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Pl. Sistema Evoluir 257: 119–127 (2006)

DOI 10.1007 / s00606-005-0375-8

Caracterização cariotípica de cinco espécies brasileiras de Echinodorus

(Alismataceae) com bandas cromossômicas e 45S rDNA FISH
JY Costa1,3, ER Forni-Martins1 , e TODOS Vanzela2

1
Departamento de Bot^anica, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP),
Campinas, SP Brazil
2
Departamento de Biologia Geral, Centro de Ci^encias Biolo´gicas, Universidade Estadual de Londrina
(UEL), Londrina, PR Brazil
3
Student from Programa de Po´s Graduac¸~ao em Biologia Vegetal, UNICAMP, Brazil

Recebido em 17 de março de 2005; aceito em 21 de agosto de 2005

Publicado on-line: 17 de janeiro de 2006
Springer Verlag 2006

Abstrato. Os cariótipos de cinco espécies brasileiras de gêneros, sendo Echinodorus e Sagittaria os

Echinodorus; E. bolivianus, E. grandiflorus, E. longipetalus, E.
macrophyllus e E. tenellus (Alismataceae); foram estudados
usando bandas C, bandas CMA3/DAPI e hibridização in situ de
fluorescência com uma sonda de rDNA 45S. Houve poucas
diferenças nas regiões ricas em GC das cinco espécies, mas
diferenças marcantes foram observadas no número e posição das
bandas C, regiões ricas em AT e sítios de rDNA 45S. No geral,
essas características foram espécie-específicas, com exceção de
E. bolivianus e E. tenellus, que foram muito semelhantes em todas
as características cariotípicas estudadas.
maiores e mais representativos. Com base em
uma análise filogenética combinada usando
principalmente a sequência rbcL, Judd et al.
(1999) estendeu a Alismataceae para incluir os
gêneros anteriormente agrupados na família Limnocharitaceae.
A unificação dessas duas famílias já havia sido
sugerida por Dahlgren e Clifford (1981) e é
apoiada por uma análise do tipo karyo de várias
espécies (Forni-Martins e Calligaris 2002, Costa
e Forni-Martins 2003). Atualmente, a Alismataceae
contém 16 gêneros e cerca de 100 espécies.

Palavras-chave: Plantas aquáticas, bandamento cromossômico,

Echinodorus, com 45 espécies, ainda é o
citotaxonomia, heterocromatina, heteromorfismo, hibridização in
mais representativo deste grupo e contém várias
situ.
espécies Neotropicais. Dezessete espécies de
Echinodorus ocorrem no Brasil (Haynes e Holm-
A família Alismataceae (Judd et al. 1999) Nielsen 1994), sendo seis delas no Estado de
consiste em ervas aquáticas e semi-aquáticas São Paulo (E. tenellus (Mart.) Buche nau, E.
que crescem em substratos lamacentos ou grandiflorus (Cham. & Schltdl.) Mic heli, E.
alagados e possuem folhas eretas ou flutuantes. longipetalus Micheli, E. macrophyllus (Kunth)
Os membros da família podem ser reconhecidos Micheli, E. aschersonianus Graebn. e E.
pela presença de laticíferos, placentação basal paniculatus Micheli) (MCE do Amaral,
e frutos que são principalmente aquênios (Judd comunicação pessoal). A maioria dessas
et al. 1999). Segundo Cronquist (1988), esta família contém 11tinha o número cromossômico de 2n=22 e uma forte
espécies
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120 JY Costa et al.: Caracterização cariotípica de espécies brasileiras de Echinodorus
cariótipo bimodal (Costa e Forni-Martins 2003), que
apresentou baixo índice de simetria devido à
predominância de cromossomos acrocêntricos. Costa
e Forni-Martins (2003) também encontraram alta
similaridade cariotípica entre os pares E.
aschersonianus – E. pubescens e E. grandiflorus – E.
macrophyllus.
Os dados de banda C e banda CMA3/DAPI foram
relatados apenas para E. tenellus (Costa e Forni-
Martins 2004), e incluem dois citótipos, um diploide
(2n=22) e um triploide (2n=33). O citótipo diplóide
apresentou uma região CMA+/DAPI+ , também
bandada por banda C, em um par de cromossomos
acrocêntrico heteromórfico. O citótipo triplóide que
apresentou duas bandas C/CMA+/DAPI+ , indicou
origem autopoliplóide para o citótipo triplóide.
Bandas C heteromórficas também foram
observadas em diferentes espécies de Alismataceae
(Kenton 1981) e algumas das bandas C também
foram associadas à região satélite (SAT) no braço
curto dos menores cromossomos acrocêntricos.
A hibridização in situ por fluorescência (FISH)
tem sido usada com sucesso para localizar sequências
de ácidos nucléicos no núcleo e cromossomos (Leitch
et al. 1994). Sequências da região do rDNA,
especialmente 5S e 45S, têm sido amplamente
utilizadas para analisar estruturas cromossômicas e
relações filogenéticas entre espécies (Tagashira e
Kondo 2001, Vanzela et al. 2002, Fregonezi et al.
2004).
Vanzela et ai. (2002) observaram que as espécies de
Helianthus (Asteraceae) diferiram não apenas no nível
de ploidia, mas também no número e posição das
regiões heterocromáticas, identificadas por
bandamento cromossômico, e no número e intensidade bandagem e FISH, as pontas das raízes foram digeridas
dos sinais de hibridização 45S rDNA. O último achado
sugeriu que rearranjos envolvendo pequenos
segmentos heterocromáticos e de rDNA
desempenharam um papel importante na evolução
cariotípica do
grupo.
As plantas aquáticas são amplamente
reconhecidas como um grupo biológico diversificado
com muitas características morfológicas convergentes
e extensa plasticidade fenotípica (Wooten 1986, Les e Philbrick
1993, Les e Haynes 1995). Além disso, a reprodução
assexuada via crescimento clonal e uma alta
vagilidade de propágulos vegetativos representam
um catalisador evolutivo significativo que permite a
perpetuação de descendentes híbridos e variantes
citotípicas anômalas (Les e Philbrick 1993). Juntos,
esses caracteres representam muitos problemas para
os taxonomistas tradicionais e dificultam o
discernimento da plasticidade fenotípica em indivíduos
híbridos ou variantes citotípicas. Especula-se que a
hibridização natural ocorra entre E. cordifolius e E.
berteroi, mas não há estudos detalhados sobre
cruzamentos interespecíficos em Echinodorus (Les e
Philbrick 1993). Variantes citotípicas foram descritas
para E. tenellus (Costa e Forni-Martins 2004). Neste
trabalho, utilizamos bandagem cromossômica (C,
CMA3 e DAPI) e FISH com sonda 45S rDNA para
analisar as diferenças cariotípicas e dinâmica evolutiva
de cinco espécies brasileiras de Echinodorus.
material e métodos
As cinco espécies e populações utilizadas neste trabalho
estão listadas na Tabela 1. Os espécimes voucher foram
depositados no Herbário da Universidade Estadual de
Campinas (UEC), Brasil. Para análise citogenética, as
pontas das raízes das espécies foram coletadas em campo
e pré-tratadas com uma mistura (2:1, v/v) de solução
saturada de paradiclorobenzeno (PDB) e 0,009% de
cicloheximida por 5 h, a 16–18 C.
As raízes foram então fixadas em solução de Carnoy
(etanol:ácido acético, 3:1, v/v) por pelo menos 24 h e
armazenadas em etanol 70% a )4 C. Para as técnicas de
em uma solução enzimática contendo celulase (2%),
pectinase (20%) e água destilada. As lâminas foram
preparadas usando uma técnica padrão de esmagamento.
O bandeamento C e o bandeamento CMA3/DAPI
fluorescente foram feitos em E. bolivianus, E. grandiflorus,
E. longipetalus e E. macrophyllus. Para banda C, foi
utilizado o protocolo de Schwarzacher et al. (1980), e para
o bandeamento CMA3/DAPI utilizamos o de Schweizer
(1976), este último precedido por algumas das etapas
utilizadas no bandeamento C (as lâminas foram tratadas
com ácido acético 45%, hidróxido de bário 5% e 2xSSC,
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JY Costa et al.: Caracterização cariotípica de espécies brasileiras de Echinodorus 121

Tabela 1. Características cariotípicas das espécies de Echinodorus. (-) não analisadas, (*) espécies mantidas em casa
de vegetação, (#) ver Costa e Forni-Martins (2004). Populações: I) Campinas, SP - S 22 54¢20¢¢, W 47 03¢39¢¢; II)
Casa Branca, SP - 21 46¢26¢¢, 47 05¢11¢¢; III) Itapetininga, SP - 23 35¢30¢¢, 48 03¢11¢¢; 4)
Itirapina, SP - 22 15¢10¢¢, 47 49¢22¢¢; V) Pereira Barreto, SP - 20 38¢18¢¢, 51 06¢33¢¢; VI) Bonito, MS - 21 20¢28¢¢,
56 33¢34¢¢

Espécies Voucher População 2n Número de bandas PEIXE

C CMA3/DAPI

E. bolivianus (Rusby) NÓS JYC 1101 22 1 1 CMA+/DAPI+ –

Holm-Niels.
E. grandiflorus II, IV, V JYC 1073, 091, 0103 22 2 2 CMA+/DAPI0 2
(Cham. & Schltdl.) Micheli E.
longipetalus Micheli II, IV JYC 1071, 1072 22 38 4 CMA+/DAPI0 –
14 CMA0 /DAPI+
*
E. macrophyllus EU
22 24 2 CMA+/DAPI0 4
(Kunth) Micheli
12 CMA0 /DAPI+
E. tenellus III JYC 1075 22 1# 1 CMA+/DAPI+ # 3
(Mart.) Buchenau

todos a 60 C) antes da coloração com os fluorocromos.
As fotografias foram tiradas com filme preto e branco (ISO
25 para banda C e ISO 100 para CMA3/ DAPI). Filme de
slide colorido (ISO 400) também foi usado para bandas
fluorescentes. Usamos o MicroMeasure 3.3 para medir os
cromossomos e identificar a posição das bandas. Com
auxílio dos idiogramas apresentados anteriormente (Costa
e Forni-Martins 2003) traçamos um idiograma mostrando
a caracterização longitudinal das bandas C/CMA/DAPI de
E. grandiflorus, E.longi petalus e E. macrophyllus.
Infelizmente não foi possível traçar um idiograma para E.
bolivianus, devido à má qualidade do espalhamento
cromossômico.
A hibridização in situ por fluorescência foi feita para
E. grandiflorus, E. macrophyllus e E. tenellus.
A sonda pTa71 contendo 45S rDNA isolado de trigo
(Gerlach e Bedbrook 1979) foi usada para FISH. A sonda
foi marcada com biotina-14-dATP por nick translation. As
lâminas foram incubadas em RNase (100 lg/ml), pós-
fixadas em paraformaldeído a 4% (p/v), desidratadas em
série de etanol graduado de 70% a 100% e secas ao ar.
A mistura da sonda (20-100 ng) foi desnaturada a 70 C
por 10 min e imediatamente resfriada em gelo. Cromo
alguma desnaturação/hibridização foi feita a 90o C por 10
min, 50 C por 10 min e 38 C por 5 min usando um
termociclador (MJ Research), e mantido a 37 C durante a
noite em uma câmara úmida. As lavagens de pós-
hibridação foram feitas com 80% de rigor em
2xSSC, 0,1xSSC/20% formamida, 0,1xSSC, 2xSSC e
4xSSC/0,2% Tween 20, a 42 C por 5 min cada. A sonda
marcada com biotina foi detectada com um conjugado de
avidina FITC, e as lâminas foram montadas em uma
solução composta de 50% Antifade (Vector Labs), 50% de
glicerol em tampão McIlvaine, pH 7,0 e 4% de iodeto de
propídio (2,5 lg /ml)1 ).
As fotografias foram tiradas com filme colorido Kodak
Proimage ISO 100.
Resultados
As espécies estudadas diferiram em número,
distribuição e composição de suas regiões
heterocromáticas (Tabela 1). Houve também
diferenças no número de sítios de rDNA 45S
(Tabela 1), embora em todas as espécies esses
sítios tenham sido visualizados na região terminal
dos braços curtos dos cromossomos acrocêntricos.
O padrão de bandas C revelou apenas uma
região heterocromática em E. bolivianus, e estava
localizado no braço curto de um cromossomo de um
par de cromossomos acrocêntricos (Fig. 2a). Um
par heteromórfico de cromossomas também foi visto
nesta espécie. Echinodorus grandiflorus apresentou
duas regiões heterocromáticas nos braços curtos de
um par de acrocêntricos.
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122 JY Costa et al.: Caracterização cariotípica de espécies brasileiras de Echinodorus

Fig. 1. Idiogramas mostrando número e posição das bandas C/CMA3/DAPI em Echinodorus. a) E. grandiflorus, b)
E. longipetalus ec) E. macrophyllus

cromossomos (Figs. 1a, 2b). Em E. longipetalus, E. macrophyllus, o bandeamento C revelou 24

38 regiões heterocromáticas foram observadas
nas regiões terminal, intercalar e proximal.
Ambos os pares de cromossomos metacêntricos e
o maior par de cromossomos acrocêntricos tinham
apenas pontos proximais. Um par de cromossomos
acrocêntricos apresentou apenas regiões
heterocromáticas terminais, enquanto seis pares
desses cromossomos apresentaram bandas C
intercalares e proximais, e um par apresentou
bandas C terminais, proximais e intercalares (Figs. 1b, dos
regiões erocromáticas, com 2n=22 cromossomos,
e predominância de bandas terminais.
Três pares acrocêntricos apresentaram bandas C
intercalares. Em dois desses pares acrocêntricos
havia uma banda C terminal nos braços curtos,
enquanto em um desses pares a região do satélite
também era fortemente bandada. No par
metacêntrico e em seis pares de cromossomos
acrocêntricos havia bandas C nas regiões terminais
2c). braços
Dentro longos (Figs. 1c, 2d).
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JY Costa et al.: Caracterização cariotípica de espécies brasileiras de Echinodorus 123

Fig. 2. Bandamento C/CMA3/DAPI em espécies de Echinodorus. a, b, c, d) bandas C; e, f, g, h) bandas CMA3; i, j, k, l)

bandas DAPI; a, e, i) Echinodorus bolivianus; b, f, j) E. grandiflorus; c, g, k) E. longipetalus; d, h, l) E. macrophyllus.
Barra = 10 lm

O bandeamento CMA3/DAPI em E. bolivianus associada com as bandas C intercalares.

revelou apenas uma região CMA+/ DAPI+ Echinodorus macrophyllus tinha duas regiões
heteromórfica , localizada nos braços curtos de CMA+/ DAPI0 (Figs. 1c, 2h) localizadas nos
um cromossomo de um par acrocêntrico (Fig. 2e braços curtos de um par acrocêntrico de
e 2i), na mesma região identificada pelo cromossomas e 12 bandas CMA0 /DAPI+ (Figs.
bandeamento C. Apenas duas bandas CMA+/ 1c, 2l), dez das quais localizadas em posições
DAPI0 foram observadas em E. grandiflorus (Figs. terminais dos braços longos dos pares de
1a, 2f e 2j), nos braços curtos de um par acrocêntrico.cromossomos metacêntricos e acrocêntricos; as
Echinodorus longipetalus tinha quatro regiões duas bandas restantes estavam em uma posição
CMA+/ DAPI0 (Figs. 1b, 2g) que também estavam intercalar nos braços longos de um par acrocêntrico
localizadas nos braços curtos de dois pares de de cromossomos. As regiões ricas em GC e AT
cromossomos acrocêntricos, e 14 bandas CMA0 / foram provavelmente associadas a regiões
DAPI+ (Figs. 1b, 2k) que sempre foram heterocromáticas.
encontradas em regiões intercalares nos braços FISH usando a sonda pTa71 de 45S rDNA
longos dos cromossomos acrocêntricos; estes últimosem
foram prob
E. grandiflorus revelou apenas dois sítios
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124 JY Costa et al.: Caracterização cariotípica de espécies brasileiras de Echinodorus
Fig. 3. Hibridização in situ de 45S rDNA de Echino
dorus. a) Echinodorus grandiflorus, b) E. macrophyllus, gêneros,
c) E. tenellus. Barra = 10 lm
hibridizado com a sonda nos braços curtos de
um par acrocêntrico de cromossomos (Fig. 3a).
Em E. macrophyllus, havia quatro sítios de
hibridização para a sonda 45S rDNA, todos os quais
também estavam localizados nos braços curtos
dos cromossomos acrocêntricos (Fig. 3b). Equinodoro regiões. Apenas E. macrophyllus apresentou alguns
tenellus apresentou três sítios de hibridização para
45S rDNA nos braços curtos do acrocêntrico
cromossomos, com heteromorfismo para um dos
esses locais (Fig. 3c).
Discussão
Existem poucos estudos de cromossomas
bandas em Alismatales, e nenhuma investigação
usando hibridização in situ. Estudos anteriores
com Hydrocleys nymphoides (Kenton 1981)
e Echinodorus tenellus (Costa e Forni Martins
2004) mostraram que essas espécies
número reduzido de regiões heterocromáticas
e um heteromorfismo facilmente observado. Como
mostrado aqui, algumas espécies tiveram um pequeno número
de regiões heterocromáticas, mas esta não foi uma
característica consistente da família. Dois
espécies, Echinodorus longipetalus e E. mac
rophyllus, apresentaram um grande número de
regiões heterocromáticas. A maioria dos heterocromáticos
bandas terminais que estavam presentes no curto
braços de cromossomos acrocêntricos foram
associados a regiões ricas em GC. No entanto,
E. longipetalus e E. macrophyllus tiveram uma
região heterocromática terminal adicional em
o braço curto de um par acrocêntrico de
cromossomos não associados
regiões ricas em GC. Guerra (2000) apontou
que uma combinação de bandas C e
A banda fluorescente é um método confiável para
identificar diferentes tipos de heterocromatina,
mas que as bandas C às vezes reagem de forma neutra a
coloração de fluorocromo. A associação de
regiões heterocromáticas com het erocromatina
rica em GC, e mesmo com constrições secundárias
e regiões organizadoras de nucléolos
(NORs), tem sido observada em várias plantas
incluindo Scilla (Greilhuber et al.
1981), Capsicum (Moscone et al. 1996), Sesbania
Scop. (Forni-Martins e Guerra 1999),
Clivia (Ran et al. 1999) e Pinus (Jacobs
et ai. 2000).
Outro padrão observado aqui foi que o
heterocromática intercalar e terminal
regiões presentes nos braços longos dos
cromossomas foram geralmente associadas a AT ricos
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JY Costa et al.: Caracterização cariotípica de espécies brasileiras de Echinodorus
bandas heterocromáticas intercalares e terminais
que reagiram de forma neutra durante o
bandamento fluorescente. O padrão de
heterocromatina associado a regiões ricas em AT
sugere que E. longipetalus e E. macrophyllus
podem estar intimamente relacionados, e que as
inversões cromossômicas podem ter desempenhado
um papel importante na evolução dessas espécies,
uma vez que as bandas C proximais e intercalares
predominaram em E. longipetalus, enquanto as
bandas C terminais predominaram em E.
macrophyllus. Além disso, essas duas espécies
foram as únicas que apresentaram um grande
número de bandas C e regiões ricas em AT.
Conforme mostrado aqui e por Costa e Forni
Martins (2004), houve uma forte semelhança entre
os padrões de bandas de E. bolivianus e E.
tenellus. Tanto E. bolivianus quanto o citótipo
diplóide de E. tenellus apresentaram uma região
heterocromática associada a uma banda CMA+/
DAPI+ na região terminal de apenas um par de
cromossomos heteromórficos. A sinonimização
dessas duas espécies sob E. tenellus foi sugerida
por Je´re´mie et al. (2001) com base no exame de
vários espécimes de herbário e também do
material tipo durante a descrição de uma nova
espécie de Echinodo rus. Sugerimos que essas
espécies estejam pelo menos intimamente
relacionadas, pois apresentaram a maior
similaridade nos padrões de bandas entre todas
as espécies estudadas, e também mostraram a
presença exclusiva de uma banda CMA+/DAPI+ .
Sítios de hibridização in situ para a sonda 45S
rDNA foram sempre observados em posições
terminais nos braços curtos de cromossomos
acrocêntricos, e foram associados a regiões
heterocromáticas em E. grandiflorus e E.
macrophyllus. Em E. grandiflorus, os sítios 45S
rDNA também foram associados a regiões ricas
em GC. Uma associação entre regiões ricas em
GC e sítios de 45S rDNA tem sido observada em
vários gêneros de plantas, incluindo algumas Aster
aceae como Helianthus (Vanzela et al. 2002),
Crepis, Galinsoga e Chaptalia (Fregonezi et al.
2004). No entanto, tal associação nem sempre foi
observada em todas as espécies aqui estudadas.
Em E. macrophyllus, dois dos quatro sítios de
rDNA 45S não foram detectados por
125
banda CMA3 , embora esses locais tenham sido
vistos por banda C. Em E. tenellus, a hibridização
in situ feita aqui e os dados de bandas apresentados
por Costa e Forni-Martins (2004) mostraram que
dois dos três sítios de rDNA 45S não foram
detectados por bandas C ou CMA3 . A falta de
associação entre regiões ricas em GC e sítios 45S
rDNA também foi relatada para algumas das
bandas cromossômicas em espécies de Helianthus
(Vanz ela et al. 2002), embora geralmente existam
mais regiões ricas em GC do que sítios 45S rDNA.
Sugerimos que a hibridização in situ com a sonda
45S rDNA também seja feita em E. bolivianus para
permitir a comparação com os dados obtidos para
E. tenellus.
Embora apenas algumas espécies tenham
sido estudadas aqui, a combinação de bandas C,
bandas fluorescentes e hibridização in situ com a
sonda 45S rDNA provou ser um método eficiente
para detectar diferenças e semelhanças entre
essas espécies. As duas espécies (E. grandiflorus
e E. macrophyllus) que apresentaram a maior
similaridade cariotípica usando técnicas
convencionais (Costa e Forni-Mart 2003) na
verdade apresentaram padrões de bandas e
hibridização muito diferentes. Em contraste, os
padrões de bandas semelhantes de E. bolivianus
e E. tenellus sugeriram uma relação próxima entre
essas duas espécies e podem representar mais
uma evidência para corroborar a sinonimização
sugerida por Je´re´mie et al. (2001). A aplicação
das técnicas aqui utilizadas a um maior número
de espécies de Alismataceae pode ser útil no
esclarecimento de problemas taxonômicos neste
grupo e pode auxiliar na identificação de alterações
cromossômicas relevantes para a evolução dessas
espécies.
The authors thank Maria do Carmo Estanislau do
Amaral and Emerson Ricardo Pansarin for identifying
the species, Iara F. Bressan for helping with the
laboratory techniques and the Laborato´rio de Citogene
´tica e Gene´tica Molecular de Plantas (Universidade
Estadual de Londrina), for provid ing access to laboratory
facilities. J.Y. Costa was supported by a fellowship from
the Fundac¸a˜o de Amparo a` Pesquisa do Estado de
Sa˜o Paulo (FAPESP, #00/00767–0).
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126 JY Costa et al.: Caracterização cariotípica de espécies brasileiras de Echinodorus

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JY Costa et al.: Caracterização cariotípica de espécies brasileiras de Echinodorus 127

Endereços dos autores: JY Costa, ER SP, Brazil. A. L. L. Vanzela, Departamento de Biologia

Forni-Martins (e-mail: elianafm@unicamp.br), Geral, Centro de Cieˆncias Biolo´gicas, Universidade
Departamento de Botaˆnica, Instituto de Biologia, Estadual de Londrina (UEL), CEP 86051-990, Londrina,
Universidade Estadual de Campinas (UNI CAMP), CP PR, Brazil.
6109, CEP 13083-970, Campinas,