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Melhoria da extração proteica do farelo de girassol por hidrólise com alcalase

ArtigoemGraças e Aceites · Outubro de 2003

DOI: 10.3989/gya.2003.v54.i4.230 · Fonte: DOAJ

CITAÇÕES LÊ
28 697

7 autores, Incluindo:

Maria del Mar Yust Justo Pedroche

Instituto de la Grasa-CSIC Conselho Nacional de Pesquisa Espanhol

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Cristina Megias

46PUBLICAÇÕES1.567CITAÇÕES

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Graças e Aceites
Vol. 54. Fasc. 4 (2003), 419-423
Melhoria da extração de proteínas do farelo de girassol por hidrólise
com alcalase
PorMM Yust, J. Pedroche, C. Megias, J. Girón-Calle, M. Alaiz, F. MilláneJ. Vioque*
Instituto de la Grasa, CSIC. Avenida Padre García Tejero 4. 41012-Sevilha, Espanha.
E-mail: jvioque@cica.es
RESUMO
Melhor extração proteica da harina de girasol por
meio de hidrólise com alcalasa.
A extração proteica da harina desengrasa de girasol foi
melhorada através da adição da protease alcalasa durante a
extração alcalina. Este método oferece diversas vendas adicionais
em comparação com a extração alcalina tradicional sem alcalasa,
que é desenvolvida normalmente por meio de um processo de
flotação/sedimentação para remover a fração lignocelulósica. Em
comparação com a extração sem alcalasa, a adição de 0,1% (v/v)
de alcalasa melhora os resultados de extração proteica de 57,5%
a 87,4%, proporcionando um extrato com um grau de hidrólise
de 22%. Além disso, é obtido um incremento de até 4,5 vezes na
solubilidade proteica em pHs baixos, que está correlacionado
com o grau de hidrólise. Os extratos obtidos com alcalasa tinham
um maior conteúdo de prolina e glicina, sugerindo que a
proteasa melhorasse a extração das proteínas ricas em prolina e
glicina da parede celular que forma parte da fração
lignocelulósica. Este extrato proteico pode ser seco diretamente
sem geração de água residual, e o material resultante rico em
fibra pode ser usado para alimentação animal.
PALABRAS-CLAVE: Alcalasa - Extração proteica -- Harina de
girasol -- Hidrolizados proteicos -- Proteasa.
RESUMO
Melhoria da extração de proteínas do farelo de
girassol por hidrólise com alcalase.
A extração de proteínas do farelo de girassol desengordurado foi
melhorada pela adição da protease alcalase durante a extração
alcalina. Este método oferece diversas vantagens adicionais em
comparação com a extração alcalina tradicional sem alcalase, que
geralmente é realizada após uma etapa de sedimentação/flutuação
para remover a fração lignocelulósica. Em comparação com a extração
sem alcalase, a adição de 0,1% (v/v) de alcalase melhorou o rendimento
da extração de proteínas de 57,5% para 87,4%, proporcionando um
extrato 22% hidrolisado. Além disso, consegue-se um incremento de
até 4,5 vezes na solubilidade da proteína em baixos valores de pH, o
que se correlaciona com o grau de hidrólise. Os extratos obtidos na
presença de alcalase apresentaram maior teor de prolina e glicina,
sugerindo que a protease melhora a extração de proteínas da parede
celular ricas em prolina e glicina que fazem parte da fração
lignocelulósica. Esses extratos proteicos podem ser secos diretamente
sem geração de águas residuais, e o material rico em fibras resultante
pode ser usado para alimentação animal.
PALAVRAS-CHAVE: Alcalase -- Protease-- Extração de proteínas --
Hidrolisados proteicos-- Farelo de girassol.
1. INTRODUÇÃO
A transformação de subprodutos da indústria
alimentar em novas fontes não convencionais de
419
proteínas é de grande interesse porque representa uma
fonte potencial de proteína barata para alimentação de
gado e também para consumo humano. Uma vantagem
adicional da utilização destes subprodutos como fonte
de proteína é que reduz os problemas ambientais
associados ao seu descarte. O girassol (Helianthus
annuusL.) a farinha desengordurada que sobra após a
extração do óleo é um caso típico desses subprodutos.
O girassol é uma das oleaginosas mais importantes
cultivadas no mundo, representando a quarta maior
fonte de óleo comestível (Lühs & Friedt, 1994). O farelo
de girassol desengordurado, que contém cerca de 30%
de proteína (Parrado et al., 1991), já foi utilizado para a
preparação de isolados proteicos (Saeed & Cheryan,
1988) e hidrolisados proteicos de alto valor agregado
(Villanueva et al., 1999). ).
Durante a extração industrial de óleos de frutas ou
sementes, as proteínas sofrem um processo de
desnaturação que reduz sua solubilidade. Para melhorar a
solubilidade, as proteínas podem ser hidrolisadas antes ou
durante a extração usando proteases. Nos últimos anos, a
disponibilidade de proteases industriais, principalmente
purificadas de bactérias e fungos, permitiu a produção em
larga escala de hidrolisados de proteínas (Vioque et al.,
2001). Alcalase é uma dessas proteases comerciais e tem
sido usada para auxiliar na extração de proteínas de ossos
de galinha (Sales et al., 1991), folhas de urtiga (Dalev et al.,
1996) e farelo de arroz (Hanmoungjai et al., 2001).
Recentemente, observou-se que um tratamento limitado de
Brassica carinatafarinha desengordurada com alcalase
produz um aumento significativo no rendimento de extratos
protéicos (Pedroche et al., 1998). Uma vez que o tratamento
com alcalase parece melhorar a extracção de proteínas de
diferentes fontes, o efeito da adição de alcalase durante a
extracção de proteína desengordurada de farinha de
girassol foi agora investigado. A extração alcalina na
presença de alcalase foi comparada com o método
convencional de extração alcalina na ausência de alcalase.
Isto resulta em diversas vantagens, além de permitir altos
rendimentos de extração de proteínas sem a necessidade
de realizar uma etapa preliminar de flotação/sedimentação
para remoção da fração lignocelulósica.
420
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. Materiais
Girassol (H. annuusL.) foi obtida por extração com
solvente e fornecida pela Koipesol (Sevilla, Espanha).
Todos os produtos químicos eram de grau analítico e
foram adquiridos da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO),
salvo indicação em contrário. Alcalase 2,4 L, uma
protease microbiana deBacillus licheniformis com
actividade de endopeptidase, foi fornecido pela Novo
Nordisk (Bagsvaerd, Dinamarca). Um componente
principal desta preparação comercial é a serina
protease subtilisina A. A atividade específica da alcalase
2,4 L é de 2,4 unidades Anson por grama.
2.2. Determinação de proteínas
As quantidades de proteínas e peptídeos foram
determinadas por análise elementar utilizando um
analisador LECO CHNS-932 (St. Joseph, MI), e foram
calculadas como % de teor de nitrogênio x 6,25.
2.3. Fracionamento de sedimentação/flutuação de
farelo de girassol desengordurado
Uma suspensão a 10% (p/v) de farinha de girassol
desengordurada em água foi borbulhada com ar
durante 10 minutos para obter uma dispersão uniforme
da farinha. A mistura foi deixada sedimentar por 15
minutos, para que a suspensão fosse resolvida em três
fases: uma fração proteica que formou um sedimento
no fundo do tanque de sedimentação; uma fração
solúvel no meio e uma fração lignocelulósica que
flutuava no topo. Após a remoção mecânica da fração
lignocelulósica, as frações solúvel e proteica foram
separadas por filtração a vácuo (Bautista et al., 1990).
2.4. Extração de proteínas
Farinha de girassol desengordurada (10 g) foi
suspensa em 0,25% de Na2ENTÃO3(100 mL) pH 10. A
suspensão foi extraída por agitação durante 1 hora à
temperatura ambiente na presença de diferentes
concentrações de alcalase. Após centrifugação a 8.000
g, os sobrenadantes foram reunidos e utilizados para
experimentação. Uma alíquota dos sobrenadantes
reunidos foi levada à secura para determinar a matéria
extraída por gravimetria.
2.5. Precipitação isoelétrica
Para a precipitação isoelétrica das proteínas, o pH dos
sobrenadantes foi ajustado ao ponto isoelétrico da proteína
do farelo de girassol (pH 4,3). Os precipitados foram
recuperados por centrifugação a 8.000 g.
Graças e Aceites
2.6. Grau de hidrólise
O grau de hidrólise foi calculado pela
determinação de grupos amino livres por reação
com ácido 2,4,6-trinitrobenzenossulfônico (Adler-
Nissen, 1979). O número total de grupos amino foi
determinado em uma amostra 100% hidrolisada por
tratamento com HCl 6 N a 110óC por 24 horas.
2.7. Análise de aminoácidos
2 mg de amostras foram hidrolisadas com HCl 6 N (4
mL) a 110óC por 24 horas em tubos selados com
nitrogênio. Os aminoácidos foram determinados após
derivatização com etoximetilenomalonato de dietila por
cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) de
acordo com o método de Alaiz et al. (1992), utilizando
ácido D,L-aminobutírico como padrão interno. O
sistema de HPLC consistiu de um multissistema Waters
Modelo 600E com um detector UV-Vis Waters Modelo
484, equipado com uma coluna de fase reversa de 300 x
3,9 mm de diâmetro interno (Novapack C18, 4m; Waters)
que foi mantido em 18óC durante as análises. Foi
utilizado um sistema de gradiente binário formado pela
mistura de (A) acetato de sódio 25 mM contendo 0,02%
de azida de sódio (pH 6,0) e (B) acetonitrila. O solvente
foi entregue à coluna a uma vazão de 0,9 mL/min como
se segue: tempo 0,0-3,0 min, gradiente linear de A/B
(91/9) a A/B (86/14); 3,0-13,0 min, eluição com A/B
(86/14); 13,0-30,0 min, gradiente linear de A/B (86/14) a
A/B (69/31); 30,0-35,0 min, eluição com A/B (69/31).
Aminoácidos derivatizados foram detectados a 280 nm.
2.8. Determinação da solubilidade
Os extratos proteicos foram testados quanto à
solubilidade em diferentes valores de pH que foram obtidos
pela adição de HCl 1 N. A solubilidade foi expressa como
percentagem de proteína total que permaneceu solúvel
após acidificação. A proteína foi determinada como
nitrogênio nas frações solúveis e insolúveis obtidas por
centrifugação a 8.000 g por 30 minutos.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Antes da extração alcalina da proteína do farelo de
girassol desengordurado, a fração lignocelulósica é
geralmente removida usando um procedimento de
sedimentação/flutuação (Parrado et al., 1991, Villanueva
et al., 1999). A fibra é o principal componente da fração
de baixa densidade que permanece na fase superior
após a sedimentação/flutuação (60-70%), mas esta fase
superior ainda contém uma quantidade significativa de
proteína (20-25%) (Villanueva, 1997). Esta proteína é
perdida como consequência da realização do
procedimento de sedimentação/flutuação. Na tentativa
de aumentar o rendimento da extração de proteínas,
foram realizados ensaios nos quais a protease alcalase
foi adicionada durante a extração alcalina e a
Vol. 54. Fasc. 4 (2003)
a etapa de sedimentação/flutuação foi omitida. Alcalase
é uma preparação comercial barata, mais ativa em pH
básico, o que a torna adequada para uso durante a
hidrólise alcalina. Vários parâmetros deste novo
procedimento de extração alcalina direta da farinha
desengordurada utilizando alcalase têm sido estudados
a fim de avaliar as possíveis vantagens do uso desta
enzima.
Todos os resultados aqui apresentados
correspondem a extrações de proteínas realizadas à
temperatura ambiente e pH 10 em meio contendo
sulfito de sódio. O sulfito de sódio é um agente redutor
que inibe a oxidação de polifenóis (Gheyasuddin, Cater,
& Mattil, 1970) e aumenta o rendimento da extração de
proteínas (Sze-Tao, & Sathe, 2000) devido à redução das
ligações dissulfeto. A Tabela I mostra os rendimentos
de extração proteica da farinha integral
desengordurada (sem remoção prévia da fibra por
flotação/sedimentação) na presença de diferentes
concentrações de alcalase. Quantidades crescentes de
alcalase melhoraram o processo de extração tanto em
termos de matéria total extraída quanto de rendimento
de proteína. A adição de 0,1% (v/v) de alcalase permite a
extração de 87,4% das proteínas originais, em
comparação com o rendimento de 57,5% sem alcalase.
Além disso, o teor de proteína deste extrato, 60,8%, é
maior. A melhoria na extração de proteínas
correlaciona-se com um maior grau de hidrólise, que
chega a 22% com alcalase 0,1% (Tabela I).
A remoção da fração lignocelulósica por
sedimentação/flotação antes da adição de 0,1% de
alcalase levou a uma diminuição no rendimento da
extração de proteínas de 87,4% para 55,5%. Assim, a
alcalase parece facilitar a extração de proteínas
insolúveis ligadas à fibra na fração lignocelulósica. No
entanto, estes extratos podem não ser adequados para
a preparação de isolados proteicos. Assim, quando as
proteínas foram precipitadas no seu ponto isoelétrico
após extração com alcalase 0,01% ou na ausência da
protease microbiana, a proteína
Tabela I
Matéria extraída, teor de proteína, rendimento de extração de proteína e grau de farelo desengordurado de girassol
usando diferentes concentrações de alcalasea
0%
Alcaláse
Matéria Extraída (g) 3.33±0,1
Teor de proteína (%) 51,7±1,5
Rendimento de proteína 57,5±2.7
Extração (%)b
Grau de Hidrólise 0,0±0,0
a Valores representam média±DP (n=3).
b Com base num teor proteico de farinha desengordurada de girassol de 30%.
421
o conteúdo dos isolados diferiu significativamente. Os
isolados proteicos de extratos obtidos sem alcalase
apresentaram teor de proteína de 84,4%, enquanto os
isolados obtidos com 0,01% de alcalase apresentaram
apenas 68% de teor de proteína. Isto é provavelmente
devido a uma quantidade substancial de fibra estar
associada e coprecipitar com proteínas, como foi descrito
anteriormente no caso de extratos proteicos de bagaço de
azeitona (Vioque et al., 2000).
Os extratos proteicos obtidos com alcalase 0,1%
apresentaram o dobro da concentração de proteínas da
farinha original. Isso aumenta o possível valor desses
hidrolisados como fonte de proteína, pois a mesma
quantidade de proteína poderia ser fornecida com
metade do material, em comparação com extratos
obtidos sem o uso de alcalase. O custo da alcalase não é
uma limitação porque considerando quanto custa a
alcalase, a extração/hidrólise usando alcalase ainda é
mais barata que o método tradicional. Assim, para a
mesma quantidade de proteína extraída, o custo da
alcalase é inferior ao da quantidade de farinha
necessária pelos métodos tradicionais para compensar
um menor rendimento. Além disso, o custo da etapa de
flotação/sedimentação e o custo da eliminação de
águas residuais têm de ser adicionados para calcular o
custo global do método tradicional, o que não é o caso
do novo método aqui descrito.
A solubilidade é uma propriedade funcional muito
importante das proteínas, pois também determina, em
certa medida, outras propriedades funcionais, como
formação de espuma, emulsão e gelificação (Zayas,
1997). As proteases são frequentemente utilizadas para
aumentar a solubilidade de proteínas, particularmente
no ponto isoelétrico das proteínas nativas (Chobert et
al., 1996, Chobert et al., 1988, Turgeon et al., 1992). Esse
aumento na solubilidade se deve ao menor tamanho
dos peptídeos e à maior hidrofilicidade dos hidrolisados
resultantes, como consequência do maior número de
grupos amino e carboxila livres gerados pela quebra
das ligações peptídicas (Mahmoud, 1994). O uso de
0,01% (v/v) 0,05% (v/v) 0,1% (v/v)
Alcaláse Alcaláse Alcaláse
3.32±0,2 4,34±0,4 4.41±0,6
53,9±4.2 51,8±3.1 60,8±2.3
59,8±3.6 76,0±4,0 87,4±4.9
14,7±0,5 16,9±1,8 22,0±2.3
422 Graças e Aceites

às diferenças na eficiência com que diferentes proteínas

Álcool 0% Álcool 0,01%
são extraídas (Tabela II). Foi observado aumento dos
Álcool 0,05% Álcool 0,1%
aminoácidos glicina e prolina, abundantes nas
proteínas da parede celular (Condit & Keller, 1990,
120
Keller et al., 1988, Hong et al., 1990) nos extratos
100 obtidos por tratamento com alcalase. Assim, parece que
a alcalase aumenta a solubilização de proteínas ricas
80 em prolina e ricas em glicina que são características da
Solubilidade (%)

60
fração lignocelulósica. Por outro lado, os conteúdos dos
aminoácidos sulfurados metionina e cisteína são
40 relativamente mais baixos quando se utiliza alcalase.
Isto provavelmente é explicado pelo fato de os
20 aminoácidos sulfurados serem mais abundantes nas
0
albuminas e outras proteínas solúveis em água do
0 2 4 6 8 10 12
girassol do que nas proteínas associadas à fração
lignocelulósica (Baudet, & Mossé, 1977).
pH

Uma vantagem adicional da extração alcalina direta

figura 1
com alcalase em comparação com o procedimento
Solubilidade em água em diferentes valores de pH de extratos proteicos
obtido por extração alcalina na presença de diferentes clássico de sedimentação/flutuação é a eliminação de
concentrações de alcalase. águas residuais que são produzidas durante a extração
de farinha de girassol desengordurada usando a
alcalase para preparação de extratos protéicos de extração alcalina tradicional. Isto representa custos
girassol aumentou drasticamente a solubilidade dos adicionais de produção para evitar um impacto
extratos, conforme mostrado na figura 1. Assim, a ambiental negativo (Borja et al., 2001). As águas
adição de 0,1% de alcalase ao meio de extração causou residuais são geradas pelo procedimento de
aumento na solubilidade em pH ácido (pH entre 2 e 4) sedimentação/flutuação porque é necessário realizar
de 20 para mais de 80%. filtração a vácuo ou centrifugação para separar o
A composição de aminoácidos dos extratos proteicos obtidos sedimento proteico da fração solúvel, após remoção
pelo tratamento com diferentes quantidades de alcalase mecânica da fração de fibra que flutua no topo (ver
apresentou pequenas variações que podem ser devidas materiais e métodos).

Tabela II
Composição de aminoácidos (g/100 g de proteína) de extratos protéicos de girassola

0% (v/v) 0,01% (v/v) 0,05% (v/v) 0,1% (v/v)

Alcaláse Alcaláse Alcaláse Alcaláse
Asp + Asn 8.4±0,1 10,0±0,2 9.6±0,1 8.6±0,2
Glú + Gln 24.3±0,3 24.3±0,4 22,8±0,4 22,7±0,5
Ser 5.5±0,1 5.5±0,1 5.5±0,1 5.7±0,1
Dele 2.6±0,0 2,5±0,0 2.4±0,0 2,5±0,0
Gly 6.8±0,1 7.6±0,2 7,5±0,2 7.2±0,1
Thr 4,0±0,1 4.2±0,1 4,5±0,1 4.6±0,1
Alá 4,5±0,1 4.7±0,1 5,0±0,1 4.9±0,1
Pró 3.6±0,1 4.3±0,1 4,5±0,1 4.6±0,1
Argumento 10.3±0,2 9.7±0,1 9.4±0,1 9,5±0,2
Tyr 2.2±0,0 2.2±0,0 2.4±0,0 2.3±0,0
Val 4.2±0,1 4.3±0,1 4,5±0,1 4.6±0,1
Conheceu 2,5±0,0 0,3±0,0 0,5±0,0 1.3±0,0
Cis 1,9±0,0 1.3±0,0 1.4±0,0 1.6±0,0
Ou 3.8±0,1 3.7±0,1 3.8±0,1 3.7±0,1
Leu 7.1±0,1 7.1±0,1 7,5±0,2 7.4±0,1
Phe 5.2±0,1 5,0±0,1 5.2±0,1 5,0±0,1
Lis 3.5±0,1 3.3±0,1 3.5±0,0 3.8±0,0

aValores representam média±DP (n=3).

 Vol. 54. Fasc. 4 (2003)
Concluindo, o processo combinado extração
alcalina/hidrolítica é mais eficiente para extração de
proteínas do que o método tradicional (flotação/
sedimentação seguida de extração alcalina na ausência
de alcalase) porque não há perda de proteína na fração
lignocelulósica. Também fornece um extrato
hidrolisado final que é mais solúvel em soluções ácidas,
e o processo geral não envolve a geração de águas
residuais poluentes. Esta solubilidade aumentada pode
ser especialmente útil em alimentos líquidos, aos quais
podem ser adicionados hidrolisados para melhorar o
seu valor nutricional. Considerando tudo isto, a
aplicação potencial deste produto pode não se limitar à
alimentação do gado, mas também pode ser utilizado
na preparação de alimentos para consumo humano.
RECONHECIMENTOS
Agradecemos a M. Dolores García pela assistência
técnica. Este trabalho foi apoiado pela bolsa AGL
2001-0526.
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Recebido: fevereiro de 2003
Aceito: maio de 2003