Tese - Podridão Radicular Da Mandioca Causada Por Phytopythium Sp.... o

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DA AMAZÔNIA - UFRA

DOUTORADO EM AGRONOMIA
ALINE MEDEIROS LIMA
PODRIDÃO RADICULAR DA MANDIOCA CAUSADA POR Phytopythium sp.

PROPAGAÇÃO, METODOLOGIA DE INOCULAÇÃO E PROSPECÇÃO DE
GENES DE RESPOSTA
BELÉM
2017
ALINE MEDEIROS LIMA
PODRIDÃO RADICULAR DA MANDIOCA CAUSADA POR Phytopythium sp.:

PROPAGAÇÃO, METODOLOGIA DE INOCULAÇÃO E PROSPECÇÃO DE
GENES DE RESPOSTA
Tese apresentada à Universidade Federal Rural da

Amazônia, como parte das exigências do Curso de
Doutorado em Agronomia para obtenção do título de
Doutor.
Orientadora: Prof.a Dr.a Claúdia R. Batista de Souza
Co-orientadora: Dr.a Elisa Ferreira Moura Cunha
BELÉM
2017
Lima, Aline Medeiros
Podridão radicular da mandioca causada por Phytopythium sp.:

propagação, metodologia de inoculação e prospecção de genes de resposta /
Aline Medeiros Lima. - Belém, 2017
131 f.
Tese (Doutorado em Agronomia / Área de Concentração Agronomi

Universidade Federal Rural da Amazônia, 2017.
Orientadora: Cláudia R. Batista de Souza.
1. Manihot esculenta 2. Phytophytium sp 3. Expressão

diferencial 4. Propagação rápida da mandioca 5. Produção de mudas I.
Souza, Cláudia R. Batista de, (orient.) II. Título
CDD: 633.682
ALINE MEDEIROS LIMA
PODRIDÃO RADICULAR DA MANDIOCA CAUSADA POR Phytopythium sp.:

PROPAGAÇÃO, METODOLOGIAS DE INOCULAÇÃO E PROSPECÇÃO DE
GENES DE RESPOSTA
Tese apresentada à Universidade Federal Rural da Amazônia, como parte das exigências do
Curso de Doutorado em Agronomia para obtenção do título de Doutor.
Orientadora: Prof.a Dr.a Claúdia Regina Batista de Souza
Co-orientadora: Dr.a Elisa Ferreira Moura Cunha
Aprovado em 20 de dezembro de 2017.
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr1, Cláudia Regina Batista de Souza - Orientadora

(UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ- ICB/UFPA)
Prof. Dr. Sávio Pinho dos Reis - Io Examinador

(UNIVERSIDADE ESTADUAL DO PARÁ - UEPA)
Dr. Roberto Lisboa Cunha - 2o Examinador

(EMBRAPA AMAZÔNIA ORIENTAL)
Prof. Dr. Hugo Alves Pinheiro - 3o Examinador

(UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DA AMAZÔNIA-UFRA)
Prof.3 Dr.a Gisele Barata da Silva - 4o Examinadora

(UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DA AMAZÔNIA-UFRA)
INSTITUIÇÕES E FONTES FINANCIADORAS
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
CAPES
CAPES
vf#
Universidade Federal Rural da Amazônia - UFRA
Universidade Federal do Pará - UFPA
AmazcPnia Fundação Amazônia Paraense de Amparo a Pesquisa - FAPESPA

Paraense
le Amparo è Pesquisa
QCNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
Conselho Nadonal de Desenvolvimento CNPq

Científico e Tecnológico
Programa de Pós Graduação em Agronomia - UFRA

m
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

Enítàpi Embrapa Amazônia Oriental - Belém - PA
AGRADECIMENTOS
- Agradeço primeiramente a Universidade Federal Rural da Amazônia que através do
Programa de Pós-Graduação em Agronomia proporcionou a realização de meu curso de
doutorado. A Universidade Federal do Pará a EMBRAPA Amazônia Oriental pelo apoio dado
a pesquisa.
- Ao CNPq, FAPESPA, GOVERNO DO PARA e CAPES pelo financiamento do projeto de
pesquisa e bolsa de estudo.
Aos professores pelos ensinamentos oferecidos durante todo o curso, em especial a professora
Prof. Dr3. Cláudia Regina Batista de Souza e a Dr.a Elisa Ferreira Moura da Cunha pela
eficiente e dedicada orientação durante todo o trabalho e aos professores componentes da
banca pela participação, atenção e valiosos comentários oferecidos na ocasião da pré-banca e
da apresentação deste trabalho. Aos técnicos Edson Sampaio e Nivaldo pelo apoio dado e
conselhos valiosos.
A minha família pelas orações e pensamentos positivos para que eu pudesse alcançar meus
objetivos em especial aos meus pais Sônia e Sebastião que me compreendem e me deram
ensinamentos valiosos e a minha irmã Audriana que em todos os momentos que estava em
dificuldade me ajudou.
Ao meu noivo/esposo Diehgo, companheiro e amigo de todas as horas que esteve comigo
todos os dias acompanhando o meu dia a dia me dando força diante das dificuldades e se
alegrando com cada conquista. A minha segunda família, meu sogro e minha sogra, que nos
últimos meses acompanhou de perto os meus dias e me deram força e coragem para seguir em
frente.
Aos meus amigos e amigas que vivenciaram comigo esta conquista, agradeço o apoio
recebido, todos os ensinamentos e os momentos de incentivo compartilhando alegrias e
tristezas. Em especial aos amigos do Laboratório de Biologia Molecular e da Embrapa, que
estiveram comigo durante a realização deste trabalho.
E em especial a Deus por ter me concedido esta grande vitória.

Dedico este trabalho ao meu noivo/esposo Diehgo
companheiro e confidente que paciente me ajudou a
caminhar e chegar até aqui, aos meus Pais que me
educaram para enfrentar as dificuldades da vida e a minha
orientadora Prof.a Cláudia que confiou em mim e me
educou para enfrentar a vida acadêmica.
"No fim tudo dá certo, se não deu certo é porque ainda não
chegou ao fim". Fernando Sabino
RESUMO
A mandioca é um dos mais dinâmicos produtos da agricultura mundial, sendo cultivada em
mais de cem países, no entanto sua produtividade é afetada por patógenos, principalmente os
causadores de podridões radiculares, como o Phytopythium sp. Não há relatos de estudos que
identificaram genes envolvidos na interação Mandioca- Phytopythium sp., portanto esta tese
tem como objetivo principal a prospecção de genes envolvidos nos mecanismos de resposta
da mandioca ao agente causador da podridão radicular. A tese está dividida em seis capítulos,
onde o primeiro faz a contextualização geral, o segundo identificou genes relacionados à
imunidade de mandioca que possuam potencial para atuar na defesa contra o agente causador
da podridão radicular, o terceiro capítulo discutiu o potencial das fitocistatinas no controle de
doenças de plantas causadas por fungos. No quarto capítulo foi realizada uma busca no
genoma da mandioca por genes que irão codificar fitocistatina e estes foram caracterizados />?
silico e comparados filogeneticamentes com fitocistatinas de outras culturas. O quinto
capítulo trata de uma adaptação no método de propagação rápida da mandioca para a
obtenção de mudas visando estudos em casa de vegetação, tais como, a inoculação do agente
causador da podridão radicular das raízes em plantas de mandioca. O sexto capítulo apresenta
os resultados visando realizar a inoculação do agente causador da podridão radicular das
raízes em plantas de mandioca. A adaptação do método de propagação rápida da mandioca foi
eficaz na produção de mudas para estudos em nível molecular da interação mandioca-
Phytopythium sp. No total foram investigados nove genes envolvidos na resposta ao estresse
biótico, dos quais sete apresentaram padrões de expressão diferencial nas raízes inocuculadas
com Phytopythium sp.. A análise do genoma da mandioca resultou na identificação de nove
isoformas de genes da fitocistatina que estão distribuídas em sete cromossomos. Estes genes
se tornam canditados para utilização em programas de melhoramento genético que visem o
combate a podridão radicular em mandioca causado ôx Phytopythium sp.
Palavras chaves: Manihot escuíenla, Phytophytium sp, expressão diferencial, propagação

rápida da mandioca, produção de mudas.
ABSTRACT
Cassava is one of the most dynamic agricultural products in the world, being cultivated in
many countries, however your productive is affected by pathogens, mainly those witch cause
root rot, with Phytopythium sp. Studies related with identification of genes in the interaction
between cassava-P/?yto/?y//?7MOT sp. are not found in the literature. Therefore, the main
objective of thesis was prospecting genes involved in the mechanisms of response of cassava
to the agent that causes root rot. The thesis is divided in six chapter, the first does a general
contextualization, in second chapter was identified genes related with cassava immunity that
possess potential for combat against root rot pathogen, the third chapter discussed the
potential of phytocystatin in the control of plant diseases caused by fungi. In the chapter four
a search of the cassava genome was carried out by genes that will code phytocystatin and
these were characterized in silico and compared phylogenetically with phytocystatin from
other cultures. Chapter five is about the adaptations methodology of rapid propagation of
cassava for obtainment of seedlings aiming at greenhouse studies, such as the inoculation of
root rot agent in cassava plants. The sixth chapter presents the results aiming at the
inoculation of root rot agent of roots in cassava plants. The adaptation of the rapid
propagation method of cassava was effective in the production of seedlings for studies at the
molecular levei of the interaction of cassava -Phytopythium sp. In total, nine genes involved
in biotic stress response were investigated, of which seven presented differential expression
pattems in the roots inoculated with Phytopythium sp. The analysis of the cassava genome
resulted in the identification of novel phytochemical gene isoforms that are distributed on
seven chromosomes. These genes become eligible for use in breeding programs aimed at
combating root rot in cassava caused by Phytopythium sp.
Key words: Manihot esculenta, Phytophytium sp, differential expression, rapid propagation of
cassava, production of seedlings.

SUMÁRIO
RESUMO
ABSTRAT
1. CONTEXTUALIZAÇÃO 11
REFERÊNCIAS 23
2. PROPAGAÇÃO RÁPIDA DE MANDIOCA PARA ESTUDOS EM CASA DE 32
VEGETAÇÃO
RESUMO 33
ABSTRACT 34
2.1 Introdução 35
2.2 Material e Métodos 37
2.3 Resultados e Discussão 38
2.4 Conclusão 43
Referências 44
3. PODRIDÃO RADICULAR DA MANDIOCA: METODOLOGIA DE 53
INOCULAÇÃO E DESENVOLVIMENTO DA DOENÇA
RESUMO 54
ABSTRACT 55
3.1 Introdução 55
3.4 Conclusão 62
Referências 63
4. PADRÕES DIFERENCIAIS DE EXPRESSÃO GÊNICA EM RAÍZES DE 72
MANDIOCA INOCULADAS COM Phytopythium sp.
RESUMO 73
ABSTRACT 73
4.1 Introdução 74
4.4 Conclusão 89
Referências 90
5. PHYTOCYSTATINS AND THEIR POTENTIAL TO CONTROL PLANT 95
DISEASES CAUSED BY FUNGI
6. A FAMÍLIA DE GENES DE FITOCISTATINAS EM MANDIOCA: 104
CARACTERIZAÇÃO E ORGANIZAÇÃO GENÔMICA
RESUMO 105
ABSTRACT 105
6.1 Introdução 106
6.4 Conclusão 116
Referências 117
CONCLUSÕES GERAIS 120
ANEXOS 121
11
1. CONTEXTUALIZAÇÃO
1.1 A cultura da mandioca e a podridão radicular.
A mandioca {Manihot esculenta Crantz) pertence à classe das Eudicotiledôneas, à
ordem Malpighiales, à família Euphorbiaceae e ao gênero Manihot, sendo uma espécie de
arbusto nativo do Brasil e conhecida popularmente como mandioca, macaxeira e aipim
(CORDEIRO etal., 2017).
A mandioca é um dos mais dinâmicos produtos da agricultura mundial, sendo
cultivada em mais de cem países. As raízes são fontes de carboidratos e uma importante fonte
de alimentação para pessoas de baixa renda. A folha é fonte de carboidratos e proteínas.
Sendo que a maior teor de proteínas da mandioca está concentrado nas folhas denominadas de
manivas. As manivas tem potencialidade para ser utilizado na alimentação animal e como
matéria-prima para a agroindústria e o etanol (MATTOS e CARDOSO, 2003; LARA et al.,
2008; ANDRÉ e SANTOS, 2012).
O Brasil é um dos maiores produtores de mandioca e também um grande consumidor
(ALVES FILHO et al., 2015). Em 2016, o Brasil produziu mais de 23 milhões de toneladas
de mandioca, com rendimento médio de mais de 15 toneladas por hectare (IBGE, 2017). A
região Norte é responsável por 43% da produção Brasileira (Figura 1), sendo o estado do Pará
o mais representativo nesta região e no país, com produção total anual de mais de 6 milhões
de toneladas em 2016 (IBGE, 2017).
A mandioca é considerada uma cultura rústica e a maior parte dos cultivos está
concentrada em pequenos produtores, que se caracterizam pelo uso de poucos insumos no
manejo da cultura. Deste modo, o sistema rudimentar de manejo utilizado pela maioria dos
agricultores associado ao baixo uso de insumos são fatores responsáveis pelo baixo
rendimento da mandiocultura (ALVES FILHO et al., 2015).
A raiz da mandioca é uma das principais fontes de alimento nas populações de baixa
renda em países subdesenvolvidos. Neste sentido, programas de melhoramento genético,
atualmente estão focados em desenvolver variedades biofortificadas principalmente com a
presença de carotenoides como P-caroteno, encontrados nas raízes de coloração amarela
(IGLESIAS et al. 1997; MEZETTE et al, 2009; CARVALHO et al, 2012a; SILVA et al,
2014).
12
Figura 1. Percentual da produção de mandioca por regiões do Brasil. Destacando o percentual de produção da
região norte do Brasil.
Produção de mandioca por regiões do Brasil
1.4% 2.6%
6.5%
Rondônia
11.2%
"J- r
22% ArrHionai
16.5% ■ Roraima
43% so%
10% Amapá
Tocantins
20%
1.8%
Noits SNirsssts Sudeste kSU aCentro-Oeste
Fonte: Dados IBGE. (2017).
Estudo a nível molecular foi realizado por CARVALHO et al. (2012b), visando
fornecer informações a respeito do acúmulo de carotenoides na raiz de reserva da mandioca.
Logo, melhorar o conteúdo de precursores de vitamina A, como P-caroteno, em mandioca,
pode auxiliar, sobretudo em regiões de baixa renda, no combate a doença como a cegueira
noturna, distúrbios de crescimento e dificuldade de aprendizagem (UNDERWOOD e
SMITASII, 1999).
Os espécimes de mandioca podem ser classificados em dois grupos, conforme o teor
de ácido cianídrico presente. Um dos grupos é constituído por mandioca brava (também
conhecida como amarga) e o outro constituído pela mandioca mansa (também conhecida
como doce). O sabor amargo está associado ao potencial cianogênico, que é a capacidade da
liberação de ácido cianídrico, que é tóxico (LARA et a/., 2008).
A obtenção de mudas de mandioca é feita preferencialmente por propagação
vegetativa, onde pedaços do caule, chamados manivas-semente ou estacas, são utilizados para
gerar plantas geneticamente idênticas (SILVA et al., 2002; CARVALHO e GUERRA, 2002).
Em contraste, o uso de sementes em mandioca é limitado pela baixa taxa de fecundação das
flores, baixa germinação destas e levam mais tempo para se estabelecer e são menores e
menos vigorosas que as plantas oriundas de estacas (SILVA et al, 2002). Contudo, a
reprodução sexuada se mantém ativa, promovendo a variabilidade genética e possibilitando
aos melhoristas selecionar genótipos de maior importância agronômica (SILVA et al, 2001).
13
No Brasil, existe uma ampla variabilidade genética de mandioca, a qual se encontra
mantida em coleções de trabalho e bancos ativos de germoplasma distribuídos em todo o país.
Essa variabilidade é representada em sua maioria por variedades selecionadas naturalmente ou
por agricultores (FUKUDA et a/., 1996; VIEIRA et a/., 2007). Essas variedades representam
o alicerce dos sistemas de produção familiar, por isso são consideradas um patrimônio
genético importante para a segurança alimentar dos agricultores e para a preservação da
biodiversidade (FUKUDA et ai., 1996).
Apesar de sua rusticidade vários fatores relacionados a estresse biótico (Figura 2 A-E)
e abiótico (Figura 2 F) limitam a expansão da mandiocultura (BORGES et al., 2002;
OLIVEIRA et al, 2013; VENTURINI et al, 2015; VILAS-BOAS et al, 2016). Dentre os
fatores bióticos limitantes para a cultura da mandioca, a podridão radicular vem se tornando
uma doença de alto impacto econômico e social no Brasil (SERRA et al, 2009), pois provoca
queda progressiva na produtividade, com relatos de perdas de até 100% na produtividade de
raízes (MOSES et al, 2007), além de inutilizar as áreas para plantio ao longo dos ciclos da
cultura (NOTARO, 2013).
Figura 2. Fatores bióticos e abiótico que afetam a produção da mandioca. A- Brocas do caule. B- Cupins. C-
Mosca-branca. D- Àcaros. G-Podridão radicular. H- Deterioração pós-colheita.
Av
K m
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h w
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A C
L a/V
Vê
D
J
Fonte: Arquivo pessoal.
14
1.2. Podridão radicular da mandioca causada por Phytopythiuni.
No Estado do Pará, foram descritos como patógenos associados à podridão mole das
raízes, os oomicetos dos gêneros Phytophthora e Pylhium (FIGUEIREDO e
ALBUQUERQUE 1970; POLTRONIERI et al., 1997), o fungo Fusarium solani
(POLTRONIERI et al., 2002) e, recentemente, os oomicetos do gênero Phytopythiiim (Boari
et al., 2018).
O gênero Phylopylhium foi recentemente enquadrado no reino Chromista, filo
Oomicota, na ordem Pythiales e na família Pythiaceae. Esta alteração se deu ao analisar
molecularmente espécie de Pylhium, os resultados revelaram um grupo que se destaca como
sendo filogeneticamente distinto, denominado ciado K, resultando assim na criação do
gênero, onde as espécies possuem características intermédiárias entre Phytophthora e
Phytium (BALA et al., 2010; de COCK et al., 2015). Estudos mostraram que o oomiceto
Phytopythium sp. está associado à podridão da raiz de mandioca e a ferrugem de folhagem no
estado do Pará, sendo este o primeiro relato mundial de Phytopythium sp. causando podridão
radicular na mandioca (Boari et al., 2018).
As espécies de patógenos associadas à podridão mole das raízes em mandioca habitam
o solo e afetam principalmente as raízes tuberosas e o efeito do apodrecimento pode ser
camuflado até a colheita, já que a planta de mandioca tem um extenso sistema radicular,
podendo permanecer de pé, apesar de uma parcela significativa de suas raízes estarem podres.
A podridão mole é caracterizada pela deterioração completa da raiz e a exsudação de um
líquido de forte odor (MSIKITA et al., 2005; BANDYOPADHYAY et al, 2006).
A forma mais indicada de combate a podridão radicular das raízes é a rotação de
culturas, manejo físico do solo, o uso de microrganismos antagônicos, plantio em áreas bem
drenadas, utilização de manivas provenientes de áreas sem ocorrência da doença e destruição
do material vegetal originário de áreas infestadas (CASTILHO et al., 1990; FUKUDA, 1993;
FIALHO; VIEIRA, 2011). Porém, a forma mais econômica e confiável para manejar as
podridões radiculares da mandioca se baseia no plantio de variedades resistentes (ONYEKA
et al., 2005b).
A Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa) recomenda três acessos
(BRS Mari, BRS Kiriris e BRS Poti), que apresentam baixa produção comparada com outros
acessos, mas boa tolerância a podridão radicular (ALBUQUERQUE e BRANDÃO, 2008).
Estudos que busquem elucidar os mecanismos envolvidos na resistência destes acessos podem
15
contribuir para o desenvolvimento de acessos mais produtivos e resistentes à doença. No
entanto, faz-se necessário identificar os genes envolvidos na resposta da planta a patógenos.
1.3. Metodologias de propagação e ínoculação de plantas de mandioca com

Phyth opyth ium sp.
A propagação vegetativa da mandioca é um processo vantajoso porque mantêm as
características da planta mãe, mas por outro lado tem como fatores limitantes a baixa taxa de
multiplicação, a redução da qualidade sanitária da maniva durante ciclos sucessivos de
propagação, além da facilidade de transmissão de doenças através do material de propagação
(FUKUDA e CARVALHO, 2006; SANTOS et al., 2009; SILOTO e FERNANDES, 2016).
Para sanar essas dificuldades o Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT)
desenvolveu o método de propagação rápida da mandioca (COCK et al., 1976), o qual foi
testado em algumas regiões brasileiras, proporcionando um aumento significativo do fator de
multiplicação da cultura comparado com o método de propagação tradicional (SILVA et al.
2002; FUKUDA e CARVALHO, 2006; RODRIGUES et al. 2008; ALVES et al., 2009;
SANTOS et al. 2009; VIEIRA e MOURA, 2011).
Esta metodologia deve ser adaptada de acordo com as condições edafo-climáticas da
região onde os experimentos são conduzidos e as características genéticas da acesso usada
(RODRIGUES et al. 2008; ALVES et al. 2009; SANTOS et al. 2009; VIEIRA e MOURA,
2011; SILOTO e FERNANDES, 2016). O método de propagação rápida da mandioca ainda
não foi testado para as condições climáticas da região de Belém. Além disso, a utilização
deste método pode possibilitar a obtenção de plantas de mandioca com raízes tuberizadas
adequadas para estudos em condições controladas de casa de vegetação.
Um dos desafios da identificação de fontes de resistência a podridão radicular nos
germoplasmas de mandioca é a falta de metodologias adequadas para a seleção de genótipos
por meio de inoculações artificiais, de modo a refletir o comportamento destes em condições
de campo. O método de inoculação de raízes destacadas, apesar de ser a metodologia de
seleção atualmente utilizada na busca por genótipos resistentes à podridão radicular, é uma
metodologia que necessita de uma programação na colheita das raízes (com tempo mínimo de
10 meses de plantio) e uma minuciosa triagem para que não sejam utilizadas raízes com
injúrias e com infecções provenientes do campo (ONYEKA et al., 2005a; OLIVEIRA et al.,
2013; VILAS-BOAS et al, 2016). Sendo, necessário estabelecer protocolos de inoculação

16
que visem inocular plantas jovens e em condições controladas para serem utilizadas nos
experimentos que visem identificar os genes envolvidos na resposta da mandioca a patógenos.
1.4 Mecanismos de resistência das plantas contra patógenos
As plantas estão continuamente expostas a microrganismos, patogênicos ou não, e
desenvolveram, durante o processo de evolução, mecanismos diferenciados de defesa que
quando são acionados traduzem essa percepção em uma resposta apropriada. Os
fitopatógenos, em especial, usam diversas estratégias, como a liberação de moléculas efetoras
(efetores de virulência) na célula da planta, garantindo uma maior aptidão ao patógeno
(JONES e DANGL, 2006; THAKUR e SOHAL, 2013).
As plantas respondem ao ataque de patógenos com um sistema de defesa que evita a
infecção ou combate aos patógenos que as infectam. As alterações que constituem o sistema
de resistência da planta podem ser agrupadas em constitutiva e indutível, e os mecanismos de
defesa variam de morfológicos a estruturais e químicos (FERREIRA et ai., 2007).
A interação entre a planta e o patógeno pode ser divida em dois tipos básicos: a
interação compatível e a interação incompatível. Na interação compatível, o patógeno invade
o tecido vegetal, multiplica-se e provoca doença na planta. Na interação incompatível, o
patógeno, ao penetrar no tecido vegetal, encontra as defesas da planta que irão impedir sua
multiplicação, resultando na resistência. A intensidade do mecanismo de defesa da planta
depende da capacidade do vegetal de reconhecer certos patógenos. Os patógenos são
classificados em dois tipos: virulentos e avirulentos (BOREM & MIRANDA, 2013).
A expressão da resistência é governada tanto por genes R da planta quanto por genes
de Avirulência (Avr) correspondente do patógeno. Uma vez que o reconhecimento específico
é realizado, uma resposta forte e rápida é desencadeada no local da infecção. Esta resposta é
conhecida como reação de hipersensibilidade (HR) e é característica de interações
incompatíveis (ELVIRA et ai, 2008). Desta forma, HR aciona o sistema de resistência
adquirida (SAR) que confere uma imunidade para um amplo espectro de patógeno. Os
mecanismos de defesa de uma planta são controlados geneticamente e dependem da expressão
de determinados genes no momento e magnitude adequados após o contato do patógeno com
o hospedeiro (PIETERSE et ai, 2014).
Plantas quando em contato com microorganismos ativam, em nível celular, receptores
de reconhecimento de padrões (PRRs), presentes na membrana celular ou no citoplasma das
células. Os PRRs das células vegetais estão localizados na membrana plasmática,

17
apresentando dois tipos estruturais básicas, receptors like Kinases (RLKs) e receptors Like
Proteínas (RLPs), ambos possuindo um domínio funcional modular. PRRs reconhecem
moléculas do patógeno, conhecidas como padrões moleculares conservados associados à
patógenos (PAMPs). Como esses epítetos estão presentes também em microorganismos não
patogênicos, é comum encontrar o termo MAMPs (Padrões moleculares associados a
microorganismos) (CHISHOLM et ai, 2006; JONES e DANGL, 2006; PIETERSE et ai,
2014).
Segundo JONES e DANGL (2006), o sistema de defesa vegetal pode ser representado
por um modelo de quatro fases denominado "Zig-Zag" (Figura 3) em que na fase 1 PAMPs
são reconhecidos por PRRs resultando na imunidade disparada por PAMPs (PTI); na fase 2
patógenos que obtiveram sucesso liberam efetores que interferem na PTI, desencadeando uma
suscetibilidade disparada por efetores (ETS); na fase 3 o efetor é especificamente reconhecido
por uma proteína R resultando em imunidade disparada por efetores (ETI).
Figura 3: Modelo Zig-Zag do sistema imune em plantas. No esquema, as plantas detectam padrões moleculares
associados a patógenos (PAMPs. losangos vermelhos) via PRRs para desencadear a imunidade disparada por
PAMPs (PTI). Patógenos de sucesso produzem efetores que interferem com a PTI. resultando em suscetibilidade
desencadeada por efetores (ETS). Se um efetor (indicado em vermelho) é reconhecido por uma proteína da
planta NB-LRR. a imunidade disparada por efetores (ETI) é ativada, sendo uma versão amplificada de PTI que
permite a indução da morte celular e resposta de hipersensibilidade (HR). Isolados do patógeno podem evoluir,
perdendo efetores (em vermelho) ou ganhar novos efetores (em azul), permitindo que o patógeno suprima ETI.
Tal seleção, então, favorecem novos alelos NB-LRR a evoluir e reconhecer um dos efetores recém-adquirido.
resultando novamente em ETI.
PTI ETS ETI ETS ETI

Alta
Limiar para HR
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efetiva
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Baixa 0^0
v
PAMPS
Fonte: Adaptado de Jones e Dangl (2006).
18
Os PAMPs são definidos como moléculas de epítopos invariantes, que são
fundamentais para a adequação dos diferentes microrganismos patógenos, ausentes no
hospedeiro, porém reconhecidas por eles (LIU et ai, 2013). A primeira molécula claramente
definida como um PAMP foi a Pepl3, um peptídeo curto de 13 aminoácidos com uma
superfície exposta dentro de um fragmento de transglutaminase cálcio dependente da parede
celular da Phytophthora sojae, que provoca respostas de defesa em Solanaceae
(NURNBERGEN et ai, 2004).
Considerando sua estrutura molecular, a maioria dos PAMPs pode ser dividida em
polissacarídeos e polipeptídios. Os representantes mais conhecidos do primeiro grupo são
Lipopolissacarideos presentes na membrana das bactérias gram-negativas, peptídeoglicanos
encontrados na membrana celular das bactérias gram-negativas e gram-positivas, e quitina
presente na parede celular de fungos (LRJ et ai, 2013; NEWMAN et ai, 2013).
Os principais polipeptídios são flagelina microbiana, proteína componente do flagelo
de bactérias e fator Tu de alongamento, proteína envolvida na biossíntese da cadeia de
aminoácidos pelos ribossomos bacterianos (NEWMAN et al, 2013). O domínio N-terminal
da flagelina (flg22) é altamente conservado e reconhecido pela maioria das plantas (ZIPFEL e
FELIX, 2005). A planta do tomate é capaz de reconhecer uma versão mais curta do mesmo
epítopo (flglS) e o arroz parece ser insensível à flg22, mas pode reconhecer a molécula de
flagelina como um todo (TAKAI et al, 2007; WAN et al, 2008).
O elicitor lecitina que se encontra ligado à celulose, em Phytophthora parasitica var.
nicotianae, foi identificado como o responsável pelo mecanismo de disparo de respostas de
defesa em Arabidopsis e tabaco (GAEILIN et al, 2006). Esses dois pontos de ligação com a
celulose, que são provavelmente relevantes na adesão celular durante a infecção, são
suficientes para a indução de defesa. Outras PAMPs mais amplamente reconhecidas são
derivadas de componentes da parede celular de fungos, tais como beta-glucanas, ergosterol ou
quitina (MIYA et al, 2007).
Nos últimos anos, diversos estudos mostraram a relevância dos PAMPs e sua ligação
com a imunidade das plantas. Muitos receptores para os PAMPs ainda precisam ser
identificados e mais estudos devem ser desenvolvidos para uma melhor compreensão de como
as mais diversas plantas respondem ao estresse causado no vegetal durante o processo de
patogênese (HENRY et al, 2012; NEWMAN et al, 2013).
O sistema de defesa vegetal apresenta dois níveis. Durante o primeiro nível de defesa,
a célula vegetal reconhece os PAMPs/ MAMPs, através dos seus receptores de
reconhecimento de padrão presentes na superfície celular, desencadeando a imunidade ativada

19
por PAMP {PAMPs-triggered immunily - PTI) (CHISHOLM et ai, 2006). Sendo esta fase
essencial para a ativação da imunidade inata nas plantas. Pois, há estudos demonstrando que
plantas com mutações nos PRRs são susceptíveis a infecções microbianas (ZIPFEL, 2009).
Uma vez que as barreiras da primeira linha de defesa são ultrapassadas, as plantas
desenvolveram um mecanismo mais especializado para detectar e combater o ataque de
microrganismos patogênicos, a imunidade desencadeada por efetor {effector triggered
immunity - ETI), que apresenta como principal característica a morte celular e necrose
tecidual no local da infecção, esta conhecida como reação de hipersensibilidade (CHISHOLM
et ai, 2006). Nessa fase, a efetividade do patógeno em conseguir secretar proteínas efetoras
no citoplasma da célula é combatida por proteínas especializadas, que atuam como receptores
conhecidas como proteínas de resistências, sendo essas proteínas expressas por genes
conhecidos como genes de resistência ou genes R (DANGL E JONES, 2006; DANGL et ai,
2013) (Figura 4).
A maioria dos genes R codificam membros de uma superfamília extremamente
polimórfica de repetição rica em leucina (NLR) que são receptores de nucleotídeos de
ligação, que funcionam intracelularmente e âncora o segundo nível do sistema imunológico da
planta. Proteínas específicas NLR são ativadas por efetores específicos do patógenos. Essa
interação pode ser via direta entre a molécula efetora e o receptor. Alternativamente, através
da modificação da proteína efetora por uma molécula Decoy (Isca) que é reconhecida pelo
receptor somente quando sofre a mudança. E também através do reconhecimento da molécula
efetora mediada pela alteração de um alvo de virulência hospedeiro, tal como a de um
domínio citosólico, PRR; cada um desses três processos de reconhecimento desencadeia a ETI
(DANGL et ai, 2013).
O desenvolvimento da doença, em plantas é, na maioria das vezes, um evento raro.
Isso se deve a eficiência na reposta, que não se restringe apenas aos receptores, ativada tanto
na PTI quanto ETI. Plantas sobre estresse biótico possue vasto e variado mecanismo de defesa
que incluem barreiras estruturais e bioquímicas, ambos pré e/ou pós-formados em relação à
tentativa de penetração do patógeno no hospedeiro. Dentre os mecanismos encontrados
podemos citar as barreiras estruturais pré-formadas, representadas principalmente pelo
processo de lignificação da parede celular das plantas vasculares (TOBIMATSU et ai, 2013).
E as barreiras químicas pré-formadas, estas representadas principalmente pelas Proteínas
Relacionadas à Patogênese, conhecidas também como proteínas PR (VAN LOON et al,
2006).
20
Figura 4: Célula vegetal infectada por patógenos de todas as classes; Em (1) a célula reconhece os PAMPs
através dos PRR extracelulares ativando a PTI; Em (2) mostra a capacidade que os patógenos possuem de
secretar proteínas efetoras no citoplasma da célula inativando a resposta PTI (3); Intracelular NLRs percebem as
moléculas efetoras por três vias: Através da ligação direta entre a molécula efetora e o receptor (4a); Através da
modificação da proteína efetora por uma molécula Decoy (Isca) que é reconhecida pelo receptor somente quando
sofre a mudança (4b); através do reconhecimento da molécula efetora mediada pela alteração de um alvo de
virulência hospedeiro, tal como a de um domínio citosólico. PRR (4c); cada um desses três processos de
reconhecimento desencadeia a ETI (5).
fungos/
Bactéria Nematoide Afidío Oomicetos
PAMPs/MAMPs
Q
Ü o —w-J
O
o O 'TTSS Estiletes
Co- Hauslorio
PR
Efetores
O
Efetores
NLRs
Intracelular
/ Q Efetores
rr m
ÇftA, 9 CUD> Atívaçao
NLR Decoy
Expressão de
genes de
imunidade
PRR
Efetores
Núcleo
Fonte: Adaptado de Dangl et ai. (2013).
1.5. Prospecção de genes de resposta da mandioca à podridão radicular
O estudo da indução de genes de defesa nas plantas é algo que vem sendo feito há
mais de quatro décadas (GREEN e RYAN, 1972) e, ainda hoje, existem pontos não
esclarecidos a respeito deste processo (DANGL e JONES, 2006; DANGL et al., 2013;
ZIPFEL e OLDROYD, 2017).

21
Vários métodos permitem isolar e manipular genes específicos de interesse agronômico,
como os que conferem resistência a condições de estresses bióticos e abióticos e também
aqueles que podem aumentar o valor nutricional das culturas. Este conhecimento permitiu que
algumas culturas fossem modificadas. Dentre as culturas melhoradas e que são amplamente
utilizadas, podemos citar: a soja (resistente a herbicida), algodão (resistente a insetos) milho
(resistente a herbicida e insetos), mamão (resistente a vírus), tomate (alteração no
amadurecimento) e arroz (maior qualidade nutricional) (BESPALHOK et ai, 2017).
Desta forma, torna-se evidente a importância dos estudos moleculares de expressão
gênica na compreensão das respostas de defesa das plantas contra os patógenos. A busca por
genes diferencialmente expressos em plantas resistentes e susceptíveis a patógenos vem sendo
realizadas em diversas plantas tais como, tomate (AMARAL et ai., 2008), Piper tuberculatum
(NASCIMENTO et ai., 2009), pimenteira-do-reino (DE SOUZA et ai., 2011), maçã (BALDO
et ai., 2010), couve-flor (JIANG et ai., 2011), uva (LEGAY et ai., 2011), soja (WANG et ai.,
2012), banana (TIMM et ai., 2016), cana-de-açúcar (SATHYABHAMA et ai., 2016) e trigo
(ALTAWEEL et ai, 2017).
A identificação de genes de genes de resposta da mandioca ao agente causador da
podridão radicular pode contribuir para, no futuro, obter-se acessos melhoradas. Nas buscas
realizadas na literatura não há relatos de estudos que visem identificar genes de resposta a
estresse biótico da interação Mandioca- Phytopythium sp.. Espera-se ao final dos
experimentos confirmar a hipótese de que a mandioca expressa genes de forma diferencial
quando em contato com o agente causador da podridão radicular. Com isso, o presente
trabalho tem como objetivo principal a prospecção de genes envolvidos nos mecanismos de
resposta da mandioca ao agente causador da podridão radicular. Para satisfazer os objetivos
traçados, fora realizados 5 trabalhos no qual estão descritos nos capítulos que constituem esta
tese.
Este primeiro procura levantar os dados já descritos na literatura sobre o tema em
questão. O segundo capítulo trata de uma adaptação no método de propagação rápida da
mandioca para a obtenção de mudas visando estudos em casa de vegetação, tais como, a
inoculação do agente causador da podridão radicular das raízes em plantas de mandioca. A
metodologia de propagação rápida da mandioca foi proposta para contornar o baixo índice de
multiplicação da cultura. Uma vez que estudos que utilizem material destacado não possibilita
a análise da planta como um todo e para estudar a interação mandioca- Phytopythium sp. em
plantas foi necessário estabelecer um método de obtenção de material que possibilitasse os
estudos em condições controladas.

22
O terceiro capítulo apresenta os resultados visando realizar a inoculação do agente
causador da podridão radicular das raízes em plantas de mandioca. Por se tratar dos primeiros
esforços para estudar os mecanismos envolvidos na interação foi necessário desenvolver um
método para realizar a inoculação do agente causador da podridão radicular das raízes de
mandioca e assim possibilitar a produção de material vegetal adequado para os estudos
moleculares desta interação planta-patógeno. As mudas foram produzidas utilizando o método
de propagação rápida da mandioca. Para a inoculação, as mudas foram infestadas com uma
mistura de areia e fubá (3:1) com discos de meio mandioca dextrose ágar contendo micélio do
isolado CT084 e seus efeitos analisados. Foi possível observar sinais característicos da
doença nas plantas inoculadas quando comparadas com as plantas controle.
O quarto capítulo deste trabalho visa identificar genes relacionados à imunidade de
mandioca que possuam potencial para atuar na defesa desta planta contra o agente causador
da podridão mole das raízes e analisar sua expressão em raízes de mandioca inteiras
inoculadas com Phytopythhim sp..
O quinto capítulo visa discutir o potencial das fitocistatinas no controle de doenças de
plantas causadas por fungos, uma vez que uma fitocistatina foi identificada como
potencialmente envolvida na resposta da mandioca ao ataque do Phytopythium sp. Os
inibidores de proteases cisteínicas, também conhecidos como cistatinas, são um grupo de
proteínas que se ligam às proteases cisteínicas inibindo sua atividade. As cistatinas de plantas
ou fitocistatinas já foram identificadas em diversas espécies vegetais (FERNANDES et a/.,
1993; WALDRON et ai, 1993; ABE et ai, 1995; MISAKA et al, 1996; JOSHI et al, 1998;
KURODA et al, 2001; RYAN et al, 2003; SHYU et al, 2004; BANGRAK et al, 2011).
Possuem várias funções como a regulação dos processos de maturação e germinação das
sementes (OJIMA et al, 1997; RASSAM et al, 2004), a regulação da morte celular
programada (BELENGHI et al, 2003) e funções de defesa em resposta a estresse biótico
(HINES et al., 1991; MARTINEZ et al, 2005; PIROVANI et al, 2010) e abiótico (DIOP et
al, 2004; HWANG et al, 2010).
O sequenciamento de todo o genoma da mandioca tomou possível à análise dos genes
que irão codificar fitocistatinas. No sexto capítulo foi realizada uma busca no genoma da
mandioca por genes que irão codificar fitocistatina e estes foram caracterizados />? silico e
comparados filogeneticamentes com fitocistatinas identificadas em cacau, seringueira e
inhame. Os resultados obtidos contribuirão para futuros estudos funcionais que possam ser
realizados com as fitocistatinas de mandioca.

23
REFERÊNCIAS
ABE, M.; ABE, K.; DOMOTO, C.; ARAI, S. Two distinct species of corn cystatin in com
kemels. Biosci. Biotechnol. Biochem. v. 59, p. 756-758, 1995.
AGRIOS, G. N. Plant pathology . 5a edição. Amsterdam: Elsevier, 2004. 922 p.
ALBUQUERQUE, A. S.; BRANDÃO, I. C. D. Acessos BRS Mari e BRS Poti e medidas de

controle da podridão-mole da mandioca. Belém, PA: Embrapa Amazônia Oriental,
Documentos, 326 ISSN 1517-2201, 2008. 27p.
ALTAWEEL, K.; AMARASINGHE, C. C.; BRÚLÉ-BABEL, A. L.; FERNANDO, W. D.

Gene expression analysis of host-pathogen interaction between wheat and Fusarium
graminearum. European Journal of Plant Pathology, v.l, p.13, 2017.
ALTSCHUL, S. F.; MADDEN, TE, SHAFFER AA, ZHANG J, ZANGH Z, MILLER W,

LIPMAN DJ. Gapped Blast and PSI-Blast a new generation of protein database search
programs. Nucleic Acids Res., v.25, p. 3389-3402, 1997.
ALVES AAC, CUNHA AF. 2003. Cultivo da Mandioca para a Região Semi-Árida. Embrapa
Mandioca e Fruticultura Sistemas de Produção, 12. ISSN 1678-8796. Versão eletrônica.
ALVES, J. M. A.; ARRUDA, K. R.; RODRIGUES, G. S.; UCHÔA, S. C. P.;

ALBUQUERQUE, J.A.A. Brotação de manivas para a propagação rápida da mandioca.
Revista Raízes e Amidos Tropicais, v. 5, p. 280-284, 2009.
ALVES FILHO, P. P. DA C.; GALVÃO, J. R.; NEVES, L. B.; COSTA, I. DOS R. Produção
de Mandioca acesso roxinha, Igarapé-Açu, Pará em resposta à adubação NPK. Revista Raízes
e Amidos Tropicais, v. 11, n. 1, p. 1-7, 2015.
AMARAL, D. O. J., LIMA, M. M. A., RESENDE, L. V., & SILVA, M. V. Differential gene
expression induced by salicylic acid and Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici infection, in
tomato. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.43, p. 1017-1023, 2008.
ANDRÉ, TB. e SANTOS, A.C. Uso de produtos da cultura da mandioca (Manihot) na

produção animal. Enciclopédia Biosfera, v.8, n.15, p.1622-1647, 2012.
BALA, K.; ROBDEAU G.P.; LÉVESQUE C A. Phytopythium Abad, de Cock, Bala,

Robideau, Lodhi e Lévesque, gen. nov. and Phytopythium sindhum Lodhi, Shahzad e
Lévesque. Fungai Planet 49. Persoonia 24: 136-137. 2010.
BALDO, A., NORELLI, J. L., FARRELL, R. E., IR., BASSETT, C. L., ALDWINCKLE, H.
S., & MALNOY, M. Identification of genes differentially expressed during interaction of
resistant and susceptible apple acessos (Malus x domestica) with Erwinia amylovora. BMC
Plant Biology, v.10, p.l, 2010.
BANDYOPADHYAY, R.; MWANGI, M.; AIGBE, S. O.; LESLIE, J. F. Fusarium species

firom the cassava root rot complex in West África. Phytopathology, v. 96, p. 673-676, 2006.
24
BANGRAK, P.; CHOTIGEAT,W. Molecular cloning and biochemical characterization of a

novel cystatin from Hevea rubber látex. Plant Physiol. Biochem., v. 49, p.244-250, 2011.
BELENGHI, B.; ACCONCIA, F.; TROVATO, M.; PERAZZOLLI, M.; BOCEDI, A.;
POLTICELLI, F.; ASCENZI, P.; DELLEDONNE, M. AtCYSl, a cystatin from Arabidopsis
thaliana, suppresses hypersensitive cell death. Eur. J. Biochem. v. 270, p. 2593-2604, 2003
BESPALHOK F., J.C.; GUERRA, E.P.; OLIVEIRA, R. Plantas Transgênicas. Disponível

em: <http://www.bespa.agrarias.ufpr.br/paginas/livro/capitulo%20transgenicos.pdf>.
Acessado em: 09 junho 2017.
BOARI, A. J., QUADROS, A. F. F., CUNHA, E. M., FERNANDES, A. F., & BARRETO, R.
W. First report of Phytopythium sp. causing storage root rot and foliage blight of cassava in
Brazil. Plant Disease, https://doi.org/10.1094/PDIS-09-17-1449-PDN, 2018.
BORÉM, A. e MIRANDA, G.V. Melhoramento de Plantas. Viçosa. Editora UFV, 5a

edição, 2013. 529p.
BORGES, M.F.; FUKUDA, W.M.G; ROSSETTI, AG. Avaliação de variedades de

mandioca para consumo humano. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.37, p. 1559-1565,
2002.
CARVALHO, L. M.; OLIVEIRA, A. R.; GODOY, R. L.; PACHECO, S.; NUTTI, M. R.; DE
CARVALHO, J.L.; PEREIRA, E. J.; FUKUDA, W.G. Retention of total carotenoid and 13-
carotene in yellow sweet cassava (Manihot esculenta Crantz) after domestic cooking. Food
Nutr. Res., v.56, 15788, 2012a. doi: 10.3402/fnr.v56i0.15788.
CARVALHO L. J. C. B ; LIPPOLIS, J. ; CHEN, S. ; DE SOUZA, C. R. B. ; VIEIRA, E. A. ;

ANDERSON, J. . Characterization of carotenoid-protein complexes and gene expression
analysis associated with carotenoid sequestration in pigmented cassava (Manihot esculenta
Crantz) storage root. Open Biochem. J., v. 6, p. 116-130, 2012b.
CARVALHO, R.; GUERRA, M. Cytogenetics of Manihot esculenta Crantz (cassava) and

eight related species. Hereditas, v.136, p.159-168, 2002.
CASTILHO, E.; FUKUDA, C.; TUPINAMBÁ, E. A. Podridão radicular no Estado de

Sergipe. I-Isolamento e patogenicidade. Revista Brasileira de Mandioca, v.9, p. 90-99,
1990.
COCK, J.H; WHOLEY, D.; LOZANO J.C.; TORO, J.C. Sistema rápido de propagación de
yuca. Colômbia: Centro Internacional de Agricultura Tropical, 1976. 12 p. (Serie ES: Centro
Internacional de Agricultura Tropical. N0. 20). Disponível em http://ciat-
library.ciat.cgiar.org/ciat_digital/CIAT/books/historical/147.pdf. Acessado em: 15 out. 2017.
CORDEIRO, T; SECCO, R.; SILVA, M.J.DA; SODRÉ, R.C.; MARTINS,

M.L.L. Manihot in Lista de Espécies da Flora do Brasil. Jardim Botânico do Rio de Janeiro.
Disponível em: http://floradobrasil.jbrj.gov.br/jabot/floradobrasil/FB17600. Acesso em: 22
Jun. 2017.
25
COSTA, C. N.M.; SANTA-BRÍGIDA, A. B.; BORGES, B. N.; MENEZES-NETO, M. A.;

CARVALHO, L. J. C. B.; DE SOUZA C. R. B. Leveis of MeLEAS, a cDNA sequence
coding for an atypical late embryogenesis abundant protein in cassava, increase under in vitro
salt stress treatment. Plant Mol. Biol. Rep., v. 29, p. 997-1005, 2011.
CHISHOLM, S. T.; COAKER, G; BRAD DAY, B.; STASKAWICZ, B. J. Host-Microbe

Interactions: Shaping the Evolution of the Plant Immune Response. Cell, v.124, p.803-814,
2006.
CHOI, H.W.; HWANG, B. K. The pepper extracellular peroxidase CaP02 is required for salt,
drought and oxidative stress tolerance as well as resistance to fungai
pathogens. Planta, v. 235 p. 1369-1382, 2012.
DANGL, J. L.; HORVATH, D. M..;STASKAWICZ, B. J. Pivoting the Plant Immune System

firom Dissection to Deployment. Science, v. 341, p.746-751, 2013.
DE COCK, A. W. A. M ; LODHI, A. M.; RINTOUL, T. L.; BALA, K., ROBIDEAU, G. P.;

ABAD, Z. G.; ... LÉVESQUE, C. A. Phytopythium: molecular phylogeny and
systematics. Persoonia: Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi, v. 34, p. 25-39,
2015.
DE SOUZA, C. R. B.; CARVALHO, L. J. C. B.; CASCARDO, J. C. M. Comparative gene

expression study to identify genes possibly related to storage root formation in cassava.
Protein Pept. Lett. V. 11, p. 577-582, 2004.
DE SOUZA CRB, SANTA BRÍGIDA AB, DOS SANTOS RC, COSTA CNM, DARNET
SH, HARADA ML. Identification of sequences expressed during compatible black pepper -
Fusarium solani f. sp. piperis interaction. Acta Physiologiae Plantarum, v.33, p.2553-2560,
2011.
DIATCHENKO L, LAU, Y-FC, CAMPBELL AP, CHENCHIK A, MOQADAM F, HUANG

B, LUKYANOV S, LUKYANOV K, GURSKAYA N, SVERDLOV ED, SIEBERT PD.
Suppression subtractive hybridization: a method for generating differentially regulated or
tissue-specific cDNA probes and libraries. PNAS, v.93, p.6025-6030, 1996.
DIOP, N.N.; KIDRIC, M.; REPELLIN, A.; GAREIE, M.; D'ARCY-LAMETA, A.; PHAM
THI, A.T.; ZUILY-FODIL, Y. A multicystatin is induced by drought-stress in cowpea (Vigna
unguiculata (L.) Walp.) leaves. FEBS Lett, v. 577, p. 545-550, 2004.
EL VIRA MI, MOLINA GALDEANO M, GILARDI P, GARCÍA-LUQUE I, SERRA MT.

Proteomic analysis of Pathogenesis-Related proteins (PRs) induced by compatible and
incompatible interactions of pepper mild mottle virus (PMMoV) in Capsicum chinense L3
plants. Journal of Experimental Botany, v.59, p. 1253-1265, 2008.
FELIPE, F. T; ALVES, L.R.A.; VIEIRA, R.M. Fécula de mandioca. Produção na Tailândia

versus Brasil. Agroanalysis, p.28, 2013.
FERNANDES, K. V. S.; SABELLI, P. A.; BARRATT, D. H. P.; RICHARDSON, M.;

XAVIER-FILHO, J.; SHEWRY, P. R. The resistance of cowpea seeds to bruchid beetles is
26
not related to leveis of cysteine proteinase - inhibitors. Plant Mol. Biol., v. 23, p.215-219,
1993.
FERREIRA RB, MONTEIRO S, FREITAS R, SANTOS CN, CHEN Z, BATISTA LM,

DUARTE J, BORGES A, TEIXEIRA AR. The role of plant defense proteins in fungai
pathogenesis. Molecular Plant Pathology, v. 8: p.677-700, 2007.
FIALHO, J. F.; VIEIRA, E. A. Mandioca no Cerrado: orientações técnicas. Embrapa

Cerrados, p. 208, 2011.
FUKUDA, C. Doenças da mandioca. In: Centro Nacional de Pesquisa de Mandioca e

Fruticultura Tropical (Cruz das Almas, BA). Instruções práticas para o cultivo da mandioca,
p.53-56, 1993.
FUKUDA, W.; de CARVALHO, H. W. L. Propagação rápida de mandioca no nordeste

brasileiro. Aracajú: Embrapa Tabuleiros Costeiros, 2006. 6 p. (Embrapa Tabuleiros
Costeiros. Circular Técnica, 45). Disponível em
http://www.infoteca.cnptia.embrapa.br/handle/doc/372216. Acessado em: 15 out. 2017.
FUKUDA, W.M.G; COSTA, I.R.S.; VILARINHOS, A.D.; OLIVEIRA, R.P. Banco de

germoplasma de mandioca: manejo, conservação e caracterização. Embrapa-CNPMF:
Cruz das Almas-Bahia, 1996. (Documento, 68).
FUKUDA, W. M. G.; COSTA, I. R. S.; SILVA, S. O. Manejo e conservação de recursos

genéticos de mandioca (Manihot esculenta Crantz) na Embrapa Mandioca e
Fruticultura Tropical.Cruz das Almas: EMBRAPA-CNPMF, 2005. 4 p. (Circular Técnica,
74).
GAULIN, E.; DRAME, N.; LAFITTE, C.; TORTO-ALALIBO, T.; MARTINEZ, Y.;
AMELINE-TORREGROSA, C.; KHATIB, M.; MAZARGUIL, H.; VILLALBA-MATEOS,
F.; KAMOUN, S. Cellulose binding domains of a Phytophthora cell wall protein are novel
pathogen-associated molecular patterns. Plant Cell, v. 18, n. 7, p. 1766-1777, 2006.
GREEN, T.R. & RYAN, C.A. Wound-induced proteinase inhibitors from tomato leaves: a
possible defense mechanism against insects. Science, v. 175, p. 776-777, 1972.
HALL T. A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis

program for windows 95/98 /NT. Nuc. Acid Symp. Ser., v. 41, p. 95-98, 1999.
HENRY, G, THONART, P., AND ONGENA, M. PAMPs, MAMPs, DAMPs and others: an
update on the diversity of plant immunity elicitors. Biotecbnol. Agron. Soe. Environ. v. 16,
p.257-26, 2012.
HINES, M. E.; OSUALA, C. T; NIELSEN, S. S. Isolation and partial characterization of

soybean cystatin cysteine proteinase inhibitor of coleopteran digestive proteolytic activit. J.
Agric. Food Chem., v. 39 (8), p.1515-1520. 1991.
HU , L.; YANG, Y.; JIANG, L. AND LIU, S. "The catalase gene family in cucumber:
genome-wide identification and organization," Genetics and Molecular Biology, v. 39, p.
408-415,2016.
27
HWANG, J.E.; HONG, J.K.; LIM, C.J.; CHEN, H.; JE, J.; YANG, K.A.; KIM, D.Y.; CHOI,
Y.J.; LEE, S.Y.; LIM, C.O. Distinct expression pattems of two Arabidopsis phytocystatin
genes, AtCYSl and AtCYS2, during development and abiotic stresses. Plant Cell Rep. v. 29,
p. 905-915, 2010.
IGLESIAS, C.; MA YEN, J.; CHÁVEZ, L.; CALLE, F. Genetic potential and stability of
carotene content in cassava roots. Euphytica, v.94, p. 367-373, 1997
JIANG, EL, SONG, W., LI, A., YANG, X., & SUN, D. Identification of genes differentially
expressed in cauliflower associated with resistance to Xanthomonas campestris pv.
campestris. Molecular biology reports, v. 38, n. 1, p. 621-629, 2011.
JONES JDG, DUNSUMUIR P, BEDBROOK J. High levei expression of introduced

chimaeric genes in regenerated transformed plants. EMBO Journal,v. 4, p. 2411-2418, 1985.
JONES, J. D. G; DANGL, J. L. The plant immune system. Nature, v. 444, p. 323-329, 2006.
JOSHI, B. N.; SAINANI, M. N.; BASTAWADE, K. B.; GUPTA, V. S.; RANJEKAR, P. K.

Cysteine protease inhibitor from pearl millet: a new class of antifungal protein. Biochem.
Biophys. Res. Commun., n. 246, p. 382-387, 1998.
KURODA, M.; KIYOSAKI, T.; MATSUMOTO, I.; MISAKA, T.; ARAI, S.; ABE, K.
Molecular cloning, characterization, and expression of wheat cystatins. Biosci. Biotechnol.
Biochem., v. 65, p. 22-28, 2001.
LACERDA, A., VASCONCELOS, É. A. R., PELEGRINI, P. B., & GROSSI-DE-SA, M. F.

Antifungal defensins and their role in plant defense. Frontiers in microbiology, v. 5, p. 116.
2014.
LARA, A. C. C.; BICUDO, S. J.; BRACHTVOGEL, E. L.; ABREU, M. L.; CURCELLI F.

MELHORAMENTO GENÉTICO DA CULTURA DA MANDIOCA (Manihol esculenta
Cranlz). Revista Raízes e Amidos Tropicais, v. 4, p.55-65, 2008.
LEGAY, G., MAROUF, E., BERGER, D., NEUHAUS, J. M., MAUCH-MANI, B., &
SLAUGHTER, A. Identification of genes expressed during the compatible interaction of
grapevine with Plasmopara viticola through suppression subtractive hybridization
(SSH). European journal of plant pathology, v. 129, n. 2, p. 281-301, 2011.
LIU, W.; LIU, J.; NING, Y.; BO DING, B.; WANG, X.; WANG, Z.; GUO-LIANG WANG.,
G. L. Recent Progress in Understanding PAMP- and Effector-Triggered Immunity against the
Rice Blast Fungus Magnaporlhe oryzae. Molecular Plant, v.6, n.3, p. 605-620, 2013.
MALONE, G.; ZEMMER, P. D.; MENEGHELLO, G. E.; BINNECK, E. ; PESKE, S. T.

Prospecção de Genes em Bibliotecas de cDNA. Revista Brasileira de Agrociências, v. 12, p.
7-13, 2006.
MARTINEZ, M.; ABRAHAM, Z.; GAMBARDELLA, M.; ECHAIDE, M.; CARBONERO,

P.; DIAZ, I. The strawberry gene Cyfl encodes a phytocystatin with antifungal properties. J.
Exp. Bot., v. 56, p. 1821-1829, 2005.
28
MATTOS, P. L. P. de.; CARDOSO, E. M. R. Cultivo da mandioca para o Estado do Pará.

Cruz das Almas: Embrapa Mandioca e Fruticultura, 2003. (Embrapa Mandioca e Fruticultura.
Sistema de Produção 13.). Disponível em:
https://sistemasdeproducao.cnptia.embrapa.br/FontesHTML/Mandioca/mandiocaj3ara/import
ancia.htm. Acessado em 22 jun 2017.
MEZETTE, T. F.; CARVALHO, C. R. L.; MORGANO, M. A.; SILVA, M. G; PARRA, E.

S. B.; GALERA, J. M. S. V.; VALLE, T. L. Seleção de clones-elite de mandioca de mesa
visando a características agronômicas, tecnológicas e químicas. Bragantia, v.68, n.3, p. 601-
609, 2009.
MISAKA, T.; KURODA, M.; IWABUCHI, K.; ABE, K.; ARAI, S. Soyacystatin, a novel
cysteine proteinase inhibitor in soybean, is distinct in protein structure and gene organization
from other cystatins of animal and plant origin. Eur. J. Biochem., v. 240, p. 609-614, 1996.
MIYA, A; ALBERT, P.; SHINYA, T.; DESAKI, Y.; ICHIMURA, K.; SHIRASU, K.;
NARUSAKA, Y.; KAWAKAMI, N.; KAKU, H.; SHffiUYA, N. CERK1, a LysM receptor
kinase, is essential for chitin elicitor signaling in Arabidopsis. Proceedings of the National
Academy of Sciences, v. 104, n. 49, p. 19613-19618, 2007.
MIZUBUTI, E.S.G., MAFFIA, L A. Introdução à Fitopatologia - Caderno Didático 115 da

UFV. Viçosa. Editora UFV, 2006. 190 p.
MSIKITA, W., BISSANG, B., JAMES, B. D., BAEMEY, H., WILKINSON, H. T.,
AHOUNOU, M., AND FAGBEMISSI, R. Prevalence and severity of Nattrassia mangiferae
root and stem rot pathogen of cassava in Bénin. Plant Disease, v.89, p. 12-16, 2005.
NASCIMENTO SB, CARCARDO JCM, MENEZES IC, DUARTE MLR, HARADA ML,
DARNET S, DE SOUZA CRB. Identifying Sequences Potentially Related to Resistance
Response of Piper luhercuíalum to Fusarium solani f. sp. piperis by Suppression Subtractive
Hybridization. Protein Peptide Letters, v. 12, p. 1429-1434, 2009.
NEWMAN, M.; SUNDELIN, T.; NIELSEN, J. T.; ERBS, G. MAMP (microbe-associated

molecular pattern) triggered immunity in plants. Frontiers in Plant Science, v. 4, p. 1-14,
2013.
NURNBERGER, T.; BRUNNER, F.; KEMMERLING, B.; PIATER, L. Innate immunity in

plants and animais: striking similarities and obvious differences. Immunologícal Reviews, v.
198, p. 249-266, 2004.
OLIVEIRA, S.A.S.; HOHENFELD, C.S.; SANTOS, V.S.; HADDAD, F.; OLIVEIRA, E.J.
Resistance to Fusarium dry root rot disease in cassava accessions. Pesquisa Agropecuária
Brasileira, v.48, p. 1414-1417, 2013.
OJIMA, A.; SHIOTA, H.; HIGASHI, K.; KAMADA, H.; SHIMMA, Y. T,

WADAMASATA, P., SATOH, S. An extracellular insoluble inhibitor of cysteine proteases in
cell cultures and seeds of carrot. Plant Mol. Biol., v. 34, p. 99-109, 1997.
29
ONYEKA, T. J.; DIXON, A. G. O.; EKPO, E. J. A. Assessment of laboratory methods for

evaluating cassava genotypes for resistance to root rot disease. Mycopathologia, v.159,
p.461-467, 2005a.
ONYEKA, T. J.; DIXON, A. G. O.; EKPO, E. J. A. Identification of leveis of resistance to

cassava root rot disease (Botryodiplodia lheohromae) in African landraces and improved
germplasm using in vitro inoculation method. Euphytica, v.145, p.281-288, 2005b.
PIETERSE, C.M.J., ZAMIOUDIS, C., BERENDSEN, R.L., WELLER, D.M., VAN WEES,
S.C.M., AND BAKKER, P.A.H.M. Induced systemic resistance by beneficiai microbes.
Annu Rev Phytopathol, v. 52, p. 347-375, 2014.
PIROVANI, C. P.; SANTIAGO, A. S.; SANTOS, L.S.; MICHELI, F.; MARGIS, R.;
GESTEIRA, A.S.; AL VIM, F. C.; PEREIRA, G. A. G; CASCARDO, J. C. M. Theobroma
cacao cystatins impair Moniliophthora perniciosa mycelial growth and are involved in
postponing cell death symptoms. Planta, v. 232, p. 1485-1497, 2010.
POLTRONIERI, L. S.; TRINDADE, D.R.; SILVA, H. M.; ALBUQUERQUE, F. C.

Patógenos associados à podridão mole de raízes de mandioca no estado do Pará.
Fitopatologia Brasileira, v. 22, p.111-112, 1997.
POLTRONIERI, L. S.; TRINDADE, D. R.; ALBUQUERQUE, F. C.; DUARTE, M. L. R.;

CARDOSO, S. S. Incidência de Fusarium solani em mandioca no Estado do Pará.
Fitopatologia Brasileira, v. 5, p. 544. 2002.
RASSAM, M.; LAING, W. A. Purification and characterization of phytocystatins firom

kiwifruit cortex and seeds. Phytochemistry, v. 65, p. 19-30, 2004.
RYAN, S. N.; MCMANUS, M. T.; LAING, W. A. Identification and characterization of

proteinase inhibitors and their genes firom seeds of apple {Malus domestica). J. Biochem.,
v.134, p. 31-42, 2003.
REIS SP, TAVARES ESC, COSTA CNM, SANTA-BRIGIDA AB, de SOUZA CRB.
Molecular cloning and characterization of a novel RING zinc-finger protein gene up-regulated
under in vitro salt stress in cassava. Molecular Biology Reports, v. 39, p. 6513-6519, 2012.
RODRIGUES, A. R.; ALVES, J. M. A.; UCHÔA, S. C. P.; ALBUQUERQUE, J. A. A.;

RODRIGUES, G. S.; BARROS, M. M. Avaliação da capacidade de enraizamento, em água,
de brotações, ponteiros e estacas herbáceas de clones de mandioca de mesa. Agro@mbiente
On-line, v.2, n.l, p.37-45, 2008.
SAMBROOK J, FRITSCH EF, MANIATIS T Molecular Cloning: A Laboratory Manual,

2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 1989
SANTA ERIGIDA, A. B.; REIS, S. P.; COSTA, C. N. M.; CARDOSO, C. M.; LIMA, A. M.
DE SOUZA C.R.B. Molecular cloning and characterization of a cassava translationally
controlled tumor protein gene potentially related to salt stress response. Mol. Biol. Rep. v. 41,
p. 1787-1797, 2014.
SANTOS, V.S.; SOUZA, A.S.; VIANA, A.E.S.; FERREIRA FILHO, J.R.; SOUZA, K.A.;
MENEZES, M C. Multiplicação rápida, método simples e de baixo custo na produção de
30
material propagativo de mandioca. Cruz das Almas: Embrapa Mandioca e Fruticultura

Tropical, 2009. 23 p. (Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical. Boletim de Pesquisa e
Desenvolvimento, 44). Disponível em https://www.embrapa.br/busca-de-publicacoes/-
/publicacao/748639/multiplicacao-rapida-metodo-simples-e-de-baixo-custo-na-producao-de-
material-propagativo-de-mandioca Acesso em 17 abr. 2017.
SATHYABHAMA, M., VISWANATHAN, R., MALATHI, P., & SUNDAR, A. R. (2016).

Identification of differentially expressed genes in sugarcane during pathogenesis of
Colletotrichum falcatum by suppression subtractive hybridization (SSH). Sugar Tech, v. 18,
n. 2, p. 176-183, 2016.
SERRA, I.M.R.S., SILVA, G.S.; NASCIMENTO, F.S.; LIMA, L. K. F. Scylalidium lignicola

em mandioca: ocorrência no Estado do Maranhão e reação de acessos ao patógeno. Summa
Phytopathologica, v. 35, p. 327-328, 2009.
SHYU, D. J. H.; CHYAN, C. L.; TZEN, J. T. C.; CHOU, W. M. Molecular cloning,

expression, and functional characterization of a cystatin from pineapple stem. Bíoscí.
Biotechnol. Biochem., v. 68, p. 1681-1689, 2004.
SILOTO, E.D.; FERNANDES, A. M. Brotação de manivas de mandioca no sistema de

propagação rápida sob diferentes níveis de adubação. Revista Raízes e Amidos Tropicais, v.
12, p.15-25, 2016.
SILVA, M. N.; CEREDA, M. P.; FIORINI, R.A. Multiplicação rápida de mandioca. In:
CEREDA, M. P. (Coord ). Agricultura: Tuberosas Amiláceas Latino Americanas. São
Paulo: Fundação Cargill, 2002, p. 187-197.
SILVA, R.M. BANDEL, G. FARALDO, M.I.F. & MARTINS, P S. 2001. Biologia

reprodutiva de etnovariedades de mandioca. Scientia Agrícola, 58(1): 101-107.
SILVA, K. N.; VIEIRA, E. A.; FIALHO, J. F.; CARVALHO, L. J. C. B.; SILVA, M. S.

Potencial agronômico e teor de carotenoides em raízes de reserva de mandioca. Cienc. Rural.
v.44, n.8, p. 1348-1354. 2014.
SINGH, P., & ZEMMERLI, L. Z. (2013). Lectin receptor kinases in plant innate
immunity. Frontiers in plant science, v. 4, p. 124, 2013.
TAKAI, R.; KANEDA. T.; ISOGAI, A.; TAKAYAMA, S.; CHE, F. S. A new method of
defense response analysis using a transient expression system in rice protoplasts. Bioscience,
Biotechnology, and Biochemistry, v. 71, n. 2, p. 590-593, 2007.
THAKUR, M.; SOHAL, B.S. Role of Elicitors in Inducing Resistance in Plants against
Pathogen Infection: A Review. ISRN Biochemistry v. 2013, p. 1-10, 2013.
TEMM, E. S., PARDO, L. H., COELLO, R. P., NAVARRETE, T. C., VILLEGAS, O. N., &
ORDONEZ, E. S. (2016). Identification of Differentially-Expressed Genes in Response to
Mycosphaerella fijiensis in the Resistant Musa Accession 'Calcutta-4'Using Suppression
Subtractive Hybridization. PloS one, v.77, n.8, DOI: 10.1371/journal.pone.0160083, 2016.
31
TOBIMATSU, Y., WAGNER, A., DONALDSON., L., MITRA, P., NICULAES, C., DIMA,
O., KIM, J. I., ANDERSON, N., LOQUE, D., BOERJAN, W., CHAPPLE, C., RALPH, J.
Visualization of plant cell wall lignification using fluorescence-tagged monolignols. The
Plant Journal, v. 76, p. 357-366, 2013.
UNDERWOOD, B.A.; SMITASII, S. Micronutrient malnutrition: policies and programs for

control and their implications. Annual Review of Nutrition, v. 19, p.303-324, 1999.
VAN LOON, L.C.; REP, M.; PIETERSE, C.M.J. Significance of Inducible Defense-related
Proteins in Infected Plants. Annual Review of Phytopathology, v.44, p. 135-162. 2006.
VIEIRA, E.A.; FIALHO, J.F.F.; SILVA, M.S.; FALEIRO, F.G. Variabilidade genética do
banco ativo de germoplasma de mandioca do Cerrado acessada por meio de descritores
morfológicos. Planaltina: Embrapa Cerrados, 2007b. 15p.
VILAS-BOAS, S.A.; HOHENFELD, C.S.; OLIVEIRA, S.A.S.; SILVA, S.V.; OLIVEIRA,

E.J. Sources of resistance to cassava root rot caused by Fusarium spp.: a genotypic approach.
Euphytica, v. 209 p. 237-251, 2016.
VENTURINI, M. T., DA SILVA SANTOS, V., & DE OLIVEIRA, E. J. Procedures for

evaluating the tolerance of cassava genotypes to postharvest physiological
deterioration. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 50, n. 7, p. 562-570, 2015.
VRIENS, K., CAMMUE, B., & THE VIS SEN, K. (2014). Antifungal plant defensins:
mechanisms of action and production. Molecules, v. 19, n. 8, p. 12280-12303, 2014.
WAN, J.; ZHANG, X. C.; NEECE, D.; RAMONELL, K. M.; CLOUGH, S.; KIM, S. Y.;
STACEY, M. G.; STACEY, G. A LysM receptor-like kinase plays a criticai role in chitin
signaling and fungai resistance in Arahidopsis. Plant Cell, v. 20, n. 2, p. 471-481, 2008.
WALDRON, C.; WEGRICH, L. M.; MERLO, P. A.; WALSH, T. A. Characterization of a

genomic sequence coding for potato multicystatin, an eight-domain cysteine proteinase
inhibitor. Plant Mol. Biol., v. 23, p. 801-812, 1993.
WANG, Y., YUAN, X., HU, H., LIU, Y., SUN, W., SHAN, Z., & ZHOU, X. Proteomic
analysis of differentially expressed proteins in resistant soybean leaves after Phakopsora
pachyrhizi infection. Journal of Phytopathology, v. 160, n.10, p. 554-560, 2012.
ZIPFEL, C.; FELIX, G. Plants and animais: a different taste for microbes? Current Opinion
in Plant Biology, v. 8, n. 4, p. 353-360, 2005.
ZIPFEL, C. Early Molecular Events in PAMP-triggered Immunity. Current Opinion in

Plant Biology , v.12, p.414-420, 2009.
ZIPFEL, C., & OLDROYD, G. E. Plant signalling in symbiosis and immunity. Nature, v.
543, n.7645, p. 328-336, 2017.
32
Capítulo II
PROPAGAÇÃO RÁPIDA DE MANDIOCA PARA ESTUDOS EM CONDIÇÕES 1
CONTROLADAS DE CASA DE VEGETAÇÃO
33
Propagação rápida de mandioca para estudos em condições controladas de casa
de vegetação1
Aline Medeiros Lima*1'2'3', Jonny Lúcio Sousa Silva(1'4), Elisa Ferreira Moura*4 *', José Edson
de Sampaio*4', Roberto Lisboa Cunha*4' e Cláudia Regina Batista de Souza*3'
'''Programa de Pós-Graduação em Agronomia da Universidade Federal Rural da Amazônia,
Belém, PA, CEP 66077-530, Brasil. E-mail: aline.lima@ufra.edu.br,
jonnylucios.silva@hotmail.com *2'Universidade Federal Rural da Amazônia - Campus de
Tomé-Açu, Tomé Açu - PA, CEP 68680-000, Brasil. *3' Instituto de Ciências Biológicas,
Universidade Federal do Pará, Belém, PA, 66075-110, Brasil, bsouza@ufpa.br. *4' Embrapa
Amazônia Oriental, Caixa postal 48, Belém, PA CEP 66095-903, Brasil,
elisa.moura@embrapa.br, jose.sampaio@embrapa.br, roberto.cunha@embrapa.br
*Corresponding author: elisa.moura@embrapa.br
Resumo - O presente trabalho teve como objetivo testar a metodologia de propagação rápida
da mandioca {Mamhot esculenta Crantz) para a produção de plantas adequadas para estudos
em condições controladas de casa de vegetação. A metodologia consistiu na indução de brotos
a partir de manivas, e posterior corte e enraizamento na água, seguido do preparo das mudas,
aclimatação em viveiros e posterior desenvolvimento em casa de vegetação até que as raízes
estivessem em fase de tuberização. Os procedimentos foram baseados na metodologia de
propagação rápida da mandioca descrita na literatura, contudo as câmaras de propagação e de
enraizamento foram adaptadas com clarite com 20% de sombreamento devido as condições
climáticas de Belém-PA. Foram utilizados quatro cultivares do Banco Ativo de Germoplasma
de Mandioca da Embrapa Amazônia Oriental (Belém-PA), os quais apresentaram

34
desempenhos diferenciados nas etapas de produção de brotos, de enraizamento e de
aclimatação. Os cultivares BRS Poti e CPATU 530 apresentaram maior taxa de multiplicação,
produzindo mudas com qualidade e quantidade adequadas para estudos em casa de vegetação
e que necessitem de raízes já tuberizadas, como aqueles que requerem a inoculação de
patógenos causadores da podridão radicular e/ou a análise de genes com expressão diferencial
em raízes nesta fase de desenvolvimento.
Termos para indexação: Manihot esculenta, produção de mudas, raízes tuberosas.
Abstract - The present work aimed to test the methodology of rapid propagation of cassava
{Manihot esculenta Crantz) for the production of plants suitable for studies under greenhouse.
controlled conditions. The method was based on bud induction from stem cuttings, which
were cut and water rooted, followed by seedlings preparation, acclimatization in the nursery
and further development under greenhouse until roots were tuberized. The procedures were
based on the methodology of rapid propagation of cassava described on the literature,
although the propagation and rooting chambers were adapted with clarite that reduced
lightmtransmission by 20%, due to climatic conditions of Belém, Pará, Brazil. It was used
four accessions from a germplasm bank, which had different behavior during the phases of
bud production, rooting and acclimatization. The accessions BRS Poti and CPATU 530 had
higher rate of bud multiplication and produced higher-quality and quantity seedlings, suitable
for studies under greenhouse conditions and that need tuberized roots, such as those that
require the inoculation of root rot pathogens and/or differential expression analyses of root
genes in this developmental stage.
Index terms: Manihot esculenta Crantz, seeding production, tuberous roots.

35
Introdução
Manihot esculenta Crantz é uma espécie de arbusto nativo do Brasil, conhecida
popularmente como mandioca, macaxeira e aipim (Cordeiro et al., 2017). De fácil adaptação,
a mandioca é cultivada em todo o mundo, principalmente na Ásia, África e América onde
milhões de pessoas dependem da raiz de reserva desta cultura (FAO, 2017). No Brasil, seu
cultivo ocorre em todos os Estados, sendo a região norte responsável por mais de 40% da
produção nacional (IBGE, 2017) onde possui uma ampla utilização na alimentação (animal e
humana) e na indústria (Vieira et al., 2011).
A mandioca é considerada uma cultura rústica e a maior parte dos cultivos está
concentrada em pequenos produtores, que utilizam um sistema rudimentar de manejo e baixo
uso de insumos (Alves Filho et al., 2015). O sucesso da mandiocultura depende, em grande
parte, da utilização de mudas de boa qualidade. A obtenção de mudas de mandioca é feita
preferencialmente por propagação vegetativa, onde pedaços do caule, chamados manivas-
semente ou estacas, são utilizados para gerar plantas geneticamente idênticas (Silva et al.,
2002; Carvalho & Guerra, 2002).
Na propagação vegetativa, após as manivas serem colocadas em contato com o solo,
as brotações e as primeiras raízes, conhecidas como raízes adventícias, surgem entre 15 e 20
dias após o plantio (DAP). Com 30 DAP as folhas verdadeiras começam a se expandir e se
inicia o processo fotossintético. O desenvolvimento das raízes de armazenamento inicia-se de
35-52 DAP, e a partir de oito meses já estão aptas para serem colhidas, no entanto as
variações nas condições climáticas e o tipo de acesso podem afetar este processo, sendo
recomendada a colheita entre 10 e 12 meses (Wechkrajang et al., 2006; de Souza et al., 2015).
Apesar de sua rusticidade, vários fatores relacionados a estresses biótico e abiótico
limitam a expansão da mandiocultura (Borges et al., 2002; Oliveira et al., 2013; Venturini et
al., 2015; Pietrowski et al., 2014; Vilas-Boas et al., 2016). Nos últimos anos, diversos estudos
36
utilizando tecidos destacados de mandioca foram realizados com o objetivo de investigar a
resposta da planta frente aos diferentes estresses. Um exemplo é a utilização de folhas
destacadas para identificar genes envolvidos na resposta ao estresse salino (Costa et al., 2011;
Reis et al., 2012; Santa Erigida et al., 2014). As raízes destacadas é um outro exemplo, já que
estudos para identificar acessos resistentes e susceptíveis a podridão radicular têm utilizado
este tecido (Oliveira et al., 2013; Vilas-Boas et al., 2016). No entanto, os métodos que
utilizam tecidos destacados não permitem avaliar os processos fisiológicos e/ou moleculares
em outras partes da planta, bem como, por períodos de tempo mais prolongados. No caso das
raízes de mandioca ainda se observa a deterioração pós-colheita, cujos sintomas assemelham-
se aos causados por patógenos, levando a uma interpretação equivocada dos resultados dos
estudos visando a identificação de fontes de resistência a doenças (Venturini et al., 2015).
A metodologia da propagação rápida da mandioca, estabelecida inicialmente pelo
CIAT (Centro Internacional de Agricultura Tropical) (Cock et al., 1976) é utilizada para
contornar o baixo índice de multiplicação da cultura pelo método de propagação tradicional,
sendo um instrumento capaz de viabilizar a produção de mudas sadias, com baixo custo e de
fácil acesso. Esta metodologia envolve basicamente a indução de brotos a partir da maniva, e
posterior corte e enraizamento na água, seguido do preparo das mudas, aclimatação em
viveiros e plantio no campo (Cock et al., 1976; Silva et al., 2002; Fukuda & Carvalho, 2006).
Contudo esta metodologia deve ser testada nas condições climáticas onde os experimentos são
conduzidos, e seu sucesso depende também das características genéticas da acesso usada.
Diante da necessidade de plantas de mandioca sadias, apresentando raízes tuberizadas
e desenvolvimento homogêneo para uso em estudos em condições controladas, como os que
buscam o entendimento dos mecanismos de tolerância da planta a estresses, o presente
trabalho objetivou testar a metodologia de propagação rápida em acessos de um Banco Ativo
de Germoplasma e nas condições climáticas de Belém-PA.

37
Material e Métodos
Os experimentos foram conduzidos em condições ambientais, entre os meses de
agosto de 2016 a maio de 2017, na Embrapa Amazônia Oriental com sede em Belém-PA,
região caracterizada por umidade e temperatura elevadas durante todo o ano (Oliveira et al.,
2016). Quatro acessos de um Banco Ativo de Germoplasma, os acessos CPATU 530, CPATU
348, BRS Kiriris e BRS Poti, foram utilizados neste trabalho, sendo os dois primeiros
susceptíveis e os dois últimos tolerantes a podridão radicular.
Para a produção de brotos enraizados foram utilizadas duas instalações, uma câmara
de propagação e uma câmara de enraizamento, preparadas conforme Silva et al. (2002)
(Figura IA). Devido às condições climáticas de Belém foi necessária uma adaptação na
câmara de propagação, substituindo o plástico transparente da cobertura por clarite 1003 com
20% de sombreamento (Figura 1B). Por outro lado, a câmara de enraizamento consistiu em
uma estrutura metálica coberta com clarite 1003 verde com 20% de sombreamento na parte
frontal, e plástico transparente nas demais partes (Figura 1B).
A primeira etapa consistiu na obtenção das manivas-sementes a partir dos dois terços
inferiores da haste principal de plantas sadias e vigorosas, com 12 meses de idade. Foram
cortados toletes com 10 cm em média, cada um contendo duas gemas. Em seguida, cerca de
40 manivas-sementes de cada cultivat, foram plantadas em linha nas câmaras de propagação,
com as gemas voltadas para cima (Figura 1C), sendo umedecidas sempre que necessário
(Figura 1D), já que esta instalação não possibilita a manutenção da umidade.
Quando os brotos atingiram de 10 a 15 centímetros, estes foram cortados abaixo de
uma gema e imediatamente colocados em água destilada, para indução do enraizamento. Os
cortes foram feitos com estilete esterilizado com álcool etílico 70% (Figura 1E). Em seguida,
o excesso de folhas presente nos brotos foi retirado para evitar a murcha devido à perda
excessiva de água. Os brotos cortados foram colocados em copos plásticos (capacidade de

38
300 mL) contendo 100 mL de água destilada, sendo 3 brotos/copo, com troca de água a cada
dois dias (Figura 1 F ). Na câmara de enraizamento, foi necessário que os copos plásticos
estivessem a uma distância mínima de 1,50 m em relação ao teto, evitando o deslocamento
dos mesmos devido a força do vento, o que poderia prejudicar a indução do enraizamento.
Nos primeiros dias as folhas murcharam e algumas caíram logo em seguida. Após sete dias
formaram-se brotações na base (Figura 1 Gl), e posteriormente as raízes adventícias aos 15
dias (Figura 1 G2). As folhas que caíram e os brotos que apodreceram foram descartados.
Na etapa seguinte os brotos enraizados foram plantados em sacos de polietileno 18 x
35 cm contendo terra preta, as mudas foram transferidas para um telado de madeira coberto
com sombrite a 50% de luminosidade. Na ausência de chuvas, as mudas foram umedecidas
com água (Figura 1H). Os acessos foram cultivados por 90 dias e o desenvolvimento das
raízes foi monitorado durante este período.
Por último, as plantas com três meses de idade foram transplantadas para vasos de 10
litros contendo terra preta. Para isto, o saco preto de polietileno foi retirado com cuidado para
não danificar as raízes existentes e a planta foi colocada no vaso, o qual foi preenchido com
terra preta. Após o transplante, as plantas foram umedecidas, e mantidas em casa de vegetação
com irrigação diária até completarem 6 meses, quando foram observadas raízes já tuberizadas.
Resultados e Discussão
A propagação vegetativa da mandioca é um processo vantajoso visto que mantêm as
características da planta mãe, contudo apresenta limitações como a baixa taxa de
multiplicação, a redução da qualidade sanitária da maniva durante ciclos sucessivos de
propagação, além da facilidade de transmissão de doenças através do material de propagação
(Fukuda & Carvalho, 2006; Santos et al., 2009; Siloto & Fernandes, 2016). Para sanar essas
dificuldades o CIAT desenvolveu a metodologia de propagação rápida da mandioca (Cock et

39
al., 1976), a qual foi testada em algumas regiões brasileiras, proporcionando um aumento
significativo do fator de multiplicação da cultura comparado com o método de propagação
tradicional (Silva et al. 2002; Fukuda & Carvalho, 2006; Rodrigues et al. 2008; Alves et al.
2009; Santos et al. 2009; Vieira & Moura, 2011).
No presente trabalho a metodologia de propagação rápida da mandioca foi testada nas
condições climáticas de Belém-PA e objetivou a obtenção de plantas de mandioca com raízes
tuberizadas adequadas para estudos em condições controladas de casa de vegetação.
A metodologia de propagação rápida inicia-se com uma fase de propagação na qual se
utiliza uma câmara de propagação, a qual proporciona um ambiente com umidade e
temperatura mais elevadas, que segundo Silva et al. (2002) e Fukuda & Carvalho (2006)
possibilitam uniformizar e acelerar a brotação das gemas. Contudo, devido as condições de
alta umidade e temperatura em Belém-PA, a utilização do plástico transparente recomendado
por Silva et al. (2002) fez com que a temperatura no interior da câmara ficasse muito elevada,
limitando a produção de brotos em todos os acessos utilizados (dados não mostrados). Sendo
assim, o plástico transparente teve que ser substituído por clarite 1003 na cor verde com 20%
de sombreamento (Figura 1 B).
A adaptação da câmara de propagação com o clarite 1003 surtiu efeito positivo, pois
sanou a condição de alta temperatura devido ao plástico transparente, e proporcionou
condições adequadas para o processo de brotação, gerando brotos com desenvolvimento
uniforme, e estando de acordo com dados obtidos por Silva et al. (2002) e Fukuda & Carvalho
(2006) que relataram brotos com 20 D AP apresentando 15 cm de altura.
Quando o desenvolvimento dos brotos obtidos na câmara de propagação foi
comparado com os brotos obtidos em condições de campo na propagação tradicional,
observou-se uma aceleração na etapa de brotação e expansão foliar, visto que em condições
de campo as primeiras folhas fotossintéticas ativas surgem em média com 30 DAP

40
(Wechkrajang et al., 2006; de Souza et al., 2015), enquanto que no presente trabalho aos 20
DAP já se pôde observar um padrão de desenvolvimento semelhante, com brotos com 15 cm
de altura (Figura 1E). No entanto, necessita-se de estudos adicionais para esclarecer se esta
variação foi devido às condições proporcionadas pela câmara de propagação ou às
características genéticas dos acessos utilizados.
A segunda etapa do método de propagação rápida consistiu no corte dos brotos para
posterior enraizamento em água. A primeira colheita dos brotos que atingiram a altura entre
10-15 cm ocorreu 20 DAP, e a segunda colheita 28 DAP, estando este tempo de corte em
concordância com o observado quando a metodologia de propagação rápida foi adaptada para
as condições de São Luiz do Maranhão (Silva et al., 2002) e de Araripina, em Pernambuco
(Fukuda & Carvalho, 2006). Nos dois cortes realizados foi obtido um total de 414 brotos,
sendo que a capacidade de brotação variou entre os acessos utilizados, e o BRS Poti
apresentou melhor desempenho produzindo 145 brotos (Tabela 1). Segundo a literatura, a
capacidade de brotação das manivas varia dependendo das partes do caule (Porto et al., 1979)
e dos acessos que são utilizados (Alves et al., 2009; Santos et al., 2009). No presente trabalho
buscou-se utilizar manivas-sementes a partir dos dois terços inferiores da haste principal de
plantas sadias e vigorosas, com 12 meses de idade, seguindo as recomendações de Porto et al.
(1979), e portanto o resultado observado deve-se provavelmente à diferença genética entre os
acessos. Alves et al. (2009), em estudo com dois acessos de mandioca de mesa, observaram
que o acesso Pão teve uma produção de brotos quase duas vezes menor que o acesso Aciolina.
Os brotos cortados, incubados em água, permaneceram 22 dias na câmara de
enraizamento, sendo que nos seis primeiros dias algumas folhas murcharam (Figura 1F), e
surgiram também as primeiras brotações (Figura 1G1). As primeiras raízes adventícias
surgiram 12 dias após o corte (Figura 1G2), e dez dias depois os brotos enraizados já estavam
41
bem desenvolvidos e adequados para serem plantados, os resultados estão de acordo com os
descritos para a região nordeste (Silva et al., 2002 e Fukuda & Carvalho, 2006).
Quanto ao enraizamento, somente o acesso CPATU 348 teve uma baixa taxa de
enraizamento (-32%), sendo que os demais ficaram acima de 90%. Rodrigues et al. (2008)
também observou resultado similar, já que o acesso de mandioca de mesa Aciolina apresentou
uma baixa capacidade de enraizamento quando utilizado o método de propagação rápida por
meio de micro-estacas comparado com o acesso Pão. A capacidade de enraizamento de brotos
de mandioca em água, segundo Rodrigues et al. (2008) depende do fator genético e da origem
da água utilizada; e a água proveniente da chuva pode ser uma excelente opção para indução
do enraizamento das estruturas vegetativas da mandioca no processo de propagação rápida.
Dentre as alterações observadas nesta etapa, a baixa taxa de enraizamento do acesso CPATU
348 foi evidenciada pela não formação de calos (Figura 2 A), com posterior apodrecimento do
material. E no caso do BRS Kiriris, apesar da alta taxa de enraizamento, foram observados
alguns pontos escuros (Figura 2B), que podem estar relacionados com apodrecimento do
tecido, com potencial efeito na capacidade de aclimatação. Desta forma, é necessário testar
outras condições de enraizamento para estes acessos.
No final da etapa de enraizamento foi obtido um total de 322 brotos que apresentaram
raízes de absorção bem desenvolvidas, que foram plantados em sacos de polietileno contendo
terra preta resultando em 207 mudas ao final de três meses. Na produção de mudas, o BRS
Poti e o CPATU 530 tiveram eficiências similares, com taxas de aclimatação acima de 77%,
contudo como o CPATU 530 produziu um número menor de brotos, o BRS Poti teve um
melhor rendimento com a produção de 117 mudas enquanto o CPATU 530 produziu 68
mudas. A partir dos dados obtidos pode-se concluir que o acesso BRS Poti apresentou a maior
taxa de multiplicação, pois produziu o maior número de mudas. Esse melhor desempenho
pode estar relacionado ao fato do acesso BRS Poti possuir maior vigor híbrido por se tratar de
42
um cultivar resultante de cruzamento. Os acessos CPATU 348 e BRS Kiriris não
apresentaram resultados satisfatórios já que o primeiro não produziu mudas e o segundo
resultou em 22 mudas e com baixa qualidade.
As mudas permaneceram no viveiro por 90 dias, sendo possível observar os sinais de
tuberização nas raízes de armazenamento (Figura 3). Em condições de campo o
desenvolvimento das raízes de armazenamento inicia-se de 35-52 DAP (Wechkrajang et al.,
2006; de Souza et al., 2015). Nesta fase se observou também a necessidade de trocar o
saquinho por um vaso maior, pois recipientes pequenos podem limitar o desenvolvimento da
planta pelo volume de substrato neles contido (Almeida et al., 2014).
A limitação do substrato contido nos sacos plásticos é uma possível explicação para
um desenvolvimento radicular tardio em relação ao observado no campo, no entanto novos
estudos devem ser realizados para determinar o tamanho ideal do recipiente para o plantio dos
brotos. De acordo com dados da literatura, processos fisiológicos da planta, como a absorção
de água e nutrientes, a redução de assimilação líquida de carbono e o crescimento da parte
aérea podem ser afetados diretamente pelo tamanho do vaso usado, resultando numa
conseqüente restrição ao crescimento radicular (Andrade et al., 2012; Macana, 2012).
As plantas transferidas para os vasos foram mantidas em casa de vegetação, sendo que
após 30 dias já apresentavam sinais de crescimento, demonstrando que a limitação do
substrato e o sombreamento estavam influenciando o seu desenvolvimento (Figura 4.1). Este
período se prolongou por mais 60 dias, quando as raízes de armazenamento já se
apresentavam bem desenvolvidas (Figura 4.2).
A utilização do método de propagação rápida da mandioca com câmara de propagação
adaptada com clarite, no presente trabalho, possibilitou a obtenção de mudas de mandioca
sadias e com baixo custo, sendo uma alternativa para sanar as dificuldades dos estudos com
tecidos destacados, principalmente raízes. Isto porque a utilização de raízes destacadas em

43
estudos de identificação de fontes de resistência a patógenos que causam podridão radicular
em mandioca não possibilita uma avaliação ampla, e os sintomas causados pelo patógeno
podem ser confundidos com os sintomas da deterioração pós-colheita (Oliveira et al., 2013;
Venturini et al., 2015; Vilas-Boas et al., 2016).
No caso da BRS Poti, foi obtido um total de 117 mudas, número suficiente de plantas
para estudos moleculares de interação planta-patógeno, como por exemplo a biblioteca
subtrativa (de Souza et al., 2011), onde devem ser considerados os tratamentos utilizados
(plantas inoculadas e plantas não inoculadas com o patógeno, em diferentes tempos de
exposição) e o número de repetições para cada tratamento.
Conclusões
1- A utilização da metodologia de propagação rápida da mandioca nas condições de clima
quente e úmido necessita de adaptação nas câmaras de propagação e de enraizamento, onde o
plástico transparente deve ser substituído por clarite com 20% de sombreamento;
2- Foi possível obter mudas dos cultivares BRS Poti e CPATU 530 (o primeiro tolerante e o
segundo susceptível à podridão mole da raiz) com qualidade e quantidade adequadas para
estudos em condições controladas;
Agradecimentos
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) pela bolsa; à
Fundação Amazônia de Amparo a Estudos e Pesquisas do Pará (FAPESPA) e ao Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo financiamento da
pesquisa; e à Universidade Federal Rural da Amazônia (UFRA), à Embrapa Amazônia
Oriental e à Universidade Federal do Pará (UFPA) pelo apoio a pesquisa.

44
Referências
ALBUQUERQUE, A.S., & BRANDÃO, I.C D. Acessos BRS Mari e BRS Poti e medidas
de controle da podridão-mole da mandioca. Belém: Embrapa Amazônia Oriental, 2008.
24p. (Embrapa Amazônia Oriental, Documento, 326) Disponível em:
http://www.cpatu.embrapa.br/publicacoes_online. Acessado em: 11 out. 2017.
ALMEDA, MD.O.; FERREIRA, E.A., SILVA, D.V., DOS SANTOS, J.B.; RODRIGUES,
R.B.; DE SOUZA, B.P.; DA COSTA, S.S.D. Influência do tamanho do vaso e época de
avaliação sobre o crescimento do picão preto em competição com milho e soja. Bioscience
Journal, v.30, p. 1428-1437, 2014.
ALVES, LM.A.; ARRUDA, K. R.; RODRIGUES, G.S.; UCHÔA, S.C.P.; ALBUQUERQUE,
J.A. A. Brotação de manivas para a propagação rápida da mandioca. Revista Raízes e Amidos
Tropicais, v. 5, p. 280-284, 2009.
ALVES, J. D. N., DE SOUZA, F. C. A., & VALENTE, J. Crescimento da produção de
mandioca e pimenta-do-reino na microrregião do guamá, estado do pará, no período de 2000-
2011. Enciclopédia Biosfera: Centro Científico Conhecer, v. 10, p. 1792-1799, 2014.
ANDRADE, F.R.; PETTER, F.A.; JÚNIOR, B.H.M.; ZUFFO, A.M.; DE SOUZA, T.R.;
GONÇALVES, L.G. Formação de mudas de mamona em diferentes recipientes. Revista
Brasileira de Ciências Agrárias, v. 7, p. 274-279, 2012.
BORGES, M.F.; FUKUDA, W.M.G; ROSSETTI, AG. Avaliação de variedades de
mandioca para consumo humano. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.37, p. 1559-1565,
2002.
CARVALHO, R.; GUERRA, M. Cytogenetics of Manihot esculenta Crantz (cassava) and
eight related species. Hereditas, v.136, p.159-168, 2002.
COCK, J.H; WHOLEY, D.; LOZANO J.C.; TORO, J.C. Sistema rápido de propagación de
yuca. Colômbia: Centro Internacional de Agricultura Tropical, 1976. 12 p. (Serie ES: Centro
45
Internacional de Agricultura Tropical. N0. 20). Disponível em http://ciat-
library.ciat.cgiar.org/ciat_digital/CIAT/books/historical/147.pdf. Acessado em: 15 out. 2017.
CORDEIRO, T; SECCO, R.; SILVA, M.J.DA; SODRÉ, R.C.; MARTINS,
M.L.L. Manihot in Lista de Espécies da Flora do Brasil. Jardim Botânico do Rio de Janeiro.
Disponível em: http://floradobrasil.jbrj,gov.br/jabot/floradobrasil/FBI7600, Acesso em: 22
Jun. 2017.
COSTA, C. N.M.; SANTA-BRÍGIDA, A. B.; BORGES, B. N.; MENEZES-NETO, M. A.;
CARVALHO, L. J. C. B.; DE SOUZA C. R. B. Leveis of MeLEAS, a cDNA sequence
coding for an atypical late embryogenesis abundant protein in cassava, increase under in vitro
salt stress treatment. Plant Molecular Biology Repórter, v.29, p.997-1005, 2011.
DE SOUZA C.R.B; SANTA BRÍGIDA, A.B; DOS SANTOS R.C.; COSTA C.N.M.;
DARNET, S.H.; HARADA, M.L.; Identification of sequences expressed during compatible
black pepper - Fusarium solani f. sp. piperis interaction. Acta Physiologiae Plantarum, v.33,
p.2553-2560, 2011.
DE SOUZA, C. R. B.; REIS, S. P.; CARVALHO, L. J. C. B. An overview of protein
identification studies in cassava. Current Protein & Peptide Science, v.16, p.219-27, 2015.
FAO. Why cassava? Disponível em http://www.fao.org/ag/agp/agpc/gcds/index_en.html
Acesso em 16 out 2017.
FUKUDA, W.; de CARVALHO, H. W. L. Propagação rápida de mandioca no nordeste
brasileiro. Aracajú: Embrapa Tabuleiros Costeiros, 2006. 6 p. (Embrapa Tabuleiros
Costeiros. Circular Técnica, 45). Disponível em
http://www.infoteca.cnptia.embrapa.br/handle/doc/372216. Acessado em: 15 out. 2017.
IBGE (2017). Levantamento sistemático da produção agrícola. Rio de Janeiro v.30 n.3
p.1-83 Março. 2017.

46
MACANA, Y.A.M. Efeitos da disponibilidade de água e de luz no metabolismo
fotossintético em Coffea arahica. 2012. 46 p.. Dissertação (Mestrado) - Universidade
Federal de Viçosa, Viçosa.
OLIVEIRA, S.A.S. de; HOHENFELD, C.S.; SANTOS, V. D.A.S.; HADDAD, F.;
OLIVEIRA, E.J. Resistance to fusarium dry root rot disease in cassava accessions. Pesquisa
Agropecuária Brasileira, v.48, p. 1414-1417. 2013.
OLIVEIRA, M.C.F.; SOUZA JÚNIOR, J.A.; CRUZ, P.P.N.; SOUZA FILHO, J.D.
Climatologia urbana da cidade de Belém-Pará, através das precipitações e temperaturas do ar,
das normais climatológicas de 1941 a 1970, 1971 a 2000 e da normal provisória de 2001 a
2015. Revista Brasileira de Geografia Física, v.09, p.803-819, 2016.
PIETROWSKI, V.; RHEINHEIMER, A.R.; MIRANDA, A.M.; DA SILVA WENGRAT, A.
P.G.; BARILLI, D.R. Ocorrência de Aleuroíhrixus aepim (Goeldi, 1886) em mandioca na
região Oeste do Paraná. Arquivos do Instituto Biológico, v.81, p.186-188, 2014.
REIS S.P., TAVARES L.S.C, COSTA C.N.M, SANTA-BRIGIDA A.B., de SOUZA C.R.B.
Molecular cloning and characterization of a novel RING zinc-fmger protein gene up-regulated
under in vitro salt stress in cassava. Molecular Biology Reports, v.39, p.6513-6519, 2012.
RODRIGUES, A. R.; ALVES, J. M. A.; UCHÔA, S. C. P.; ALBUQUERQUE, J. A. A.;
RODRIGUES, G. S.; BARROS, M. M. Avaliação da capacidade de enraizamento, em água,
de brotações, ponteiros e estacas herbáceas de clones de mandioca de mesa. Agro@mbiente
On-line, v.2, n.l, p.37-45, 2008.
SANTA ERIGIDA, A.B.; REIS, S.P.; COSTA, C.N.M.; CARDOSO, C.M.; LIMA, A.M.; DE
SOUZA C.R.B. Molecular cloning and characterization of a cassava translationally controlled
tumor protein gene potentially related to salt stress response. Molecular Biology Reports,
v.41, p. 1787-1797, 2014.

47
SANTOS, V.S.; SOUZA, A.S.; VIANA, A.E.S.; FERREIRA FILHO, J.R.; SOUZA, K.A.;
MENEZES, M C. Multiplicação rápida, método simples e de baixo custo na produção de
material propagativo de mandioca. Cruz das Almas: Embrapa Mandioca e Fruticultura
Tropical, 2009. 23 p. (Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical. Boletim de Pesquisa e
Desenvolvimento, 44). Disponível em https://www.embrapa.br/busca-de-publicacoes/-
/publicacao/748639/multiplicacao-rapida-metodo-simples-e-de-baixo-custo-na-producao-de-
material-propagativo-de-mandioca Acesso em 17 abr. 2017.
SILOTO, E.D.; FERNANDES, A. M. Brotação de manivas de mandioca no sistema de
propagação rápida sob diferentes níveis de adubação. Revista Raízes e Amidos Tropicais, v.
12, p.15-25, 2016.
SILVA, M. N.; CEREDA, M. P.; FIORINI, R.A. Multiplicação rápida de mandioca. In:
CEREDA, M. P. (Coord ). Agricultura: Tuberosas Amiláceas Latino Americanas. São
Paulo: Fundação Cargill, 2002, p. 187-197.
WECHKRAJANG, S.; VICHUKIT, V.; TOONKOOL, P.; NAKASATHffiN, S. Anatomical
characterization and protein profiles in adventitious and storage roots of two commercial Thai
cassava varieties. Kasetsart Journal (Natural Science), v. 40, p.297-305, 2006.
VENTURINI, M.T.; DA SILVA SANTOS, V.; DE OLIVEIRA, E. J. Procedimentos para
avaliar a tolerância de genótipos de mandioca à deterioração fisiológica
pós-colheita. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.50, p.562-570, 2015.
VIEIRA, E.A.; FIALHO, J. F.; FACEIRO, F.G.; BELLON, G. SILVA, M S. Caracterização
molecular de acessos de mandioca biofortificados com potencial de uso no melhoramento
genético. Revista Ciência Agronômica, v.42, p.457-463, 2011.
VILAS BOAS, S.A.; HOHENFELD, C.S.; OLIVEIRA, S.A.S.; SANTOS, V.S.; OLIVEIRA,
E.J. Sources of resistence to cassava root rot caused by Fusarium spp.: a genotyoic approach.
Eupbytica, v.209, p.237-251, 2016.

Tabela 1. Número de brotos obtidos, taxa de emaizamento ao final de 22 dias e taxa de aclimatação ao final
três meses, de acessos de mandioca testados com a metodologia de propagação rápida da mandioca.
Acesso N2 de brotos obtidos Taxa de enraizamento Taxa de aclimatação
BRS Poli 145 94.5% 85.4%

Surubim 41 107 31.7%
BRS Kiriris 70 91.4% 34.3%
CPATU 530 92 95.6% 77.3%
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Figura 1. Etapas de propagação, enraizamento e plantio dos brotos para obtenção das mudas
de mandioca. Em (A) câmara de propagação no primeiro plano e câmara de enraizamento ao
fundo, ambas construídas conforme Silva et al. (2002); (B) câmara de propagação no primeiro
plano, e câmara de enraizamento ao fundo, adaptadas com clarite para as condições de Belém-
PA; (C) plantio das manivas; (D) cultivo dos brotos com irrigação diária; (E) Corte dos brotos
com 15 centímetros de comprimento; (F) Brotos colocados em copos plásticos contendo água
destilada para enraizamento, apresentando murcha inicial das folhas; (Gl) Formação de calos
após 5 dias; (G2) Posterior formação de raízes adventícias nos brotos; (H) Mudas plantadas
em sacos plásticos contendo terra preta, mantidas em telado de madeira e irrigadas na
ausência de chuvas.
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II
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Li /r
B
Figura 2. Brotos em fase de enraizamento. (A) Brotos do genótipo CPATU 348, com a
ausência de calos, indicada pela seta; (B) Brotos do acesso BRS Kiriris, com setas indicando
o aparecimento de pontos escuros.

Figura 3. Estágio do desenvolvimento das raízes com 90 dias após o plantio dos brotos do
acesso BRS Poti (A) As raízes adventícias ocupam a maior parte do substrato (B e C) se
observa a presença de raízes em fase inicial de tuberização.

Figura 4. Desenvolvimento das plantas com 120 e 180 dias após o plantio dos Brotos dos
acessos (A) BRS Poti, (B) CPATU 530 e (C) BRS Kiriris. (1) Plantas com 120 dias e (2)
plantas com 180 dias após o plantio, apresentando raízes tuberosas bem desenvolvidas.
53
Capítulo III
PODRIDÃO RADICULAR DA MANDIOCA: METODOLOGIA DE INOCULAÇÃO E
DESENVOLVIMENTO DA DOENÇA
54
1 PPODRIDÃO RADICULAR DA MANDIOCA: METODOLOGIA DE INOCULAÇÃO E
2 DESENVOLVIMENTO DA DOENÇA1
4 Aline Medeiros Lima<U3), Jonny Lúcio Sousa Silva<U), Elisa Ferreira Moura Cunha*4'^,
5 Alessandra Keiko Nakasone Ishida(4), Roberto Lisboa Cunha(4) e Cláudia Regina Batista de
6 Souza<3)
(1)
8 Programa de Pós-Graduação em Agronomia da Universidade Federal Rural da Amazônia,
9 Belém, PA, CEP 66077-530, Brasil. E-mail: aline.lima@ufra.edu.br,
(2)
10 jonnylucios.silva@hotmail.com Universidade Federal Rural da Amazônia - Campus de
<3)
11 Tomé-Açu, Tomé Açu - PA, CEP 68680-000, Brasil. Instituto de Ciências Biológicas,
(4)
12 Universidade Federal do Pará, Belém, PA, 66075-110, Brasil, bsouza@ufpa.br. Embrapa
13 Amazônia Oriental, Caixa postal 48, Belém, PA CEP 66095-903, Brasil,
14 elisa.moura@embrapa.br, alessandra.ishida@embrapa.br, roberto.cunha @embrapa.br
15 *Corresponding author: elisa.moura@embrapa.br
16
17 Resumo - O objetivo do presente trabalho foi estabelecer um protocolo de inoculação do
18 agente causador da podridão radicular das raízes em plantas jovens de mandioca. Para a
19 obtenção das plantas foi utilizada a metodologia de propagação rápida em condições de casa
20 de vegetação. O isolado de Phytopythium sp. foi cultivado e inoculado em plântulas com
21 raízes adventícias e plantas de mandioca com raízes tuberizadas. A inoculação em plântulas
22 com raízes adventícias não resultou em sintomas característicos de podridão radicular,
23 enquanto a inoculação em plantas com raízes tuberizadas e solo infestado com o patógeno
24 Phytophytium sp. resultou em sintomas característicos de podridão radicular.
^ste capítulo segue a norma de apresentação da Revista Pesquisa Agropecuária Brasileira - PAB
55
25 Termos para indexação: Manihot esculenta, Phytophytium sp., propagação rápida da
26 mandioca e interação planta-patógeno.
27 Abstract - The aim of this work was establish a protocol of inoculation of the root rot agent in
28 young cassava plants. The methodology for getting plants was the fast propagation
29 methodology under greenhouse conditions. The isolate of Phytopythium sp. was cultiveted
30 and inoculed in seedlings with adventitious roots and cassava plants with tuberous roots.
31 Inoculation on seedlings with adventitious roots did not result in symptoms characteristic of
32 root rot, while inoculation in plants with tuberized roots and soil infested with the pathogen
33 Phytophytium sp. resulted in symptoms characteristic of root rot.
34 Index termos: Manihot esculenta, Phytophytium sp., Rapid propagation of cassava and plant-
35 pathogen interaction.
36
37 Introdução
38 A mandioca {Manihot esculenta Crantz) é uma espécie cultivada em diversos países,
39 visando principalmente o aproveitamento de suas raízes tuberosas ricas em amido utilizadas
40 em processos industriais e como fonte de calorias na alimentação humana e animal (Vieira et
41 al., 2011). Em algumas regiões do planeta como África, Ásia e America Latina milhões de
42 pessoas dependem da mandioca, principalmente como fonte de alimento e renda, sobretudo
43 para pequenos agricultores (FAO, 2015).
44 No Brasil, a mandioca é cultivada em todas as regiões, onde o estado do Pará se
45 destaca o principal produtor, com uma produção de 4,7 mil toneladas em 2016 (IBGE, 2017).
46 Essa produção é limitada pela baixa adoção de tecnologia, aliada a incidência de limitações de
47 origem biótica causadas por insetos (Pietrowski et al., 2014), ácaros e microrganismos
48 (Oliveira et al., 2013; Vilas-Boas et al., 2016).

56
49 A podridão radicular da mandioca é causada principalmente pelo fungo Fusarium
50 solani (Poltronieri et al., 2002) e oomicetos dos gêneros Phytophthora e Pylhium (Poltronieri
51 et al., 1997) e recentemente Phytopythium sp. foi descrito como causador da doença no Estado
52 do Pará (Boari et al., 2018). Esta é uma doença de alto impacto econômico e social, por gerar
53 drástica queda na produtividade das raízes de mandioca e inviabilizar as áreas de plantio ao
54 longo de novos ciclos de cultura (Notaro, 2013).
55 Um dos desafios da identificação de fontes de resistência à podridão radicular nos
56 acessos de mandioca é a falta de metodologias adequadas para seleção de genótipos por meio
57 de inoculações artificiais, de modo a refletir o comportamento destes em condições de campo.
58 O método de inoculação de raízes destacada, apesar de ser a metodologia de seleção
59 atualmente utilizada na busca por genótipos resistentes à podridão radicular é uma
60 metodologia que necessita de uma programação na colheita das raízes (com tempo mínimo de
61 10 meses de plantio) e uma cuidadosa triagem para que não sejam utilizadas raízes com
62 injúrias e com infecções provenientes do campo (Onyeka et al., 2005a; Oliveira et al., 2013;
63 Vilas-Boas et al., 2016). Desta forma, o objetivo do presente trabalho foi estabelecer um
64 protocolo de inoculação do agente causador da podridão radicular das raízes em plantas
65 jovens de mandioca.
66
67 Material e métodos
68 Os experimentos foram conduzidos em condições ambientais entre os meses de agosto
69 de 2016 a junho de 2017, na Embrapa Amazônia Oriental com sede em Belém-PA região
70 caracterizada por umidade e temperatura elevada durante todo o ano (Oliveira et al., 2016).
71 Para a obtenção das plântulas com raízes adventícias e plantas com raízes tuberizadas
72 foi utilizada a metodologia da propagação rápida de mandioca para a região norte em
73 condições de casa de vegetação (Capítulo anterior). Dois genótipos com 12 meses de idade
57
74 foram selecionados no Banco Ativo de Germoplasma de mandioca da Embrapa Amazônia
75 Oriental. O acesso CPATU 530, conhecido como Olho Verde 1, apresenta o fenótipo
76 suscetível à podridão radicular, enquanto o acesso BRS Poti é tolerante à doença
77 (Albuquerque & Brandão, 2008).
78 O isolado de Phytopythium sp. utilizado neste trabalho está catalogado na Micoteca da
79 Embrapa Amazônia Oriental (CPATEI) com o código CT0084. Um fragmento da coleção foi
80 retirado e inserido numa placa de Petri contendo meio de cultura Mandioca Mansa Dextrose
81 Agar (MMDA) (Dados não publicados) a 28±20C e escuro contínuo por 7 dias.
82 Objetivando testar a melhor umidade para o crescimento do Phytopythium sp., foram
83 autoclavados frascos de vidro de 1000 mL contendo 250 g de areia branca e fubá de milho na
84 proporção de 3:1 (p/p) de areia lavada peneirada e fubá de milho. As condições de umidade
85 testada foram natural (sem a adição de água), 10% (25 mL de água/frasco contendo 250g) e
86 30% (75 mL de água/frasco contendo 250g). Estes foram autoclavados duas vezes por Ih a
87 1210C com intervalo de 24h. Após o resfriamento, foram adicionados em cada frasco, 50
88 discos de meio de cultura MMDA, com 6 mm de diâmetro, contendo micélio do patógeno. No
89 controle, foram adicionados 50 discos de meio de cultura MMDA, com 6 mm de diâmetro,
90 estéreis. Os frascos foram incubados por sete dias a 28±20C, no escuro e o crescimento
91 avaliado. Para confirmar, parte do micélio foi adicionado numa placa contendo meio MMDA
92 e incubado a 28±20C no escuro contínuo por 7 dias. Em seguida, a morfologia da colônia foi
93 comparada para confirmar a presença do isolado.
94 O isolado de Phytopythium sp. foi crescido numa placa de Petri contendo meio de
95 cultura Mandioca Mansa Dextrose Agar (MMDA) (Dados não publicados) a 28±20C e escuro
96 contínuo por sete dias.. Em seguida, a suspensão de esporos utilizada para imersão das raízes
97 foi preparada a partir da adição de 10 mL de água destilada esterilizada em cada placa de Petri
98 contendo o patógeno, e os zoósporos foram liberados com auxílio de uma lâmina de bisturi. A
58
99 concentração dos zoósporos foi determinada pela contagem em microscópio ótico utilizando
100 um hemocitômetro (câmara de Neubauer) e posteriormente ajustada para 16x103
101 zoósporos/mL. Para o controle da inoculação (testemunha), foi utilizada somente água
102 destilada esterilizada.
103 O teste de patogenicidade do isolado foi realizado utilizando a metodologia de
104 inoculação de raízes inteiras propostas por Onyeka et al. (2005) e adaptadas por Oliveira et al.
105 (2013), em que as raízes foram lavadas e submetidas à desinfestação com hipoclorito de sódio
106 (0,5%), em seguida perfuradas em pontos equidistantes (6 mm de diâmetro) e adicionados
107 discos de meio de cultura MMDA (6 mm de diâmetro) contendo micélio do patógeno
108 Phytopythium sp. No controle, foram adicionados discos de meio de cultura MMDA (6 mm
109 de diâmetro) estéreis. Os locais de inoculação foram cobertos com parafilme para evitar
110 contaminação externa e garantir a umidade no local de inoculação. As raízes foram mantidas
111 em câmera úmida e temperatura 25±2 0C por sete dias. No momento da avaliação, as raízes
112 foram cortadas transversalmente e longitudinalmente nas regiões onde foi realizada a infecção
113 e fotografadas.
114 Para a inoculação das plântulas com raízes adventícias, foram utilizadas duas
115 metodologias: a infestação do substrato e a imersão de raízes. As plântulas com raízes
116 adventícias foram plantadas em substrato inerte areia branca e vermiculita. O substrato areia
117 lavada e vermiculita foram misturados na proporção de 1:1 volume/volume e em seguida
118 ensacados e levados para o laboratório para esterilização. Os sacos contendo a mistura foram
119 autoclavados por Ih a 1210C duas vezes com intervalo mínimo de 24 horas. Para o cultivo
120 das plântulas, foi utilizada solução nutritiva proposta por Hoagland & Arnon (1950).
121 A infestação do substrato se deu pela mistura de 25g de areia e fubá de milho infestado
122 ao substrato areia e vermiculita esterilizado e irrigados com solução nutritiva. No tratamento
123 controle, foram adicionados 25 g de areia e fubá de milho estéril. A imersão de raízes, as
59
124 raízes adventícias das plântulas foram imersas em suspensão (16x103 zóosporos/mL) do
125 patógeno por 1 hora e depois plantadas em vasos de 0,8 L contendo 750 g de substrato (areia e
126 vermiculita) estéril e irrigados com 200 mL de solução nutritiva diluída (1/4 da força). As
127 plântulas controle foram imersos em água destilada autoclavada. Os procedimentos descritos
128 acima foram realizados tanto nas plântulas com raízes adventícias sem ferimento quanto nos
129 plântulas que tiveram suas raízes adventícias feridas com lâmina de bisturi estéril para
130 facilitar a ação do patógeno.
131 Para evitar a contaminação, os vasos foram cobertos com discos de EVA. Os vasos
132 foram pesados diariamente e seu peso completado com água destilada autoclavada para
133 equilibrar a concentração dos nutrientes em solução. As plantas com raízes adventícias foram
134 levadas para uma estrutura de ferro coberta com plástico transparente telado e mantidas lá até
135 o fim do experimento. As avaliações foram realizadas diariamente procurando observar sinais
136 característicos da doença. Foram coletadas ao final do experimento amostras do substrato para
137 re-isolamento do patógeno.
138 O inóculo para inoculação das plantas com raízes tuberizadas pelo método de
139 infestação do solo foi produzido em substrato areia e fubá de milho conforme descrito
140 anteriormente e com umidade de 30%. A mistura foi acondicionada em sacos plásticos
141 transparentes (Figura 1 A). Para promover o crescimento uniforme, os sacos contendo o
142 substrato areia-fubá infestado foram homogeneizados a cada dois dias e incubados a 28±2 0C,
143 por 10 dias.
144 A metodologia utilizada para a inoculação foi a infestação do solo com uma mistura de
145 areia e fubá de milho (proporção 3:1) infestada com discos contendo micélio do patógeno.
146 Em cada vaso, foram distribuídos lOOg da mistura areia e fubá infestado (Figura 1 B-D).
147 Como controle, foram distribuídos lOOg da mistura areia e fubá estéril. As avaliações foram
148 realizadas com 7, 15 e 34 dias após a inoculação. No momento da avaliação, as raízes foram
60
149 cortadas transversalmente nas regiões onde foi realizada a infecção e fotografadas. Foram
150 coletadas amostras de raízes, caule e folhas e estas foram armazenadas a -80oC para estudos
151 posteriores de biologia molecular. Também foram coletadas amostras de solo e raízes para o
152 re-isolamento do patógeno
153
154 Resultados e discussão
155 O isolado de Phytopythium sp. apresentou-se como patogênico quando inoculado pelo
156 método de inoculação de raízes inteiras propostas por Onyeka et al. (2005) e adaptadas por
157 Oliveira et al. (2013), apresentando os sinais característicos da doença (Dados não
158 mostrados), mostrando-se que este estava adequado para realizar as inoculações.
159 Quanto à umidade necessária para o crescimento do Phytopythium sp. no substrato
160 areia e fubá das três umidades testadas a que apresentou melhor resultado foi com 30% de
161 umidade já que 7 dias após a inoculação apenas este apresentava crescimento do patógenos. O
162 re-isolamento do patógeno confirmou este resultado já que se observou colônias com
163 características do isolado CT084 . No controle não foram observadas formações de colônias,
164 comprovando que o meio estava estéril (dados não mostrados).
165 A inoculação a partir de plântulas com raízes adventícias seria uma alternativa rápida e
166 prática (Figura 2 A), no entanto não foram observados sinais característicos da doença nas
167 plântulas inoculadas. O desenvolvimento das mudas no vaso contendo substrato irrigado com
168 a solução nutritiva mostrou-se favorável até quinze dias após o início do experimento. Nessas
169 condições, as plantas controle e as inoculadas se mostravam saudáveis e com crescimento
170 radicular bem desenvolvido (Figura 2 B). Uma avaliação mais prolongada não pode ser
171 realizada aos vinte dias após a inoculação, pois as plantas começaram a apresentar sinais de
172 estresse de origem biótica e abiótica influenciados provavelmente pela concentração da
173 solução nutritiva e/ou limitações de crescimento influenciadas pelo tamanho do vaso (Figura
61
174 5 C). Dois meses após a inoculação, não se observou recuperação e nem crescimento nas
175 plantas controle e inoculadas. Também não se observou sintomas de podridão nas raízes
176 avaliadas (Figura 5 D) nos dois métodos testados.
177 Segundo Almeida et al. (2014), vasos pequenos podem limitar o desenvolvimento da
178 planta pelo volume de substrato neles contido. No entanto, essa limitação está diretamente
179 relacionada às espécies em desenvolvimento e ao tempo de avaliação. Alguns processos
180 fisiológicos podem ser afetados pelo tamanho do vaso, como por exemplo, absorção de água e
181 nutrientes, redução de assimilação líquida de carbono e, deste modo, o crescimento da parte
182 aérea (Andrade et al., 2012). A redução do crescimento da parte aérea, em função da restrição
183 ao crescimento radicular, decorre, principalmente, da aclimatação da maquinaria
184 fotossintética, por um processo denominado retroinibição da fotossíntese (Macana, 2012).
185 A ineficiência do método de inoculação por imersão das raízes e infestação do solo
186 pode estar relacionada com a capacidade de regeneração do sistema radicular da mandioca. A
187 inoculação não foi suficiente para impedir o desenvolvimento de novas raízes pelo caule e,
188 consequentemente, a recuperação da planta inoculada. Outros fatores a serem analisados são a
189 concentração do inóculo e o tempo para colonização do solo e posterior penetração nas raízes.
190 Além disso, vale ressaltar que as espécies de fitopatógenos associadas à podridão radicular
191 das raízes em mandioca afetam principalmente as raízes tuberosas (Msikita et al., 2005;
192 Bandyopadhyay et al., 2006).
193 A metodologia da infestação do solo de vasos com plantas de mandioca com raízes
194 tuberizadas possibilitou o aparecimento dos sintomas típicos de podridão radicular nas raízes
195 de armazenamento e que sofreram algum tipo de ferimento durante a inoculação. Não se
196 observaram lesões nas raízes das plantas controle, apesar de se observar ferimentos já
197 cicatrizados nestas (Figura 3 A-M).

62
198 Não foram observadas lesões nas raízes adventícias das plantas inoculadas, reforçando
199 assim o relato de que os patógenos associados à podridão radicular das raízes em mandioca
200 afetam principalmente as raízes de armazenamento (Msikita et al., 2005; Bandyopadhyay et
201 al., 2006). Nas raízes que não sofreram ferimentos, não se observou sinais característicos da
202 doença. É importante, no momento da inoculação, realizar aberturas nas raízes para facilitar a
203 infecção.
204 O método de infestação do solo de plantas com raízes tuberizadas foi suficiente e
205 possibilitou o desenvolvimento inicial da doença. Este método se mostrou promissor para
206 inocular raízes de mandioca e assim auxiliar nos estudos moleculares que necessitem de
207 material obtido em casa de vegetação. A metodologia que utiliza a mistura de fubá de milho
208 com areia para cultivo do patógeno, e em seguida, esta mistura infectada é adicionada ao solo
209 onde as plântulas serão transplantadas é bastante simples e tem sido utilizado com sucesso em
210 outros patossistemas (Klingelfuss et al., 2007; Silva et al., 2011).
211 Com as observações realizadas aos 34 dias após a inoculação, não foi possível
212 observar avanço da doença, pois comparando com as amostras de 15 dias, as lesões são bem
213 similares (Figura 4 A- F). Como foi possível re-isolar tanto das raízes quanto do solo o
214 patógeno (dados não mostrados), exclui-se a possibilidade da morte deste, porém as condições
215 climáticas podem não ter favorecido o seu desenvolvimento. É necessário realizar novos
216 estudos que busquem avaliar se a planta respondeu e conseguiu controlar o patógeno ou o
217 patógeno não estava em condições favoráveis para se desenvolver. Amostras foram coletadas
218 e estudos moleculares serão realizados posteriormente para maiores esclarecimentos.
219 Conclusão
220 Os resultados obtidos neste trabalho mostram que o método de propagação rápida da
221 mandioca em casa de vegetação foi eficiente para a produção de mudas de mandioca e pode
222 auxiliar na produção de material vegetal para estudar a interação da mandioca com o
63
223 Phytophytium sp.. O protocolo que permitiu a reprodução da podridão radicular da mandioca
224 foi o que utilizou plantas de mandioca com raízes tuberizadas e solo infestado com o patógeno
225 Phytophytium sp..
226 Agradecimentos
227 A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) pela bolsa; à
228 Fundação Amazônia de Amparo a Estudos e Pesquisas do Pará (FAPESPA) e ao Conselho
229 Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo financiamento da
230 pesquisa; e à Universidade Federal Rural da Amazônia (UFRA), à Embrapa Amazônia
231 Oriental e à Universidade Federal do Pará (UFPA) pelo apoio a pesquisa.
232
233 Referências
234 ALBUQUERQUE, A. S., & BRANDÃO, I. C. D. Acessos BRS Mari e BRS Poti e medidas
235 de controle da podridão-mole da mandioca. Belém: Embrapa Amazônia Oriental, 2008.
236 24p. (Embrapa Amazônia Oriental, Documento, 326). Disponível em:
237 http://www.cpatu.embrapa.br/publicacoes_online. Acessado em: 11 out. 2015.
238
239 ALMEIDA, M. O. et al. Influência do tamanho do vaso e época de avaliação sobre o
240 crescimento do pícão preto em competição com milho e soja. Biosci. J., v. 30, n. 5, p.
241 1428-1437, 2014.
242
243 ANDRADE, F. R. et al. Formação de mudas de mamona em diferentes recipientes. R. Bras.
244 Ci. Agr., v. 7, n. 2, p. 274-279, 2012.
245
246 BANDYOPADHYAY, R.; MAWANGI, M.; AIGBE, S.O.; LESLIE, J. Fusarium species
247 firom the cassava root rot complex in West África. Phytopathology, v.96, p.673-676, 2006.
64
248
249 BOARI, A. J., QUADROS, A. F. F., CUNHA, E. M., FERNANDES, A. F., & BARRETO, R.
250 W. First report of Phytopythium sp. causing storage root rot and foliage blight of cassava in
251 Brazil. PlantDisease, https://doi.org/10.1094/PDIS-09-17-1449-PDN, 2018
252
253 COCK, J.H; WHOLEY, D.; LOZANO J.C.; TORO, J.C. Sistema rápido de propagación de
254 yuca. Colômbia: Centro Internacional de Agricultura Tropical, 1976. 12 p. (Serie ES: Centro
255 Internacional de Agricultura Tropical. N0. 20). Disponível em http://ciat-
256 library.ciat.cgiar.org/ciat_digital/CIAT/books/historical/147.pdf. Acessado em: 15 out. 2015.
257
258 FAO. Why cassava? Disponível em http://www.fao.org/ag/agp/agpc/gcds/index_en.html
259 Acesso em 16 out 2017.
260
261 FUKUDA, W., & de CARVALHO, H. W. L. Propagação rápida de mandioca no nordeste
262 brasileiro. Aracajú: Embrapa Tabuleiros Costeiros, 2007. 6 p. (Embrapa Tabuleiros
263 Costeiros. Circular Técnica, 45). Disponível em
264 http://www.infoteca.cnptia.embrapa.br/handle/doc/372216. Acessado em: 15 out. 2015.
265
266 HOAGLAND, D.R..; ARNON, D.I. The water culture method for growing plants without soil.
267 Califórnia Agricultural Experiment Station, Circular, 347. 1950.
268
269 IBGE (2017). Levantamento sistemático da produção agrícola. Rio de Janeiro v.30 n.3
270 p.1-83 Março. 2017. Disponível em
271 ftp://ftp.ibge.gov.br/Producao_Agricola/Levantamento_Sistematico_da_Producao_Agricola_[
272 mensal]/Fasciculo/lspa_201703.pdf Acessado em 01 maio 2017.

65
273
274 KLINGELFUSS, LUIZA H., JOSÉ T. YORINORI, AND DEONISIO DESTRO. "Métodos
275 de ínoculação para quantificação de resistência em soja à Fusarium solaní f. sp. glycines,
276 em cíí^íí-át-ytgtiíí^ko" Fitopatologia Brasileira ?)2.l (2007): 50-55.
277
278 MACANA, Y. A. M. Efeitos da disponibilidade de água e de luz no metabolismo
279 fotossintético em Coffea arahica. 2012. 46 f. Dissertação (Mestrado em Fisiologia Vegetal)
280 -Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 2012.
281
282 MSIKITA, W., BISSANG, B., JAMES, B. D., BAEMEY, H., WILKINSON, H. T.,
283 AHOUNOU, M., AND FAGBEMISSI, R. Prevalence and severity of Nattrassia mangiferae
284 root and stem rot pathogen of cassava in Bénin. Plant Disease, v.89, p. 12-16, 2005.
285
286 NOTARO, K. A.; MEDEIROS, E. V.; SILVA, C. A. D.; BARROS, J. A. Prospecção de
287 fitopatógenos associados a podridão radicular da mandioca em Pernambuco,
288 Brasil. Bioscience Journal, v. 29, p. 1832-1839, 2013.
289
290 OLIVEIRA, S. A. S. DE; HOHENFELD, C. S.; SANTOS, V. DA S.; HADDAD, F.;
291 OLIVEIRA, E. J. Resistance to fusarium dry root rot disease in cassava accessions.
292 Pesquisa agropecuária brasileira (PAB), Brasília, v.48, n.10, p.1414-1417. 2013.
293
294 OLIVEIRA, M. C. F.; SOUZA JÚNIOR, J. A.; CRUZ, P. P. N.; SOUZA FILHO, J. D.
295 Climatologia urbana da cidade de Belém-Parã, através das precipitações e temperaturas do ar,
296 das normais climatológicas de 1941 a 1970, 1971 a 2000 e da normal provisória de 2001 a
297 2015. Revista Brasileira de Geografia Física v.09, n. 03, p. 803-819, 2016.
66
298
299 ONYEKA, T. J., DIXON, A. G. O., AND EKPO, E. J. A. Assessment of laboratory
300 methods for evaluating cassava genotypes for resistance to root rot disease.
301 Mycopathologia, v.159, p.461-467. 2005.
302
303 PIETROWSKI, V., RHEINHEIMER, A. R., MIRANDA, A. M., DA SILVA WENGRAT, A.
304 P. G., & BARILLI, D. R. (2014). Ocorrência de Aleurothrixus aepim (Goeldi, 1886) em
305 mandioca na região Oeste do Paraná. Arquivos do Instituto Biológico, 81(2), 186-188.
306
307 POLTRONIERI, L. S.; TRINDADE, D.R.; SILVA, H. M.; ALBUQUERQUE, F. C.
308 Patógenos associados à podridão mole de raízes de mandioca no estado do Pará.
309 Fitopatologia Brasileira, v. 22, p.111-112, 1997.
310
311 POLTRONIERI, L. S.; TRINDADE, D. R.; ALBUQUERQUE, F. C.; DUARTE, M. L. R.-
312 CARDOSO, S. S. Incidência de Fusarium solani em mandioca no Estado do Pará.
313 Fitopatologia Brasileira, v. 5, p. 544. 2002.
314
315 SILVA, M. N.; CEREDA, M. P.; FIORINI, R.A. Multiplicação rápida de mandioca. In:
316 CEREDA, M. P. (Coord ). Agricultura: Tuberosas Amiláceas Latino Americanas. São
317 Paulo: Fundação Cargill, 2002, p 187 a 197.
318
319 SILVA, A. dos S. et al. Seleção de metodologias para ínoculação da fusariose do
320 maracujazeiro causada por Fusarium oxysporum f sp passiflorae Cruz das Almas:
321 Embrapa Mandioca e Fruticultura, 200. 20p. (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento, 51).
322
67
323 VENTURINI, M. T., DA SILVA SANTOS, V., & DE OLIVEIRA, E. J. (2015).
324 Procedimentos para avaliar a tolerância de genótipos de mandioca à deterioração fisiológica
325 pós-colheita. Pesquisa Agropecuária Brasileira, 50(7), 562-570.
326
327 VILAS BOAS, S.A.; HOHENFELD, C.S.; OLIVEIRA, S.A.S.; SANTOS, V.S.; OLIVEIRA,
328 E.J. Sources of resistence to cassava root rot caused by Fusariam spp.: a genotyoic
329 approach. Euphytica, 209: 237-251. 2016.
330
331 VIEIRA, E.A.; FIALHO, J. F.; FALEIRO, F. G.; BELLON, G. SILVA, M. S. Caracterização
332 molecular de acessos de mandioca biofortificados com potencial de uso no melhoramento
333 genético. Revista Ciência Agronômica, v. 42, n. 2, p. 457-463, 2011.

68
M.
A
Figura 1. Etapas de preparo do inóculo e inoculação das plantas com raízes tuberizadas. (A) Saco onde foram
produzidos o inóculo para a infestação do solo infestado contendo discos do micélio do patógeno incubado a
250C por 10 dias. (B) para a inoculação foram pesados lOOg do inóculo e adicionados próximos às raízes
tuberizadas (C) as plantas controle receberam lOOg da mistura de areia e fubá de milho com discos de meio
MDA estéreis incubado a 250C por 10 dias. (D) Vasos com o substrato incorporado ao solo e umedecidos.
69
i■[ i n
k- ■ /m ;
v
§
Figura 2. Inoculação das plântulas com raízes adventícias. Plântulas no substrato areia e vermiculita irrigados
com solução nutritiva e3 dias após o plantio (A). Raízes 15 dias após o plantio (B). Plantas após 20 dias de
inoculação(C). Raízes das plantas inoculadas após 60 dias de inoculação (D).

70
"1
"
V il
Figura 3: Lesões observadas nas raízes dos acessos de mandioca (Manihot esculenía) BRS Poti (A - F) e CPATU
530 (G-M). Amostras coletadas do acesso BRS Poti Controle aos 7 (A). 15 (C) e 34 dias (E)após a inoculação.
Amostras coletadas do acesso BRS Poti inoculadas com Phytophytium sp. 7 (B). 15 (D) e 34 dias (F)após a
inoculação. Amostras coletadas do acesso CPATU 530 controle com 7 (G). 15 (I) e 34 dias (L) dias após a
inoculação. Amostras coletadas do acesso CPATU 530 inoculadas cova Phytophytium sp com 7 (H). 15 (J) e 34
dias (M) após a inoculação.

71
III
1
íf ' 3
ri'"!!""!"1'!
0.7
0.6
I BRS Poti 24 horas
0.5 I BRS Poti 48 horas
0.4 BRS Poti 72 horas
ICPATU 530 24 horas
0.3
I CPATU 530 48 horas
0.2
CPATU 530 72 horas
0.1
Lesão relativa
Figura 4. Área Lesionada nos cortes transversais nas raízes infectadas 1- Fotografia dos acessos BRS Poti (A -
C) e CPATU 530 (D-F). A e D amostras coletadas com 7 dias. B e E amostras coletadas com 15 dias. C e F
amostras coletadas com 34 dias. 2- Lesão relativa referente aos cortes transversais realizados nas raízes
infectadas em relação ao controle.

72
Capítulo IV
PADRÕES DIFERENCIAIS DE EXPRESSÃO CÊNICA EM RAÍZES DE

73
4. PADRÕES DIFERENCIAIS DE EXPRESSÃO GÊNICA EM RAÍZES DE
RESUMO
A mandioca é cultivada em todo o mundo e um dos fatores que limitam a expansão da
mandiocultura é a podridão radicular causada por Phytopythium sp. Portanto, este trabalho
visa identificar e analisar a expressão de genes que codificam proteínas efetoras
potencialmente envolvidas na respostade defesa da mandioca. Raízes destacadas do acesso
Caxuianã foram inoculadas com Phytophytium sp. e como controle foram utilizadas raízes
sem o patógeno nas mesmas condições. As coletas do material foram realizadas com 24, 48 e
72 horas após a inoculação (hai). Para a analise dos padrões de expressão foi extraído o RNA
e realizados ensaios de RT-PCR semi quantitativo. Foram analisados 9 genes, onde sete genes
apresentaram expressão diferenciada nas raízes de mandioca inoculadas com o patógeno. A
análise da expressão também confirmou a ausência da deterioração pós colheita (PPD) no
material, confirmando que o método utilizado foi eficiente para estudar a interação. Dentre os
genes analisados destacam-se o gene que codifica uma cistatina de mandioca (McCPI), que
além de mostrar-se envolvidos na resposta negativa a PPD também mostrou-se favorável na
resposta ao patógeno e os genes que codificam as enzimas Chalcona sintase (MeCHS) e
Fenilalanina amônia-liase (PAL) pois estas apresentam expressam diferencial no tecido
inoculado com 48 e 72 hai comparado com o controle. A identificação de genes de genes de
resposta da mandioca ao agente causador da podridão radicular - Phytopythium sp. pode
contribuir para no futuro se obter acessos resistentes.
ABSTRACT
The cassava is cultivate in almost ali in the world and root rot caused by Phytopythium sp is a
one factor that limite the expansion of mandiocultura. Therefore, the objective of this work is
identify and analyze the expression of genes that coding effectors proteins potentially
involved in the defense response of cassava to pathogen attack. Roots of the Caxuianã access
were inoculated with Phytophytium sp. and as control were used roots without the pathogen in
the same conditions. The collect of material were realized with 24, 48 e 72 hours after
inoculation (HAI). For the analysis of expression pattems, RNA was extracted and p
semiquantitative RT-PCR assays were realized. Nine genes were analyzed, where seven genes
presented differentiated expression in cassava roots inoculated with the pathogen. Expression
analysis also confirmed the absence of post-harvest deterioration (PPD) in the material,
74
confirming that the method used was efficient to study the interaction. Among the analyzed
genes, the gene coding for a cassava cystatin (MeCPI), which in addition to being involved in
the negative response to PPD, also showed to be favorable in the response to the pathogen and
the genes coding for the enzymes Chalcone synthase MeCHS) and Phenylalanine ammonia
lyase (MePAL), since they present differential expression in the tissue inoculated with 48 and
72 hai compared to the control. The identification of genes in response to the cassava to root
rot agent - Phytopythium sp may contribute to the future of resistant acessos.
4.1 Introdução
As plantas estão expostas a vários e complexos tipos de interações no seu ambiente
natural. No entanto, algumas condições extremas como seca, calor, salinidade, frio ou o
ataque de patógenos e pragas tem impactos sobre o crescimento e o rendimento das plantas.
Estas condições extremas, denominadas estresses bióticos e abióticos, são devastadoras
quando ocorrem em culturas de importância econômica. As plantas, de modo geral,
respondem a esses estresses de forma complexa, envolvendo adaptações fisiológicas,
moleculares e celulares (FRAIRE-VELÁZQUEZ et al., 2011; REJEB et al., 2014; SUZUKI
et al., 2014; GASSMANN et al., 2016).
A convivência das plantas com microrganismos resultou num complexo sistema de
interação, onde mecanismos diferenciados de defesa que, quando são acionados traduzem essa
percepção em uma resposta apropriada que vem se desenvolvendo ao longo do processo
evolutivo. Os microrganismos patogênicos possuem a habilidade de reconhecer sinais da
planta para iniciarem a infecção. Por outro lado, as plantas apresentam um complexo sistema de
defesa para impedir a invasão dos patógenos e, em conseqüência, o desenvolvimento da doença.

Esta interação planta- patógeno resulta em uma constante pressão de seleção entre os organismos
envolvidos (D ALIO, 2013; D ALIO et al., 2014; GASSMANN et al., 2016).
A mandioca {Manihot esculenla Crantz) é um dos mais dinâmicos produtos da
agricultura mundial, sendo cultivada em mais de cem países (ANDRÉ e SANTOS, 2012).
Apesar de sua rusticidade vários fatores relacionados a estresse biótico e abiótico limitam a
expansão da mandiocultura (OLIVEIRA et al., 2013; VENTURINI et al., 2015; VILAS-
BOAS et al., 2016). Dentre os fatores bióticos limitantes para a cultura da mandioca, a
podridão radicular é uma das doenças mais danosas por provocar queda progressiva na
produtividade, inviabilizando ciclos subsequentes da cultura (NOTARO, 2013). Os patógenos

75
causadores da podridão radicular são habitantes do solo e atacam principalmente as raízes
tuberosas, o principal produto para comercialização (VILAS-BOAS et al., 2016).
As formas mais indicadas de combate à podridão das raízes da mandioca são a rotação
de culturas, o manejo físico do solo, o uso de microrganismos antagônicos, o plantio em áreas
bem drenadas, a utilização de manivas provenientes de áreas sem ocorrência da doença e
destruição do material vegetal originário de áreas infestadas (VIEIRA, 2011). Porém, a forma
mais econômica e confiável para manejar as podridões radiculares da mandioca se baseia no
plantio de variedades resistentes (VILAS-BOAS et al., 2016).
Uma ferramenta que pode acelerar o desenvolvimento de novas variedades é a
prospecção de genes, que consiste na identificação e o isolamento de genes que confira
características de interesse como, resistência a estresses bióticos e abióticos. Diversos genes
relacionados ao estresse abiótico foram caracterizados em mandioca (LEE et al., 1999;
REILLY et al., 2001; SHIN et al., 2005; de SOUZA et al., 2006; 2009; COSTA et al., 2011;
REIS et al., 2012; SANTA BRÍGIDA et al., 2014), no entanto não existem estudos
envolvendo a identificação de genes relacionados a interação Mandioca- Phytopythium sp.
A busca na literatura resultou em nove genes candidatos sendo estes, Superóxido
dismutase tipo cobre e zinco (MeCu/ZnSOD), Proteínas abundantes na embriogenese tardia
tipo 3 (MeLEA-3), Proteína de tumor controlada tradicionalmente (MeTCTP), Dedo de zinco
-RING-H2 (MeRZF), Proteína alergênica Pt2L4 {Meei), Ziper Básico de Leucina {MebZIP),
Fitocistatinas {MeCPI), Chalcona sintase {MeCHS) e Fenilalanina amônio base {MePAL).
Portanto, este trabalho visa analisar a expressão de genes que codificam proteínas efetoras
potencialmente envolvidas na resposta de M. esculenla ao patógeno Phytopythium sp. A
identificação de genes de resposta da mandioca ao agente causador da podridão radicular pode
contribuir para a obtenção de acessos de mandioca resistentes a este patógeno.
4.2 Material e Métodos
4.2.1 Material vegetal e inoculação de raízes inteiras de mandioca com Phytopythium sp.
As raízes foram obtidas no Banco Ativo de Germoplasma da mandioca da Embrapa
Amazônia Oriental (Belém-PA) a partir de plantas do acesso Caxuianã com 12 meses de
idade. O acesso Caxuianã foi coletado no município de Caxuianã - Pará em área de produtor
de mandioca e é susceptível à podridão radicular em condições de campo. O patógeno
Phytopythium sp. foi obtido da Coleção do Laboratório de Fitopatologia da Embrapa

76
Amazônia Oriental. O isolado foi repicado em placas de Petri contendo 20 mL de meio
Mandioca-Dextrose-Agar (MDA), as placas foram mantidas a temperatura constante de 25 ±2

0
C em completa ausência de luminosidade durante doze dias (Dados não publicados).
A inoculação do patógeno nas raízes foi realizada seguindo a metodologia de
inoculação de raízes inteiras propostas por Oliveira et al. (2013). As raízes foram lavadas com
água destilada, sanitizadas com hipoclorito de sódio (0,5%) e em seguida perfuradas em três
pontos equidistantes (6 mm de diâmetro). Discos de meio de cultura MDA (6 mm de
diâmetro) contendo micélio do patógeno Phytopythium sp foram colocados nos pontos de
perfuração. Para o controle, foram adicionados discos de meio de cultura MDA (6 mm de
diâmetro) estéreis. Os locais de inoculação foram cobertos com parafilme para evitar
contaminação externa e garantir a umidade no local de inoculação.
As raízes foram mantidas em câmera úmida e temperatura constante de 25±2 0C até a
coleta. As raízes foram retiradas da câmara após 12, 24 e 48 horas com base no teste de
patogenicidade realizado (Dados não mostrados). No momento da avaliação, as raízes foram
cortadas transversalmente nas regiões onde foi realizada a infecção e fotografadas. Em
seguida o córtex foi separado e armazenado no ultrafreezer (-80°) para análises subsequentes.
4.2.2 Obtenção das seqüências dos genes de interesse nos Bancos de dados e desenho dos
iniciadores.
A seleção de genes candidatos para as análises de expressão gênica foi realizada em
função de informações prévias da literatura que possam estar potencialmente associados com
a resistência de plantas a patógenos (Tabela 1). As seqüências para os genes de mandioca
foram obtidas por meio das ferramentas de busca disponível no Phytozome
(http://www.phytozome.net/cassava). A busca foi realizada utilizando palavras chaves e/ou às
seqüências obtidas na literatura. As seqüências obtidas foram avaliadas quanto a presença dos
domínios conservados através dos programas InterPro Scan (https://www.ebi.ac.uk/interpro) e
CDD {ConservededDomains I)alahase\ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/docs
/cdd search.html) e quanto à similaridade com proteínas de estrutura resolvida depositadas
nos bancos de dados, para tal foi utilizada a ferramenta BLAST
(www.blast.ncbi.nlm.nig.gov). O alinhamento das seqüências de aminoácidos dos genes foi
realizado com o auxílio do programa CLUSTALW utilizando os parâmetros padrões. O peso
molecular e o ponto isoelétrico da seqüência de aminoácidos deduzida foram previstos pelo
ExPASy Proteomics Server (http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html) e/ou confirmados com

77
dados da literatura. A predição da localização no cromossomo dos genes em estudo foi
realizada por meio das ferramentas de busca disponível no Phytozome.
Os iniciadores específicos utilizados para amplificação dos genes em estudo foram
obtidos na literatura e/ou desenhados a partir das seqüências obtidas nas buscas utilizando-se
o programa computacional Vector NTI. Os iniciadores utilizados estão descritos na Tabela 1.
Tabela 1. Genes avaliados na interação Manihot esculenta Crantz - Phytopythium sp. e seqüências dos
iniciadores utilizadas para amplifícação destes.
Nome do Nome do Tam*
Seqüência (5'- 3') Referência
Gene Iniciador (pb)
MeTub-F ATCCTTCTCAAGGGCAGCAAGAT Costa et al.
MeTUB
MeTub-R ACATGGAAAGTACATGGCCTGCTG 370 2012
MeCu/Z MeSOD -F1 GGCTTCATGGGTTCCACGTCCATG
313 Este estudo
nSOD MeSOD-Rl GCTACCCTGCCACCAGCATTTCCAG
MeLEA-F ATGGCTCGCTCTTTCTCAGACG Costa et al.
MeLEA3 285
MeLEA-R TTAATGCTTCTTCAACAGCATAGCCCT 2012
MeTCTP-E-Fl TGCATATGTTGCTATATCAGGATTTGCTTACCG Santa-Brígida
MeTCTP 504
MeTCTP-E-Rl TACTCGAGGCATTTGACCTCCTTCAGAGCAT etal, 2014
MeTub-F TCCTTCTCAAGGGCAGCAAGAT3 Reis et al..
MeRZF 370
MeTub-R ACATGGAAAGTACATGGCCTGCTG 2012
Meei ORF-F ATGGCTACTGCTGAGGTAGTAACAG de Souza et
Meei 534
Mec 1 ORF-R TTACTCAGTCTTCTCAGCTTCA al.. 2006
MebZIP-F2 GAATTGCTTTCAAATAGAGAGTCAGCTAGACG
MebZIP 396 Cardoso. 2008
BZ14 CGGACATAGGGTTATTTGGAGGCTGAT
MeCPI-Fl CGCCGCCGTAGGTTCTGCTG
MeCPI 294 Este estudo
Me CPI-RI TACCCTTGCACAGGGACAAACGATG
MeCHS-Fl TACTACTTTCGGATCACCAATAGTGAGCACA
MeCHS 455 Este estudo
Me CHS-RI GAGCACACAACAAGAACACGAGCACC
MePAL-Fl CATTTGACACAT AAATTGAAGCATCATCCTG
MePAL 388 Este estudo
MePAL-Rl: TAACAAGCTCAGAGAATTGAGCAAACATGAG
*Tamanlio esperado em pares de bases (pb)
4.2.3 Extração do RNA total e reação de RT-PCR semiquantitativa para detecção dos genes
de interesse.
A extração de RNA total de raízes inoculadas e do controle foram realizada de acordo
com a metodologia descrita por Jones et al. (1985), o material utilizado foi o cortex referentes
a região entre dois pontos de infecção. As amostras de RNA foram visualizadas em gel de
agarose contendo formaldeído, de acordo com Sambrook et al. (1989).
Os experimentos de reação da transcriptase reversa, seguida de reação em cadeia da
polimerase (RT-PCR) foram realizados de acordo com Reis et al. (2012). Inicialmente, 10 pg
do RNA total de cada amostra serão tratadas com DNAse I (Invitrogen- USA) e utilizadas na
síntese das moléculas de cDNA utilizando um iniciador dT e a enzima Transcriptase Reversa
(Invitrogen- USA). As amostras contendo o RNA total e cDNA foram quantificadas por
fluorimetria utilizando-se o flurímetro QUBIT (Invitrogen- USA).

78
Em seguida, 100 ng de cDNA provenientes de raízes de plantas infectadas e de plantas
não infectadas (controle negativo) foram utilizadas como template em ensaios de reação em
cadeia da polimerase (PCR) com iniciadores específicos para as seqüências de interesse. A
Tubulina foi utilizada como gene constitutivo, para a padronização da concentração de cDNA
utilizada para as outras amostras. As condições da PCR foram: um ciclo inicial de
desnaturação de 5 minutos a 94° C, seguido diferentes ciclos de 940C por 1 minuto, 550C por
1 minuto, 720C por 4 minutos. O número de ciclos da PCR foi estabelecido para os diferentes
genes utilizando a amostra controle.
O produto da PCR foi avaliado por eletroforese em gel de agarose 1% (P/V) corado
com brometo de etídio (Img/mL), visualizado na luz ultravioleta e fotografado. O programa
ImageJ 1.44p (National Institutos of Saúde, EUA) foi utilizado para avaliar a intensidade dos
produtos de RT-PCR. Está intensidade refere-se densitometria óptica de cada banda, contanto
cada microponto de tonalidade escura na foto. Em seguida, os dados quantitativos foram
submetidos à análise de variância e as diferenças estatísticas foram avaliadas pelo teste de
Tukey a nível de 1% de probabilidade.
4.3 Resultados e Discussão
4.3.1 Material vegetal e extração do RNA total de raízes de mandioca
Neste trabalho, buscamos identificar transcritos de mandioca expressos em resposta a
infecção por I^hylophyliiim sp. para elucidar a interação a nível transcricional. O material para
o estudo foi obtido a partir de amostras de raízes de mandioca destacadas do acesso Caxuianã
inoculadas e não inoculadas com Phytophytium sp. com 24, 48 e 72 horas após a inoculação
(hai). A podridão radicular foi observada em todos os tempos de avaliação nas raízes
inoculadas confirmando a patogenicidade do isolado utilizado neste trabalho. Os sintomas da
podridão radicular observados foram lesões na polpa que foram evoluindo com as hai. Não
foram observadas lesões nas raízes controle (Figura 1.).
A utilização de raízes de mandioca para inoculação é uma metodologia bastante
utilizada, porém os sintomas da deterioração fisiológica pós-colheita (Post-harvest
physiological delerioralion - PPD) podem ser confundidos com os sintomas típicos causados
pelos patógenos. Os resultados obtidos nas amostras com 24, 48 e 72 hai com e sem o
patógeno confirmam a ausência PPD nas raízes deste estudo, pois não se observa sintomas
como pontos escuros nas raízes nos tempos analisados (Figura 1.).
79
Figura 1. Raízes de Mandioca do acesso Caxuianã inoculadas com Phytopythium sp. com 24. 48 e 72 hai
comparadas com as raízes controle sem o patógeno. As setas indicam as regiões onde ocorreram as lesões.
24 h 48h 72h
o
u
a
o
U
o
■o
"a
w
o
a
Fonte: Este estudo
O RNA extraído das raízes inoculadas e do controle, em todos os tempos de
inoculação (24, 48, 72 horas), apresentou um padrão integro. A integridade do RNA foi
avaliada pela comparação da intensidade das bandas 28S:18S do RNA ribossômico (rRNA),
que indicou boa qualidade (Figura 2.).
Figura 2. Amostras de RNA total isoladas a partir de raízes de mandioca (Manihot esculenta Crantz). em (1)
amostras correspondentes ao Controle (não inoculadas) e em (2) amostras inoculadas com Phytophylium sp.. A
extração tanto para o controle quanto para o inoculado foi realizada com 24. 48 e 72 hai.
24 horas 48 horas 72 horas
1 2
18SI
MM«Í| jí *
Fonte: Este estudo
4.3.2. Caracterização dos genes a ser investigado.
A busca na literatura resultou em nove genes candidatos, todas as seqüências obtidas
foram avaliadas quanto à presença dos domínios conservados e à similaridade com proteínas
80
de estrutura resolvida depositadas nos bancos de dados confirmando assim a família a qual
pertence. Além disso, foram preditas informações destes, tais como número de acesso,
família, tamanho do gene em pares de base (pb), número de resíduos de aminoácidos (aa),
massa molecular (MM) e ponto isoelétrico (PI), e os resultados estão descritas na Tabela 2.
Tabela 2. Caracterização molecular dos genes candidatos. Número de acesso, família . tamanho do gene pares
de base (pb) Número de resíduos de aminoácidos (aa). massa molecular (MM) e ponto isoelétrico (PI).
Nome do gene Número de Família Tam. Tam. MM PI
Acesso (pb) (aa) (kDa)
Manes.08G1254
855 152 15.1 5.42
00
MeCu/ZnSOD Superoxido Dismutase [CU-ZN]
Manes.09G1604
1008 152 15.3 5.82
00
Abundantes na Embriogênese 664 94 10 9.66
MeLEA3 GR421259
Tardia tipo 3 (LEA-3)
Proteína de tumor controlada 812 168 19 4.53
MeTCTP JX855123
traducionalmente (TCTP)
MeRZF JN203495 Dedo de zinco- RING-H2 739 174 19.44 9.75
970 177 18.8 3.75

Meei AY101376 Proteína alergênica - Pt2L4
Manes.08G1345
MebZlP Ziper básico de leucina 1728 439 47 5.98
00.1
MeCPI DT883603 Fitocistatinas 528 111 12.1 9.52
XM 021753028 1503 389 42.4 6.17
MeCHS XM 021753697 Chalcona sintase 1553 395 43.3 6.18
XM 021771783 1634 391 42.8 6.08
AY036011 2253 710 77.5 6.03
MePAL XM 021755397 Fenilalanina amônio liase 2453 715 77.7 6.06
XM 021755398 2234 588 64.4 5.93
As plantas de mandioca são diploides (2n = 36 cromossomos), o sequenciamento de
genomas completos possibilitou a análise da localização exata dos genes nos cromossomos.
Através de buscas realizadas no Phytozome foi possível identificar que os nove genes
utilizados neste estudo mostraram-se distribuídos em dez dos dezoito cromossomos da
mandioca (Fig. 3). Possibilitando concluir que a maioria dos genes se encontram presentes
mais de uma vez no genoma da mandioca. Foi levado em consideração apenas os genes nos
quais os iniciadores eram capazes de amplificar, visto que estes genes possuem inúmeras
isoforma no genoma. Por exemplo, já foram identificadas duas isoformas de Superóxido
Dismutase tipo Cu/Zn em mandioca a primeira foi descrita por Lee et al. (1999) e
denominada mSODle a segunda descrita por Shin et al. (2005) e denominada mSOD2.
Diversos estudos demonstram que genes isolados de outras espécies vegetais estão
envolvidos tanto no estresse abiótico como no biótico, incluindo a resposta de defesa das
plantas contra os patógenos (REJEB et al., 2014; NATH et al., 2017). Os genes Mec 1,
81
MeLEA3, MeRZF, e MeTCTP descrito por De Souza et al., (2004) estão relacionado à
formação de raízes de armazenamento de mandioca e estudos posteriores demonstraram a
relação dos três últimos com estresse salino (COSTA et al., 2011; REIS et al., 2012; SANTA
BRÍGIDA et al., 2014).
Figura 3. Localização dos genes em estudo nos cromossomos da mandioca.
3 4 5 10 11 15
MePAL
— 10000000
Meei
— 25000000 MeCu/ZnSOD
- MeCu/ZnSOD
- MebZIP
Fonte: Este estudo
4.3.3 Reação de RT-PCR semiquantitativa para detecção dos genes de interesse.
Com os padrões de PCR utilizados foi possível observar uma banda única de 370 pb a
partir das amostras de cDNA de raiz de mandioca controle e inoculado nos diferentes tempos.
As concentrações foram ajustadas e os ensaios repetidos 5 vezes e as análises dos dados não
apresentou diferença significativa entre os tratamentos e tempos analisados.
Os ensaios para determinar número de ciclos a serem utilizados para analisar a
expressão dos genes foram realizados a partir da amostra controle, na Figura 3 estão os
resultados obtidos e o número de ciclos utilizados para cada um dos genes em estudo. Sendo
considerada a fase exponencial de amplificação, pois no método de RT-PCR semiquantitativo
a análise dos transcritos só é realizada após a etapa de amplificação em termociclador,
mediante a realização da eletroforese em gel de agarose. Dos dez genes analisados sete
demonstraram que com 31 ciclos ainda estavam na fase exponencial de amplificação e para os
outros três foram considerados 28 ciclos, pois estes já apresentavam sinais de saturação com
31 ciclos (Figura 4).
4.3.4 Genes relacionados na deterioração pós colheita e que se apresentam inalterados durante
este estudo.
82
Os resultados obtidos nos ensaios de RT-PCR semi quantitativos demostram que os
genes MeTCTP e Mec 1 não apresentaram diferença significativa na expressão nos tempos e
condições analisadas (Figura 5.) Este resultado confirma em nível molecular a a ausência PPD
nas raízes deste estudo. A nível molecular os genes MeTCTP e Meei tiveram sua atividade
reduzida em raízes de mandioca após a colheita (REILLY et al., 2007) validando a ausência
de sintomas da PPD, pois estes se mantiveram estáveis em todos os tempos avaliados, tanto
nas raízes infectadas com o Phytopythium sp. quanto naquelas sem o patógeno.
Figura 4. Padronização do número de ciclos utilizado para os diferentes genes em estudo. Gel de agarose mostrando
amplificação feita a partir de amostras de cDNA de raiz de mandioca usando os iniciadores para os genes descritos na
Tabela 1 com diferentes número de ciclos (25. 28. 31. 34 e 37) em triplicata.
Gel de agarose com os diferentes ciclos N0 de ciclos

Nome do Gene
25 28 31 34 37 utilizado
MeTUB 28
MeCu/ZnSOD 28
MeLEA3 » ' ■ 1 31
MeTCTP 31
MeRZF I I I 31
Meei 31
MebZlP 31
MeCPI 28
31
MePAL
31
MeCHS
Fonte: Este estudo
O gene MeTCTP codifica a proteína de tumor controlada traducionalmente (TCTP). A
proteína TCTP é altamente conservada em eucariotos, e está envolvida em vários processos
celulares, como morte celular programada, crescimento celular e proteção contra diversos
tipos de estresses (LI et al., 2013; SANTA BRÍGIDA et al., 2014; GUTÉRREZ-GALEANO
et al., 2014; WANG et al., 2015; de CARVALHO et al., 2017). O gene TCTP está
relacionado à resposta de varias plantas contra patógenos, como na resposta ao patógeno
I*seudomonas syringae (JONES et al., 2006), Piper luhercufalum à Fiisarinm solani f. sp.
piperis, causador da fusariose em Pimenteira-do-reino (NASCIMENTO et al., 2009), na
resposta de trigo a Erysiphe graminis, o agente causai de oídios nas folhas (LI et al., 2010).
83
Apesar de seu papel ser conhecido, não se tem dados sobre a atuação a nível molecular da
proteína TCTP.
Apesar do geneM?7ÜZP não apresentar alteração em ambos os tratamentos, ele é um
candidato para ser utilizado em programas de melhoramento que visem o combate a PPD
assim como o gene Meei que codifica a proteína Pt2L4, rica em ácido glutâmico e
diferencialmente expressa em raízes tuberosas de mandioca. A identificação e caracterização
da região promotora deste gene podem viabilizar estudos de plantas transgênicas resistentes a
patógenos e direcionar a expressão de genes de interesse para as raízes. Possibilitando no
futuro a obtenção de plantas de mandioca resistentes aos estresses bióticos e abióticos
(SOUZA et ai. 2006; 2009).
4.3.5 Genes relacionados na deterioração pos colheita e que apresenta expressão diferencial
em raízes destacadas inoculadas.
As cistatinas de plantas, também chamadas de fitocistatinas, são conhecidas por
possuir papel importante na resposta da planta a estresses bióticos e abióticos
(BENCHABANE et al., 2010; LIMA et al., 2015; ZUST E AGRAWA et al., 2017). Nas
análises das raízes com e sem patógeno uma fitocistatina de mandioca apresentou um
aumento da expressão foi significativamente maior nas plantas inoculadas com Phytophytium
sp. com 24 e 48 hai quando comparado com as plantas sem o patógeno, não houve diferença
significativa com 72 hai (Figura 5.). Fitocistatinas possuem potencial />? vivo e />? vitro de
controlar o crescimento de patógenos, no entanto não se sabe o papel desta na defesa da
planta, mas acredita-se que estas podem inibir proteases do patógeno (BENCHABANE et al.,
2010; LIMA et al., 2015).
Estudos tem demostrado o petencial das fitocistatinas na defesa da planta frente aos
ataque de patógenos. Plantas de tabaco superexpressando o gene TcCYS4, uma fitocistatina do
cacao, demonstraram uma redução significativa nas lesões necróticas causadas nas folhas de
tabaco inoculadas com o fungo Moniliophthora perniciosa (SANTANA et al., 2014), além
disso diversas fitocistatinas de plantas expressas em sistema bacteriano foram testadas />? vitro
contra fungos e oomicetos e demonstraram o potencial destas em controlar o crescimento de
fitopatógenos (LIMA et al., 2015).
A nível molecular uma cistatina da mandioca foi identificada em raízes após a colheita
(REILLY et al., 2007) e a expressão desta quando comparado com o controle foi reduzida. No
entanto, neste trabalho a expressão deste mesmo gene aumentou o que valida mais uma vez à
84
ausência de PPD neste estudo. Sugerindo que este gene possa estar envolvido na resposta a
deterioração pós-colheita e também na resposta ao ataque do patógeno.
2.3.6 Genes apresentam expressão diferencial durante este estudo e tem potencial para
participar dos mecanismos de defesa.
As proteínas abundantes na embriogênese tardia (LEA- late emhryogenesis ahundanl)
do grupo 3, são a- hélices anfipáticas e foram definidas como seqüestradoras de íons
concentrados e proteção da estrutura de proteínas e membranas durante a desidratação
(COSTA et al., 2011; LIU et al., 2013). Diversos estudos tem demonstrado o papel das
proteínas LEA no estresse abiótico, no entanto são poucos os estudos que relatam o papel
deste no estresse biótico. O gene MeLEA3 foi identificado na mandioca e codifica uma
proteína LEA do grupo 3 e teve sua expressão aumentada em folhas de mandioca destacadas
tratadas com NaCl (COSTA et al., 2011).
O gene ZmLEA3, codifica uma proteína LEA do grupo 3 em milho, e quando este foi
expressa em tabaco transgênico aumentou significativamente a reação de hipersensibilidade
desencadeada Pseudomonas syringae e também aumentou a expressão de PRla, PR2 e PR4
quando comparado com o tipo selvagem (LRJ et al., 2013). No presente estudo, o gene
MeLEA3 demonstrou uma aumento significativo na expressão nas raízes inoculadas com
Phytophytium em comparação com o controle 48 hai (Figura 5.), no entanto não é possível
inferir o seu papel.
Os fatores de transcrição regulam expressão gênica são usualmente definidos como
proteínas contendo domínio de ligação, conhecidos como DNA-Binding domain que
reconhecem seqüências específicas de DNA. Os fatores de transcrição podem ser agrupados
em diferentes classes ou famílias onde apresentam estruturas relacionadas e estes
desempenham papel importante durante a defesa vegetal (MITSEIDA e OHME-TAKAGI,
2009; ALVES et al., 2013; FRANCO-ZORRILLA et al, 2014 ).
Os genes MebZIP e MeRZF apresentaram sua expressão aumentada 48 hai em
comparação as raízes controle, no entanto com 24 e 72 hai a expressão do controle foi
significativamente superior ao inoculado (Figura 5.), padrão de expressão esperado para uma
proteína reguladora, que geralmente são expressas nas primeiras horas de infecção antes dos
seus genes alvos (FRANCO-ZORRILLA et al., 2014).
A predição da estrutura tridimensional da proteína MeRZF revela um motivo RING
z/fic finger na sua região C-terminal e um resíduo de histidina no quinto sítio do domínio,
85
sugerindo assim que faz parte do subgrupo RING-H2 e o gene MeRZF teve sua expressão
aumentada em folhas de mandioca destacadas tratadas com NaCl (REIS et al., 2012). Em
arroz foi identificado o gene OsBIRFl, que codifica uma proteína do subgrupo RING-H2, as
plantas de tabaco expressando este gene apresentam resistência contra o vírus do mosaico do
tabaco e Pseudomonas syringae e níveis de expressão elevados de genes relacionados à
defesa, por exemplo as proteínas relacionadas a patogênese - PR-1, PR-2, PR-3 e PR-5 (LRJ
et a/., 2008). O aumento da expressão do gene MeRZF nos fornece indícios da participação
das proteínas codificadas na resposta da mandioca ao estresse biótico causado por
Phytophythim sp..
Nas plantas, os zíper de leucina básico (bZIP - basic leucine zipper) são reguladores
de muitos processos fisiológicos e de desenvolvimento, incluindo morfogênese, formação de
sementes e respostas de estresse abiótico e biótico (ALVES et a/., 2013). Cardoso (2008)
isolou uma seqüência de cDNA que codifica para uma proteína do tipo bZIP de mandioca,
denominada MebZIP, que apresenta significativa identidade com proteínas bZIP de outras
espécies vegetais, entre elas a G/HBF-1 de soja, a BZI-1 de fumo e a CPRF-2 de salsa. A
presença dessas regiões indica que o MebZIP é um fator de transcrição relacionado ao CPRF-
2 e esta pode desempenhar um papel na expressão do gene da chalcona sintase (CHS), pois
esta relação já foi demostrada para outras bZIPs (YOSHIDA et al., 2008).
Em plantas de Arabdopsis sob o ataque de patógenos ocorre o aumento de espécies
reativas de oxigênio (reactive oxygen species- ROS). Essas ROS promovem a mudança
conformacional da proteína reguladora NPR1, relacionada à resposta de defesa em plantas via
ácido salicílico, e essa mudança promove a translocação da proteína para o núcleo através de
proteínas de poro nuclear, onde a NPR1 interage com membros da família TGA (bZIP) se
ligando posteriormente à regiões promotoras de genes relacionados a indução de defesa
(PIETERSE et al., 2012). Demonstrando assim que a Proteína MebZIP pode desempenhar
papel semelhante na indução de defesa da mandioca em resposta a Phytopythium sp.
O Gene MeCu/ZnSOD apresentou expressão up-regulaíed 48 e 72 hai as raízes serem
inoculadas com Phytophytium sp. em comparação com o controle, com 24 hai não se observa
diferença (Figura 5.). Plantas sob ataque de patógenos respondem de forma rápida com uma
"explosão oxidativa", que constituem na produção de ROS principalmente ânion superóxido
(Oi") e peróxido de hidrogênio (H2O2) e o acúmulo destes é toxico para a planta (HU et al.,
2009; LÓPEZ- CRUZ et al., 2017).
A superóxido dismutase (SOD) pertence a uma família de enzimas que neutralizam os
efeitos de ROS ao catalisar a conversão ânion superóxido (O2) em peróxido de hidrogênio

86
(H2O2), esta mudanças no equilíbrio de ROS é importante para ativar a respostas de defesa da
planta (LÓPEZ- CRUZ et al., 2017). Este aumento na expressão de MeCu/ZnSOl) após 48 hai
pode estar relacionado a necessidade da planta decompor ânions superóxidos em peróxido de
hidrogênio durante a explosão oxidativa que ocorre nas primeiras horas de infecção, causando
assim um mudança no equilíbrio de ROS e ativando o sistema de defesa, o que torna este gene
um candidato a programas de melhoramento.
Após a planta reconhecer o patógeno inicia-se o processo de defesa, dentre estes
processos ocorre a síntese de barreiras físicas, aumento da lignificação da parede celular e a
síntese de compostos fenólicos secundários de defesa, dentre os quais se destacam as enzimas
fenilalanina amômia-liase (PAL) e Chalcona sintase (CHS), estes desempenham um
importante papel na defesa vegetal (DAO et al., 2011; CASS et al., 2015). Neste estudo foi
possível observar que os genes MePAL e MeCHS foram diferencialmente expressos nas
plantas inoculadas comparadas com as plantas controle 48 hai, não apresentando expressão
com 72 horas, demonstrando que estes genes estão possivelmente envolvidos nos mecanismos
de defesa da planta nas primeiras horas de infecção (Figura 5.). A cinética do mRNA de PAL
induzido pelo elicitor é bastante relacionada à observada para o mRNA de CHS.
Estes genes apresentaram diferenças na expressão gênico com 24 horas, sendo que
para & MePAL os níveis de expressão no material inoculado foi significativamente maior que
nas plantas controle (Figura 5.). Por outro lado a expressão do gene MeCHS foi
significativamente maior no controle do que no material inoculado. A produção destas
enzimas é controlada durante o crescimento vegetal, mas também é induzida em células
vizinhas ao local de infecção por vários estímulos ambientais, como infecção, ferimentos,
contaminação por metais pesados, luz e reguladores de crescimento (RAHMAN e PUNJA,
2005; DAO et al., 2011; DEHGHAN et al., 2014; CASS et al., 2015) . Esta presença no
material sem o patógeno com 24 hai pode ser devido à indução pelo ferimento realizado nas
raízes.
Os resultados obtidos com os padrões diferenciais de expressão gênica em raízes de
mandioca inoculadas com o agente causador da podridão radicular irão contribuir para o
entendimento da interação Mandioca - Phytopythium sp. sendo estes os primeiros dados
moleculares do mecanismo de resposta da mandioca a estresse biótico.

88
Figura 5. Quantificação do inRNA dos genes em estudo. O gráfico refere-se a quantificação relativa do gene em
estudo comparado com o controle interno (tubulina). as imagens referem-se a géis de agarose 1% corados com
brometo de etídeo. Os resultados referem-se ao controle (sem patógeno) estão representados em azul e os em
vermelho claro referem-se ao material inoculado (com patógeno) nos diferentes tempos coletados 24. 48 e 72
hai.
MeTCTP Meei MebZIP
1.4 a a a a aa a a 1.4
a
1.2 i.2a
1.2
i
0.8
0.6 0.6 0.6
0.4 0.4 0.4
0.2 0.2 0.2
0
24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h
MeTUB MeTUB MeTUB
MeTCTP Meei MebZIP
24h . 48h . 72h . 24h . 48h . 72h 24h . 48h . 72h
MeRZF MeCu/ZnSOD MeLEA3

1.4 1.4
1.2 b b 1.2
1.2
0.6 0.6
0.4 0.4 0.4
0.2 0.2 0.2
24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h
MeTUB MeTUB MeTUB
MeRZF MeCu/Zn Mel. EA 3
SOD
. 24h LA2h . 72h , 24h , 48h . 72h . 24h , 48h , 72h
MeCPI MeCHS MePAL

1.4 1.4 1.4
1.2 1.2 1.2
0.6 0.6 0.6

0.4 0.4 0.4
0.2 0.2 0.2
24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h
MeTUB MeTUB MeTUB
MeCPI MeCHS MePAL
24h , 48h , 72h . 24h . 48h . 72 h 24h . 48h . 72h
Fonte: Este estudo.

89
2.4 Conclusões
Os resultados obtidos neste trabalho nos permite concluir que:
- Foi possível realizar a inoculação de tecidos destacados de mandioca e a partir deste
extrair RNA de qualidade e quantidade para estudar os genes a nível molecular.
- A ausência da PPD foi confirmada molecularmente e visualmente, confirmando que o
método foi eficiente e nos permitiu avaliar a expressão diferencial dos genes em
resposta ao patógeno.
- Dos nove genes identificados sete tem potencial para contribuir no melhoramento
genético de mandioca para no futuro se obter acessos resistentes.
- Dentre os genes analisados destacam-se o gene que codifica uma cistatina de
mandioca (M?CPI), que além de mostrar-se envolvidos na resposta negativa a PPD
também mostrou-se favorável na resposta ao patógeno e os genes que codificam as
enzimas Chalcona sintase (MeCHS) e Fenilalanina amônia-liase (PAL) pois estas
apresentam expressão diferencial no tecido inoculado com 48 e 72 hai comparado com
o controle.
90
Referências
ALVES, M. S.; DADALTO, S. P.; GONÇALVES, A. B.; DE SOUZA, G. B.;

BARROS, V. A.; FIETTO, L. G. Plant bZIP transcription factors responsive to
pathogens: a review. International journal of molecular sciences, v. 1, n.4, p. 7815-
7828, 2013.
ANDRÉ, T.B.; SANTOS, A.C. Uso de produtos da cultura da mandioca (Manihot) na

produção animal. Enciclopédia Biosfera, v.8, n.15, p.1622-1647, 2012.
BENCHABANE, M.; SCHLÜTER, U.; VORSTER, L; GOULET, M. C.; MICHAUD,

D. Plant cystatins. Biochimie, v. 92, n. 11, p. 1657-1666, 2010.
CASS, C. L; PERALDI, A.; DOWD, P. F.; MOTTIAR, Y.; SANTORO, N.; KARLEN,
S. D.; MOSKVIN, O. V. Effects of PHENYLALANINE AMMONIA LYASE (PAL)
knockdown on cell wall composition, biomass digestibility, and biotic and abiotic stress
responses in Brachypodium. Journal of experimental botany, v. 66, n. 14, p. 4317-
4335,2015.
COSTA, C. N.M.; SANTA-BRÍGIDA, A. B.; BORGES, B. N.; MENEZES-NETO, M.

A.; CARVALHO, L. J. C. B.; DE SOUZA C. R. B. Leveis of MeLEA3, a cDNA
sequence coding for an atypical late embryogenesis abundant protein in cassava,
increase under in vitro salt stress treatment. Plant Molecular Biology Report, v. 29, p.
997-1005,2011.
DALIO R. J. D. Deciphering mechanísms of pathogenicity and resistance ínductíon

in the interaction between Phytophthora spp. and European beech (Fagus sylvatica
L.). Ph.D. Thesis. Technische Universitaet Muenchen (TUM), Freising, Germany.
2013, 188p.
DALIO, R. L; FLEISCHMANN, F.; HUMEZ, M. & OSSWALD, W. Phosphite

protects Fagus sylvatica seedlings towards Phytophthora plurivora via local toxicity,
priming and facilitation of pathogen recognition. Pios One, v. 9, n.l,
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0087860, 2014.
DAO, T. T. H.; LINTHORST, H. J. M.; VERPOORTE, R. Chalcone synthase and its

functions in plant resistance. Pbytochemistry Reviews, v.10, n. 3, p. 397-412, 2011.
DE CARVALHO, M.; AGENCIO, M. U; LAITZ, A. V. N.; DE ARAÚJO, L. M.;

ARCURI, M. D. L. C.; DO NASCIMENTO, L. C.; MAIA, I. G. Impacts of the
overexpression of a tomato translationally controlled tumor protein (TCTP) in tobacco
revealed by phenotypic and transcriptomic analysis. Plant Cell Reports, v. 36, n. 6, p.
887-900, 2017.
DE SOUZA, C. R.; CARVALHO, L. J.; DE ALMEIDA, E. R.; GANDER, E. S. A

cDNA sequence coding for a glutamic acid-rich protein is differentially expressed in
cassava storage roots. Protein Peptide Letters, v.13, p. 653-657, 2006.
DE SOUZA, C. R.; ARAGÃO, F. J.; MOREIRA, E. C.; COSTA, C. N.;

NASCIMENTO, S. B.; CARVALHO, L. J. Isolation and characterization of the
91
promoter sequence of a cassava gene coding for Pt2L4, a glutamic acid-rich protein
differentially expressed in storage roots. Genetics and molecular research v. 8, p.
334-344, 2009.
DE SOUZA, C. R. B.; CARVALHO, L. J. C. B.; CASCARDO, J. C. M. Comparative

gene expression study to identify genes possibly related to storage root formation in
cassava. Protein Peptide Letters V. 11, p. 577-582, 2004.
DEHGHAN, S.; SADEGHI, M.; PÔPPEL, A.; FISCHER, R.; LAKES-HARLAN, R.;
KAVOUSI, H. R.; RAHNAMAEIAN, M. Differential inductions of phenylalanine
aininonia-lyase and chalcone synthase during wounding, salicylic acid treatment, and
salinity stress in safflower, Carlhamus tinctorius. Bíoscíence reports, v.34, n.3, doi
10.1042/BSR20140026, 2014.
FRAIRE-VELÁZQUEZ, S.; RODRÍGUEZ-GUERRA, R.; SÁNCHEZ-CALDERÓN,

L. Abiotic and Biotic Stress Response Crosstalk. In Plants-Physiological,
Biochemical and Genetic Perspectives; In Shanker, A., Ed.; InTech Open Access
Company: Rijeka, Croatia, 2011; pp. 1-26.
FRANCO-ZORRILLA, J. M.; LÓPEZ-VIDRIERO, I.; CARRASCO, J. L.; GODOY,

M.; VERA, P.; SOLANO, R. DNA-binding specificities of plant transcription factors
and their potential to define target genes. Proceedings of the National Academy of
Sciences, v. 111, n. 6, p. 2367-2372, 2014.
GASSMANN, W.; APPEL, H. M.,; OLIVER, M. J. The interface between abiotic and
biotic stress responses. Journal of experimental botany, v. 67, n. 7, p. 2023-2024,
2016.
GUTIÉRREZ-GALEANO, D. F.; TOSCANO-MORALES, R.; CALDERÓN-PÉREZ,

B.; XOCONOSTLE-CÁZARES, B.; RUIZ-MEDRANO R Structural divergence of
plant TCTPs. Frontiers Plant Science, v. 5, n. 361, doi: 10.3389/fpls.2014.00361,
2014.
HU, Z.; SHEN, Y.; SHEN, F.; SU, X. Effects of feeding Cl os lera anachoreta on
hydrogen peroxide accumulation and activities of peroxidase, catalase, and ascorbate
peroxidase in Populus simonii x P. pyramidalis 'Opera 8277' leaves. Acta Pbysiologiae
Plantarum, v. 31, p. 995-1002, 2009.
JONES, J. D. G; DUNSUMUIR, P.; BEDBROOK, J.; High levei expression of

introduced chimaeric genes in regenerated transformed plants. EMBO Journal, v. 4, p.
2411-2418,1985.
JONES, A. M., THOMAS, V., BENNETT, M. H., MANSFIELD, J., & GRANI, M.
Modifications to the Arabidopsis defense proteome occur prior to significant
transcriptional change in response to inoculation with Pseudomonas syringae. Plant
pbysiology, v. 142, n. 4, p. 1603-1620, 2006.
LEE, H. S.; KIM, K.Y.; YOU, S. H.; KWON, S. Y.; KWAK, S. S. Molecular
characterization and expression of a cDNA encoding copper/zinc superoxide dismutase
92
from cultured cells of cassava (Manihot esculenta Crantz), Molecular Genonic

Genetic, v. 262, p. 807-814, 1999.
LI, G.; LIU, X.; LI, X.; WANG, Z. Cloning of a TCTP gene in wheat and its expression
induced by Erysiphe graminis. Bulletin of Botanícal Research, v. 30, n. 4, p. 441-447.
2010.
LI, D.; DENG, Z.; LIU, X.; QIN, B. Molecular cloning, expression profiles and
characterization of a novel translationally controlled tumor protein in rubber tree (Hevea
brasiliensis). Journal of Plant Physiology, v. 170, p. 497-504, 2013.
LIMA, A. M.; REIS, S. P.; DE SOUZA, C. R. Phytocystatins and their potential to

control plant diseases caused by fungi. Protein Peptide Letters, v. 22, n. 2, p. 104-111,
2015.
LIU, H.; ZHANG, H.; YANG, Y.; LI, G; YANG, Y.; WANG, X. E.; SONG, F.
Functional analysis reveals pleiotropic effects of rice RING-H2 finger protein gene
OsBIRFl on regulation of growth and defense responses against abiotic and biotic
stresses. Plant molecular biology, v. 68, n.1-2, p. 17-30, 2008.
LIU, Y.; WANG, U; XING, X.; SUN, U; PAN, L; KONG, X.; LI, D. ZmLEA3, a
multifunctional group 3 LEA protein from maize (Zea mays L.), is involved in biotic
and abiotic stresses. Plant and cell physiology, v. 54, n. 6, p. 944-959, 2013.
LÓPEZ-CRUZ, L; ÓSCAR, C. S.; EMMA, F. C.; PILAR, G. A.; CARMEN, G. B.

Absence of Cu-Zn superoxide dismutase BCSOD1 reduces Botrytis cinerea virulence
in Arabidopsis and tomato plants, revealing interplay among reactive oxygen species,
callose and signalling pathways. Molecular plant pathology, v. 18, n. 1, p. 16-31,
2017.
MITSUDA N.; OHME-TAKAGI M.; Functional Analysis of Transcription Factors in

Arabidopsis. Plant e Cell Physiology, v.50, n.7, p. 1232-1248, 2009.
NATH, M.; BHATT, D.; PRASAD, R.; TUTEJA, N. Reactive Oxygen Species (ROS)
Metabolism and Signaling in Plant-Mycorrhizal Association Under Biotic and
Abiotic Stress Conditions. In: Mycorrhiza-Eco-Physiology, Secondary Metabolites,
Nanomaterials. Springer, Cham, 2017, p. 223-232.
NASCIMENTO, S. B.; CASCARDO, J. C. M.; MENEZES, I. C.; DUARTE, M. L. R.;

HARADA, M. U; DARNET, S ; DE SOUZA, C. R. B. Identifying Sequences
Potentially Related to Resistance Response of Piper tuherculatum to Fusarium solani f.
sp. piperis by Suppression Subtractive Hybridization. Protein Peptide Letters, v. 12,
p.1429-1434, 2009.
NOTARO, K.A.; MEDEIROS, E.V.; SILVA, C. A.D.; BARROS, J. A. Prospecção de

fitopatógenos associados à podridão radicular da mandioca em Pernambuco, Brasil.
Bioscience Journal, v.5, p.1832-1839, 2013.
93
OLIVEIRA, S. A. S. DE; HOHENFELD, C. S.; SANTOS, V. DA S.; HADDAD, F.;

OLIVEIRA, E. J. Resistance to fusarium dry root rot disease in cassava accessions.
Pesquisa Agropecuária brasileira, v. 48, n. 10, p. 1414-1417, 2013.
ONYEKA, T. L; DIXON, A. G. O.; AND EKPO, E. J. A. Assessment of laboratory

methods for evaluating cassava genotypes for resistance to root rot disease.
Mycopathologia, v. 159, p. 461-467, 2005.
PIETERSE, C. M. L; VAN DER DOES, D.; ZAMIOUDIS, C.; LEON-REYES, A.;

VAN WEES, S. C. M. Hormonal modulation of plant immunity. Annual Review of
Cell and Developmental Biology, v. 28, p. 489-521, 2012.
RAHMAN, M.; PUNIA, Z. K. Biochemistry of ginseng root tissues affected by rusty

root symptoms. Plant Physiology and Biochemistry, v. 43, p. 1102-1114, 2005.
REILLY, K.; HAN, Y.; TOHME, L; BEECHING, J. R. Isolation and characterisation of

a cassava catalase expressed during post-harvest physiological
deterioration. Bíochímíca et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and
Expression, v. 1518, n. 3, p. 317-323, 2001.
REILLY, K.; BERNAL, D.; CORTÊS, D. F.; GÓMEZ-VÁSQUEZ, R.; TOHME, L;

BEECHING, J. R. Towards identifying the full set of genes expressed during cassava
post-harvest physiological deterioration. Plant Molecular Biology, v. 64, p. 187-203,
2007.
REIS, S.P.; TAVARES, L. S.C.; COSTA, C. N. M.; SANTA-BRIGIDA, A. B.; de

SOUZA, C. R. B. Molecular cloning and characterization of a novel RING zinc-finger
protein gene up-regulated under in vitro salt stress in cassava. Molecular Biology
Reports, v. 39, p. 6513-6519, 2012.
REJEB, I. B.; PASTOR, V.; MAUCH-MANI, B. Plant responses to simultaneous biotic

and abiotic stress: molecular mechanisms. Plants, v.3, n. 4, p. 458-475, 2014.
SAMBROOK, L; FRITSCH, E. F.; MANIATIS, T. Molecular Cloning: A

Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, New York. 1989
SANTA ERIGIDA, A. B.; REIS, S. P.; COSTA, C. N. M.; CARDOSO, C. M.; LIMA,
A. M. DE SOUZA C.R.B. Molecular cloning and characterization of a cassava
translationally controlled tumor protein gene potentially related to salt stress response.
Molecular Biology Report. v. 41, p. 1787-1797, 2014.
SANTANA, L. S.; COSTA, M.; PIROVANI, N. M.; ALMEIDA, A. F.; AL VIM, F. C.;
PIROVANI, C. P. TcCYS4, a cystatin firom cocoa, reduces necrosis triggered by
MpNEP2 in tobacco plants. Genetic Molecular Researh, v.13, n. 3, p. 7636-48, 2014.
SENTHIL, M.; NATH, V.S; LAJAPATHYJEEVA, M.; HEGDE, V.M; MISRA, R S. In

vitro standardisation of resistance screening methods in cassava against tuber rot
disease. Archives of Phytopathology and Plant Protection, v. 46, p. 1255-1261, 2013.
94
SHIN, S. Y.; LEE, H. S.; KWON, S. Y.; KWON, S. T.; KWAK, S. S. Molecular
characterization of a cDNA encoding copper/zinc superoxide dismutase from cultured
cells of Manihot esculenta. Plant physiology and biochemistry, v. 43, n.l, p. 55-60,
2005.
SUZUKI, N.; RIVERO, R. M.; SHULAEV, V.; BLUMWALD, E.; MITTLER, R.

Abiotic and biotic stress combinations. New Phytologist, v. 203, n. 1, p. 32-43, 2014.
WANG, Z. Q.; LI, G.Z.; GONG, Q.Q.; LI, G. X.; ZHENG, S. J. OsTCTP, encoding a
translationally controlled tumor protein, plays an important role in mercury tolerance in
rice. BMC Plant Biology, v. 15, doi: 10.1186/sl2870-015-0500-y, 2015.
VENTURINI, M. T.; DA SILVA SANTOS, V.; DE OLIVEIRA, E. J. Procedimentos

para avaliar a tolerância de genótipos de mandioca à deterioração fisiológica
pós-colheita. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 50, p. 562-570, 2015.
VIEIRA, E.A.; FIALHO, J. F.; FALEIRO, F.G.; BELLON, G. SILVA, MS.

Caracterização molecular de acessos de mandioca biofortificados com potencial de uso
no melhoramento genético. Revista Ciência Agronômica, v. 42, p. 457-463, 2011.
VILAS BOAS, S.A.; HOHENFELD, C.S.; OLIVEIRA, S.A.S.; SANTOS, V.S.;

OLIVEIRA, E.J. Sources of resistence to cassava root rot caused by Fusarium spp.: a
genotyoic approach. Euphytica, v. 209, p. 237-251, 2016.
ZUST, T.; AGRAWAL, A. A. Trade-Offs Between Plant Growth and Defense Against
Insect Herbivory: An Emerging Mechanistic Synthesis. Annual Review of Plant
Biology, v. 68, p. 513-534, 2017.
95
Capítulo V
PHYTOCYSTATINS AND THEIR POTENCIAL TO CONTROL PLANT

DISEASES CAUSED BY FUNGI
Artigo publicado
96
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104 Protein ã Peptide Letters, 2015,22, 104-111
Phytocystatins and their Potential to Control Plant Diseases Caused by

Fungi
Aline M. Lima1'2, Sávio P. dos Reis1'3 and Cláudia R.B. de Souza1'*
'instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará, Belém, PA, 66075-110, Brazil 'Programa
de Pós-Graduação em Agronomia, Universidade Federal Rural da Amazônia, Belém, PA, 66077-530, Brazil
Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Pará, Belém, PA,
66075-110, Brazil
Abstract: Plant cystatins, also called phytocystatins, constituis a famiiy of spccific cysteine protease inhibi-
tors found in severa] monocots and dicots, where they can be invoived in the regulation of severa! endogenous
processes and in defense against pests and pathogens, as well as in response to abiotic stress. In this mini-review we aimed
to present isolated and characterized phytocystatins with potential use in control of plant disease causcd by fungi.
Keywords: Cysteine protease inhibitors, phytopathogenic fungi, plant cystatin, plant disease, plant-pathogen interaction,
#
Author profile: Cláudia Regina Batista de Souza is a professor at the Universidade Federal do Pará, Brazil. since 2003, where
she works with proteins expressed in plants in response to abiotic and biotc stress, including phytocystatins from biack pepper.
protease inhibitor with the catalytic site of largel protease by

INTRODUCTION competition with substrate [8, 9], Maintenance of equilib-
Proteases are enzymes that catalyze the hydrolytic cleav- rium between free cysteine proteases and their complexes
age of peptide bonds, and they are classified according to with inhibitors is necessary for adequate functioning of ali
their catalytic sites into: serine-, threonine-, aspartic-, met- living systems. In Fig. 1 the molecular modcling of the inter-
allo-, and cysteine proteases [1], Proteases are also classified action between cathepsin B HvPap-19, a cysteine protease,
in evolulionary families and clans in the MEROPS database and its inhibitor from barley, is shown as reported by
[2]. Martinez et al. 19],
Cysteine proteases are proteins showing molecular rnass Cysteine protease inhibitors are grouped into the cystatin
about 21-30 kDa with proteolytic activity conferred by the superfamily, which ineludes animal cystatins (stefins, cystat-
presence of a cysteine residue in their active site that acts as ins and kininogens) ["101 nnd plant cystatins, also called phy-
a nucleophile in the first step of proteolysis [3]. These prote- tocystatins [11], Phytocystatins have been identified in sev-
ases are found in a large variety of organisms, such as virus, eral monocots and dicots, where they can be invoived in the
prokaryotes and plants [4], where they are invoived in many regulation of several endogenous processes and in defense
physiological processes requiring metabolic degradation of against pests and pathogens, as well as response to abiotic
peptides and proteins. stress [12, 13],
The papain farnily constitutes the best characterized fam- In the last 15 years significant advances on Identification
iiy of cysteine proteases and contains pcptidases, which are of phytocystatins showing potential to control phyto-
stmcturally related to papain, isolated from Carica papaya pathogenic fungi were obtained. Despite some literature
and the first cysteine protease with its structure identified available on phytocystatins, most of them are focused in
[5], Another cysteine protease famiiy is the legumain famiiy their application in control of insects and pests. On the other
constituted by Asn-specific cysteine proteases found in ani- hand, phytopathogenic fungi are one of the most important
mais and plants able to cleave the asparaginy! bounds [6, 7J. biotic factors affecting the agriculture in the world. There-
fore, in this mini-review we aimed to present isolated and
The activity of cysteine proteases in the cell can be regu- characterized phytocystatins with potential use in control of
lated at transcriptional levei, by the rate of protease synthesis
plant disease caused by fungi.
and degradation, as well as by their specific inhibitors,
known as cysteine protease inhibitors or cystatins. Inhibition
process involves specific and reversible interaction of MAIN FE ATURES OF PHYTOCYSTATINS
Phytocystatins (PhyCys) constitute a famiiy of specific
*Address coirespnndence to this author at the Instituto de Ciências Biológi- cysteine protease inhibitors found only in plants, comprising
cas, Universidade Federal do Pará, Belém, PA, 66075-110. Brazil; more than 80 members [14].
Tel/Fax: 55 91 320 17585: E-mail: bsouza@ufpa.br
1875-5305/15 $58.0n+.00 ® 2015 Benthani Science Publishers

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Phytocystatins and their Potential to Contrai Plant Diseases Protein & Peptide Leíten, 2015, Vol. 22, No. 2 105
LY36 LNITo TRPT09

LY8Z
Si SER81
Figure 1. Molecular modeling of interaction between the cathepsin B HvPap-19 (pink) and the cystatin HvCPI-6 (yellow) frorn barley.
Amino aeids residues involved in lhe calalytic site of proíease are colored in blue, while residues related (o lhe protease inhibilory activity of
cystatin are in green. (A) Whole protease-cystatin interaction model. (B) Details ofthe predicted region of interaction between protease and
cystatin. Note: This figure has been previously published in Physiologia Plantamm (145:85-94, 2012) and was kindly provided by Dr Isabel
Diaz from the Universidad Politécnica de Madri, with pennission of John Wiley and Sons (License number: 2936571224920).
The first identified and also the better characterized Phy- their number of amino acid residues and molecular weights
Cys were the oryzacystatin I [15] and oryzacystatin II [16], are shown in Table 1.
proteins considered important to regulation of storage protein One of the main features of PhyCys, is that these proteins
during developing and germinating of rice seeds. Since then,
contain neithev sulfite bridges nor putative site of glycosyla-
many other PhyCys have been isolated and characterized tion. In addition to the three motifs common to ali cystatins
from different crops, such as cowpea [17], potato [18], corn (a conserved amino-terminal glycine residue, a highly con-
[19], soybean [20, 21], cabbage [22], carrot [23], Pearl Millet
served QXVXG motif in the central loop region and a P/AW
[24], wheat [25], apple [26], pineapple [27], kiwifruit [28], near the carboxy-terminal) ali PhyCys contain an amino-
strawberry [29], cacao [30], and látex tree [31], terminal conserved motif [LVI1-[AGT]-[RKE]-[FY1-[AS]-
Studies have showed that PhyCys may be involved in [VI]-X-IEDQV]-[HYFQ]-N, also known as LARFAV-like
many physiological process, including programmed cell motif (Fig. 2) that comprises the a-helix in the cystatin struc-
death [32], fruit development [33, 34], developing and ger- ture [55, 59-61]. Studies have showed that lhe three motifs
minating seeds [15, 21, 35-39], and defense against biotic common to ali cystatins are important to their functional
and abiotic stress [24, 30. 36, 40-53]. The Arabidopsis ge- roles and ability of interaction with their target-proteases,
nome encodes for seven PhyCys isoforms, named AtCYI to since changes in specific amino acid residues have decreased
AtCYS7, comprising two distantly related gene clusters [54]; drastically their inhibilory activity [45], Also, in pineapple a
among them AtCYS3 and AtCYS6 are involved in resistance cystatin containing an extended amino-terminal trunk of 63
to salt and drought stresses, as well as oxidative and cold residues rich in alanine and glutamate important to its inhibi-
stresses [55]. lory activity was identified [34], Furthermore, some PhyCys
The PhyCys have been grouped according to lhe presence may contain an amino-terminal signal peptide (Fig. 2) for
of consetved domains and their molecular weight. The transport inlo the lumen of the endoplasmic reticulum [29,
group-1 represent the most PhyCys und is constituted by 30, 47],
proteins containing only 1 cystatin domain wilh about 100 The main targets of PhyCys are the papain-like proteases;
residues and molecular weight ranging between 12 and 16 however group-2 PhyCys showing an extended region at
kDa, such as those found in chestnut and sugarcane [41, 44], carboxy-terminal contain the motif SNSL, which has been
The groiip-2 is constituted by PhyCys showing a highly con- involved in the inhibition of legumain-üke proteases [6]. In
served cystatin domain at the amino-terminal and an ex- addition, a recent study reported by Chu et al. [61] showed
tended cystatin-like domain at the carboxy-terminal, and a that the inhibition tole of the conserved amino-terminal cys-
molecular weight about 23 kDa [21, 29, 30, 47]. The group-3 tatin domain of tarocystatin, a group-2 phytocystatin isolated
is constituted by proteins with high molecular weight, such from corn of taro (Colocasia esculenta), might be increased
as the 86 kDa phytocystatin expressed in potato tuber, also by its carboxy-terminal cystatin-like extension during inter-
known as a multicystatin, since this protein contains eight action with the papain. In Fig. 2 the alignment between Phy-
cystatin-like domains [18]. Some examples of PhyCys with
98
106 Prolein <E Peptide Lellers, 2015, Vol. 22, No. 2 Lima etal.
Tablc 1, Number ot amino acid (aa) residues and theoretical molecular wcight (Mw) of PhyCys.
Organism Protein na me l,engih (aal Mw (kl)at Referentes

Fragaria ananassa Fa-CPI-l 235 23.1* [29]
Amaranthus hypochondriacus AhCPl 247 28* [47]
TcCYS-1 185 21.5*
Tkeobroma cacao TcCYS-2 127 14.1 1301
TcCYS-3 100 11.6*
TcCYS-4 205 22.8
Castanea saliva ND** 102 1 1.4 [41]
Colocaria esculenta CeCPl 205 29 [56]
Saccharum officittanwi Canecystatin 106 11.9 |44J
Solamtm tuberosum Potato multicystatin 756 86.8 [18]
Glycine max Soyacystatin 245 26 [2IJ
Triticum aestivum L. cv. Chihoku mTaMDCl 243 23* 157J
Dianthus caryophyllus L. cv. Reiko rDC-CPIn 98 10.8 [58J
Hordeum vulgare HvCPI-1 107 11.8 136]
Actinidia deliciosa KCPI-1 116 n 128]
Sesamum indicam SiCYS 199 22 [53]
* Prcdicted signal peptides were nol indudcd in lhe anaíysis. :': ;ND nol designed,
Cys highlighting lheir main conserved motifs/elements and [42], sugarcane [44], carnation [65], barley [45], taro [56],
their predicted secondary strueture is depicted. strawberry [29], wheat [57], cacao [30], amaranth [47], kiwi-
fruit [52] and sesame [53],
EXPLOITING THE PHYTOCYSTATINS' ANTIFUN- In Table 2 some antifungal PhyCys showing differences
GAL ACTIV1TY TO CONTROL PLANT D1SEASES on their inhibitory activity, where a specific phytocystatin
may inhibit different fungi species, at equal or different con-
Among diverse factors that affect the growth and devel- centration of recombinant protein, are listed. For example.
opment of plants, phytopathogenic fungi ai-e one of the most the FaCPI-1 from strawberry {Fragaria ananassa) is able to
damaging plant parasitic organisms. Worldwide, the diseases inhibit Botrytis cinerea and Fusarium oxysporum at a con-
caused by fnngi in importam crops greatly and negatively centration of 1.9 pM and 2.28 pM, respectively [29]. An-
impact agricultura! produetion and the environment [621, other example is the CeCPl from taro that inhibits Rhyz.octo-
including the Brazilian Amazon region, where the produe- nia solani, Sclerotium rolfsii, Alternaria brassicae and Py-
tion of black pepper (Piper nigrum L.) and cassava (Manihot thium aphanidermatum at SOpg/mL, while F. oxysporum and
esculenta Crantz) has been severely damaged by disease Glomerella cingulata are inhibited at 200pg/mL [56[. Re-
caused by Fusa ri um solani f. sp. piperis and Phytophibora garding the action spectrum of phytocystatins listed on Table
drechsleri, respectively [53, 64], 2, most of them showed inhibitory activity against at least
The main control methods used to combat plant patho- two fungai species. The CeCPI, for example, could bc con-
gens and pests are those based on the use of chemical prod- sidered a candidate to control different plant diseases, since
ucts (fungicídes and insecticides), which increases cost and showed inhibitory activity against more than five fungai spe-
can Icads lo environment contaminations. Since many stud- cies.
ies have reported the importam roles played by PhyCys in Moreover, data shown here confrrm the potential use of
plant defense response, their utilization in control of patho- PhyCys in control of phythopathogenic fungi with impor-
gen and pests has emerged as a powerful biotechnological tance to agriculture. Among them, the fungas B. cinerea can
tool. infect more than 200 plant species and ranks the second
For this purpose, many PhyCys have been recombinantly place in the Top 10 fungai plant pathogen lisl based on scien-
produced by expression in bactéria, followed by evaluation tific/economic importance, according to international com-
of their ability to inhibit the pathogen growth in vitro assays. munity of plant mycologists [66], Also included on this fun-
PhyCys exhibiting high antifungal activity have included gai plant pathogen list, F. oxysporum is a soil-borne patho-
those identified in pearl millet [24], chestnut [41], tomato gen causing vascular wilt on a wide range of plants, and gen-
99
Phyíocysíatins and their Poíeníial to Control Piauí Diseases Protein & Peptide Letters, 2015, Vol. 22, No. 2 107
Protel n accession SP Structure protein

^ >-
CAHé01631 60 LGRFAV Qt/VAG PW SNSL
NP 0012377341 60 LARFAV QWAG PW SNSt
AAM883971 00 LARFAV QWSG W
ACF49J661 GG LARFAV QTVAG PW SNSL
CAA118991 GG LARFAV QWSG PW
AKK30C041 GG LAKFAV . QWAG PW

1 1
GG LARFAV QWAG PW SNSL
AAM785981 G LARFAV QWAG W
CAD605J71 GG LARFAV QWAG w
AAK1S090I GG LAftFAV QWAG PW SNSL
AARS22231 GG VAQFAV QWAC PW
CAH601631 IVGGIRDSPAGSENSÜTEALGRFAVDDHÍIQKCÍfGMLEFVRVVKAlCBQWAffrLHHLWEAID-OGKKKLYEAKVKUKVMtNíTtiOViaEF
NP_001Í377341 rGGLRriS-ÍKK&NSVOTEMARFAUDEHHKKOHSLLEF SRWRTÔBSWAOTLHHLTLEAIE-AGEMCLYEXKVWTKPHUirKELOEF
AAMSS3971 UgOXVEV -1 GAQíiSAEVEE lAWAVDeMNKKENALIQF SIU.'/KAKCKr/VS(JtKKICLTVEvrE -(KSNOCVTfEAJCVWVOWOtJJSiaaHeP
ACF493661 UGOtSEN-PDAAHSLETDOIARFAVCEHKKRENALLEFVRWEAKEQTVACrrLHHLTLEALE -AGBKKVYEAEVWVKFHIXFKELQEF
CAA118991 WGGWSDVKG -HE NSLQIDDIARrAUDDHMKKANTLLQrMCWKAKCaWEOTI YILTLEVHI -CGKWCVYEAKTIÍEKPMLNFKEVQEr
AKK30004I \Arai®S<>;S3AJÍSI£IMlAKFAVCirmSl<EMAl,IÍPC!RWNTKE)aWACíri¥YirLEATtl-«GVKiaYEAJtVW7KPHVNFKEVt|DF
ABG893561 IjGGLRESOG-AANDAEIESIARFAVDEiOnCKENAI.lXFARWKAKEX!WA(7rLHHFTIEAID-AGKiaaYDAKV«VKWWHFKELQEF
AAM785981 VSI7VRDAFACU£NDL£Al£URrAVACH»$tcniAKL£r£iaVKVRHSVVAI7rT[»KrrVQVK£ASC<aQaYEAKVHEKVNENriC(íLg3F
CAD60S371 USO/ODAPAGRE NDLETIE IAiÂVAEHNAJ<ANAX.l^rE3aVKVRQSVVA03tHl(TT IZVKE-GGAWaYEAJCVWEKAMENFKOEQEF
AAK150901 tioantCSH SMPOTHEIAAF AVDQHKTKENGLLELVRWEAKBQVVACJTLHHLVX£VIi3 - AGKKKLYZAKIWVKPVJKDFKQ LQEF
AAR922Z31 AGfJWRP- IISLN-SAEVqDVAQFAVBEHHKQAKDELQYQSWRCTTÇWAOTínfRLVXAAKDG-AWtanrEAWHDKIWIHFRlJLTSr
Figure 2. Alignment ol' PhyCys highlighling the G/GG residae at lhe N-terminal sequence, lhe LARFAV-like molif, a conserved region
found in ali PhyCys that comprises the et-helix (r i )) in the cystatin stmcture, the QXVXG sequence in central part, and the P/PW se-
quence at the C-terminal end. AIso is shown lhe SNSL domain found in lhe C-terminal end of PhyCys from group-2. SP; signal peplide.
CAH60163.1: Fa-CPI-1 from Fragana ananassa, NP_001237734.1: Soyacystatin from Glycine max, AAM88397.1; CeCPÍ from Colocasia
esculenta, ACF49366.1: mTaMDClfrom Triticum aestivum L. cv. Chihoku, CAAÍ 1899.1; PhyCys from Castanea saliva, AAK30004.1;
rDC-CPIn from Dianthus caryophyllus L. cv. Reiko. ABG89856.Í: AhCPI from Amaranthus hypochondriacus, AAM78598.I: Canecystatin
from Saccharum officinarum, CAD60537.1: HvCPl-1 from Hordeum vidgare, AAKI5090.1: SiCYS from Sesamum indicum and A-
AR92223.1: KCP1-1 from Actinidui deliciosa.
erating severe losses in crops such as melon, tomato, cotton man health, since studies have shown that F. axysporum is
and banana [66], Then, taking into account the action spec- able to infect imraune compromised patients [671.
trum of phytocystatins listed on Table 2, the FaCPl-l could Since the first studies revealing the potential use of
be a candidate to control plant diseases caused by these two
PhyCys in control of pest and pathogens, one of the most
important pathogens. Interestingly, besides the control of challenges of researchers has been to understand the
diseases in agriculturally important crops, the potential use mechanism of PltyCys action against different organisms. In
of PhyCys as an antifungal agent could be extended to hu- pests, for example, it is known that PhyCys inhibit proteases
100
10S Prolein <£ Peptide Lellers, 2015, Vol. 22, No. 2 Lima etal.
Table 2. PhyCyS with in vitro inhibitory activity against differenl fungi.
Fungi PhyCys na me* (TmceiUiation Relerences

Botrytis cinerea FaCPl-1 1.9 gM 129]
Hv-CPI 3 MM [45]
rDC-CPIn 5 uM [65]
KCP1-I 5,8 gM [52]
Fusarium oxysponan FaCPI-l 2.28 (iM 129]
AhCPI 17 jrM [47]
CeCPÍ 200 uli/iiiL [56]
Sclerotium cepivomm AhCPI 5 mM 147]
Rhyzoctonia solam AhCPI 10 (iM 147]
CeCPI 80 (Jg/mL 156]
Colletotrichum graminicola Hv-CPI 1.5 fiM [45]
Pleclosphaerella cucumerina Hv-CPI 6 îM [45]
Trichoderma vinde Hv-CPI 6 îM [45]
Trichoderma reesei Canecystatia 200 gg/mL [44]
SiCYS 45 jrg/mL 153]
Sclerotium rolfsii CeCPi 80 iig/iril. [56]
Alternaria hrassicae CeCPI 80 ug/rní. 156]
Glomerella cingulata CeCP! 200 gg/mL [56]
Pythium aphanidermatum CeCPI 80 |rg/mL 156]
TcCYS-1
Moniliophthora perniciosa TcCYS-2 5 gM 130]
TcCYS-3
TcCYS-4
Microdochium nivaíe mTaMDCl 50 |ig/tnL [57]
Sclerotiana sclerotium rDC-CPIn tOgM 165]
Phytophthora nicotianae rDC-CPIn 2.5gM 165]
Aspergillus sydowii SiCYS 45 (ig/mL [53]
Helminthosporium sesamum SiCYS 45 gg/mL [53]
Alternaria radicina KCP1-I ll,6gM [52]
^ThcKC FhyCys are thcramc citcd ou lhe Table I
interfermg in dietary protein assimilation and causing growth mechanism. For example, Martinez et ai. [45] reported that
delays and mortality [68]; moreover, in ihis case, PhyCys inhibition of B. cinerea by the barley cystatin Hv-CPI is not
can be considered anti-metabolite molecules, because they associated with its cysteine-proteinase inhibitory properties,
produce a deficiency of protein in those organisms. Although and correlates with the absence of intra- and extra-cysteine
the mechanism by which PhyCys inhibit fungi growth is not protease activity in this fungas. Also, the same aulhors [45]
yet elucidated, it hns been suggested to be related to the dC have suggested that action of PhyCys could involve changes
rect inhibition of fungai cysteine protease [47, 56]. Likewise, in the permeability of fungai membrane, in a similar
Wang et at. [46] showcd that the N-terminus of CeCPI, pro- mechanism to inhibition of Sclerotiana sclerotium by the
duced by heterologous expression in bactéria, is implicated trypsin inhibitor SAP16 from Helianthm annuus [69], Other
in papain-inhibitory activity as weil as antifungal activity studies have also corroborated that antifungal activity of
against S. rolfsii. In contrast, other studies have indicated PhyCys cannot be directly related to their enzymatic activity.
that antifungal activity of PhyCys could involve a different As reported by Cheng et al. [53] the whole PhyCys from
101
Phytocystatins and llieir Putential Io Control Pltnil Diseases Protein & Peptide Letters, 2015, Vol. 22. Nu. 2 lOt»
sesame seeds (SiCYS), as well as its N- and C-terminal do- ACKNOWLEDGEMENTS

mains (SiCYS-N and SiCYS-C, respcctively), recombinantly
produced by expression in bactéria, showed comparable abil- The authors thank: Conselho Nacional de Desenvolvi-
ity to inhibit spore germination of Trichoderma reesei, Aç- mento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de
pergillus sydowii. and Helminthosporíum sesamum. On llic Aperfeiçoamento de Pessoal dc Nível Superior (Capes),
other hand, SiCYS exhibiled more effective pupain- Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Pará (FA-
inhibitory activity than SiCYS-N while SiCYS-C had almost PESPA), Universidade Federal Rural da Amazônia (UFRA)
no inhibitory activity, indicating no correlation between anti- and Universidade Federal do Pará (UFPA), Brazil. Special
fungal and papain-inhibitory activities for this PhyCys. thanks to Dr. Isabel Diaz from lhe Universidad Politécnica
de Madri (Spain), who kindly provided us lhe Figure 1
In addition to in vitro studies, transgenic approaches have shown in this papei.
also contributed in understanding of mechanisms by which
plants over-expressing or silencing PhyCys genes respond to REEERENCES
attacks by insects and pathogens. Enhanced resislance
against insects in transgenic plants over-expressing PhyCys [1] BaiTetl, A.J.; Rawlings, N.D., Woessner, J.F, Handbook of Prote-
olytic Enzymes, 2nd edition; Academic Press: London, 2004.
genes has been shown [70, 71], In Arabidopsis the over- [2] Rawlings, N.D.; Barrett, A.J.; Bateman, A. MEROPS: the database
expression of PhyCys gene from barley increased the resis- of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors. Nucleic Ac-
lance against two aphid species [70]. In fungi, however, it ids Res.y 2012. ^,343-350.
has been shown that PhyCys can inhibit their growth when in [3] Powers, J.C.; Asgian, J.L,; Ekici, O.D.; James, K.E. Jrreversibíe
inhibitors of serine. cysteine, and threonine proteases. Chem. Rev.,
vitro conditions, but not in transgenic plants [72], As 2002, J02, 4639-4750.
reported by Carrilo et al. [72] HvCPl from barley inhibited [4] Otto, H.H .; Schirmeister, T. Cysteine proteases and their inhibitors.
the in vitro growth of some phytopathogenic fungi, including Chem. Rev.. 1997, 97, 133-171.
Magnaporthe oryzae, but Arabidopsis plants over-expressing [51 Drenth, J.; Jansonius, J.; Koekoek, R.: Swen, H.; Wollers, B. Struc-
this PhyCys showed no differences in fungai resistance ture of Papain. Nature, 1968, 2IH, 929.
[6] Martínez, M.; Diaz-Mendoza, M.: Camilo, L.; Díaz, I. Carboxy
leveis in comparison to non-transformed plants. On the other terminal extended phytocystatins are bifiinctional inhibitors of pa-
hand, another study on in vitro and in vivo PhyCys anti- pain and legumain cysteine proteinases. FEBS Leu., 2007. 58J,
fungal properties revealed a kiwifruit cystatin able to preveni 2914-2918.
artificial infection of apple and carro! by spore suspension of [7] Esleban-Garcia, B.; Garrido-Cardenas; J.A.: Lopez-Alonso, D.;
Garcia-Maroto, F. A distinet subfamily of papain-like cysteine pro-
B. cinerea and Alternaria radieina, respcctively [73], This teinases regulated by senescence and stresses in Glyciue max. J.
purified cystatin was also abie to inhibit the in vitro growth Plant Physiol, 2010, 767, 1101-1108.
of these two fungai species [73]. In addition, a recent study [8] Rzychon, M.; Chmiel, D.; Stec-niemczyk, J. Modes of inhibition of
reported by van der Linde et al. [74] revealed an interesting cysteine proteases. Acta Biochim. Pol., 2004. 57, 861-873.
role of cystatin-9 from maize during interaction wiih [9] Martínez. M,; Cambra; I.; González-Melendi. P.: Santamaría, M.E,:
Díaz, 1. CIA cysteine-proteases and their inhibitors in plants.
biotrophic pathogen Ustilago maydis. Transgenic plants by Physiol. Plant, 2012, 145, 85-94.
silencing of the cystaün-9 gene resulted in reduced infection [10] Barrett, A. The cystatins; a new class of peptidase inhibitors.
by U. maydis, showing that this PhysCys suppresses host Trends Biochem. Sei. 1987, 12, 193-196.
immunity by inhibition of apoplastic cysteine proteases [74]. [11] Kondo, H.; Abe, K.; Emori, Y.; Arai, S. Gene organization of
oryzacystatin II, a new cystatin superfamily member of plant origin,
is closely related to that of oryzacystatin-1 but different from those
CONCLUSION of animal cystatins. FEBS Lett., 1991, 278, 87-90.
[12] Abraham, Z,; Martínez. M.; Carbonero, P.; Diaz, I. Stmctural and
In lhe last years several PhyCys with antifungal functional diversity wilhin the cystatin gene family of Hordeum
properties have been isolated and eharacterized; however, vulgare. J. Exp. Bot., 2006, 57, 4245-4255.
taking into account the whole immense plant diversity in the [13] Grudkowska, M.; Zagdanska, B. Multifunctional role of plant cys-
world, many PhyCys remain yet unexploited. A potential teine Proteinases. Acta Biochim. Pol., 2004,57, 609-624.
[14] Bateman, A.; Bimey, E.; Cerruti, L.; Burbin. R.; Etwiller, L.; Eddy,
application of these antifungal PhyCys is their use in stable S.R.; Griffiths-Jones, S.: Howe, K.L.; Marsahall, M.; Sonnhammer,
transformation of plants to control phythopathogenic fungi E.L. The Pfam protein families database. Nucleic Acids Res.. 2002,
with importance to agriculture, since the development of 30, 276-280.
genetically engineered plants by the over-expresskm and/or [15] Abe, K.; Emori,Y.; Kondo, H.: Suzuki, K,: Arai, S.: Molecular
cloning of a cysteine proteinase inhibitor of rice (oryzacystatin).
the silencing of specific genes has been the more viable op- Homology with animal cystatins and transienl expression in the rip-
tion to the produetion of pathogen resistant crops. Despite ening process of rice seeds. J. Bi oi. Chem., 1987, 262, 16793-
significant advances on PhyCys studies, our knowledge 16797.
ahoul mechanism of their action against fungi is yet limited. [16] Kondo H.; Abe, K.; Nishinura, I.; Watanabe, H.; Emori, Y.; Arai, S.
Therefore, further studies are necessary to a better under- Two Distinet Cystatin species in rice seeds with different
speciflcities against cysteine proteases. J. Biol. Chem., 1990. 265,
standing of piam defense systems, including the elucidation 15832-15837.
of functional roles of PhyCys in inhibition of fungai growth [17] Fernandes, K.V.S.; Sabelli, P.A.; Barratt, D.H.P.; Richardson, M.;
that will help us in development of new strategies to control Xavier-Filho, J.; Shewry, P.R. The resistance of cowpea seeds to
plant diseases caused by these pathogens. bruchid beetles is not related to leveis of cysteine proteinase - in-
hibitors. Plant Mol. Biol, 1993,25,215-219.
[18] Waldron, C.; Wegrich, L.M.; Medo, P.A.; Walsh, T.A. Characleri-
CONFLICT OF INTEREST zation of a genomic sequence coding for potato multicyslatin. an
eight-domain cysteine proteinase inhibitor. Plant Mol. Biol. 1993,
The authors confirm that this article content has no 23. 801-812.
conflict of interest.
102
MO Protein & Peptide Letters, 2015, Vul. 22, No. 2 Lima et ai

119J Abe, M.: Abe. K.; Domoto, C.; Arai, S. Two distinct species of com dein mobilization during seed germination. Plant Physiol.. 2009.
cystatin in com keraels. Bi o sei. Biotechnol Biochem., 1995, 59, 757, 1531-1545.
756-758. 140J Koiwa, H.; Bressan. R.A.; Hasegawa, P.M. Regulation of protease
[20] Hines, M.E.; Osuala, C.I.; Nielsen, S,S. Isolalion and partial charac- inhibitors and plant defense. Trends Plant Sei., 1997, 2, 379-384.
terization of soybean cystatin cysleine proteinase inhibitor of cole- [41] Pernas, M.; López-Solanilla, E.; Sanchez-Monge, R.; Salcedo, G.;
opteran digestive proteolytic aclivil. J. Agric. Food Chem., 1991, Rodríguez- Palenzuela, P. Antifungal aclivity of a plant cystaiin.
59(8), 1515-1520. Mol. Plant Microbe Internet.. 1999, 72, 624-627.
[21] Misaka, T.; Kuroda, M.; Iwabuchi, K.; Abe, K.; Arai, S. Soyacys- [42] Siqueira-Júnior, C.L.; Fernandes, K.V.S.; Machado, O.L.T.; Da
tatin, a novel cysteine proteinase inhibitor in soybean, is distinct in Cunha, M.; Gomes, V.M.; Moura, D.; Jacinto, T. 87 kDa tomato
protein strueture and gene organization from other cystatins of ani- cystatin exhibits properties of a defense protein and forms protein
mal and planí origin. Eur. J. Biochem., 1996, 240,609-614. crystals in prosystemin overexpressing transgenic plants. Plant
[22] Lim, C.O.; Lee, S.L; Chung, W.S.; Park, S.H.; Hwang, L; Cho, M. Physiol. Biochem.. 2002. 40, 247-254.
J. Characterization of a cDNA encoding cysteine proteinase inhibi- [43] Delledonne, M.; Allegro, G.; Belenghi. B.; Balestrazzi, A.; Picco,
tor from Chinese cabbage (Brassica campestris L. ssp. pekinensis) F.; Levine, A.; Zelasco, S.; Callígari, P.; Confalonieri, M. Trans-
flower buds. Plant Mol. BioL, 1996,59,373-379. formation of white poplar (Populus alho L.) with a novel Arabidop-
[23] Ojima, A.; Shíota, H.; Higashi. K.; Kamada, H.: Shimma, Y.I.; sis thaliana cysleine proteinase inhibitor and analysis of insect pest
Wadamasata, P.; Satoh, S. An extracellular insoluble inhibitor of resistance. Mol. Breed.. 2001. 7, 35-42.
cysteine proteases in cell cultures and seeds of carrot. Plant Mol. [44] Soares-Costa, A.; Beltramini, L.M.; Thiemann, O.H.; Henrique-
BioL, 1997, 34,99-109. Silva, F. A sugarcane cystatin: recombinant expression, purifica-
[24] Joshi, B.N.; Sainani, M.N.; Bastawade, K.B.; Gupta, V.S.; Ran- tion, and antifungal activity. Biochem. Biophys. Res. Commun.,
jekar, P.K. Cysteine protease inhibitor from pearl millet: a new 2002,296,1194-1199.
class of anüfungal protein. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1998, [45] Martinez, M.; López-Solanilla, E.; Rodríguez-Palenzuela, P.; Car-
246,382-387. bonero, P.; Diaz, I. Inhibition of plant-pathogenic fungi by the bar-
[25] Kuroda, M.; Kiyosaki, T.; Malsumoto, 1.; Misaka, T.; Arai, S.; Abe, ley cystatin Hv-CPI (gene Icy) is not associaled with its cysteine-
K. Molecular cloning, characterization, and expression of wheat proteinase mhibitory properties. Mol. Plant Microbe Internet.,
cystatins. Biosci. Biotechnol. Biochem., 2001,65, 22-28. 2003, 76,876-883.
[26] Ryan, S.N.; Mcmanus, M.T.; Laing, W.A. Identification and char- [46] Wang, K.M.; Kumar, S.; Cheng, Y.S.; Venkatagiri, S.; Yang, A.H.;
acterization of proteinase inhibitors and their genes from seeds of Yeh, K.W. Characterization of inhibitory mechanism and antifungal
apple (Malas domestica). J. Biochem.. 2003. 134, 31-42. activity between group-1 and group-2 phytocystatins from taro
[27] Shyu, Chyan, C.L.; Tzen, J.T.C.; Chou, W.M. Molecular (Colocasia esculenta). FEBSJ., 2008, 275, 4980-4989.
cloning, expression, and functional characterization of a cystatin [47] Vakles-Rodriguez, S.; Cedro-Tanda, A.; Aguilar-Hernandez, V.;
from pineapple stem. Biosci. Biotechnol. Biochem . 2004. 68, 1681- Cortes-Onofre, E.; Blanco-Labra, A.; Guerrero-Rangel, A. Recom-
1689. binant amaranth cystatin (AhCPl) inhibits the growth of phytopa-
[28] Rassam, M.; Laing, W.A. Purification and characterization of pby- thogenic fungi. Plant Physiol. Biochem., 2010, 48,469-475.
tocystatíns from kiwifruit cortex and seeds. Fhytochemistry, 2004. [48] de Souza, C.R.B.; Santa-Brígida, A.B.; Santos, R.C.; Costa,
65,19-30. C.N.M.; Damel S.H.: Harada, M.L. Identification of sequences ex-
[29] Martinez, M.; Abraham, Z.; Gambardella, M.; Echaide, M.; Car- pressed during compatible black pepptT-Fusarium solam f. sp. pi-
bonero, P.: Diaz, I, The strawberry gene Cyfl encodes a phytocys- peris interaction. Acta Physiol. Plant.. 2011,33, 2553-2560.
tatin with antifungal properties. J. Exp. Boi.. 2005,56,1821-1829. [49] Lima, A.M. Isolamento e caracterização de genes de cistatinas de
[30] Pirovani, CP.; Santiago, A.S.; Santos, L.S.; Micheli, F.; Margis, R.; pimenteira-do-reino (Piper nigrum) durante interação com o Fusa-
Gesteira, A.S.: Alvim, F.C.; Pereira, G.A.G.; Cascardo. J.C.M. riitm solanif sp. piperis. Mastefs degree dissertation. Federal Uni-
The oh romã caca o cystatins impair Moniliophthora pernicioso my- versily of Pará, Belém, March 2012.
celial growth and are involved in postponing cell death symptoms. [50] Diop, N.N.; Kidric, M.; Repellin, A.; Gareil, M.; Ârcy-Lameta,
Planta, 2010, 352, 1485-1497. A.; Pham Thi, A T.; Zuily-Fodil, Y, A multicystatin is induced by
[31] Bangrak, P.; Chotigeat, W. Molecular cloning and biochemical droughl-stress in cowpea (Vigna unguiculata (L.) Walp.} leaves.
characterization of a novel cystatin from Hevea rubber látex. Plant FEBS Lett., 2004, 577, 545-550.
Physiol. Biochem., 2011, 49, 244-250. [51J Hwang, J.E.; Hong, J.K.; Lim, CJ.; Chen, H.; Je. J.; Yang, K.A.;
[32] Belenghi, B.; Acconcia, F.; Trovato, M.; Perazzolh, M,; Bocedi, A.; Kim, D.Y.; Choi, Y.J.; Lee, S.Y.; Lim, CO. Distinct expression
Pollicelli, F.; Ascenzi. P.; Delledonne, M. AtCYSl, a cystatin from patterns of two Arabidopsis phytocystatin genes, AtCYSl and
Arabidopsis thaliana, suppresses hypersensitive cell death. Eur. J. AtCYS2, during developmenl and abiotic stresses. Plant Cell Rep.,
Biochem.. 2003. 270, 2593-2604. 2010, 29, 905-915.
[33] Ryan, S.N.; Laing, W.A.; McManus, M.T. A cysteine proteinase [52] Popovic, M.; Andjelkovic, U.; Burazer, L.; Lindner, B.; Petersen,
inhibitor purified from apple fruit. Phytochemistry, 1998. 49. 957- A.; Gavrovic-Jankulovic, M. Biochemical and immunological char-
963. acterization of a recombinantly produced antifungal cysteine prote-
[34] Neuteboom, L.W.; Malsumoto, K.O.; Christopher, D.A. An ex- inase inhibitor from green kiwifruit (Actinidia deliciosa). Phyto-
tended AE-rich N-terminal trunk in secreted pineapple cystatin en- chemistry, 2013, 94, 53-59.
hances inhibition of fruit bromelain and is posttranslationally re- [53] Cheng, M.-L.: Tzen, J.T.C.; Shyu, D.J.H.; Chou W-M. Functional
moved during ripening. Plant Physiol.. 2009. 151, 515-527. characterization of lhe N-terminal and C-terminal domains of a ses-
[35] Bolter, C.J. Methyl jasmonate induces papain inhibitor(s) in toniato ame group II phytocystatin. Bot. Stud.. 2014,55(18), 1-10.
leaves. Plant Physiol., 1993, Í03, 1347-1353. [54] Martinez, M.; Abraham, Z.; Carbonero, P.; Diaz, I. Comparative
[36] Gaddour, K.; Vicenle-Carbajosa, J.; Lara, P.; Isabel-Lamoneda, I.; phylogenetic analysis of cystatin gene families from arabidopsis,
Diaz, I.; Carbonero, P. A constitutive cystatin-encoding gene from rice and barley. Mol. Genet. Genomics. 2005,273,423-432.
barley (Icy) responds differentially to abiotic stimuli. Plant Mol. [55] Zhang, X.; Liu, S.; Takano, T. Two cysteine proteinase inhibitors
fi/o/., 2001. 45,599-608. from Arabidopsis thaliana, AtCYSíi and AtCYS6, increasing the
[37] Hong, J.K.; Hwang, J.E.; Lim, C.J.: Yang, K.A.; Jin, Z.-L.; Kim, salt, drought, oxidation and cold tolerance. Plant Mol. BioL. 2008,
C.Y.; Koo, J.C.; Chung, W.S.; Lee, K.O.; Lee, S.Y.; Cho, M.J.; 65,131-143.
Lim, CO. Over-expression of Chinese cabbage phytocystatin 1 re- [56] Yang, A.H.; Yeh, K.W.C. Molecular cloning, recombinant gene
tards seed germination in Arabidopsis. Planí Sei., 2007, 172, 556- expression and antifungal activity of cystatin from taro (Colocasia
563. esculenta cv. Kaosiung no. 1). Planta, 2005, 227, 493-501.
[38] Hwang, J.E.; Hong, J.K.; Je, J.H.; Lee, K.O.; Kim, D.Y.; Lee, S.Y.; [57] Christova, P.K.; Chrisíov, N.K.; Imai, R. A cold inducible multà-
Lim, CO. Regulation of seed germination and seedling growth by domain cystatin from winter wheat inhibits growth of the snow
an Arabidopsis phytocystatin isoform, AtCYSó. Planí Cell Rep., mold fungus, Microdochium nivale Planta, 2006,223, 1207-1218.
2009, 28, 1623-1632. [58] Sugawara, H.; Shibuya, K.; Yoshioka, T.; Hashiba, T.; Satoh, S. Is
[39] Martinez, M.; Cambra, L; Camilo, L.; Diaz-Mendoza, M.; Diaz, L a cysleine proteinase inhibitor involved in the regulation of petal
Characterization of the entire cystatin gene family in barley and wilting in senescing camation (Dianthus caryophyllus L.) flowers?
their larget cathepsin L-like cysteine-proteases, partners in lhe hor- J. Exp. Bot., 2002, 55, 407-413.
103
Phytocystatins and their Potential to Contrai Planí Diseases Protein & Peptide Letters, 2015, Vol. 22, No. 2 111
[59J Margis, R.; Reis, E.M.; Villeret, V. Structural and phyiogenetic [68] Benchabane, M.; Schlüler, U.; Vorster, J.; Goulet, M.C.; Michaued,
reladonships among planl and animal cyslalins. Arch. Biochem. D. Planl cyslalins. Biochimie. 2010, 92. 1657-1666,
Biophys., 1998, 359, 24-30. |69J Giudici, A.M.; Regente, M.C.; Canal, L. A potent antifungal protein
[60] Reis, E.M,; Margis, R. Sugarcane phytocystatins: Identification, from Helianthus annuus fíowers is a trypsin inhibitor. Plant
classification and expression pattern analysis. Genet. Mal. Biol., Physiol. Biochem., 2000. 35, 881 -888.
2001, 24, 291-296. [70] Cairillo, L.; Martinez, M.; Alvarez-Alfageme, F.; Castanera, P.;
[61] Chu, M.H.; Liu, K.L.: Wu, H.Y.; Yeh, K.W.; Cheng, Y.S. Crystal Smagghe, G.; Diaz, 1.; Ortego. F. A barley cysteine-proteinase in-
structure of tarocystalin-papain complex: implications for the inhi- hibitor reduces the performance of two aphid species in artificia! di-
bition property of group-2 phytocystatins. Planta. 2011, 234, 243- ets and transgenic Arabidopsis plants. Transgenic Res., 2011, 20,
254. 305-319.
[62] Gonzalez-Fernandez, R.; Jorrin-Novo, J.V. Contribution of Pro- 171] Zhang, B.; Chen, M.; Zhang, X.; Luan, H.; Diao, S.; Tian, Y.; Su,
teomics to lhe Study of Planl Pathogenic Fungi. J. Proteome Res., X. Laboratory and field evaluation of the transgenic Populus alba x
2012, 7/(1), 3-16. Populus glandulosa expressing double coleopteran-resistance
[63] Duarte. M.L.R.; Archer, S.A. In vitro toxin production by Fusarium genes. Tree Physiol., 2011, 37. 567-573.
solani f. sp. piperis. Fitopatol. Brás., 2003, 28, 229-235. [72] Camilo, L.; Herrero, I.; Cambra, I.; Sánchez-Monge, R.: Diaz, 1.;
[64] Muniz, M.F.S.: Andrade, F.W.R.; Queiroz, F.M.: Moura-Filho, G.; Martinez, M. Differential in vitro and in vivo effect of barley cys-
Menezes, M. Characterization of Phytophthora drechsleri, the cau- teine and serine protease inhibitors on phytopathogenic microorgan-
sai agent of cassava soft root rot. Fitopatol. Bras., 2006, 37,195- isms. Plant Physiol. Biochem., 2011, 49, 1191-1200.
198. [73] Popovic, M. M.: Bulajic, A.: Ristic. D.; Krstic, B.; Jankov, R.M.;
[65] Sugawara, H.; Yoshioka, T.; Hashiba, T.; Satoh, S. Antifungal Gavrovic-Jankulovic, M. In vitro and in vivo antifungal properties
activity of a recombinant carnation cystatin. rDC-CPLi. Planí Bio- of cysteinc proteinase inhibitor from green kiwifmit. J. Sei. Food
íechnoL, 2002, 79(3), 207-209. Agric.. 2012, 92, 3072-3078.
[66] Dean, R.: Van Kan, J.A.L.; Pretorius, Z.A.; Hammond-Kosack, [74] van der Linde, K.; Hemetsberger, C.; Kastner, C.; Kaschani, F.
K.E.; Pietro A.D.; Spanu, P.D.; Rudd, J.J.; Dickman, M.; Kahmann, Renier, A.L.; Hoom, V.D.; Jochen, K.; Doehlemann, G. A maize
R.; Ellis, J.; Foster, G.D. The Top 10 fungai pathogens in molecular cystatin suppresses host immunity by inhibiting apoplastic cysteine
plant pathology. Mol. Plant. Paíhot., 2012, 73(4), 414-430. proteases. Plant Cell, 2012, 24, 1285-1300.
[67] Nucci, M.; Anaissie, E. Fusarium infections in immunocom-
promised patients, Clin. Microbiol. Rev., 2007. 20, 695-704.
Recdved: Septeinhor 22,2013 Revised: Mareh 15,2014 Acccptcd: April 1.2014

104
CAPÍTULO VI
A FAMÍLIA DE GENES DE FITOCISTATINAS EM MANDIOCA:
105
6. A FAMÍLIA DE GENES DE FITOCISTATINAS EM MANDIOCA:

RESUMO As fitocistatinas são moléculas com atividade antifúngica amplamente
reconhecida, tornando-a com isso uma alternativa viável no combate a patógenos.
Estudos relataram uma fitocistatina da mandioca down-regulation durante a
deterioração pós-colheita. Esta fitocistatina foi posteriormente identificada como
potencialmente envolvida na defesa da mandioca ao ataque de Phytophythium sp. Este
trabalho tem como objetivo caracterizar in silico a família de genes de fitocistatinas da
mandioca sob aspecto evolutivos relacionando-os com a diversidade funcional das
mesmas. Pesquisas foram realizadas no genoma da mandioca através do banco de dados
Phytozome e as seqüências obtidas foram analisadas por bioinformática. A busca
resultou em nove seqüências e as análises computacionais revelaram ampla conservação
dos motivos principais característicos das fitocistatinas de planta. Sendo possível
identificar e caracterizar nove seqüências genômicas de fitocistatinas distribuídas em 7
cromossomos, com padrões diferenciados de organização de introns e exons. Foram
identificadas fitocistatinas dos grupos I e do grupo II com pesos moleculares diferentes,
e com diferentes localizações subcelular. O potencial destas fitocistatinas do grupo II
em inibir papaína e legumaina foi predito por meio das análises da possível estrutura
tridimensional, bem como o potencial da fitocistatinas do grupo I em inibir papaína. Os
resultados mos permite concluir que a família de fitocistatinas possuem nove isoformas
e que estas podem atuar em diferentes processos celulares, inclusive nos mecanismos de
defesa contra o ataque de patógenos já demonstrado para PnCPI-5, indicando a
necessidade de conhecer suas atividades enzimáticas e biológicas.
ABSTRACT
Phytocystatins are molecules with antifungal activity widely recognized, thus they are
an alternative for combat against pathogens. Studies related one Mandioca's
Phytocystatins down-regulation under post-harvest deterioration, this Phytocystatin was
posteriorly recognized with potentially involved in the defense of mandioca against
Phytophythium sp. This research aims to characterize in silico the Phytocystatin gene
family of mandioca under evolutionary aspects relating them to their functional
diversity. Research were done in the mandioca genome through the Phytozome database
106
and the sequences obtained were analyzed by bioinformatics The search resulted in nine
sequences and the computational analyzes revealed wide conservation of the main
characteristic motifs of plant phytocystatin. It is possible to identify and characterize
nine genomic sequences of phytochistides distributed in 7 chromosomes, with
differentiated pattems of organization of introns and exons. Phytotic agents of groups I
and II with different molecular weights and with different subcellular locations were
identified. The potential of these group II phytotic agents to inhibit papain and
legumaine was predicted by analyzing the possible three-dimensional structure as well
as the potential of group I phytotic agents to inhibit papain. The results allow us to
conclude that the phytochistosin family has nine isoforms and that these can act in
different cellular processes, including the mechanisms of defense against the pathogen
attack already demonstrated for PnCPI-5, indicating the need to know its enzymatic and
biological activities.
6. 1. Introdução
Ao longo da evolução, as plantas desenvolveram mecanismos de proteção que
lhes permitiram resistir com sucesso a diferentes tipos de condições desfavoráveis,
incluindo insetos e microrganismos fitopatogênicos. Dentre estes mecanismos podemos
citar os inibidores de proteases, uma vez que tanto os insetos como os microrganismos
patogênicos usam enzimas proteolíticas para penetrar no tecido da planta hospedeira
(WAR et ak, 2012; PANDEY et ak, 2016; ZUST e AGRAWA, 2017).
As cistatinas são inibidores competitivos de proteases cisteínicas que,
interagindo com o sítio ativo das enzimas-alvo, bloqueiam o acesso ao substrato. Foi
identificada primeiramente em animais (em clara de ovo de galinha (FOSSUM e
WHITAKER, 1968)). Alguns anos após a identificação de cistatinas em animais
verificou-se que estes inibidores de proteases cisteínicas também estavam presentes em
plantas, através do isolamento e caracterização de uma cistatina em arroz (ABE et ak,
1987).
Fitocistatinas (PhyCys) são inibidores de proteases da família CIA, composta
principalmente por proteases do tipo papaína e integradas em uma subfamília
independente na árvore filogenética da cistatina (MARTINEZ e DIAZ, 2008;
MARTINEZ et ak, 2009; RAWLINGS et ak, 2016). Adicionalmente algumas
fitocistatinas também conseguiam inibir proteases de uma família bastante diferente das
107
papaínas (família CIA), as legumaínas que pertencem à família C13 (MARTINEZ et
al., 2007). Na base de dados MEROPS (versão 11.0), várias isoformas de cistatina e
genes que codificam a cistatina, com diferentes padrões de expressão espaciais e
temporais, foram caracterizados em Arahidopsis thaliana, Castanea saliva, Manihot
esculenla, Hevea hrasiliensis e Oryza saliva (RAWLINGS et al., 2016 ).
Uma alternativa ao uso de defensivos químicos no combate de doenças de
plantas é a busca por biomoléculas que confiram resistência ou tolerância à planta. A
espécie Manihot esculenla Crantz, conhecida popularmente como mandioca, é atacada
por I^hylopylhium sp., causador da podridão radicular nas raízes, principal produto para
comercialização (Boari et al., 2018). Esta doença causa sérios prejuízos à produção de
mandioca no Estado do Pará, principalmente em pequenos produtores ou agricultores
familiares, pois não há acessos comercial resistente nem controle químico eficaz
(VIEIRA, 2011).
O papel exato das PhyCys não está determinado, mas sugeri-se que podem atuar
em diversos mecanismos, tais como no estresse biótico e abiótico (BENCHABANE et
al., 2010; WAR et al., 2012; LIMA et al., 2015; PANDEY et al., 2016; ZUST e
AGRAWA, 2017). As fitocistatinas pertencem são moléculas com atividade antifúngica
amplamente reconhecida, tornando-a com isso uma alternativa viável no combate a
patógenos. No capítulo 2 foi identificada uma seqüência diferencialmente expressa de
fitocistatinas em raízes de mandioca destacadas inoculadas com Phytophytium sp.,
agente causador da podridão radicular nesta cultura. Sendo assim necessário a
caracterizar in silico a família de genes de fitocistatinas da mandioca sob aspectos
evolutivos, relacionando-os com a diversidade funcional das mesmas, para possibilitar a
análise de suas atividades enzimáticas e biológicas no futuro.
6.2. Material e Métodos
As seqüências genômica, cDNA e protéica de PhyCys de mandioca foram
obtidas por meio das ferramentas de busca disponível no Phytozome
(http://www.phytozome.net/cassava). A busca foi realizada utilizando a palavra
Cystatin e as seqüências obtidas foram avaliadas quanto a presença dos domínios
conservados através dos programas InterPro Scan (https://www.ebi.ac.uk/interpro)
(HUNTER et al., 2008) e CDD {Canse rveded Domains Database\
www.ncbi.nlm.nig.gov/cdd) (MARCHLER-BAUER et al., 2010) e quanto à

108
similaridade com proteínas de estrutura resolvida depositadas nos bancos de dados, para
tal foi utilizada a ferramenta BLAST (www.blast.ncbi.nlm.nig.gov) (ALTSCHUL et al.,
1997).
Para confirmar se as seqüências encontradas correspondem as fases de leitura
aberta - ORFs ("open reading frame") foi utilizado o software ORF FINDER
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html) (ROMBEL et al., 2002). O alinhamento
das seqüências de nucleotídeos e aminoácidos foram realizados com o auxílio do
programa CLUSTALW utilizando os parâmetros padrões (THOMPSON et al. 1994).
As seqüências de aminoácidos deduzidas foram avaliadas através de programas e
ferramentas computacionais. Para a predição da presença e tamanho do peptídeo sinal
foi utilizado o programa SignalP v.2.0 (http:// www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)
(NIELSEN e KROGH, 1998). O peso molecular e o ponto isoelétrico da seqüência de
aminoácidos deduzida foram previstos pelo ExPASy Proteomics Server
(http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html). A localização subcelular foi obtida utilizando
SherLoc2 (BRIESEMEISTER et al., 2009). A estrutura tridimensional da seqüência de
aminoácidos foi modelada pelo programa SWISS-MODEL. A análise filogenética foi
realizada utilizando o software Molecular Evolutionly Gemtics Analysis (MEGA),
versão 7.0 (KUMAR et al., 2000), usando o método Neighbor-Joining, após o
alinhamento realizado pelo programa CLE1STALW das seqüências de mandioca com
seqüências de outras espécies.
6.3. Resultados e Discussão
O sequenciamento de genomas completos possibilitou a busca por genes
homólogos em diferentes organismos, revelando assim uma grande variedade de genes
de cistatinas conservados entre eucariotos e procariotos (MARTINEZ e DIAZ, 2008;).
Foram obtidas nove seqüências de PhyCys de mandioca no Phytozome. Estas foram
denominadas de MeCPI-1 a MeCPI-9 (Tabela 1) de forma aleatória. As nove seqüências
de fitocistatina mostraram-se distribuídas em sete dos dezoito cromossomos de
mandioca (Figura 1). Análises comparativas das seqüências de cDNA utilizando o
programa mostraram que as seqüências obtidas possuem identidade com cistatinas de
outras espécies vegetais com proteínas de estruturas já resolvidas e depositadas nos
bancos de dados.
Tabela 1 - Nome do gene. Locus, Tamanho da sequencia genômica em pares de bases (gDNA (bp)).
Número de Introns. Número de resíduos de aminoácidos (aa). massa molecular teórica (MM) e ponto
isoelétrico (PI), grapo e localização subcelular das isoformas dos genes de fitocistatinas identificadas
neste estudo.
Nome do Locus gDNA Número Tam. MM PI Grapo Localização

gene (bp) de Intron (aa) (kDa) subcelular
MeCPl-l Manes-05G198500 369 0 122 13.5 5.07 I Secretada
MeCPI-2 Manes-05G198300 405 0 134 15 9.47 I Núcleo
MeCPl-3 Manes-04G155400 2077 3 245 27 6.06 II Cloroplasto
MeCPl-4 Manes-11G008700 1347 3 167 18.3 6.45 II Outra
MeCPl-5 Manes-09G039400 603 0 111 12.1 9.52 I Secretada
MeCPI-1 Manes-08G063200 7470 2 195 22.3 7.08 II Secretada
MeCPl-S Manes-08G041000 527 0 111 12.6 6.60 I Secretada
O alinhamento das seqüências de aminoácidos de seqüências de fitocistatinas da
mandioca nos permitiu observar a presença dos motivos conservados: um ou dois sítio
de glicina (G) na porção N-terminal, um motivo QXVXG no loop central e um
triptofano (W) na região C-terminal na maioria das seqüências. Quanto ao motivo
LARFAV, comum a todas as fitocistatinas, se observa substituições relacionadas em
todos os aminoácidos, mas sempre se observa a seqüência conservada [LVI] - [AGT] -
[RKE] - [FY] - [AS] - [VI] (Figura 2.).
Figura 1. Localização das seqüências de fitocistatinas nos cromossomos da mandioca.
2 3 4 5 3 9 11
i— 0
MeCPIA
- MeCPI-S
lMeCP/-5
.WeCPI-7
- 10000000 ■ IMeCP/-6
- 25000000 ■ MeCPI-S MeCPI-2

MeCPI-3 /WeCPM
_ 30000000
Fonte: Este estudo

110
Figura 2. Alinhamento das nove seqüências de aminoácidos das fitocistatinas de mandioca. As regiões referentes aos peptídeos sinais estão sublinhadas. A região em amarelo
mostra um motivo conservado entre as fitocistatina. As regiões em vermelho mostram os resíduos de aminoácidos conservados no local inibitório. A região conservada entre
as legumaínas SNSL é mostrado em verde. O intervalo gerado no alinhamento é indicado por traços.
i 50 100
MeCPI-9 —MKGHRLIFSFLFFAAVAF AALV G|ííQPI KDL-KDPNIV EIGEYAVKEY NKR ANTDLILVNV VKGEE QWSG
MeCPI-8 —MKGHRLIFSFLFFATVAF AALA GflWQPI KDL-KDPNIV EIGEYAVKEY NKR ANTDLILVNV VKGEE QWSG
MeCPI-5 —MKPFSLLSGLLFFAAVGS AALL GflWKPI KDL-NDPHIV EIGKFAVDEY NQR SKADLKLVKL EKGEQ QWSG
MeCPI-7 MVMD RVSALLLSVL VLGCGYCFDL
GHGRQLNLLR MRIP GDPSDC KGFQNSVEIE SLARFAVQEH NKK QNALLEFVRV LKVKE QWAG
MeCPI-4 MATL GOVRDS QCAANSVEIN ALGRFAVDEH NKK E —AKE QWAG
MeCPI-3 MQRHFPPSSS SFSSLLFLLS LVSLSHSFAI GSSAFCRE-E MTTL GtVHDS PDASNTVEID DLARFAVDEH NKK QNAVLEFARV VKAKE QWAG
MeCPI-6 MATL GOIKEV EGSANSVEID NLARFAVDDY NKK QNALLEFKRV VSTKQ QWAG
MeCPI-2 MAKV EQLLLLLLVP VFLLVSVSAR GGLL GOLQPV EDVKSNQQVQ ELGRFSITEF NKQLLNQANG G-EELIFSEV VEAKVpWRG
MeCPI-1 MAKV -MLPVLLLLS AFLLVST —IP GfllSPV QDVKNNKEVQ DLGRFCVEEF NRQLLQHSNG GGERLVFSEV VDALE QWAG
101 150 200

MeCPI-9 MNYRLILAVT EGKASKK—Y QAEVWEKA E NFKNLT-SFE PVKE
MeCPI-8 MNYRLILEVT EGKASKK—Y QAEVWEKA E NFKNLT-SFE PVKE
MeCPI-5 MNYRLILEAK DGQASKK—Y QAWWEKP G KSRNLT-SFV PVQG
MeCPI-7 KLYYLTLEAI DVGHKKW—Y EAKVWVKP T NFKQLE-EFK HAESDLS FTPSDLG VIQDDHGQGW QVMPTKDTEV RDAANHAVKF IQLVTIRTHT
MeCPI-4 TLHHLTIEAI EAGKKKL—Y EANVWVKP L NFKELQ-EFK HAGDVDA DGPGSGW KEVPAHDPAV QDAANHAVKT IQQRSNSLFL
MeCPI-3 TLHLLTIEAI EAGKKKL—Y EAKIWVKP L NFKELQ-EFK HAGDVDGSAG APSFTSSDLG VKRDGHGPGW KEVPADDPAV QDAANHAVKI IHQRSNSLFP
MeCPI-6 TMYYITLEVA DGGQTKV—Y EAKVWEKP L NFKEVQ-EFK PIGVAPSDST A
MeCPI-2 IMYYLKIEAT TKGSQETGIY DSKVATQP L HQRKLI-RFQ PSMDLRIRKS GK
MeCPI-1 VKYYLKIAAW SMENREMAIY DAQWSAP K YETGLLLSFQ PSVA
201 250
MeCPI-9
MeCPI-8
MeCPI-5
MeCPI-7 DPYSKS QDWHFWCKA L
MeCPI-4 —VGDDYAKF NMLLKVKRGS SEEKFKVEVH KKNEGTFLLN QMEPHA
MeCPI-3 YELKEIVCAK AEWDEHAKF DMLLKVKRGT SEEKYKVEVH KNNEGSFLLN QMEPHA
MeCPI-6
MeCPI-2
MeCPI-1
Fonte: Este estudo

111
Nas nove seqüências proteicas preditas para as fitocistatinas de mandioca,
juntamente com os motivos proteicos encontrados, sugere que elas possuem a
capacidade de atuar nos processos biológicos, tais como, como reguladores da
proteólise durante a maturação e germinação das sementes (LEPELLEY et al., 2012), e
/ou durante a morte celular programada (PIROVANI et al., 2010; DIAZ MENDOZA et
al., 2014), e/ou contribuir para a defesa das plantas pela inibição de proteases exógenas
de insetos, nematódeos, fungos, oomicetos e bactérias (BENCHABANE et al., 2010;
WAR et al., 2012; PANDEY et al., 2016; ZUST E AGRAWA; 2017). Já que se
observou nas nove seqüências de aminoácidos preditas para as PhyCys de mandioca,
uma ou duas Glicina (G) na parte amino-terminal da molécula e o site reativo QxVxG
localizado na parte central. Quanto ao triptofano (W) conservado na porção Carboxi-
terminal, este está ausente nas MeCPI-4 e MeCPI-5 (Figura 2) e presente nas demais.
O motivo LARFAV apresenta substituições relacionadas em todos os
aminoácidos. As alterações observadas no motivo LARFAV-Like das fitocistatinas de
mandioca também foram observadas quando se comparou as famílias de genes de
Arabdopsis, Arroz e cevada (MARTINEZ et a/., 2005a). Uma vez que substituições no
motivo Larfav-like são comuns e sempre se observa a seqüência conservada [LVI] -
[AGI] - [RKE] - [FY] - [AS] - [VI] (BENCHABANE et al., 2010).
Ao analisar a possível localização subcelular das predita para as fitocistatinas de
mandioca, três isoforma, estão predidas para atuarem no interior da célula, enquanto que
as outras seis isoformas, provavelmente são exportadas para fora da célula (Tabela 1.).
Indicando assim possível potencial das isoformas exportadas para o meio extracelular
estar envolvidas na inibição de proteases secretadas por patógenos e as restritas ao
citoplasma desenvolver atividades relacionadas a processos endógenos
Análises das seqüências de aminoácidos permitiram predizer a massa molecular
e o ponto isoelétrico das seqüências obtidas, e estes variaram de 12 a 26 KDa. A maioria
das PhyCys tem uma massa molecular entre 12-16-KDa, porém já foram descritas
PhyCys com massa molecular estimada superior como a de soja (26 KDa), morango
(26,39 KDa), TcCYS4 de cacao (22,84 KDa) e inhame (29 KDa). A diferença se deve
ao fato destas PhyCys possuírem uma extremidade Carboxi-terminal mais longa
(MARTINEZ et al., 2005b; PIROVANI et al., 2010).
A descoberta de fitocistatinas com seqüências maiores levou a uma
diferenciação destes genes, os mesmos são conhecidos como fitocistatinas carboxi-

112
estendidas (MARTINEZ et ai, 2005b; MARGIS-PINHEIRO et ai, 2008). Alguns
inibidores carboxi-estendidos possuem dois domínios principais, neste caso, o primeiro
deles é o domínio cistatina, localizado na parte amino-terminal da proteína. O segundo
domínio, na região carboxi-terminal é um domínio similar a cistatina, mas que de fato,
não possui similaridade de seqüência com as cistatinas, ao invés disto, em alguns casos
ele possui o domínio SNSL conservado (BENCHABANE et al., 2010).
Estudos anteriores propõem que a região carboxi terminal das fitocistatinas do
grupo II podem ter possíveis papeis: (1) A região C-terminal de fitocistatina de inhame
(CeCPI) mostrou uma baixa capacidade de inibir Papaína (WANG et al., 2008); (2) um
domininio SNSL na região C-terminal de uma fitocistatina de cevada (HvCPI-4)
mostrou atividade inibitória contra legumaina (MARTINEZ et al., 2007).
A análise de modelagem tridimensional realizada com a fitocistatina carboxi-
estendida de mandioca, MeCPI-3 e MeCPI-4, demonstram que a estrutura desta proteína
têm duas regiões principais separadas espacialmente em dois lobos, de acordo com os
domínios inibitórios preditos (Figura 3.). A extensão carboxi-terminal encontrada nas
seqüências MeCPI-3 e MeCPI-4 sugeri que essas duas proteínas pertencem ao grupo II
de fitocistatinas e que estas podem ser um inibidor bifuncional de proteases cisteínicas
em mandioca, atuando sobre proteases do tipo papaína (CIA) com a região amino-
terminal, e também sobre legumaínas (Cl3) com o domínio carboxi-terminal.
Figura 3. Modelo estrutural das fitocistatina da mandioca. As setas indicam o domínio cistatina. o qual é
formado por três motivos proteicos conservados: um resíduo de glicina na região amino-terminal; o
motivo QxVxG; e um triptofano (PW) na região carboxi-terminal. sendo que. estes dois últimos motivos
estruturais localizam-se no primeiro e segundo loops entre as folhas-f da estrutura terciãria.
McCPI-1 McCPI-2 McCPI-3 MeCPI-4 McCPI-5
MeCPI-6 MeCPI-7 MeCPl-S MeCPI-9

Fonte: Este estudo
113
Enquanto que as análises de modelagem tridimensional realizadas com a
fitocistatina carboxi-estendida de mandioca, MeCPI-7, demonstram que a estrutura
desta proteína têm uma única região, de acordo com os domínios inibitórios preditos
(Figura 4.). Esta por sua vez pode ser um inibidor de proteases cisteínicas em mandioca,
pertencentes ao grupo II, demonstrando assim potencial para atuar sobre proteases do
tipo papaína (CIA). Estrutura similar já foi descrita para uma fitocistatina de inhame
(CeCPI) (WANG et al., 2008).
Nas famílias de genes de Fitocistatinas de plantas dicotiledôneas geralmente se
observa duas proteínas carboxi-extendidas, conforme encontrado no genoma de Populus
trichocarpa (MARGIS-PINHEIRO et a/., 2008), Arahdopsis thaliana (MARTINEZ et
a/., 2005a), Theobrama cacao (PIROVANI et ai, 2010) e também no genoma de
Manihot esculenla neste estudo. Em contrapartida nas monocotiledôneas geralmente se
encontra apenas uma proteína carboxi-extendida como observado em Oryza saliva e
Hordeum vulgare (MARTINEZ et aí., 2005a).
A análise filogenética permitiu-nos identificar quatro fitocistatinas (Figura 4.)
que se agrupam com fitocitastinas de cacao, seringueira e inhame, estas já foram
identificadas com potencial para inibir o crescimento de patógenos de plantas />? vitro
(PIROVANI et al., 2010; BANGRAK e CHOTIGEAT, 2011) e in vivo (SANTANA et
al., 2014), portanto, estas fitocistinas podem desempenhar papel semelhante. Podendo
contribuir para obtenção de acessos resistentes a insetos, ácaros e microrganismos.
Dentre os microrganismos que causa graves prejuízos na mandiocultura no
estado do Pará se observa o oomiceto Phytophythium sp., causador da podridão
radicular nas raízes de mandioca. Uma fitocistatina de mandioca foi identifica por
Reilly et al. (2007) como dow-regulated em raízes após a colheita em processo de
deterioração pós colheita acesso número DT883603 e este mesmo gene teve sua
expressão superior em raízes de mandioca infectadas por Phytophytium sp. demostrando
potencial no mecanismo de defesa da planta. O gene denominado neste estudo por
MeCPI-5 tem 100% de similaridade com o acesso DT883603, sendo este portanto um
candidato a estudos que visem identificar o papel deste em inibir o crescimento de
patógenos. Fitocistatina isolada de Seringueira já demostrou ter potencial para inibir in
vitro o oomiceto Phytophthora palmivora (BANGRAK e CHOTIGEAT, 2011),
reforçando o potencial das fitocistatinas podem desempenhar sobre o oomiceto
Phytophythium sp.
114
Figura 4. Análise filogenética de cistatinas vegetais (destacado em rosa) e animais (destacados em azul). (A) Análises evolutivas foi realizada usando o software Molecular
Evolutionly Genetics Analysis (MEGA). versão 7.0 (. usando o método Neighbor-Joining.. A porcentagem de árvores replicadas em que os taxons associados agrupados no
teste bootstrap (10000 replicacas) são mostrados ao lado dos ramos. As seqüências utilizadas para comparação com as fitocistatinas de Manihot esculenta foram: Anolis
carolinensis ( número de acesso - XM_003220026.3). Crotalus horridus ( número de acesso - GBKC01000883.1). Theobroma cacao (TcCYS - Número de Acesso
KM361432 ; TcCYS 2 - Número de Acesso KM361433; TcCYS 3 - Número de Acesso KM361434 e TcCYS 4 - Número de Acesso KM361435). Colocasia esculenta
(CeCPI - Número de Acesso AF525880) e Hevea brasiliensis ( HbCPI - Número de Acesso FJ850964). (B) Alinhamento esquemático das seqüências de aminoácidos
deduzidas caixa verde escura destacandoo resíduo G / GG na seqüência N-terminal. o motivo semelhante a LARFAV. uma região conservada encontrada em todos os PhyCys.
a seqüência QXVXG na parte central e a seqüência P / W / PW na extremidade C-terminal. A caixa verde claro representa extremidade C-terminal de PhyCys do grapo 2 e o
domínio SNSL está destacado. O pepüdeo sinal previsto (SP) é indicado na caixa vermelha.
| cassava | MeCPI-3
O Taro □ MeCPI-4
■ A TCCYS-4 ■ "TflBFÃÜ- QVVflG PW
A Cocoo
m/\ TcCYS-2
Rubber látex
O CeCPI
_□ MeCPI-6
O HbCPI
■A TcCYS-1
./\ TcCYS-3 [ GG LARFAV QVVSG PW ■
. S MeCPI-7 I G LARFAV QVVAG PW 1
*□ MeCPI-5 GG IGKFAV QWSG P ■
□ MeCPI-9 [ GG IGEYAV QVVSG W m
■ □ MeCPI-8 [ GG IGEYAV QVVSG W m
■ □ MeCPI-2
.■ MeCPI-1
' Q C. horridus
■ V A. carolinensis E
V Anolis Verde ( [Wald-Klapperschlanfie
B
Fonte: Este estudo

115
A organização genômica das fitocitatinas de mandioca é bastante variável e está de
acordo com o relatado para outras espécies estudas tais como Arabidopsis e arroz
Comparando-se o padrão encontrado neste estudo com cistatinas de outras vegetais
observamos que quatro não apresentam íntron, assim como observado em oito seqüências de
arroz (OC-IV a XI), duas seqüências de Arabidopsis (AtCYS-4 e AtCYS-5). O padrão
observado para as seqüências MeCPI-3 e MeCPI-4, com quatro éxons e três íntrons é o
mesmo observado para uma proteína de arroz (OC-XII) e duas de Arabidopsis (AtCYS-6 e
AtCYS-7). O padrão da seqüência MeCPI-7 com três éxons e dois íntrons não foi observado
em arroz e em Arabidopsis. O padrão observado para MeCPI-6 com um intron e dois exóns é
o mesmo observado para três proteínas de arroz (OC-I, OC-II e OC-III) e três de Arabidopsis
(AtCYS-1, AtCYS-2 e AtCYS-3) (MARTINEZ et al., 2005a) (Figura 5). Nas seqüências de
mandioca que apresentam íntron podemos observar que o primeiro íntron está localizado entre
o motivo conservado LARFAV e o sítio ativo QXVXG, e os demais após este sítio, este
padrão também foi observado em arroz, Arabidopsis e cevada (MARTINEZ, et al., 2005a)
morango (MARTINEZ, et al., 2005b) e seringueira (BANGRAK e CHOTIGEAT, 2011).
Figura 5. Organização genômica dos genes de cistatinas de mandioca. Os éxon são indicados pelos boxes e os
íntrons pelas linhas. O tamanho dos íntrons estão informados abaixo da linhas em pares de bases (pb). O motivo
LARFAV e os três motivos envolvidos na interação com suas proteinases alvo (um G próximo a região N-
terminal N. motivo QxVxG no loop central e um W conservado na região C-terminal) são representados nos
boxes hachurados e pretos, respectivamente. Também é mostrado o domínio SNSL encontrado na extremidade
C-terminal de PhyCys do grupo 2 indicado pelas caixas cinza.
Nome do N0 de
Predição da estrutura da sequeneia genômica
gene Aminoácidos
MeCPI-l 122
MeCPI-2 134
MeCPI-3 190pb 245

88 pb 553 pb
MeCPI-4 115pb 167
llbpb 5uypb
MeCPI-5 111
MeCPI-6 101
323 pb
MeCPI-l 6388 pb 195
497 pb
MeCPI-Z 111
MeCPI-9 111
Fonte: Este estudo
116
6.4 Conclusões
-Família de fitocistatinas da mandioca possui 9 isoforma, nas quais foram possíveis identificar
as regiões conservadas características desta família.
- Dos nove genes analisados três pssuem localização predita para o interior da célula enquanto
seis são provavelmente extracelulares, podendo assim atuar contra proteases de patógeno.
- A análise da estrutura tridimensional preditas para as fitocistatinas de mandioca revelam que
duas proteínas podem atuar na inibição de papaína e legumainas e as outras sete possuem
apenas atividade inibitória de papaínas.
- A análise da organização genômica permite concluir que cinco seqüências não possuem
introns e que quatro possuem e dentre as que possuem o primeiro intron está localizado senpre
entre os motivos LARFAV e QxVxG.
- A análise das seqüências indicam que estas podem atuar em diferentes processos celulares,
inclusive nos mecanismos de defesa contra o ataque de patógenos já demonstrado para
PnCPI-5, indicando a necessidade de conhecer suas atividades enzimáticas e biológicas.

117
Referências
ABE, K.; EMORI,Y.; KONDO, H.; SUZUKI, K.; ARAI, S. Molecular cloning of a cysteine
proteinase inhibitor of rice (oryzacystatin). Homology with animal cystatins and transient
expression in the ripening process of rice seeds. Journal Bíologícal Chemistry, v. 262, p.
16793 - 16797, 1987.
ALTSCHUL, S. F.; MADDEN, T. L.; SCHA FFER, A. A.; ZHANG, J.; ZHANG, Z.;
MILLER, W.; LIPMAN, D. J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein
database search programs. Nucleic Acids Research, v. 25, n. 17, p. 3389-3402, 1997.
BANGRAK, P.; CHOTIGEAT,W. Molecular cloning and biochemical characterization of a

novel cystatin from Hevea rubber látex. Plant Physiology Biochemistry, v. 49, p. 244-250,
2011.
BENCHABANE, M.; SCHLÜTER, U.; VORSTER, J.; GOULET, M. C.; MICHAUD, D.

Plant cystatins. Biochimie, v. 92, n. 11, p. 1657-1666, 2010.
BOARI, A. J., QUADROS, A. F. F., CUNHA, E. M., FERNANDES, A. F., & BARRETO, R.
W. First report of Phytopythium sp. causing storage root rot and foliage blight of cassava in
Brazil. Plant Disease, https://doi.org/10.1094/PDIS-09-17-1449-PDN, 2018.
BRIESEMEISTER, S.; BLUM, T.; BRADY, S.; LAM, Y; KOHLBACHER, O.; SHATKAY,
H. SherLoc2: a high-accuracy hybrid method for predicting subcellular localization of
proteins. Journal of proteome research, v. 8, p. 11, p. 5363-5366, 2009.
DÍAZ-MENDOZA, M.; VELASCO-ARROYO, B.; GONZALEZ-MELENDI, P;

MARTINEZ, M.; DIAZ, I. CIA cysteine protease-cystatin interactions in leaf senescence.
Journal Experimental. Botany, v. 65, p. 3825-3833, 2014.
FOSSUM, K.; WHITAKER, J. R. Ficin and Papain from Chicken Egg White. Archives of
Biochemistry and Biophysics, v. 125, p. 367-375, 1968.
HUNTER, S.; APWEILER, R.; ATTWOOD, T. K.; BAIROCH, A.; BATEMAN, A.; BINNS,
D.; ... FINN, R. D. InterPro: the integrative protein signature database. Nucleic acids
research, v. 37(suppl_l), D211-D215, 2008.
KUMAR, S.; STECHER, G.; TAMURA, K. MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics

Analysis version 7.0 for bigger datasets. Molecular hiology and evolution, v.33, n. 7, p.
1870-1874,2016.
LEPELLEY, M.; AMOR, M. BEM; MARTINEAU, N; CHEMINADE, G.; CAILLET, V.;

MCCARTHY, J. Coffee cysteine proteinases and related inhibitors with high expression
during grain maturation and germination. BMC Plant Biology, v.12, n. 31, 2012.
LIMA, A. M.; dos REIS, S. P.; de SOUZA, C. R. Phytocystatins and their potential to control
plant diseases caused by fungi. Protein Peptied Letters, v. 22, n. 2, p. 104-111, 2015.
118
MARCHLER-BAUER, A.; LU, S.; ANDERSON, J. B.; CHITSAZ, F.; DERBYSEQRE, M.

K.; DEWEESE-SCOTT, C.; ... GWADZ, M. CDD: a Conserved Domain Database for the
functional annotation of proteins. Nucleic acids research, v. 39(suppl_l), D225-D229, 2010.
MARGIS-PINHEIRO, M.; ZOLET, A. C. T.; LOSS, G; PASQUALI, G; MARGIS, R.

Molecular evolution and diversification of plant cysteine proteinase inhibitors: new insights
after the poplar genome. Molecular phylogenetics and evolution, v. 49, n. 1, p. 349-355,
2008.
MARTINEZ, M.; ABRAHAM, Z.; CARBONERO, P.; DIAZ, I. Comparative phylogenetic

analysis of cystatin gene families from arabidopsis, rice and barley. Molecular Genetics and
Genomics v. 273, p. 423-432, 2005a.
MARTINEZ, M.; ABRAHAM, Z.; GAMBARDELLA, M.; ECHAIDE, M.; CARBONERO,

P.; DIAZ, I. The strawberry gene Cyfl encodes a phytocystatin with antifungal properties.
Journal of Experimental Botany, v. 56, p. 1821-1829. 2005b.
MARTINEZ, M.; DIAZ, I. The origin and evolution of plant cystatins and their target
cysteine proteinases indicate a complex functional relationship. BMC Evolotionary Biology,
v. 8, doi: 10.1186/1471-2148-8-198, 2008.
MARTÍNEZ, M.; DIAZ-MENDOZA, M.; CARRILLO, L.; DÍAZ, I. Carboxy terminal

extended phytocystatins are bifunctional inhibitors of papain and legumain cysteine
proteinases. FEBS Letters, v. 581, p. 2914-2918, 2007.
MARTINEZ, M.; CAMBRA, T; CARRILLO, L.; DIAZ-MENDOZA, M.; DIAZ, I.

Characterization of the entire cystatin gene family in barley and their target cathepsin L-like
cysteine-proteases, partners in the hordein mobilization during seed germination. Plant
Physiology,v. 151, p. 1531-1545, 2009.
NIELSEN, H.; KROGH, A. Prediction of signal peptides and signal anchors by a hidden
Markov model. Proc Int Conf Intell Syst. Molecular Biology, v. 6, p. 122-130, 1998.
PANDEY, D.; RAJENDRAN, S. R. C. K.; GAUR, M.; SAJEESH, P. K.; RUMAR, A. Plant
defense signaling and responses against necrotrophic fungai pathogens. Journal of Plant
Growth Regulatíon, v. 35, n. 4, p. 1159-1174, 2016.
PIROVANI, C.P.; SANTIAGO, A.S.; SANTOS, L.S.; MICHELI, F.; MARGIS, R;

GESTEIRA, A.S.; ALVIM, F.C.; PEREIRA, G.A.G.; CASCARDO, J.C.M. Theobroma
cacao cystatins impair Moniliophthora perniciosa mycelial growth and are involved in
postponing cell death symptoms. Planta, v. 232, p. 1485-1497, 2010.
RAWLINGS, N.D.; BARRETT, A.J.; FINN, R.D.; Twenty years of the MEROPS database of
proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors. Nucleic Acids Research, v. 44, D343-
D350, 2016.
REILLY, K.; BERNAL, D.; CORTÊS, D. F.; GÓMEZ-VÁSQUEZ, R; TOHME, J.;

BEECHING, J. R. Towards identifying the full set of genes expressed during cassava post-
harvest physiological deterioration. Plant Molecular Biology, v. 64, p. 187-203, 2007.
119
ROMBEL, I. T.; SYKES, K. F.; RAYNER, S.; JOHNSTON, S. A. ORF-FINDER: a vector

for high-throughput gene identification. Gene, v. 282, n. 1, p. 33-41, 2002.
SANTANA, L. S.; COSTA, M.; PIROVANI, N. M.; ALMEIDA, A. F.; AL VIM, F. C.;
PIROVANI, C. P. TcCYS4, a cystatin from cocoa, reduces necrosis triggered by MpNEP2 in
tobacco plants. Genetic Molecular Research, v. 13, n. 3, p. 7636-48, 2014.
THOMPSON, J. D.; HIGGINS, D. G; GIBSON, T. J. CLUSTAL W: improving the

sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-
specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, v. 22, p. 4673-
4680, 1994.
WANG, K. M.; KUMAR, S.; CHENG, Y. S.; VENKATAGIRI, S.; YANG, A. H.; YEH, K.
W. Characterization of inhibitory mechanism and antifungal activity between group- 1 and
group- 2 phytocystatins from taro (Colocasia esculenta). The FEBS journal, v. 275, n. 20, p.
4980-4989, 2008.
WAR, A. R.; PAULRAJ, MG; BUHROO, A. A.; AHMAD, T.; HUSSAIN, B.;
IGNACIMUTHU, S.; SHARMA, H. C. Mechanisms of plant defense against insect
herbivores. Plant Signal Behav v. 7, n. 10, p. 1306-1320 , 2012.
ZUST, T.; AGRAWAL, A. A. Trade-Offs Between Plant Growth and Defense Against Insect
Herbivory: An Emerging Mechanistic Synthesis. Annual Review Plant Biology, v. 68, p.
10.1-10.22,2017.
VIEIRA, E. A.; FIALHO, J. F.; FALEIRO, F. G; BELLON, G. SILVA, M. S. Caracterização

molecular de acessos de mandioca biofortificados com potencial de uso no melhoramento
genético. Revista Ciência Agronômica, v. 42, n. 2, p. 457-463, 2011.
120
CONCLUSÕES GERAIS
- Foi possível identificar nove genes na literatura de proteínas efetoras potencialmente
envolvidas na resposta de Manihot esculenta Crantz ao patógeno Phytopythhim sp. Dos nove
genes identificados sete tem potencial para contribuir no melhoramento genético de mandioca
para no futuro se obter acessos resistentes.
- A revisão da literatura indica que as Fitocistatinas possuem potencial no controle de doenças
de plantas causadas por fungos.
- A família de fitocistatinas de mandioca possuem nove isoformas, distribuídas em 7
cromossomos e todas as seqüências identificadas possuem as regiões conservadas
características desta família. Destacando o potencial delas no controle de doenças tais como
na resposta d a mandioca ao patógeno Phytopythium sp.
- O método de propagação rápida da mandioca foi adaptado as condições de Belém e permitiu
obter mudas em quantidade e qualidade suficiente para realizar estudos que visem elucidar os
mecanismos de resposta da mandioca ao patógeno Phytopythium sp.
- A inoculação utilizando solo infestado com areia e fubá foi eficiente para reproduzir em
condições controlada o ataque do patógeno Phytopythium sp. em raízes de mandioca
tuberosas, não se observando sintomas em raízes adventícias.

121
ANEXOS
122
ANEXO I
ARTIGO CIENTÍFICO PUBLICADO
MOLECULAR CLONING AND CHARACTERIZATION OF A CASSAVA

TRANSLATIONALLY CONTROLLED TUMOR PROTEIN GENE POTENTIALLY
RELATED TO SALT STRESS RESPONSE
123
Mol Biol Rep (2014) 41:1787-1797

DOl 10.1007/s 11033-014-3028-6
Molecular cloning and characterization of a cassava

translationally controlled tumor protein gene potentially
related to salt stress response
Ailton Borges Santa Brígkla • Sávio Pinho dos Reis •

Carinne de Nazaré Monteiro Costa • Cristina Michiko Yokoyama Cardoso •
Aline Medeiros Lima ■ Cláudia Regina Batista de Souza
Recdved: 6 January 2013 / Accepted: 3 January 2014/Published online: 12 January 2014

© Springer Sdence+Business Media Dordreeht 2014
Abstract Cassava (Manihot esculenta Crantz) is one of abiotic factors affecting the production of crops worldwide,
lhe mosl imporiam tropical crops showing lolerance to lhe MeTCTP gene could be a candidate gene for generation
abiotic stress and adaptations to a wide range of environ- of salt toleram crops.
mental conditions. Here, we aimed to isolate and charac-
terize the full-length cDNA and genomic sequences of a Keywords Cassava ■ TCTP Abiotic stress ■ Salt stress
cassava translationally controlled tumor protein gene response ■ Gene expression ■ Heteroíogous expression in
(MeTCTP), and evaluate its potential role in response lo bactéria Semi-quantitative RT-PCR
salt stress. The MeTCTP full-length cDNA sequence
encodes for a deduced protein with 168 amino acid re.si-
dues, with theoretical isoelectric point and molecular Introduction
weight of 4,53 and 19 kDa, respectively, containing two
putative signatures of TCTP family and one site for Translationally controlled tumor protein (TCTP) was firstly
myristoylation, The MeTCTP genomic sequence includes described as a protein related to growth in many tumoral
four introns and five exons within a 1,643 bp coding cells, when their mRNAs are stored as mRNA/protein
region, and a 264 bp partial promoter sequence containing complexes translationally inactive-niRNP [1],
severa] putative m-acting regulatory elements, among Despite TCTP was firstly identified in mouse sarcoma
them, two putative GT-! motifs, which may be related to ascites cells [1 ], it is not a tumor-specific protein, being also
response to sodium chioride (NaCl) and pathogen infec- found in normal cells and widely expressed in eukaryotes [2-
tion. Semi-quantitative RT-PCR assays showed that MeT- 6], Also, it is known that TCTP expression is regulated at both
CTP transcripts were higher in roots than leaves, and were the transcriptional and translational leveis [4, 7J. Neverthe-
significantly increased in detached leaves treated with less, there is no description of this gene in prokaryotes [8].
NaCl. Furthermore, the recombinant MeTCTP conferred a Most studies have reported that TCTP is related to
protective fiinction against salt stress in bacterial cells. We proliferation and growth cell, since it is found to be highly
report for the first time lhe molecular cloning and charac- expressed in proliferating and physiologically active tis-
terization of a cassava TCTP with potential role in salt- sues [3, 9, 10J. TCTP is a key component of the TOR
stress response. Since salinity is one the most importam signaling pathway (target of rapamycin), an importam
growth regulator in animais, fungi and plants [11-13].
Studies show that among the molecular funetions of TCTP,
Fdectronic supplementary material The online version of ihis it is a calcium-binding protein [7, 14] and also a lubulin-
article {doi:10.1007/sl 1033-014-3028-6) eontains supplementary
material, which is availabte to authorized users. binding protein that associates with microtubules [15],
There are few studies reported in plant TCTPs in com-
A. B, Santa Brígida ■ S. P. dos Reis • C. de Nazaré Monteiro parison to animal TCTPs. Some authors have reported
Costa ■ C. M. Y. Cardoso ■ A. M. Lima ■ C. R. B. de Souza (El) changes in TCTP transcript or protein leveis under various
Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará,
Guamá, Belém. PA 66075-110, Brazil environmental conditions, such as darkness [16], toxic
e-maü: bsouza@ufpa.br aluminum stress [17], water déficit and salinity [18, 19],
ô Springer
124
ANEXO II
ARTIGO CIENTÍFICO PUBLICADO
ENDOPHYTIC BACTÉRIA FROM Piper tuherculatum Jacq.: ISOLATION,

MOLECULAR CHARACTERIZATION, AND IN VITRO SCREENING FOR THE
CONTROL OF Fusariam solani f. sp piperis, THE CAUSAL AGENT OF ROOT ROT
DISEASE IN BLACK PEPPER {Piper nigrum L.).
Endophytic bactéria from Piper tuberculatum
Jacq.: isolation, molecular characterization,
and in vitro screening for the control of
Fusarium solani f. sp piperis, the
causai agent of root rot disease in
black pepper {Piper nigrum L.)
S.B. Nascimento1, A.M. Lima1'2'3, B.N. Borges4 and C.R.B. de Souza1
instituto de Ciências Biológicas. Universidade Federal do

Pará. Belém. PA. Brasil
2
"Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia
Molecular. Belém. PA. Brasil
Programa de Pós-Graduação em Agronomia.
Universidade Federal Rural da Amazônia. Belém. PA.
4
Brasil Instituto Socioambiental e dos Recursos Hídricos.
Universidade Federal do Pará. Belém. PA. Brasil
Corresponding author: C.R.B. de Souza

E-mail: bsouzaíSiufpa.br
Genet. Mol. Res. 14 (3): 7567-7577 (2015)

Received April 1. 2015
Accepted May 26. 2015
Published July 3. 2015
DOI http://dx.doi.Org/10.4238/2015.July.3.32
ABSTRACT. Endophytic bactéria have been found to colonize

internai tissues in many different plants, where they can have several
beneficiai effects, including defense against pathogens. In this study,
we aimed to identify endophytic bactéria associated with roots of the
tropical piperaceae Piper tuberculatum, which is known for its
Genetics and Molecular Research 14 (3): 7567-7577 (2015) ©FUNPEC-RP www.funpecrp.com.br

126
ANEXO III
CAPÍTULO DE LIVRO PUBLICADO
GENES REGULATED IN PLANTS UNDER SALT STRESS

127
Molecular Àpproaches
ín Plant Abiotic Stress
Edtlors
R.K. Caur and Pradeep SKarraa
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129
ANEXO IV
ADVANCES IN MOLECULAR CLONING DIRECTING THE PRODUCTION

OF PLANT PROTEINS AND THEIR APPLICATIONS IN PATHOGENS
CONTROL
130
In: Advauces in Genetics Research. Volume 11 ISBN: 978-1-62948-744-1

Editor: Kevin V. Urbano ©2014 Nova Science Publishers, Inc.
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conncction with or arising out of infonnation contained hcrcin. This digital documenl is sold
with the clear understanding that the publisher ís not engaged in rendering legal, medicai or
any other professional services.
Chapter 3
Advances in Molecular Cloning
Directing the Production of Plant
Proteins and their Applications in
Pathogens Control
Liliane Souza Conceição Tavares, Sávio Pinho dos Reis,

Diehgo Tuloza da Silva, Aline Medeiros Lima
and Cláudia Regina Batista de Souza*
Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará, Belém-PA, Brazil
Abstract
Plants are frequently exposed to adverse conditions that affects the crop production.
mainly when are submitted to pathogens attack such as vírus, bacterial or fungai. Like
animais, plants have au iuuate immuuity system composed by two defense layers at
cellular and molecular levei against patliogens attack. The first layer of the immune
system is composed by extracellular surface receptors. Tliese are transmembrane
receptors or patteni recognition receptors (PRR s) that recognize pathogen-associated
molecular patfems (PAMPs). When the pathogens overcome the first layer, the second
layer is activated. composed by genes that encode resistance proteins which recognize
highly variable pathogeu molecules called avirulence (Avr) effectors. Other molecules
involved in defense against pathogen are vegetabie proteins, such as lectins, peroxidases
and Pathogenesis-Related proteins (PRs). Ali these biomolecules are of great
biotechnological iuterest in plants breeding program. The molecular cloning allows us to
study them deeply. by providing pure samples of genes that cau be expressed later. It is
possible due to rapid growtli of bacterial, producing large amounts of identical DNA
fragments wliich alone have no capacity to reproduce themselves. Once a gene has beeu
cloned there is a lot of infonnation that can be obtained about the structme and the
expression of that gene, The popularization of cloned fragments has stiraulated the
improvement of methods for studyíug genes, with new approaches being used along the
* Correspondíng author: bsouza@ufra.br.

ANEXO V
PLANT MOLECULAR ADAPTATIONS AND STRATEGIES UNDER

DROUGHT SERESS
132
CluptLT 4
Ptant Molecular Adaptations
and Stratcgics Undcr Drought Strcss
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hni: I: nv lhe pruduLlL^riy af ltljh-. E:LuiJii;mkTiu. j:- jh Aspacl. útluuIiL

injLTUJNÍn^ly in ;l mliciim->11 ijF m-críty in nuriv i?ckids lí lhe n^jrld 111.
TKu!-, Lil di;\cliypmcnl uF lhijin kik~inl 1u drciuchl vi II he .■iLcniJiLJiilly jJv jciIí-
ecous in TíciíhfL-: ■lIilti KULh .-itre.ís I iy:qii^ nl K i&ÉÈt±,
^tic.íN b joi ^.IIlTllI [ikvi-iiJLgicjl l'> ■iilIiLi> >11 rJUNCii hy fuiilcira L:i;il kn:l Io Jihru[i|
Ike aquiLihniim jji üreuDÍNm. In pIjnlK. L:il wjkr deluiil ljuíiíJ by úmuubL
iuiJijlijn giriwLh jnii JuvclupcnenL jriKÍnu fmm. ibr red.iK:lii]c <if wata ociiikril.
dinirui-licd l»r vi^-Ilt piilenli^l ^nJ Lurîr Ilis-k, cktíuiv uf kIuiiiuLl und ikvreuNL lh
cell fnbaTcincnl unii çruvi-lJi ^Fi^. -1.1a] [-1- Olber cIEllL-- íiF diviuchLlkjfl Eimrl plunl
çmwlh jnii L-rif pri^üjcliviEy in.-lu.li: Ihr rviiuLLiLin dí pkjcibciín-crlhí.-iL-i. n--i:ii>:iL
TtirrTT-krymrH ma-itrînt ou [ilanl pjikcí-kc!-. unii inLíTlnen^c wilh Tiulrienl
afvijilijbikly Jt LIL M:>: I JIILT- | :< |.
£_P. Júi iULi. ■ EkH. Mjil^, ■ A-Ü. Jjílu ■ f* h i iFÍ i

linlilul.i li." CUnelu Rinlüf 1..E1. C I-IIÜCI J do FuríL
Htlníi PA Mínt-1 lUL &IUII
CHILIJ: buuvufiilphi.br
£_H. Jlh iUL.
Uriiv-ífpjluJí -ik- bj-Juiki ilu Háij. PA «ÉlCd-lXk. bnll
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PEMiruilU li- IWLi.uJujLáll L-IM ( ÍL-jif I.U L- Biulupm M.llci-_Ll.
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AM. Uru.
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Ki_iáJ Já. .'uiuViirux. fc'™. PA ÉtóTl-UÜ, Hi jjjI
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JVl.A- EkEVuUH l-l j|. ■.-íl]:■. ■- r■,.1 iV.-rj:nI .'li'.1 C-I-i rilhirjihr f III Piunliu. '■ 'l11' 1.
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Tese - Podridão Radicular Da Mandioca Causada Por Phytopythium Sp.... o

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Tese - Podridão Radicular Da Mandioca Causada Por Phytopythium Sp.... o

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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DA AMAZÔNIA - UFRA

ALINE MEDEIROS LIMA

PODRIDÃO RADICULAR DA MANDIOCA CAUSADA POR Phytopythium sp.

PODRIDÃO RADICULAR DA MANDIOCA CAUSADA POR Phytopythium sp.:

Tese apresentada à Universidade Federal Rural da

Orientadora: Prof.a Dr.a Claúdia R. Batista de Souza

Co-orientadora: Dr.a Elisa Ferreira Moura Cunha

Podridão radicular da mandioca causada por Phytopythium sp.:

Tese (Doutorado em Agronomia / Área de Concentração Agronomi

1. Manihot esculenta 2. Phytophytium sp 3. Expressão

PODRIDÃO RADICULAR DA MANDIOCA CAUSADA POR Phytopythium sp.:

Aprovado em 20 de dezembro de 2017.

Prof. Dr1, Cláudia Regina Batista de Souza - Orientadora

Prof. Dr. Sávio Pinho dos Reis - Io Examinador

Dr. Roberto Lisboa Cunha - 2o Examinador

Prof. Dr. Hugo Alves Pinheiro - 3o Examinador

Prof.3 Dr.a Gisele Barata da Silva - 4o Examinadora

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

Universidade Federal Rural da Amazônia - UFRA

Universidade Federal do Pará - UFPA

AmazcPnia Fundação Amazônia Paraense de Amparo a Pesquisa - FAPESPA

QCNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

Conselho Nadonal de Desenvolvimento CNPq

Programa de Pós Graduação em Agronomia - UFRA

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

- Agradeço primeiramente a Universidade Federal Rural da Amazônia que através do

Programa de Pós-Graduação em Agronomia proporcionou a realização de meu curso de

- Ao CNPq, FAPESPA, GOVERNO DO PARA e CAPES pelo financiamento do projeto de

pesquisa e bolsa de estudo.

eficiente e dedicada orientação durante todo o trabalho e aos professores componentes da

banca pela participação, atenção e valiosos comentários oferecidos na ocasião da pré-banca e

recebido, todos os ensinamentos e os momentos de incentivo compartilhando alegrias e

tristezas. Em especial aos amigos do Laboratório de Biologia Molecular e da Embrapa, que

estiveram comigo durante a realização deste trabalho.

E em especial a Deus por ter me concedido esta grande vitória.

A mandioca é um dos mais dinâmicos produtos da agricultura mundial, sendo cultivada em

onde o primeiro faz a contextualização geral, o segundo identificou genes relacionados à

da podridão radicular, o terceiro capítulo discutiu o potencial das fitocistatinas no controle de

silico e comparados filogeneticamentes com fitocistatinas de outras culturas. O quinto

capítulo trata de uma adaptação no método de propagação rápida da mandioca para a

os resultados visando realizar a inoculação do agente causador da podridão radicular das

raízes em plantas de mandioca. A adaptação do método de propagação rápida da mandioca foi

eficaz na produção de mudas para estudos em nível molecular da interação mandioca-

com Phytopythium sp.. A análise do genoma da mandioca resultou na identificação de nove

se tornam canditados para utilização em programas de melhoramento genético que visem o

combate a podridão radicular em mandioca causado ^ox Phytopythium sp.

Palavras chaves: Manihot escuíenla, Phytophytium sp, expressão diferencial, propagação

combating root rot in cassava caused by Phytopythium sp.

cassava, production of seedlings.

2. PROPAGAÇÃO RÁPIDA DE MANDIOCA PARA ESTUDOS EM CASA DE 32

2.2 Material e Métodos 37

2.3 Resultados e Discussão 38

3. PODRIDÃO RADICULAR DA MANDIOCA: METODOLOGIA DE 53

INOCULAÇÃO E DESENVOLVIMENTO DA DOENÇA

3.2 Material e Métodos 56

3.3 Resultados e Discussão 60

4. PADRÕES DIFERENCIAIS DE EXPRESSÃO GÊNICA EM RAÍZES DE 72

MANDIOCA INOCULADAS COM Phytopythium sp.

4.2 Material e Métodos 75

4.3 Resultados e Discussão 78

DISEASES CAUSED BY FUNGI

6. A FAMÍLIA DE GENES DE FITOCISTATINAS EM MANDIOCA: 104