplo, o hipoclorito de sdio comercial de uso comum na indstria de alimentos
geralmente contm 10 % de cloro residual total.
A concentrao de cloro residual livre o somatrio das concentraes de cido hipocloroso e do on hipoclorito. Esse tipo de cloro determinado por diferentes
mtodos nas estaes de tratamento de gua; dentre eles, incluem-se os testes da
ortotolidina e do DPD. A ortotolidina, suspeita de causar danos sade humana, tem
sido substituda pelo DPD. Por exemplo, determinada estao de tratamento de gua libera ao consumo gua contendo entre 0,8 e 1,0 mg.L-1 de cloro residual livre, expresso
em Cl2. Aps a desinfeco, a gua tratada na estao deve conter um teor mnimo de
cloro residual livre de 0,5 mg.L-1, sendo obrigatria a manuteno de, no mnimo, 0,2
mg.L-1 em qualquer ponto da rede de distribuio, recomendando-se que a clorao
seja realizada em pH inferior a 8,0 e tempo de contato mnimo de 30 min.
No existe mtodo de laboratrio que determine a concentrao de cido hipocloroso na gua. Essa determinao muito importante, uma vez que o cido
hipocloroso, forma no dissociada, o responsvel pela atividade bactericida dos agentes clorados. A forma no dissociada cerca de 80 vezes mais bactericida do que a
dissociada. Por meio da equao de Henderson-Hasselblach, possvel determinar a
concentrao do cido hipocloroso na gua (reaes qumicas 4 e Equao 2). Para
isso, necessrio que se conheam a concentrao de cloro residual livre e o pH da
gua. Por exemplo, uma gua contendo 0,8 mg.L-1 de cloro residual livre com um pH
de 7,5 tem 0,4 mg.L-1 de cido hipocloroso. Da mesma forma, se o pH da gua for 8,5
301
cap.06
O acido hipocloroso capaz de atravessar a membrana celular dos microrganismos e, no citoplasma, inativar enzimas da via glicoltica, pela reduo de grupos
SH de aminocidos constituintes dessas enzimas. Essa tem sido a teoria mais aceita
para a ao antimicrobiana do cloro. No entanto, outras possibilidades para o mecanismo de ao desse agente sanitizante so mencionadas. Por exemplo, a reao do
cido hipocloroso com compostos nitrogenados da parede celular ou da membrana
celular, ou de ambos, formando substncias cloro-nitrogenadas txicas s clulas.
Dependendo da concentrao e do pH, as solues cloradas podem ser esporicidas, e, para isso, o cido hipocloroso deve alterar a permeabilidade da capa
do esporo, que contm cerca de 15 % de cistena em sua composio, aminocido
responsvel pela resistncia da capa ao cloro, pois confere a essa camada do esporo uma estrutura semelhante ao fio de cabelo ou queratina de insetos. No entanto,
o esporo perde essa resistncia a partir do momento em que o cido hipocloroso
consegue romper a capa, naturalmente em outros pontos dela, onde no est presente a cistena. H duas teorias que tentam explicar como o cloro inativa o esporo
bacteriano. Em uma delas, afirma-se que, aps o rompimento da capa, o esporo
absorve gua e nutrientes, germina, e o cloro elimina o esporo germinado, que j
no apresenta resistncia ao agente qumico. Em outra, tem-se que, aps a alterao da permeabilidade da capa, o cloro oxidaria as demais camadas constituintes
do esporo at atingir o protoplasma, onde se encontram DNA, RNA, ribossomos e
enzimas essenciais transformao do esporo em clula vegetativa.
Um experimento comparou a resistncia de formas vegetativas e esporuladas
302
de Bacillus subtilis, s solues cloradas, contendo 100 mg.L-1 de cloro residual livre,
em pH 9,8, temperatura de 25 C. Observou-se que o tempo para que a populao
de clulas vegetativas do microrganismo reduzisse em um ciclo logartmico foi de 6
seg. J nos esporos, esse tempo foi de 88 min, ou seja, 5.280 seg, que corresponde
a uma resistncia 880 vezes maior. No experimento, constatou-se que a fase que
corresponde ao tempo necessrio para que o agente qumico rompesse a capa do
esporo foi de 60 min. Solues com pH 7,0 reduziram em um ciclo logartmico a
populao dos esporos em apenas 30 segundos, com uma fase lag de 15 seg. Isso
mostra a importncia do pH das solues cloradas na rotina de sanitizao de uma
indstria de alimentos, particularmente quando se deseja eliminar esporos bacterianos alm de clulas vegetativas.
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07
1.
Introduo
2.
3.
4.
Referncias
1. Introduo
O ambiente em uma indstria de alimentos, dependendo das condies higinicas e do tempo em que o produto permanece exposto, pode contamin-lo.
Superfcies de contato com alimentos e equipamentos sempre foram consideradas as fontes importantes de contaminao de produtos alimentcios. Entretanto,
o estgio atual do desenvolvimento de equipamentos para processamento de
alimentos e de instalao industriais permite uma higienizao eficiente. A contaminao por microrganismos transportados pelo ar do ambiente de processamento tem sido constatada.
Na indstria, o ar pode entrar em contato com produtos alimentcios durante
as diversas etapas de manipulao, armazenagem, processamento e embalagem.
Deve-se atentar possibilidade da contaminao dos produtos alimentcios com
microrganismos patognicos e, ou, alteradores provenientes do ar, comprometendo a segurana alimentar; alm disso, a vida-de-prateleira e a qualidade do
alimento tambm podem ser afetadas.
A busca do aumento da vida de prateleira tem levado a uma preocupao
maior com a qualidade microbiolgica do ar dos ambientes de processamento
na indstria de laticnios, por exemplo, considerando que mesmo se presentes
em baixo nmero, os microrganismos oriundos do ar podem causar deteriorao.
Uma pesquisa mostrou correlao elevada (r=0,86) entre o nmero de microrganismos presentes no ar ambiental na rea de embalagem de leite e o nmero de
microrganismos contaminantes do produto final. Calculou-se que durante 60 seg
306
gua corre para dentro destes, respinga ou forma bolhas. A quantidade de partculas viveis detectada na contagem de bactrias transportadas pelo ar reduz
proporcionalmente com o nmero de vezes em que os drenos so usados. Essa
relao indica que a populao microbiana que cresce nos produtos slidos do
interior dos drenos forma aerossis que so contaminados pelo deslocamento do
ar devido ao fluxo de gua.
O sistema de ventilao, quanto presentes nas plantas de processamento,
pode contribuir para a contaminao microbiolgica do ar. Para que se obtenha
um design ou manuteno adequada desse sistema, deve-se conhecer o movimento do ar atravs da fbrica, assim como a difuso das partculas pelo ar. Um
sistema de ventilao eficiente pode, no entanto, auxiliar o controle de microrganismos do ambiente, contribuindo para a melhor qualidade microbiolgica do ar,
da temperatura ambiental e da umidade relativa do ambiente.
Em muitas situaes, a contaminao de produtos por bioaerossis ocorre em virtude do transporte de microrganismos de reas adjacentes na linha de
processamento; transporte esse que depende de um gradiente de concentrao
307
cap.07
309
cap.07
Para as determinaes dos grupos de microrganismos analisados so utilizadas placas de Petri de 90 mm de dimetro, contendo 20 mL dos respectivos
meios de cultura, conforme recomendaes da APHA (1992). Durante a coleta de
amostras, a tampa do amostrador pr-autoclavada (121 C por 15 min) sanitizada, usando-se algodo umidecido com lcool etlico 70 %, no intervalo de cada
amostragem. Aps cada coleta, as placas removidas do amostrador so tampadas, invertidas e incubadas sob condies ideais para cada determinao, sendo
30 C/3-5 dias para fungos filamentosos e leveduras e 35 C/48 h para mesfilos
aerbios (APHA, 1992). A contagem de UFC corrigida por meio de uma tabela
desenvolvida com base em probabilidade estatstica:
Essa correo mostra que, quanto maior o nmero de partculas viveis impressas na placa, menor a probabilidade de as prximas partculas passarem em
orifcios vazios, subestimando a contagem. Dessa forma, o nmero de UFC por volume de ar em m3 pde ser determinado:
Compensando fatores como influncia do fluxo de ar, volume de gar e dimenso da placa, o amostrador fornece resultados corretos e precisos, sendo classificado pela 16 edio do Standard Methods for the Examination of Dairy Products
como mtodo Classe B.
310
311
Um programa de monitoramento da qualidade do ar pode ser aplicado em plantas de processamento de laticnios, com a finalidade de controlar patgenos e aumentar a vida de prateleira dos produtos. Um acrscimo de sete dias na vida de prateleira
de leite pasteurizado foi obtido com o uso de um sistema assptico de embalagem
que elimina o risco de contaminao por microrganismos transportados pelo ar.
A seguir so descritos alguns trabalhos que envolvem avaliaes microbiolgicas do ar em estabelecimentos produtores de alimentos.
312
UANs foi avaliado pela tcnica de sedimentao simples. Em razo das exigncias
de qualidade microbiolgica dos ambientes, as UANs foram enquadradas na classe
menos exigente, conforme recomendao da APHA.
Verificou-se, em relao aos mesfilos aerbios, que apenas 18,5 % dos ambientes avaliados encontravam-se corretamente higienizados. Usando essa mesma
recomendao para fungos filamentosos e leveduras, constatou-se que 32,28 % dos
ambientes apresentavam condies satisfatrias de higiene (Figura 4).
Figura 4 - Porcentuais de ambientes com contagens de mesfilos aerbios e de fungos e leveduras dentro
da recomendao da APHA (at 30 UFC.cm-2.semana-1).
Muitas vezes, essa recomendao americana considerada rgida pelos restaurantes brasileiros. As recomendaes da APHA ou da OMS (Organizao Mundial
313
de Sade) devem ser utilizadas apenas como referncia, pois de se esperar que,
dentre as UANs nacionais, encontram-se aquelas que trabalham dentro de condies preconizadas pela APHA e tambm muitas outras, provavelmente a maioria,
que no atendem s recomendaes adotadas nos Estados Unidos.
Um procedimento de higienizao pode ser considerado inadequado ou aceitvel se o nmero de bactrias de interesse ultrapassar ou no determinado limite.
O smbolo m usado para representar esse limite, como uma linha que divide um
processo considerado bom e outro de qualidade insatisfatria, e os valores de m
devem ser consistentes com as Boas Prticas de Processamento (BPP) e determinados de acordo com a importncia atribuda ao microrganismo. J o smbolo M
igual ao menor valor capaz de causar prejuzos sade ou problemas relacionados
higiene na indstria de alimentos.
Existem diferentes sugestes para se determinar um valor para m. Uma
cap.07
314
(pontuao mxima), ou seja, um porcentual de 70 %, o restaurante seria classificado dentro das BPF. Esse porcentual foi estabelecido considerando-se simulaes
feitas ao se usar questionrios que obtiveram valores iguais ou superiores a 70 %
em restaurantes comprovadamente operando em Boas Prticas de Processamento.
Para a determinao do valor m, a terceira estratgia foi escolhida, pois as
outras metodologias forneciam valores irreais, muito baixos ou elevados, para serem
tidos como especificaes microbiolgicas recomendadas. Os valores de m, expressos em UFC.cm-2.semana-1, determinados para os ambientes refrigerados, em relao a microrganismos mesfilos aerbios e fungos filamentosos e leveduras, foram,
respectivamente, 80 e 50 e para os no-refrigerados, 250 e 100 (SILVA, 1996).
Esses valores foram utilizados para avaliar e classificar as condies de higiene
das 12 UANs avaliadas. Quanto aos mesfilos aerbios, constatou-se que 32,3 % dos
ambientes refrigerados e 24,3 % dos no-refrigerados apresentaram contagens acima
dos valores de m sugeridos, o que significa condies higinicas insatisfatrias.
Uma interpretao das contagens encontradas em relao ao valor m foi proposta por Silva (1996), conforme Quadro 5.
Quadro 5 - Interpretao dos resultados das contagens de mesfilos aerbios no ar de ambientes de processamento de alimentos
Quadro 4 - Valores de m propostos para ar de ambientes em unidade de alimentao e nutrio, usando-se o mtodo da sedimentao em placas
315
alimentos so variadas, mas com limites mximos de uso preconizados pelos fabricantes (Quadro 6). Esses limites, segundo os prprios fabricantes, ainda carecem
de base cientfica slida, tendo sido realizados apenas alguns estudos internos e
empricos de sua eficcia.
Quadro 6 - Concentraes para uso, sugeridas para alguns agentes qumicos para desinfeco
do ar de ambientes na indstria de alimentos
Em um trabalho realizado em uma indstria de laticnios de porte mdio, avaliou-se a microbiota do ar de seis ambientes de processamento: i) recepo de leite
cru, ii) embalagem de leite, iii) pasteurizao de leite, iv) processamento de queijo, v)
processamento de iogurte e vi) processamento de doce de leite e manteiga. Foram
utilizadas as tcnicas da impresso em gar e da sedimentao em placas. Avaliouse, ainda, a eficincia de solues diludas de sanitizantes base de digluconato de
clorohexidina, de cido peractico e de quaternrio de amnia, pulverizadas no ar
a uma presso de 9 kgf.cm-2, temperatura entre 20 C e 25 C . Simultaneamente
coleta de amostras, tambm foram medidas a temperatura ambiente e a umidade
relativa do ar de cada local de amostragem.
316
das na literatura (KANG; FRANK, 1989). Esses autores sugeriram de 180 a 360 UFC.
m-3 de ar para microrganismos mesfilos aerbios e de 70 a 430 UFC.m-3 para fungos
filamentosos e leveduras, dependendo do ambiente de processamento. Outros autores recomendaram contagens menores que 200 UFC.m-3 para salas de embalagem de
produtos lcteos e menores que 1.400 UFC.m-3 de ar para plantas de processamento
de sorvete. Neste trabalho, realizado em laticnios, adotaram-se para comparao os
valores recomendados pela APHA.
Quadro 7 - Faixa de contagem, mdias e desvio-padro de fungos filamentosos e leveduras e
de microrganismos mesfilos aerbios, em UFC.m-3, no ar de ambientes de processamento de
uma planta de laticnios, pela tcnica de impresso em gar
317
de empacotamento assptico.
318
319
Apesar de haver dados na literatura sobre a influncia da temperatura no aumento da microbiota do ar, neste experimento parece que no houve essa relao
entre as contagens obtidas, em razo da variabilidade das condies de anlise. A
influncia da umidade relativa nas contagens obtidas neste trabalho pode ser explicada pela maior facilidade de as clulas microbianas permanecerem viveis em
aerossis na presena de maiores teores de umidade.
As tcnicas de anlise foram comparadas com base na relao de 1:3
estabelecida entre as recomendaes da APHA de 30 UFC.cm -2.semana-1 e de
90 UFC.m -3 de ar. Pela tcnica da impresso em gar, houve contagens que
variaram de 5 a 10 e de 2 a 10 vezes mais, respectivamente, que as obtidas por
sedimentao, evidenciando-se a maior capacidade da tcnica de impresso
cap.07
Essa menor capacidade da tcnica de sedimentao em recuperar microrganismos do ar pode ser explicada pela necessidade de certo tempo de exposio,
para deposio das partculas nas placas de Petri. Da mesma forma, a dimenso
dos esporos tambm influencia a deposio. Diversos gneros de fungo foram listados e classificados em trs categorias, quanto s suas dimenses: esporos maiores
(Alternaria, Stemphilium, Epicoccum, Nigrospora, Diplospora, Monotospora e Sepedonium); esporos intermedirios (M. sitophilia, Geotrichum, Cndida, Pullularia,
Saccharomyces, Aspergillus, Hormodendrum e Penicillium); e esporos menores
(Ustilago, Rhodotorula, Rhizopus, Oospora, Gliocladium, Paecilomyces, Hemispora
e Streptocyces). Analisados pelas tcnicas de sedimentao simples e impresso
em gar, para esporos maiores, intermedirios e menores, as relaes encontradas
entre as duas tcnicas foram de aproximadamente 1:5, 1:14; e 1:19, respectivamente. Portanto, quanto menor a dimenso do esporo, mais visvel a diferena entre as
duas tcnicas e a superioridade da tcnica de impresso em gar.
O tempo de anlise requerido tambm um fator importante para a comparao das tcnicas, pois a sedimentao exige tempo maior de exposio das placas
de Petri ao ar ambiente. Perodo longo de exposio dessas placas pode resultar
em ressecamento do meio de cultura, dificultando o crescimento das colnias e subestimando as contagens. Na tcnica de impresso em gar, embora o ar que entra
no amostrador seja considerado seco, a umidade dentro do amostrador aumenta
rapidamente, no permitindo o ressecamento do meio de cultura. Em um estudo,
essa umidade do ar era de 23 % antes de entrar no amostrador e passou para 39 %
dentro deste, ficando tambm evidenciado que a passagem do ar pelo amostrador,
320
Para avaliao da eficincia dos sanitizantes, foram realizadas anlises de microrganismos mesfilos aerbios e fungos filamentosos e leveduras presentes no
ar. Neutralizantes para os sanitizantes aplicados e avaliados foram adicionados aos
meios PCA e PDA, para inibir a interferncia dos sanitizantes nas anlises, de acordo
com as recomendaes usuais (Quadro 10).
321
Esses grupos de microrganismos foram determinados em quatro tempos distintos: antes da aplicao, aps 30 min, 12 e 24 h, pelas tcnicas de sedimentao e
impresso em gar. Assim, aps realizar a anlise no tempo zero (T0), a aplicao
foi feita aps o expediente, s 17 h, com trmino at as 17 h 30; o tempo um (T1)
foi analisado s 18 h, o tempo dois (T2) s 5 h 30 do dia seguinte e, finalmente, o
cap.07
Em razo dos resultados e de informaes da literatura, considerou-se neste trabalho que houve ao antimicrobiana do sanitizante quando a reduo das
contagens microbianas foi de pelo menos 15 % em duas das trs aplicaes do
agente qumico, 30 min aps a pulverizao ambiental. Considerou-se, ainda, que a
soluo sanitizante apresentou efeito residual quando ocorreram redues de pelo
menos 10 % nas contagens determinadas antes da pulverizao, da primeira para a
segunda aplicao e da segunda para a terceira aplicao. O uso de sanitizantes foi
avaliado nos diferentes tempos de anlise do ar dos ambientes: To, antes, e T1, T2 e
T3 respectivamente, 30 min, 12 e 24 h depois da pulverizao.
Nas aplicaes de digluconato de clorohexidina a 2.000 mg.L-1 e de quaternrio de
amnia a 700 mg.L-1, foi observada a ao antimicrobiana da soluo sanitizante contra
fungos filamentosos e leveduras. Contra microrganismos mesfilos aerbios, foi constatada a ao antimicrobiana de cido peractico a 45 mg.L-1 (Quadro 11). Nas aplicaes
de digluconato de clorohexidina a 1.000 mg.L-1, foi constatado efeito residual contra fungos filamentosos e leveduras. Constatou-se, tambm, efeito residual da aplicao de
cido peractico a 75 mg.L-1, contra fungos filamentosos e leveduras (Quadro 12).
Quadro 11 - Log10 UFC.m-3 de fungos filamentosos e leveduras e mesfilos aerbios antes da
aplicao do sanitizante (T0) e aps 30 min de aplicao (T1) e a porcentagem de diminuio (-)
ou aumento (+) aps a pulverizao do sanitizante no ar de ambiente de processamento em
um laticnio
323
cap.07
com 1,0 g.m-3 de ar duas semanas depois, houve reduo de 15 % nas contagens;
aps mais cinco tratamentos, a reduo passou para 23-25 %. Nessa indstria de laticnios, a contaminao da manteiga que vinha ocorrendo em torno de 1.200 esporos
de fungos por grama foi completamente controlada; redues essas compatveis com
as encontradas no experimento ora citado.
As contagens de 12 e 24 h aps a aplicao das solues sanitizantes (T2 e T3)
apresentaram nmeros elevados em relao aos outros tempos de anlise, uma
explicao para essas maiores contagens seria a variabilidade das condies de
anlise, que nem sempre puderam ser controladas nos ambientes, principalmente
nesses tempos.
Com base nos resultados deste estudo, sugere-se a avaliao, pela tcnica da
impresso em gar, da aplicao de sanitizantes por perodos mais longos, fazendose o rodzio de agentes qumicos e realizando, ainda, a associao da pulverizao
desses agentes com o controle de fontes na indstria que possam contribuir para a
contaminao do ar.
324
As amostras para avaliao da qualidade microbiolgica do ar foram coletadas em oito ambientes distintos de uma indstria de processamento de carnes:
setor de cozimento, setor de embutimento de lingia, setor de embutimento, setor de embalagem, sala do cutter, setor de preparo de massas, setor de produtos
especiais e sala de pesagem.
Os resultados obtidos pelas tcnicas de sedimentao simples e de impresso
em gar foram comparados usando-se a relao na recomendao da APHA (1992):
de 3 UFC da tcnica de impresso em gar, para 1 UFC da tcnica de sedimentao
simples, e, com os resultados transformados, as duas tcnicas foram comparadas.
Figura 5 - Porcentagem de mesfilos aerbios e fungos filamentosos e leveduras dentro e fora do padro
proposto pela APHA, por meio da tcnica de sedimentao simples.
325
filamentosos e leveduras.
Quadro 15 - Mesfilos aerbios (UFC.m-3) no ar de ambientes de processamento em uma
indstria de crneos
cap.07
326
O ambiente de processamento apresentou contagem de microrganismos mesfilos aerbios e fungos filamentosos e leveduras superiores ao recomendado pela APHA.
Deve-se salientar, porm, que a coleta foi feita com a indstria em processamento, o
que pode ter elevado o nmero de microrganismos presentes no ambiente analisado.
327
cap.07
328
329
Observou-se pelo Quadro 21 que houve a predominncia de fungos filamentosos e leveduras nos ambientes, que se caracterizam por serem microrganismos
Gram-positivos. Na cmara de maturao de queijo e de salga de queijo contatou-se
a presena de bactrias Gram-positivas e Gram-negativas; no entanto, as bactrias
cap.07
Assim, conclui-se que, de forma geral, o ar das cmaras de resfriamento encontrava-se em condies higinicas inadequadas para o processamento e armazenamento de alimentos, apresentando contagens microbianas acima das recomendaes da APHA, para as tcnicas de impresso em gar e sedimentao em placas.
A tcnica de impresso em gar recuperou maior nmero de microrganismos
do ar dos ambientes, a microbiota era constituda principalmente de fungos filamentosos e leveduras, e a maioria das bactrias isoladas era Gram-positiva.
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08
1.
Introduo
1.1. Mtodo do swab
1.2. Mtodo da Rinsagem
1.3. Mtodo da Placa de Contato
1.4. Mtodo da Seringa com gar
1.5. Mtodo da Esponja
2.
3.
Referncias
1. Introduo
A implementao dos Procedimentos Operacionais (POP) deve ser avaliada
periodicamente, de forma a garantir uma produo segura de alimentos. Para isso,
preciso adotar medidas corretivas, em casos de desvios desses procedimentos,
evitando colocar em risco a sade dos consumidores, pela veiculao de microrganismos patognicos. imprescindvel, portanto, controlar e monitorar a contaminao, a multiplicao e a sobrevivncia microbiana nos produtos, superfcies,
equipamentos, utenslios e manipuladores, o que contribuir para a obteno de
alimentos com boa qualidade.
A atuao dos profissionais responsveis pela qualidade nas indstrias deve
ser eminentemente preventiva. Se fundamentado em planos de amostragem bem
definidos, o monitoramento microbiolgico dos ambientes de processamento pode
melhorar sensivelmente a qualidade, fornecendo informaes sobre o nvel e fonte
de contaminao do produto. Os resultados obtidos com esse monitoramento, normalmente, podem ser comparados com as especificaes ou com as recomendaes propostas por rgos oficiais ou por entidades cientficas conceituadas, como
a American Public Health Association (APHA), a Organizao Mundial de Sade
(OMS) e a Organizao Panamericana de Sade (OPAS). Dependendo dos resultados, mantm-se as tcnicas de higienizao adotadas ou so tomadas medidas
corretivas.
Quando determinado procedimento de higienizao, durante o processamento
de alimentos, no eficiente ou falho, o primeiro indcio do problema pode ser
334
335
cap.08
Em situaes em que se deseja verificar a eficincia de procedimentos de higienizao e sanitizao, agentes neutralizantes especficos devem ser adicionados
ao diluente. Para sanitizantes que atuam por oxidao, como cloro, iodo e cido
peractico, recomenda-se como neutralizante uma soluo de tiossulfato de sdio a
0,25 %. Para outros sanitizantes como amnia quaternria e clorhexidina, sugere-se
soluo de lecitina ou tween 80 % a 2 %. Alm disso, recomenda-se o uso do que se
superfcie a ser avaliada o suficiente para uma boa remoo das clulas. Aps a
incubao das placas, as unidades formadoras de colnias so contadas, a fim de se
avaliarem as condies microbiolgicas da superfcie amostrada.
Em 1964, Hallee Hartnett desenvolveram as placas de contato Replicate Orga-
337
cap.08
338
O resultado expresso em UFC. cm-2, sendo a rea de cada fatia determinada pela
equao: A=3,1416xr2, em que A=rea de contato do meio com a superfcie e r =
raio da fatia do meio de cultura, em cm.
regies da Zona da Mata e Metalrgica de Minas Gerais, com capacidade para produo de 1.000 a 4.000 refeies/dia. Trinta e seis equipamentos e utenslios foram
avaliados nos diversos restaurantes, incluindo cortadores de frios, cortadores de
legumes, mquina de moer carne, placa de altileno, bandejas de refeio, talheres,
339
cap.08
totalizando uma rea de 250 cm2. Quando havia dificuldades para se determinar essa
rea nos equipamentos, foram feitas estimativas, sendo as coletas efetuadas sempre
da mesma forma. Depois da remoo dos microrganismos das superfcies, realizaram-se diluies adequadas, seguidas de plaqueamento e incubao em condies
apropriadas aos microrganismos sob avaliao.
Verificou-se, em relao aos mesfilos aerbios, que apenas 18,5 % dos
equipamentos e utenslios avaliados encontravam-se corretamente higienizados,
segundo a recomendao da APHA, que de 2 UFC. cm-2. Usando essa mesma
recomendao para fungos e leveduras, constatou-se que 32,28 % dos ambientes
apresentavam condies satisfatrias de higiene.
Muitas vezes, essa recomendao americana considerada rgida para os restaurantes brasileiros. As recomendaes da APHA ou da OMS devem ser utilizadas
apenas como referncia, pois de se esperar que, dentre os restaurantes nacionais,
encontram-se aqueles que trabalham dentro de condies preconizadas pela APHA
e, tambm, muitos outros, provavelmente a maioria, que no atendem s recomendaes adotadas nos EUA.
Alguns pesquisadores e algumas instituies como a OPAS e a OMS admitem
contagens de at 50 UFC.cm- de superfcie, e, nesse caso, os porcentuais de 52,9
para microrganismos mesfilos aerbios, 76,7 para coliformes totais e 77,1 para
fungos e leveduras encontram-se dentro dessa recomendao.
2.2.1. Superfcies
Superfcies do misturador, do picador de toucinho, da embaladora de lingia,
da embaladora de salsicho, da embutideira de lingia e da mesa da linha de processamento de lingia foram avaliadas quanto contaminao microbiana, cujos
resultados so apresentados na Tabela 1.
Tabela 1 - Mesfilos aerbios (UFC. cm-2) em superfcies de processamento de uma indstria
de produtos crneos
2.2.2. Manipuladores
Ao realizar a coleta de microrganismos nas mos dos manipuladores, usou-se
a seguinte tcnica (Figura 2): um Swab com haste de 12 cm de comprimento e algodo hidrfilo de 2,5 cm de comprimento e 1,5 cm de dimetro, utilizando o Swab
esterilizado e iniciando a coleta com Swab umedecido em soluo-tampo-fosfato,
friccionando o algodo trs vezes em direo a cada um dos dedos a partir do punho. Em seguida, a comear do punho, friccionou-se o algodo do mesmo Swab entre os dedos, retornando novamente ao punho. Os microrganismos coletados foram
transferidos para o tubo contendo 10 mL de tampo-fosfato, acrescentando-se agentes
neutralizantes para inativar possveis quantidades residuais de agentes sanitizantes. Por
exemplo, para cloro, iodo, cido peractico usou-se como agente neutralizante soluo com 0,25 % de tiossulfato de sdio e para amnia quaternria, soluo de
lecitina 2 %. Em seguida, plaquearam-se diluies adequadas para meios de cultura
e incubaram-se as placas nas condies apropriadas a cada microrganismo: gar
para contagem total e 32 C por 48 h para mesfilos aerbios; gar Violet Red Bile
Agar (VRB) e 37 C por 24 h, para coliformes totais e gar Baird Parker e 30 C por
24 h, para Staphylococcus spp. As placas foram incubadas nas condies de crescimento de cada grupo ou espcie microbiana. Os resultados foram expressos em
UFC/mo.
341
cap.08
cap.08
343
2.3.2. Identificao
Para a purificao dos isolados, foi utilizado o meio de cultivo gar Baird-Parker,
onde foram selecionadas cepas caractersticas e no-caractersticas: i) colnias negras e lustrosas, devido precipitao de telurito de potssio; e ii) com e sem halo
transparente ao redor das colnias.
344
345
das como coagulase negativa e 34,3 %, como coagulase positiva. Dos isolados coagulase negativa, 5,5 % foram identificados como S. aureus; dos isolados coagulase positiva, 84,6 %. Esses resultados demonstram que a prova de coagulase varivel, no
podendo ser relacionada patogenicidade das espcies de estafilococos. A coagulase
livre uma enzima produzida por algumas espcies de estafilococos, principalmente
S. aureus, que reage com plasma de coelho formando cogulos. Esse teste tem sido
largamente utilizado para identificao de S. aureus patognicos.
cap.08
346
Observa-se, pelos resultados, que todas as cepas produtoras de enterotoxinas so de espcies coagulase negativa, contrariando aspectos conhecidos de
patogenicidade e de legislao. Observa-se tambm que, na maioria dos casos,
uma nica cepa foi capaz de produzir mais de um tipo de enterotoxina, de acordo
com a interpretao do kit SET-RPLA. necessrio salientar ainda a necessidade
O leite utilizado nas microindstrias era caracterizado por algum tipo de controle de qualidade, por exemplo a realizao do teste do alizarol. Os responsveis
pela produo, na sua maioria, no eram treinados em processamento de produtos
347
lcteos. O leite normalmente no era estocado de forma adequada, embora em alguns casos fosse processado logo aps a ordenha.
As microindstrias, em sua maioria, eram construdas em reas inadequadas
quanto s condies gerais de higiene, como a proximidade de granja, curral, galinheiro, brejo e fbrica de suco, o que contribua para o mau cheiro e atrao de
moscas. Em todas as microindstrias era utilizada a pasteurizao lenta (65 C/30
min) da matria-prima. Porm, em algumas delas, esse processo era realizado de
maneira inadequada, devido s falhas no controle do binmio tempo-temperatura.
Em virtude do pequeno porte das empresas, era invivel a existncia de um laboratrio de anlise, e por causa dessa limitao esse servio era terceirizado, sendo as
anlises realizadas esporadicamente.
Em relao aos equipamentos e utenslios, foram avaliadas as condies de
conservao e funcionamento, como: presena de solda, ranhuras, ferrugem, equicap.08
As microindstrias eram vistoriadas periodicamente pela Empresa de Assistncia Tcnica e Extenso Rural (EMATER) e por veterinrios que controlavam a
sanidade do rebanho. As microindstrias, em sua maioria, no costumavam ter
produtos de retorno, devido pequena produo e ao consumo praticamente
imediato do produto. Quando ocorria algum retorno, o produto era consumido
pela famlia e empregados.
Na Tabela 6 so mostradas algumas informaes acerca de caractersticas
de consies de processamento nas microindstrias selecionadas.
Tabela 6 - Condies de processamento de uma microindstria de laticnios
meio ambiente.
Na Tabela 7 so mostradas algumas informaes acerca de caractersticas da
estrutura fsica das microindstrias de laticnios.
Tabela 7 - Estrutura fsica de uma microindstria de laticnios
Em geral, as microindstrias no foram projetadas para a fabricao de produtos lcteos, mas, medida que a fiscalizao e tambm a assistncia tcnica se
intensificavam, essas empresas estavam se adequando s especificaes vigentes.
Por exemplo, preocupavam-se em melhorar o sistema de ventilao, as instalaes
Em relao aos manipuladores, constatou-se que as microindstrias apresentavam condies bastante variadas. Em uma delas, manipuladores trabalhavam com
349
uniforme completo, incluindo botas, gorro, cala e camisas brancas, avental, mscara, e mantinham cabelos aparados e totalmente cobertos pelo gorro. Em outras,
manipuladores trabalhavam com uniforme incompleto, mas mantinham cabelos
aparados e cobertos pelo gorro. E ainda, em outras, os manipuladores trabalhavam
totalmente desuniformizados e sem gorro, touca, rede ou similares.
As empresas, em sua maioria, apresentavam manipuladores com unhas em
bom estado, mantidas curtas, limpas e sem esmalte. Com relao ao estado de sade dos manipuladores, havia situaes diversas nas microindstrias, mas poucas
delas providenciavam o afastamento de pessoas do trabalho de manipulao do
alimento quando se encontravam afetadas por enfermidades infectocontagiosas ou
quando apresentavam inflamaes, infeces ou afeces na pele ou outras anormalidades. Boa parte das microindstrias submetia os manipuladores a exame mdico pelo menos uma vez por ano. Mais da metade dos manipuladores higienizava
as mos adequadamente e no utilizava acessrios como brincos, anis, colares,
cap.08
De acordo com os resultados dos itens anteriores, selecionou-se uma microindstria para proposio e implantao de um Programa de Boas Prticas de Fabricao que, posteriormente, foi avaliado. O critrio de seleo baseou-se em interesse,
permisso e disposio do proprietrio em implantar o sistema de higienizao, o
qual foi constitudo de vrias etapas, descritas subseqentemente.
351
cap.08
listada a seguir:
352
clorada (100 mg. L-1 de CRT) por cerca de 10 min, colocados para escorrer e, antes
de serem novamente utilizados, foram rapidamente imersos em gua clorada.
No caso de utenslios de ao inoxidvel, como mesa, agitador, lira e tanque
de fabricao, seguiu-se o processo de limpeza alcalina, sendo o tanque submetido a uma limpeza cida uma vez por semana, para evitar problemas de formao
de pedra de leite.
Mesa de granito: seguiu-se o processo de limpeza alcalina e, logo aps essa
higienizao, foi sanitizada com gua clorada contendo 100 mg.L-1 de CRT, por
aproximadamente 10 min.
Os manipuladores seguiram este procedimento de higienizao: a) pr-lavagem das mos com gua at aproximadamente os cotovelos; b) lavagem com detergente neutro; c) enxge com gua em abundncia; d) sanitizao com gua
clorada a 50 mg. L-1 de CRT ou utilizando lcool 70 GL; e) imerso em gua clorada
das mos, braos e cotovelos periodicamente durante o processo de produo e,
nos casos de interrupo desse processo, os manipuladores repetiram o procedimento de higienizao.
Depois de implantado o sistema de higienizao, foram realizadas anlises
fsico-qumicas e microbiolgicas da gua, ambiente, superfcie de equipamentos
e utenslios e manipuladores.
Constata-se, pela Tabela 11, que as caractersticas fsico-qumicas da gua variaram dentro do esperado aps a realizao do procedimento de higienizao do
reservatrio de gua e a instalao do clorador por difuso. A dureza permaneceu
praticamente inalterada; ocorreu aumento do pH e alcalinidade total; houve aumento
considervel no teor de cloretos e, pela primeira vez, foi detectada a presena de cloro
residual livre na gua de uso industrial. Todas as anlises encontravam-se de acordo
com a legislao vigente (Portaria n 518/MS, de 25 de maro de 2004).
353
As anlises microbiolgicas revelaram a boa qualidade da gua aps a clorao, reafirmando a importncia desse procedimento no controle de microrganismos
alteradores e patognicos.
Na rea de processamento da microindstria selecionada, as anlises de mesfilos aerbios, fungos filamentosos e leveduras encontravam-se de acordo com as
especificaes sugeridas aps a pulverizao de 100 mg. L-1 de cloro residual livre,
realizada duas vezes por semana, com valores abaixo de 100 UFC. cm-2. semana-1,
cap.08
As anlises microbiolgicas de mesfilos aerbios e coliformes totais de equipamentos e utenslios encontravam-se abaixo de 50 UFC. cm-2, de acordo com a Tabela
13. As contagens microbianas nas mos de manipuladores foram em mdia de 5,0x102
UFC/mo de mesfilos aerbios e de <1,0x101 UFC/mo de coliformes totais.
Tabela 13 - Anlise microbiolgica de superfcie de processamento de uma microindstria de
laticnios
355
cap.08
Referncias
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09
1.
Introduo
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Concluso
8.
Referncias
1. Introduo
A segurana dos alimentos tem-se tornado preocupao cada vez maior, tanto
para os consumidores quanto para os rgos governamentais responsveis pela
sade pblica. Como conseqncia, tem aumentado a exigncia sobre as indstrias
envolvidas no processamento de alimentos e bebidas, no que diz respeito aos padres de qualidade durante a manufatura e obteno do produto final.
A avaliao do procedimento de higienizao de equipamentos e utenslios,
que entram em contato direto com os alimentos, constitui preocupao constante
das indstrias de alimentos, que necessitam de resultados rpidos para garantir a
qualidade dos produtos processados e a segurana dos consumidores.
A reduo da vida de prateleira de leite pasteurizado, por exemplo, devida, principalmente, a microrganismos contaminantes na ps-pasteurizao, como
as bactrias Gram-negativas, particularmente as do gnero Pseudomonas, ou em
virtude da presena de microrganismos resistentes ao tratamento trmico, como
as espcies de Enterococcus e de esporulantes. A presena dessas bactrias deteriorantes em sistemas de processamento de leite deve-se geralmente a programas
inadequados de limpeza e sanitizao, em que resduos de leite so deixados nas
360
superfcies dos equipamentos, permitindo o crescimento de microrganismos contaminantes e alteradores (MURPHY et al., 1998).
Os mtodos tradicionais de anlises microbiolgicas, como a contagem-padro
em placas, so trabalhosos, alm de demorados, necessitando de um tempo de incubao de 24 a 72 h, retardando a deteco de condies sanitrias insatisfatrias
e contaminaes microbianas que podem afetar a segurana dos produtos (KENNEEDY; OBLINGER, 1985). Alm disso, esses mtodos no detectam a presena dos
resduos que permanecem nas superfcies aps a higienizao, os quais so fontes
de contaminao de alimentos e diminuem a eficincia dos sanitizantes.
Para atender s necessidades das indstrias de alimentos, tm sido desenvolvidos mtodos rpidos para enumerao de microrganismos e deteco de resduos orgnicos (KENNEEDY; OBLINGER, 1985; HAWRONSKYJ; HOLAH, 1997; HOLAH
et al., 2005). Dentre esses mtodos rpidos, encontram-se aqueles que se fundamentam nos conceitos de biofsica ou no crescimento e metabolismo microbiano,
na radiometria, nas medidas de impedncia, na microcalorimetria e na medio da
361
cap.09
O ATP um nucleotdeo utilizado pelos microrganismos como fonte de energia, desaparecendo depois de 2 h aps a morte da clula e sendo sua quantidade
por clula geralmente constante. O uso de ATP para medir a qualidade bacteriolgica est fundamentado no fato de todas as clulas vivas conterem ATP, o que no
ocorre com as clulas no viveis. Cada bactria contm, em mdia, 1 fentograma
(10-15 g) de ATP, podendo variar de 0,1 a 5,5. Dentre as vrias razes para a variao
desse contedo entre as bactrias, encontra-se a fase do crescimento celular, pois
na estacionria se observa o mais baixo contedo. Alm disso, o contedo intracelular de ATP pode diminuir em resposta a alguma condio de estresse, por exemplo
limitao de nutrientes, alteraes no pH e presena de inibidores, e a quantidade
desse nucleotdeo depende da forma de extrao. O ATP, s vezes, est presente
em uma variedade de alimentos, podendo ser de origem microbiana ou no.
Uma limitao do mtodo a necessidade de um nmero mnimo de microrganismos na amostra, para que o ATP seja detectado. Apenas contagens acima de
104-105 UFC por mililitro ou grama originam quantidade detectvel do nucleotdeo
(ADAMS; HOPE, 1989).
O mtodo descrito por Stannard e Wood (1983) produziu resultados em 20-25
min; tempo esse considerado curto, se comparado com 24-48 h necessrias para
uma contagem convencional de colnias. Nesse experimento, amostras de carne
fresca foram analisadas, e o mtodo mostrou uma estimativa da populao microbiana, quando o alimento apresentava contagens acima de 105 UFC.g-1.
A tcnica de ATP-bioluminescncia foi utilizada com sucesso para detectar o
362
ATP em superfcies de equipamentos usados em cirurgias orais na rea odontolgica, como um indicador da presena de contaminao por saliva ou microrganismos, e avaliar a eficincia dos procedimentos de rotina de higienizao. Tais rotinas
so difceis de serem monitoradas, em razo do tempo e do trabalho despendido na
realizao das tcnicas microbiolgicas. Esse monitoramento vital no controle de
infeces cruzadas, ou seja, de um paciente para outro ou, ento, para as pessoas envolvidas na cirurgia, como os dentistas e seus auxiliares. A ateno sobre o controle
de contaminao cruzada em cirurgia oral aumentou principalmente com o advento
da AIDS (HIV), embora outra grande preocupao seja referente ao vrus da hepatite B
(HBV), presentes no somente no sangue, mas tambm em secrees como a saliva.
Embora a maior preocupao com a transmisso do HIV e HBV durante as cirurgias
orais seja relacionada aos acidentes perfurocortantes, a transmisso envolvendo superfcies contaminadas no pode ser descartada (DOUGLAS; ROTHWELL, 1991).
O princpio da tcnica do ATP-bioluminescncia consiste em quantificar
ATP presente em uma superfcie ou em uma amostra lquida, utilizando-se
Swabs apropriados.
Figura 2 - Tcnica adequada para remoo de ATP na superfcie de equipamentos e utenslios, mostrando a
forma de segurar o Swab, o ngulo de contato, a rea (10 cm x 10 cm) e a coleta em diagonal.
363
A medida de ATP pelo mtodo da bioluminescncia afetada por certos fatores que causam reduo na emisso dos ftons de luz. Essa reao acontece em
pH timo de 7,75. Quando o pH est abaixo ou acima desse valor pode ocorrer
diminuio na produo de luz. A temperatura tima da reao de 25 C, e em
cap.09
turas mais baixas a velocidade da reao diminui. A turbidez e a cor das amostras,
por exemplo no caso de anlise de gua, tambm causam diminuio na produo
de luz (COMBRUGGE; WAES, 1991a; TYDRICH, 1996).
Os instrumentos disponveis para medir a luminescncia so os fotmetros
sensveis emisso de luz. Relativamente simples, baseiam-se na deteco de luz
por fotomultiplicadores. A amostra colocada em uma cmara escura, para que o
fotomultiplicador e o amplificador sejam protegidos da luz externa. Os resultados
so usualmente dados em unidades relativas de luz (URL) ou em logaritmos decimais das unidades relativas de luz (log10URL) (COMBRUGGE; WAES, 1991a; HAWRONSKYJ; HOLAH, 1997).
A tcnica de ATP-bioluminescncia tem sido utilizada para determinar a qualidade microbiolgica de produtos alimentcios, como leite e derivados, bebidas,
vegetais e carnes e derivados; para avaliar a qualidade da gua de abastecimento
pblico e no processo de limpeza e desinfeco, tanto em indstria de alimentos
quanto em hospitais e indstria farmacutica (KENNEDY; OBLINGER, 1985; GRIFFITHS, 1993; TYDRICH, 1996; VELAZQUEZ; FEIRTAG, 1997; GOMEZ, 1999; CORBITT et al., 2000; GRIFFITHS et al., 2000). Atualmente, h vrios fabricantes desses
equipamentos, e muitos deles so comercializados no Brasil. Alguns estudos tm
mostrado as diferenas na sensibilidade e reprodutibilidade desses aparelhos.
De acordo com Hawronskyj e Holah (1997) e Tydrich (1996), quanto tcnica
364
convencionais de cultivo de microrganismos a rapidez na obteno dos resultados. Em alguns casos, so necessrios dias para a finalizao de mtodos de cultivo, enquanto a anlise de ATP requer apenas alguns minutos. Assim, programas
de higienizao podem ser monitorados em tempo real, e, se os nveis de ATP
encontrados estiverem acima dos limites preestabelecidos como aceitveis, uma
nova higienizao do ponto amostrado deve ser iniciada imediatamente.
O uso da anlise de ATP para monitorar nveis de higienizao no deve
substituir as tcnicas tradicionais, que so utilizadas para detectar microrganismos
especficos, podendo servir como anlise complementar nesse tipo de monitoramento (COLQUHOUN et al., 1998).
A determinao de ATP microbiano depende da eficincia da separao entre
bactria e os resduos orgnicos. Aps a separao, seguem-se a extrao e a medida do ATP microbiano. Pode-se usar tambm a extrao seletiva e a destruio enzimtica do ATP no-microbiano, seguida pela extrao e medida do ATP microbiano.
Esses tipos de reagentes, disponveis comercialmente, podem ser encontrados sob
as seguintes denominaes: NRS, Lumac e NAS (STANNARD; WOOD, 1983;
KENNEDY; OBLINGER, 1985; GIESE, 1995; TYDRICH, 1996). Alguns pesquisadores
tm aplicado filtrao ou centrifugao para separar os microrganismos da amostra
do alimento, medindo, assim, apenas o ATP microbiano.
365
cap.09
366
367
Os resultados das anlises para as amostras de gua de manancial foram comparados aos padres exigidos pela Resoluo n 357, de 17 de maro de 2005, do
Conselho Nacional do Meio Ambiente (BRASIL, 2005), podendo afirmar que os parmetros avaliados se encontram dentro da legislao vigente. Da mesma forma,
puderam-se comparar os resultados das anlises da gua industrial j tratada da
ETA/UFV com os padres estabelecidos pela Portaria n 518 do Ministrio da Sade,
de 25 de maro de 2004 (BRASIL, 2004), que trata da qualidade de gua potvel,
constatando-se que a gua se encontrava dentro do padro legal vigente para os
parmetros avaliados: aerbios mesfilos e coliformes totais. No entanto, deve-se
salientar que h exigncia da anlise de cerca de 90 parmetros diferentes para
determinar se um manancial se encontra em condies de potabilizao (Resoluo
n 357, do Conselho Nacional do Meio Ambiente) ou se a gua potvel (Portaria n
cap.09
A seleo das amostras fundamentou-se no fato de que se procuraram selecionar aquelas que apresentassem diferenas bem caracterizadas em seus aspectos
fsicos, qumicos e, ou, microbiolgicos. A gua de manancial mostrou valores elevados de turbidez e de contagens de aerbios mesfilos e coliformes totais. J na
gua de resfriamento de amnia, notaram-se concentraes elevadas em todos os
parmetros avaliados. A gua industrial pode ser considerada uma amostra-controle, em razo de suas boas caractersticas fsico-qumicas e microbiolgicas.
Para a avaliao da qualidade microbiolgica da gua, o experimento foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado (DIC), com trs repeties e trs
tratamentos, e, a partir das anlises de varincia do log10 de URL e UFC.cm-2 , foram
comparadas as mdias pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Observa-se, pela anlise de varincia da quantidade de ATP total, livre e microbiano e tambm das contagens de aerbios mesfilos e de coliformes totais das
amostras de gua avaliadas (Quadro 4) que houve diferena significativa (p< 0,05).
Quadro 4 - Resumo das anlises de varincia dos logaritmos decimais (log10) da concentrao de Unidades Relativas de Luz (URL) do ATP total, livre e microbiano, de UFC.mL-1 de
mesfilos aerbios e de NMP.100 mL-1 de coliformes totais de amostras de gua de manancial, resfriamento de amnia e industrial
que 150 URL, cujo log10 corresponde a 2,18, para que a gua seja considerada em
condies higinicas satisfatrias. Independentemente da origem do ATP, os valores
se encontravam abaixo do recomendado. Deve-se ressaltar, entretanto, que essa
tcnica no diferencia as espcies microbianas contaminantes. Os resultados das
anlises microbiolgicas de aerbios mesfilos e coliformes totais esto dentro dos
padres legais vigentes (BRASIL, 1990, 2005).
No que se refere gua do manancial, observou-se que as concentraes de
ATP total e livre eram mais elevadas do que as obtidas na gua utilizada na indstria. J as caractersticas microbiolgicas, de turbidez e de cor diferenciaram essas
amostras. Comparando-se as trs amostras avaliadas, as concentraes de ATP total e microbiano foram as mais elevadas na gua de manancial e consistentes com
os resultados das contagens de aerbios mesfilos e coliformes totais. Os resultados das anlises pela tcnica de ATP-bioluminescncia sugeriram que a gua do
manancial encontrava-se em condies insatisfatrias, acima de 300 URL para ATP
total, e em condies de alerta entre 150 e 300 URL, para o ATP livre e microbiano.
De acordo com os resultados, a determinao do ATP total a recomendada para
avaliar a qualidade microbiolgica da gua de manancial e, nesse caso, no um
problema considervel o fato de a tcnica no diferenciar espcies microbianas, j
que a gua receber tratamentos, como sedimentao com coagulantes, floculao,
Em relao gua industrial, houve a concordncia entre os mtodos de bioluminescncia e de contagem de aerbios mesfilos e coliformes totais. Para a tcnica
da bioluminescncia, o fabricante (BIOTRACE, 2000) recomenda valores menores
369
encontrados esto dentro dos padres legais exigidos para gua a ser potabilizada.
A gua de resfriamento de amnia foi selecionada em razo das diferenas considerveis em suas caractersticas fsico-qumicas e microbiolgicas, em relao s
outras amostras. Essa gua foi considerada em situao de alerta para a determinao
de ATP total e livre e em boas condies de higiene para determinao do ATP microbiano. Tambm, nesse caso, os resultados indicaram que a determinao de ATP total
foi a mais recomendada. Talvez a qualidade fsico-qumica da gua tenha influenciado
a determinao da bioluminescncia, diminuindo a formao de luz. Essa gua apresentou valores elevados de turbidez, pH, alcalinidade, cloretos e dureza.
Pesquisas mostram que diversas substncias detergentes e sanitizantes afetam
cap.09
370
tendo, portanto, energia suficiente para a reao da formao de luz. Assim, quando
Observa-se, pelo Quadro 8, que a determinao das URL afetada pelas condies de adeso de E. coli. Constatou-se que a suspenso microbiana centrifugada
associada ao tempo de repicagem do microrganismo interferiu na avaliao pela
371
tcnica da bioluminescncia e tambm na quantidade de clulas aderidas. Determinaram-se os valores de 113 URL para ATP total e 5,9x102 UFC.cm-2 de clulas
aderidas ao ao inoxidvel, quando a suspenso foi centrifugada e o tempo de repicagem, de 24 h. Sem a centrifugao e com 12 h de repicagem, os valores foram de
2397 URL e 1,1x104 UFC.cm-2.
cap.09
Quadro 8 - Logaritmo decimal (log10) de Unidades Relativas de Luz (URL) para ATP total,
livre e microbiano e UFC.cm-2 presentes em superfcies de ao inoxidvel com suspenso
de Escherichia coli K12
372
373
(p<0,05) quando se compararam os resultado antes (9772 URL e 1,20 x103 UFC.cm-2) e
depois (2511 URL e 1, 10x101 UFC.cm-2) do procedimento de higienizao.
cap.09
Os resultados indicaram que no h uma concordncia entre os mtodos de contagem microbiana e ATP-bioluminescncia na classificao das condies higinicas
dos equipamentos avaliados para o processamento de leite (Quadros 10 e 11). Observa-se, nesses quadros, que para ambas as tcnicas de avaliao do procedimento
de higienizao, as superfcies da DES e do TRC foram aquelas que se apresentaram
em piores condies higinicas. No entanto, no houve uma concordncia entre as
duas tcnicas na classificao das condies higinicas das demais superfcies. Podese dizer que no houve relao direta entre URL e UFC.cm-2. Portanto, a tcnica de
ATP-bioluminescncia apenas pode ser usada como indicadora das condies higinicas associadas s quantidades de matria orgnica nas superfcies, ou seja, se o
procedimento de higienizao foi efetuado corretamente ou no. Essa informao
importante, pois a presena de resduo de alimentos nas superfcies pode originar
processos de adeso microbiana e formao de biofilmes (ZOTTOLA, 1997). No expe-
rimento, o nmero de microrganismos aderidos indicou que ocorreu adeso bacteriana, atingindo cerca de 104 UFC.cm-2, e no formao de biofilmes.
Quadro 10 - Log10 de Unidades Relativas de Luz (URL) em diferentes superfcies de uma indstria de alimentos antes e depois do procedimento de higienizao. Mdia de trs repeties
374
Verifica-se, pelo Quadro 12, que pela tcnica da bioluminescncia 100 % das
375
cap.09
De acordo com o Quadro 14, os cupons avaliados aps a sanitizao e esterilizao apresentaram resultados inferiores a 150 URL, ou seja, estavam limpos,
livres de contaminao microbiana ou de resduos orgnicos, com base na interpretao proposta pelo fabricante.
Quadro 14 - Avaliao dos cupons de prova pela tcnica de ATP-bioluminescncia em diferentes situaes. Valores expressos em Unidade Relativa de Luz (URL)
cap.09
Quadro 15 - Sntese de pesquisa que avaliou a interferncia de resduos orgnicos e microrganismos na medida do ATP-bioluminescncia
378
de probabilidade.
c) A avaliao das combinaes de substncias orgnicas em suspenso/soluo seguiu
modelo de delineamento inteiramente casualizado com sete tratamentos, em trs repeties. As determinaes do nmero de URL foram feitas em duplicatas. As comparaes
de interesse, testadas pelo teste F, esto representadas a seguir (Quadro 16 ):
d) A avaliao da combinao de duas e trs substncias orgnicas em suspenso/soluo adicionada de S. carnosus ou esporos de B. subtilis seguiu modelo de delineamento
inteiramente casualizado com cinco tratamentos, em trs repeties. As determinaes
do nmero de URL foram feitas em duplicatas. As comparaes de interesse, testadas
pelo teste F, esto representadas no Quadro 16.
porco e sacarose apresenta uma mdia de log de URL menor (p<0,05) do que a das
demais combinaes (Quadro 17).
Quadro 16 - Comparaes de interesse avaliadas pelo Teste F
379
cap.09
mos e avaliadas isoladamente, o nmero mdio de URL para de S. carnosus foi maior
(p<0,05) do que aquele obtido nas suspenses com esporos de B. subtilis, conforme
o teste t, de Student. O logaritmo do nmero de URL foi 3,79 nas clulas vegetativas
e 1,95 nos esporos bacterianos (Quadro 18), o que corresponde a 69 vezes a mais na
medida da bioluminescncia. Em relao aos esporos, no houve diferena (p>0,05)
no nmero de URL nas contagens de 2,9X103 UFC.mL-1, 2,9x104 UFC.mL-1, 2,9x105
UFC.mL-1, com mdia de 1,93 log de URL. Porm, nas contagens de 2,9x107 UFC.
mL-1, o log de URL atingiu 2,6.
Quadro 18 - Mdia e desvio-padro dos logaritmos decimais do nmero de Unidades Relativas
de Luz das suspenses e solues de substncias orgnicas adicionadas de microrganismos
380
Apesar de as suspenses de microrganismos estarem em concentraes microbianas prximas (5,4x104 UFC.mL-1 de S. carnosus e 2,9x104 UFC.mL-1 de esporos
de B. subtilis), a diferena na medida de URL pode ser explicada, levando-se em
381
cap.09
do ATP-bioluminescncia.
382
383
Segundo as recomendaes do fabricante do luminmetro, superfcies de processamento de alimentos so consideradas em condies higinicas insatisfatrias
quando o log10URL for maior que 2,48. Quando esse valor estiver abaixo de 2,18
significa que as condies so satisfatrias. Porm, quando o logaritmo do nmero
de URL estiver entre esses dois valores significa condio de alerta.
Nas condies deste experimento, todas as superfcies seriam consideradas
em condies higinicas satisfatrias, estando aptas ao processamento de alimentos, uma vez que os resultados com a tcnica de ATP-bioluminescncia ficaram abaixo do limite de URL de 2,18.
cap.09
logaritmo de URL foi de 1,95. No que se refere s suspenses de clulas vegetativas ou esporo bacteriano aderidas ao ao inoxidvel, adicionadas ou no das trs
substncias orgnicas, pode-se fazer a mesma constatao para qualquer uma das
concentraes microbianas analisadas, ou seja, as medidas de URL nas clulas vegetativas foram sempre maiores que nos esporos bacterianos.
385
Concluso
A tcnica do ATP-bioluminescncia no estgio atual pode ser usada como ferramenta auxiliar no monitoramento de procedimentos de higienizao desde que
seja associada a outros mtodos, como contagem microbiana. Esta tcnica deve
ser usada com cuidado, e o significado dos resultados das anlises deve ser corretamente entendido pelos profissionais que utilizam essa metodologia na avaliao
cap.09
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cap.09
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a
A
C
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10
1.
Introduo
1.1. Teste da Diluio de Uso
1.2. Teste de Suspenso
1.3. Teste do Coeficiente Fenlico
1.4. Teste de Capacidade
1.5 Teste de Ao Esporicida
2.
3.
Eficincia do cido peractico Sobre Esporos de Bacillus sporothermodurans Avaliada pelos Testes de Diluio de Uso e de Suspenso
3.1. Avaliao pelo Teste da Diluio de Uso
3.2. Avaliao pelo Teste de Suspenso
3.3. O teste de Suspenso versus o Teste da Diluio de Uso
4.
5.
6.
7.
8.
1. Introduo
A avaliao da eficincia dos sanitizantes bastante complexa, principalmente em
razo dos inmeros fatores que podero afet-la. Assim, a natureza e tipo de superfcies
tratadas, a concentrao e natureza dos resduos a elas aderidos, o tipo de microbiota
contaminante na superfcie, a concentrao e o perodo de contato do sanitizante com
a superfcie so apenas algumas das variveis que podero afetar, em menor ou maior
grau, a eficincia dos sanitizantes. Dessa forma, evidente a importncia da realizao de
alguns testes que permitam a seleo de um produto ideal para as condies especficas
de uso na indstria de alimentos.
As comprovaes da eficincia microbiolgica dos sanitizantes qumicos so necessrias, e uma das formas de se confirmar isso por meio de testes laboratoriais, como os
de diluio de uso, de capacidade, de coeficiente fenlico, teste esporicida e de suspenso. Deve-se frisar que, na maioria das vezes, apenas a determinao do princpio ativo
dos produtos sanitizantes comerciais ou de suas solues diludas para uso rotineiro no
procedimento de higienizao no suficiente para definir a atividade antimicrobiana.
Produtos comerciais que originam solues sanitizantes com mesma concentrao do
princpio ativo podero apresentar eficincias diferentes sobre os microrganismos, mostrando necessidade de se avaliar a ao desses agentes diretamente sobre os microrganismos, usando-se metodologias adequadas.
No Quadro 1 so apresentadas as propriedades e aplicaes de substncias qumicas antimicrobianas na indstria de alimentos que causam injrias aos microrganismos.
Quadro 1. Propriedades e usos de substncias qumicas antimicrobianas de uso na indstria de
alimentos que causam injria em membranas celulares
cap.10
391
Os testes laboratoriais padronizados so teis para comparar a atividade de sanitizantes em vrios produtos e diluies, tempo de contato e temperatura, entre outras
variaes e condies. So esses os fatores que afetam a eficincia de sanitizantes
qumicos usados na indstria de alimentos: concentrao de uso; tipo e concentrao
de microrganismos; tipos e rugosidade das superfcies; concentrao e natureza dos
resduos; tempo de contato e temperatura de aplicao; e mtodo de higienizao.
393
cap.10
O uso de neutralizantes nos meios de subcultivos, aps o contato do microrganismo com o agente sanitizante, particularmente na metodologia do teste de suspenso, fundamental. A diluio e a neutralizao geralmente so as tcnicas preferidas para inativar os sanitizantes, podendo ser usados individualmente ou de forma
simultnea. Outra tcnica, embora menos usada, para inativar agentes qumicos
a lavagem das clulas microbianas, consistindo na inativao dos sanitizantes por
meio da centrifugao ou filtrao em membrana.
Em muitos mtodos, dilui-se a mistura dos sanitizantes mais o microrganismo
em soluo de agentes neutralizantes Considera-se que somente a diluio no
394
suficiente para suprimir a atividade residual da maioria dos agentes qumicos. Por
exemplo, os compostos de amnio quaternrio podem ter uma atividade bacteriosttica contra certas espcies mesmo em altas diluies.
A neutralizao corresponde a uma reao complexa ou simples. Por exemplo, ocorre uma neutralizao puramente qumica quando se usa tiossulfato de
sdio para controle residual de compostos iodados. No entanto, ocorrem reaes
mais complexas, quando os vrios neutralizantes reagem com partes lipoflicas
dos sanitizantes, inativando-os.
Dependendo das condies de teste, pode-se usar apenas um neutralizante
ou, s vezes, sugerida uma mistura de substncias. Para compostos clorados e
iodados, geralmente indicado o tiossulfato de sdio. Para compostos de quaternrio de amnio e clorohexidina, recomenda-se lecitina de ovo e Tween 80. Na
literatura recomendada uma soluo contendo vrios agentes neutralizantes, por
exemplo bissulfito de sdio, tiossulfato de sdio, tioglicolato de sdio, Tween 80 e
lecitina de soja, que poderia ser aplicada na maioria dos testes usados para avaliar
a eficincia do sanitizante.
O teste de coeficiente fenlico foi, praticamente, o primeiro a ser desenvolvido com o propsito de avaliar a eficincia dos sanitizantes. A metodologia
deste teste tem recebido vrias propostas de modificaes ao longo do tempo,
permanecendo em todos eles o fundamento bsico original: a comparao da
eficincia de sanitizante contra uma soluo-padro de fenol, ambas atuando
sobre clulas vegetativas de bactrias. um mtodo oficial preconizado pela
Association of Official Analitycal Chemists (AOAC).
O teste realizado sob condies rigidamente definidas. A AOAC recomenda como organismos de teste as culturas-teste de Pseudomonas aeruginosa ATCC
15442, Salmonella typhi ATCC 6539 e Staphylococcus aureus ATCC 6538. No Quadro 6, encontram-se resumidos o fundamento, a interpretao dos resultados e as
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Figura 1 - Porcentual de tubos negativos no teste da diluio de uso para Enterococcus faecium, pela ao
de agentes sanitizantes.
Verificou-se que o hipoclorito de sdio foi mais eficiente do que o dicloroisocianurato de sdio e existe explicao para essa diferena de ao bactericida.
Sabe-se que o cido hipocloroso (HClO), forma no dissociada, liberado em soluo
aquosa, o responsvel pela ao bactericida de ambos os compostos, conforme as
equaes qumicas 1 e 2. No entanto, o hipoclorito de sdio, por ser um composto
inorgnico, hidrolisa-se mais rapidamente em soluo aquosa do que o dicloroisocianurato de sdio. Este ltimo pertence classe dos compostos clorados orgni-
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cos, sendo quimicamente uma cloramina, cujo uso est em expanso no Brasil.
O cido dicloroisocianrico apresenta uma estrutura qumica em que a liberao do HClO dependente da inter-relao da concentrao e do pH da soluo
sanitizante e do pKa do cido hipocloroso (Eq. 3). Nesse experimento, foram usadas solues de hipoclorito de sdio contendo 100 mg.L-1 de cloro residual livre
(CRL), em pH 8,0, e sal do cido dicloroisocianrico (dicloroisocianurato de sdio)
contendo 150 mg.L-1 de CRL em pH 8,4. Usando a equao 3, determinam-se as
concentraes de 24 mg.L-1 e 19 mg.L-1 de HClO nas solues de hipoclorito e de
diclorocianurato. Assim, a liberao mais rpida e a maior concentrao de HClO na
soluo preparada a partir do hipoclorito de sdio explicam sua maior eficincia.
Esse resultado indica a importncia dos cuidados que se deve ter no uso de
Essas formulaes so instveis ao armazenamento, txicas aos manipuladores e corrosivas a diversas superfcies. Portanto, para assegurar eficincia do uso
desse sanitizante nas indstrias de alimentos necessrio o controle da concentrao do princpio ativo, assim como cuidados na manipulao e no armazenamento,
sendo fundamental avaliar sua atividade microbicida.
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Neste experimento, verificou-se que a adeso dos esporos de Bacillus sporothermodurans nos cilindros de ao inoxidvel, utilizados para o teste de diluio
de uso, aumentou com o tempo (Quadro 12). Aps 30 min de contato, o nmero
de esporos aderidos foi de 4,3x103 UFC.cilindro-1. Esses valores atingiram 5,1x104
e 9,1x104 UFC.cilindro-1 nos tempos de adeso de 12 h a 24 h, e em funo desses
resultados foi definido o tempo de adeso de 24 h, para efetuar os experimentos
relativos ao esporicida do cido peractico.
Quadro 12 - Nmero de esporos de Bacillus sporothermodurans (UFC) aderidos a cilindros de
ao inoxidvel, temperatura de 25 C, em funo do tempo de contato
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Constatou-se que, medida que aumentou o nmero de esporos aderidos, a eficincia do sanitizante foi mais elevada, o que pode ser explicado pela microtopografia
da superfcie de ao inoxidvel, que observada pela microscopia eletrnica de varredura, por exemplo, apresenta fendas e ranhuras. Assim, a capacidade de proteo da
superfcie ser maior quando o nmero de esporos for menor, considerando-se que
essa capacidade ser limitada.
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A aplicao de um modelo matemtico para relacionar o tempo e a concentrao na ao esporicida do cido peractico mostrada a seguir.
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Figura 3 - Logaritmo do tempo de contato (min) em funo da concentrao de cido peractico, em que no
h esporos sobreviventes, determinada pelo teste da diluio de uso nas temperaturas de 4 C, 25 C e 40 C.
Desse modo, foram determinados os valores Z iguais a 256, 263 e 149 mg.L-1 de
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equaes desse tipo possvel determinar o tempo necessrio para se obter higienizao adequada.
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5.3 Rotulagem
A informaes contidas nos rtulos dos produtos sanitizantes de grande importncia para o uso correto na indstria de alimentos. Essa rotulagem definida
pela legislao, conforme Portaria n 15/88 do MS. No painel principal da embalagem, deve constar:
1. O nome do produto.
2. A classificao.
3. As frases relacionadas com a classe de risco, restries de uso, se hospitalar, veterinrio, indstria de alimentos ou profissional.
4. Modo de usar, diluio de uso, tempo de contato, sendo, por exemplo para a indstria
de alimentos, esse tempo geralmente de 10 min.
5. As limitaes de uso.
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caveira com tbias cruzadas), fatal se ingerido, inalado, absorvido pela pele, conforme
o caso. Outro exemplo: PERIGO! VENENO! Causa queimaduras graves aos olhos,
pele, conforme o caso; ii) Classe de risco II, deve constar do rtulo a palavra CUIDADO,
em destaque, e, conforme o caso, as informaes pode ser fatal se ingerido, inalado,
absorvido pela pele , ou produto irritante para os olhos, a pele; iii) Classe de risco III,
deve constar do rtulo a palavra ATENO, em destaque e conforme o caso as informaes No ingerir ou Evite inalao ou aspirao, contato com os olhos e contato com
a pele. Classe de risco IV, deve constar do rtulo, conforme o caso, as informaes No
ingerir ou Evite a inalao ou aspirao, contato com os olhos e contato com a pele.
Alm das citadas, as seguintes frases de advertncia devem constar de todos
os rtulos de produtos sanitizantes: i) Mantenha afastado de crianas; ii) No d
nada por via oral a uma pessoa inconsciente; e iii) No reutilize embalagens vazias.
Existem frases de advertncias especficas com relao aos primeiros socorros
que devem constar do rtulo de produto, no painel principal ou secundrio, devendo
ser selecionadas em funo das caractersticas do produto, conforme recomendao da Portaria n 15/88 do MS. Como exemplo, pode-se citar: i) Em caso de ingesto
acidental, no provoque vmitos, faa beber gua em abundncia e procure socorro
mdico, levando a embalagem ou o rtulo do produto; e ii) Em caso de inalao ou
aspirao, remova o paciente para local arejado e chame o socorro mdico.
avaliao de toxicidade crnica, via oral, com uma espcie roedora e outra noroedora; xiii) teste para verificao de efeitos nocivos ao processo reprodutivo,
em ratos, por no mnimo duas geraes; xiv) teste para verificao de toxicidade
drmica subaguda (durante 21 dias) em ratos ou coelhos; xv) teste para toxicidade
inalatria subaguda (14 a 21 dias), em ratos; xvi) teste para verificao de neurotoxicidade retardada; xvii) testes complementares para enzimas especficas e
xviii) dados sobre o emprego de antdotos, antagonistas e primeiros socorros para
casos de intoxicao.
No Quadro 17 so apresentados critrios de classificao de risco toxicolgico agudo.
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7. Concluso
A seleo de sanitizantes para uso na indstria de alimentos deve passar por
uma etapa em que se usam os testes laboratoriais, em particular os de diluio de
uso e de suspenso. A partir dessa avaliao inicial, que os sanitizantes sero
submetidos s condies de aplicao industrial. Alm disso, o teste de diluio
de uso o utilizado no Brasil para fins de avaliao antimicrobiana e registro dos
sanitizantes no Ministrio da Sade.
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