E Book Procedimentos em Micologia Atualizado em 141123

PROCEDIMENTOS
LABORATORIAIS
EM MICOLOGIA
João Marcelo Oliveira

E-book
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Eu sou o João Marcelo, sou biomédico, microbiologista e

tenho algumas experiências para compartilhar com você por meio
desse e-book. Este material é oferecido dentro do meu curso de
Microbiologia Clínica ou separadamente. Neste livro digital, eu
quero compartilhar com você algumas práticas e rotinas de
microbiologia que eu vivo desde o dia que decidi atuar nesta área
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Clínica, aprendendo sobre o isolamento e identificação de bactérias
e fungos; ter acesso aos meus outros ebooks, PDFs de conteúdos e
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De todas as formas, desejo sucesso, paz e desenvolvimento
para você. Que Deus te abençoe, sempre!
Esta é a primeira versão deste ebook.

Se você tiver alguma consideração importante ou dúvida, por favor,
nos escreva para biomedjmarcelo@gmail.com e
microlabassessoria@gmail.com
(p) 2023, versão 0001/23. Primeira edição.

Introdução e noções gerais a respeito

dos fungos de interesse médico
Introdução
Fungos são seres aclorofilados, sem capacidade de produzir energia ou material plástico
por meio da energia da luz e do gás carbônico (C02), isto é, são desprovidos da
capacidade da fotossíntese, pois não possuem cloroplasto. São seres heterotróficos
quimiotróficos, dependendo de substâncias orgânicas previamente formadas. São
eucariotos, podendo ser haplóides, diplóides ou poliploides; têm parede rígida quitinosa
constituída de polímeros de amino-açúcares, sem reservas de amido e, em alguns casos,
com presença de glicogênio. Alimentam-se por absorção, pois não são capazes de ingerir
ou fagocitar alimentos. Os fungos reproduzem-se de forma vegetativa, sexual, assexual e
parassexual. Na identificação dos fungos patogênicos para o homem e os animais, é
importante a reprodução assexual e, raramente, a sexual.
Citologia Fúngica
Dentre as principais características celulares dos fungos, temos as seguintes:
São organismos eucariontes;
Unicelulares ou pluricelulares;
São imóveis com parede celular rígida;
Não necessitam de grandes exigências nutricionais;
Não apresentam: plastos, celulose, clorofila, e não armazenam amido.
Parede celular constituído por quitina, manana e alfa glucano - pode ser composta de
múltiplas camadas em alguns casos;
Podem ser uninucleados ou multinucleados;
Membrana celular rica em ergosterol.
Nutrição e Metabolismo Fúngico

Dentre as principais características de nutrição e metabolismo estão:
•São aeróbios obrigatórios;
•Processo de oxidação glicolítica;
•Fermentadores facultativos - leveduras;
•São saprófitas;
•Alguns são fototróficos;
•Absorvem nutrientes e hidrolisam através de enzimas (lipase, invertases, amilases,
proteinases);
•Metabolizam carboidratos diversos, como glicose, sacarose, maltose, amido, celulose, e
outros.
Crescimento Microbiano
Diferente das bactérias, os fungos apresentam um crescimento lento. Crescem em
ambientes ricos em glicose, peptona, e outros tipos de carboidratos. Alguns crescem em
ambientes halofílicos, ou seja, com concentração de 0,9% de NaCl.
Quanto a temperatura de crescimento temos:
•Psicrófilo - vivem em temperaturas abaixo de 4ºC;
•Mesófilos - vivem em temperaturas de 20 a 37ºC;
•Termófilos - vivem em temperaturas acima de 50ºC.
Morfologia dos Fungos

Os fungos podem ser divididos de acordo com a sua morfologia em dois tipos básicos:
•Fungos Leveduriformes - Leveduras - São unicelulares;
•Fungos Filamentosos - Bolores - São pluricelulares;
As leveduras são fungos unicelulares, não filamentosos, geralmente esféricos ou ovais. São
amplamente distribuídas na natureza: com frequência, são encontradas na forma de um pó
branco cobrindo frutas e folhas. No brotamento, a célula parental forma uma protuberância
(broto) em sua superfície externa. À medida que o broto se alonga, o núcleo da célula parental
divide-se, e um dos núcleos migra para o broto. O material da parede celular é, então,
sintetizado entre o broto e a célula parental e, por fim, o broto acaba se separando.
Uma célula de levedura pode produzir mais de 24 células-filhas por brotamento
(imagem microscópica). Algumas leveduras produzem brotos que não se separam uns dos
outros; esses brotos formam uma pequena cadeia de células, denominada pseudo-hifa.
Candida albicans adere-se às células epiteliais humanas na forma de levedura, mas requer
pseudo-hifas para invadir os tecidos profundos.
Em culturas (imagem da placa de ágar sangue), as colônias de leveduriformes se
assemelham às bacterianas, apresentam uma característica mucoide, brilhante ou opaca, de
textura cremosa. Essas características podem variar de acordo com ou gênero ou espécie
isolada.
Algumas características principais

Os fungos, microrganismos uni ou pluricelulares, eucariotos dotados de uma celula

complexa, é um reino enorme e replete de desafios para o estudo em medicina
laboratorial. Em especial, os fungos de interesse médico, agentes de micoses.
Classifcamente Podemos dividi-los em fungos filamentosos (o que muitos chamam de
bolores) e fungos leveduriformes, sendo estes pluricelulares e unicelula, respectivamente.
Todos os fungos de interesse medico crescem em temperature ambiente e em 37 graus
(com algumas excessõess). Microscopicamente falando, eles possuem um aparelho de
vida vegetativa denominado micélio e um aparelho de frutificação, cujos órgãos se
diferenciam para servir à reprodução. Quando eles não possuem o aparelho de
frutificação, derivado de um processo sexuado ou assexuado, diz-se que são constituídos
de micélio estéril. A morfologia de um fungo pode ser estudada à microscopia óptica
comum, em vida parasitária ou saprofítica, utilizando-se, também, a microscopia de
varredurae a microscopia eletrônica.
A célula dos fungos é constituída pelos principais componentes
encontrados nos demais organismos eucarióticos, isto é, os que apresentam núcleos
dotados de membrana envolvente própria. Entretanto, não apresenta plastos de qualquer
natureza. Parede celular, membrana plasmática ou plasmalema, vacúolos, retículo
endoplasmático, aparelho de Golgi, lomassomos, mitocôndrias, capa ou parede nuclear,
núcleo e cromossomos, septos e poros septais são estruturas encontradas nos fungos,
sendo que flagelos são demonstrados em Chytridiomycota (LACAZ, 1998). O corpo de um
fungo filamentoso consiste em longos filamentos de células conectadas. Esses filamentos
são chamados de hifas. As hifas podem crescer até proporções imensas. Utilizando a
técnica de fingerprinting de DNA, os cientistas mapearam as hifas de um único fungo em
Oregon (um cogumelo), que se estendem por mais de 6,4 quilômetros quadrados.
Na maioria dos bolores, as hifas contêm paredes cruzadas, chamadas de septos, que
dividem as hifas em unidades semelhantes a células uninucleadas (um núcleo) distintas.
Essas hifas são chamadas de hifas septadas.
Algumas características principais

Em algumas poucas classes de fungos, as hifas não contêm septos e apresentam como
células longas e contínuas com muitos núcleos e são denominadas hifas cenocíticas.
Mesmo nos fungos com hifas septadas, geralmente existem aberturas nos septos que
tornam contínuo o citoplasma das “células” adjacentes; esses fungos também são, na
verdade, organismos cenocíticos. As hifas crescem por alongamento das extremidades.
Cada parte de uma hifa é capaz de crescer e, quando um fragmento é quebrado, ele pode
alongar-se para formar uma nova. Em laboratório, os fungos geralmente crescem a partir
de fragmentos obtidos de um talo do fungo. Quando as condições ambientais, se tornam
favoráveis, as hifas crescem e formam uma massa filamentosa, chamada de micélio,
visível a olho nu. Outra classificação de acordo com as hifas é relacionada a sua
coloração natural, podendo ser hifas demáceas (escuras) ou hifas hialinas (claras). Os
fungos filamentosos também possuem características importantes de acordo com o
crescimento no meio de cultura, observando o tipo de formação do micélio.
Micélio Vegetativo - Porção responsável pela sustentação e absorção nutricional, se
localiza dentro ou sobre o substrato/meio de cultura;
Micélio Aéreo (reprodutivo) - Responsável pela reprodução e disseminação fúngica,
onde contempla as estruturas de propagação (esporos).
A divisão entre fungos filamentosos e leveduras não é rígida, pois muitos fungos são
dimórficos, isto é, podem apresentar formas filamentosas ou em levedura, conforme o meio
usado e as condições de incubação, como umidade, temperatura etc.
•Fase micelial/micelar - Crescimento em temperatura entre 22 e 28ºC - Fase Infectante;
•Fase leveduriforme - Crescimento em temperatura entre 35 e 37ºC - Fase Parasitária;
Reprodução dos Fungos

Entre os fungos filamentosos de interesse às análises clínicas, dois tipos principais
de órgãos de reprodução são importantes: o conidióforo e o esporangióforo. O conidióforo
caracteriza-se por produzir esporos externos, denominados conídios; o esporangióforo
produz esporos internos, os esporangiósporos. A forma dos esporos varia conforme gênero
ou espécie, apresentando, ou não, septos longitudinais ou transversais, que podem ser
hialinos ou coloridos com tamanho variável.
No caso do Rhizopus os esporangióforos compõe-se de uma haste que sai de uma
hifa aceptada, com um alargamento na extremidade, a columela, e uma membrana formando
uma esfera, o esporângio, dentro do qual se encontram os esporangiósporos. Com o
rompimento do esporângio, os esporangiósporos são liberados no ambiente.
O processo de reprodução assexual mais importante é por gemulação, isto é, com
formação de brotos. A artrosporação é um processo de reprodução por segmentação. A
Candida albicans em condições especiais, forma esporos arredondados, os clamidósporos.
A reprodução sexual é insignificante na identificação das leveduras patogênicas. Algumas
espécies de leveduras podem formar cápsulas ao redor das células, como é o caso do
Cryptococcus neoformans.
Classificação das infecções causadas por

fungos em humanos
De modo geral, os fungos estão presentes na natureza em constante interação

orgânica. Fazem parte da nossa microbiota, porém eventualmente podem causar
doenças. Ao longo dos últimos anos, a incidência de infecções importantes causadas por
fungos tem aumentado. Ocorrem como infecções nosocomiais (hospitalares) e em
indivíduos com sistema imunológico comprometido. O diagnóstico de uma infecção
fúngica requer esforços colaborativos do médico, anatomopatologista e microbiologista. A
equipe médica é responsável por reconhecer os sinais e sintomas das infecções fúngicas
e colher e transportar adequadamente os espécimes ao laboratório. É importante que os
clínicos transmitam suas considerações clínicas ao microbiologista, quando suspeitam de
determinados tipos de infecção fúngica para os quais podem ser necessários
procedimentos especiais. Por exemplo, quando o clínico suspeita de zigomicose, técnicas
mais delicadas de processamento dos espécimes devem ser usadas. O cirurgião
patologista e o citopatologista devem estar atentos às reações teciduais sugestivas de
uma infecção fúngica e devem ser capazes de reconhecer elementos fúngicos nos cortes
de tecidos corados. O micologista é responsável por utilizar as técnicas laboratoriais
necessárias à detecção e ao isolamento ideais dos fungos em cultura; realizar uma
identificação precisa e efetuar os testes de sensibilidade aos antimicóticos, quando isto for
necessário.
A seguir, estão enumerados os grupos de pacientes imunossuprimidos:
• Pacientes com infecção avançada pelo HIV Receptores de transplantes de órgãos,
principalmente durante o período de imunossupressão pós-transplante;
• Pacientes com neoplasias malignas, principalmente leucemia e linfoma, ou durante os
ciclos de quimioterapia;
• Pacientes com várias doenças imunes e metabólicas debilitantes, inclusive lúpus
eritematoso sistêmico (LES) e outras doenças do colágeno vascular, diabetes melito,
disgamaglobulinemia e uso abusivo de álcool ou drogas IV;
• Pacientes tratados com corticosteroides, fármacos citotóxicos, antibióticos (tratamento
crônico) e moduladores mais novos do sistema imune (p. ex., inibidores do fator a de
necrose tumoral).
Também estão em risco indivíduos que viajam para ou vivem em regiões do mundo nas
quais as infecções fúngicas são reconhecidamente endêmicas. Os participantes de
atividades ou ocupações que os colocam em contato direto com animais ou seres
humanos infectados e/ou materiais contaminados estão sujeitos a adquirir infecções
fúngicas.
Os fungos podem infectar o organismo de diversas formas, podendo causar infecções
rápidas, brandas ou até mesmo fatais.
Classificação Clínica das Micoses
As micoses são classificadas de acordo com a localização da infecção (sítio anatômico),
gênero dos fungos envolvidos (agente etiológico), estado imunológico do hospedeiro,
grau de invasão no hospedeiro, entre outras. Elas são geralmente crônicas e
relacionadas ao homem e animais.
Classificação quanto a Terminologias - Nome Popular
Classificação quanto a Terminologias - Gênero do Agente Etiológico

Classificação quanto a Terminologias - Tecido e órgão afetado ou grau de invasão no

hospedeiro (classificação mais adequada em micologia médica)
•Micoses Superficiais - Se caracterizam por serem causadas por fungos que invadem
as camadas mais superficiais da camada córnea da pele ou a haste livre dos pelos. As
lesões se manifestam como manchas hiper ou hipopigmentadas na pele, com baixo ou
nenhum processo inflamatório.
•Micoses Cutâneas - Se caracterizam por serem causadas por fungos que invadem
toda a camada córnea da pele ou a parte queratinizada intra-folicular dos pêlos ou
lâmina ungueal.
•Micoses Subcutâneas - Ocorre por inoculação do fungo patógeno ou oportunista ao
tecido subcutâneo, sendo comumente por um traumatismo. Pode se manifestar como
placas verrucosas, como tumefação ou lesão supurada da pele ou do tecido
subcutâneo, podendo ocorrer a disseminação do fungo por vias linfáticas, porém
limitada aos linfonodos.
•Micose Sistêmica/Profunda - Caracteriza-se por serem adquiridas por inalação de
propágulos fúngicos, sendo, consequentemente a lesão primária pulmonar, com
tendência à regressão espontânea. O fungo pode se disseminar, originando lesões
extrapulmonares, afetando vários órgãos.
Micose Oportunista - Causadas por fungos termotolerantes (que crescem a uma
temperatura de 37°C), de baixa virulência e que determinam doenças em hospedeiros
com algum imunocomprometimento. Pode-se localizar se apresentar de forma cutânea,
subcutânea e sistêmica.
Alguns exemplos de estruturas que fazem

parte do micélio vegetative ou reprodutor
dos fungos filamentosos
Observe o esquema clássico que delimita a macromorfologia dos fungos

filamentosos em meios de cultura. Sendo o micélio gevetativo, responsável pela captação
de nutrientes e o micélio aéreo pela reprodução fúngica. Tudo que está “mergulhado” no
meio de cultura é micélio vegetativo, isso acontece para que as estruturas constituídas por
hifas busquem nutriente no meio de cultura. O micélio aéreo por sua vez, forma o que
conhecemos popularmente por bolor. A característica algodonosa, por exemplo, é um
emaranhado de estruturas de reprodução, compostas por hifas, hastes, conidióforos,
conídeos e outras estruturas.
Micélio aéreo
Micélio vegetativo
(1) (2)
hifas
O micélio vegetativo é formado de hifas. Estas, por sua vez podem ser consideradas
septadas (2) ou cenocíticas (1), ou seja, com ou sem parece separando uma hifa da outra.
As hifas podem-se dividir em compartimentos celulares, através de septos, os quais são
parciais, completos ou, então, perfurados. Os septos parciais (pseudo-septos) resultam de
um espessamento da parede celular das hifas. Os septos perfurados são uni ou
multiperfurados. Os poros, estando presentes, os núcleos movem-se livremente de uma
célula para outra.
A hifa pode ser simples ou ramificado, septado ou não, constitui, em seu conjunto, o
micélio dos fungos. O crescimento da hifa resulta do alongamento linear no seu ápice. As
paredes celulares são paralelas, não apresentado constrições na região dos septos. Esta
é uma das principais diferenças entre pseudo-hifa (a) e hifas verdadeiras (b). As pseudo-
hifas produzem filamento entre os encontros de uma hifa e outra. Os septos são retos e a
célula terminal da hifa é geralmente cilíndrica.
Hifas formando parte do micélio reprodutor
Hifas formando parte do micélio vegetativo
Septos (parede que divide as hifas)

As hifas que formam conidióforos férteis diferenciam-se da hifa vegetativa, sendo

eretas ou decumbentes, simples ou ramificadas, com ou sem septos, retos ou flexuosos,
no ápice dos quais originam-se os conídios. Os conídios podem ser hialinos - hialoconídio
- ou pigmentados, geralmente escuros chamados de demáceos – feoconídios, apresentam
formas diferentes — esféricos, fusiformes, cilíndricos, piriformes. Podem ter parede lisa ou
rugosa; serem formados de uma só célula ou terem septos em um ou dois planos;
apresentar-se isolados ou agrupados. O conidióforo e a célula conidiogênica podem
formar estruturas bem diferenciadas, peculiares, o aparelho de frutificação, também
denominado de conidiação que permite a identificação de alguns fungos patogênicos. A
fiálide é uma célula conidiogênica encontrada em muitos fungos. Tem a forma de um
frasco alongado ou de taça. No aparelho de conidiação do gênero Aspergillus, por
exemplo, os conídios formam cadeias sobre fiálides, estruturas em forma de garrafa, em
torno de uma vesícula que é uma dilatação na extremidade do conidióforo.
métula
vesícula
conidióforo
Aspergillus spp conídeos
fiálides
Penicillium spp Aspergillus spp

Alguns esquemas básicos extraídos

do livro “Guia para Identificação” de
Lacaz e colaboradores, 1998
Alguns exemplos de estruturas que fazem

parte do micélio vegetative ou reprodutor
dos fungos filamentosos
O estudo da macromorfologia das colônias é muito importante, em especial fazendo

relação com o verso e anverso e com o observado na microscopia (assim como na
bacteriologia).
Verso Anverso
Algumas estruturas importantes na observação da micromorfologia
1
O estudo da macromorfologia das colônias é muito importante, em especial fazendo

relação com o verso e anverso e com o observado na microscopia (assim como na
bacteriologia).
Verso Anverso
Algumas estruturas importantes na observação da micromorfologia

Algumas imagens de colônias de fungos

clinicamente significantes e outros
ambientais
Aspergillus spp Rhzopus spp
Penicillium (verso e anverso)

Curvularia spp (verso e anverso)
Aspergillus niger (verso e anverso)
Noções em métodos laboratoriais para

diagnóstico em Micologia Médica
Exame direto da colônia ou de escamas com auxílio de fita adesiva:

Este exame é um dos mais simples e baratos realizados na rotina da micologia. É um
exame útil, pois, permite o estudo das estruturas fúngicas ao microscópio, em alguns
casos (os que não necessitam de microcultivo), podem-se diferenciar algumas espécies
de fungos filamentosos. Lembrando que este exame é utilizado apenas para fungos
filamentosos, as leveduras são coradas pelo Gram. Nesta técnica nós utilizamos o corante
azul de lactofenol (azul de algodão).
Este teste consiste que com uma fita adesiva grudada do lado colante para fora nos dedos
polegar e médio. Com o dedo indicador deve-se aproximar a fita com o lado colante à
colônia do isolado e pressionar levemente sobre ela e em seguida dispor sob uma lâmina
com azul de lactofenol e observar ao microscópio. Quando não se tem a fita, pode-se usar
fragmento da colônia retirado com pinça ou alça bacteriológica.
Esta técnica também é utilizada para a pesquisa de Malassezia (agente etiológico da
Pitiríase versicolor) em escamas de pele. Neste caso utiliza-se a técnica aproximando a
parte colante da fita na pele e dispondo em uma lâmina limpa e visualizar. Neste
momento, quando positivo, é possível visualizar aglomerados de esporos em forma de
cachos de uva, podendo aparecer junto com filamentos grossos.
Cultivo sob lâmina e lamínula: microcultivo:

O microcultivo é um dos principais exames utilizados para o estudo detalhado das
estruturas fúngicas. Determinadas micoses requerem este exame para a identificação
precisa e diferenciação de algumas espécies de fungos. No caso da cromoblastomicose,
só é possível diferenciar as espécies de Fonsecaea pelo microcultivo, além, dos demais
gêneros, a diferenciação de espécies do gênero Cladosporium é indispensável para o
diagnóstico preciso da cromoblastomicose, dentre os demais agentes da doença.

Material utilizado:
Uma placa de Petri;
Um papel filtro (5);
Um tubo em “U” ou lamina (para usar como suporte)
(2);
Uma lâmina e uma lamínula (1 e 3);
Água destilada estéril;
Bloco de ágar Sabouraud ou batata (ou outro,
depende do isolado específico) (4).
A técnica consiste em:
Montar o kit com o papel filtro ao

fungo da placa e sob ele dispor o
tubo em “U” ou a lâmina de suporte.
Sobre o tubo colocar outra lâmina e
nela dispor de um bloco de
aproximadamente 10x10mm de ágar
Sabouraud/batata ou outro. Neste
momento o semeio deve ser feito
neste bloco de ágar, pode ser feito
um pique central, ou nas pontas
laterais do bloco. Em seguida deve-
se colocar a lamínula sob o bloco de
ágar e fechar a placa. Deve-se
umedecer com 1 a 4 mL de água
destilada estéril, sempre que
necessário o papel filtro para que o
sistema permaneça úmido e
contenha as condições mínimas de
sobrevivência do fungo.

Para a visualização do microcultivo, deve-se com muito cuidado retirar a lamínula

de cima do bloco de ágar com uma pinça estéril, colocar em uma lâmina limpa que tenha
uma gota do corante azul de lactofenol (azul de algodão) e visualizar com os
procedimentos padrões. Uma observação importante é que para a visualização do
microrganismo ao microscópico, deve-se evitar ao máximo contaminações pelos
profissionais manipuladores, por tanto, deve-se colocar 1 ou 2 mL de formol em algodão
esparramado na placa e vedando-a com fita adesiva ou insulfim, assim, o formol inativa o
fungo através da inativação da esporulação e ajuda a fixar o material na lamínula. O
tempo de crescimento dos fungos varia de gênero e espécies de diferentes fungos,
principalmente nos fungos leveduriformes e dimórfico em geral, cabe ao responsável
visualizar o crescimento e avaliar se o mesmo contém condições mínimas de
desenvolvimento para estudo ao microscópio, geralmente isso ocorre em torno de 7 a 10
dias. Com o auxílio de uma pipeta estéril dispor de algumas gotas de água sob o papel
filtro para umedecer.

Técnica da Tinta da China (Tinta Nanquim):

Este exame é utilizado para visualização de leveduras capsuladas como as do gênero
Cryptococcus em diversos tipos de material clínico. O princípio desde exame não é corar
as leveduras, pois, a tinta nanquim não é capaz de penetrar a cápsula polissacarídica,
mas sim, todo o material ao redor dela, enegrecendo todo o material e evidenciando
através da luz microscópica a cápsula leveduriforme e os possíveis brotamentos em
andamento, além, de evidenciar também, futuros rompimentos das cápsulas, quando o
objetivo do exame é verificar a atuação de antifúngicos, no entanto, esse exame não é
exato quanto a esse fim.
Este exame não permite verificar a viabilidade das leveduras, seu objetivo principal é
apenas evidenciar as cápsulas presentes no material clínico, pois, mesmo que inviáveis,
por conta da administração de antifúngicos, as leveduras podem estar presentes no
exame por um bom tempo. Este fato, pode não representar um bom parâmetro para o
controle da doença. Para confirmar a viabilidade do material clínico, deve-se realizar a
cultura do material.
A técnica consiste em dispor uma gota de aproximadamente 50 a 100μl numa lâmina

limpa e estéril do líquor. Depois com cuidado dispor de uma ou duas gotas da tinta no
canto da lâmina e com uma ponta de pipeta misturar aos poucos com o líquor, deve-se
deixar uma quantidade grande de tinta para que melhore na hora da visualização.

No campo 1 é possível visualizar as células leveduriformes, porém com pouco contraste;

em 2 a visualização é perfeita; é possível identificar os brotamentos e com perfeição as
células.
Técnicas de semeios em micologia:

Existem várias técnicas de semeio para fungos; essas técnicas auxiliam na
obtenção de culturas puras. Algumas técnicas são mais eficientes quando há uma
quantidade mínima de material.

Semeio por estria e esgotamento

Essa técnica tem o objetivo de obter uma grande quantidade de microrganismos
numa placa ou tubo, é utilizada para a semeadura de leveduras para fins de diagnóstico
em micologia. Neste caso estria-se o material em uma placa com a alça bacteriológica
transversalmente na placa ou em locais diferentes; se possível passar a alça sob os
semeios recém-realizado e realizar um novo semeio a fim de carregar mais
microorganismos para uma superfície maior para obter colônias puras do microorganismo.
O semeio deve ser feito, de modo que depois de finalizar uma estria, seja feita
outra estria com fragmentos da estria anterior. Dessa forma, quando crescer, a
possibilidade de se obter colônias puras é maior.
Semeio por pique central:

Essa técnica é utilizada para organizar o crescimento de um determinado fungo
em uma placa; é utilizada com maior frequência para fungos filamentosos a fim de que ele
cresça do centro para as bordas da placa. Assim, essa técnica auxilia no momento da
realização de exames como o da fita adesiva. Consiste em um pique central em uma
placa de Petri ou em um tubo, assim, através do crescimento centrífugo o fungo irá se
desenvolver normalmente.

Este tipo de semeio é comum quando o objetivo é de se obter uma cultura pura
de fungo filamentoso. Se pega uma alça bacteriológica, abre-se o seu alo a fim de que
fique como uma agulha. Pica-se na amostra e em seguida no centro da placa nova.
Dessa forma, através do crescimento centrífugo o fungo de se desenvolve como no da
foto acima.
Técnicas de Coleta em Micologia

Na rotina do laboratório de micologia são usados os mais diversos tipos de
material biológico. Os mais comuns são raspados de pele, pelo, cabelo, unha e couro
cabeludo. Porém, há exames mais específicos e microorganismos mais “ousados” que
são pesquisados em líquor, escarro sangue e outros líquidos corpóreos; além de biópsias
de fragmentos de tecidos de modo geral.
O diagnóstico das micoses é realizado pela demonstração da presença do fungo
causador da doença por meio do exame micológico. Antes de se coletar o material é
muito importante que o paciente não esteja utilizando medicamentos antimicóticos. Caso
esteja, eles devem ser suspensos, pois interferem na microscopia e no isolamento. Essa
deve ser uma ação feita pelo médico, que deve entender que o uso pode trazer
resultados falso-negativos.

A coleta do material é uma etapa fundamental no exame micológico, devendo ser

feita no local adequado, com o material correto, no momento indicado e na quantidade
certa. Nas lesões descamativas de pele ou de unha raspa-se o local com lâmina.
Existindo micose em áreas cobertas com pêlos esses devem ser arrancados. Em caso de
micoses pulmonares é coletado o escarro. A punção é utilizada na coleta do líquor, ou de
pus nos gânglios linfáticos enfartados.
Material necessário para coleta em Micologia

Bisturi pequeno ou lâmina de bisturi;
Pinça de depilação;
Estiletes;
Tesouras;
Lâminas de microscopia;
Placas de Petri;
Frascos;
Tubos de ensaio com salina esterilizada;
Swabs;
Fita adesiva – Scotch 3M.
Coleta para micoses superficiais - Amostra de Pele

As amostras de lesões de pele como escamas, crostas, ou cascas, devem ser
colhidas preferencialmente com uma lâmina de bisturi descartável ou com a borda da
lâmina de vidro de microscopia, muito limpa;
Deve-se colher, raspando em vários pontos da lesão, procurando as bordas das lesões
mais recentes;
Nos casos em que não há escamas aparentes, procura-se raspar bem o local e retirar o
material que for possível.

Coleta para micoses superficiais - Amostra de Couro Cabeludo

• As amostras de lesões no couro cabeludo devem ser obtidas através da raspagem do
local;
• A amostra deve conter tocos de cabelo, o conteúdo dos folículos tapados e as
escamas de pele;
• Os cabelos da área também podem ser puxados com pinça (os cabelos infectados são
facilmente removíveis).
Coleta para micoses superficiais - Cabelo e Pelo

• Se a lesão for ao longo do cabelo ou pelo, como nódulos, por exemplo, esses devem
ser cortados com tesoura.
Coleta para micoses superficiais - Raspado de Unha

• Os fragmentos de unhas alteradas podem ser colhidos, raspando-os com o bisturi ou
com o auxílio de uma tesoura limpa;
• Material que se deposita embaixo da unha pode ser retirado cuidadosamente com o
bisturi, com um palito (tipo de manicure), previamente esterilizado, ou outro objeto
pontiagudo estéril;
• Em casos de paroníquia (lesões na região da cutícula), colhem-se as escamas e, se
possível, o pus, com um swab;
• Se a lesão é uma mancha esbranquiçada embaixo da unha, raspar por cima da unha
com o bisturi até chegar na parte com a lesão; desprezar este material e raspar todo o
conteúdo da mancha.

Observação: Quando o material da lesão é seco, reduz a contaminação bacteriana e a

amostra pode ser estocada, em placas de Petri estéreis ou em envelopes, por meses,
sem perder a viabilidade do fungo dermatófito. O transporte é sem refrigeração.
Coleta para micoses superficiais - Membranas Mucosas

• Para as infecções de boca ou vagina, o raspado com lâmina de bisturi ou espátula, nas
partes afetadas (áreas com eritema e/ou placas brancas), é melhor do que o swab, se
o material for processado imediatamente;
• No caso de coleta vulvar/vaginal, o swab (sempre embebido em salina ou água estéril)
é o mais adequado. Não esquecer que o swab tem que ser mantido úmido até ser
processado o exame.
Coleta para micoses superficiais - Ouvido

• As infecções fúngicas de ouvido são geralmente secas, exceto quanto associadas a
infecções bacterianas;
• A raspagem do material é sempre melhor para o diagnóstico laboratorial, embora o
swab também possa ser usado.
Coleta para micoses superficiais - Mucosa Ocular

Deve ser solicitado meio de cultura ao laboratório e o material retirado das áreas de
ulcerações e supurações pelo oftalmologista deve ser inoculado imediatamente no meio;
Lágrima e fluídos podem ser coletados com pipeta plástica estéril chamada de pipeta
Pasteur descartável ou pipeta de transferência. O swab não é adequado para este tipo de
material.

Coleta com suspeita de micoses Subcutâneas

• Podem ser raspadas as escamas ou crostas da parte superficial da lesão;
• Aspirado do pus e/ou biópsia, são mais apropriados para o exame;
• O pus é coletado assepticamente de abscessos não drenados com uma agulha estéril
em seringa. Após a coleta, retirar a agulha com uma pinça e passar o material para um
frasco estéril;
• Nas lesões ulceradas, caso o material tenha que ser colhido com swab (o que não é
recomendado), deve ser retirado da parte mais profunda da lesão, evitando encostar
na periferia e na pele adjacente;
• Se algum grão for visível no pus, este deve ser incluído na amostra.
Observações:
Para todas as coletas descritas acima, colher todo o material disponível na lesão. Quanto
mais material mais viabilidade na visualização e no crescimento em cultura.
Todas as vezes que a coleta for com swab, este deve ser umedecido em salina ou água
estéril antes da coleta. Após a coleta, deve permanecer em um frasco estéril com salina
suficiente para mantê-lo úmido até o procedimento do exame.
Coleta com suspeita de micoses sistêmicas ou profundas
Escarro
• Preferencialmente deve ser colhido por broncoscopia: lavado ou aspirado brônquico;
• Quando não for possível, o escarro deve ser colhido da mesma maneira como é
colhido para o exame de tuberculose, não esquecendo da higiene da boca antes da
coleta, para diminuir a contaminação pelos saprófitas da cavidade bucal e da faringe;
• O exame de escarro, tanto o direto como a cultura, na maioria das vezes não são
satisfatórios, porque não é confiável, já que é uma amostra muito contaminada.
Portanto, quando houver a possibilidade do exame sorológico, deve-se optar pelo
último.
Líquor (Líquido Céfalo Raquidiano)

• É colhido pelo médico. Não é recomendável que a mesma amostra seja utilizada para
os exames bacteriológicos, micológicos ou de tuberculose, porque pode haver
contaminação;
• O ideal é uma alíquota da amostra para cada setor;
• Para um bom exame direto com cultura e Prova do Látex, é necessário 2 a 3 mL de
líquor.

Sangue (Coleta, processamento e transporte)
Técnica de Coleta - Procedimento:

Realizar assepsia do sítio escolhido para puncionar com álcool 70 % esperar 5 segundos
e aplicar solução de Iodo-povidine a 10%, coletar de 8 a 10 mL de sangue venoso
(adultos) e de 1 a 3 mL (crianças), para cada frasco coletado.
Terminada a punção retirar a agulha trocando-a por uma nova, inocular o sangue no
frasco enviando de imediato ao laboratório.
Quanto ao volume da amostra é recomendado de duas a três amostras de cada paciente,
com intervalos de 30 minutos. Deve ser respeitada a quantidade de sangue de 1:10 em
relação ao meio de cultura, isto é: 5ml de sangue para 45 mL de meio de TSB -Trypticase
Soy Broth - (hemocultura adulto) e 1 mL de sangue para 9 mL de TSB (hemocultura
pediátrico).
Inoculação e Incubação do material:

• Romper o lacre central dos frascos e fazer assepsia na tampa de borracha dos frascos
de meio com TSB (frasco de hemocultura) com álcool 70%;
• Inocular 5 mL de sangue direto da seringa de coleta no frasco de hemocultura adulto
(45 mL) ou 1 mL de sangue em frasco de hemocultura pediátrica (9 mL). Misturar bem
(sem agitar) para evitar coagulação; encaminhar imediatamente em temperatura
ambiente;
Para distâncias maiores, proceder como o descrito abaixo:

Em caso de mais de um frasco, em um deles deverá ser introduzido na tampa de
borracha uma agulha estéril com uma pequena porção de algodão na parte posterior,
para aeração;
Incubar a 35ºC por 24 horas antes de enviar para o laboratório onde será feita a pesquisa.

Quanto ao transporte, depois de decorrido o tempo de incubação de 24 horas, o TSB

deverá ser encaminhado ao laboratório em temperatura ambiente, juntamente com os
dados do paciente, ficha e demais dados informativos.
Processamento da amostra
Os materiais líquidos são examinados inicialmente a fresco (pus, líquor, escarro, etc.).
Muitas vezes esses materiais necessitam passar por um processo de enriquecimento ou
digestão, como os casos do líquor ou do escarro, respectivamente.
Os materiais sólidos, como os pelos, as escamas de pele ou de unha, são submetidos a
um processo de clareamento com hidróxido de potássio e leve aquecimento. A fervura
deve ser evitada, pois cristaliza e precipita as substâncias digeridas, dificultando a
microscopia, além de fragmentar excessivamente as escamas, impossibilitando a
pesquisa do agente.
O isolamento de fungos é feito especialmente no meio de ágar Sabouraud em tubos ou
placas. Devido ao pH ácido (cerca de 5,0 a 5,5) desse meio muitas bactérias são inibidas.
O meio é relativamente simples, não havendo dificuldades para o seu preparo. Os meios
industrializados podem, com pouca frequência, gerar problemas no crescimento dos
fungos, além de provocar alterações no aspecto e na esporulação da cultura.
Ao meio de cultura acrescentam-se antibióticos, como cloranfenicol, gentamicina,
penicilina, estreptomicina etc. Para os dermatófitos usa-se a cicloheximida que inibe os
bolores contaminantes. O uso desses antibióticos não pode ser indiscriminado, pois há
inibição de algumas culturas, como acontece com a o C. neoformans com a
cicloheximida.
A identificação dos bolores é feita pelos caracteres morfológicos, especialmente no caso
dos agentes patogênicos. O exame microscópico das culturas é realizado usando-se
fragmentos destas, clareados com lactofenol azul-algodão. Para estudos mais acurados
utiliza-se o cultivo sobre lâminas. As leveduras exigem provas bioquímicas para sua
identificação, como as provas de fermentação (zimograma), de assimilação de fontes de
carbono, de nitrogênio etc.

Processamento de Sangue para cultura de medula óssea

Coletar de 3 a 5 ml de sangue e colocar em um frasco estéril contendo 0,5 ml de heparina
diluída 1:1000.
Fluidos em geral (Pleural, Sinovial e Peritonial):

Aspirados ou drenados, são coletados assepticamente em frasco estéril contendo
heparina estéril 1:1000.;
A quantidade de heparina usada varia de acordo com o volume da amostra
(aproximadamente 1 ml por 10 ml de fluído);
Em casos de fluído abdominal de pacientes de diálise peritoneal, colher sem heparina ou
em frasco de hemocultura.
Processamento e coleta de urina para cultura:

A assepsia com água e sabão da região genital deve ser rigorosa, podendo após lavar
com povidine, enxaguar com água estéril e secar com gaze estéril. (sexo masculino retrair
o prepúcio e lavar a zona da glande e meato urinário);
Coletar 10 ml de urina do segundo jato urinário (sexo feminino afastando os grandes
lábios) em frasco esterilizado;
Crianças: Fazer assepsia rigorosa dos genitais e região perianal com água e sabão,
colocar o coletor urinário adequado segundo sexo, uma vez obtida a amostra mandar o
coletor fechado ao laboratório. (o coletor deverá ser trocado a cada 30-40 minutos caso a
criança não tenha urinado);
Paciente com sonda vesical de permanência: Desprezar a urina remanescente na sonda
vesical permitindo a descida desta para a bolsa coletora, pinçar a sonda vesical 20 cm de
distal a proximal logo que a urina fresca se acumule. Prévia assepsia com álcool 70%,
coletar 10 ml da amostra puncionando no lugar do dispositivo para coleta de urina, e
depositar em tubo esterilizado adequadamente fechado e transportar ao laboratório.
Referências
LACAZ, Carlos da Silva et al. Guia para identificação: fungos, actinomicetos, algas de
interesse médico. . São Paulo: SARVIER. . Acesso em: 08 set. 2023. , 1998
Compêndio de Micologia Médica | Rio de Janeiro; Guanabara Koogan; 2 ed; 2015.
SIDRIM, J. J. C.; ROCHA, M. F. G. Micologia médica à luz de autores contemporâneos.

Rio de. Janeiro: Guanabara Koogan, 2004.
Compêndio de micologia médica / Clarisse Zaitz ... [et al.]. - 2. ed. - Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2010.
KONEMAN, E. W. et al. Koneman Diagnóstico Microbiológico: Texto e Atlas. 7ª ed. Rio de

Janeiro: Guanabara Koogan, 2018.
Lacaz C.S., Porto, E., Martins, J.E.C., Heins-Vaccari, E.M. and Melo, N.T. Tratado de
Micologia Médica, 9a ed., Sarvier, São Paulo, 2002.
MARTINKO, J. M.; MADIGAN, M. T. et al. Microbiologia de Brock. 14ª ed. Porto Alegre:
Artmed, 2016.
Micologia: métodos laboratoriais de diagnóstico das micoses. Paulo S. Minami. Barueri,

SP: Manole, 2003.
Micologia Médica a luz de autores contemporâneos. José Júlio Costa Sidrim. Editora:
Guanabara, 2004.
Sidrim, J.J.C. and Moreira, J.L.B. Fundamentos clínicos e laboratoriais da micologia

médica. Guanabara-Koogan, Rio de Janeiro, 1999.
TORTORA, Gerard J.; FUNKE, Berdell R; CASE, Christine L. Microbiologia. 12ª ed. Porto
Alegre: Artmed, 2017
A venda deste e-book é proibida. Todo o material aqui disponível é de autoria das referências
citadas e reestruturado com algumas imagens de Microlab Assessoria e Treinamentos Online
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PROCEDIMENTOS

João Marcelo Oliveira

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Eu sou o João Marcelo, sou biomédico, microbiologista e

Esta é a primeira versão deste ebook.

(p) 2023, versão 0001/23. Primeira edição.

Introdução e noções gerais a respeito

Nutrição e Metabolismo Fúngico

Morfologia dos Fungos

Algumas características principais

Os fungos, microrganismos uni ou pluricelulares, eucariotos dotados de uma celula

Algumas características principais

Reprodução dos Fungos

Classificação das infecções causadas por

De modo geral, os fungos estão presentes na natureza em constante interação

Classificação quanto a Terminologias - Nome Popular

Classificação quanto a Terminologias - Gênero do Agente Etiológico

Classificação quanto a Terminologias - Tecido e órgão afetado ou grau de invasão no

Alguns exemplos de estruturas que fazem

Observe o esquema clássico que delimita a macromorfologia dos fungos

Hifas formando parte do micélio reprodutor

Hifas formando parte do micélio vegetativo

Septos (parede que divide as hifas)

As hifas que formam conidióforos férteis diferenciam-se da hifa vegetativa, sendo

Aspergillus spp conídeos

Penicillium spp Aspergillus spp

Alguns esquemas básicos extraídos

Alguns exemplos de estruturas que fazem

O estudo da macromorfologia das colônias é muito importante, em especial fazendo

Algumas estruturas importantes na observação da micromorfologia

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Algumas imagens de colônias de fungos

Aspergillus spp Rhzopus spp

Penicillium (verso e anverso)

Noções em métodos laboratoriais para

Exame direto da colônia ou de escamas com auxílio de fita adesiva:

Cultivo sob lâmina e lamínula: microcultivo:

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Montar o kit com o papel filtro ao

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Para a visualização do microcultivo, deve-se com muito cuidado retirar a lamínula

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Técnica da Tinta da China (Tinta Nanquim):

A técnica consiste em dispor uma gota de aproximadamente 50 a 100μl numa lâmina

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No campo 1 é possível visualizar as células leveduriformes, porém com pouco contraste;

Técnicas de semeios em micologia:

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Semeio por estria e esgotamento

Semeio por pique central:

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Técnicas de Coleta em Micologia

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A coleta do material é uma etapa fundamental no exame micológico, devendo ser

Material necessário para coleta em Micologia

Coleta para micoses superficiais - Amostra de Pele

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Coleta para micoses superficiais - Amostra de Couro Cabeludo

Coleta para micoses superficiais - Cabelo e Pelo

Coleta para micoses superficiais - Raspado de Unha

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